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CN118914553B - 一种结直肠腺瘤和结直肠癌早期筛查的生物标志物的应用 - Google Patents

一种结直肠腺瘤和结直肠癌早期筛查的生物标志物的应用 Download PDF

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CN118914553B
CN118914553B CN202410982040.4A CN202410982040A CN118914553B CN 118914553 B CN118914553 B CN 118914553B CN 202410982040 A CN202410982040 A CN 202410982040A CN 118914553 B CN118914553 B CN 118914553B
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Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种结直肠腺瘤和结直肠癌早期筛查的生物标志物的应用。所述生物标志物为丛生蛋白。本发明通过弱阳离子交换磁珠(WCX‑MB)和基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱技术(MALDI‑TOF MS)分析来自正常健康人群、增生性息肉、腺瘤性息肉患者的血清样本，选择显著差异表达峰中的差异多肽，并通过高通量测序鉴定相对应的差异蛋白，进而探寻肠道息肉早期癌变的潜在生物学标志物。本发明提供的生物标志物对腺瘤和结直肠癌具有良好的诊断效能，显著优于传统肿瘤标记物，对于结直肠肿瘤的早筛早诊具有重要意义。

Description

一种结直肠腺瘤和结直肠癌早期筛查的生物标志物的应用
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及一种结直肠腺瘤和结直肠癌早期筛查的生物标志物的应用。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)又称大肠癌，是一种对人类健康构成重大威胁的恶性肿瘤。结直肠癌筛查手段分为侵入性检查和非侵入性检查，其中非侵入检查包括粪便检查以及影像学检查。目前用于粪便的检测工具包括愈创木脂法粪便潜血试验(Guaiacum fecal occultblood test,gFOBT)、粪便免疫化学检测(Fecal immunochemicaltest,FIT)以及新型的粪便DNA检测粪便检测具有价格便宜、操作容易等优势，而且可减少大肠癌的死亡率，但研究发现粪便检测的特异性和灵敏性低，容易受到饮食和药物的干扰导致假阳性结果。
影像学检查主要是指结肠CT成像技术即CT模拟全结肠镜，一种非侵入性的图像诊断技术，利用计算机技术对肠道进行三维重建，并提供结肠内部的虚拟图像，进而对肠道肿瘤进行诊断、筛查。但是，这一技术存在着诸多问题，例如肠道清洁准备、成本高、操作繁琐、假阳性、辐射危害大以及人群接受度低等，因此目前暂不建议应用于人群肠道肿瘤筛查。其他的一些影像学检查包括核磁共振成像技术(MRI)和正电子发射断层扫描(PET)/CT仿真肠镜也可以用于结肠癌的辅助诊断。这两种方法仅作为术前评估的重要组成部分，可以对结直肠癌患者的TNM分期提供有价值的信息，可以算作为当前检查手段的补充，但目前尚未有指南推荐其作为CRC筛查。
侵入性检查有结肠镜和乙状结肠镜两种，都可以在内镜下进行直接的观察，并能获得病理学的标本。结肠镜检查，作为一项高效且精确的医疗手段，目前已经成为了结直肠癌早期诊断和筛查的首选方法。但是，结肠镜检查具有侵入性，操作过程中患者会有不适感、前期充分的肠道准备工作、无痛肠镜的高昂费用以及大众接受程度低等诸多因素，现阶段难以普及肠镜检查作为肠癌的常规筛查手段，所以，需要寻找理想的生物学标志物。
生物学标志物是癌症诊断、患者预后及治疗选择的主要工具，临床中应用最广的是血清生物学标志物。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen,CEA)被普遍认为是CRC的一种血清生物标志物，与癌胚抗原类似，糖类癌胚抗原199(CA19-9)和糖类癌胚抗原242(CA24-2)也是胃肠道肿瘤标志物。但这些生物学标志物在肠癌筛查中的特异性和敏感性较差，如CEA升高不仅仅表现在肠癌中，乳腺癌、肺癌等许多癌症中CEA水平也会增加，甚至一些良性疾病水平也会增加。此外，目前的血清生物标志物存在特异性和敏感性较差的问题。
发明内容
为解决现有生物标志物特异性和敏感性较差的问题，本发明提出从炎症-息肉-瘤变的途径中寻求具有“腺瘤-癌变”的早期癌变的分子定义的特异性血清生物标志物，用于结直肠腺瘤甚至肠息肉的早筛过程中终止进展成结直肠癌的可能。本发明提供的了一种血清生物标志物即结直肠腺瘤和结直肠癌早期筛查的生物标志物的应用。该血清生物标志物即结直肠腺瘤和结直肠癌早期筛查的生物标志物优点在于价格便宜、操作容易、可接受度高、特异性高、敏感性好、疾病发现阶段早。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供的应用为结直肠腺瘤和结直肠癌早期筛查的生物标志物在制备用于结直肠腺瘤和/或结直肠癌筛查或诊断产品中的应用。其中，所述生物标志物为丛生蛋白CLU、白蛋白ALB中的任意一种。
优选地，所述结直肠腺瘤和结直肠癌早期筛查的生物标志物为丛生蛋白CLU。丛生蛋白，载脂蛋白J、硫酸糖蛋白2、补体裂解抑制物或睾酮抑制的前列腺信息2基因。经过本发明证实了CLU蛋白在健康对照人群中表达最高，增生型息肉患者中表达次之，腺瘤组型息肉患者中血清表达含量最低，即CLU蛋白在结直肠息肉进展为结直肠腺瘤的过程中梯度成降低趋势，并且在CLU蛋白浓度低于2895.78pg/mL时，诊断腺瘤性息肉的可能性大。其中，丛生蛋白的英文名称为Clusterin，CLU；载脂蛋白J的英文简称为APOJ；硫酸糖蛋白2的英文简称为SGP2；补体裂解抑制物的英文简称为CLI；睾酮抑制的前列腺信息2基因的英文简称为TRPM-2。
优选地，所述丛生蛋白CLU为一种血清标志物或病理组织中的标志物。本发明基于收集增生型息肉患者和腺瘤组型息肉患者的血清样本和息肉组织样本进行分析和验证丛生蛋白CLU作为生物标志物的意义和价值。
优选地，所述产品包括试剂盒、检测试剂或抗体芯片。CLU-MB-WCX磁珠试剂盒用于蛋白质谱分析，将CLU抗体包被在磁珠上，省去进行抗体与磁珠的孵育阶段，便于进行质谱检测和分析。CLU相关检测试剂在携带CLU抗体的同时能够携带相应的荧光标签，便于在显微镜下直观分析CLU蛋白的含量变化。CLU相关抗体芯片可以在包含其他生物标志物的抗体同时包含CLU抗体，便于在样本检测时节省样本的使用量，并在同一时间统一处理下共同判定所有生物标志物的表达。
其中，所述试剂盒包括结直肠腺瘤和/或结直肠癌筛查或诊断试剂盒。本剧本发明分析的CLU诊断浓度，在样本数据分析时进行数值设定，能够进一步缩短对结直肠腺瘤和/或结直肠癌的筛查和诊断。
优选地，所述试剂盒包括特异性结合所述丛生蛋白CLU的抗体或抗体片段。根据CLU蛋白和/或特异性肽段的序列进行抗体制备，得到CLU特异性的抗体或抗体片段。
所述检测试剂包括检测血清生物标志物的试剂或检测病理组织中的标志物的试剂。本发明主要针对肠息肉患者的血清样本和息肉病理组织进行生物标志物的分析。
优选地，所述血清生物标志物的试剂或检测病理组织中的标志物的试剂为ELISA试剂、免疫印迹试剂、免疫荧光试剂、免疫组化试剂、蛋白芯片或质谱检测用试剂。ELISA试剂能够特异性的判定血清或组织中CLU的绝对表达浓度，具体试剂包括有CLU检测抗体、HRP标记链霉亲和素、显色TMB等；免疫印迹试剂能够特异性的判定血清和组织中CLU的相对表达浓度，具体试剂包括有RIPA裂解液、10％APS、TBST洗脱液等；免疫组化试剂能够用图像直观地表现CLU的表达及位置，具体试剂包括有4％多聚甲醛、二甲苯、DAB显色液等；蛋白芯片或质谱检测用试剂能够判定血清或组织样本中的具体蛋白种类，具体试剂包括有单克隆抗体、磁珠、50％乙腈等。
优选地，所述血清检测生物标志物的试剂为PCR检测试剂、原位杂交用试剂，或测序用试剂。PCR检测试剂能够从RNA水平判定组织样本中CLU的相对表达量，具体试剂包括有SYBR Green、RT Enzyme mix、引物等；原位杂交用试剂能够在组织样本中定点原位判定CLU的表达，具体试剂包括有胃蛋白酶、1％多聚甲醛/0.1M PBS、杂交液等。
优选地，所述检测血清生物标志物的试剂为ELISA试剂。ELISA能够快速便捷的在同一时间和统一处理水平下判定大量血清或组织样本中的CLU表达含量。
所述抗体芯片能够将不同抗原特异性结合的多种抗体包含CLU高密度地固定到载体上，从而检测血清或组织样本中特异性结合在上面的抗原。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明提供了一种结直肠腺瘤和结直肠癌早期筛查的生物标志物的应用。本发明通过分析正常健康人群、增生型息肉患者、腺瘤型息肉患者血清样本中的差异多肽，试图找到至少一种蛋白生物标志物，根据其表达浓度能够在息肉进展为腺瘤甚至结直肠癌的过程中准确灵敏的反映出疾病的阶段，并绘制ROC曲线鉴定其诊断价值。
2、本发明采用蛋白质谱、高通量测序、ELISA等技术，以正常人群、增生性肠息肉、腺瘤肠息肉患者为对象，对患者息肉组织样本、血清进行检测，分析不同人群组织及血清样本中蛋白表达的差异。同时通过ELISA、Western Blotting等技术验证息肉向癌前病变转化的潜在生物标志物，检测结果将辅助临床医生更加合理地诊断和治疗，以达到精准检测、精确治疗的目的。
基于蛋白质组学的疾病研究被认为是一种动态和创新的工具，能够提供比其他高通量技术更详细的信息，用来确认、补充或提供相关数据。此外，对生物系统中真正起效应分子的蛋白质和代谢物进行分析，可以更多反映机体的生理变化。因此，应用蛋白组学技术可以揭示体内蛋白质表达和或蛋白质加工上的变化，这些变化往往可以作为分子标记，甚至可能成为疾病强大的筛查工具的基础。
质谱技术(Mass Spectrometry,MS)的基本原理是将被测物质离子化，按照离子的质荷比分离出来，测量各种离子谱峰值的强度而实现分析疾病的目的。目前用于分析多肽和蛋白质的三种电离方法主要包括电喷雾电离(ESI)、基质辅助激光解吸/电离(MALDI)和表面增强激光解吸/电离(SELDI)。这些电离源通常与飞行时间(TOF)或四极杆分析器相组合耦合起来可以通过分析产生的碎片的质量来推断多肽的详细结构特征。其中基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)是20世纪80年代发展起来的一项新技术，已经广泛应用于糖、核酸、蛋白质等三大分子的检测，生物大分子和合成聚合物的结构分析和分子量测定已成为当前蛋白质组学研究的核心目标之一。该技术具有计算质荷比准确率高、成本低、亲和力大、重现性好等优点，而且不仅可以分析细胞和组织，还可以分析粉末、溶液和膜组织等样品，同时具有高灵敏度、高质量准确度和快速分析时间的优势。临床上，用于质谱分析的样本主要有尿液、唾液、血清、血浆等生物流体、生物组织和细胞培养基等。由于生物流体收集程序相较于其他简单，如易获取，成本低廉、侵入性小，因此，一般质谱分析经常使用生物流体，有利于筛选无创的生物标志物，最终实现筛查癌症的目标。质谱分析蛋白组学可以轻易地探测并分析数百个候选疾病标志物的蛋白组学信息。因此，现已经成为生命科学领域中最常见的发现和验证工具之一。
附图说明
图1为本发明中正常健康人群(NC,，绿色，26例)、增生型息肉患者(IP,蓝色，13例)、腺瘤型息肉患者(AP,红色，17例)血清样本的一级质谱分析。(A-B)从NC、IP和AP样品获得的质量范围为1至10kDa的光谱的总和。(C)样品在成分分析中的二元图，具有最具差异的两个峰(m/z:1866.7Da，5066.2Da)。(D)主成分分析成分分析中NC、IP和AP样品的3D图。(注横坐标m/z值表示质荷比，是蛋白质或多肽的相对分子量，以单位为Da(达尔顿)为计量单位，纵坐标上是Intensity代表蛋白质或多肽的相对含量，即在样品中的相对丰度)。
图2为本发明中筛选出的六个差异多肽的血清蛋白多肽混合物的凝胶色谱分离图；其中，a为图名质荷比为2865.37二级质谱图；b为图名质荷比为2191.88二级质谱图；c为图名质荷比为1619.15二级质谱图；d为图名质荷比为1351.03二级质谱图；e为图名质荷比为1194.35二级质谱图；f为图名质荷比为2663.05二级质谱图。
图3为本发明中CLU蛋白的标准曲线，其中，横坐标表示CLU蛋白的浓度(单位：pg/mL)；纵坐标表示在450nm的吸光值(OD值)。
图4为本发明中内部验证阶段各组人群血清中CLU蛋白表达水平，其中，横坐标表示组别，其中NC表示健康对照组；IP表示增生组；AP表示腺瘤组；纵坐标表示CLU蛋白的浓度(单位：pg/mL)。其中***表示P≤0.001。
图5为本发明中筛选阶段3组人群血清中CLU蛋白表达水平。
图6为本发明中蛋白印记技术验证CLU蛋白在对照组和腺瘤组中的表达水平，其中，NC表示健康对照组；AP表示腺瘤组；-actin为内参蛋白。
图7为本发明中筛选阶段合并验证阶段3组人群血清中CLU蛋白表达水平，其中，横坐标表示组别，其中NC表示健康对照组；IP表示增生组；AP表示腺瘤组；纵坐标表示CLU蛋白的浓度(单位：pg/mL)。其中***表示P≤0.001。
图8为本发明中CLU蛋白的ROC曲线图，其中，其中横坐标表示1-特异度；纵坐标表示敏感度。
具体实施方式
下面将结合本发明具体实施，对本发明中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明各实施例中所述方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明在下面实施例中使用的仪器、试剂如下：
1、仪器
质谱：Orbitrap，Thermo Scientific；液相EasynLC：1200，Thermo Scientific；质谱柱；C181.9 mm 150μm×120mm，Thermo Scientific；质谱预柱；C183 mm100μm×20mm，Thermo Scientifi；高速离心机：Pico 17Centrifuge，Thermo Scientific；热干浓缩仪：SC210A，Thermo Scientific；NanoDrop：2000C，Thermo Scientific；移液器：2.5\10\20\200\1000，Eppendorf。
2、试剂
甲酸(FA)；500mL，Sigma，RT；H2O：596mL，娃哈哈，RT；氨水(HPLC分级)：500mL，Sigma，4℃；乙腈(ACN)；4L，Sigma，RT；一次性吸头；0.5-10mL 2-200mL、00-1000mL，Axygen；离心管：1.5mL，Axygen；上样小瓶；Thermo Scientific；96孔板：Thermo Scientific；MB-WCX磁珠试剂盒，德国Bruker Daltonics公司。
3、毛细管高效液相色谱参数设置
每份样品使用Easy nL C 1200nL流速HPLC液相系统进行分离。缓冲液A是0.1％甲酸水溶液，缓冲液B是0.1％甲酸乙腈溶液。色谱柱以95％的A液平衡。样品从自动进样器上样到质谱预柱C18trap column(C183mm 0.10×20mm)，然后通过分析柱C18 column(C181.9mm 0.15×120mm)进行分离，流速为600nL/min。相关液相梯度如表1所示：
表1液相色谱洗脱梯度参数
时间(min) A(0.1％FA/H2O) B(0.1％FA/ACN) 流速(nL/min)
0 92％ 8％ 600
8 88％ 12％ 600
48 77％ 23％ 600
68 64％ 36％ 600
69 5％ 95％ 600
78 5％ 95％ 600
4、质谱鉴定参数设置
每份样品经毛细管高效液相色谱分离后用Orbitrap Fusion质谱仪(ThermoSceientific)进行质谱分析。主要参数设置见表2：
表2质谱仪器参数设置
实施例1
一、样品采集
I.选取2021年1月至2023年12月期间西安医学院第一附属医院消化内科收治的单纯结直肠息肉患者90例，根据病理诊断分为两组：其中增生组28例和腺瘤组62例，同时收集同期内镜下显示黏膜基本正常的无结直肠息肉的正常健康人群作为对照组(正常健康组/对照组)，收集各组人群的血清及组织样本。
上述单纯结直肠息肉的收集的一般临床资料包括性别、年龄、BMI、是否感染HP、吸烟史、饮酒史、息肉的大小、部位、数量等指标。
其中，HP感染：通过碳13呼气试验或碳14呼气试验阳性或组织病理学检查其中一项阳性，即认为存在HP感染。
吸烟史：使用吸烟指数(SI)评估，SI≥200即表示有吸烟史，计算公式＝每日吸烟支数×吸烟年数。
饮酒史：男性平均每日乙醇摄入量≥40g，女性≥20g，并且饮酒历史超过5年，即认为存在饮酒史。
BMI分类：根据中国肥胖问题工作组提出的指南，将BMI分为偏瘦(＜18.5)、正常(18.5≤BMI＜24.0)、超重(24≤BMI≤28.0)和肥胖(BMI＞28)四类。
息肉部位：根据息肉发生的部位分为左半结肠、右半结肠和全结肠。其中，左半结肠包括脾曲、乙状结肠、降结肠和直肠；右半结肠包括肝曲、盲肠、升结肠和横结肠；全结肠指左半结肠和右半结肠均有息肉。
息肉大小：按照息肉最大径将其分为≤5mm、5-10mm、10-15mm和＞15mm四组。
息肉数量：单发息肉的定义是在结肠镜检查时仅发现1枚息肉者；多发息肉是指镜下发现≥2枚息肉，其中多发息肉病理类型以分化程度最低的类型为准。
在肠道准备期间，使用复方聚乙二醇电解质散剂(商品名和含量68.56克/袋，国药准字H20030827，深圳万和药业股份有限公司生产)。所有结直肠息肉患者在检查前一天下午16:00-18:00之间服用1袋1L的药物配制溶液。上午检查的患者在检查当天凌晨4:00-6:00之间服用2袋2L装的药物配制溶液。下午接受检查的患者将在检查当天上午6:00-8:00之间服用由2袋药物配制成的2L溶液。检查前一天，建议患者进食易消化的半流质饮食，晚饭后禁食，但可以喝水。检查当天，患者需要禁食，并在肠道准备期间进行轻微活动以促进肠道蠕动。
II.组织样本收集：经过有经验的内镜医生的判断和病理检验结果的判定，在内镜下用一次性活检钳取增生型息肉患者和腺瘤型息肉患者的2cm以下的肠息肉组织置于EP管中，一部分保存于-80℃，一部分用4％多聚甲醛固定制备石蜡标本。
III.血清标本(血清样品)收集：上述增生型息肉患者和腺瘤型息肉患者以及正常健康对照组清晨空腹收集血液5mL，置于收集管中，使用离心机2000rpm/min，离心15min，收集上层血清分装于Eppendorf管中，得到血清样品，保存于-80℃冰箱。
二、试剂准备
1、ELISA试剂准备
(1)洗涤液(1×)：如果洗涤液(20×)有晶体析出，37℃加热至晶体全部溶解。按照1：20稀释倍数进行稀释：如取30mL浓缩洗涤液(20×)，加入570mL超纯水或去离子水，得到洗涤液(1×)。
(2)检测抗体(1×)：开盖前瞬时离心，按照1：100比例进行稀释，稀释前根据预先计算实验所需的总量配制(100μL/孔)，实际配制时多配制0.1-0.2mL。如10μL检测抗体浓缩液(100×)加990μL抗体稀释液进行配制，轻轻混匀。
(3)HRP标记链霉亲和素(1×)：开盖前瞬时离心，按1：100比例进行稀释，稀释前根据预先计算实验所需的总量配制(100μL/孔)，实际配制时多配制0.1-0.2mL。如10μL HRP标记的链霉亲和素浓缩度(100×)加990μL抗体稀释液进行配制，轻轻混匀。
(4)待检测样本：不同的样本使用相应的样本稀释液进行稀释，如果样本检测值超过标曲最高范围，可将样本进行一定的稀释后再进行实验，使样本的检测值处于标曲范围内，不同的样本的稀释倍数需自行优化。
梯度稀释的标准品：例如用2mLPT1-ef标本稀释液复溶标准品。
2、WB实验试剂准备
(1)1×TBST缓冲液：称取2.4228g TRIS，8.184g NaCl，加入ddH2O定容至1L，磁力搅拌使其溶解，再加入500LTween-20室温保存。
(2)1×电泳缓冲液：称取3g TRIS，14.4g Glycine，1g SDS，加入ddH2O定容至1L，磁力搅拌使其溶解，室温保存。
(3)1×转膜缓冲液：称取3g TRIS，14.4g Glycine，加入ddH2O定容至800mL，磁力搅拌使其溶解，加入200mL甲醇，室温保存。
(4)10％过硫酸铵(APS)：称取1gAPS粉末，加入ddH2O定容至10mL，溶解后分装至1.5mL离心管中，置于-20℃保存。
(5)10％SDS(十二烷基磺酸钠100mL)：称取10g SDS，加入ddH2O定容至100mL，室温保存。
(6)A液(30％丙烯酰胺储存液100mL)：称取0.8g N,N-亚甲基双丙烯酰胺和29.2g丙烯酰胺，取100mLddH2O，混匀后过滤，放于4℃冰箱避光储存备用。
(7)B液(4×分离胶缓冲液100mL)：称取18.17g Tris base，量取80mL ddH2O，溶解Tris base，加入4mL 10％SDS，调整pH至8.8，定容至100mL，4℃保存。
(8)C液(4×浓缩胶缓冲液100mL)：称取12.12g Tris base，量取80mL ddH2O，溶解Tris base，加入4mL 10％SDS，调整pH至6.8，最后定容至100mL，4℃储存备用。
(9)5％封闭液(100mL)：称取5g脱脂奶粉，加入1×TBST100mL，磁力搅拌混匀，4℃冰箱保存。
三、样品检测
1、MALDI-TOF质谱分析
将收集到的健康对照组、增生组、腺瘤组的血清样品每例取5μL与MB-WCX磁珠试剂盒中的MB-WCX 10μL和MB-WCX结合缓冲液10μL混合后，然后加入10μLWCX-MB磁珠，通过上下移液管混合。在室温下培养5分钟后，将试管放入磁性分离器中，收集珠子直到上清液澄清1分钟。取出上清液，并用试剂盒中的MB-WCX冲洗缓冲液100μL洗涤磁珠三次。然后，用5μLMB-WCX洗脱缓冲液和5μLMB-WCX稳定缓冲液从磁珠中洗脱肽部分。最后，将1μL洗脱液和1μL50％乙腈中的α-氰基-4-羟基肉桂酸加入到MALDI-TOF MS靶标上，并在MALDI锚定表面上两次添加0.5％三氟乙酸。为了评估再现性，所有样品一式三份。
2、ClinProTools分析
使用Autoflex III MALDI-TOF MS(Bruker)和FlexControl软件(3.0版，Bruker)进行所有目标的分析。使用质量范围在1000-10000Da的肽和蛋白质标准校准混合物进行质量校准。所有检测均采用盲法进行，包括健康对照组、增生组、腺瘤组三个组别的血清分析。使用Flex分析软件(3.0版；Bruker)分析所有血清数据，并使用ClinProTools软件(2.2版；Bruker)进行肽模式识别和鉴定。
3、肽鉴定
将ClinProTools软件识别出来的差异肽段通过液相色谱-质谱(LC-MS)分析，使用了NanoAcquity UPLC(美国沃特斯)和LTQ Orbitrap XL质谱仪(美国赛默飞世尔科学公司)进行集成。分析中使用了C18柱(C18，3μm，0.10×20mm，nanoAcquity)捕获20μL样品，并以600nL/min的速度进行3分钟的持续流动。然后样品被加载到分析柱(C18，1.9μm，0.15×120mm，纳米级)中。流动相A是由5％乙腈和0.1％甲酸组成的溶液，流动相B是由95％乙腈和0.1％甲酸组成的溶液。柱温保持在35℃。LTQ OrbitrapXL质谱仪在数据相关模式下运行，可以自动在MS和MS/MS采集之间切换。使用Q Exactive质谱仪在m/z 300处进行2个微扫描(m/z 300–1400)的全扫描质谱，质量分辨率为70000。随后进行了10次连续的LTQ-MS/MS扫描。动态排除设置为2次重复计数，重复时间为18秒，排除时间为80秒。在MS/MS中，前体离子以25％的归一化碰撞能量在默认激活q为0.25的情况下被激活。获取的数据将在Uniprot人类蛋白序列数据库(https://www.uniprot.org/)中进行搜索和鉴定。
4、WB实验
4.1组织蛋白提取实验操作
(1)取40mg的新鲜增生型患者和腺瘤型患者的组织剪碎后放入1.5mL的EP管中。
(2)准备RIPA裂解液，放在冰上。根据每20mg组织需要约200μL裂解液的比例，将A液(裂解液)、B液(蛋白酶)和C液(磷酸酶抑制剂)按照1％A液、1％B液、1％C液的比例混合在无菌的EP管中，制成溶液D。
(3)将溶解液加入EP管中，使用玻璃匀浆器震荡研磨组织块，直到完全溶解。震荡条件为：1200转，5个循环，每个循环震荡40秒，之间间隔10秒。
(4)将EP管放在冰上，继续裂解1小时。
(5)在4℃下，以12000rpm的速度离心20分钟。
(6)小心地将上清液转移到另一个干净的EP管中。
(7)使用BCA定量方法(通过Nano Drop测定蛋白质浓度)进行蛋白质定量。
(8)将5×Loading Buffer与蛋白质按照1:4的比例混合均匀，煮沸5分钟后存储在4℃备用。
4.2SDS-PAEG胶的制备
(1)使用洗洁精清洗玻璃板，并将其放入烘箱中烘干。然后将玻璃板小心地固定在制胶架上。
(2)按照表3的配方制备分离胶。将各成分充分混合后，立即倒入胶液，确保没有气泡产生。当胶液的液面达到玻璃板的上缘约2cm处时，停止倒胶。接着使用1mL移液枪缓慢而轻柔地向玻璃板上缘加入1mL无水乙醇，然后压平分离胶。
表3SDS-PAEG胶的制备
(3)静置30分钟后，倾斜制胶架将无水乙醇倒掉，用干净的吸水纸吸干剩余的无水乙醇。
(4)按照表3的配方制备浓缩胶。将各组分充分混合，避免产生气泡，然后将混合液倒入分离胶的上层，直到液面超出玻璃板的上缘。接下来，缓慢地插入梳子，让胶液在室温下静置30分钟。
(5)当胶凝固后，可以立即进行样品上样，或者将其放入超纯水中，能在4℃下保存3天。
4.3电泳
(1)将制备好的凝胶组装到电泳槽中，并向内外槽中加入电泳缓冲液。慢慢地拔出梳子，确保凝胶的平整性。
(2)迅速将制备好的蛋白样品小心地加入样品孔中。在左右两侧的孔中分别加入3μL的蛋白标记物。
(3)插入电极，确保正负极连接正确。首先设置80V的恒压进行电泳，大约30分钟，直到浓缩胶与分离胶的交界处。然后切换到110V的恒压继续电泳，直到蓝色的加载缓冲液跑到凝胶底部或者目标蛋白跑到凝胶中间位置。
4.4转膜(湿转法)
(1)裁剪一块PVDF膜，使其稍大于胶的大小。将PVDF膜浸泡在无水甲醇中激活，大约60秒，然后将其浸泡在预冷的转膜液中。同时，将海绵和滤纸也浸泡在预冷的转膜液中。
(2)从电泳槽中取出玻璃板，小心地将两片板分开。将胶取出，放入装有转膜液的操作盘中，保持湿润。使用刀片将浓缩胶部分切除。
(3)打开转膜夹，首先将黑色板(负极)放在转膜液中。然后从下往上依次放置海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵。注意，在放置PVDF膜时，可以在胶上倒入少量转膜液，以避免产生气泡。夹好转膜夹。
(4)将转膜夹放入转膜架中，确保转膜夹的黑色板与转膜架的黑色面对应。倒入预冷的转膜液，使其覆盖转膜夹。插入正负极电极，并连接电源。将电流调至250mA，恒定电流下转膜约2.5小时。为了避免转膜液过热，可将电转槽放入冰盒中，并在电转槽周围铺满碎冰。
4.5封闭与抗体孵育
(1)在转膜结束后，将膜取出并浸泡在5％牛奶封闭液中。将膜放在摇床上慢慢摇动，常温下封闭60分钟。
(2)根据抗体说明书的指引，将抗体按比例加入抗体孵育液中(抗体孵育液由上述的5％牛奶封闭液和1×TBST混合而成，比例为1:9)。将PVDF膜正面朝下浸泡在抗体孵育液中，确保避免产生气泡。在室温下慢慢摇动30分钟，然后将膜放入4℃的冰箱保存过夜。
(3)第二天，在摇床上缓慢复温约30分钟。然后取出PVDF膜，并用1×TBST洗涤膜三次，每次约10分钟。
(4)根据抗体说明书的建议，选择适当比例稀释二抗。将PVDF膜浸泡在二抗孵育液中，正面朝下，注意避免产生气泡。在室温下放置在摇床上孵育1.5小时。
(5)取出PVDF膜，使用1×TBST洗涤膜，每次10分钟，共洗涤三次。
4.6发光
(1)将化学发光液A液和B液按照体积比1:1的比例混合，制备成工作液(现配现用)。每平方厘米的膜大约需要0.1mL的工作液。在配制和使用工作液时要注意避光，同时打开操作系统。
(2)使用镊子夹起PVDF膜，并用滤纸轻轻吸干上面的洗涤液。然后将膜完全浸泡在制备好的工作液中。
(3)将浸泡过的PVDF膜取出，进行曝光并采集图像。
5、ELISA技术
订制ELISA试剂盒(Human Clusterin ELISAKit，1×96well plate，订购号CatNo.KE00110，sandwich ELISA,武汉三鹰生物技术有限公司)。在进行ELISA实验之前，确保所需试剂在室温下平衡20-30分钟(除了检测抗体浓缩液和HRP标记链霉素亲和素浓缩液，它们可以立即使用)；在加入标准品、样本和不同试剂时，更换枪头，避免接触微孔板的内表面，并使用不同的加样槽。以下是具体的实验步骤：
(1)取出所需的酶标板条，将剩余的酶标板条放入带有干燥剂的铝箔袋中，密封后存放在4℃，并在一周内使用完毕，以确保板条的稳定性。
(2)进行样品加样操作，设置零孔、标准孔和待测样本孔。将样品稀释液加入零孔中，加入100μL。然后在其他孔中，加入梯度稀释的标准品或待测样本，每孔加入100μL。注意避免产生气泡。建议对标准品和样本都进行复孔处理，以减少实验误差，并确保连续加样完成，时间控制在10分钟内。
(3)盖上酶标板盖，将酶标板放置在37℃下孵育2小时。
(4)进行洗涤步骤。轻柔地揭开封板膜，倒掉液体，并轻轻拍干。使用1×洗涤液洗涤酶标板条，每孔加入400μL的洗涤液。洗涤后，倒掉液体并轻轻拍干酶标板条。重复此步骤4次，以确保洗涤干净，避免异物进入孔中和酶标板条干燥。
(5)每孔加入100μL的检测抗体(1×)，盖上封板膜，继续在37℃下孵育1小时。
(6)重复步骤4的洗涤步骤。
(7)每孔加入100μL的HRP标记链霉亲和素(1×)，盖上封板膜，再次在37℃下孵育40分钟。
(8)重复步骤4的洗涤步骤。
(9)进行显色步骤：每孔加入100μL的TMB显色液，保持在37℃下避光显色15分钟(如果颜色偏浅，可适当延长显色时间，但不超过30分钟)。在显色过程中，确保始终处于避光状态，显色前应该是无色透明的，如果有变色，请勿使用。
(10)终止反应：每孔加入100μL的终止液，使蓝色变为黄色。终止液的加样顺序与TMB显色液一致。
(11)进行读数：以630nm波长为校正波长，在酶标仪上使用450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。在加入终止液后的5分钟内进行读数。
(12)进行数据分析：每个标准品和样本的OD值减去零孔的OD值，并进行复孔设置，取平均值。将标准品的浓度作为横坐标，OD值作为纵坐标，在专业软件(如Origin、ELISACalc等)中进行四参数拟合。根据样本的OD值通过标准曲线推算出拟合浓度，并乘以稀释倍数，得到样本的实测浓度。操作流程如表4所示：
表4 ELISA技术操作流程
6、数据分析
质谱分析原始数据为RAW文件，用软件Sequest HT搜索引擎和ThermoProteomeDiscoverer 2.5.0搜索引擎和Uniprot Human数据库进行数据库检测和蛋白质鉴定。作图采用GraphPadPrism 6.0版。
7、搜库参数设置
搜库将RAW文件通过Proteome Discoverer提交至Sequest服务器，选择已经建立好的数据库，然后进行数据库搜索。相关参数如下表5：
表5搜库参数
Item Value
Enzyme NoEnzyme
Variablemodifications Oxidation(M)；Acetyl(ProteinN-term)，Deamidated(N)
PeptideMassTolerance ±15ppm
FragmentMassTolerance 0.02Da
peptideconfidence High
peptidelength >4
注：结果过滤参数为：Peptide FDR≤0.01。
8、统计学方法
在统计分析中，我们使用了SPSS 25.0(IBM Corporation,NewYork,USA)和GraphPad Prism 6.0(GraphPad,San diego,USA)。对于计数数据，我们使用了例数和百分比(n，％)进行描述。对于定量数据，我们使用Shapiro-Wilk检验来检验正态分布性，使用Levene检验来检验方差的齐性。对于符合正态分布的定量数据，我们使用均值±标准差进行表示，并使用独立样本T检验分析来比较两组之间的差异。对于不符合正态分布(即偏态分布)的数据，我们使用“中位数(四分位数间距)”进行表示，并使用秩和检验进行两组之间的比较。对于分类数据，我们使用卡方检验来比较两组之间的二分类资料。如果不满足卡方检验的条件(即样本量≥40，且至少一个理论频数1≤T≤5使用校正卡方检验)，样本量＜40，或者至少1个理论频数T＜5则使用Fisher确切概率法。其中，P＜0.05被认为具有统计学差异。
四、结果
1、增生组与腺瘤组肠息肉患者的一般资料比较
1.1两组肠息肉患者性别和年龄之间比较
本发明共收集90例单纯结直肠息肉患者，其中增生组28例，年龄在24-72岁之间，平均年龄为(49.14±10.87)岁，腺瘤组62例，年龄在26-77岁之间，平均年龄为(54.63±12.38)岁，两组在年龄之间有统计学意义。
两组在性别之间无统计学差异，其中增生组中男性有17人，占比60.7％，女性11人，占比39.3％，腺瘤组息肉中男性有36人，占比58.1％，女性26人，占比41.9％，且两组之间男性患者均多于女性。
1.2两组肠息肉患者个人史和感染HP之间比较
两组息肉患者在吸烟史、饮酒史、BMI及是否感染HP之间比较，结果见表6。
表690例增生组及腺瘤组患者的个人史分布特征
表6的结果提示均无统计学差异。
1.3两组肠息肉患者的数量、部位和大小之间比较
增生组和腺瘤组肠息肉患者的临床特征比较结果见表7。
表7290例增生组及腺瘤组患者的息肉特征分析
结果表明息肉的大小在两组之间有统计学意义，其中腺瘤性息肉以5-10mm居多，增生性息肉≤5mm居多，而息肉的数目和部位之间无统计学意义。
2、正常健康组、增生组及腺瘤组中血清蛋白质表达的差异
2.1筛选阶段
收集健康人群对照组(正常健康组/对照组)26例、增生性肠息肉患者(增生组)13例、腺瘤性肠息肉患者(腺瘤组)17例，利用血清蛋白做一级质谱色谱图分析，以寻找差异表达的蛋白峰，旨在评价血清蛋白质组学对结直肠息肉发生早期癌变的诊断价值,结果见图1A-B所示。主成分发现各组别之间存在明显差异性，见图1C-D。
结果证实各组之间确实存在显著差异表达峰，即各组之间具有可比性。
经统计学分析，各组血清样本中共有63条多肽段存在差异性表达(详见表9)。根据增生组/对照组、腺瘤组/对照比值逐渐递减趋势，总共筛选出5条肽段，其中质荷比(m/z)分别为2865.37(增生组/对照组＝0.62；腺瘤组/对照组＝0.35)、2191.88(增生组/对照组＝0.81；腺瘤组/对照组＝0.58)、1619.15(增生组/对照组＝0.56；腺瘤组/对照组＝0.40)、1351.03(增生组/对照组＝0.50；腺瘤组/对照组＝0.43)、1194.35(增生组/对照组＝0.65；腺瘤组/对照组＝0.45)。而质荷比(m/z)为2663.05(其中增生组/对照组＝0.30；腺瘤组/对照组＝0.30)的肽段是增生组/对照组和腺瘤/对照组的比值最低者且数值相近，为了探究此肽段在各组血清中的差异，共选取6条肽段做二级质谱分析寻找差异表达蛋白。经过质谱分析共寻找到6种差异蛋白(具体蛋白信息见表9)，其中筛选出的6种差异多肽的血清蛋白多肽混合物的二级凝胶色谱分离图见图2所示。
表83组人群血清肽段构成情况及统计分析
注：其中标红部分是根据腺瘤/对照、炎症/对照比值逐层降低的筛选标准筛选的显著血清多肽段。*表示
P≤0.05；**P≤0.01；***表示P≤0.001。
表9增生组和腺瘤组与对照相比差异表达多肽段的一般特征
分子量 肽段序列 位置 蛋白ID 蛋白名称
2865.37 K.NPKFMETVAEKALQEYRKKHREE. 427-449 P10909 Clusterin
2191.88 K.SSSYSKQFTSSTSYNRGDST.F 575-595 P02671 Fibrinogenalphachain
1619.15 K.DVFLGMFLYEYAR.R 348-360 P02768 Albumin
1351.03 D.SGEGDFLAEGGGVR.G 22-35 P02671 Fibrinogenalphachain
1194.35 D.SGEGDFLAEGGGV.R 22-34 P02671 Fibrinogenalphachain
2663.05 A.DEAGSEADHEGTHSTKRGHAKSRPV.R 605-629 P02671 Fibrinogenalphachain
2.2内部验证阶段
内部验证阶段收集正常健康对照组血清45例，增生组血清15例、腺瘤组血清45例，根据组别将各组血清随机匹配5例形成一组即正常健康组9组，增生组5组，腺瘤组9组。利用ELISA检测血清样本的目标蛋白CLU表达浓度，测各检测孔吸光值，计算各孔的浓度值，绘制ELISA标准品的曲线图(见图4)。
结果如表10和图4所示：提示目标蛋白CLU在结直肠腺瘤组患者中血清浓度显著低于增生性息肉组患者和健康对照组，并且CLU蛋白浓度在正常健康组、增生组、腺瘤组中呈现梯度逐层降低趋势，各组之间具有统计学差异。
表10内部验证阶段各组人群血清CLU蛋白表达水平
组别 例数/分组 CLU蛋白浓度(pg/mL) F值 P值
正常健康组(NC) 45例(9组) 4069.99±1288.16 13.90 0.000***
增生组(IP) 15例(5组) 2142.04±233.73
腺瘤组(AP) 45例(9组) 1890.48±594.97
注：***表示P≤0.001。
筛选阶段收集的56例血清样本，其中正常健康组26例，增生组13例，腺瘤组17例进行分组(与内部验证阶段的实验分组保持一致性)，即正常健康组5组，增生组3组，腺瘤组4组，再次进行ELISA检测各组血清样本中目标蛋白CLU浓度，分析各组CLU蛋白的差异。结果再次证实CLU蛋白在腺瘤组血清浓度显著低于对照组，三组之间具有统计学差异(结果见表11和图5)。
表11筛选阶段各组人群血清中CLU蛋白表达水平
组别 例数/分组 CLU蛋白浓度(pg/mL) F值 P值
正常健康组(NC) 26例(5组) 5232.28±1033.91 17.21 0.001***
增生组(IP) 13例(3组) 3649.84±495.88
腺瘤组(AP) 17例(4组) 2060.74±604.49
注：***表示P≤0.001。
验证阶段随机收集了正常健康对照组组织样本2例和腺瘤组组织样本2例进行Western Blotting实验验证CLU蛋白在各组之间中的表达情况。结果再次证实与正常健康对照组组织样本相比，CLU蛋白在腺瘤组的表达水平下降(见图6)。
2.3外部验证阶段
为验证目标蛋白CLU在腺瘤性息肉中的诊断预测价值，合并筛选阶段与验证阶段收集的血清样本中的各组检测的CLU蛋白浓度，分析各组之间CLU蛋白的表达水平，结果再次证实目标蛋白浓度在各组中呈现梯度降低趋势，各组血清中CLU蛋白浓度存在显著统计学差异(见表12和图7)。
表12筛选阶段合并验证阶段3组人群血清中CLU蛋白表达水平
组别 例数/分组 CLU蛋白浓度(pg/mL) F值 P值
正常健康组(NC) 71例(14组) 4485.10±1261.41 23.11 0.000***
增生组(IP) 28例(6组) 2895.94±895.68
腺瘤组(AP) 62例(13组) 1942.88±577.90
注：***表示P≤0.001。
利用筛选阶段和验证阶段各组CLU蛋白浓度，绘制出ROC曲线图(Receiveroperating characteristic curve)，利用ROC曲线分析评价该蛋白在腺瘤性息肉和非腺瘤性息肉的诊断效果，并确定诊断效果最佳的临界值。(见图8)。ROC曲线下面积AUC＝0.92，其中CLU＜2895.78pg/mL时即诊断腺瘤性息肉可能性大。
由上述实验结果可知，正常健康组、增生组、腺瘤组3组之间的血清蛋白谱共发现63条多肽存在差异性表达(P≤0.05)，CLU蛋白在正常健康组、增生组、腺瘤组中表达成梯度降低趋势。根据生物标志物在息肉发展为腺瘤的过程中存在梯度表达的趋势，选择分析了其中质荷比为2865.37、2191.88、1619.15、1351.03、1194.35六种多肽，并鉴定出了丛生蛋白(Clusterin,CLU)、白蛋白(Albumin,ALB)和血清纤维蛋白原链(Fibrinogen alphachain,FGA)3种蛋白。
在本发明中，CLU蛋白在正常健康组、增生组、腺瘤组中的表达成梯度降低趋势，为评价CLU蛋白对腺瘤性息肉的诊断预后价值，进行ROC曲线分析评价目标蛋白对腺瘤性息肉和非腺瘤性息肉受试者的诊断效果，其中ROC曲线下面积(AUC)为0.92，表明目标蛋白的诊断准确性高。利用ROC曲线下坐标进一步确定最佳诊断临界值，值得注意的是CLU＜2895.78pg/mL时约登指数数值最大，即浓度低于2895.78pg/mL时诊断腺瘤性息肉可能大，强烈推荐结肠镜检查，有可能进一步发展为结直肠癌的风险，因此临床医生和患者应该提高警惕。
综上，CLU蛋白有望成为肠道息肉发生早期癌变的筛查工具蛋白，可能为结肠癌提供靶向治疗的应用前景。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形在内。

Claims (5)

1.一种结直肠腺瘤和结直肠增生早期筛查的生物标志物在制备用于结直肠腺瘤和/或结直肠增生筛查或诊断产品中的应用，其特征在于，
所述生物标志物为丛生蛋白CLU；
所述丛生蛋白CLU为一种血清标志物中的标志物；
所述产品包括试剂盒、检测试剂或抗体芯片；
所述试剂盒包括结直肠腺瘤和/或结直肠增生筛查或诊断试剂盒；
所述试剂盒包括特异性结合所述丛生蛋白CLU的抗体或抗体片段，还包括检测所述丛生蛋白CLU的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂包括检测血清生物标志物的试剂中的标志物的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测血清生物标志物的试剂中的标志物的试剂为ELISA试剂、免疫印迹试剂、免疫荧光试剂、免疫组化试剂、蛋白芯片或质谱检测用试剂、PCR检测试剂、原位杂交用试剂，或测序用试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测血清生物标志物的试剂为PCR检测试剂包括CLU检测抗体、HRP标记链霉亲和素、显色TMB。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测血清生物标志物的试剂为ELISA试剂包括SYBR Green、RT Enzyme mix、引物。
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