CN113490526A

CN113490526A - 血球凝集素结合肽

Info

Publication number: CN113490526A
Application number: CN202080015122.1A
Authority: CN
Inventors: 舛屋圭一; 大内政辉
Original assignee: Peptidream Inc
Current assignee: Peptidream Inc
Priority date: 2019-02-18
Filing date: 2020-02-17
Publication date: 2021-10-08
Also published as: JP2024170574A; JPWO2020171028A1; EP3936191A4; EP3936191A1; TW202042836A; TWI858016B; WO2020171028A1; US20240228544A1; AU2020224470A1; JP7580120B2; CA3130694A1

Abstract

本发明的课题是提供一种抗病毒活性明显高于iHA100的化合物、用以制造该化合物的中间体以及包含上述高活性化合物的药物等。本发明的解决方案是一种血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物，所述血球凝集素结合肽是关于：(1)由序列编号1或2所示的氨基酸序列所组成的多肽：Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys(序列编号1)、Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys(序列编号2)等。

Description

血球凝集素结合肽

技术领域

本发明涉及一种血球凝集素结合肽，更具体地，涉及一种具有极高的抗流感病毒活性的血球凝集素结合肽、用以预防或治疗流感的药物、及流感的检测药物等。

背景技术

流感病毒是具有高感染力与病原性的病毒，其蔓延作为流行病则对人体表现出大范围的病原性。

作为针对流感病毒的药品，广泛使用阻碍流感病毒游离时所需的神经氨酸酶的扎那米韦(商品名：瑞乐沙(商标))、奥司他韦(商品名：达菲(商标))、帕拉米韦(商品名：Rapiacta(商标))、Laninamivir(商品名：INAVIR(商标))。又，阻碍病毒的去核过程的Symmetrel(商品名：金刚烷胺)或Flumadine(商品名：金刚乙胺)、阻碍帽依赖性核酸内切酶的巴洛沙韦玛波西酯(商品名：Xofluza(商标))已为公知药品。上述药品，特别是针对神经氨酸酶的抗流感药被广泛用作药品，但病毒的变异所导致的抗药性成为问题。

另一方面，血球凝集素作为流感病毒侵入宿主细胞时所需的蛋白质已为人所知，已有报告一种针对此标靶的抗病毒分子。作为既有抗病毒药，以血球凝集素为标靶的抗病毒分子对于具有抗药性的病毒是有效的。因此，与既有药品不同的针对标靶分子的抗病毒分子，从抗药性的观点来看，其有用性亦较高。

作为针对血球凝集素的抗病毒分子，已有报告与血球凝集素结合的抗体分子(例如，专利文献1～3)。另一方面，抗体药品具有高活性，但由于抗体药品在体内被识别为异物而产生的中和抗体，有时会明显减少药剂的效价。

近年来，作为新的分子群，已有报告N－甲基氨基酸或D－氨基酸等具有特殊骨架的肽分子，其不仅显示高结合力与活体稳定性，而且相较于抗体，其分子量极小。因此，作为可解决以往的抗体药品所存在的问题的分子群而受到瞩目(例如，非专利文献1～4)。

我等着眼于具有此特殊骨架的肽分子，搜寻与血球凝集素对应的肽分子。iHA100是与血球凝集素对应的肽分子，其分子量及与一般抗体的投药途径大不相同，是在经由鼻腔给药中亦显示抗病毒活性的抗流感病毒分子(专利文献4)。另一方面，尚未有报告使iHA100的抗流感病毒活性明显提升的事例及其结构，其抗流感病毒活性的提升对药剂的药效提升大有帮助。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2018/108086号小册

专利文献2：国际公开第2018/015012号小册

专利文献3：国际公开第2017/122087号小册

专利文献4：国际公开第2013/071904号小册

非专利文献

非专利文献1：Nature Reviews Drug Discovery 17,531－533(2018)

非专利文献2：Current opinion in chemical biology,34,44－52(2016)

非专利文献3：Annual Review of Biochemistry,83,727－752(2014)

非专利文献4：Chemistry,19,6530－6536(2013)

发明内容

发明所欲解决的课题

本发明的目的在于提供一种抗病毒活性明显高于iHA100的化合物、用以制造该化合物的中间体、及包含上述高活性化合物的药物等。

解决课题的技术方案

本发明根据下述见解：相较于已知的具有抗流感病毒活性的血球凝集素结合肽，新合成的血球凝集素结合肽具有显着的活性。

本说明书所公开的实施方案之一是关于一种血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物(亦将此等称为本发明的肽)。

所述血球凝集素结合肽为以下(1)至(7)中任一种肽。

(1)由序列编号1或2所示的氨基酸序列所组成的多肽：

Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys(序列编号1)、

Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys(序列编号2)。

(2)由序列编号1或2中N末端的Trp为氯乙酰－Trp的氨基酸序列所组成的多肽。

(3)由序列编号1中N末端的Trp为氯乙酰－Trp且通过酰胺键对C末端的Cys施予式(I)所示的修饰的氨基酸序列所组成的多肽。

(4)由序列编号2中N末端的Trp为氯乙酰－Trp且将C末端之Lys取代成经施予式(II)所示的修饰的赖氨酸衍生物的序列所组成的多肽。

(5)由序列编号1中通过酰胺键对C末端的Cys施予式(I)所示的修饰的氨基酸序列所组成的多肽。

(6)由序列编号2中Lys的侧链包含以酰基修饰的式(II)所示的赖氨酸衍生物的序列所组成的多肽。

(7)具有上述(1)至(6)中任一种氨基酸序列、且是缺失、加成、取代或插入1或2个氨基酸的氨基酸序列的肽(其中，排除序列编号1中的C末端的Cys缺失者、及序列编号2中的C末端的Lys缺失者)。

式(I)

[化学式9]

(式(I)中，*表示与C末端Cys的羰基的连结部分，A¹表示C₈－C₁₂烷基)。

式(II)

[化学式10]

(式(II)中，*表示与C末端Cys的羰基的连结部分，A¹表示C₈－C₁₂烷基)。

血球凝集素结合肽的优选例如下。

(1)由序列编号1或2所示的氨基酸序列所组成的多肽。

(6)由序列编号2中将C末端的Lys取代成经施予式(II)所示的修饰的赖氨酸衍生物的序列所组成的多肽；或

(7)具有上述(1)、(5)及(6)中任一种氨基酸序列、且是缺失、加成、取代或插入1或2个氨基酸的氨基酸序列的肽(其中，排除序列编号1中的C末端的Cys缺失者、及序列编号2中的C末端的Lys缺失者)。

血球凝集素结合肽的优选例是血球凝集素结合肽为环状。

血球凝集素结合肽的优选例是以下列式(III)或(IV)表示。

[化学式11]

(式(III)中，式A²表示以－NH₂所示的基团或以式(I)所示的基团)。

[化学式12]

(式(IV)中，式A³表示以－NH₂所示的基团或以式(II)所示的基团)。

与上述不同的血球凝集素结合肽的另一优选例是以下列式(V)或(VI)表示。

[化学式13]

(式(V)中，式A⁴表示以－NH₂所示的基团或以式(IIa)所示的基团)。

[化学式14]

(IIa)

(式(IIa)中，*表示连结部分，A¹表示C₈－C₁₂烷基)。

[化学式15]

式(VI)中，式A⁵表示以－NH₂所示的基团或以式(I)所示的基团。

与上述不同的血球凝集素结合肽的另一优选例是以下列式(VII)表示。

[化学式16]

本说明书中与上述不同的另一方案是一种用以预防或治疗病毒感染病的药物，其包含上述任一种血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物。又另一方案是一种用以预防或治疗流感的药物(流感的预防剂或治疗剂、药品)，其包含上述任一种血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物。

本说明书所公开的另一实施方案是关于一种病毒检测药。又作为另一方案是一种流感病毒检测药。此病毒检测药包含上述血球凝集素结合肽。

本说明书所公开的另一实施方案是关于一种病毒检测用套组，其包含上述病毒检测药。

发明效果

如实施例所示，本申请案可提供一种活性明显高于iHA100的肽、使用该肽的用以预防或治疗流感的药物及流感的检测药、用以合成上述肽的中间体。

附图说明

图1-1显示使用流感病毒A/Nagasaki/HA－58/2009(H1N1)的iHA100及HA152在体外实验中的活性评价结果的图表。

图1-2显示使用流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的iHA100及HA152在体外实验中的活性评价结果的图表。

图1-3显示使用流感病毒A/Duck/Pennsylvania/84(H5N2)的iHA100及HA152在体外实验中的活性评价结果的图表。

图2对于使用流感病毒A/Duck/Pennsylvania/84(H5N2)的iHA100及HA119、HA145、HA146、HA151、HA152，以EC50值显示此等在体外实验中的抗病毒活性的结果。

图3显示使用流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)感染模型，分析在体内实验中的HA152的抗病毒活性的结果的图表。

具体实施方式

以下，对用以实施本发明的方式进行说明。本发明并不限定于以下说明的方式，亦包含本领域的技术人员在已知范围内由以下实施方式进行适当修正者。

本说明书所公开的实施方案之一是关于一种血球凝集素结合肽、血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物。

在本说明书中，血球凝集素是指存在于以流感病毒为代表的多数细菌或病毒表面的抗原性醣蛋白，以“HA”表示。血球凝集素参与病毒对宿主细胞的黏附过程。具体而言，若病毒表面的血球凝集素与作为目标的宿主细胞表面所具有的唾液酸结合，则病毒被细胞膜包覆，以包含病毒的胞内体的形态进入细胞内。接着，胞内体膜与病毒膜融合，病毒基因组进入细胞内并开始繁殖。

流感病毒分类成A型、B型及C型三种类型，特别是容易引发流行病的A型流感病毒的血球凝集素中，至少存在16种亚型，称为H1～H16。此外，H1、2、5、6、8、9、11、12、13、16、17、18称为群组1，其他血球凝集素(H3、4、7、10、14、15)称为群组II。流感的亚型名称的H表示血球凝集素。

血球凝集素结合肽意为可与血球凝集素结合的肽。是否可与血球凝集素结合，本领域的技术人员可依照公知的方法进行确认。

其药学上可容许的盐意为血球凝集素结合肽在药学上可容许的盐。盐的例子可列举：无机酸(盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等)的加成盐、有机酸(对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、羧酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等)的加成盐、无机碱(氢氧化铵或是碱或碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)、氨基酸的加成盐等。

其药学上可容许的溶剂合物意为血球凝集素结合肽在药学上可容许的溶剂合物或血球凝集素结合肽的盐在药学上可容许的溶剂合物。溶剂分子可为已与化合物或其盐配位者，溶剂合物的例子为水合物及醇合物。

所述血球凝集素结合肽为以下(1)至(7)中任一种肽。

(1)由序列编号1或2所示的氨基酸序列所组成的多肽：

(4)由序列编号2中N末端的Trp为氯乙酰－Trp且将C末端的Lys取代成经施予式(II)所示的修饰的赖氨酸衍生物的序列所组成的多肽。

式(I)

[化学式17]

(式(I)中，*表示与C末端Cys的羰基的连结部分，A¹表示C₈－C₁₂烷基)。C₈－C₁₂烷基系碳数为8～12个的烷基。C₈－C₁₂烷基可为直链状的烷基，亦可为具有分支的烷基。C₈－C₁₂烷基可为C₈烷基、C₉烷基、C₁₀烷基、C₁₁烷基及C₁₂烷基的任一种。以下各基团中的A¹亦为相同。

式(II)

[化学式18]

血球凝集素结合肽的较佳例如下。

(1)由序列编号1或2所示的氨基酸序列所组成的多肽。

此肽的具体的氨基酸序列的例子如下。

Chloroacetyl－Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－NH₂(序列编号：3)

Chloroacetyl－Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys[gamma－C(＝O)n－C₁₁H₂₃]－NH₂(序列编号：4)

Chloroacetyl－Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys[gamma－C(＝O)n－C₉H₁₉]－NH₂(序列编号：5)

Chloroacetyl－Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－[NHCH₂CH₂NHC(＝O)n－C₁₁H₂₃](序列编号：6)

Chloroacetyl－Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－[NHCH₂CH₂NHC(＝O)n－C₉H₁₉](序列编号：7)

在本说明书中，用于表示构成为构成本发明的肽及多肽的蛋白质的氨基酸(蛋白质氨基酸)残基，是使用本领域中已接受的三字母符号或单字母符号。

作为本说明书所公开的另一氨基酸，可列举：不构成蛋白质的氨基酸(亦称为非蛋白质氨基酸，简称为非天然氨基酸)；或具有本领域公知特性的氨基酸特征的化学合成的化合物等。作为非天然氨基酸的例子，可列举：主链的结构与天然型不同的α,α－二取代氨基酸(α－甲基丙氨酸等)、N－烷基－α－氨基酸、N－烷基－α－D－氨基酸、β－氨基酸；及侧链的结构与天然型不同的氨基酸(正白氨酸、高组氨酸、羟脯氨酸等)，但并不限定于此。

作为本说明书所公开的非天然型氨基酸的例子，有将一种N－烷基－α－氨基酸的N－甲基氨基酸，即N－甲基甘氨酸表示为MeGly，将N－甲基丙氨酸表示为MeAla，将N－甲基苯基丙氨酸表示为MePhe。又，作为侧链的结构与天然型不同的氨基酸的例子，有将4R－羟脯氨酸表示为hydPro。

Chloroacetyl－意为氯乙酰化，Chloroacetyl－Trp表示氯乙酰－Trp。

在本说明书中，多肽是指2个以上的氨基酸以肽键结合者，例如，可为8－30氨基酸进行肽结合而成者，可为直链状亦可为环状。优选为15或16氨基酸的环状氨基酸。

又，本发明所述的血球凝集素结合肽亦可被环化(大环化)。在本说明书中，环化意为在1个肽内，相隔1氨基酸以上的2个氨基酸直接或通过连接臂等间接结合，而在分子内形成环状的结构。

可通过公知的方法进行环化，例如可依照国际公开WO2016/063969小册所记载的方法进行。

血球凝集素结合肽的优选例是以下列式(III)或(IV)表示。

[化学式19]

[化学式20]

(式(IV)中，式A³表示以－NH₂所示的基团或式(II)所示的基团)。

[化学式21]

[化学式22]

(式(IIa)中，*表示连结部分，A¹表示C₈－C₁₂烷基)。

[化学式23]

式(VI)中，式A⁵表示以－NH₂所示的基团或式(I)所示的基团。

[化学式24]

环状肽的具体结构如下。

[化学式25]

[化学式26]

[化学式27]

[化学式28]

[化学式29]

本发明的肽可通过液相法、固相法、组合液相法与固相法的混合法等的化学合成法；基因重组法等公知的肽的制造方法进行制造。

固相法是使例如具有羟基的树脂的羟基与α－氨基被保护基所保护的第一氨基酸(通常是作为目标的肽的C末端氨基酸)的羧基进行酯化反应。作为酯化触媒，可使用1－均三甲苯磺酰基－3－硝基－1,2,4－三唑(MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)等公知的脱水缩合剂。

接着，使第一氨基酸的α－氨基的保护基脱离，并且加入主链的羧基以外的全部官能基都被保护的第二氨基酸，使该羧基活性化，以使第一及第二氨基酸结合。再将第二氨基酸的α－氨基去保护，加入主链的羧基以外的全部官能基都被保护的第三氨基酸，使该羧基活性化，以使第二及第三氨基酸结合。重复此操作，合成完作为目标的长度的肽后，将全部官能基去保护。

作为用于固相法的树脂，可列举：Merrifield树脂、MBHA树脂、Cl－Trt树脂、SASRIN树脂、Wang树脂、Rink amide树脂、HMFS树脂、Amino－PEGA树脂(默克股份有限公司)、HMPA－PEGA树脂(默克股份有限公司)等。此等树脂可用溶剂(二甲基甲酰胺(DMF)、2－丙醇、二氯甲烷等)清洗后使用。

作为α－氨基的保护基，只要为公知的保护基，则并无特别限定，可举例如：苄氧羰基(Cbz或Z)、叔丁氧羰基(Boc)、芴甲氧羰基(Fmoc)、苄基、烯丙基、烯丙氧羰基(Alloc)等。此外，Cbz基可通过氢氟酸、氢化等去保护，Boc基可通过三氟乙酸(TFA)去保护，Fmoc基可利用哌啶进行处理而去保护。

作为α－羧基的保护基，只要为公知的保护基，则并无特别限定，可举例如：甲酯、乙酯、苄酯、叔丁酯、环己酯等。

氨基酸的其他官能基无特别限定，例如，丝氨酸或苏氨酸的羟基能够以苄基或叔丁基保护，酪氨酸的羟基系以2－溴苄氧羰基或叔丁基保护。赖氨酸侧链的氨基、麸氨酸或天门冬氨酸的羧基可与α－氨基、α－羧基相同地进行保护。

可使用缩合剂进行羧基的活性化。作为缩合剂，可举例如：二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)、1－乙基－3－(3－二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC或WSC)、(1H－苯并三唑－1－基氧基)三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、1－[双(二甲氨基)甲基]－1H－苯并三唑鎓－3－氧化物六氟磷酸盐(HBTU)等。

从树脂切断肽链可通过以TFA、氟化氢(HF)等的酸进行处理而进行。

利用基因重组法(转译合成系统)制造肽，可使用编码本发明的肽的核酸来进行。编码本发明的肽的核酸可为DNA亦可为RNA。

编码本发明的肽的核酸可用公知的方法或依据其方法进行制备。例如，可通过自动合成装置进行合成。亦可加入限制酵素识别部位用于使所得到的DNA插入载体；或并入核酸序列，来编码用以将形成的肽链以酵素等切出的氨基酸序列。

如上所述，使本发明的肽与细胞穿透肽等融合时，上述核酸亦包含编码细胞穿透肽的核酸。

为了抑制来自宿主的蛋白酶所引起的分解，亦可使用将目标的肽作为与其他肽的嵌合肽而表达的嵌合蛋白质表达法。此情况下，作为上述核酸，可使用编码目标的肽及与其结合的肽的核酸。

接着，使用编码本发明的肽的核酸来制备表达载体。核酸可直接、或以限制酵素消化、或加成连接臂等而插入表达载体的启动子的下游。作为载体，可列举：来自大肠杆菌的质体(pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC18、pUC19、pUC118、pBluescript II等)、来自枯草杆菌的质体(pUB110、pTP5、pC1912、pTP4、pE194、pC194等)、来自酵母的质体(pSH19、pSH15、YEp、YRp、YIp、YAC等)、噬菌体(e噬菌体、M13噬菌体等)、病毒(反转录病毒、痘疮病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、花椰菜嵌纹病毒、烟草嵌纹病毒、棒状病毒等)、黏接质体等。

启动子可根据宿主的种类而适当选择。宿主为动物细胞的情况下，例如可使用来自SV40(猴病毒四十型)的启动子、来自CMV(巨细胞病毒)的启动子。宿主为大肠杆菌的情况下，可使用trp启动子、T7启动子、lac启动子等。

表达载体亦可并入编码DNA复制起点(ori)、选择标记(抗生素抗药性、营养需求性等)、增强子、剪接信号、poly(A)加尾信号、标签(FLAG、HA、GST、GFP等)的核酸等。

接着，以上述表达载体将适当的宿主细胞进行转形。宿主可视与载体的关系而适当选择，例如，可使用大肠杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌属菌)、酵母、昆虫或昆虫细胞、动物细胞等。作为动物细胞，例如，可使用HEK293T细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓癌细胞、海拉细胞、Vero细胞。转型可根据宿主的种类而依照转染法、磷酸钙法、电穿孔法、显微注射法、粒子枪法等公知的方法进行。通过将转型体依照常法进行培养，可出现目标的肽。

从转型体的培养物精制肽，是将培养细胞回收，于适当的缓冲液中进行悬浮后，通过超音波处理、冻融等方法将细胞破坏，利用离心分离或过滤得到粗萃取液。肽分泌至培养液中时，回收上清液。

从粗萃取液或培养上清液进行精制，亦可用公知的方法或依据其的方法(例如，盐析、透析法、超滤法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、离子交换层析法、亲和层析法、反相高效液相层析法等)进行。

所得到的肽可用公知的方法或依据其的方法从游离态转化成盐或从盐转化成游离态。

转译合成系统亦可为无细胞转译系统。无细胞转译系统包含例如核糖体蛋白质、氨酰tRNA合成酵素(ARS)、核糖体RNA、氨基酸、rRNA、GTP、ATP、转译起始因子(IF)、延伸因子(EF)、终止因子(RF)、及核糖体再循环因子(RRF)、以及转译所需的其他因子。为了提升表达效率，亦可加入大肠杆菌萃取液或小麦胚芽萃取液。此外，亦可加入兔红血球萃取液或昆虫细胞萃取液。

通过使用透析对包含此等成分的系统连续地供给能量，可生产数100μg至数mg/mL的肽。为了一并从基因DNA进行转录，亦可为包含RNA聚合酶的系统。作为市售的无细胞转译系统，可使用来自大肠杆菌的系统的罗氏诊断公司的RTS－100(注册商标)、GeneFrontier公司的PURESYSTEM或NEW ENGLAND Biolabs公司的PURExpress体外蛋白质合成试剂盒等，使用小麦胚芽萃取液的系统的ZOEGENE公司或无细胞科学股份有限公司的产品。

根据无细胞转译系统，无需精制表达产物即可得到高纯度的形态。

在无细胞转译系统中，亦可使用将所要求的氨基酸或羟酸连结(酰化)至tRNA的人工氨酰tRNA，来代替由天然氨酰tRNA合成酵素合成的氨酰tRNA。该氨酰tRNA可使用人工核酶来合成。

作为所述核酶，可列举：flexizyme(H.Murakami,H.Saito,and H.Suga,(2003),Chemistry&Biology,Vol.10,655－662；H.Murakami,D.Kourouklis,and H.Suga,(2003),Chemistry&Biology,Vol.10,1077－1084；H.Murakami,A.Ohta,H.Ashigai,H.Suga(2006)Nature Methods 3,357－359“The flexizyme system：a highly flexible tRNAaminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides”；N.Niwa,Y.Yamagishi,H.Murakami,H.Suga(2009)Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters 19,3892－3894“A flexizyme that selectively charges amino acids activated by awater－friendly leaving group”；及WO2007/066627等)。flexizyme亦作为原型的flexizyme(Fx)、及由其变化而成的二硝基芐基flexizyme(dFx)、增强型flexizyme(eFx)、氨基flexizyme(aFx)等的称呼而为人所知。

通过使用由flexizyme制成且连结有所要求的氨基酸或羟酸的tRNA，可将所要求的密码子与所要求的氨基酸或羟酸赋予关连并进行转译。作为所要求的氨基酸，亦可使用特殊氨基酸。例如，上述环化所需的非天然氨基酸亦可通过该方法而导入至血球凝集素结合肽。

本发明的大环状肽及其类似物的化学合成可使用包含阶段性固相合成、经由构造形态上可支持的再连接的肽链段的半合成、化学连接的各种该技术领域中通用的方法而合成。本说明书所记载的肽及其类似物的合成，例如是使用K.J.Jensen,P.T.Shelton,S.L.Pedersen,Peptide Synthesis and Applications,2nd Edition,Springer,2013等记载的各种固相技术的化学合成。作为优选对策，是根据可暂时保护α－氨基及利用碱选择性去除的Fmoc基，与可暂时保护侧链官能基且在去Fmoc条件下组合稳定的保护基。此类一般肽侧链的选择在上述Peptide Synthesis and Applications,2nd edition或G.B.Fields,R.L.Noble,Solid Phase Peptide Synthesis Utilizing 9－FluorenylmethoxycarbonylAmino Acids,Int.J.Peptide Protein Res.35,1990,161－214等已为人所知，但作为优选肽侧链保护基有：针对以赖氨酸为代表的氨基的Boc基或Mtt基、针对麸氨酸或天门冬氨酸的羧基的tert－butyl基、以及针对半胱氨酸的硫醇基的Trt及Mmt基。

合成本发明中作为肽合成的前驱物的树脂(或简称为resin)，可利用例如市售的PAL－PEG－resin或PAL－PEG－PS等，参考Biopolymers 2011；96(6)：715－22等的报告例进行制备。例如，概略显示于Scheme 1，n表示碳数的长度；R1表示氢或碳数为1－4的烷基；R2表示各种烷基链或具有取代基的烷基链。在适当的碱存在下以o－Ns－Cl使树脂1的氨基进行磺酰化而制备2，使以Fmoc保护N末端的氨基一级醇3，例如Fmoc－甘氨醇，在光延反应下组合所使用的试剂，例如使其在三苯膦与偶氮二羧酸二异丙酯等的存在下进行反应，由此可得到固相树脂4。Fmoc的去保护可在适当的2级氨与溶剂中的组合，例如在哌啶的DMF溶液中进行而形成5，并使用已知的多肽偶联法将各种酰基导入至重制的氨而形成6。关于R2，可通过使例如具有长链烷基的癸酸(示性式CH₃(CH₂)₈COOH)在缩合剂HATU与DIPEA的存在下进行反应而导入。最后，以适当的碱与硫醇基，例如DBU与DODT的组合处理o－Ns基的去除，由此可调整肽合成的前驱物的树脂7。

[化学式30]

本发明中的肽合成亦可使用市售的树脂作为其他方法。例如，概略显示于scheme－2，作为一优选前驱物树脂的其他调整法，可使用市售的Rink Amide MBHA树脂(西格玛奥德里奇公司)、Fmoc－Rink Amide NovaPEG resin(默克密理博公司)或Fmoc－NH－SAL－PEG resin(渡边化学公司)作为固相树脂(8)，去Fmoc之后，使其与Fmoc氨基酸9进行缩合而得到10，该Fmoc氨基酸9在侧链具有一级或二级氨基，该一级或二级氨基具有可在温和的酸性条件下去除的保护基，例如Fmoc－Lys(Mtt)－OH(m＝3，R³＝H，S－configuration)。将所得到的固相树脂以TFA/TIS/CH₂Cl₂的体积比1：4：95的溶液进行处理，由此可选择性去除Mmt基而形成11。接着，可导入上述R₂COOH后形成12，并去除Fmoc基形成13，而可用于目标的肽合成。

[化学式31]

本发明所记载的肽及其类似物，可于阶段性方法中在上述固相树脂上合成。使用的C末端氨基酸及用于合成的全部氨基酸或肽，必须在合成过程中选择性地去除α－氨基保护基。优选为使用上述固相树脂，并通过适当的试剂将使用Fmoc等保护基适当保护N末端的肽的C末端羧基或使用Fmoc等保护基适当保护的氨基酸的C末端羧基形成活性化酯之后，通过加成至固相树脂上的氨基而开始。接着，肽链的延伸可依照目标的肽的氨基酸序列，依序重复N末端保护基(例如Fmoc基)的去除，接着保护氨基酸衍生物的缩合来达成。此外，此等操作可使目标的肽在最终阶段游离。例如，作为使其游离的条件，如Teixeira,W.E.Benckhuijsen,P.E.de Koning,A.R.P.M.Valentijn,J.W.Drijfhout,ProteinPept.Lett.,2002,9,379－385等所列举，可于TFA中，在作为捕捉剂的包含水/硅烷基氢化物/硫醇基的TFA溶液下使其游离。作为典型例，可列举TFA/Water/TIS/DODT(体积比92.5：2.5：2.5：2.5)。

本说明书所记载的肽类似物的合成，可通过使用单或多通道肽合成仪，例如CEM公司的Liberty Blue合成仪或Biotage公司的Syro I合成仪来实施。

本说明书所公开的另一实施方案是关于一种药物。该药物包含上述血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或溶剂合物(方便起见，以下亦将此等简称为血球凝集素结合肽)。该药物优选为将上述血球凝集素结合肽作为有效成分且包含有效量者。

将血球凝集素结合肽用于药物用途时，为了对肽的一个或多个氨基酸进行功能赋予或各种变化，可利用例如烃、脂肪酸、聚乙二醇(PEG)等施予化学修饰。又，此等化学修饰亦可使用连接臂进行。通过此等修饰，例如，可得到化学上及代谢上更稳定的肽。连接臂是可显示抗病毒活性的环状肽(例如(II)所示的基本结构)与可进行用以功能赋予的化学修饰的子结构。本发明中的基本结构的具体例为(I)所示的1,2－乙二胺结构或(II)所示的C末端为NH₂的赖氨酸酰胺结构。

如下述实施例所示，本发明的肽通过与病毒表面的血球凝集素结合而显示抗病毒活性。此外，只要是通过血球凝集素或类似的蛋白质对感染人类等的病毒显示抗病毒活性者，则不特别限定病毒的种类。作为病毒的种类，例如是包膜病毒，进一步优选为具有I类融合蛋白的病毒。作为具体的病毒例，为季节性流感(包含人类、鸟、猪流感病毒或新型流感病毒，也单纯称为流感病毒)、高病原性禽流感、猪流行性腹泻流感、HIV－1、伊波拉病毒、黄热病病毒及新冠病毒。作为成为对象的病毒，优选为流感病毒。又，虽然成为对象的流感病毒可为A、B及C型任一者，但优选为A型，且更优选为具有属于团体I的血球凝集素的流感病毒，此外，在本说明书中，也将抗流感病毒活性称为抗病毒活性。

包含本发明的肽的组成物，作为病毒感染的预防或病毒感染病的治疗剂，优选作为流感的预防或治疗剂十分有用，同样地，本发明的肽，在病毒感染的预防或病毒感染病的治疗方法中，优选为在流感的预防或治疗方法中十分有用。

在本说明书中，流感是指流感病毒所引起的急性感染病。当感染流感病毒时，人体会出现伴随发烧、肌肉酸痛等的感冒症状。有时会伴随腹痛、呕吐、腹泻等的肠胃症状，并发症有肺炎与流感脑炎。

在本说明书中，感染是作为意指病毒通过皮肤或黏膜侵入活体的过程，或病毒通过膜融合而侵入细胞内的过程的任一种的用语而使用。又，在本说明书中，病毒感染是指不管有无症状，病毒侵入体内的状态。又，在本说明书中，感染症状是指因病毒感染而引起的各种症状。

在本说明书中，流感的治疗或预防是使用其最广泛的意思，例如，意指产生与流感病毒的感染相关的一个或多个症状的缓和或阻止其恶化、抑制感染后的症状产生、阻止(延迟或停止)体内的病毒对细胞的感染、阻止(延迟或停止)体内的病毒繁殖、减少体内的病毒数等效果。显示此等之中至少一个效果时，即判断对于流感的治疗或预防有用。

又，如下述实施例所示，本发明是肽对血球凝集素具有中和活性，因此理解为可得到与流感疫苗相同的效果。

在本说明书中，药物组成物的给药形态并无特别限定，可为经口给药予亦可为非经口给药。作为非经口给药，可举例如：肌肉内注射、静脉内注射、皮下注射等的注射给药、经皮给药、经黏膜给药(经鼻、经口腔、经眼、经肺、经膣、经直肠)给药等。

鉴于多肽容易被代谢及排泄的性质，上述药物组成物可进行各种修饰。例如，可将聚乙二醇(PEG)或糖链加成至多肽以延长血中滞留时间并降低抗原性。又，亦可将聚乳酸－甘醇酸(PLGA)等的体内分解性的高分子化合、多孔性羟磷石灰、脂质体、表面修饰脂质体、以不饱和脂肪酸所制备是乳化液、奈米粒子、奈米球等用作缓释型基剂，并使多肽包含于其中。经皮给药时，亦可于皮肤表面流动弱电流以穿透角质层(离子电渗法)。

上述药物组成物，可直接使用有效成分，亦可加入药学上可容许的担体、赋形剂、添加剂等而制剂化。作为剂形，可举例如：液剂(例如注射剂)、分散剂、悬浊剂、锭剂、丸剂、粉剂、坐剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆、片剂、吸入剂、软膏剂、点眼剂、点鼻剂、点耳剂、泥罨剂等。

制剂化可适当使用例如赋形剂、结合剂、崩解佐剂、润滑剂、溶解剂、溶解辅助剂、着色剂、矫味矫臭剂、稳定剂、乳化剂、吸收促进剂、界面活性剂、pH调整剂、防腐剂、抗氧化剂等，并通过常法进行。

作为用于制剂化的成分的例子，可列举：蒸馏水、食盐水、磷酸缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等药学上可容许的有机溶剂、动植物油、乳糖、甘露醇、葡萄糖、山梨糖醇、结晶纤维素、羟丙基纤维素、淀粉、玉米淀粉、无水硅酸、硅酸铝镁、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、黄蓍树胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、二甘油、甘油、丙二醇、石油脂、石蜡、肉豆蔻酸辛基十二酯、肉豆蔻酸异丙酯、高级醇、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白等，但并不限定于此。

鉴于肽不易经黏膜吸收，上述药物组成物可包含改善难吸收性药物的吸收的吸收促进剂。作为该吸收促进剂，可使用聚氧乙烯月桂醚类、月桂基硫酸钠、皂素等的界面活性剂；甘胆酸、脱氧胆酸、牛胆酸等的胆盐；EDTA、柳酸类等的螯合剂；己酸、癸酸、月桂酸、油酸、亚油酸、混合微胞等的脂肪酸类；烯胺衍生物、N－酰基胶原蛋白肽、N－酰基氨基酸、环糊精类、几丁聚糖类、一氧化氮施予体等。

丸剂或锭剂亦能够以糖衣、胃溶性、肠溶性物质被覆。

注射剂可包含注射用蒸馏水、生理食盐水、丙二醇、聚乙二醇、植物油、醇类等。再者，可加入湿润剂、乳化剂、分散剂、稳定剂、溶解剂、溶解辅助剂、防腐剂等。

将本发明的药物组成物对哺乳类(例如，人类、小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、狗、马、猴、猪等)，特别是对人体投予时的投予量，是因症状、患者的年龄、性别、体重、感受性差异、投予方法、投予间隔、有效成分的种类、制剂的种类而异，并无特别限定，例如，可1次或分多次投予30μg～100g、100μg～500mg、100μg～100mg。注射投予时，视患者的体重，可1次或分多次投予1μg/kg～3000μg/kg、3μg/kg～1000μg/kg。

使用本发明的肽的流感的预防或治疗方法，可参照上述药物组成物的记载来实施。

本说明书所公开的另一实施方案是关于一种病毒检测药，特别是关于一种流感病毒检测药。该病毒检测药包含上述血球凝集素结合肽、其盐或其溶剂合物。

(病毒检测药及检测用套组)

本发明亦包含含有本发明的肽的病毒检测药，特别是包含含有本发明的肽的流感病毒检测药。本发明的肽会与病毒表面的血球凝集素特异性结合。因此，例如，可使用本发明的肽代替酶联免疫吸附测定法等的免疫测定法中的抗流感抗体检测试样中的流感病毒。

用作检测药时，本发明的肽亦可标识成可检测。可用公知的标识物质对肽进行标识，例如，可使用以过氧化酶、碱性磷酸酶等的酵素、125I、131I、35S、3H等的放射性物质、荧光异硫氰酸盐、罗丹明、丹磺酰氯、藻红素、四甲基罗丹明异硫氰酸盐、近红外荧光材料等的荧光物质、荧光素酶、荧光素、水母素等发光物质标识过的抗体。此外，亦可检测出以黄金胶体、量子点等的奈米粒子标识过的抗体。

又，免疫测定法中，亦能够以生物素对本发明的肽进行标识，并使其与以酵素等标识过的卵白素或链霉亲和素结合来检测。

免疫测定法中，使用酵素标识的ELISA法亦可简便且迅速地测量抗原而为优选。例如，将特异性识别流感病毒的血球凝集素以外的部分的抗体固定于固相担体，添加样本并使其反应后，添加已标识的本发明的肽且使其反应。清洗后，与酵素基质反应，使其显色并测量吸亮度，由此可检测出流感病毒。亦可在使已固定于固相担体的抗体与试样反应后，添加未标识的本发明的肽，再将针对本发明的肽的抗体进行酵素标识并进一步添加。又，也可将本发明的肽作为捕捉物质并固定于固相担体，并将识别流感病毒的标记抗体使用作为检测物质，进一步在捕捉或检测皆可使用本发明的肽。

酵素基质的酵素为过氧化酶时，可使用3,3’－二氨基联苯胺(DAB)、3,3’,5,5’－四甲基联苯胺(TMB)、邻苯二胺(OPD)等，若为碱性磷酸酶时，可使用对硝基苯磷酸酯(NPP)等。

在本说明书中，“固相担体”只要为可固定抗体的担体，则并无特别限定，可列举：玻璃制、金属性、树脂制等的微孔板、基板、珠粒、硝化纤维膜、尼龙膜、PVDF膜等，目标物质可依照公知的方法固定于此等固相担体。

本发明所述的检査用套组包含上述检测所需的试剂及器具(包含本发明的肽、抗体、固相担体、缓冲液、酵素反应终止液、微量盘式分析仪等，但并不限定于此)。

本说明书所公开的另一实施方案亦可考虑用作包含上述流感病毒检测药的流感病毒检测用套组、及用以查明通过血球凝集素产生的流感病毒的感染及伴随于此的各种细胞功能或生命现象的工具。

本说明书亦提供血球凝集素结合肽的使用，用以制造预防或治疗流感的药物。此情况下的血球凝集素结合肽可为上述任一种。

本说明书亦提供流感的预防或治疗方法，其包含将有效量的血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物作为有效成分并对人类、非人类的哺乳动物或鸟类的对象投予的步骤。血球凝集素结合肽可适当使用上述肽。非人类的哺乳动物的例子为人类以外的灵长类、猪、牛、狗、猫、马、羊、大鼠及小鼠。

本说明书，特别是下述代表性实施例中使用的简写为本领域的技术人员所公知。所使用的几个简写如下：9－芴甲氧羰基为Fmoc；1－羟基苯并三唑为HOAt；O－(7－氮杂苯并三唑－1－基)－N,N,N’,N’－四甲基脲六氟磷酸盐为HATU；乙腈为MeCN；1,8－二吖双环“5.4.0”－7－十一烯为DBU；N,N－二异丙基乙基胺为DIPEA；3,6－二氧杂－1,8－辛烷－二硫醇为DODT；二甲基亚砜为DMSO；N,N－二甲基甲酰胺为DMF；毫升(单位)为mL；摩尔浓度(单位)为M；单甲基三苯甲基为Mtt；单甲氧基三苯甲基为Mmt；2－硝苯磺酰基为o－Ns；volume/volume为v/v；三氟乙酸为TFA；三异丙基硅烷为TIS；三苯甲基为Trt。

实施例及一般方法

在本发明的化学合成中使用的全部原料、结构单元、试剂、酸、碱、固相树脂、溶剂可直接使用市售品或由本领域的技术人员使用有机化学的方法合成。此外，包含保护基的氨基酸，若无特别记载是直接使用市售品。

在本发明中化学合成的肽的结构决定已通过质谱分析法中的ESI－MS(+)确认分子量，该分子量是考虑依照目标序列使用的氨基酸与视需求所使用的结构单元并计算而得。此外，“ESI－MS(+)”系表示在正离子模式下实施的电喷雾电离质谱分析法。所检测的质量是以“m/z”单位标示进行报告。此外，分子量约大于1000的化合物，已作为2价离子或3价离子而以高频率检测出。

在本发明中经化学合成的肽的纯度已用以下任一种分析方法决定。

(分析条件)

分析条件A

管柱：CORTECS(注册商标)UPLC(注册商标)C18 column(Nihon Waters公司)、

1.6μm、2.1x100mm

移动相：MeCN/0.025％TFA in H₂

温度：40℃

梯度：5－95％MeCN/0.025％TFA in H₂ in 5.56min；线性梯度

流量：0.4mL/min

检测法：UV 220nm

分析条件B

管柱：Kinetex EVO C18 2.6μm、2.1ID x 150mm、

(Phenomenex公司)

管柱温度：60℃

移动相A：0.025％TFA in H₂

移动相B：0.025％TFA in CH₃CN

梯度：各实施例中所记载

流速：0.25mL/min

检测：PDA(225nm)

本发明所记载的固相树脂中的肽链的延伸，是将各实施例所记载的树脂作为初始原料，并使用通常使用的肽偶联反应条件与Fmoc去除反应条件而进行。反应是使用CEM公司的Liberty Blue，依照制造厂商的说明书进行。所使用的一般氨基酸列举如下，侧链保护基显示于括号内。

Fmoc－Trp(Boc)－OH；Fmoc－Thr(tBu)－OH；Fmoc－N－Me－Gly－OH；Fmoc－Asp(OtBu)－OH；Fmoc－N－Me－Phe－OH；Fmoc－Ala－OH；Fmoc－N－Me－Ala－OH；Fmoc－His(Trt)－OH；Fmoc－Tyr(tBu)－OH；Fmoc－Val－OH；Fmoc－HydPro(tBu)－OH；Fmoc－Cys(Trt)－OH；Fmoc－Lys(Mtt)－OH；Fmoc－Ser(tBu)－OH；Fmoc－N－Me－Ser(tBu)－OH。

氯乙酰基的导入是通过下述方式进行：对于上一步骤所得到的保持有以Fmoc保护的肽的固相树脂，以上述方法去除α－氨基的Fmoc基之后，加入氯乙酸(约3等量)、约3等量的N,N’－二异丙基碳二亚胺的DMF溶液(0.5M)、约3等量的HOAt的DMF溶液(0.5M)，并在室温下振荡40分钟。

侧链的去保护及从固相树脂的切除，是先将氯乙酰基导入步骤后所得到的树脂以DMF与二氯甲烷分别清洗5次并在减压下干燥。接着于装有固相树脂的反应容器中加入反应剂混合物－A(TFA/H2/TIS/DODT的体积比92.5：2.5：2.5：2.5的混合物)，在室温下振荡150分钟。将反应液从玻料(frit)过滤回收。将残留于反应容器中的固相树脂与切除用混合物再次振荡后，从玻料回收溶液成分，并与上述滤液混合。若将该滤液加入冷却至0℃的过剩的二乙醚，则产生混浊沉淀。将该混合物进行离心分离(9000rpm，3min)，使溶液倾析。以再次冷却至0℃的少量二乙醚清洗所得到的个体后，将所得到的固体用于下一个环化反应。

本发明中肽的环化反应是通过下述方式进行：肽的最终浓度为以固相树脂的摩尔数为基准，以成为5mM的方式使其溶解于DMSO后，加入6等量的三乙胺，在室温下搅拌约16小时。以乙酸使将所得到的反应溶液成为酸性并使用Biotage(注册商标)V－10(BiotageJapan公司)进行减压浓缩。

作为所得到的粗精制肽的精制方法，是于沃特世公司自动纯化系统－SQD2单四极杆质谱仪中使用反相分离HPLC，一边监测来自目标物质的m/z离子一边进行溶析。确认以ESI－positive的扫描模式所得到的质谱与包含从目标物质的分子式计算的多价离子的质谱在使用的质量分析器的误差范围内一致。此外，包含使用的管柱的精制条件显示于各实施例。

[实施例1]

HA119的合成

[化学式32]

使用Fmoc－NH－SAL－PEG resin(渡边化学，0.15mmol/g，0.43g)，依照上述的一般方法，从去除Fmoc开始，合成目标的肽。接着，依照一般的方法导入氯乙酰基。

所得到的粗制生成物是使用以下条件精制(管柱：Waters Xbridge(注册商标)C185μm OBD(注册商标)19x 150mm(Nihon Waters公司)；移动相：A＝0.1％TFA in H₂O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％B)：花费3分钟5－29％，之后花费8分钟29－34％；流量：17mL/min)。

目标物质的纯度是从分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱的面积比算出，其为99.4％。

分析条件A：保持时间＝3.57分钟，ESI－MS(+)观测值m/z＝899.8理论值899.5((M/2)+H)

分析条件B：保持时间＝16.5分钟；梯度(％B conc)：花费20分钟25－65％，之后花费1分钟65－95％，之后花费5分钟95％

[实施例2]

HA146的合成

[化学式33]

将Fmoc－NH－SAL－PEG resin(渡边化学，0.37mmol/g，1.35g)放入附玻料的反应容器中，与二氯甲烷进行震荡以使其膨胀。依照上述的一般方法，去除Fmoc后以及将Fmoc－Lys(Mtt)－OH以肽偶联导入所得到的固相树脂。以二氯甲烷使所得到的固相树脂膨润，加入反应剂混合物－B(TFA/TIS/CH2Cl2的体积比1：4：95)并在室温下震荡30分钟后，将反应液从玻料排出。重复该操作12次后，滤液的颜色变成无色透明。将此时间点作为反应结束。于所得到的固相树脂中加入癸酸的DMF溶液(0.21M，12mL)、HATU的DMF溶液(0.5M，5mL)及DIPEA的DMF溶液(1M，5mL)，于40℃震荡40分钟。将反应液从玻料排出后，将所得到的固相树脂以DMF、然后二氯甲烷的顺序进行清洗。

针对上述操作所得到的固相树脂，以上述一般的方法利用自动合成仪依序进行Fmoc的去除及导入Fmoc－氨基酸。用于反应的氨基酸与试剂是以固相树脂为0.5mmol进行等量计算。利用自动合成仪进行肽偶联，然后依照上述一般方法导入氯乙酰基。

接着，使用所得到的固相树脂，依照上述一般方法，进行侧链的去保护、从固相树脂的切除以及环化反应。

所得到的粗制生成物是使用以下条件精制(管柱：Waters Xbridge(注册商标)C185μm OBD(注册商标)50x250mm(Nihon Waters公司)；移动相：A＝0.1％TFA in H₂O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％B)：花费3分钟16－41％，之后花费7分钟47－52％，之后花费1.5分钟47－80％；流量；120mL/min)。

目标物质的纯度是从分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱的面积比算出，其为99.3％。

分析条件A：保持时间＝4.50分钟；ESI－MS(+)观测值m/z＝1040.4理论值1040.2((M/2)+H)

分析条件B：保持时间＝18.8分钟；梯度(％B conc)：花费20分钟25－65％，之后花费1分钟65－95％，之后花费5分钟95％

[实施例3]

HA145的合成

[化学式34]

HA145是依据实施例1所示的合成法，通过使用月桂酸代替癸酸所合成。

所得到的粗制生成物是使用以下条件精制(管柱：Waters Xbridge(注册商标)C185m OBD(注册商标)50x 250mm(Nihon Waters公司)；移动相：A＝0.1％TFA in H₂O，B＝0.1％TFAin MeCN；温度：40℃；梯度(％B)：花费3分钟21－46％，之后花费7分钟46－51％，之后花费1.5分钟51－80％；流量：120mL/min)。

分析条件A：保持时间＝4.42分钟，ESI－MS(+)观测值m/z＝1055.1理论值1054.3((M/2)+H)

分析条件B：保持时间＝18.8分钟、梯度(％B conc)：花费20分钟25－65％，之后花费1分钟65－95％，之后花费5分钟95％

[实施例4]

HA152的合成

[化学式35]

将PAL－PEG resin(渡边化学，0.22mmol/g，1.16g)放入附玻料的反应容器中，与二氯甲烷进行震荡以使其膨胀。将二氯甲烷从玻料排出之后，加入2－硝苯磺酰氯(4等量)的二氯甲烷溶液(5mL)与DIPEA(4等量)的二氯甲烷溶液(4mL)，在室温下搅拌30分钟。将反应液从玻料排出后，以二氯甲烷清洗固相树脂。于所得到的固相树脂中加入Fmoc－甘氨醇(10等量)的THF溶液(6mL)、三苯膦(12等量)的二氯甲烷溶液(5mL)及偶氮二羧酸二异丙酯(10等量)的二氯甲烷溶液(5mL)并在室温下震荡。反应的进行可取出少量的固相树脂，以切除用混合物处理后，以LCMS确认。将反应液从玻料排出后，以二氯甲烷清洗固相树脂。于所得到的固相树脂中加入哌啶(20％)的DMF溶液(12mL)，在室温下振荡30分钟。从狭缝排出反应液，再次加入哌啶(20％)的DMF溶液(12mL)并在室温下振荡30分钟。从狭缝排出反应液后，将所得到的固相树脂以DMF、然后二氯甲烷的顺序进行清洗。于所得到的固相树脂中加入癸酸的DMF溶液(0.21M，5mL)、HATU的DMF溶液(0.5M，2mL)及DIPEA的DMF溶液(1M，2mL)，于40℃震荡1小时。将反应液从玻料排出后，将所得到的固相树脂以DMF，然后二氯甲烷的顺序进行清洗。将所得到的固相树脂浸入10mL的DMF，并加入DODT(0.4mL，10eq)及DBU(0.37mL，10eq)，在室温下搅拌。在处理少量的固相树脂后，以LCMS确认反应的进行及原料的消失。

以上述一般方法利用自动合成仪将Fmoc－氨基酸依序导入上述操作所得到的固相树脂。用于反应的氨基酸与试剂是以固相树脂为0.25mmol进行等量计算。利用自动合成仪进行肽偶联，然后依照上述一般方法导入氯乙酰基。

使用所得到的固相树脂，依照上述一般方法，进行侧链的去保护、从固相树脂的切除以及环化反应。

所得到的粗制生成物是使用以下条件精制(管柱：Waters Xbridge(注册商标)C185μm OBD(注册商标)50x250mm(Nihon Waters公司)；移动相：A＝0.1％TFA in H₂O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％B)：花费3分钟17－42％，之后花费7分钟42－47％，之后花费1.5分钟47－80％；流量：120mL/min)。

目标物质的纯度是从分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱的面积比算出，其为98.4％。

分析条件A：保持时间＝4.18分钟，ESI－MS(+)观测值m/z＝998.6理论值998.2((M/2)+H)

分析条件B：保持时间＝16.48分钟，梯度(％B conc)：花费20分钟25－65％，之后花费1分钟65－95％，之后花费5分钟95％

[实施例5]

HA151的合成

[化学式36]

HA151可依据实施例4所示的合成法，通过使用月桂酸代替癸酸所合成。

所得到的粗制生成物是使用以下条件精制(管柱：Waters Xbridge(注册商标)C185μm OBD(注册商标)50x250mm；移动相：A＝0.1％TFA in H₂O，B＝0.1％TFA in MeCN；温度：40℃；梯度(％B)：花费3分钟22－47％，之后花费7分钟47－52％，之后花费1.5分钟52－80％；流量：120mL/min)。

目标物质的纯度是从分析条件B的LC/MS(UV波长225nm)色谱的面积比算出，其为97.7％。

分析条件A：保持时间＝4.49分钟，ESI－MS(+)观测值m/z＝1012.4理论值1012.2(M/2)+H)

分析条件B：保持时间＝12.5分钟；梯度(％B conc)：花费20分钟40－80％，之后花费1分钟80－95％，之后花费5分钟95％

[实施例6]

[肽对于流感病毒的抗病毒活性评价]

为了确认肽对于流感病毒在体外实验中的抗病毒活性，通过以下所示方法实施试验。具体的试验方法显示如下。

1)以3×10⁴cells/well播种MDCK细胞，在37℃，5％CO₂，MEM－10％FBS存在下培养24小时。

2)培养后，将100μL的无血清MEM加入well，清洗细胞单层。

3)通过感染维持培养基(含有维生素的无血清MEM)将试验对象化合物溶解，并调整成各测量浓度。

4)将溶解于感染维持培养基的无血清MEM的试验化合物加入各well。

5)以包含胰蛋白酶的感染维持培养基稀释流感病毒A/Nagasaki/HA－58/2009(H1N1)、A/Puerto Rico/8/34(H1N1)或A/Duck/Pennsylvania/84(H5N2)，制备成1,000TCID₅₀/mL。

6)以100μL/well添加所稀释的病毒液，并将每well的效价调整成100TCID50。

7)在37℃，5％CO2条件下培养72小时。

8)培养完成后，从各well去除培养液。

9)以200ul/well添加70％乙醇水溶液，并在室温下静置5分钟。

10)去除乙醇水溶液后，以200μL/well添加0.5％结晶紫水溶液，并在室温下静置5分钟。

11)以水冲洗，并在室温下使其干燥。

12)使用TECAN infinite 200(TECAN公司)，对测量波长λ＝560nm中的各well的吸亮度进行测量。

13)在各浓度中，算出将mock群(非添加药剂且非病毒感染群)设为100％时的相对值(CV relative value，％)。

14)使用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software公司)，求出各检体的EC50的值。

为了确认肽对于流感病毒在体内实验中的抗病毒活性，通过以下所示方法实施试验。具体的试验方法显示如下。

1)作为感染模型小鼠，将BALB/cA Jcl[SPF]小鼠调整为每1群5只。

2)将于－80℃保存的病毒在冰上徐缓地融化，进行数秒钟离心后，分开注入装有PBS的管材。

3)将流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)对麻醉中的小鼠以每1只267pfu进行经鼻接种，并将上述接种时间点作为“0日”。

4)使HA152溶解于溶解溶剂的10％羟丙基－β－环糊精溶液。

5)使帕拉米韦溶解于PBS溶液。

6)针对帕拉米韦以30μmol/kg，针对HA152以15μmol/kg的投予量进行尾静脉内投予。作为溶剂对照(vehicle control)，将10％羟丙基－β－环糊精溶液同样地进行尾静脉内投予。

7)流感病毒感染、化合物投予后，进行状态观察，包含1天1次生死观察。

8)以感染日作为0日来换算14天的生存率并算出生存率。

3.结果

使用流感病毒A/Nagasaki/HA－58/2009(H1N1)、A/Puerto Rico/8/34(H1N1)及A/Duck/Pennsylvania/84(H5N2)的HA152的活性评价结果

使用流感病毒A/Nagasaki/HA－58/2009(H1N1)、A/Puerto Rico/8/34(H1N1)及A/Duck/Pennsylvania/84(H5N2)进行iHA100及HA152在体外实验中的抗病毒活性评价的结果显示于图1。iHA100在最终浓度为1μm以上的高浓度域中抑制病毒所引起的细胞死亡，但在nM区域的低浓度域中则未显示显着的细胞死亡抑制。另一方面，明确可知HA152在μm以下的低浓度域中显示显着的细胞死亡抑制，在低浓度域中亦具有显着的抗病毒活性。由此可确认，相较于iHA100，HA152显示极高的抗流感病毒活性。

接着，使用流感病毒A/Duck/Pennsylvania/84(H5N2)，将包含iHA100、HA152的化合物在体外实验中的抗病毒活性以EC50算出。如图2所示的包含HA152的化合物，相较于iHA100，显示至少10倍以上高抗病毒活性。因此，HA152及图2所示的各化合物，相较于iHA100，显示保持显着的高抗流感病毒活性。

使用流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的HA152在小鼠感染模型中的活性评价结果

使用流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)进行帕拉米韦及HA152在体内实验中的抗病毒活性评价的结果显示于图3。

对于感染流感病毒的小鼠分析14天中的生存率，结果未投予药剂的群组的生存率为0％。另一方面，将帕拉米韦以30μmol/kg单次投予的群组的生存率为20％，相对于此，投予15μmol/kg的HA152的群组的生存率为60％。由此，HA152不仅在体外实验，而且在体内实验中亦显示显着的抗病毒活性。相较于以神经氨酸酶为标靶的批准药品帕拉米韦，其抗病毒活性为相同程度或其以上。

产业上的可利用性

本发明可应用于药物产业及医疗设备产业。

序列表

<110> 日商肽梦想股份有限公司(PeptiDream INC.)

<120> 血球凝集素结合肽

<130> 110F0464-IE

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (3)..(3)

<223> N-甲基甘氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (5)..(5)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (6)..(6)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (8)..(8)

<223> N-甲基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (13)..(13)

<223> 4-羟基-L-脯氨酸

<400> 1

Trp Thr Gly Asp Phe Phe Ala Ala His Tyr Thr Val Pro Ala Cys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (3)..(3)

<223> N-甲基甘氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (5)..(5)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (6)..(6)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (8)..(8)

<223> N-甲基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (13)..(13)

<223> 4-羟基-L-脯氨酸

<400> 2

Trp Thr Gly Asp Phe Phe Ala Ala His Tyr Thr Val Pro Ala Cys Lys

1 5 10 15

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (1)..(1)

<223> N-氯乙酰基-L-色氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (3)..(3)

<223> N-甲基甘氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (5)..(5)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (6)..(6)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (8)..(8)

<223> N-甲基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (13)..(13)

<223> 4-羟基-L-脯氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (15)..(15)

<223> 通常位于成熟活性胜肽的C末端

<400> 3

Trp Thr Gly Asp Phe Phe Ala Ala His Tyr Thr Val Pro Ala Cys

1 5 10 15

<210> 4

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (1)..(1)

<223> N-氯乙酰基-L-色氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (3)..(3)

<223> N-甲基甘氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (5)..(5)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (6)..(6)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (8)..(8)

<223> N-甲基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (13)..(13)

<223> 4-羟基-L-脯氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (16)..(16)

<223> 赖氨酸[gamma-C(=O)n-C11H23]-NH2

<400> 4

Trp Thr Gly Asp Phe Phe Ala Ala His Tyr Thr Val Pro Ala Cys Lys

1 5 10 15

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (1)..(1)

<223> N-氯乙酰基-L-色氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (3)..(3)

<223> N-甲基甘氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (5)..(5)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (6)..(6)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (8)..(8)

<223> N-甲基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (13)..(13)

<223> 4-羟基-L-脯氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (16)..(16)

<223> 赖氨酸[gamma-C(=O)n-C9H19]-NH2

<400> 5

Trp Thr Gly Asp Phe Phe Ala Ala His Tyr Thr Val Pro Ala Cys Lys

1 5 10 15

<210> 6

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (1)..(1)

<223> N-氯乙酰基-L-色氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (3)..(3)

<223> N-甲基甘氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (5)..(5)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (6)..(6)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (8)..(8)

<223> N-甲基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (13)..(13)

<223> 4-羟基-L-脯氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (15)..(15)

<223> 半胱氨酸-[NHCH2CH2NHC(=O)n-C11H23]

<400> 6

Trp Thr Gly Asp Phe Phe Ala Ala His Tyr Thr Val Pro Ala Cys

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成多肽

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (1)..(1)

<223> N-氯乙酰基-L-色氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (3)..(3)

<223> N-甲基甘氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (5)..(5)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (6)..(6)

<223> N-甲基苯基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (8)..(8)

<223> N-甲基丙氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (13)..(13)

<223> 4-羟基-L-脯氨酸

<220>

<221> 残基的转译后修饰(post-translational modification)

<222> (15)..(15)

<223> 半胱氨酸-[NHCH2CH2NHC(=O)n-C9H19]

<400> 7

Trp Thr Gly Asp Phe Phe Ala Ala His Tyr Thr Val Pro Ala Cys

1 5 10 15

Claims

1.一种血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物，其特征在于，所述血球凝集素结合肽为：

(1)由序列编号1或2所示的氨基酸序列所组成的多肽：

Trp－Thr－MeGly－Asp－MePhe－MePhe－Ala－MeAla－His－Tyr－Thr－Val－hydPro－Ala－Cys－Lys(序列编号2)；

(2)由序列编号1或2中N末端的Trp为氯乙酰－Trp的氨基酸序列所组成的多肽；

(3)由序列编号1中N末端的Trp为氯乙酰－Trp且通过酰胺键对C末端的Cys施予式(I)所示的修饰的氨基酸序列所组成的多肽；

(4)由序列编号2中N末端的Trp为氯乙酰－Trp且将C末端的Lys取代成经施予式(II)所示的修饰的赖氨酸衍生物的序列所组成的多肽；

(5)由序列编号1中通过酰胺键对C末端的Cys施予式(I)所示的修饰的氨基酸序列所组成的多肽；

(6)由序列编号2中Lys的侧链包含以酰基修饰的式(II)所示的赖氨酸衍生物的序列所组成的多肽；或

(7)具有上述(1)至(6)中任一种氨基酸序列、且是缺失、加成、取代或插入1或2个氨基酸的氨基酸序列的肽(其中，排除序列编号1中的C末端的Cys缺失者、及序列编号2中的C末端的Lys缺失者)；

式(I)

[化学式1]

(式(I)中，*表示与C末端Cys的羰基的连结部分，A¹表示C₈－C₁₂烷基)；

式(II)

[化学式2]

2.根据权利要求1所述的血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物，其特征在于，所述血球凝集素结合肽为：

(1)由序列编号1或2所示的氨基酸序列所组成的多肽：

3.根据权利要求1所述的血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物，其特征在于，

所述血球凝集素结合肽为环状。

4.根据权利要求3所述的血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物，其特征在于，

所述血球凝集素结合肽以下列式(III)或(IV)表示；

[化学式3]

(式(III)中，式A²表示以－NH₂所示的基团或以式(I)所示的基团)；

[化学式4]

(式(IV)中，式A³表示以－NH₂或式(II)所示的基团)。

5.根据权利要求3所述的血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物，其特征在于，

所述血球凝集素结合肽以下列式(V)或(VI)表示；

[化学式5]

(式(V)中，式A⁴表示以－NH₂所示的基团或以式(IIa)所示的基团)；

[化学式6]

(IIa)

(式(IIa)中，*表示连结部分，A¹表示C₈－C₁₂烷基)；

[化学式7]

式(VI)中，式A⁵表示以－NH₂或式(I)所示的基团。

6.根据权利要求3所述的血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物，其特征在于，

所述血球凝集素结合肽以下列式(VII)表示；

[化学式8]

7.一种用以预防病毒感染或治疗病毒感染病的药物，其特征在于，包含根据权利要求1至6中任一项所述的血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物。

8.一种用以预防或治疗流感的药物，其特征在于，包含根据权利要求1至6中任一项所述的血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物。

9.一种病毒检测药，其特征在于，包含根据权利要求1至6中任一项所述的血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物。

10.一种流感病毒检测药，其特征在于，包含根据权利要求1至6中任一项所述的血球凝集素结合肽、其药学上可容许的盐或其溶剂合物。

11.一种病毒检测用套组，其特征在于，包含根据权利要求9所述的病毒检测药。

12.一种流感病毒检测用套组，其特征在于，包含根据权利要求10所述的流感病毒检测药。