TW202042836A - 血球凝集素結合肽 - Google Patents

Abstract

[課題]本發明提供一種抗流感病毒活性明顯高於iHA100的化合物、用以製造該化合物的中間體以及包含上述高活性化合物的藥物等。[解決手段]關於一種血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物，該血球凝集素結合肽為：（1）由序列編號1或2所示之胺基酸序列所組成的多肽：Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys（序列編號1）、Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys（序列編號2）等。

Description

血球凝集素結合肽

本發明係關於一種具有極高的抗流感病毒活性的血球凝集素結合肽、用以預防或治療流感的藥物、及流感的檢測藥物等。

流感病毒係具有高感染力與病原性的病毒，其蔓延作為廣泛性流行病（pandemic）而對人體表現出大範圍的病原性。

作為針對流感病毒的藥品，廣泛使用阻礙流感病毒游離時所需之神經胺酸酶（neuraminidase）的Zanamivir（商品名：瑞樂沙，Relenza（商標））、Oseltamivir（商品名：克流感，Tamiflu（商標））、Peramivir（商品名：瑞貝塔，Rapiacta（商標））、Laninamivir（商品名：INAVIR（商標））。又，阻礙病毒之去核過程的Symmetrel（商品名：金剛烷胺，Amantadine）或Flumadine（商品名：金剛乙胺，Rimantadine）、阻礙帽依賴型核酸內切酶（cap dependent endonuclease）的Baloxavir marboxil（商品名：Xofluza（商標））已為習知藥品。上述藥品，特別是針對神經胺酸酶之抗流感藥被廣泛用作藥品，但病毒的變異所導致的抗藥性成為問題。

另一方面，血球凝集素作為流感病毒侵入宿主細胞時所需的蛋白質已為人所知，已有報告一種針對此標靶的抗病毒分子。作為既有抗病毒藥，以血球凝集素為標靶的抗病毒分子對於具有抗藥性的病毒是有效的。因此，與既有藥品不同之針對標靶分子的抗病毒分子，從抗藥性的觀點來看，其有用性亦較高。

作為針對血球凝集素的抗病毒分子，已有報告與血球凝集素結合的抗體分子（例如，專利文獻1～3）。另一方面，抗體藥品具有高活性，但由於抗體藥品在活體內被識別為異物而產生的中和抗體，有時會明顯減少藥劑的效價。

近年來，作為新的分子群，已有報告N－甲基胺基酸或D－胺基酸等具有特殊骨架的肽分子，其不僅顯示高結合力與活體穩定性，而且相較於抗體，其分子量極小。因此，作為可解決以往的抗體藥品所存在之問題的分子群而受到矚目（例如，非專利文獻1～4）。

我等著眼於具有該特殊骨架的肽分子，搜尋與血球凝集素對應的肽分子。iHA100係與血球凝集素對應的肽分子，其分子量及與一般抗體的投藥途徑大不相同，係在經由鼻腔投予中亦顯示抗病毒活性的抗流感病毒分子（專利文獻4）。另一方面，尚未有報告使iHA100的抗流感病毒活性明顯提升的事例及其結構，其抗流感病毒活性的提升對藥劑的藥效提升大有幫助。 [習知技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1] 國際公開第2018／108086號小冊 [專利文獻2] 國際公開第2018／015012號小冊 [專利文獻3] 國際公開第2017／122087號小冊 [專利文獻4] 國際公開第2013／071904號小冊 [非專利文獻] [非專利文獻1] Nature Reviews Drug Discovery 17, 531－533（2018） [非專利文獻2] Current opinion in chemical biology, 34, 44－52 （2016） [非專利文獻3] Annual Review of Biochemistry, 83, 727－752 （2014） [非專利文獻4] Chemistry, 19, 6530－6536 （2013）

[發明所欲解決的課題] 本發明之目的在於提供一種抗流感病毒活性明顯高於iHA100的化合物、用以製造該化合物的中間體、及包含上述高活性化合物的藥物等。

[發明所欲解決的課題] 本發明係根據下述見解：相較於已知的具有抗流感病毒活性之血球凝集素結合肽，新合成之血球凝集素結合肽具有顯著的活性。

本說明書所揭示的實施態樣之一係關於一種血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物（亦將該等稱為本發明之肽）。

該血球凝集素結合肽為以下（1）至（7）中任一種肽。 （1）由序列編號1或2所示之胺基酸序列所組成的多肽： Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys（序列編號1）、 Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys（序列編號2）。 （2）由序列編號1或2中N末端之Trp為氯乙醯－Trp的胺基酸序列所組成的多肽。 （3）由序列編號1中N末端之Trp為氯乙醯－Trp且透過醯胺鍵對C末端之Cys施予式（I）所示之修飾的胺基酸序列所組成的多肽。 （4）由序列編號2中N末端之Trp為氯乙醯－Trp且將C末端之Lys取代成經施予式（II）所示之修飾的離胺酸衍生物的序列所組成的多肽。 （5）由序列編號1中透過醯胺鍵對C末端之Cys施予式（I）所示之修飾的胺基酸序列所組成的多肽。 （6）由序列編號2中Lys的側鏈包含以醯基修飾的式（II）所示之離胺酸衍生物的序列所組成的多肽。 （7）具有上述（1）至（6）中任一種胺基酸序列、且係缺失、加成、取代或插入1或2個胺基酸之胺基酸序列的肽（其中，排除序列編號1中的C末端之Cys缺失者、及序列編號2中的C末端之Lys缺失者）。

式（I） [化學式9]

（式（I）中，*表示與C末端Cys之羰基的連結部分，A¹ 表示C₈ －C₁₂ 烷基）。 式（II）

[化學式10]

（式（II）中，*表示與C末端Cys之羰基的連結部分，A¹ 表示C₈ －C_{1 2} 烷基）。

血球凝集素結合肽的較佳例如下。 （1）由序列編號1或2所示之胺基酸序列所組成的多肽。 （5）由序列編號1中透過醯胺鍵對C末端之Cys施予式（I）所示之修飾的胺基酸序列所組成的多肽。 （6）由序列編號2中將C末端之Lys取代成經施予式（II）所示之修飾的離胺酸衍生物的序列所組成的多肽；或 （7）具有上述（1）、（5）及（6）中任一種胺基酸序列、且係缺失、加成、取代或插入1或2個胺基酸之胺基酸序列的肽（其中，排除序列編號1中的C末端之Cys缺失者、及序列編號2中的C末端之Lys缺失者）。

血球凝集素結合肽的較佳例係血球凝集素結合肽為環狀。

血球凝集素結合肽的較佳例係以下列式（III）或（IV）表示。

[化學式11]

（式（III）中，式A² 表示以－NH₂ 所示之基團或以式（I）所示之基團）。

[化學式12]

（式（IV）中，式A³ 表示以－NH₂ 所示之基團或以式（II）所示之基團）。

與上述不同之血球凝集素結合肽的另一較佳例係以下列式（V）或（VI）表示。

[化學式13]

（式（V）中，式A⁴ 表示以－NH₂ 所示之基團或以式（IIa）所示之基團）。

[化學式14]

（IIa） （式（IIa）中，*表示連結部分，A¹ 表示C₈ －C₁₂ 烷基）。

[化學式15]

式（VI）中，式A⁵ 表示以－NH₂ 所示之基團或以式（I）所示之基團。 與上述不同之血球凝集素結合肽的另一較佳例係以下列式（VII）表示。 [化學式16]

本說明書中與上述不同的另一態樣係一種用以預防或治療流感的藥物（流感的預防劑或治療劑、藥品），其包含上述任一種血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物。

本說明書所揭示的另一實施態樣係關於一種流感病毒檢測藥。該流感病毒檢測藥包含上述血球凝集素結合肽。

本說明書所揭示的另一實施態樣係關於一種流感病毒檢測用套組，其包含上述流感病毒檢測藥。

[發明功效] 如實施例所示，本申請案可提供一種活性明顯高於iHA100的肽、使用該肽的用以預防或治療流感的藥物及流感的檢測藥、用以合成上述肽的中間體。

以下，對用以實施本發明之方式進行說明。本發明並不限定於以下說明的方式，亦包含在本領域中具有通常知識者在已知範圍內由以下實施方式進行適當修正者。

本說明書所揭示的實施態樣之一係關於一種血球凝集素結合肽、血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物。

在本說明書中，血球凝集素係指存在於以流感病毒為代表的多數細菌或病毒表面的抗原性醣蛋白，以「HA」表示。血球凝集素參與病毒對宿主細胞的黏附過程。具體而言，若病毒表面的血球凝集素與作為標的之宿主細胞表面所具有的唾液酸結合，則病毒被細胞膜包覆，以包含病毒之胞內體的形態進入細胞內。接著，胞內體膜與病毒膜融合，病毒基因組（viral genomes）進入細胞內並開始繁殖。 流感病毒分類成A型、B型及C型三種類型，特別是容易引發廣泛性流行病的A型流感病毒之血球凝集素中，至少存在16種亞型，稱為H1～H16。此外，H1、2、5、6、8、9、11、12、13、16、17、18稱為群組1，其他血球凝集素（H3、4、7、10、14、15）稱為群組II。流感的亞型名稱的H表示血球凝集素。

血球凝集素結合肽意為可與血球凝集素結合的肽。是否可與血球凝集素結合，本領域中具有通常知識者可依照習知的方法進行確認。

其藥學上可容許的鹽意為血球凝集素結合肽在藥學上可容許的鹽。鹽的例子可列舉：無機酸（鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等）的加成鹽、有機酸（對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯磺酸、羧酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等）的加成鹽、無機鹼（氫氧化銨或是鹼或鹼土金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽等）、胺基酸的加成鹽等。

其藥學上可容許的溶劑合物意為血球凝集素結合肽在藥學上可容許的溶劑合物或血球凝集素結合肽的鹽在藥學上可容許的溶劑合物。溶劑分子可為已與化合物或其鹽配位者，溶劑合物的例子為水合物及醇合物。

該血球凝集素結合肽為以下（1）至（7）中任一種肽。 （1）由序列編號1或2所示之胺基酸序列所組成的多肽： Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys（序列編號1）、 Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys（序列編號2）。 （2）由序列編號1或2中N末端之Trp為氯乙醯－Trp的胺基酸序列所組成的多肽。 （3）由序列編號1中N末端之Trp為氯乙醯－Trp且透過醯胺鍵對C末端之Cys施予式（I）所示之修飾的胺基酸序列所組成的多肽。 （4）由序列編號2中N末端之Trp為氯乙醯－Trp且將C末端之Lys取代成經施予式（II）所示之修飾的離胺酸衍生物的序列所組成的多肽。 （5）由序列編號1中透過醯胺鍵對C末端之Cys施予式（I）所示之修飾的胺基酸序列所組成的多肽。 （6）由序列編號2中Lys的側鏈包含以醯基修飾的式（II）所示之離胺酸衍生物的序列所組成的多肽。 （7）具有上述（1）至（6）中任一種胺基酸序列、且係缺失、加成、取代或插入1或2個胺基酸之胺基酸序列的肽（其中，排除序列編號1中的C末端之Cys缺失者、及序列編號2中的C末端之Lys缺失者）。

式（I） [化學式17]

（式（I）中，*表示與C末端Cys之羰基的連結部分，A¹ 表示C₈ －C₁₂ 烷基）。C₈ －C₁₂ 烷基係碳數為8～12個的烷基。C₈ －C₁₂ 烷基可為直鏈狀的烷基，亦可為具有分支的烷基。C₈ －C₁₂ 烷基可為C₈ 烷基、C₉ 烷基、C₁₀ 烷基、C₁₁ 烷基及C₁₂ 烷基之任一種。以下各基團中的A¹ 亦為相同。

式（II） [化學式18]

（式（II）中，*表示與C末端Cys之羰基的連結部分，A1表示C8－C12烷基）。

血球凝集素結合肽的較佳例如下。 （1）由序列編號1或2所示之胺基酸序列所組成的多肽。 （5）由序列編號1中透過醯胺鍵對C末端之Cys施予式（I）所示之修飾的胺基酸序列所組成的多肽。 （6）由序列編號2中將C末端之Lys取代成經施予式（II）所示之修飾的離胺酸衍生物的序列所組成的多肽；或 （7）具有上述（1）、（5）及（6）中任一種胺基酸序列、且係缺失、加成、取代或插入1或2個胺基酸之胺基酸序列的肽（其中，排除序列編號1中的C末端之Cys缺失者、及序列編號2中的C末端之Lys缺失者）。

該肽的具體之胺基酸序列的例子如下。 Chloroacetyl－Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－NH₂ （序列編號：3） Chloroacetyl－Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys[gamma －C（＝O）n － C₁₁ H₂₃ ]－NH₂ （序列編號：4） Chloroacetyl－Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys[gamma －C（＝O）n － C₉ H₁₉ ]－NH₂ （序列編號：5） Chloroacetyl－Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－[NHCH₂ CH₂ NHC（＝O）n － C₁₁ H₂₃ ]（序列編號：6） Chloroacetyl－Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－ Cys－[NHCH₂ CH₂ NHC（＝O）n － C₉ H₁₉ ]（序列編號：7）

在本說明書中，用於表示構成為構成本發明之肽及多肽的蛋白質之胺基酸（蛋白胺基酸（proteinogenic amino acids））殘基，係使用本領域中已接受的三字母符號或單字母符號。

作為本說明書所揭示的另一胺基酸，可列舉：不構成蛋白質的胺基酸（亦稱為非蛋白胺基酸（non－proteinogenic amino acids，簡稱為非天然胺基酸）；或具有本領域習知特性的胺基酸特徵的化學合成之化合物等。作為非天然胺基酸的例子，可列舉：主鏈的結構與天然型不同的α,α－二取代胺基酸（α－甲基丙胺酸等）、N－烷基－α－胺基酸、N－烷基－α－D－胺基酸、β－胺基酸；及側鏈的結構與天然型不同的胺基酸（正白胺酸、高組胺酸（homohistidine）、羥脯胺酸等），但並不限定於此。

作為本說明書所揭示的非天然型胺基酸的例子，有將一種N－烷基－α－胺基酸的N－甲基胺基酸，即N－甲基甘胺酸表示為MeGly，將N－甲基丙胺酸表示為MeAla，將N－甲基苯基丙胺酸表示為MePhe。又，作為側鏈的結構與天然型不同的胺基酸的例子，有將4R－羥脯胺酸表示為hydPro。

Chloroacetyl－意為氯乙醯化，Chloroacetyl－Trp表示氯乙醯－Trp。

在本說明書中，多肽係指2個以上的胺基酸以肽鍵結合者，例如，可為8－30胺基酸進行肽結合而成者，可為直鏈狀亦可為環狀。較佳為15或16胺基酸的環狀胺基酸。

又，本發明所述之血球凝集素結合肽亦可被環化（大環化）。在本說明書中，環化意為在1個肽內，相隔1胺基酸以上的2個胺基酸直接或透過連接子（linker）等間接結合，而在分子內形成環狀的結構。

可藉由習知的方法進行環化，例如可依照國際公開WO2016／063969小冊所記載的方法進行。

血球凝集素結合肽的較佳例係以下列式（III）或（IV）表示。

[化學式19]

（式（III）中，式A² 表示以－NH₂ 所示之基團或以式（I）所示之基團）。

[化學式20]

（式（IV）中，式A³ 表示以－NH₂ 或式（II）所示之基團）。

與上述不同之血球凝集素結合肽的另一較佳例係以下列式（V）或（VI）表示。

[化學式21]

（式（V）中，式A⁴ 表示以－NH₂ 所示之基團或以式（IIa）所示之基團）。

[化學式22]

（式（IIa）中，*表示連結部分，A¹ 表示C₈ －C₁₂ 烷基）。

[化學式23]

式（VI）中，式A⁵ 表示以－NH₂ 或式（I）所示之基團。

與上述不同之血球凝集素結合肽的另一較佳例係以下列式（VII）表示。 [化學式24]

環狀肽的具體結構如下。

[化學式25]

[化學式26]

[化學式27]

[化學式28]

[化學式29]

本發明之肽可藉由液相法、固相法、組合液相法與固相法的混合法等的化學合成法；基因重組法等習知的肽之製造方法進行製造。

固相法係使例如具有羥基之樹脂的羥基與α－胺基被保護基所保護之第一胺基酸（通常是作為目標之肽的C末端胺基酸）的羧基進行酯化反應。作為酯化觸媒，可使用1－均三甲苯磺醯基－3－硝基－1,2,4－三唑（MSNT）、二環己基碳二亞胺（DCC）、二異丙基碳二亞胺（DIPCDI）等習知的脫水縮合劑。 接著，使第一胺基酸的α－胺基之保護基脫離，並且加入主鏈的羧基以外的全部官能基都被保護的第二胺基酸，使該羧基活性化，以使第一及第二胺基酸結合。再將第二胺基酸的α－胺基去保護，加入主鏈的羧基以外的全部官能基都被保護的第三胺基酸，使該羧基活性化，以使第二及第三胺基酸結合。重複此操作，合成完作為目標之長度的肽後，將全部官能基去保護。

作為用於固相法的樹脂，可列舉：Merrifield resin、MBHA resin、Cl－Trt resin、SASRIN resin、Wang resin、Rink amide resin、HMFS resin、Amino－PEGA resin（默克股份有限公司）、HMPA－PEGA resin（默克股份有限公司）等。該等樹脂可用溶劑（二甲基甲醯胺（DMF）、2－丙醇、二氯甲烷等）清洗後使用。 作為α－胺基的保護基，只要為習知的保護基，則並無特別限定，可舉例如：苄氧羰基（Cbz或Z）、叔丁氧羰基（Boc）、芴甲氧羰基（Fmoc）、苄基、烯丙基、烯丙氧羰基（Alloc）等。此外，Cbz基可藉由氫氟酸、氫化等去保護，Boc基可藉由三氟乙酸（TFA）去保護，Fmoc基可利用哌啶進行處理而去保護。 作為α－羧基的保護基，只要為習知的保護基，則並無特別限定，可舉例如：甲酯、乙酯、苄酯、叔丁酯、環己酯等。 胺基酸的其他官能基無特別限定，例如，絲胺酸或蘇胺酸的羥基能夠以苄基或叔丁基保護，酪胺酸的羥基係以2－溴苄氧羰基或叔丁基保護。離胺酸側鏈的胺基、麩胺酸或天門冬胺酸的羧基可與α－胺基、α－羧基相同地進行保護。

可使用縮合劑進行羧基的活性化。作為縮合劑，可舉例如：二環己基碳二亞胺（DCC）、二異丙基碳二亞胺（DIPCDI）、1－乙基－3－（3－二甲胺基丙基）碳二亞胺（EDC或WSC）、（1H－苯并三唑－1－基氧基）三（二甲胺基）鏻六氟磷酸鹽（BOP）、1－[雙（二甲胺基）甲基]－1H－苯并三唑鎓－3－氧化物六氟磷酸鹽（HBTU）等。

從樹脂切斷肽鏈可藉由以TFA、氟化氫（HF）等的酸進行處理而進行。

利用基因重組法（轉譯合成系統）製造肽，可使用編碼本發明之肽的核酸來進行。編碼本發明之肽的核酸可為DNA亦可為RNA。 編碼本發明之肽的核酸可用習知的方法或依據其之方法進行製備。例如，可藉由自動合成裝置進行合成。亦可加入限制酵素識別部位用於使所得到之DNA插入載體；或併入核酸序列，來編碼用以將形成之肽鏈以酵素等切出的胺基酸序列。 如上所述，使本發明之肽與細胞穿透肽（cell-penetrating peptide）等融合時，上述核酸亦包含編碼細胞穿透肽的核酸。 為了抑制來自宿主的蛋白酶所引起的分解，亦可使用將目標之肽作為與其他肽之嵌合肽而表現的嵌合蛋白質表現法。此情況下，作為上述核酸，可使用編碼目標之肽及與其結合之肽的核酸。

接著，使用編碼本發明之肽的核酸來製備表現載體。核酸可直接、或以限制酵素消化、或加成連接子等而插入表現載體之啟動子的下游。作為載體，可列舉：來自大腸桿菌的質體（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等）、來自枯草桿菌的質體（pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等）、來自酵母的質體（pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等）、噬菌體（e噬菌體、M13噬菌體等）、病毒（反轉錄病毒、痘瘡病毒、腺病毒、腺相關病毒（AAV）、花椰菜嵌紋病毒、菸草嵌紋病毒、棒狀病毒等）、黏接質體等。

啟動子可根據宿主的種類而適當選擇。宿主為動物細胞的情況下，例如可使用來自SV40（猴病毒四十型）的啟動子、來自CMV（巨細胞病毒）的啟動子。宿主為大腸桿菌的情況下，可使用trp啟動子、T7啟動子、lac啟動子等。 表現載體亦可併入編碼DNA複製起點（ori）、選擇標記（抗生素抵抗性、營養需求性等）、強化子（enhancer）、剪接信號、poly（A）加成信號、標籤（FLAG、HA、GST、GFP等）的核酸等。

接著，以上述表現載體將適當的宿主細胞進行轉形。宿主可視與載體的關係而適當選擇，例如，可使用大腸桿菌、枯草桿菌、芽孢桿菌屬菌）、酵母、昆蟲或昆蟲細胞、動物細胞等。作為動物細胞，例如，可使用HEK293T細胞、CHO細胞、COS細胞、骨髓癌細胞、HeLa細胞、Vero細胞。轉型可根據宿主的種類而依照轉染法、磷酸鈣法、電穿孔法、顯微注射法、粒子槍法等習知的方法進行。藉由將轉型體依照常法進行培養，可出現目標之肽。

從轉型體的培養物精製肽，係將培養細胞回收，於適當的緩衝液中進行懸浮後，藉由超音波處理、凍融等方法將細胞破壞，利用離心分離或過濾得到粗製萃取液。肽分泌至培養液中時，回收上清液。 從粗製萃取液或培養上清液進行精製，亦可用習知的方法或依據其之方法（例如，鹽析、透析法、超濾法、凝膠過濾法、聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS-PAGE）法、離子交換層析法、親和層析法、逆相高效液相層析法等）進行。 所得到之肽可用習知的方法或依據其之方法從游離態轉化成鹽或從鹽轉化成游離態。

轉譯合成系統亦可為無細胞轉譯系統。無細胞轉譯系統包含例如核糖體蛋白質、胺醯tRNA合成酵素（ARS）、核糖體RNA、胺基酸、rRNA、GTP、ATP、轉譯起始因子（IF）、延伸因子（EF）、終止因子（RF）、及核糖體再循環因子（RRF）、以及轉譯所需的其他因子。為了提升表現效率，亦可加入大腸桿菌萃取液或小麥胚芽萃取液。此外，亦可加入兔紅血球萃取液或昆蟲細胞萃取液。 藉由使用透析對包含該等成分的系統連續地供給能量，可生產數100μg至數mg／mL的肽。為了一併從基因DNA進行轉錄，亦可為包含RNA聚合酶的系統。作為市售的無細胞轉譯系統，可使用來自大腸桿菌之系統的羅氏診斷公司的RTS－100（註冊商標）、GeneFrontier公司的PURESYSTEM或NEW ENGLAND Biolabs公司的PURExpress體外蛋白合成試劑盒（In Vitro Protein Synthesis Kit）等，使用小麥胚芽萃取液之系統的ZOEGENE公司或無細胞科學股份有限公司的產品。 根據無細胞轉譯系統，無需精製表現產物即可得到高純度的形態。

在無細胞轉譯系統中，亦可使用將所要求之胺基酸或羥酸連結（醯化）至tRNA的人工胺醯tRNA，來代替由天然胺醯tRNA合成酵素合成的胺醯tRNA。該胺醯tRNA可使用人工核糖酵素來合成。 作為該核糖酵素，可列舉：flexizyme（H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, （2003）, Chemistry & Biology, Vol. 10, 655－662；H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, （2003）, Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077－1084；H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga （2006） Nature Methods 3, 357－359 「The flexizyme system： a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides」；N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga （2009） Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892－3894 「A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water－friendly leaving group」；及WO2007／066627等）。flexizyme亦作為原型的flexizyme（Fx）、及由其變化而成的二硝基芐基flexizyme（dFx）、增強型flexizyme（eFx）、胺基flexizyme（aFx）等的稱呼而為人所知。

藉由使用由flexizyme製成且連結有所要求之胺基酸或羥酸的tRNA，可將所要求之密碼子與所要求之胺基酸或羥酸賦予關連並進行轉譯。作為所要求之胺基酸，亦可使用特殊胺基酸。例如，上述環化所需的非天然胺基酸亦可藉由該方法而導入至血球凝集素結合肽。

本發明之大環狀肽及其類似物的化學合成可使用包含階段性固相合成、經由構造形態上可支援之再連接的肽鏈段之半合成、化學連接的各種該技術領域中通用的方法而合成。本說明書所記載的肽及其類似物的合成，例如係使用K. J. Jensen, P. T. Shelton, S. L. Pedersen, Peptide Synthesis and Applications, 2nd Edition, Springer, 2013等記載的各種固相技術的化學合成。作為較佳對策，係根據可暫時保護α－胺基及利用鹼選擇性去除的Fmoc基，與可暫時保護側鏈官能基且在去Fmoc條件下組合穩定的保護基。此類一般肽側鏈的選擇在上述Peptide Synthesis and Applications, 2nd edition 或G. B. Fields, R. L. Noble, Solid Phase Peptide Synthesis Utilizing 9－Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Acids, Int. J. Peptide Protein Res. 35, 1990, 161－214 等已為人所知，但作為較佳肽側鏈保護基有：針對以離胺酸為代表之胺基的Boc基或Mtt基、針對麩胺酸或天門冬胺酸之羧基的tert－butyl基、以及針對半胱胺酸之硫醇基的Trt及Mmt基。

合成本發明中作為肽合成之前驅物的樹脂（或簡稱為resin），可利用例如市售的PAL－PEG －resin或PAL－PEG－PS等，參考Biopolymers 2011；96（6）：715－22等的報告例進行製備。例如，概略顯示於Scheme 1，n表示碳數的長度；R1表示氫或碳數為1－4的烷基；R2表示各種烷基鏈或具有取代基之烷基鏈。在適當的鹼存在下以o－Ns－Cl使樹脂1 的胺基進行磺醯化而製備2 ，使以Fmoc保護N末端的胺基一級醇3 ，例如Fmoc－甘氨醇，在光延（Mitsunobu）反應下組合所使用的試劑，例如使其在三苯膦與偶氮二羧酸二異丙酯等的存在下進行反應，藉此可得到固相樹脂4 。Fmoc的去保護可在適當的2級胺與溶劑中的組合，例如在哌啶的DMF溶液中進行而形成5 ，並使用已知的肽偶合（peptide coupling）法將各種醯基導入至重製之胺而形成6 。關於R² ，可藉由使例如具有長鏈烷基之癸酸（示性式CH₃ （CH₂ ）₈ COOH）在縮合劑HATU與DIPEA的存在下進行反應而導入。最後，以適當的鹼與硫醇基，例如DBU與DODT的組合處理o－Ns基的去除，藉此可調整肽合成之前驅物的樹脂7 。

[化學式30]

本發明中的肽合成亦可使用市售的樹脂作為其他方法。例如，概略顯示於scheme－2，作為一較佳前驅物樹脂的其他調整法，可使用市售的Rink Amide MBHA樹脂（辛格瑪艾瑞契公司）、Fmoc－Rink Amide NovaPEG resin（默克米爾麗波股份有限公司）或Fmoc－NH－SAL－PEG resin（渡邊化學公司）作為固相樹脂（8），去Fmoc之後，使其與Fmoc胺基酸9進行縮合而得到10，該Fmoc胺基酸9在側鏈具有一級或二級胺基，該一級或二級胺基具有可在溫和的酸性條件下去除的保護基，例如Fmoc－Lys（Mtt）－OH（m＝3，R³ ＝H，S －configuration）。將所得到之固相樹脂以TFA／TIS／CH₂ Cl₂ 的體積比1：4：95的溶液進行處理，藉此可選擇性去除Mmt基而形成11。接著，可導入上述R² COOH後形成12，並去除Fmoc基形成13，而可用於目標的肽合成。

[化學式31]

本發明所記載的肽及其類似物，可於階段方法中在上述固相樹脂上合成。使用之C末端胺基酸及用於合成的全部胺基酸或肽，必須在合成過程中選擇性地去除α－胺基保護基。較佳為使用上述固相樹脂，並藉由適當的試劑將使用Fmoc等保護基適當保護N末端的肽之C末端羧基或使用Fmoc等保護基適當保護的胺基酸之C末端羧基形成活性化酯之後，藉由加成至固相樹脂上的胺基而開始。接著，肽鏈的延伸可依照目標之肽的胺基酸序列，依序重複N末端保護基（例如Fmoc基）的去除，接著保護胺基酸衍生物的縮合來達成。此外，該等操作可使目標的肽在最終階段游離。例如，作為使其游離的條件，如 Teixeira, W.E. Benckhuijsen, P. E. de Koning, A. R. P. M. Valentijn, J. W. Drijfhout, Protein Pept. Lett., 2002, 9, 379－385等所列舉，可於TFA中，在作為捕捉劑的包含水／矽烷基氫化物／硫醇基之TFA溶液下使其游離。作為典型例，可列舉TFA／Water／TIS／DODT（體積比92.5：2.5：2.5：2.5）。

本說明書所記載的肽類似物之合成，可藉由使用單或多通道肽合成儀，例如CEM公司的Liberty Blue 合成儀或Biotage公司的Syro I合成儀來實施。

可使用縮合劑進行羧基的活性化。作為縮合劑，可舉例如：二環己基碳二亞胺（DCC）、二異丙基碳二亞胺（DIPCDI）、1－乙基－3－（3－二甲胺基丙基）碳二亞胺（EDC或WSC）、（1H－苯并三唑－1－基氧基）三（二甲胺基）鏻六氟磷酸鹽（BOP）、1－[雙（二甲胺基）甲基]－1H－苯并三唑鎓－3－氧化物六氟磷酸鹽（HBTU）等。

本說明書所揭示的另一實施態樣係關於一種藥物。該藥物包含上述血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或溶劑合物（方便起見，以下亦將該等簡稱為血球凝集素結合肽）。該藥物較佳為將上述血球凝集素結合肽作為有效成分且包含有效量者。

將血球凝集素結合肽用於藥物用途時，為了對肽的一個或多個胺基酸進行功能賦予或各種變化，可利用例如烴、脂肪酸、聚乙二醇（PEG）等施予化學修飾。又，該等化學修飾亦可使用連接子進行。藉由該等修飾，例如，可得到化學上及代謝上更穩定的肽。連接子係可顯示抗病毒活性之環狀肽（例如（II）所示之基本結構）與可進行用以功能賦予之化學修飾的子結構。本發明中的基本結構之具體例為（I）所示之1,2－乙二胺結構或（II）所示的C末端為NH₂ 之離胺酸醯胺（lysinamide）結構。

如下述實施例所示，本發明之肽藉由與流感病毒表面的血球凝集素結合而顯示抗流感病毒活性。因此，包含本發明之肽的組成物，作為流感的預防或治療劑十分有用，同樣地，本發明之肽，在流感的預防或治療方法中十分有用。

在本說明書中，流感係指流感病毒所引起的急性感染病。當感染流感病毒時，人體會出現伴隨發燒、肌肉酸痛等的感冒症狀。有時會伴隨腹痛、嘔吐、腹瀉等的腸胃症狀，併發症有肺炎與流感腦炎。 在本說明書中，感染係作為意指病毒透過皮膚或黏膜侵入活體的過程，或病毒藉由膜融合而侵入細胞內的過程之任一種的用語而使用。又，在本說明書中，病毒感染係指不管有無症狀，病毒侵入活體內的狀態。

在本說明書中，流感的治療或預防係使用其最廣泛的意思，例如，意指產生與流感病毒的感染相關的一個或多個症狀的緩和或阻止其惡化、抑制感染後的症狀產生、阻止（延遲或停止）活體內的病毒對細胞的感染、阻止（延遲或停止）活體內的病毒繁殖、減少活體內的病毒數等效果。顯示該等之中至少一個效果時，即判斷對於流感的治療或預防有用。 又，如下述實施例所示，本發明之肽對血球凝集素具有中和活性，因此理解為可得到與流感疫苗相同的效果。

在本說明書中，藥物組成物的投予形態並無特別限定，可為經口投予亦可為非經口投予。作為非經口投予，可舉例如：肌肉內注射、靜脈內注射、皮下注射等的注射投予、經皮投予、經黏膜投予（經鼻、經口腔、經眼、經肺、經膣、經直腸）投予等。

鑒於多肽容易被代謝及排泄的性質，上述藥物組成物可進行各種修飾。例如，可將聚乙二醇（PEG）或糖鏈（sugar chain）加成至多肽以延長血中滯留時間並降低抗原性。又，亦可將聚乳酸－甘醇酸（PLGA）等的活體內分解性的高分子化合、多孔性羥磷石灰、脂質體、表面修飾脂質體、以不飽和脂肪酸所製備之乳化液、奈米粒子、奈米球等用作持續釋放型（sustained-release）基劑，並使多肽包含於其中。經皮投予時，亦可於皮膚表面流動弱電流以穿透角質層（離子電滲法）。

上述藥物組成物，可直接使用有效成分，亦可加入藥學上可容許的擔體、賦形劑、添加劑等而製劑化。作為劑形，可舉例如：液劑（例如注射劑）、分散劑、懸濁劑、錠劑、丸劑、粉劑、坐劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿、片劑、吸入劑、軟膏劑、點眼劑、點鼻劑、點耳劑、泥罨劑等。 製劑化可適當使用例如賦形劑、結合劑、崩解佐劑、潤滑劑、溶解劑、溶解輔助劑、著色劑、矯味矯臭劑、穩定劑、乳化劑、吸收促進劑、界面活性劑、pH調整劑、防腐劑、抗氧化劑等，並藉由常法進行。 作為用於製劑化之成分的例子，可列舉：蒸餾水、食鹽水、磷酸緩衝液、葡萄糖、甘油、乙醇等藥學上可容許的有機溶劑、動植物油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨糖醇、結晶纖維素、羥丙基纖維素、澱粉、玉米澱粉、無水矽酸、矽酸鋁鎂、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、黃蓍樹膠、酪蛋白（casein）、瓊脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、石油脂、石蠟、肉豆蔻酸辛基十二酯、肉豆蔻酸異丙酯、高級醇、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白等，但並不限定於此。 鑒於肽不易經黏膜吸收，上述藥物組成物可包含改善難吸收性藥物之吸收的吸收促進劑。作為該吸收促進劑，可使用聚氧乙烯月桂醚類、月桂基硫酸鈉、皂素等的界面活性劑；甘膽酸、去氧膽酸、牛膽酸等的膽鹽；EDTA、柳酸類等的螯合劑；己酸、癸酸、月桂酸、油酸、亞油酸、混合微胞等的脂肪酸類；烯胺衍生物、N－醯基膠原蛋白肽、N－醯基胺基酸、環糊精類、幾丁聚糖類、一氧化氮施予體等。

丸劑或錠劑亦能夠以糖衣、胃溶性、腸溶性物質被覆。 注射劑可包含注射用蒸餾水、生理食鹽水、丙二醇、聚乙二醇、植物油、醇類等。再者，可加入濕潤劑、乳化劑、分散劑、穩定劑、溶解劑、溶解輔助劑、防腐劑等。

將本發明之藥物組成物對哺乳類（例如，人類、小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、狗、馬、猴、豬等），特別是對人體投予時的投予量，係因症狀、患者的年齡、性別、體重、感受性差異、投予方法、投予間隔、有效成分的種類、製劑的種類而異，並無特別限定，例如，可1次或分多次投予30μg～100g、100μg～500mg、100μg～100mg。注射投予時，視患者的體重，可1次或分多次投予1μg／kg～3000μg／kg、3μg／kg～1000μg／kg。

使用本發明之肽的流感之預防或治療方法，可參照上述藥物組成物之記載來實施。

本說明書所揭示的另一實施態樣係關於一種流感病毒檢測藥。該流感病毒檢測藥包含上述血球凝集素結合肽、其鹽或其溶劑合物。

（流感病毒檢測藥及檢測用套組） 本發明亦包含含有本發明之肽的流感病毒檢測藥。本發明之肽會與流感病毒表面的血球凝集素優異地結合。因此，例如，可使用本發明之肽代替酵素免疫吸附分析（ELISA）法等之免疫測定法中的抗流感抗體檢測試樣中的流感病毒。 用作檢測藥時，本發明之肽亦可標識成可檢測。可用習知的標識物質對肽進行標識，例如，可使用以過氧化酶、鹼性磷酸酶等的酵素、125I、131I、35S、3H等的放射性物質、螢光異硫氰酸鹽、羅丹明、丹磺醯氯、藻紅素、四甲基羅丹明異硫氰酸鹽、近紅外螢光材料等的螢光物質、螢光酵素、螢光素、水母素等發光物質標識過的抗體。此外，亦可檢測出以金膠體、量子點等的奈米粒子標識過之抗體。 又，免疫測定法中，亦能夠以生物素對本發明之肽進行標識，並使其與以酵素等標識過之卵白素或鏈霉親和素結合來檢測。 免疫測定法中，使用酵素標識的ELISA法亦可簡便且迅速地測量抗原而較佳。例如，將優異地識別流感病毒之血球凝集素以外之部分的抗體固定於固相擔體，添加樣本並使其反應後，添加已標識的本發明之肽且使其反應。清洗後，與酵素基質反應，使其顯色並測量吸光度，藉此可檢測出流感病毒。亦可在使已固定於固相擔體之抗體與試樣反應後，添加未標識的本發明之肽，再將針對本發明之肽的抗體進行酵素標識並進一步添加。 酵素基質的酵素為過氧化酶時，可使用3,3’－二胺基聯苯胺（DAB；3,3’－diaminobenzidine）、3,3’,5,5’－四甲基聯苯胺（TMB；3,3’,5,5’－tetramethylbenzidine）、鄰苯二胺（OPD；o-phenylenediamine）等，若為鹼性磷酸酶時，可使用對硝基苯磷酸酯（NPP；p-nitropheny phosphate）等。

在本說明書中，「固相擔體」只要為可固定抗體的擔體，則並無特別限定，可列舉：玻璃製、金屬性、樹脂製等的微孔板、基板、珠粒、硝化纖維膜、尼龍膜、PVDF膜等，標的物質可依照習知的方法固定於該等固相擔體。

本發明所述的檢査用套組包含上述檢測所需的試劑及器具（包含本發明之肽、抗體、固相擔體、緩衝液、酵素反應停止液、微量盤式分析儀等，但並不限定於此）。

本說明書所揭示的另一實施態樣亦可考量用作包含上述流感病毒檢測藥的流感病毒檢測用套組、及用以查明透過血球凝集素產生的流感病毒之感染及伴隨於此的各種細胞功能或生命現象的工具。

本說明書亦提供血球凝集素結合肽的使用，用以製造預防或治療流感的藥物。此情況下的血球凝集素結合肽可為上述任一種。

本說明書亦提供流感的預防或治療方法，其包含將有效量的血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物作為有效成分並對人類、非人類之哺乳動物或鳥類的對象投予的步驟。血球凝集素結合肽可適當使用上述肽。非人類之哺乳動物的例子為人類以外的靈長類、豬、牛、狗、貓、馬、羊、大鼠及小鼠。

本說明書，特別是下述代表性實施例中使用的簡寫為本領域中具有通常知識者所習知。所使用的幾個簡寫如下：9－芴甲氧羰基為Fmoc；1－羥基苯并三唑為HOAt；O－（7－氮雜苯并三唑－1－基）－N,N,N’,N’－四甲基脲六氟磷酸鹽為HATU；乙腈為MeCN；1,8－二吖雙環「5.4.0」－7－十一烯為DBU；N,N－二異丙基乙基胺為DIPEA；3,6－二氧雜－1,8－辛烷－二硫醇為DODT；二甲基亞碸為DMSO；N,N－二甲基甲醯胺為DMF；毫升（單位）為mL；莫耳濃度（molar）（單位）為M；單甲基三苯甲基為Mtt；單甲氧基三苯甲基為Mmt；2－硝苯磺醯基為o－Ns；volume／volume為v／v；三氟乙酸為TFA；三異丙基矽烷為TIS；三苯甲基為Trt。

實施例及一般方法 在本發明之化學合成中使用的全部原料、結構單元、試劑、酸、鹼、固相樹脂、溶劑可直接使用市售品或由本領域中具有通常知識者使用有機化學的方法合成。此外，包含保護基之胺基酸，若無特別記載係直接使用市售品。

在本發明中化學合成之肽的結構決定已藉由質譜分析法中的ESI－MS（+）確認分子量，該分子量是考量依照目標序列使用之胺基酸與視需求所使用之結構單元並計算而得。此外，「ESI－MS（+）」係表示在正離子模式下實施的電灑游離質譜分析法。所檢測的質量係以「m／z」單位標示進行報告。此外，分子量約大於1000的化合物，已作為2價離子或3價離子而以高頻率檢測出。

在本發明中經化學合成之肽的純度已用以下任一種分析方法決定。 （分析條件） 分析條件A 管柱：CORTECS（註冊商標） UPLC（註冊商標） C18 column（Nihon Waters公司）、90 Å、1.6μm、2.1x100 mm 移動相：MeCN／0.025% TFA in H₂ 溫度：40℃ 梯度：5－95% MeCN ／ 0.025% TFA in H₂ in 5.56 min；線性梯度（linear gradient） 流量：0.4mL／min 檢測法：UV 220nm 分析條件B 管柱：Kinetex EVO C18 2.6 μm、 2.1 ID x 150 mm、 100 Å（Phenomenex公司） 管柱溫度：60℃ 移動相A：0.025% TFA in H₂ 移動相B：0.025% TFA in CH₃ CN 梯度：各實施例中所記載 流速：0.25mL／min 檢測：PDA（225nm）

本發明所記載之固相樹脂中的肽鏈的延伸，係將各實施例所記載之樹脂作為初始原料，並使用通常使用的肽偶合反應條件與Fmoc去除反應條件而進行。反應係使用CEM公司的Liberty Blue，依照製造廠商的說明書進行。所使用的一般胺基酸列舉如下，側鏈保護基顯示於括號內。 Fmoc－Trp（Boc）－OH；Fmoc－Thr（tBu）－OH；Fmoc－N－Me－Gly－OH； Fmoc－Asp（OtBu）－OH； Fmoc－N－Me－Phe－OH； Fmoc－Ala－OH； Fmoc－N－Me－Ala－OH； Fmoc－His（Trt）－OH； Fmoc－Tyr（tBu）－OH；Fmoc－Val－OH； Fmoc－HydPro（tBu）－OH；Fmoc－Cys（Trt）－OH；Fmoc－Lys（Mtt）－OH； Fmoc－Ser（tBu）－OH； Fmoc－N－Me－Ser（tBu）－OH。

氯乙醯基的導入係藉由下述方式進行：對於上一步驟所得到的保持有以Fmoc保護之肽的固相樹脂，以上述方法去除α－胺基的Fmoc基之後，加入氯乙酸（約3等量）、約3等量的N,N’－二異丙基碳二亞胺的DMF溶液（0.5 M）、約3等量的HOAt的DMF溶液（0.5 M），並在室溫下振盪40分鐘。 側鏈的去保護及從固相樹脂的切除，係先將氯乙醯基導入步驟後所得到的樹脂以DMF與二氯甲烷分別清洗5次並在減壓下乾燥。接著於裝有固相樹脂的反應容器中加入反應劑混合物－ A（TFA／H₂ ／TIS／DODT的體積比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物），在室溫下振盪150分鐘。將反應液從玻料（frit）過濾回收。將殘留於反應容器中的固相樹脂與切除用混合物再次振盪後，從玻料回收溶液成分，並與上述濾液混合。若將該濾液加入冷卻至0℃的過剩之二乙醚，則產生混濁沉澱。將該混合物進行離心分離（9000 rpm，3 min），使溶液傾析。以再次冷卻至0℃的少量二乙醚清洗所得到之個體後，將所得到之固體用於下一個環化反應。

本發明中肽的環化反應係藉由下述方式進行：肽的最終濃度為以固相樹脂之莫耳數為基準，以成為5 mM的方式使其溶解於DMSO後，加入6等量的三乙胺，在室溫下攪拌約16小時。以乙酸使將所得到之反應溶液成為酸性並使用Biotage（註冊商標） V－10（Biotage Japan公司）進行減壓濃縮。 作為所得到之粗精製肽的精製方法，係於Waters公司自動純化系統（AutoPurification System）－SQD2單段式四極桿質譜儀（single quadruple mass spectrometer）中使用反相分離HPLC，一邊監測來自目標物質的m／z離子一邊進行溶析。確認以ESI－positive的掃描模式所得到之質譜與包含從目標物質的分子式計算之多價離子的質譜在使用之質量分析器的誤差範圍內一致。此外，包含使用之管柱的精製條件顯示於各實施例。

[實施例1] HA119的合成 [化學式32]

使用Fmoc－NH－SAL－PEG resin （渡邊化學，0.15 mmol／g，0.43 g），依照上述的一般方法，從去除Fmoc開始，合成目標之肽。接著，依照一般的方法導入氯乙醯基。

所得到之粗製生成物係使用以下條件精製（管柱：Waters Xbridge（註冊商標）C18 5 μm OBD（註冊商標）19 x 150 mm（Nihon Waters公司）；移動相：A ＝ 0.1% TFA in H₂ O，B ＝ 0.1% TFA in MeCN；溫度：40℃；梯度（%B）：花費3分鐘5－29%，之後花費8分鐘29－34%；流量：17 mL／ min）。

目標物質的純度係從分析條件B的LC／MS（UV波長225 nm）色譜的面積比算出，其為99.4%。 分析條件A：保持時間＝3.57分鐘，ESI－MS（+） 觀測值m／z＝ 899.8 理論值899.5（（M／2）+H） 分析條件B：保持時間＝16.5分鐘；梯度（% B conc）：花費20分鐘25－65%，之後花費1分鐘65－95%，之後花費5分鐘95%

[實施例2] HA146的合成 [化學式33]

將Fmoc－NH－SAL－PEG resin（渡邊化學，0.37 mmol／g，1.35 g）放入附玻料之反應容器中，與二氯甲烷進行震盪以使其膨脹。依照上述的一般方法，去除Fmoc後以及將Fmoc－Lys（Mtt）－OH以肽偶合導入所得到之固相樹脂。以二氯甲烷使所得到之固相樹脂膨潤，加入反應劑混合物－ B （TFA／TIS／CH₂ Cl₂ 的體積比1：4：95）並在室溫下震盪30分鐘後，將反應液從玻料排出。重複該操作12次後，濾液的顏色變成無色透明。將該時間點作為反應結束。於所得到之固相樹脂中加入癸酸的DMF溶液（0.21 M，12 mL）、HATU的DMF溶液（0.5 M，5 mL）及DIPEA的DMF溶液（1 M，5 mL），於40℃震盪40分鐘。將反應液從玻料排出後，將所得到之固相樹脂以DMF、然後二氯甲烷的順序進行清洗。

針對上述操作所得到之固相樹脂，以上述一般的方法利用自動合成儀依序進行Fmoc的去除及導入Fmoc－胺基酸。用於反應之胺基酸與試劑係以固相樹脂為0.5mmol進行等量計算。利用自動合成儀進行肽偶合，然後依照上述一般方法導入氯乙醯基。 接著，使用所得到之固相樹脂，依照上述一般方法，進行側鏈的去保護、從固相樹脂的切除以及環化反應。 所得到之粗製生成物係使用以下條件精製（管柱：Waters Xbridge（註冊商標）C18 5 μm OBD（註冊商標）50 x 250 mm（Nihon Waters公司）；移動相：A ＝ 0.1% TFA in H₂ O，B ＝ 0.1% TFA in MeCN；溫度：40℃；梯度（%B）：花費3分鐘16－41%，之後花費7分鐘47－52%，之後花費1.5分鐘47－80%；流量；120 mL／min）。

目標物質的純度係從分析條件B的LC／MS（UV波長225 nm）色譜的面積比算出，其為99.3%。 分析條件A：保持時間＝4.50分鐘；ESI－MS（+） 觀測值m／z＝ 1040.4 理論值 1040.2（（M／2）+H） 分析條件B：保持時間＝18.8分鐘；梯度（%B conc）：花費20分鐘25－65%，之後花費1分鐘 65－95%，之後花費5分鐘95%

[實施例3] HA145的合成

[化學式34]

HA145係依據實施例1所示的合成法，藉由使用月桂酸代替癸酸所合成。 所得到之粗製生成物係使用以下條件精製（管柱：Waters Xbridge（註冊商標）C18 5 m OBD（註冊商標）50 x 250mm（Nihon Waters公司）；移動相：A ＝ 0.1% TFA in H₂ O，B ＝ 0.1% TFA in MeCN；溫度：40 ℃；梯度（%B）：花費3分鐘21－46%，之後花費7分鐘46－51%，之後花費1.5分鐘51－80%；流量：120 mL／ min）。 目標物質的純度係從分析條件B的LC／MS（UV波長225 nm）色譜的面積比算出，其為99.3%。 分析條件A：保持時間＝4.42分鐘，ESI－MS（+） 觀測值m／z＝ 1055.1 理論值1054.3（（M／2）+H） 分析條件B：保持時間＝18.8分鐘、梯度（%B conc）：花費20分鐘25－65%，之後花費1分鐘 65－95%，之後花費5分鐘95%

[實施例4] HA152的合成 [化學式35]

將PAL－PEG resin （渡邊化學，0.22 mmol／g，1.16 g）放入附玻料的反應容器中，與二氯甲烷進行震盪以使其膨脹。將二氯甲烷從玻料排出之後，加入2－硝苯磺醯氯（4等量）的二氯甲烷溶液（5 mL）與DIPEA（4等量）的二氯甲烷溶液（4 mL），在室溫下攪拌30分鐘。將反應液從玻料排出後，以二氯甲烷清洗固相樹脂。於所得到之固相樹脂中加入Fmoc－甘氨醇（10等量）的THF溶液（6 mL）、三苯膦（12等量）的二氯甲烷溶液（5 mL）及偶氮二羧酸二異丙酯（10等量）的二氯甲烷溶液（5 mL）並在室溫下震盪。反應的進行可取出少量的固相樹脂，以切除用混合物處理後，以LCMS確認。將反應液從玻料排出後，以二氯甲烷清洗固相樹脂。於所得到之固相樹脂中加入哌啶（20%）的DMF溶液（12 mL），在室溫下振盪30分鐘。從狹縫排出反應液，再次加入哌啶（20%）的DMF溶液（12 mL）並在室溫下振盪30分鐘。從狹縫排出反應液後，將所得到之固相樹脂以DMF、然後二氯甲烷的順序進行清洗。於所得到之固相樹脂中加入癸酸的DMF溶液（0.21 M，5 mL）、HATU的DMF溶液（0.5 M，2 mL）及DIPEA的DMF溶液（1 M，2 mL），於40 ℃震盪1小時。將反應液從玻料排出後，將所得到之固相樹脂以DMF，然後二氯甲烷的順序進行清洗。將所得到之固相樹脂浸入10 mL的DMF，並加入DODT（0.4mL，10 eq）及DBU（0.37 mL，10 eq），在室溫下攪拌。在處理少量的固相樹脂後，以LCMS確認反應的進行及原料的消失。

以上述一般方法利用自動合成儀將Fmoc－胺基酸依序導入上述操作所得到之固相樹脂。用於反應的胺基酸與試劑係以固相樹脂為0.25 mmol進行等量計算。利用自動合成儀進行肽偶合，然後依照上述一般方法導入氯乙醯基。

使用所得到之固相樹脂，依照上述一般方法，進行側鏈的去保護、從固相樹脂的切除以及環化反應。

所得到之粗製生成物係使用以下條件精製（管柱：Waters Xbridge（註冊商標）C18 5 μm OBD（註冊商標）50 x 250mm（Nihon Waters公司）；移動相：A ＝ 0.1% TFA in H₂ O，B ＝ 0.1% TFA in MeCN；溫度：40℃；梯度（%B）：花費3分鐘17－42%，之後花費7分鐘42－47%，之後花費1.5分鐘47－80%；流量：120 mL／min）。 目標物質的純度係從分析條件B的LC／MS（UV波長225 nm）色譜的面積比算出，其為98.4%。

分析條件A：保持時間＝4.18分鐘，ESI－MS（+） 觀測值m／z＝ 998.6 理論值 998.2（（M／2）+H） 分析條件B：保持時間＝16.48分鐘，梯度（% B conc）：花費20分鐘25－65%，之後花費1分鐘65－95%，之後花費5分鐘95%

[實施例5] HA151的合成 [化學式36]

HA151可依據實施例4所示的合成法，藉由使用月桂酸代替癸酸所合成。

所得到之粗製生成物係使用以下條件精製（管柱：Waters Xbridge（註冊商標）C18 5 μm OBD（註冊商標）50 x 250mm；移動相：A ＝ 0.1% TFA in H₂ O，B ＝ 0.1% TFA in MeCN；溫度：40 ℃；梯度（%B）：花費3分鐘22－47%，之後花費7分鐘47－52%，之後花費1.5分鐘52－80%；流量：120 mL／ min）。

目標物質的純度係從分析條件B的LC／MS（UV波長225 nm）色譜的面積比算出，其為97.7%。 分析條件A：保持時間＝4.49分鐘，ESI－MS（+）觀測值m／z＝ 1012.4 理論值1012.2 （M／2）+H） 分析條件B：保持時間＝12.5分鐘；梯度（% B conc）：花費20分鐘40－80%，之後花費1分鐘80－95%，之後花費5分鐘95%

[實施例6] [肽對於流感病毒的抗病毒活性評價] 為了確認肽對於流感病毒在活體外實驗中的抗病毒活性，藉由以下所示方法實施試驗。具體的試驗方法顯示如下。 1)      以3×10⁴ cells／well播種MDCK細胞，在37℃，5%CO₂ ，MEM－10%FBS存在下培養24小時。 2)      培養後，將100μL的無血清MEM加入well，清洗細胞單層。 3)      藉由感染維持培養基（含有維生素之無血清MEM）將試驗對象化合物溶解，並調整成各測量濃度。 4)      將溶解於感染維持培養基之無血清MEM的試驗化合物加入各well。 5)      以包含胰蛋白酶（trypsin）的感染維持培養基稀釋流感病毒A／Nagasaki／HA－58／2009 （H1N1）、A／Puerto Rico／8／34 （H1N1）或A／Duck／Pennsylvania／84 （H5N2），製備成1,000 TCID₅₀ ／mL。 6)      以100 μL／well添加所稀釋之病毒液，並將每well的效價調整成100 TCID₅₀ 。 7)      在37℃，5% CO₂ 條件下培養72小時。 8)      培養完成後，從各well去除培養液。 9)      以200ul／well 添加70% 乙醇水溶液，並在室溫下靜置5分鐘。 10) 去除乙醇水溶液後，以200 μL／well添加0.5%結晶紫（crystal violet）水溶液，並在室溫下靜置5分鐘。 11) 以水沖洗，並在室溫下使其乾燥。 12) 使用TECAN infinite 200 （TECAN公司），對測量波長λ＝ 560 nm中的各well之吸光度進行測量。 13) 在各濃度中，算出將mock群（非添加藥劑且非病毒感染群）設為100%時的相對值（CV relative value， %）。 14) 使用GraphPad Prism 5.0（GraphPad Software公司），求出各檢體的EC50的值。

為了確認肽對於流感病毒在活體內實驗中的抗病毒活性，藉由以下所示方法實施試驗。具體的試驗方法顯示如下。 1)      作為感染模型小鼠，將BALB／cA Jcl[SPF]小鼠調整為每1群5隻。 2)      將於－80℃保存的病毒在冰上徐緩地融化，進行數秒鐘離心後，分開注入裝有PBS的管材。 3)      將流感病毒A／Puerto Rico／8／34 （H1N1）對麻醉中的小鼠以每1隻267 pfu進行經鼻接種，並將上述接種時間點作為「0日」。 4)      使HA152溶解於溶解溶劑的10%羥丙基－β－環糊精溶液。 5)      使Peramivir溶解於PBS溶液。 6)      針對Peramivir以30 μmol／kg，針對HA152以15 μmol／kg的投予量進行尾靜脈內投予。作為溶劑對照（vehicle control），將10%羥丙基－β－環糊精溶液同樣地進行尾靜脈內投予。 7)      流感病毒感染、化合物投予後，進行狀態觀察，包含1天1次生死觀察。 8)      以感染日作為0日來換算14天的生存率並算出生存率。

3.結果使用 流感病毒A ／Nagasaki ／HA －58 ／2009 （H1N1 ）、A ／Puerto Rico ／8 ／34 （H1N1 ）及A ／Duck ／Pennsylvania ／84 （H5N2 ） 的HA152 之 活性評價結果 使用流感病毒A／Nagasaki／HA－58／2009 （H1N1）、A／Puerto Rico／8／34 （H1N1）及A／Duck／ Pennsylvania／84 （H5N2）進行iHA100及HA152在活體外實驗中的抗病毒活性評價的結果顯示於圖1。iHA100在最終濃度為1 μm以上的高濃度域中抑制病毒所引起的細胞死亡，但在nM區域的低濃度域中則未顯示顯著的細胞死亡抑制。另一方面，明確可知HA152在μm以下的低濃度域中顯示顯著的細胞死亡抑制，在低濃度域中亦具有顯著的抗病毒活性。由此可確認，相較於iHA100，HA152顯示極高的抗流感病毒活性。

接著，使用流感病毒A／Duck／Pennsylvania／84 （H5N2），將包含iHA100、HA152的化合物在活體外實驗中的抗病毒活性以EC50算出。如圖2所示的包含HA152之化合物，相較於iHA100，顯示至少10倍以上高抗病毒活性。因此，HA152及圖2所示的各化合物，相較於iHA100，顯示保持顯著的高抗流感病毒活性。

使用 流感病毒A ／Puerto Rico ／8 ／34 （H1N1 ） 的HA152 在 小鼠感染模型中的活性評價結果 使用流感病毒A／Puerto Rico／8／34（H1N1）進行Peramivir及HA152在活體內實驗中的抗病毒活性評價的結果顯示於圖3。 對於感染流感病毒的小鼠分析14天中的生存率，結果未投予藥劑之群組的生存率為0%。另一方面，將Peramivir以30 μmol／kg單次投予之群組的生存率為20%，相對於此，投予15 μmol ／kg之HA152之群組的生存率為60%。由此，HA152不僅在活體外實驗，而且在活體內實驗中亦顯示顯著的抗病毒活性。相較於以神經胺酸酶為標靶的批准藥品Peramivir，其抗病毒活性為相同程度或其以上。

[產業上的可利用性] 本發明可應用於藥物產業及醫療設備產業。

無。

圖1-1係顯示使用流感病毒A／Nagasaki／HA－58／2009（H1N1）的iHA100及HA152在活體外實驗（in vitro）中的活性評價結果的圖表。 圖1-2係顯示使用流感病毒A／Puerto Rico／8／34（H1N1）的iHA100及HA152在活體外實驗中的活性評價結果的圖表。 圖1-3係顯示使用流感病毒A／Duck／Pennsylvania／84（H5N2）的iHA100及HA152在活體外實驗中的活性評價結果的圖表。 圖2係對於使用流感病毒A／Duck／Pennsylvania／84（H5N2）的iHA100及HA119、HA145、HA146、HA151、HA152，以EC50值顯示該等在活體外實驗中的抗病毒活性的結果。 圖3係顯示使用流感病毒A／Puerto Rico／8／34（H1N1）感染模型，分析在活體內實驗（in vivo）中的HA152之抗病毒活性的結果的圖表。

Claims (9)

1. 一種血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物，該血球凝集素結合肽為： （1）由序列編號1或2所示之胺基酸序列所組成的多肽： Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys（序列編號1）、 Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys（序列編號2）； （2）由序列編號1或2中N末端之Trp為氯乙醯－Trp的胺基酸序列所組成的多肽； （3）由序列編號1中N末端之Trp為氯乙醯－Trp且透過醯胺鍵對C末端之Cys施予式（I）所示之修飾的胺基酸序列所組成的多肽； （4）由序列編號2中N末端之Trp為氯乙醯－Trp且將C末端之Lys取代成經施予式（II）所示之修飾的離胺酸衍生物的序列所組成的多肽； （5）由序列編號1中透過醯胺鍵對C末端之Cys施予式（I）所示之修飾的胺基酸序列所組成的多肽； （6）由序列編號2中Lys的側鏈包含以醯基修飾的式（II）所示之離胺酸衍生物的序列所組成的多肽；或 （7）具有上述（1）至（6）中任一種胺基酸序列、且係缺失、加成、取代或插入1或2個胺基酸之胺基酸序列的肽（其中，排除序列編號1中的C末端之Cys缺失者、及序列編號2中的C末端之Lys缺失者）； 式（I） [化學式1]

   

   （式（I）中，*表示與C末端Cys之羰基的連結部分，A¹ 表示C₈ －C₁₂ 烷基）； 式（II） [化學式2]

   

   （式（II）中，*表示與C末端Cys之羰基的連結部分，A¹ 表示C₈ －C₁₂ 烷基）。
2. 如請求項1所述之血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物，其中，該血球凝集素結合肽為： （1）由序列編號1或2所示之胺基酸序列所組成的多肽： Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys（序列編號1）、 Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys（序列編號2）； （5）由序列編號1中透過醯胺鍵對C末端之Cys施予式（I）所示之修飾的胺基酸序列所組成的多肽； （6）由序列編號2中將C末端之Lys取代成經施予式（II）所示之修飾的離胺酸衍生物的序列所組成的多肽；或 （7）具有上述（1）、（5）及（6）中任一種胺基酸序列、且係缺失、加成、取代或插入1或2個胺基酸之胺基酸序列的肽（其中，排除序列編號1中的C末端之Cys缺失者、及序列編號2中的C末端之Lys缺失者）。
3. 如請求項1所述之血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物，其中，該血球凝集素結合肽為環狀。
4. 如請求項3所述之血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物，其中，該血球凝集素結合肽係以下列式（III）或（IV）表示； [化學式3]

   

   （式（III）中，式A² 表示以－NH₂ 所示之基團或以式（I）所示之基團）； [化學式4]

   

   （式（IV）中，式A³ 表示以－NH₂ 或式（II）所示之基團）。
5. 如請求項3所述之血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物，其中，該血球凝集素結合肽係以下列式（V）或（VI）表示； [化學式5]

   

   （式（V）中，式A⁴ 表示以－NH₂ 所示之基團或以式（IIa）所示之基團）； [化學式6]

   

   （IIa） （式（IIa）中，*表示連結部分，A¹ 表示C₈ －C₁₂ 烷基）； [化學式7]

   

   式（VI）中，式A⁵ 表示以－NH₂ 或式（I）所示之基團。
6. 如請求項3所述之血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物，其中，該血球凝集素結合肽係以下列式（VII）表示； [化學式8]

   

   。
7. 一種用以預防或治療流感的藥物，其包含如請求項2至6中任一項所述之血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物。
8. 一種流感病毒檢測藥，其包含如請求項2至6中任一項所述之血球凝集素結合肽、其藥學上可容許的鹽或其溶劑合物。
9. 一種流感病毒檢測用套組，其包含如請求項8所述之流感病毒檢測藥。

Images