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TW202039583A - 結合因子IXa及因子X的蛋白分子 - Google Patents

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TW202039583A
TW202039583A TW108144824A TW108144824A TW202039583A TW 202039583 A TW202039583 A TW 202039583A TW 108144824 A TW108144824 A TW 108144824A TW 108144824 A TW108144824 A TW 108144824A TW 202039583 A TW202039583 A TW 202039583A
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藍道夫 克許包默
麥可 都可卡
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魯道夫 哈特曼
安德里亞 伊斯肯德里安
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瑞士商巴克斯歐塔有限公司
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Abstract

本發明提供結合因子IXa及因子X以增進促凝血活性（procoagulant activity）的蛋白分子。

Description

結合因子IXa及因子X的蛋白分子
本發明提供治療及/或預防出血性疾病（如A型血友病（hemophilia A））的治療劑。具體而言，本發明提供結合因子IXa及因子X的蛋白分子。
A型血友病是由因子VIII（FVIII）基因突變引起的嚴重X染色體連鎖型（X-chromosome-linked）隱性疾病。FVIII參與凝血的內在途徑，缺少FVIII會導致血液凝結不佳或幾乎不凝結。FVIII缺乏症（FVIII deficiency），亦稱作A型血友病，是最常見的出血性疾病之一，且在約10,000名男性之中有一人受影響（Stonebraker et al.（2012）Haemophilia 18（3）:e91-4）。依據因子FVIII血漿濃度為1%或以下（「嚴重」）、2至5%（「中度」）、及6至30%（「輕度」）（White et al.（2001）Thromb. Haemost. 85:560）或依據WFH 「Guidelines for the Management of Hemohpilia」第二版血友病（Haemophilia）；Epub 6 JUL 2012. DOI: 10.1111/j.1365-2516.2012.02909.x的5至>40%，將A型血友病的嚴重程度分成三級。在該疾病的嚴重型中，首次出血通常在年齡5至6個月大時出現，而在中度型中，首次出血則延至年齡約1至2歲大時。出血可自發出現，或發生在最小限度創傷後。在所有A型血友病患中，約有一半歸類為患有嚴重型疾病。彼等病患從幼年時期開始經歷嚴重出血，且在生命後期頻繁發生自發性或過度出血。出血通常發生在關節與肌肉，若無適當治療，反覆出血可導致不可逆的出血性關節病變（hemoarthropathy）（Manco-Johnson et al.（2007）N. Engl. J. Med. 357（6）:535-44）。
治療A型血友病的一項重要目標為維持FVIII血漿濃度大於1%，從而降低出血風險。欲達到此目的，頻繁地以靜脈內重組型或血漿衍生型FVIII作為預防性治療。然而，此一當前的A型血友病治療標準有其難度，其中有幾個缺點，且為病患及其家人帶來相當大的身心負擔。
在FVIII治療中最常見的阻礙為產生針對FVIII的異體抗體（alloantibodies），其作用為FVIII抑制劑。有多達30%的嚴重受影響病患會發展出此類異體抗體，且一旦開始發展，會侷限FVIII在治療持續性出血上的有效用途（Kempton & White（2009）Blood 113（1）: 11-7）。在彼等情況下，可採用其他繞徑藥劑（bypassing agents）控制出血。然而，彼等藥劑的半衰期通常較短，且並非總是有效。此外，由於FVIII的血漿半衰期短（成人平均約12小時，而兒童則更短），因此需要頻繁投予。此方案可能很困難，尤其是在幼童身上。由於可用的治療方法會引起併發症及副作用，目前沒有最佳且有效治療血友病的方法。因此，仍需要有新的有效治療方法，解決以FVIII治療A型血友病的缺點。
本發明提供一蛋白分子，其包含：（i）一包含第一抗原結合位點與第二抗原結合位點的骨架模組（scaffold module），以及（ii）至少一包含第三抗原結合位點的第一結合模組；其中抗原結合位點之至少一者結合至因子IXa且抗原結合位點之至少一者結合至因子X。在此具體實施例中，其餘的抗原結合位點（亦即，尚未指定功能者）可結合至一標靶（如磷脂絲胺酸（phosphatidylserine）、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記（platelet surface marker）），以增進促凝血活性，如凝血酶生成試驗（thrombin generation assay）之測定。
在一些具體實施例中，本文所述蛋白分子之任一者具有促凝血活性。特別較佳為彼等具有高促凝血活性的蛋白分子。
本發明亦提供編碼本發明蛋白分子的核酸。此外，本發明提供一包含本發明核酸及/或本發明蛋白分子的細胞（較佳為哺乳類動物細胞）。
本發明亦提供一種用於產生本發明蛋白分子的方法，其包含在細胞中表現本發明之蛋白分子，及純化該蛋白分子。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含本發明蛋白分子及醫藥上可接受載體及/或稀釋劑。
本發明亦提供本發明之分子或醫藥組合物，以作為藥劑。此外，本發明提供本發明之分子或醫藥組合物，用於治療及/或預防出血性疾病之方法，其中病患或動物係被投予一治療上有效量的分子。
本發明亦提供一種治療及/或預防出血性疾病的方法，其中病患或動物係經投予治療上有效量的本發明分子或醫藥組合物。此外，本發明提供本發明分子或醫藥組合物的用途，用於製造治療及/或預防出血性疾病的藥劑。
定義
「親合體（affibody）」乙詞意指一源自蛋白A之Z結構域的蛋白，且其經基因工程改造以結合至一特異性標靶（參見，Frejd & Kim, 2017. Exp Mol Med. 49（3）: e306）。
本申請案中使用的「動物」乙詞意指非人類的任何多細胞真核異營生物（heterotroph）。在一些具體實施例中，動物係選自於由貓、狗、豬、雪貂（ferrets）、兔子、沙鼠（gerbils）、倉鼠、天竺鼠、馬、大鼠、小鼠、牛、綿羊、山羊、羊駝（alpacas）、駱駝、驢、美洲駝（lamas）、犛牛（yaks）、長頸鹿、大象、狐獴（meerkats）、狐猴（lemurs）、獅子、老虎、袋鼠、無尾熊（koalas）、蝙蝠、猴子、黑猩猩、大猩猩、熊、儒艮（dugongs）、海牛（manatees）、海豹、及犀牛組成之群組。
「抗體」乙詞意指一包含至少一免疫球蛋白結構域的分子，其結合至或在免疫學上反應於一特定標靶。本詞包括整個抗體及其任何抗原結合部分或單鏈及其結合物；舉例而言，「抗體」乙詞特別地包括雙價抗體及雙價雙特異性抗體。
抗體之典型類型包含至少二個重鏈（「HC」）與二個輕鏈（「LC」），其利用雙硫鍵互相連接。
各個「重鏈」包含「重鏈可變結構域」（在此縮寫為「VH」）與「重鏈恆定結構域」（在此縮寫為「CH」）。重鏈恆定結構域典型上包含三個恆定結構域，即CH1、CH2、及CH3。
各個「輕鏈」包含「輕鏈可變結構域」（在此縮寫為「VL」）與「輕鏈恆定結構域」（「CL」）。輕鏈恆定結構域（CL）可為κ型或λ型。VH與VL結構域可進一步細分為高度可變區（regions of hypervariability），稱作互補決定區（「Complementarity Determining Regions；CDR」），並散佈著更具保守性的區域，稱作「框架區」（「FW」）。
各個VH與VL由三個CDRs與四個FWs組成，其以下列順序從胺基端至羧基端排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。此外，本發明提出VH與VL序列，以及相對應於CDR1、CDR2、及CDR3的子序列（subsequences）。
據此，本領域之技術人員應理解到，FW1、FW2、FW3、及FW4的序列係同樣公開。針對特定VH，FW1為VH之N端與H-CDR1之N端之間的子序列、FW2為H-CDR1之C端與H-CDR2之N端之間的子序列、FW3為H-CDR2之C端與H-CDR3之N端之間的子序列、及FW4為H-CDR3之C端與VH之C端之間的子序列。同樣地，針對特定VL，FW1為VL之N端與L-CDR1之N端之間的子序列、FW2為L-CDR1之C端與L-CDR2之N端之間的子序列、FW3為L-CDR2之C端與L-CDR3之N端之間的子序列、及FW4為L-CDR3之C端與VL之C端之間的子序列。
重鏈與輕鏈之可變結構域包含一與結合標靶（binding target）交互作用的區域，且此一與結合標靶交互作用之區域於此亦稱作「抗原結合位點」或「抗原結合位點」。抗體之恆定結構域可介導抗體結合至宿主組織或因子，包括免疫系統之各類細胞（如效應子細胞（effector cells））及典型補體系統之第一組分（C1q）。本發明之示例性抗體包括典型抗體，但亦可為其二價片段與變異形（variations ），如F（ab’）2 。
本文中使用的「抗體」乙詞涵蓋完整多株抗體、完整單株抗體、雙價抗體片段（如F（ab'）2 ）、多特異性抗體（如雙特異性抗體）、嵌合抗體、人源化抗體、人類抗體、及包含二個抗原結合位點之任何其他經改質的免疫球蛋白分子。
抗體可為免疫球蛋白之五個主要類別（同型）之任一者：IgA、IgD、IgE、IgG、及IgM，或其子類別（如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及IgA2），基於其重鏈恆定結構域之標識（identity），分別稱作α、δ、ε、γ、及μ。不同類別之免疫球蛋白具有不同且眾所周知的次單元結構及三維構形。抗體可裸露或結合其他分子（如治療劑或診斷劑），以形成免疫結合物（immunoconjugates）。
「抗運載蛋白（anticalin）」乙詞意指一源自脂質運載蛋白（lipocalin）的蛋白，且其經基因工程改造以結合至一特異性標靶（參見，Skerra, 2008. FEBS J. 275（11）:2677-83）。
「抗原結合片段」或「Fab」等詞意指抗體片段之重鏈與輕鏈之每一者包含一恆定結構域與一可變結構域。Fab片段可利用木瓜酶（papain）分解完整單株抗體而取得。
「抗原結合位點」乙詞意指骨架模組或結合模組之一區域，其可與所欲標靶進行非共價結合相互作用。「抗原結合位點」可為，舉例而言，包含三個互補決定區（complementary determining regions）的位點，諸如在抗體、scFv或scFab、或結合界面（如β2-醣蛋白I的磷脂質結合界面）的情況下。
「結合模組」乙詞意指結合至因子IXa、因子X、或任何其他標靶之任何物質，相較於骨架模組本身，其可增進本發明蛋白分子的促凝血活性。結合模組之非侷限實例包括抗運載蛋白、重複體（repebody）、單體（monobody）、scFv、Fab、scFab、親合體、調聚物（fynomer）、DARPin、奈米抗體（nanobody）、胜肽適體（peptide aptamer）、及核酸適體。
「雙特異性分子」乙詞意指能通過二個不同抗原結合位點結合至至少二個不同標靶的分子。本發明之雙特異性分子能結合至因子IXa及因子X。接著，「三特異性分子」為能通過三個不同抗原結合位點結合至至少三個不同標靶的分子。本發明之三特異性分子能結合至因子IXa、因子X、其他標靶，以增進促凝血活性。「多特異性分子」乙詞意指能通過二個以上不同的抗原結合位點結合二個以上不同標靶的分子。
「設計的錨蛋白重複蛋白（designed ankyrin repeat proteins）」或「DARPin」等詞意指源自錨蛋白重複（ankyrin repeat）的蛋白，其經基因工程改造以結合至特定標靶（參見，Plückthun, 2015. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 55:489-511）。
本文中使用的試劑（如抗體等治療劑）之「有效量」乙詞為足以產生有益或所需結果（如臨床結果）的量，因此，「有效量」取決於其應用的情況。舉例而言，在投予治療出血之治療劑的情況下，相較於未投予試劑之反應，該試劑之有效量為足以降低或減少出血發生的量。「有效量」乙詞可與「有效劑量」、「治療上有效量」、或「治療上有效劑量」互換使用。
「因子IX」或「FIX」等詞意指由肝臟肝細胞合成的前原酶原（pre-prozymogen）蛋白，其需要大量轉譯後修飾。前原酶原在其胺基端包含前胜肽（pre-peptide）（疏水性傳訊胜肽），其將生成的多胜肽運輸至內質網腔（lumen of the Endoplasmic Reticulum）。一旦在ER內部，此傳訊胜肽可利用傳訊胜肽酶切割。前胜肽（pro-peptide）可作為維生素K依賴性羧化酶（γ-麩胺醯基羧化酶（γ-glutamyl carboxylase））的識別元件，可將12個麩胺酸殘基修飾成γ-羧基麩胺醯基（gammacarboxyglutamyl；Gla）殘基。彼等殘基為通過Ca2+ -依賴性結合與陰離子磷脂質表面結合所需。在傳訊胜肽與前胜肽切割後，FIX以酶原（zymogen）形式呈現。FIX之酶原從而以415個胺基酸的單鏈多胜肽循環。
FIX之酶原係由FXIa或組織因子/FVIIa複合體活化。第一個切割位點在Arg 191（成熟型FIX序列中的Arg145），產生失活的FIX-α。第二個切割位點在Arg226（成熟型FIX序列中的Arg180），其移除FIX活化型胜肽的35個胺基酸，且產生催化活化分子FIXa-β。此不與FVIIIa結合的催化活化型FIXa於此亦稱作游離型FIXa。所得的雜二聚體藉由Cys178-Cys335上的雙硫鍵固定。絲胺酸蛋白酶包含His267、Asp315、及Ser411的催化三聯體。在Arg226處切割後，Val227可與Asp410形成鹽橋，此為活化型絲胺酸蛋白酶的特徵。關於因子IX之非侷限實例數據皆以登錄號P00740登錄在UniProtKB中。在一些具體實施例中，本發明蛋白分子之抗原結合位點優先結合至游離型因子IXa而非因子IX之酶原。
「因子X」或「FX」等詞意指一分子量為58.5 kDa的維生素K依賴性醣蛋白，其從肝細胞分泌至血漿中以作為酶原。最初，所產生的因子X為原前胜肽（prepropeptide）且伴隨傳訊胜肽，其包含總共488個胺基酸。
傳訊胜肽在輸入內質網的過程中由傳訊胜肽酶（signal peptidase）切割。在成熟N端鏈之N端前面11個麩胺酸殘基處發生γ羧化作用後，切除前胜肽序列。藉由在Arg182與Ser83之間的切割，進行進一步的加工步驟。此加工步驟亦伴隨導致三胜肽Arg180-Lys181-Arg182的刪除。所得之分泌的因子X酶原由139個胺基酸的N端輕鏈（M，16,200）與306個胺基酸的C端重鏈（M，42,000）組成，其經由Cys172與Cys342之間的雙硫鍵共價連接。因子X酶原之重鏈可由因子IXa切割，且隨後在活化型胜肽釋放後活化，從而產生稱作「因子Xa」或「FXa」的蛋白。有關因子X之非侷限實例之數據皆登錄在UniProtKB中，其登錄號為P00742。在一些具體實施例中，本發明蛋白分子之抗原結合位點優先結合至因子X之酶原而非因子Xa。
「調聚物（fynomer）」乙詞意指源自人類Fyn激酶之SH3結構域的蛋白，其經基因工程改造以結合至特定標靶（參見，Bertschinger et al., 2007. Protein Eng Des Sel. 20（2）:57-68）。
在本申請案中，「個體」、「病患」、或「受試者」等詞可互換使用，以指稱人體，且未旨在以任何方式侷限。「個體」、「病患」、或「受試者」可為任何年齡、性別、及身體狀況。
「連接子」乙詞意指在二個化學實體之間形成共價鍵之至少一原子。「連接子」乙詞可指在骨架模組與另一方共價連接結合模組之間形成共價鍵之至少一原子。若骨架模組與結合模組僅通過胜肽鍵連接，則連接子稱作「胜肽連接子」。否則，連接子稱作「化學連接子」。此外，「撓性胜肽連接子」大多數包含小型之非極性或極性胺基酸，而「剛性胜肽連接子」包含α-螺旋形成序列及/或富含脯胺酸殘基（Chen et al., 2013. Adv Drug Deliv Rev. 65（10）:1357-1369）。
「單體」乙詞意指源自纖網蛋白第III型（fibronectin type III）結構域的蛋白，其經基因工程改造以結合至特定標靶（參見，Koide et al., 2013. J Mol Biol. 415（2）:393-405）。
「奈米抗體」乙詞意指一包含重鏈抗體之可溶性單一抗原結合V結構域的蛋白，較佳為駱駝重鏈抗體（參見，Bannas et al., 2017. Front Immunol. 8:1603）。
「核酸適體」乙詞意指短的合成單鏈寡核苷酸，其特異性結合至各個分子標靶（參見，Ni et al., 2011. Curr Med Chem. 18（27）:4206-4214）。
「胜肽適體」乙詞意指短的5-20個胺基酸殘基序列，其可結合至特定標靶。胜肽適體係典型上插入穩定之蛋白骨架的圈環區（loop region）之內（參見，Reverdatto et al., 2015. Curr Top Med Chem. 15（12）:1082-101）。
「磷脂絲胺酸」乙詞可指磷脂醯基-L-絲胺酸與磷脂醯基-D-絲胺酸兩者。在一些具體實施例中，「磷脂絲胺酸」乙詞意指磷脂醯基-L-絲胺酸。
「磷脂絲胺酸結合蛋白」乙詞意指能結合至磷脂絲胺酸的蛋白。非侷限實例包括Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素（lactadherin）、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶（prothrombin））、因子V、因子VII、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、及β2-醣蛋白I（Apo-H）。
「血小板表面標記」乙詞意指可在血小板表面上找到的分子，其可用於將本發明蛋白分子共定位到血小板表面上。非侷限實例包括CD61、GPIb-IX、CD69、CD40、膠原蛋白、伴護蛋白（chaperone）HSP47、麻黃素B1（ephrin B1）、硫醇異構酶蛋白ERP5、造血前驅細胞激酶1交互作用蛋白55（Hematopoietic progenitor kinase 1-interacting protein of 55；HIP-55）、醣蛋白VI、血小板醣蛋白1b、血小板衍生性生長因子受體、血小板內皮凝集受體I、CD36、CD31、MARKS、多聚體蛋白（multimerin）、整合素αIIb/β3、表現在骨髓細胞（TREM）上的驅動受體，如轉錄子-1蛋白（TLT-1）、整合素連接激酶（ILK）、斑聯蛋白（zyxin）、膠原蛋白、P-選擇素（P-selectin）、因子XIII、P-選擇素醣蛋白配體-1、整合素α6β1、凝血栓蛋白（thrombospondin）、馮威里氏因子（von Willebrand factor）、G6B、CD42b、突觸融合蛋白結合蛋白2（syntaxin binding protein 2）、磷脂醯基乙醇胺、纖維蛋白原/纖維蛋白、纖維蛋白（filamin）、胃抑素（stomatin）、神經脂質（sphingolipid）、CD63、CD41、CD49b、CD107a、CD107b、CD42c、CD42、CD109、CD62P、CD154、PECAM-1、及ERPS。
本申請案中使用的「預防」乙詞意指一套用於預防疾病及/或症狀發作及/或發展的衛生、藥理、外科手術、及/或物理方法。「預防」乙詞涵蓋預防方法，係因彼等方法用於維持動物或個體的健康。
本文中使用的「促凝血活性」乙詞係用於定義一可促進凝血的活性，例如，藉由促進任何有助於凝血之過程或反應（或藉由抑制任何降低凝血之過程或反應）。據此，「促凝血活性」乙詞涵蓋（但不侷限於）下列活性之一或多者： -       類因子VIIIa活性，亦即，與活化型因子VIII（因子VIIIa）之活性相對應的活性。 -       增進因子IXa介導之因子X活化，如基於FIXa介導之FX活化的醯胺分解（amidolytic）（顯色或螢光）試驗之測定。本試驗通過切割FXa特異性胜肽受質而測定FXa。受質生成，其產生可利用吸光度進行光度測定的顏色。 -       縮短凝血次數，如利用凝血試驗（clotting assays）（如活化的部分凝血質時間（Activated partial thromboplastin time；APTT）測定固有活性及常見凝血途徑。將血漿與含有接觸活化劑（如土耳其鞣酸（ellagic acid）或高嶺土（kaolin））及磷脂質之APTT試劑預處理。添加氯化鈣以促進纖維蛋白凝塊（clot）形成。可能的讀數為凝血時間或凝塊波形。 -       增進凝血酶生成，如凝血酶生成試驗（如校正式自動化血栓造影（Calibrated Automated Thrombography；CAT））之測定。血栓圖（thrombogram）描述凝血酶在凝血血漿中之濃度，因此為止血系統（hemostatic system）的功能測試。本試驗係基於螢光測定，其係隨時間推移利用凝血酶切割螢光受質Z‑G‑G‑R‑AMC而產生。 -       增進血塊形成的整體黏彈特性（visco-elastic properties），如在全血中之剪切應力下，利用黏彈性止血法（如ROTEM（旋轉血栓彈性描記法（Rotational thromboelastometry））測定。在儀器中，滾珠軸承銷（ball-bearing pin）在固定杯（stationary cup）中旋轉。在凝集過程中，樣本中的纖維蛋白絲會在杯壁與銷之間形成，且絲的強度會影響銷的運動，並檢測此現象。 -       利用諸如t-TAS（總血栓形成分析系統（Total Thrombus-formation Analysis System））等流動室系統測定，改進流動條件下的血栓形成（thrombosis）。此試驗用於定量評估可變流量下的血栓形成過程。血液流經微晶片的分析路徑，血小板黏附並凝集在塗覆膠原蛋白的毛細管表面，最終導致血流壓力增加。 -       縮短全血關閉時間（whole blood closure time；WBCT），如血小板功能分析儀，其係基於血小板活化後馮威里氏因子（VWF）介導之血小板對膠原蛋白的黏附。產生高剪切應力（shear stress），導致血小板黏附與血小板凝集。測定血流從開始到結束的時間。 -       利用諸如凝集儀（aggregometer），測定血小板富集血漿（PRP）中的人類血小板凝集。凝集儀依據光透射之基本原理運作。隨著血小板凝集，樣本的透光率（light transmission）增加。
上述所有方法皆可應用在與人類血液相關之標本，以及不同動物物種之標本。因此，其為可用於離體分析樣本之促凝活性的分析工具，以諸如在動物研究中評估抗體的藥效動力學特性。 -       本發明提供用於鑑定蛋白分子具有有利特徵類型之治療藥物的體內方法與手段，以及用於篩選最合格之蛋白分子及/或治療性蛋白分子之臨床前測試的體內方法。 -       一般而言，動物模型為研究與開發人類藥物之過程中使用的活體動物，或目的在於更好地瞭解人類疾病的動物模型。所選擇之動物模型通常概括人類病理生理學，以及所投予候選藥物之藥理學、誇大藥理學（exaggerated pharmacology）、安全性、及/或毒性，而治療功效則反映在對普遍疾病狀態之改進或針對具有人為疾病之健康動物時所引起的傷害（創傷）。候選藥物可通過口服或非經口途徑（包括靜脈與皮下途徑）以預防或緊急方式投予。動物模型經證實在人類血友病治療（包括模擬因子活性的因子替代療法或雙特異性抗體）的選擇與開發中具有價值及可預測性。 -       動物模型係指任何歸類為，包括但不侷限於，囓齒類動物，如小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔、狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、非人類靈長類動物。彼等包括實驗室動物、家畜、及農場動物，以及獸醫病患。動物模型使用藥理學耗竭或抑制促凝血因子（因子VIII），並以特定疾病相關基因及其編碼蛋白之功能喪失或獲得，確認了天然存在或基因工程改造的結果。舉例而言，動物模型概括人類止血調節組分（因子VIII、因子IX、VWF、APC）之功能喪失原因。在一些情況下，囓齒類動物為小鼠或大鼠、天竺鼠、或倉鼠。非人類模型可為兔子，或體型更大的動物，如狗、綿羊、或非人類靈長類動物，如食蟹獼猴（Cynomolgus macaque）或恆河獼猴（Rhesus macaque）。在進一步之動物模型設定中，好比非人類靈長類動物，測試品顯示在人體中密切反映出藥物動力學行為、特定標靶吸引度、及藥理學特徵。 -       具體而言，本發明之動物模型可監測與動脈或靜脈血栓形成、微血管血栓形成、血栓溶解（thrombolysis）相關的終點。舉例而言，血栓形成/血栓溶解模型應用氯化鐵、光化學物質、靜脈鬱積（venous stasis）、機械性創傷、全身性腎上腺素-膠原蛋白輸注、雷射損傷、肺栓塞或微栓塞的自發性溶解、及藥理性動脈血栓溶解。研究的血管部位包括但不侷限於，頸動脈或股動脈（carotid or femoral arteries）、頸靜脈或股靜脈（jugular or femoral veins）、腸繫膜或精索外動脈（mesenteric or cremasteric arterioles）、小耳靜脈與動脈、肌肉動脈、尾靜脈、指甲血管。 -       具體而言，本發明之動物模型可監測與自發性或誘發性出血發作（bleeding episodes）之後的止血及其藥理學變化相關的終點。評估可包括彼等通過自發性出血而收集者，以及在受到尾靜脈切斷（tail vein transection）、尾尖出血（tail-tip bleeding）、靜脈穿刺出血（vein puncture bleeding）、提睾肌損傷模型（cremaster injury model）、氯化鐵頸動脈阻塞、指甲夾傷（nail-clipping）、皮膚損傷（手術切口（Surgicut））、肌內損傷、皮下剝脫（subutaneous exfoliation）、或引發關節機械性創傷的損傷模型，或在受到自發性關節血腫（hemarthrosis）影響者。疾病改進的監測包括但不侷限於，評估臨床體徵、跛行發作（limping episodes）的發病率與頻率、出血時間、出血量、瘀傷部位的測量、關節腫脹、血液中血紅素濃度、尿血紅素等終點；離體凝血分析（ROTEM）、APTT、因子活性與凝血酶產生；存活率、再出血率、以及關節組織的病理測定與變化，以及在其他組織中的內出血。 -       鼠科血栓形成模型。Day SM, Reeve JL, Myers DD, Fay WP. Thromb Haemost. 2004；92（3）:486-94。 -       血友病之動物模型。Denise E. Sabatino, Timothy C. Nichols, Elizabeth Merricks, Dwight A. Bellinger, Roland W. Herzog, and Paul E. Monahan Prog Mol Biol Transl Sci. 2012；105: 151–209。
「重複體（repebody）」乙詞意指從富含白胺酸之重複模組衍生的蛋白，並經基因工程改造以結合至特定標靶（參見，Lee et al., 2012. PNAS. 109（9）: 3299-3304）。
「骨架模組」乙詞意指一包含二個抗原結合位點的蛋白實體，且可作為一或多個結合模組的支撐結構。結合模組可通過連接子連接至骨架模組及/或結合模組可併入存在於骨架模組中之任何圈環區。
「單鏈抗原結合片段」或「scFab」等詞意指一融合蛋白，其包含將抗體輕鏈的一個可變與一個恆定結構域連接至抗體重鏈的一個可變與一個恆定結構域，其中重鏈與輕鏈通過一短胜肽連接在一起。
「單鏈可變片段」或「scFv」等詞意指一融合蛋白，其包含以胜肽連接子將抗體之重鏈與輕鏈之可變結構域彼此連接在一起。在一些具體實施例中，scFv為經二硫化物穩定之Fv（dsFv）。以雙硫鍵穩定scFvs的方法揭示於Reiter et al., 1996. Nat Biotechnol. 14（10）:1239-45。
本申請案中使用的「治療」與「療法」等詞意指一套旨在治癒及/或減輕疾病及/或症狀之衛生、藥理、外科手術、及/或物理方法，其目的在補救健康問題。「治療」與「療法」等詞包括預防性與治性療方法，係因兩者均針對維持及/或重建個體或動物的健康。無論症狀、疾病、及殘疾之來源為何，在本申請案全文中，應將投予適當藥劑以減輕及/或治癒健康問題理解為一治療或療法形式。
本申請案中使用的「價（valent）」乙詞表示蛋白分子中存在指定數量的抗原結合位點。因此，「雙價」、「四價」、及「六價」等詞表示蛋白分子中分別存在二個抗原結合位點、四個抗原結合位點、及六個抗原結合位點。本文中揭示的雙特異性蛋白分子係至少「三價」，且可為，舉例而言，「四價」或「六價」。「多價」乙詞意指一分子具有至少三個抗原結合位點。本發明之蛋白分子
本發明提供一蛋白分子，其包含：（i）一包含第一抗原結合位點與第二抗原結合位點的骨架模組，以及（ii）至少一包含第三抗原結合位點的第一結合模組；其中抗原結合位點之至少一者結合至因子IXa且抗原結合位點之至少一者結合至因子X。在此具體實施例中，其餘的抗原結合位點可結合至一標靶（如磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記），以增進促凝血活性（如凝血酶生成試驗之測定）及/或結合至與損傷部位相關聯之標靶（如馮威里氏因子（von Willebrand factor；VWF）、纖維蛋白原（fibrinogen）、或膠原蛋白），以便將蛋白分子定位在損傷部位。
在一些具體實施例中，第一結合模組係通過連接子連接至骨架模組，或第一結合模組係插入骨架模組之圈環區之內。在一些具體實施例中，第一結合模組係通過連接子連接至骨架模組。
如圖1-4所顯見，所有的結合模組可通過一或多個連接子連接至骨架模組。結合模組可為串接，如圖4B與4E。在一些具體實施例中，各個單獨之結合模組係通過連接子分別連接至骨架模組，舉例而言，如圖1-3，以及圖4A、C、D、及F。骨架模組
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段。在一些具體實施例中，骨架模組為IgD、IgE、或IgG。在一些具體實施例中，骨架模組為IgG或其二價片段。在一些具體實施例中，骨架模組為IgG。在一些具體實施例中，IgG意指IgG1。
在一些具體實施例中，骨架模組為IgG，其包含一減少FcγR與C1q結合的突變（參見，Wang et al., 2018. Protein Cell. 9（1）: 63–73）。在一些具體實施例中，突變為LALA突變（參見，Xu et al., 2000. Cell Immunol. 200（1）: 16-26）。
在一些具體實施例中，骨架模組為IgG，其包含改進人類系統中FcRn介導之運輸的突變。
在一些具體實施例中，骨架模組為IgG，其包含可在人體中增加血清半衰期的突變（參見，如WO 02/060919 A2揭示之突變）。在一些具體實施例中，突變為YTE突變（參見，Robbie et al., 2013. Antimicrob Agents Chemother. 57（12）:6147-53）。
在一些具體實施例中，骨架模組為包含進一步之抗原結合位點的IgG。在一些具體實施例中，進一步之抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。進一步之抗原結合位點可利用改質圈環區而導入CH3結構域（參見，Wozniak-Knopp et al., 2010. Protein Eng Des Sel. 23（4）:289-97）。
本發明之骨架模組可分成二個群組： 1）               骨架模組為雙特異性且結合至因子IXa及因子X；或者 2）               骨架模組為單特異性且結合至因子IXa或因子X。
因此，在一些具體實施例中，第一抗原結合位點結合至因子IXa，且第二抗原結合位點結合至因子X。在另一具體實施例中，第一抗原結合位點與第二抗原結合位點之每一者結合至因子IXa，或第一抗原結合位點與第二抗原結合位點之每一者結合至因子X。骨架模組 – 雙特異性
雙特異性骨架模組可諸如通過二個單特異性抗體的化學交聯（chemical crosslinking）取得，骨架模組可為本文中揭示之四體瘤（quadroma）或任一重組型雙特異性抗體。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含二個具有相同HCDRs的重鏈。在一些具體實施例中，骨架模組包含二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為GFTFSSYA（SEQ ID NO: 1）、HCDR2為ISGSGGST（SEQ ID NO: 2）、及HCDR3為AKSYGAFDY（SEQ ID NO: 3）。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含二個具有相同VH結構域的重鏈。在一些具體實施例中，骨架模組包含二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4。 SEQ ID NO: 4： EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSS
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含二個相同的重鏈。在一些具體實施例中，骨架模組包含二個包含SEQ ID NO: 5的相同重鏈。 SEQ ID NO: 5： EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
在一些具體實施例中，骨架模組包含二個包含SEQ ID NO: 405的相同重鏈。 SEQ ID NO: 405： EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLY IT RE PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（YTE突變係經重點提示）
在一些具體實施例中，骨架模組包含二個輕鏈。在一具體實施例中，一個輕鏈可變結構域係融合至κ恆定結構域，且其他可變輕鏈結構域係融合至λ恆定結構域。此容許純化包含二個抗原結合位點的骨架模組，其中一個抗原結合位點結合至一個標靶，且其他則結合至另一者。
在一些具體實施例中，λ恆定結構域包含SEQ ID NO: 165，且κ恆定結構域包含SEQ ID NO: 166。 SEQ ID NO: 165： GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 166： RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含二個相同的重鏈及二個輕鏈，其中一個輕鏈可變結構域係融合至κ恆定結構域且其他可變輕鏈結構域係融合至λ恆定結構域（稱作「κλ抗體」）。在此具體實施例中，骨架模組包含二個抗原結合位點，其中一個抗原結合位點結合至因子IXa且其他抗原結合位點結合至因子X。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）     一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LDR3；以及 （iii）   一個輕鏈，其包含表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；
在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83、W88、W128、W127、或W162之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V198、V202、V204、V212、或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）與（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3分別為表1與表2a揭示之W88與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127與V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149與W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W126與V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83與V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88與V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W83與V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）     一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LDR3；以及 （iii）   一個輕鏈，其包含表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；
在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W206、W83、W88、W128、W127、或W162之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V245、V43、V90、V141、V149、V198、V202、V204、V212、V305、V320、或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）與（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3分別為表1與表2b揭示之W88與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W206與V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127與V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149與W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W126與V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83與V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88與V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W83與V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）     一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LDR3；以及 （iii）   一個輕鏈，其包含表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；
在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W122之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W133之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W159之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W189之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W207之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W140之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）     一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LDR3；以及 （iii）   一個輕鏈，其包含表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；
在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W122之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W133之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W159之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W189之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W207之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W140之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V245、V320、V305、V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V320, V305, V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43、V320, V305, V90、V141、V149、V155、V198、V202、V204、V212、V217、V241、V242、V245、V249、V281、V282、V283、V284、V285、V286、V287、V288、V289、V290、V296、或V196之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）   一個輕鏈，其包含表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（ii）與（iii）之VL分別為表3與表4a揭示之W88與V198之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）   一個輕鏈，其包含表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W206之VL、W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V43之VL、V245之VL、V305之VL、V320之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（ii）與（iii）之VL分別為表3與表4b揭示之W206與V245之VL、W88與V198之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）   一個輕鏈，其包含表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W83之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W88之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W122之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W127之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W128之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W133之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W159之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W162之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W189之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W198之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W204之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W206之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W207之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W140之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W196之VL，且（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）   一個輕鏈，其包含表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W83之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W88之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W122之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W127之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W128之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W133之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W159之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W162之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W189之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W198之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W204之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W206之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W207之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W140之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W196之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。在一些具體實施例中，（ii）之VL為表3揭示之W206之VL，且（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V155之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、V217之VL、V241之VL、V242之VL、V245之VL、V249之VL、V281之VL、V282之VL、V283之VL、V284之VL、V285之VL、V286之VL、V287之VL、V288之VL、V289之VL、V290之VL、V296之VL、或V196之VL。骨架模組 – 單特異性
單特異性骨架模組可包含二個相同的輕鏈及二個相同的重鏈。這使得單一對稱分子實體的表現可從培養基中進行親和性純化，諸如使用單株抗體。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W162之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W162之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V320之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V305之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V155之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL,或表4a揭示之因子IXa結合輕鏈。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或二個輕鏈之每一者之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL為表3揭示之W206之VL、W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或二個輕鏈之每一者之VL為表4b揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V320之VL、V305之VL、V155之VL、V245之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。表 1 ：因子 X 結合輕鏈之 LCDRs
識別碼 LCDR1 LCDR2 LCDR3
W83 SSNILTNKN （SEQ ID NO: 9） AIS （SEQ ID NO: 10） QSYDTSGHTLTAV （SEQ ID NO: 11）
W88 QSVTTGY （SEQ ID NO: 12） EAS （SEQ ID NO: 13） QQVTRRSPWT （SEQ ID NO: 14）
W122 SSNILTHRN （SEQ ID NO: 15） GVS （SEQ ID NO: 16） QSYDTSVKPMSAV （SEQ ID NO: 17）
W127 SGSINNYY （SEQ ID NO: 18） NHN （SEQ ID NO: 19） QSWTWSGEKV （SEQ ID NO: 20）
W128 SGSINNYY （SEQ ID NO: 21） NHN （SEQ ID NO: 22） QSWTWEGLKV （SEQ ID NO: 23）
W133 SGSINNYY （SEQ ID NO: 24） NHN （SEQ ID NO: 25） QSWSWEGLRV （SEQ ID NO: 26）
W159 SGSINNYY （SEQ ID NO: 27） NHN （SEQ ID NO: 28） QSWTWEGAKV （SEQ ID NO: 29）
W162 SGSINNYY （SEQ ID NO: 30） NHN （SEQ ID NO: 31） QSWTWEGDLV （SEQ ID NO: 32）
W189 QQVTTGY （SEQ ID NO: 33） DIS （SEQ ID NO: 34） QQVTRRSPWT （SEQ ID NO: 35）
W198 SGSISNYY   （SEQ ID NO: 36） NHN （SEQ ID NO: 37） QSWTWEGLKV （SEQ ID NO: 38）
W204 SSNILTNKN （SEQ ID NO: 39） AIS （SEQ ID NO: 40） QSYDTGRRALTAV （SEQ ID NO: 41）
W206 SGSISNYY （SEQ ID NO: 42） NHN （SEQ ID NO: 43） QSWTWSGEKV （SEQ ID NO: 44）
W207 HGSINNYY （SEQ ID NO: 45） NHN （SEQ ID NO: 46） QSWTWEGDLV （SEQ ID NO: 47）
W140 SSNILTNRN （SEQ ID NO: 364） GVS （SEQ ID NO: 365） QSYDIGGRSMTAV （SEQ ID NO: 366）
W196 SSNILTNRN （SEQ ID NO: 367） GVS （SEQ ID NO: 368） QSYDTGRRALTAV （SEQ ID NO: 369）
表 2a ：因子 IXa 結合輕鏈之 LCDRs
識別碼 LCDR1 LCDR2 LCDR3
V43 QAIHAH （SEQ ID NO: 48） DNS （SEQ ID NO: 49） QQATFGHALST （SEQ ID NO: 50）
V90 NIEAES （SEQ ID NO: 51） TDS （SEQ ID NO: 52） QVRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 53）
V141 QKVDDDE （SEQ ID NO: 54） RAS （SEQ ID NO: 55） QQYNDPDLGYEDYT （SEQ ID NO: 56）
V149 QEVDDNE （SEQ ID NO: 60） GAS （SEQ ID NO: 61） QQYNDPDLGYDGYT（SEQ ID NO: 62）
V155 QSVDDDE （SEQ ID NO: 63） GAS （SEQ ID NO: 64） QQYNDPDLGYEGYT （SEQ ID NO: 65）
V198 NIEAET （SEQ ID NO: 66） SDS （SEQ ID NO: 67） QVRDSVDDLYV （SEQ ID NO: 68）
V202 NIEAET （SEQ ID NO: 69） RDS （SEQ ID NO: 70） QVRDSVDDKAV （SEQ ID NO: 71）
V204 NIEAET （SEQ ID NO: 72） NDN （SEQ ID NO: 73） QVRDSNDDLIV （SEQ ID NO: 74）
V212 NIEAES （SEQ ID NO: 75） NDN （SEQ ID NO: 76） QVLLNDADEGV （SEQ ID NO: 77）
V217 QNIVNH （SEQ ID NO: 78） DNS （SEQ ID NO: 79） QQAPYGHALST （SEQ ID NO: 80）
V241 NIEAET （SEQ ID NO: 81） NDS （SEQ ID NO: 82） QVRDSNDDKIV （SEQ ID NO: 83）
V242 NIEAET （SEQ ID NO: 84） NDN （SEQ ID NO: 85） QVRDSVDDLAV （SEQ ID NO: 86）
V245 NIEAET （SEQ ID NO: 87） SDS （SEQ ID NO: 88） QVRDSIDDLIV （SEQ ID NO: 89）
V249 NIEAET （SEQ ID NO: 90） SDS （SEQ ID NO: 91） GVLLNDADEGF （SEQ ID NO: 92）
V281 NIEAET （SEQ ID NO: 93） SDN （SEQ ID NO: 94） TLRDSNDDRAL   （SEQ ID NO: 95）
V282 NIEAET （SEQ ID NO: 96） SDS （SEQ ID NO: 97） GVRDSNDDRAL （SEQ ID NO: 98）
V283 NIEAET （SEQ ID NO: 99） RDN （SEQ ID NO: 100） SIRDSNDDRAL （SEQ ID NO: 101）
V284 NIEAET （SEQ ID NO: 102） SDN （SEQ ID NO: 103） QVRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 104）
V285 NIEAET （SEQ ID NO: 105） SDS （SEQ ID NO: 106） QVRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 107）
V286 NIEAET （SEQ ID NO: 108） NDN （SEQ ID NO: 109） GTRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 110）
V287 NIEAET （SEQ ID NO: 111） SDN （SEQ ID NO: 112） GLRDSNDDRAM （SEQ ID NO: 113）
V288 NIEAET （SEQ ID NO: 114） SDS （SEQ ID NO: 115） QVRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 116）
V289 NIEAET （SEQ ID NO: 117） SDS （SEQ ID NO: 118） SVRDSNDDRAM （SEQ ID NO: 119）
V290 NIEAET （SEQ ID NO: 120） SDN （SEQ ID NO: 121） TVRDSNDDRAS （SEQ ID NO: 122）
V296 NIEAET （SEQ ID NO: 123） NDN （SEQ ID NO: 124） YLRDSVDDLAR （SEQ ID NO: 125）
V196 NIEAET （SEQ ID NO: 287） RDS （SEQ ID NO: 288） QVRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 289）
表 2b ：因子 IXa 結合輕鏈之 LCDRs
識別碼 LCDR1 LCDR2 LCDR3
V43 QAIHAH （SEQ ID NO: 48） DNS （SEQ ID NO: 49） QQATFGHALST （SEQ ID NO: 50）
V90 NIEAES （SEQ ID NO: 51） TDS （SEQ ID NO: 52） QVRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 53）
V141 QKVDDDE （SEQ ID NO: 54） RAS （SEQ ID NO: 55） QQYNDPDLGYEDYT （SEQ ID NO: 56）
V149 QEVDDNE （SEQ ID NO: 60） GAS （SEQ ID NO: 61） QQYNDPDLGYDGYT（SEQ ID NO: 62）
V155 QSVDDDE （SEQ ID NO: 63） GAS （SEQ ID NO: 64） QQYNDPDLGYEGYT （SEQ ID NO: 65）
V198 NIEAET （SEQ ID NO: 66） SDS （SEQ ID NO: 67） QVRDSVDDLYV （SEQ ID NO: 68）
V202 NIEAET （SEQ ID NO: 69） RDS （SEQ ID NO: 70） QVRDSVDDKAV （SEQ ID NO: 71）
V204 NIEAET （SEQ ID NO: 72） NDN （SEQ ID NO: 73） QVRDSNDDLIV （SEQ ID NO: 74）
V212 NIEAES （SEQ ID NO: 75） NDN （SEQ ID NO: 76） QVLLNDADEGV （SEQ ID NO: 77）
V217 QNIVNH （SEQ ID NO: 78） DNS （SEQ ID NO: 79） QQAPYGHALST （SEQ ID NO: 80）
V241 NIEAET （SEQ ID NO: 81） NDS （SEQ ID NO: 82） QVRDSNDDKIV （SEQ ID NO: 83）
V242 NIEAET （SEQ ID NO: 84） NDN （SEQ ID NO: 85） QVRDSVDDLAV （SEQ ID NO: 86）
V245 NIEAET （SEQ ID NO: 87） SDS （SEQ ID NO: 88） QVRDSIDDLIV （SEQ ID NO: 89）
V249 NIEAET （SEQ ID NO: 90） SDS （SEQ ID NO: 91） GVLLNDADEGF （SEQ ID NO: 92）
V281 NIEAET （SEQ ID NO: 93） SDN （SEQ ID NO: 94） TLRDSNDDRAL   （SEQ ID NO: 95）
V282 NIEAET （SEQ ID NO: 96） SDS （SEQ ID NO: 97） GVRDSNDDRAL （SEQ ID NO: 98）
V283 NIEAET （SEQ ID NO: 99） RDN （SEQ ID NO: 100） SIRDSNDDRAL （SEQ ID NO: 101）
V284 NIEAET （SEQ ID NO: 102） SDN （SEQ ID NO: 103） QVRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 104）
V285 NIEAET （SEQ ID NO: 105） SDS （SEQ ID NO: 106） QVRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 107）
V286 NIEAET （SEQ ID NO: 108） NDN （SEQ ID NO: 109） GTRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 110）
V287 NIEAET （SEQ ID NO: 111） SDN （SEQ ID NO: 112） GLRDSNDDRAM （SEQ ID NO: 113）
V288 NIEAET （SEQ ID NO: 114） SDS （SEQ ID NO: 115） QVRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 116）
V289 NIEAET （SEQ ID NO: 117） SDS （SEQ ID NO: 118） SVRDSNDDRAM （SEQ ID NO: 119）
V290 NIEAET （SEQ ID NO: 120） SDN （SEQ ID NO: 121） TVRDSNDDRAS （SEQ ID NO: 122）
V296 NIEAET （SEQ ID NO: 123） NDN （SEQ ID NO: 124） YLRDSVDDLAR （SEQ ID NO: 125）
V196 NIEAET （SEQ ID NO: 287） RDS （SEQ ID NO: 288） QVRDSNDDRAV （SEQ ID NO: 289）
V305 NIEAES （SEQ ID NO: 370） NDN （SEQ ID NO: 371） QVLLNDADQGV （SEQ ID NO: 372）
V320 NIEAES （SEQ ID NO: 373） NDN （SEQ ID NO: 374） QVLLNDADQGV （SEQ ID NO: 375）
表 3 ：因子 X 結合輕鏈之 VL
識別碼 VL
W83 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNILTNKNVHWYQQLPGTAPKLLIYAISRRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSGHTLTAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 126）
W88 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTTGYLAWYQQKPGQAPRLLIYEASKRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVTRRSPWTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 127）
W122 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNILTHRNVHWYQQLPGTAPKLLIYGVSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSVKPMSAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 128）
W127 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 129）
W128 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 130）
W133 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWSWEGLRVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 131）
W159 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGAKVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 132）
W162 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGDLVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 133）
W189 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQQVTTGYLAWYQQKPGQAPRLLIYDISRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVTRRSPWTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 134）
W198 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSISNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 135）
W204 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNILTNKNVHWYQQLPGTAPKLLIYAISRRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTGRRALTAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 136）
W206 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSISNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 137）
W207 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRPHGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGDLVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 138）
W140 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNILTNRNVHWYQQLPGTAPKLLIYGVSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDIGGRSMTAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 290）
W196 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNILTNRNVHWYQQLPGTAPKLLIYGVSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTGRRALTAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 291）
表 4a ：因子 IXa 結合輕鏈之 VL
識別碼 VL
V43 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQAIHAHLRWYQQKPGKAPKLLIYDNSPLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQATFGHALSTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 139）
V90 SYVLTQPPSVSVAPGKTAILTCGGDNIEAESVHWYQQKPDQAPLLVVYTDSYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTITRVEVGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 140）
V141 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQKVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEDYTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 141）
V149 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQEVDDNELAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYDGYTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 143）
V155 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEGYTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 144）
V198 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLYVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 145）
V202 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDKAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 146）
V204 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDLIVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 147）
V212 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 148）
V217 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNIVNHLRWYQQKPGKAPKLLIYDNSPLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQAPYGHALSTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 149）
V241 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDSNTPTGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDKIVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 150）
V242 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNIWETGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLAVFGGGTKLTVL （SEQ ID NO: 151）
V245 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCRGDNIEAETVGWYQQKPGQAPVLVIYSDSVRMSGIPERFSGSNSWNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSIDDLIVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 152）
V249 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCGVLLNDADEGFFGGGTKLTVLG（SEQ ID NO: 153）
V281 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCTLRDSNDDRALFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 154）
V282 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCGVRDSNDDRALFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 155）
V283 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDNIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCSIRDSNDDRALFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 156）
V284 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDNNRFVGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 157）
V285 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSILTVGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 158）
V286 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCGTRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 159）
V287 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCGLRDSNDDRAMFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 160）
V288 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSNRNLGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 161）
V289 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCSVRDSNDDRAMFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 162）
V290 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCTVRDSNDDRASFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 163）
V296 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCYLRDSVDDLARFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 164）
V196 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 292）
表 4b ：因子 IXa 結合輕鏈之 VL
識別碼 VL
V43 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQAIHAHLRWYQQKPGKAPKLLIYDNSPLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQATFGHALSTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 139）
V90 SYVLTQPPSVSVAPGKTAILTCGGDNIEAESVHWYQQKPDQAPLLVVYTDSYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTITRVEVGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 140）
V141 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQKVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEDYTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 141）
V149 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQEVDDNELAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYDGYTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 143）
V155 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEGYTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 144）
V198 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLYVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 145）
V202 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDKAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 146）
V204 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDLIVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 147）
V212 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 148）
V217 DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNIVNHLRWYQQKPGKAPKLLIYDNSPLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQAPYGHALSTFGQGTKVEIK（SEQ ID NO: 149）
V241 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDSNTPTGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDKIVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 150）
V242 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNIWETGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLAVFGGGTKLTVL （SEQ ID NO: 151）
V245 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCRGDNIEAETVGWYQQKPGQAPVLVIYSDSVRMSGIPERFSGSNSWNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSIDDLIVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 152）
V249 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCGVLLNDADEGFFGGGTKLTVLG（SEQ ID NO: 153）
V281 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCTLRDSNDDRALFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 154）
V282 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCGVRDSNDDRALFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 155）
V283 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDNIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCSIRDSNDDRALFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 156）
V284 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDNNRFVGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 157）
V285 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSILTVGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 158）
V286 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCGTRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 159）
V287 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCGLRDSNDDRAMFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 160）
V288 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSNRNLGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 161）
V289 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCSVRDSNDDRAMFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 162）
V290 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCTVRDSNDDRASFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 163）
V296 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCYLRDSVDDLARFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 164）
V196 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 292）
V305 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADQGVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 376）
V320 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCRGDNIEAETVGWYQQKPGQAPVLVIYSDSVRMSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSIDDLIVFGGGTKLTVL（SEQ ID NO: 377）
在一些具體實施例中，骨架模組為抗體或其二價片段，其包含改質之絞鏈結構域，其中一連接子係插入抗體之CH1與CH2結構域之間。在一些具體實施例中，骨架模組包含二個相同的重鏈，其包含SEQ ID NO: 5，其中一連接子係插入SEQ ID NO: 5之殘基C219與D220之間。在一些具體實施例中，骨架模組包含二個相同的重鏈，其包含SEQ ID NO: 5，其中一撓性連接子係插入SEQ ID NO: 5之殘基C219與D220之間。
在一些具體實施例中，骨架模組包含二個相同的重鏈，其包含SEQ ID NO: 5，其中1、2、3、或4個重複的GGGGS（SEQ ID NO: 6）或GSAGSAAGSGEF（SEQ ID NO: 7）係插入SEQ ID NO: 5之殘基C219與D220之間。在一些具體實施例中，骨架模組包含二個相同的重鏈，其包含SEQ ID NO: 5，其中GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO: 8）或GSAGSAAGSGEF（SEQ ID NO: 7）係插入SEQ ID NO: 5之殘基C219與D220之間。連接子
在一些具體實施例中，第一個及選擇性地任何其他結合模組係連接至骨架模組。可用任何連接子將一或多個結合模組連接至骨架模組。本領域技術人員理解到可使用許多不同的連接子。
在一些具體實施例中，連接子為化學連接子或胜肽連接子。在一些具體實施例中，連接子為胜肽連接子。
設計適用之胜肽連接子的方法係本領域中已知（Chen et al., 2013. Adv Drug Deliv Rev. 65（10）:1357-1369）。具體而言，胜肽連接子可分為撓性或剛性，取決於連接子的序列與結構。在一些具體實施例中，連接子之至少一者或全部係或皆為撓性胜肽連接子。依據本發明之發現，在凝血酶生成試驗中，相較於更剛性之連接子，撓性連接子具有優勢。
在一些具體實施例中，連接子係可切割。舉例而言，連接子可包含雙硫鍵或蛋白酶切割位點。在一些具體實施例中，連接子包含凝血酶或因子Xa切割位點。
在一些具體實施例中，連接子係選自於表5。在一些具體實施例中，連接子為一選自於表5之撓性連接子。表 5 ：連接子序列
連接子 類型 SEQ ID NO 序列
撓性 167 GGGGS
撓性 168 GGG
撓性 169 GGGGG
撓性 170 GGGGSGGGGS
撓性 171 GGGGSGGGGSGGGGS
撓性 8 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
撓性 7 GSAGSAAGSGEF
剛性 172 AEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKA
剛性 173 GGGAEAAAKEAAAKEAAAKALEAEAAAKEAAAKEAAAKA
剛性 174 EAAAKEAAAKEAAAK
剛性 175 GGGEAAAKEAAAKEAAAK
剛性 176 APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
剛性 177 GGGAPAPAPAPAPAPAPAPAPAP
在一些具體實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 8。
在一些具體實施例中，連接子包含或由SEQ ID NO: 168或SEQ ID NO: 169組成。這可能較佳，係因短的連接子在蛋白表現過程中無法進行轉譯後修飾，將導致異質性下降，並改進蛋白分子作為藥物的可開發性。結合模組
本發明蛋白分子可包含一或多個結合模組。結合模組可增加蛋白分子上與因子IXa /因子X結合之抗原結合位點的數量，或其可增加進一步之特異性，使蛋白分子具有多特異性（multispecific），如三特異性。
在一些具體實施例中，結合模組之抗原結合位點係結合至Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、β2-醣蛋白I、CD61、GPIb-IX、CD69、CD40、膠原蛋白伴護蛋白HSP47、麻黃素B1、硫醇異構酶蛋白ERP5、造血前驅細胞激酶1交互作用蛋白55（HIP-55）、醣蛋白VI、血小板醣蛋白1b、血小板衍生性生長因子受體、血小板內皮凝集受體I、CD36、CD31、MARKS、多聚體蛋白、整合素αIIb/β3、表現在骨髓細胞（TREM）上的驅動受體，如轉錄子-1蛋白（TLT-1）、整合素連接激酶（ILK）、斑聯蛋白、膠原蛋白、P-選擇素、因子XIII、P-選擇素醣蛋白配體-1、整合素α6 β1 、凝血栓蛋白、馮威里氏因子、G6B、CD42b、突觸融合蛋白結合蛋白2、磷脂醯基乙醇胺、纖維蛋白原/纖維蛋白、纖維蛋白、胃抑素、神經脂質、CD63、CD41、CD49b、CD107a、CD107b、CD42c、CD42、CD109、CD62P、CD154、PECAM-1、或ERPS。
因此，在一些具體實施例中，結合模組抗原結合位點係結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
在一些具體實施例中，磷脂絲胺酸結合蛋白為C蛋白、Z蛋白、S蛋白、組織因子、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、Mer、LOX-1、α5 β3 整合素、乳凝集素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、氧化固醇结合蛋白、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。
在一些具體實施例中，結合模組結合至血小板表面標記，其中血小板表面標記為CD61、GPIb-IX、CD69、CD40、膠原蛋白伴護蛋白HSP47、麻黃素B1、硫醇異構酶蛋白ERP5、造血前驅細胞激酶1交互作用蛋白55（HIP-55）、醣蛋白VI、血小板醣蛋白1b、血小板衍生性生長因子受體、血小板內皮凝集受體I、CD36、CD31、MARKS、多聚體蛋白、整合素αIIb/β3、表現在骨髓細胞（TREM）上的驅動受體，如轉錄子-1蛋白（TLT-1）、整合素連接激酶（ILK）、斑聯蛋白、膠原蛋白、P-選擇素、因子XIII、P-選擇素醣蛋白配體-1、整合素α6 β1 、凝血栓蛋白、馮威里氏因子、G6B、CD42b、突觸融合蛋白結合蛋白2、磷脂醯基乙醇胺、纖維蛋白原/纖維蛋白、纖維蛋白、胃抑素、神經脂質、CD63、CD41、CD49b、CD107a、CD107b、CD42c、CD42、CD109、CD62P、CD154、PECAM-1、或ERPS。
結合模組可通過連接子連接至骨架模組或可插入存在於骨架模組中的圈環區之內。在一些具體實施例中，骨架模組為IgG或其二價片段，且結合模組係連接至輕鏈或重鏈之C端或N端。在一些具體實施例中，結合模組係插入CH1與CH2結構域之間，亦即絞鏈區附近。在一些具體實施例中，骨架模組為包含重鏈與輕鏈之抗體或其二價片段，且結合模組係連接至輕鏈或重鏈之C端或N端。在一些具體實施例中，骨架模組為包含二個重鏈與二個輕鏈之抗體或其二價片段，且結合模組係連接至輕鏈或重鏈之C端或N端。結合至因子 IXa 或因子 X 之結合模組
在一些具體實施例中，結合模組之抗原結合位點結合至因子IXa或因子X。
在一些具體實施例中，結合模組為抗運載蛋白、重複體、單體、scFv、Fab、scFab、親合體、調聚物、DARPin、奈米抗體、胜肽適體、或核酸適體。在一些具體實施例中，結合模組為scFv或scFab。在一些具體實施例中，結合模組為scFv。
在一些具體實施例中，結合模組為scFv或scFab，其包含（i）表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及（ii）HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3。在一些具體實施例中，LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
在一些具體實施例中，結合模組為scFv或scFab，其包含（i）表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及（ii）HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3。在一些具體實施例中，LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之V198、W206、W198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
在一些具體實施例中，結合模組為scFv或scFab，其包含（i）表3揭示之因子X結合輕鏈或表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL，以及（ii）SEQ ID NO: 4（VH結構域）。在一些具體實施例中，（i）為表3與表4a之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162之VL。
在一些具體實施例中，結合模組為scFv或scFab，其包含（i）表3揭示之因子X結合輕鏈或表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL，以及（ii）SEQ ID NO: 4（VH結構域）。在一些具體實施例中，（i）為表3與表4b之V198、W206、W198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162之VL。
在一些具體實施例中，結合模組為scFv，其包含（i）由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成之VL結構域，其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGD（SEQ ID NO: 179）、FW2為VHWYQQKPGQAPVLVIY（SEQ ID NO: 180）、FW3為DRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC（SEQ ID NO: 181）、及FW4為FGCGTKLTVL（SEQ ID NO: 182），以及（ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。在一些具體實施例中，LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
在一些具體實施例中，結合模組為scFv，其包含（i）由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成之VL結構域，其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGD（SEQ ID NO: 179）、FW2為VHWYQQKPGQAPVLVIY（SEQ ID NO: 180）、FW3為DRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC（SEQ ID NO: 181）、及FW4為FGCGTKLTVL（SEQ ID NO: 182），以及（ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。在一些具體實施例中，LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之V198、W206、W198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。 SEQ ID NO: 183 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSS結合至其他標靶之結合模組
在一些具體實施例中，結合模組結合至磷脂絲胺酸、血小板表面標記、或磷脂絲胺酸結合蛋白，其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。
在一些具體實施例中，結合模組結合至與損傷部位相關之標靶（如馮威里氏因子（VWF）、纖維蛋白原、或膠原蛋白），以便將蛋白分子定位在損傷部位，而非或除了前述之磷脂絲胺酸、血小板表面標記、或磷脂絲胺酸結合蛋白以外。
在一些具體實施例中，結合模組為抗運載蛋白、重複體、單體、scFv、Fab、scFab、親合體、調聚物、DARPin、奈米抗體、胜肽適體、或核酸適體。在一些具體實施例中，結合模組為scFv或scFab。在一些具體實施例中，結合模組為scFv。
在一些具體實施例中，結合模組為scFv或scFab，其包含VL結構域與VH結構域，其中VL結構域包含LCDR1、LCDR2、及LCDR3且VH結構域包含HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中： （i）  LCDR1為QDIGSS（SEQ ID NO: 293）、LCDR2為ATS（SEQ ID NO: 294）、LCDR3為LQYVSSPPT（SEQ ID NO: 295）、HCDR1為GYSFTGYN（SEQ ID NO: 296）、HCDR2為IDPYYGDT（SEQ ID NO: 297）、及HCDR3為VKGGYYGHWYFDV（SEQ ID NO: 298）； （ii）     LCDR1為SLRSYY（SEQ ID NO: 299）、LCDR2為GKN（SEQ ID NO: 300）、LCDR3為NSSKIPRRMVV（SEQ ID NO: 301）、HCDR1為GFTFSSYA（SEQ ID NO: 302）、HCDR2為INGSGGST（SEQ ID NO: 303）、及HCDR3為AKTRRKVFDY（SEQ ID NO: 304）；或者 （iii）   LCDR1為GNIHNY（SEQ ID NO: 305）、LCDR2為NAK（SEQ ID NO: 306）、LCDR3為QHFWSTPYT（SEQ ID NO: 307）、HCDR1為GFTFSSYI（SEQ ID NO: 308）、HCDR2為IRSGGDNT（SEQ ID NO: 309）、及HCDR3為AIYYGNYGGLAY（SEQ ID NO: 310）。
在一些具體實施例中，結合模組為scFv或scFab，其包含VL結構域與VH結構域，其中VL結構域係選自於SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、或SEQ ID NO: 186，且VH結構域係選自於SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、或SEQ ID NO: 189。在一些具體實施例中，VL結構域為SEQ ID NO: 184且VH結構域為SEQ ID NO: 187，VL結構域為SEQ ID NO: 185且VH結構域為SEQ ID NO: 188，或VL結構域為SEQ ID NO: 186且VH結構域為SEQ ID NO: 189。 SEQ ID NO: 184（巴維昔單抗之VL） DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQGPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYVSSPPTFGCGTKLELKRADAAP SEQ ID NO: 185（PS72之VL） SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSKIPRRMVVFGCGTKLTVL SEQ ID NO: 186（抗LIBS抗體之VL） DILMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGCGTKLEIKRADAAP SEQ ID NO: 187（巴維昔單抗之VH） EVQLQQSGPELEKPGASVKLSCKASGYSFTGYNMNWVKQSHGKCLEWIGHIDPYYGDTSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGAGTTVTVSS SEQ ID NO: 188（PS72之VH） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAINGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTRRKVFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 189（抗LIBS抗體之VH） QVQLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYIMSWVRQTPEKCLEWVATIRSGGDNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNKLYLQMSSLRSEDTALYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSA
在一些具體實施例中，結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。 巴維昔單抗： EVQLQQSGPELEKPGASVKLSCKASGYSFTGYNMNWVKQSHGKCLEWIGHIDPYYGDTSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQGPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYVSSPPTFGCGTKLELKRADAAP（SEQ ID NO: 190） PS72 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAINGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKTRRKVFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSKIPRRMVVFGCGTKLTVL（SEQ ID NO: 191） 抗LIBS抗體 QVQLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYIMSWVRQTPEKCLEWVATIRSGGDNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNKLYLQMSSLRSEDTALYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDILMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGCGTKLEIK（SEQ ID NO: 192）
在一些具體實施例中，結合模組為scFv、scFab、或Fab，其包含如表6之1-13之任一者之VH與VL結構域。表 6 ：人源化巴維昔單抗構築體之 VL 與 VH 序列
  VH序列 VL序列
1 EVQLQQSGPELEKPGASVKLSCKASGYSFTGYNMNWVKQSHGKSLEWIGHIDPYYGDTSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGAGTTVTVSS（SEQ ID NO: 311） DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQGPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYVSSPPTFGAGTKLELK（SEQ ID NO: 312）
2 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTSYNQKFQGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 313） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLQSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 314）
3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTSYNQKFQGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 315） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLQSGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 316）
4 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTSYNQKFQGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 317） EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQDIGSSLNWLQQKPGQAIRRLIYATSSRATGIPDRFSGSRSGSDYTLTISRLEPEDFAVYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 318）
5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTSYAQKFQGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 319） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLQSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 320）
6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTSYAQKFQGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 321） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLQSGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 322）
7 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTSYAQKFQGRVTMTVDKSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 323） EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQDIGSSLNWLQQKPGQAIRRLIYATSSRATGIPDRFSGSRSGSDYTLTISRLEPEDFAVYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 324）
8 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTTYNQGFTGRFVFSVDKSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 325） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLQSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 326）
9 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTTYNQGFTGRFVFSVDKSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 327） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLQSGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 328）
10 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTTYNQGFTGRFVFSVDKSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 329） EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQDIGSSLNWLQQKPGQAIRRLIYATSSRATGIPDRFSGSRSGSDYTLTISRLEPEDFAVYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 330）
11 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTTYAQGFTGRFVFSVDKSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 331） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLQSGVPSRFSGSRSGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 332）
12 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTTYAQGFTGRFVFSVDKSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 333） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIGSSLNWLQQKPGKAIKRLIYATSSLQSGVPSRFSGSRSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 334）
13 EVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYSFTGYNMNWVRQAPGQGLEWMGHIDPYYGDTTYAQGFTGRFVFSVDKSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID NO: 335） EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQDIGSSLNWLQQKPGQAIRRLIYATSSRATGIPDRFSGSRSGSDYTLTISRLEPEDFAVYYCLQYVSSPPTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 336）
在一些具體實施例中，結合模組為scFv、scFab、或Fab，其包含如表7之1-13之任一者之VH與VL結構域。表 7 ：人源化抗 LIBS 抗體構築體之 VL 與 VH 序列
  VH序列 VL序列
1 QVQLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYIMSWVRQTPEKRLEWVATIRSGGDNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNKLYLQMSSLRSEDTALYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSA（SEQ ID NO: 337） DILMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGGGTKLEIK（SEQ ID NO: 338）
2 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVSTIRSGGDNTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 339） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAKTLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 340）
3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVSTIRSGGDNTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 341） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLLYNAKTLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 342）
4 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVSTIRSGGDNTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 343） EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASGNIHNYLAWYQQKPGQAPRLLVYNAKTRATGIPARFSGSGSGTEYTLTISSLQSEDFAVYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 344）
5 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVSTIRSGGDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 345） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAKTLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 346）
6 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVSTIRSGGDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 347） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLLYNAKTLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 348）
7 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYIMSWVRQAPGKGLEWVSTIRSGGDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 349） EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASGNIHNYLAWYQQKPGQAPRLLVYNAKTRATGIPARFSGSGSGTEYTLTISSLQSEDFAVYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 350）
8 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSSYIMSWVRQAPGQRLEWMGTIRSGGDNTKYPDKFQGRVTITRDNSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 351） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAKTLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 352）
9 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSSYIMSWVRQAPGQRLEWMGTIRSGGDNTKYPDKFQGRVTITRDNSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 353） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLLYNAKTLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 354）
10 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSSYIMSWVRQAPGQRLEWMGTIRSGGDNTKYPDKFQGRVTITRDNSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 355） EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASGNIHNYLAWYQQKPGQAPRLLVYNAKTRATGIPARFSGSGSGTEYTLTISSLQSEDFAVYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 356）
11 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSSYIMSWVRQAPGQRLEWMGTIRSGGDNTKYSQKFQGRVTITRDNSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 357） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLVYNAKTLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 358）
12 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSSYIMSWVRQAPGQRLEWMGTIRSGGDNTKYSQKFQGRVTITRDNSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 359） DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASGNIHNYLAWYQQKPGKAPKLLLYNAKTLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 360）
13 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSSYIMSWVRQAPGQRLEWMGTIRSGGDNTKYSQKFQGRVTITRDNSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSS（SEQ ID NO: 361） EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASGNIHNYLAWYQQKPGQAPRLLVYNAKTRATGIPARFSGSGSGTEYTLTISSLQSEDFAVYYCQHFWSTPYTFGQGTKLEIK（SEQ ID NO: 362）
在另一具體實施例中，結合模組包含磷脂絲胺酸結合蛋白之磷脂絲胺酸結合結構域。此類結構域為本領域已知，且可易於由技術人員鑑定（參見，如WO 2006/079120 A2，其內容在此全部併入本案以作為參考資料）。在一些具體實施例中，結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V（參見，WO 2006/079120 A2）。在一些具體實施例中，結合模組包含 KASCKVPVKKATVVYQGERVKIQEKFKNGMLHGDKVSFFCKNKEKKCSYTEDAQCIDGTIEVPKCFKEHSSLAFWKTDASDVKPC（SEQ ID NO: 178）。雙特異性多價分子
在一些具體實施例中，蛋白分子係雙特異性且多價。在一些具體實施例中，骨架模組包含二個結合至因子IXa或因子X的抗原結合位點，或者骨架模組包含一個結合至因子IXa的抗原結合位點及一個結合至因子X的抗原結合位點。
圖1與圖4揭示本發明涵蓋之雙特異性多價分子的實例。本發明之雙特異性多價分子依據所使用的骨架模組細分成二個類別：1）包含結合至因子IXa之第一抗原結合位點與結合至因子X之第二抗原結合位點的骨架模組（稱作「IXa/X骨架」），以及2）包含二個抗原結合位點的骨架模組，其中該二抗原結合位點結合至因子IXa或因子X（稱作「單特異性骨架）。在一些具體實施例中，IXa/X骨架為抗體。在一些具體實施例中，單特異性骨架為抗體。
欲製造三特異性多價蛋白分子，單一結合模組可通過連接子之任一者連接至IXa/X骨架，且前面揭示之位置或結合模組可插入圈環區之內。在此具體實施例中，包含抗原結合位點的結合模組可結合至本文揭示之其他標靶之任一者，亦即非因子IXa或因子X。
IXa/X骨架亦可製成雙特異性多價。在一些具體實施例中，單一結合模組可通過連接子之任一者連接至IXa/X骨架，且前面揭示之位置或結合模組可插入圈環區中。在此具體實施例中，結合模組包含結合至因子IXa或因子X的抗原結合位點。
若僅連接/插入一個結合模組，則僅可製造雙特異性多價之單特異性骨架。在一些具體實施例中，單一結合模組可通過連接子之任一者連接至單特異性骨架，且前面揭示之位置或結合模組可插入圈環區中。在此具體實施例中，結合模組包含結合至因子IXa或因子X的抗原結合位點。
然而，欲產生包含單特異性骨架的三特異性多價蛋白分子，蛋白分子必需包含二個結合模組。在此具體實施例中，第一結合模組係通過連接子連接至單特異性骨架，或第一結合模組係插入圈環區中。因此，隨後第二結合模組可以與第一結合模組相似或不同的方式連接至骨架模組。然而，第一結合模組的抗原結合位點應結合至因子IXa或因子X，第二結合模組之抗原結合位點應結合至另一標靶（亦即非因子IXa或因子X）以製造三特異性蛋白分子。
顯而易見的是，使用本文揭示之設計考量，可能有各種不同的巨分子拓撲結構，且彼等不同的巨分子拓撲結構落於本發明之範疇內。發明人聚焦在以下幾種可能的巨分子拓撲結構，以概述本方法之實用性及多功能性。1 ）「 1 乘 3 」或「 3 乘 1 」拓撲結構
具有「3乘1」或「1乘3」拓撲結構之蛋白分子的實例如圖1所示。彼等蛋白分子為雙特異性多價，且包含直接針對其中一個標靶的大量抗原結合位點。
在一方面，本發明提供一蛋白分子，其包含： （i）       一個骨架模組，其中骨架模組包含結合至因子IXa的第一抗原結合位點及結合至因子X的第二抗原結合位點；以及 （ii）     分別包含第三與第四抗原結合位點之第一與第二結合模組， 其中第三與第四抗原結合位點結合至因子IXa或因子X。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a）     抗體或其二價片段，其包含： （i）     二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）   一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （iii）一個輕鏈，其包含表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （b）     至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，其包含： （i）  表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 （ii）         HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（a）（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3分別為表1與表2a揭示之W88與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127與V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149與W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W126與V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83與V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88與V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W83與V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a）抗體或其二價片段，其包含： （i）     二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）   一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （iii）一個輕鏈，其包含表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （b）     至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，其包含： （i）  表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 （ii）  HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（a）（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3分別為表1與表2b揭示之W206與V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127與V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149與W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W126與V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83與V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88與V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W83與V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W206、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a）抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）  一個輕鏈，其包含表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）             至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）       VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）     VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（a）（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之VL分別為表3與表4a揭示之W88與V198之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）  一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）               VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）            VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W206之VL、W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（a）（iii）之VL為表4b揭示之V245之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之VL分別為表3與表4b揭示之W206與V245之VL、W88與V198之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W206、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）               二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）            一個輕鏈，其包含表3揭示之W88之VL；以及 （iii）          一個輕鏈，其包含表4a揭示之V198之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）               VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V198之 LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）            VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）  一個輕鏈，其包含表3揭示之W88之VL；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表4a揭示之V198之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V198之 LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）               二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）            一個輕鏈，其包含表3揭示之W27之VL；以及 （iii）          一個輕鏈，其包含表4a揭示之V202之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）  一個輕鏈，其包含表3揭示之W128之VL；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表4a揭示之V149之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之V128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）  一個輕鏈，其包含表3揭示之W128之VL；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表4a揭示之V198之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之W88之VL；以及 （iii）  一個輕鏈，其包含表4a揭示之V198之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）  一個輕鏈，其包含表3揭示之W128之VL；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表4a揭示之V141之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）  一個輕鏈，其包含表3揭示之W127之VL；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表4a揭示之V202之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）  一個輕鏈，其包含表3揭示之W162之VL；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表4a揭示之V204之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）  一個輕鏈，其包含表3揭示之W206之VL；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表4b揭示之V245之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183。
在前述任一者之一些具體實施例中，結合模組係通過連接子連接至重鏈或輕鏈之N端或C端。在一些具體實施例中，結合模組係連接至重鏈或輕鏈之C端。在一些具體實施例中，第一結合模組係通過連接子連接至第一重鏈之C端，且第二結合模組係通過連接子連接至第二重鏈之C端。
在一些具體實施例中，蛋白分子包含表8揭示之Lex#3、Bax#137、Bax#148、Bax#146、Lex#2、Lex#12、Bax#138、或Bax#145之任一者之重鏈序列與二個LC序列。
在一些具體實施例中，蛋白分子包含表8揭示之Lex#3、Lex#131、Bax#137、Bax#148、Bax#146、Lex#2、Lex#12、Bax#138、或Bax#145之任一者之重鏈序列與二個LC序列。
在一些具體實施例中，蛋白分子由表8揭示之Lex#3、Bax#137、Bax#148、Bax#146、Lex#2、Lex#12、Bax#138、或Bax#145之任一者之二個拷貝的重鏈序列組成，一個拷貝為具有λ恆定結構域序列之LC，且一個拷貝為具有κ恆定結構域序列之LC。
在一些具體實施例中，蛋白分子由表8揭示之Lex#3、Lex#131、Bax#137、Bax#148、Bax#146、Lex#2、Lex#12、Bax#138、或Bax#145之任一者之二個拷貝的重鏈序列組成，一個拷貝為具有λ恆定結構域序列之LC，且一個拷貝為具有κ恆定結構域序列之LC。表 8 ：「 3 乘 1 」與「 1 乘 3 」構築體之序列
ID 具有λ恆定結構域之LC 具有κ恆定結構域之LC 重鏈序列
Lex#3 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 193） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTTGYLAWYQQKPGQAPRLLIYEASKRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVTRRSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 194） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLYVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 195）
Bax#137 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDKAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 196） NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 197） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDKAVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 198）
Bax#148 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 199） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQEVDDNELAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYDGYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 200） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 201）
Bax#146 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 202） NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 203） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 204）
Lex#2 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 205） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTTGYLAWYQQKPGQAPRLLIYEASKRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVTRRSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 206） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTTGYLAWYQQKPGQAPRLLIYEASKRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVTRRSPWTFGCGTKVEIK （SEQ ID NO: 207）
Lex#12 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 208） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQKVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEDYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 209） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 210）
Bax#138 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDKAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 211） NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 212） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 213）
Bax#145 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSNDDLIVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 214） NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGDLVFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 215） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGDLVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 216）
Lex#131 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCRGDNIEAETVGWYQQKPGQAPVLVIYSDSVRMSGIPERFSGSNSWNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSIDDLIVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO:378） NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSISNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO:379） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSISNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO:380）
2 ）「 2 乘 2 」模式
具有「2乘2」拓撲結構之蛋白分子的實例如圖1所示。彼等蛋白分子為雙特異性多價，且包含等數量的抗原結合位點，其結合至因子IXa或因子X。此類拓撲結構使用單特異性骨架。
在一方面，本發明提供一蛋白分子，其包含： （i）一個骨架模組，其中骨架模組包含結合至因子IXa或因子X的第一與第二抗原結合位點；以及 （ii）分別包含第三與第四抗原結合位點之第一與第二結合模組， 其中第三與第四抗原結合位點結合至因子IXa或因子X，且蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點與二個結合至因子X的抗原結合位點。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，其包含： （i）               表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 （ii）            HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，其包含： （i）  表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 （ii）  HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V155之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V320之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V305之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W198、W206、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表2b揭示之V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，其包含： （i）               表1揭示之W198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 （ii）            HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或（a）（ii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W206之VL、W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或（a）（ii）之VL為表4b揭示之V245之VL、V155之VL、V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W206、W198、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4b揭示之V212之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4b揭示之V305之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4a揭示之V141之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4b揭示之V245之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4b揭示之V245之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4b揭示之V245之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4b揭示之V155之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4b揭示之V155之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4b揭示之V320之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4b揭示之V320之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4a揭示之V212之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表3揭示之W128之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表4a揭示之V202之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表3揭示之W127之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183， 其中蛋白分子包含至少二個結合至因子IXa的抗原結合位點與至少二個結合至因子X的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，且二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同。
在前述任一者之一些具體實施例中，結合模組係通過連接子連接至重鏈或輕鏈之N端或C端。在一些具體實施例中，結合模組係連接至重鏈或輕鏈之C端。在一些具體實施例中，第一結合模組係通過連接子連接至第一重鏈之C端，且第二結合模組係通過連接子連接至第二重鏈之C端。
在一些具體實施例中，蛋白分子包含揭示於表9之Lex#84、Lex#85、Lex#86、Lex#87、Lex#88、Lex#96、Lex#97、Lex#60、Lex#63、Lex#71、Lex#72、Lex#73、Lex#74、Lex#75、Bax#144、Lex#59、Lex#53、Lex#99、Lex#102、Lex#103、或Lex#105之任一者之重鏈序列與輕鏈序列兩者。
在一些具體實施例中，蛋白分子包含揭示於表9之Lex#95、Lex#121、Lex#129、Lex#143、Lex#153、Lex#157、Lex#161、Lex#167、Lex#168、Lex#169、Lex#84、Lex#85、Lex#86、Lex#87、Lex#88、Lex#96、Lex#97、Lex#60、Lex#63、Lex#71、Lex#72、Lex#73、Lex#74、Lex#75、Bax#144、Lex#59、Lex#53、Lex#99、Lex#102、Lex#103、或Lex#105之任一者之重鏈序列與輕鏈序列兩者。在一些具體實施例中，蛋白分子包含揭示於表9之Lex#153之重鏈序列與輕鏈序列兩者。
在一些具體實施例中，蛋白分子由揭示於表9之Lex#84、Lex#85、Lex#86、Lex#87、Lex#88、Lex#96、Lex#97、Lex#60、Lex#63、Lex#71、Lex#72、Lex#73、Lex#74、Lex#75、Bax#144、Lex#59、Lex#53、Lex#99、Lex#102、Lex#103、或Lex#105之任一者之二個拷貝的重鏈序列與二個拷貝的輕鏈序列組成。
在一些具體實施例中，蛋白分子由揭示於表9之Lex#95、Lex#121、Lex#129、Lex#143、Lex#153、Lex#157、Lex#161、Lex#167、Lex#168、Lex#169、Lex#84、Lex#85、Lex#86、Lex#87、Lex#88、Lex#96、Lex#97、Lex#60、Lex#63、Lex#71、Lex#72、Lex#73、Lex#74、Lex#75、Bax#144、Lex#59、Lex#53、Lex#99、Lex#102、Lex#103、或Lex#105之任一者之二個拷貝的重鏈序列與二個拷貝的輕鏈序列組成。在一些具體實施例中，蛋白分子由揭示於表9之Lex#153之二個拷貝的重鏈序列與二個拷貝的輕鏈序列組成。表 9 ：「 2 乘 2 」構築體之序列
ID 輕鏈序列 重鏈序列
Lex#84 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQKVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEDYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 217） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 218）
Lex#85 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQKVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEDYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 219） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 220）
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Lex#97 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQKVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEDYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 229） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGSAGSAAGSGEFDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 230）
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Lex#72 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 237） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 238）
Lex#73 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 239） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 240）
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Lex#75 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 243） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 244）
Bax#144 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDKAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 245） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 246）
Lex#59 NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 247） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSSYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 248）
Lex#53 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQKVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEDYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 249） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 250）
Lex#99 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 251） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG （SEQ ID NO: 252）
Lex#102 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 253） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG （SEQ ID NO: 254）
Lex#103 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 255） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCGSAGSAAGSGEFDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG （SEQ ID NO: 256）
Lex#105 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 257） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG （SEQ ID NO: 258）
Lex#95 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQKVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEDYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 381） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGSAGSAAGSGEFEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 382）
Lex#121 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCRGDNIEAETVGWYQQKPGQAPVLVIYSDSVRMSGIPERFSGSNSWNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSIDDLIVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 383） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 384）
Lex#129 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCRGDNIEAETVGWYQQKPGQAPVLVIYSDSVRMSGIPERFSGSNSWNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSIDDLIVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 385） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSISNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 386）
Lex#143 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEGYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 387） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 388）
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Lex#157 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEGYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 391） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSISNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 392）
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Lex#167 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCRGDNIEAETVGWYQQKPGQAPVLVIYSDSVRMSGIPERFSGSNSWNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSIDDLIVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 395） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSISNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 396）
Lex#168 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCRGDNIEAETVGWYQQKPGQAPVLVIYSDSVRMSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSIDDLIVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 397） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSISNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 398）
Lex#169 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCRGDNIEAETVGWYQQKPGQAPVLVIYSDSVRMSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSIDDLIVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 399） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 400）
三特異性多價分子
在一些具體實施例中，蛋白分子為三特異性且多價。
圖2與圖3揭示本發明所涵蓋之三特異性多價分子之實例。本發明之三特異性多價分子依據所使用的骨架模組細分成二個類別：1）包含結合至因子IXa之第一抗原結合位點與結合至因子X之第二抗原結合位點的骨架模組（稱作「IXa/X骨架」），以及2）包含二個抗原結合位點的骨架模組，其中該二抗原結合位點結合至因子IXa或因子X（稱作「單特異性骨架）。
如所論及的，顯而易見的是，使用本文揭示之設計考量，可能有各種不同的巨分子拓撲結構，且彼等不同的巨分子拓撲結構落於本發明之範疇內。發明人聚焦在以下幾種可能的巨分子拓撲結構，以概述本方法之實用性及多功能性。1 ）三特異性「 IXa/X 骨架」拓撲結構
具有三特異性「IXa/X骨架」拓撲結構之蛋白分子的實例如圖2所示。彼等蛋白分子為三特異性多價，且包含至少三個結合至不同標靶的抗原結合位點。
在一方面，本發明提供一蛋白分子，其包含： （i）     一個骨架模組，其中骨架模組包含結合至因子IXa的第一抗原結合位點及結合至因子X的第二抗原結合位點；以及 （ii）   分別包含第三與第四抗原結合位點的第一與第二結合模組， 其中第三與第四抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記； 其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）  一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （b）至少二個結合模組，各包含一個抗原結合位點， 其中兩者的抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記； 其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（a）（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3分別為表1與表2a揭示之W88與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127與V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149與W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W126與V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83與V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88與V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W83與V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）  一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （b）至少二個結合模組，各包含一個抗原結合位點， 其中兩者的抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記； 其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（a）（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V320之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V305之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3分別為表1與表2b揭示之W88與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W206與V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127與V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149與W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128與V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W126與V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83與V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88與V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W83與V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）  一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）           至少二個結合模組，各包含一個抗原結合位點，其中兩者的抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記， 其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（a）（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之VL分別為表3與表4a揭示之W88與V198之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）  一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）                一個輕鏈，其包含表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）至少二個結合模組，各包含一個抗原結合位點， 其中兩者的抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記， 其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W206之VL、W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（a）（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V245之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之VL分別為表3與表4b揭示之W88與V198之VL、W206與V245之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）  一個輕鏈，其包含表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，包含VL結構域與VH結構域，其中VL結構域包含SEQ ID NO: 184且VH結構域包含SEQ ID NO: 187、VL結構域包含SEQ ID NO: 185且VH結構域包含SEQ ID NO: 188、或VL結構域包含SEQ ID NO: 186且VH結構域包含SEQ ID NO: 189。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（a）（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之VL分別為表3與表4a揭示之W88與V198之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）  一個輕鏈，其包含表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，包含VL結構域與VH結構域，其中VL結構域包含SEQ ID NO: 184且VH結構域包含SEQ ID NO: 187、VL結構域包含SEQ ID NO: 185且VH結構域包含SEQ ID NO: 188、或VL結構域包含SEQ ID NO: 186且VH結構域包含SEQ ID NO: 189。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W206之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（a）（iii）之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V245之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之VL分別為表3與表4b揭示之W206與V245之VL、W88與V198之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域包含SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）  一個輕鏈，其包含表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其包含SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（a）（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之VL分別為表3與表4a揭示之W88與V198之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域包含SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）  一個輕鏈，其包含表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其包含SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W206之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（a）（iii）之VL為表4b揭示之V43之VL、V320之VL、V305之VL、V245之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之VL分別為表3與表4b揭示之W88與V198之VL、W206與V245之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域包含SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）  一個輕鏈，其包含表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其包含β2-醣蛋白I之結構域V。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（a）（iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之VL分別為表3與表4a揭示之W88與V198之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL、或W83與V43之VL，且結合模組包含SEQ ID NO: 178。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域包含SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）  一個輕鏈，其包含表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL；以及 （b）至少二個結合模組，其包含β2-醣蛋白I之結構域V。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W206之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，且（a）（iii）之VL為表4b揭示之V43之VL、V320之VL、V305之VL、V90之VL、V141之VL、V245之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。在一些具體實施例中，（a）（ii）與（a）（iii）之VL分別為表3與表4b揭示之W206與V245之VL、W88與V198之VL、W127與V202之VL、V149與W128之VL、W128與V198之VL、W128與V141之VL、W162與V204之VL、W83與V217之VL、W88與V90之VL,或W83與V43之VL，且結合模組包含SEQ ID NO: 178。
在前述任一者之一些具體實施例中，結合模組係通過連接子連接至重鏈或輕鏈之N端或C端。在一些具體實施例中，結合模組係連接至重鏈或輕鏈之C端。在一些具體實施例中，第一結合模組係通過連接子連接至第一重鏈之C端，且第二結合模組係通過連接子連接至第二重鏈之C端。
在一些具體實施例中，蛋白分子包含表10揭示之Bax#142、Lex#38、Lex#39、Bax#87、Bax#89、Lex#36、Lex#40、或Lex#41之任一者之重鏈序列與二個輕鏈（LC）序列。
在一些具體實施例中，蛋白分子由表10揭示之Bax#142、Lex#38、Lex#39、Bax#87、Bax#89、Lex#36、Lex#40或Lex#41之任一者之二個拷貝的重鏈序列組成，一個拷貝為具有λ恆定結構域之LC序列，且一個拷貝為具有κ恆定結構域之LC序列。表 10 ：「三特異性 κλ 抗體」構築體之序列
ID 具有λ恆定結構域之LC 具有κ恆定結構域之LC 重鏈序列
Bax#142 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYRDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDKAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 259） NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGGGTKLTVLRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 260） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELEKPGASVKLSCKASGYSFTGYNMNWVKQSHGKCLEWIGHIDPYYGDTSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQGPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYVSSPPTFGCGTKLELKRADAAP （SEQ ID NO: 261）
Lex#38 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 262） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTTGYLAWYQQKPGQAPRLLIYEASKRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVTRRSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 263） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELEKPGASVKLSCKASGYSFTGYNMNWVKQSHGKCLEWIGHIDPYYGDTSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQGPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYVSSPPTFGCGTKLELK （SEQ ID NO: 264）
Lex#39 QSVLTQPPS.VSGAPGQRVTISCTGSSSNILTNKNVHWYQQLPGTAPKLLIYAISRRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSGHTLTAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 265） DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNIVNHLRWYQQKPGKAPKLLIYDNSPLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQAPYGHALSTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 266） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELEKPGASVKLSCKASGYSFTGYNMNWVKQSHGKCLEWIGHIDPYYGDTSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQGPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYVSSPPTFGCGTKLELK （SEQ ID NO: 267）
Bax#87 SYVLTQPPSVSVAPGKTAILTCGGDNIEAESVHWYQQKPDQAPLLVVYTDSYRPSGIPERFSGSNSGNTATLTITRVEVGDEADYYCQVRDSNDDRAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 268） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTTGYLAWYQQKPGQAPRLLIYEASKRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVTRRSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 269） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELEKPGASVKLSCKASGYSFTGYNMNWVKQSHGKCLEWIGHIDPYYGDTSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQGPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYVSSPPTFGCGTKLELKRADAAP （SEQ ID NO: 270）
Bax#89 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNILTNKNVHWYQQLPGTAPKLLIYAISRRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSGHTLTAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 271） DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQAIHAHLRWYQQKPGKAPKLLIYDNSPLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQATFGHALSTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 272） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELEKPGASVKLSCKASGYSFTGYNMNWVKQSHGKCLEWIGHIDPYYGDTSYNQKFRGKATLTVDKSSSTAYMQLKSLTSEDSAVYYCVKGGYYGHWYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSSLNWLQQGPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYVSSPPTFGCGTKLELKRADAAP （SEQ ID NO: 273）
Lex#36 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 274） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTTGYLAWYQQKPGQAPRLLIYEASKRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVTRRSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 275） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYIMSWVRQTPEKCLEWVATIRSGGDNTYYPDSVKGRFTISRDNAKNKLYLQMSSLRSEDTALYYCAIYYGNYGGLAYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDILMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWSTPYTFGCGTKLEIK （SEQ ID NO: 276）
Lex#40 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAETVHWYQQKPGQAPVLVIYSDSIRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSVDDLYVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 277） EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVTTGYLAWYQQKPGQAPRLLIYEASKRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQVTRRSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 278） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKASCKVPVKKATVVYQGERVKIQEKFKNGMLHGDKVSFFCKNKEKKCSYTEDAQCIDGTIEVPKCFKEHSSLAFWKTDASDVKPC （SEQ ID NO: 279）
Lex#41 QSVLTQPPS.VSGAPGQRVTISCTGSSSNILTNKNVHWYQQLPGTAPKLLIYAISRRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSGHTLTAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS （SEQ ID NO: 280） DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQNIVNHLRWYQQKPGKAPKLLIYDNSPLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQAPYGHALSTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO: 281） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKASCKVPVKKATVVYQGERVKIQEKFKNGMLHGDKVSFFCKNKEKKCSYTEDAQCIDGTIEVPKCFKEHSSLAFWKTDASDVKPC （SEQ ID NO: 282）
2 ）「 2 乘 2 三特異性」拓撲結構
具有「2乘2三特異性」拓撲結構之蛋白分子的實例如圖3所示。彼等蛋白分子為三特異性多價，且包含等數量的抗原結合位點，其結合至因子IXa、因子X、或另一標靶。此類拓撲結構使用單特異性骨架。
在一方面，本發明提供一蛋白分子，其包含： （i）一個骨架模組，其中骨架模組包含結合至因子IXa或因子X的第一與第二抗原結合位點； （ii）分別包含第三與第四抗原結合位點之第一與第二結合模組；以及 （iii）分別包含第五與第六抗原結合位點之第三與第四結合模組； 其中第三與第四抗原結合位點結合至因子IXa或因子X，第五與第六抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記，且蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點； 其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3； （b）至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，其包含： （i）       表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 （ii）     HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3，以及 （c） 至少二個結合模組，各包含一個抗原結合位點，其中抗原結合位點兩者結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記； 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點；以及磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組結合至相同標靶。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3； （b）至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，其包含： （i）  表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 （ii）  HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3，以及 （c） 至少二個結合模組，各包含一個抗原結合位點，其中抗原結合位點兩者結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記； 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點；以及磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。
在一些具體實施例中，（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或（a）（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W198、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組結合至相同標靶。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL； （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183；以及 （c） 至少二個結合模組，各包含一個抗原結合位點，其中抗原結合位點兩者結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記； 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點；以及磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或（a）（ii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組結合至相同標靶。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL； （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183；以及 （c） 至少二個結合模組，各包含一個抗原結合位點，其中抗原結合位點兩者結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記； 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點；以及磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或（a）（ii）之VL為表4b揭示之V43之VL、V245之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W198、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組結合至相同標靶。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL； （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183；以及 （c） 至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，包含VL結構域與VH結構域，其中VL結構域包含SEQ ID NO: 184且VH結構域包含SEQ ID NO: 187、VL結構域包含SEQ ID NO: 185且VH結構域包含SEQ ID NO: 188、或VL結構域包含SEQ ID NO: 186且VH結構域包含SEQ ID NO: 189， 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點；以及磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或（a）（ii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）              二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL； （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183；以及 （c） 至少二個結合模組，其為scFvs或scFabs，包含VL結構域與VH結構域，其中VL結構域包含SEQ ID NO: 184且VH結構域包含SEQ ID NO: 187、VL結構域包含SEQ ID NO: 185且VH結構域包含SEQ ID NO: 188、或VL結構域包含SEQ ID NO: 186且VH結構域包含SEQ ID NO: 189， 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點；以及磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或（a）（ii）之VL為表4b揭示之V43之VL、V245之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W198、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL； （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183，以及 （c） 至少二個結合模組，其包含SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192， 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點；以及磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或（a）（ii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈 ，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL； （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183，以及 （c） 至少二個結合模組，其包含SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191或SEQ ID NO: 192， 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點；以及磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或（a）（ii）之VL為表4b揭示之V43之VL、V245之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W198、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL； （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183；以及 （c） 至少二個結合模組，其包含β2-醣蛋白I之結構域V， 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點；以及磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或（a）（ii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL； （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183；以及 （c） 至少二個結合模組，其包含β2-醣蛋白I之結構域V， 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記的抗原結合位點；以及磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（較佳為膜聯蛋白V）、或β2-醣蛋白I。在一些具體實施例中，（a）（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，或（a）（ii）之VL為表4b揭示之V43之VL、V245之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL，且（b）（i）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W198、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）  二個輕鏈，各包含表4b揭示之V245之VL； （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183；以及 （c） 至少二個結合模組，其包含β2-醣蛋白I之結構域V， 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組相同。
在一些具體實施例中，本發明提供一蛋白分子，其包含： （a） 抗體或其二價片段，其包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含Table 4b揭示之V212之VL； （b）至少二個結合模組，其為scFvs，其包含： （i）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，且其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182，以及 （ii）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183；以及 （c） 至少二個結合模組，其包含β2-醣蛋白I之結構域V， 其中蛋白分子包含二個結合至因子IXa的抗原結合位點、二個結合至因子X的抗原結合位點、及二個結合至磷脂絲胺酸的抗原結合位點。在一些具體實施例中，二個輕鏈之每一者之VL相同，（b）之二個結合模組之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3相同，且（c）之二個結合模組相同。
在前述任一者之一些具體實施例中，結合模組係通過連接子連接至重鏈或輕鏈之N端或C端。在一些具體實施例中，結合模組係連接至重鏈或輕鏈之C端。在一些具體實施例中，結合模組係連接至重鏈之C端與輕鏈之C端。
在一些具體實施例中，蛋白分子包含表11揭示之Lex#68或Lex#69之重鏈序列與輕鏈序列兩者。
在一些具體實施例中，蛋白分子包含表11揭示之Lex#134、Lex#135、Lex#68、或Lex#69之任一者之重鏈序列與輕鏈序列兩者。
在一些具體實施例中，蛋白分子由表11揭示之Lex#68或Lex#69之二個拷貝的重鏈序列與二個拷貝的輕鏈序列組成。
在一些具體實施例中，蛋白分子由表11揭示之Lex#134、Lex#135、Lex#68、或Lex#69之二個拷貝的重鏈序列與二個拷貝的輕鏈序列組成。表 11 ：「三特異性 2 乘 2 」構築體之序列
ID 輕鏈序列 重鏈序列
Lex#68 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQKVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEDYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 283） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKASCKVPVKKATVVYQGERVKIQEKFKNGMLHGDKVSFFCKNKEKKCSYTEDAQCIDGTIEVPKCFKEHSSLAFWKTDASDVKPC （SEQ ID NO: 284）
Lex#69 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQKVDDDELAWYQQKPGQAPRLLIYRASNRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYNDPDLGYEDYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKASCKVPVKKATVVYQGERVKIQEKFKNGMLHGDKVSFFCKNKEKKCSYTEDAQCIDGTIEVPKCFKEHSSLAFWKTDASDVKPC （SEQ ID NO: 285） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 286）
LEX#134 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCRGDNIEAETVGWYQQKPGQAPVLVIYSDSVRMSGIPERFSGSNSWNTATLTISRVEAGDEADYYCQVRDSIDDLIVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKASCKVPVKKATVVYQGERVKIQEKFKNGMLHGDKVSFFCKNKEKKCSYTEDAQCIDGTIEVPKCFKEHSSLAFWKTDASDVKPC （SEQ ID NO: 401） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSISNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWEGLKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 402）
LEX#135 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGDNIEAESVHWYQQKPGQAPVLVIYNDNNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVLLNDADEGVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSKASCKVPVKKATVVYQGERVKIQEKFKNGMLHGDKVSFFCKNKEKKCSYTEDAQCIDGTIEVPKCFKEHSSLAFWKTDASDVKPC （SEQ ID NO: 403） EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKCLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSYGAFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNFMLTQPHSVSESPGKTVTISCTRSSGSINNYYVQWYQQRPGSSPTTVIYNHNKRPSGVPDRFSGSIDSSSNSASLTISGLKTEDEADYYCQSWTWSGEKVFGCGTKLTVL （SEQ ID NO: 404）
醫藥組合物
本發明亦提供一醫藥組合物，其包含本發明之抗體及醫藥上可接受載體及/或稀釋劑。
在一第二方面，本發明提供一醫藥組合物，其包含本發明之抗體或其抗原結合片段及醫藥上可接受載體或稀釋劑。
本文中使用的「醫藥上可接受載體」或「醫藥上可接受稀釋劑」意指與藥學投予兼容的任何及所有溶劑、分散介質、塗料、抗菌與抗真菌劑、及等張與吸收延遲劑。此類介質與試劑在藥學活性物質中之用途為本領域已知。可接受之載體、賦形劑、或安定劑的使用劑量與濃度對接受體無毒，在未受限於本發明範疇的情況下，包括：額外的緩衝劑；防腐劑；助溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸與甲硫胺酸；螯合劑如EDTA；金屬錯合物（如鋅蛋白錯合物）；生物可降解聚合物，如聚酯類；成鹽相對離子，如鈉、多元糖醇；胺基酸，如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、及蘇胺酸；或者有機糖類或糖醇類，如乳糖醇（lactitol）、水蘇糖（stachyose）、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇（ribitol）、肌初始糖（myoinisitose）、肌初始醇（myoinisitol）、半乳糖、半乳糖醇（galactitol）、甘油、環糖醇類（cyclitols）（如肌醇（inositol））、聚乙二醇；含硫還原劑，如尿素、穀胱甘肽、硫辛酸（thioctic acid）、硫代乙醇酸鈉（sodium thioglycolate）、硫代甘油、[α]-單硫甘油、及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白，如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠、或其他免疫球蛋白；以及親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮。
本文所述之醫藥組合物亦可包含其他物質。彼等物質包括但不侷限於，冷凍保護劑類、凍乾保護劑類、界面活性劑類、增積劑類（bulking agents）、抗氧化劑類、及安定劑類。在一些具體實施例中，醫藥組合物可凍乾。
本文中使用的「冷凍保護劑」乙詞包括提供抗體免於冷凍所引發壓迫之安定性的試劑，其係藉由優先阻隔抗體表面。冷凍保護劑類亦可在一次與二次乾燥及長期產品保存期間提供保護。冷凍保護劑類之非侷限實例包括糖類，如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘露糖、及乳糖；聚合物類，如聚葡糖（dextran）、羥乙基澱粉、及聚乙二醇；界面活性劑類，如聚山梨醇酯類（如PS-20或PS-80）；以及胺基酸，如甘胺酸、精胺酸、白胺酸、及絲胺酸。通常使用在生物系統中表現出低毒性的冷凍保護劑。
在一具體實施例中，將凍乾保護劑加入本文所述之醫藥組合物。本文中使用的「凍乾保護劑」乙詞包括在冷凍乾燥期間或脫水過程中（一次與二次冷凍乾燥循環）為抗體提供安定性的試劑，其係藉由提供非晶形玻璃狀基質，並通過氫鍵與抗體表面結合，從而在乾燥過程中取代去除的水分子。此有助於最小化凍乾循環過程中的產品降解，並改進長期產品安定性。凍乾保護劑類之非侷限實例包括糖類，如蔗糖或海藻糖；胺基酸，如麩胺酸鈉、非晶形甘胺酸或組胺酸；甲基胺，如甜菜鹼（betaine）；a 溶致鹽（lyotropic salt），如硫酸鎂；多元醇，如三元或更高級糖醇類，如丙三醇（glycerin）、赤藻糖醇（erythritol）、甘油、阿拉伯糖醇（arabitol）、木糖醇、山梨糖醇、及甘露醇；丙二醇；聚乙二醇；普朗尼克斯（pluronics）；以及其結合物。凍乾保護劑添加至醫藥組合物中的量，通常是在凍乾該醫藥組合物時不造成無法接受之品系降解的量。
在一些具體實施例中，醫藥組合物包括增積劑。本文中使用的「增積劑」乙詞包括提供冷凍乾燥產品結構而不與藥學產品直接交互作用的試劑。除了提供醫藥上雅致之餅狀物增積劑類以外，其亦可在改善崩潰溫度（collapse temperature）、提供凍融保護、及增進長期保存的品系安定性方面賦予有用的品質。增積劑類之非侷限實例包括甘露醇、甘胺酸、乳糖、及蔗糖。增積劑類可為結晶形（如甘胺酸、甘露醇、或氯化鈉）或無定形（如聚葡糖、羥乙基澱粉），且通常以0.5%至10%的量用於製劑中。
彼等描述於諸如Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.（1980）中之其他醫藥上可接受載體、賦形劑、或安定劑亦可涵蓋在本文所述之醫藥組合物中，前提是其不會不利地影響藥物成分之所需特性。本文中使用的「醫藥上可接受載體」意指與藥學投予兼容的任何及所有溶劑、分散介質、塗料、抗菌與抗真菌劑、及等張與吸收延遲劑。此類介質與試劑在藥學活性物質中之用途為本領域已知。可接受之載體、賦形劑、或安定劑的使用劑量與濃度對接受體無毒，且包括：額外的緩衝劑；防腐劑；助溶劑；抗氧化劑，包括抗壞血酸與甲硫胺酸；螯合劑如EDTA；金屬錯合物（如鋅蛋白錯合物）；生物可降解聚合物，如聚酯類；成鹽相對離子，如鈉、多元糖醇；胺基酸類，如丙胺酸、甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、白胺酸、2-苯丙胺酸、麩胺酸、及蘇胺酸；或者有機糖類或糖醇類，如乳糖醇、水蘇糖、甘露糖、山梨糖、木糖、核糖、核糖醇、肌初始糖、肌初始醇、半乳糖、半乳糖醇、甘油、環糖醇類（如肌醇）、聚乙二醇；含硫還原劑，如尿素、穀胱甘肽、硫辛酸、硫代乙醇酸鈉、硫代甘油、[α]-單硫甘油、及硫代硫酸鈉；低分子量蛋白，如人類血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠、或其他免疫球蛋白；以及親水性聚合物類，如聚乙烯吡咯烷酮。
在一些具體實施例中，醫藥組合物可為適合靜脈、肌肉、結膜、經皮、腹腔、及/或皮下投予的溶液。
醫藥組合物可進一步包含本技術領域中已知之普通賦形劑與載體。在注射液方面，醫藥組合物可進一步包含冷凍保護劑類、凍乾保護劑類、界面活性劑類、增積劑類、抗氧化劑類、安定劑類、及醫藥上可接受載體。取得雙特異性抗體的方法
一般而言，欲克服單株與單價抗體治療劑僅可靶向單一抗原的侷限，或欲克服單價抗體治療劑組合的侷限，已致力於利用雙特異性抗體形式的多種抗原靶向能力。此類攜帶超過一種特異性的抗體在生物技術上令人感興趣，且在作為新穎治療方法的治療劑上具有巨大潛力（Fischer and Leger, Pathobiology 2007；74:3-14；Morrison SL Nature Biotechnol 2007；25:1233-1234）。雙特異性抗體的優勢在於其容許多重靶向、其增加治療潛力、其解決生物系統的冗餘、及其通過諸如重新靶向及/或增加特異性的能力提供新的作用機制。如所驗證的，單一治療標靶標變得越來越耗竭，而雙特異性抗體的組合為治療劑與應用提供新穎且廣泛的靶標視野。
有數個策略用於生成此類雙特異性分子，且彼等已知策略之任一者可用於產生IXa/X骨架。彼等已知策略包括諸如抗體片段的化學交聯、強制的雜二聚化、四體瘤技術、抗體片段經由多胜肽連接子的融合、及使用單一結構域抗體等策略。重組型DNA技術的可用性導致產生大量的雙特異性抗體形式（參見如，Ridgway JB et al.（1996）Protein Eng 9 : 617-621）。近來將連接子與突變導入抗體的不同區域中，迫使雜二聚體形成或將不同結合部分連接成單一分子。彼等方法在下方進一步描述，且所討論之格式如WO 2012/023053 A2之圖1所示。
化學交聯反應 。使用化學交聯劑共價連接二個抗體在概念上是直接的方法。利用雙功能試劑，將酵素切割之個別親代抗體所產生的或通過重組型技術所產生的抗體片段偶接（Glennie MJ et al., J Exp Med 1992；175:217-225）。
四體瘤 。將二個融合瘤（hybridoma）或一個融合瘤分別融合B淋巴細胞，可產生四體瘤與三體瘤（triomas）（Suresh MR et al., Methods Enzymol 1986；121: 210-228）。在此情況下，同時表現二個重鏈與二個輕鏈，導致10個抗體結合物的隨機組裝，且所需之雙特異性抗體（bsAb）僅佔分泌抗體之一小部分。必須結合層析技術，以純化bsAb。
重組型雙特異性抗體 。大多數雙特異性抗體形式皆由基因工程改造技術產生，其以經由多胜肽連接子連接的抗體片段（如scFv或Fab片段）作為建構塊元（building blocks）。依據連接之抗體片段格式，包括串聯的scFv（BiTE）、雙抗體、及串聯之雙抗體（Kipriyanov SM. Methods Mol Biol 2003；207:323-333；Korn T et al, Int J Cancer 2002；100:690-697）。彼等建構塊元可進一步連接至抗體Fc區，引發「IgGlike」分子。彼等形式包括雙抗體-Fc、串聯之雙抗體-CH3、（scFv）4-Fc、及DVD-Ig（Lu D et al, J Immunol Methods 2003；279: 219-232 ；Lu D et al, J Biol Chem 2005；280: 19665-19672 ；Lu D et al, J Biol Chem 2004；279: 2856-2865；Wu C et al., Nat Biotechnol 2007 25:1290-7）。
已有探索基於迫使二個重鏈雜二聚化的策略。第一個方法稱作「旋入孔法（knob into hole）」，旨在藉由將突變導入CH3結構域以改良接觸界面，迫使二個不同的IgG重鏈配對（Ridgway JB et al., Protein Eng 1996；9 : 617-621）。在一個鏈上導入帶有大型側鏈的胺基酸，以製造「旋鈕」。反之，以具有短型側鏈的胺基酸取代大型胺基酸，以在其他CH3結構域中製造「孔」。藉由共同表現彼等二個重鏈，對比同二聚體形成（「孔-孔」或「旋鈕-旋鈕」），觀察到超過90%的雜二聚體形成（「旋鈕孔」）。利用鏈交換基因工程結構域（SEED）人類CH3結構域，開發了類似的概念，其以人類IgG與人類IgA序列為基礎（Davis JH et al., 2010, PEDS 23:195-202）。彼等基因工程改造結構域導致形成雜二聚體分子，其可攜帶二個不同特異性。近來揭示了改進「旋入孔」的方法，以解決輕鏈配對問題（WO 2009/080253 A1）。此方法除了「旋入孔」突變以外，還涉及一些輕鏈與重鏈結構域的交換。
單一結構域為主之抗體 。駱駝（美洲駝與駱駝）與軟骨魚類（護士鯊（nurse sharks））的免疫系統以單一V結構域融合至Fc，證實單一結構域可賦予結合至抗原的高親和力。駱駝、鯊魚、及甚而人類V結構域代表抗體的替代品，但其亦用於產生bsAbs。其可重定格式為典型的IgG，其中各臂具有經由其VH或VL結構域結合二個靶標的潛力。此單一結構域-IgG具有與IgG相似的生化特性，並可解決其他bsAbs形式在生產與異質性方面遇到的問題。
前述雙特異性抗體形式之代表如WO 2012/023053 A2之圖1所示。彼等形式代表之一些來自Fischer and Leger, Pathobiology 2007；74:3-14；以及 Morrison SL Nature Biotechnol 2007；25:1233-1234。產生雙特異性與雙價抗體的改進方法
在一些具體實施例中，IXa/X骨架由二個拷貝的相同重鏈多胜肽組成，其中第一輕鏈可變結構域融合至恆定κ結構域且第二輕鏈可變結構域融合至恆定λ結構域（參見，Delves et al., 2017. Roitt’s Essential Immunology 13th edition. ISBN: 978-1-118-41577-1中κ與λ輕鏈的描述）。各抗原結合位點表現出不同特異性，其中重鏈與輕鏈兩者皆有貢獻。輕鏈可變結構域可為λ或κ家族，且可分別融合至λ與κ恆定結構域。然而，亦可藉由將κ輕鏈可變結構域融合至恆定λ結構域以得到第一特異性及將λ輕鏈可變結構域融合至恆定κ結構域以得到第二特異性，以取得雙特異性抗體（參見，WO 2012/023053 A2之圖3）。本文所述之雙特異性抗體，其依據彼等具體實施例產生，亦稱作IgG κλ（「κλ」為希臘字母，或縮寫的英文子母「KL」）抗體或「KL抗體」。
KL抗體生產方法的關鍵步驟在於鑑定具有相同重鏈可變結構域之不同抗原特異性的二個抗體Fv區（各由可變輕鏈與可變重鏈結構域組成）。有許多描述用於產生單株抗體及其片段的方法（參見如，Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY，在此併入本案以作為參考資料）。完全人類抗體為其中無人類以外物種衍生之序列的抗體分子。此類抗體在此稱作「人類抗體」或「完全人類抗體」；此類人類抗體或完全人類抗體在其胺基酸序列中可包含人工導入的變化。人類單株抗體可利用三體瘤技術；人類B細胞融合瘤技術（參見，Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4 : 72）；以及EBV融合瘤技術製備，以產生人類單株抗體（參見，Cole, et al, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）。可使用人類單株抗體，且可藉由使用人類融合瘤（參見，Cote, et al, 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030）或藉由以艾司坦-巴爾病毒（Epstein Barr Virus）體內轉形至人類B細胞（參見，Cole, et al., 1985 In:MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY , Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）而生產。
單株抗體係藉由諸如以標靶抗原或其免疫原性片段、衍生物、或變體免疫注射動物而產生。或者，動物以轉染一包含編碼標靶抗原核酸分子之載體的細胞免疫注射，使得標靶抗原表現並與轉染細胞的表面結合。有許多產生異種非人類動物的技術為本領域已知。舉例而言，參見，U.S. Pat. No. 6,075,181與No. 6,150,584，其在此併入本案以作為參考資料。
或者，藉由篩選包含抗體或抗原結合位點序列之庫結合至標靶抗原，以取得抗體。此庫係諸如在噬菌體中製備，其中蛋白或胜肽融合至噬菌體殼蛋白，其係表現在經組裝之噬菌體顆粒表面上，且編碼的DNA序列含於噬菌體顆粒之內（亦即「噬菌體顯示庫（phage displayed library）」）。
然後，篩選由骨髓瘤/B細胞融合體產生之融合瘤與標靶抗原的反應性。製備單株抗體，諸如利用融合瘤方法，如Kohler and Milstein, Nature, 256:495（1975）所述之彼等。在融合瘤方法中，小鼠、倉鼠、或其他合適的宿主動物，典型上以誘導淋巴細胞的免疫試劑進行免疫注射，其產生或能產生特異性結合至免疫試劑的抗體。或者，可在體外進行淋巴細胞的免疫注射。
儘管並非絕對不可能，但極為不可能的是，偶然鑑定出具有相同重鏈可變結構域但針對不同抗原的不同抗體。的確，在大多數情況下，重鏈在抗原結合表面上貢獻良多，且在序列上亦變化最大。特別的是，重鏈上的CDR3在序列、長度、及結構上為最多樣化的CDR。因此，對不同抗原具有特異性的二個抗體，幾乎總是帶有不同的重鏈可變結構域。
此侷限可通過使用抗體庫而克服，其中所有庫成員的重鏈可變結構域皆相同，因此多樣性僅限於輕鏈可變結構域。此類庫係描述在，舉例而言，2010年5月20日提申的申請號PCT/US2010/035619，及2010年11月25日公開的PCT公開號WO 2010/135558，及2010年11月23日提申的申請號PCT/US2010/057780，每一者在此皆併入本案以作為參考資料。然而，由於輕鏈可變結構與重鏈可變結構域一起表現，兩個結構域有助於抗原結合。欲進一步促進該過程，可平行使用包含相同重鏈可變結構域之抗體庫及各式各樣的λ可變輕鏈或κ可變輕鏈，以在體外選取針對不同抗原的抗體。此方法使得能鑑定出二個具有共同重鏈的抗體，但一個攜帶λ輕鏈可變結構域且另一個攜帶κ輕鏈可變結構域，其可作為生產雙特異性抗體的建構塊元。雙特異性抗體可為不同型，且其Fc部分可經改良，以改變其對不同Fc受體的結合性質，並以此方式改良抗體的效應子功能及其藥物動力學性質。已經描述許多改良Fc部分的方法，且彼等方法適用於本文所述之骨架模組（參見如，Strohl, WR Curr Opin Biotechnol 2009（6）:685-91；美國專利號6,528,624；PCT/US2009/0191 199，2009年1月9日提申）。
另一個可進行的步驟為優化共同的重鏈與二個不同的輕鏈在單一細胞中的共表現，以容許組裝成雙特異性抗體。若所有多胜肽皆在同一濃度上表現，且組裝得一樣好，以形成抗體分子，則單特異性（相同輕鏈）與雙特異性（二個不同輕鏈）之比率應為50%。然而，不同的輕鏈可能以不同濃度表現，及/或組裝效率不同。因此，本文揭示之方法亦提供調節不同多胜肽的相對表現方式，以補償其固有表現特徵或與共同重鏈組裝的不同傾向。此調節可通過啟動子強度達成，如使用針對不同效率的內部核醣體進入位點（internal ribosome entry sites；IRES）或其他類型的調節元件，其可在轉錄或轉譯濃度上發揮作用，並對mRNA穩定性作用。不同強度之不同啟動子可包括CMV（立即早期巨細胞病毒（Immediate-early Cytomegalovirus virus）啟動子）；EFl- Iα（人類延長因子la-子單元啟動子）；Ubc（人類泛素C啟動子）；SV40（猿猴病毒40啟動子）。從哺乳類動物到病毒來源，皆有不同的IRES提出（參見如，Hellen CU and Sarnow P. Genes Dev 2001 15: 1593-612）。此類IRES的長度與核醣體募集效率可能存在很大差異。此外，可藉由導入多個IRES拷貝，進一步調節活性（Stephen et al. 2000 Proc Natl Acad Sci USA 97: 1536-1541）。亦可藉由對細胞進行多次連續轉染，增加表現一個或另一個輕鏈之個別基因的拷貝數，以改良其相對表現，從而實現表現之調節。在一些具體實施例中，表現之調節亦可應用於本發明蛋白分子的表現。
純化之雙特異性抗體之特徵如WO 2012/023053 A2所述。
本發明無須使用二個具有κ與λ型輕鏈可變結構域的抗體；本文所述之方法容許產生具有一或多個雜交輕鏈的KL抗體，其中λ可變結構域可融合至κ恆定結構域及/或反之κ可變結構域可融合至λ恆定結構域，如WO 2012/023053 A2之圖3所示。表現與純化本發明蛋白分子的方法 表現
多核苷酸可位於表現質體。表現質體可具有本領域普通技術人員已知之任何數量的複製原點（origins）。多核苷酸或表現質體可利用本領域普通技術人員已知之任何數量的方式導入宿主細胞。舉例而言，可使用流動電穿孔系統（flow electroporation system）（如MaxCyte GT®、MaxCyte VLX®、或MaxCyte STX®轉染系統），將多核苷酸或表現質體導入宿主細胞。
多核苷酸序列可含於一質體上，或超過一質體上。舉例而言，在一些情況下，重鏈與輕鏈序列位於同一質體上。在另一實例中，重鏈在一質體上，且輕鏈在另一質體上。在一些具體實施例中，質體的比率為1:1。在一些具體實施例中，質體比率可改變，如1:1、1:5、1:10。在一些具體實施例中，抗體變體質體包含一用於選擇穩定細胞株的選擇標記（selection marker）。在一些具體實施例中，不同選擇標記位於不同質體上。舉例而言，一選擇標記可在重鏈質體上，而另一選擇標記則在輕鏈質體上。
在各具體實施例中，宿主細胞表現核酸。宿主細胞可在足以批次飼養細胞培養的規模或其他大型規模的濃度下表現抗體變體。大規模生產抗體變體的替代方法包括滾瓶培養、生物反應器批次培養、灌注法、及偽灌注法（pseudoperfusion）。在一些具體實施例中，抗體變體蛋白由懸浮培養的細胞產生。在一些具體實施例中，抗體變體蛋白由黏附細胞（adherent cells）產生。生產
抗體變體可利用任何可用的方法生產。舉例而言，利用基因工程改造宿主細胞系統以表現編碼抗體變體的核酸，可重組生產抗體變體。 或者，利用mRNA治療劑或AAV/慢病毒基因療法，可在體內產生抗體變體。
在一些具體實施例中，抗體變體在哺乳類動物細胞中產生。本發明可用之哺乳類動物細胞的非侷限實例包括BALB/c小鼠骨髓瘤株（NSO/1，ECACC No: 85110503）；人類視網膜母細胞（PER.C6，CruCell，Leiden，The Netherlands）；SV40轉形之猴腎CV1株（COS-7，ATCC CRL 1651）；人類胚胎腎株（HEK293或293細胞次選殖以生長在懸浮培養基中，Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977）；人類纖維肉瘤細胞株（如HT1080）；幼倉鼠腎細胞（BHK21，ATCC CCL 10）；中國倉鼠卵巢細胞+/−DHFR（CHO，Urlaub and Chasin，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980），包括CHO EBNA（Daramola O. et al., Biotechnol. Prog., 2014, 30（1）:132-41）與CHO GS（Fan L. et al., Biotechnol. Bioeng. 2012, 109（4）:1007-15；小鼠塞氏細胞（sertoli cells）（TM4，Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980）；猴腎細胞（CV1，ATCC CCL 70）；非洲綠猴腎細胞（VERO-76，ATCC CRL-1 587）；人類子宮頸癌細胞（HeLa，ATCC CCL 2）；犬腎細胞（MDCK，ATCC CCL 34）；水牛鼠肝細胞（BRL 3A，ATCC CRL 1442）；人類肺細胞（W138，ATCC CCL 75）；人類肝細胞（Hep G2，HB 8065）；小鼠乳腺腫瘤（MMT 060562，ATCC CCL51）；TRI細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982）；MRC 5細胞；FS4細胞；以及人類肝癌株（Hep G2）。
在一些具體實施例中，抗體變體由人類細胞產生。在一些具體實施例中，重組型抗體變體係由CHO細胞或HEK細胞或HT1080細胞產生。
在特定具體實施例中，選擇宿主細胞以產生細胞系，其係基於特定優選屬性或在為培養細胞而選擇的特定條件下生長。本領域之技術人員應理解到，基於已知特徵及/或已建立細胞株之性徵（亦即經確認之商用細胞株）或通過經驗評估，可確定彼等屬性。在一些具體實施例中，可選用之細胞係依據其在細胞飼養層上的生長能力。在一些具體實施例中，可選用之細胞係依據其在懸浮培養基中的生長能力。在一些具體實施例中，可選用之細胞係依據其是否如同細胞黏附單層的生長能力。在一些具體實施例中，可選擇優良的轉譯後修飾（如醣化）細胞系。在一些具體實施例中，此類細胞可用於任何組織培養容器或任何經適當黏附基質處理的容器。在一些具體實施例中，適用之黏附基質係選自於由膠原蛋白（如膠原蛋白I、II、II、或IV）、明膠、纖網蛋白、層連結蛋白（laminin）、玻連蛋白（vitronectin）、纖維蛋白原、BD Matrigel™、基底膜基質、硫酸皮膚素蛋白聚醣（dermatan sulfate proteoglycan）、聚-D-離胺酸、及/或其結合物組成之群組。在一些具體實施例中，可選擇黏附的宿主細胞，並在特定生長條件下改良，使其在懸浮培養基中生長。此類改良黏附細胞以生長在懸浮培養基之方法為本領域已知。舉例而言，藉由逐步從生長培養基中隨時間移除動物血清，可使細胞適應於懸浮培養基中的生長。典型上，細胞經基因工程改造以表現重組型抗體變體，其包含編碼本文所述之重組型抗體變體的轉基因（transgene）。細胞可經基因工程改造，並在瞬時或穩定表現系統中表現抗體變體。應理解的是，編碼重組型抗體變體的核酸可包含調節序列、基因控制序列、啟動子、非編碼序列、及/或其他合適序列，以表現重組型抗體變體。典型上，編碼區係可操作地與彼等核酸組分之一或多者連接。
在一些具體實施例中，以批次培養法表現抗體變體。在一些具體實施例中，批次培養期間可為7-14天。在一些具體實施例中，批次培養期間可為14-21天。在一些具體實施例中，抗體變體以灌注培養法表現（每天隨時間收集培養基）。在一些具體實施例中，抗體變體以偽灌注培養法表現（每天在單一時間點收集培養基，並替換新鮮培養基）。在一些具體實施例中，可使用特定飼養方案/培養基，以促進最佳的抗體變體生產（提高聚醣、減少凝集、改進κ/λ抗體比率）。在一些具體實施例中，可控制/維持細胞密度，以促進最佳的抗體變體生產（減少凝集、改進重鏈/輕鏈、改進κ/λ抗體比率）。純化
源自總IgGs的所有多價與三特異性抗體係首先以一個親和性層析步驟純化，其中使用蛋白A樹脂（如Mab Select Sure樹脂，購自GE Healthcare）。以100 mM甘胺酸（pH3.0）進行溶析，並以1M Tris-HCl（pH 9）中和。
針對KL抗體為主之多價抗體，需要二個額外的親和性層析步驟，以分離KL抗體及去除二個單特異性mAbs。利用LambdaFabSelect樹脂（如購自GE Healthcare）純化總IgGs，以去除IgGκκ（亦即包含二個κ型輕鏈的IgG），接著為κ樹脂（如κXL，購自Thermo，或KappaSelect，購自GE Healthcare）以去除IgGλλ（亦即包含二個λ型輕鏈的IgG）。以100 mM甘胺酸（pH 3.0）進行溶析，LambdaFabSelect樹脂在前三個管柱體積之後，暫停10 min，且以100 mM甘胺酸（pH3.5）溶析κ特異性樹脂，隨後以1M Tris-HCl（pH 9）中和。將最終純化之抗體透析至保存緩衝液（20 mM HEPES、150 mM NaCl，pH 6.5）。針對對稱性多價與三特異性抗體（如以β2-GP1或其他三特異性部分進行2乘2s、2乘2s），在蛋白A樹脂之後加上一個額外的純化步驟。第二純化步驟可為SEC管柱（如Hi Prep 16/60 S-300 Hr SEC管柱（17-1167-01））或陶瓷羥磷灰石（Ceramic Hydroxyapatite）（第I型）管柱（HA）。針對本領域之技術人員，亦可使用額外的常規層析法，以達到所需之抗體純度與均質性（如離子交換樹脂、多峰（multimodal）樹脂、或疏水性樹脂）。
在SEC管柱方面，以100kd VivaSpin（P/N 28-9323-63）濃縮蛋白A溶析與中和之抗體，並以約15 mg/mL填入2.5 mL經濃縮之抗體（運行緩衝液為20 mM HEPES、150 mM NaCl，pH 6.5）。依據SDS-PAGE與SEC-HPLC分析所證實之純化抗體的純度與均質性，匯集最終純化之抗體。將最終之匯集池（pool）透析至保存緩衝液（20 mM HEPES、150 mM NaCl，pH 6.5）。針對本領域之技術人員，可使用其他緩衝液交換方法，如除鹽管柱，或超過濾法（ultrafiltration），以達到最終緩衝液保存條件。
在HA方法中，蛋白A純化之抗體在4°C下之dPBS中透析隔夜。將每毫升30 mg的抗體填入管柱中（填充與清洗緩衝液為10 mM Na2 HPO4 pH6.5）。表面中和步驟（其使用25 mM Tris、25mM NaCl、5mM Na2 HPO4 ，pH 7.7）係以5個管柱體積（CV）進行，接著抗體以溶析1（10CV步驟，其使用100%溶析緩衝液：2M NaCl、10 mM Na2 HPO4 、100 mM MES，pH 6.5）與溶析2（10CV梯度，其使用100%溶析緩衝液：500 mM Na2 HPO4 ，pH 6.5）進行溶析。依據SDS-PAGE與SEC-HPLC分析所證實之純化抗體的純度與均質性，匯集最終純化之抗體。將最終之匯集池透析至保存緩衝液（20 mM HEPES、150 mM NaCl，pH 6.5）。針對本領域之技術人員，可使用其他緩衝液交換方法，如除鹽管柱，或超過濾法，以達到最終緩衝液保存條件。
在一方面，本發明包含下列各項。彼等項可結合上述態樣或具體實施例之任一者。
1.    一具有促凝血活性的蛋白分子，其包含： （i）一包含第一抗原結合位點與第二抗原結合位點的骨架模組；以及 （ii）至少一包含第三抗原結合位點的第一結合模組； 其中抗原結合位點之至少一者結合至因子IXa且抗原結合位點之至少一者結合至因子X。
項1意指一具有三個抗原結合位點的蛋白分子。抗原結合位點之一者之標靶無特別侷限，只要與標靶的結合容許促凝血活性即可。
2.    如項1之蛋白分子，其中第一結合模組通過連接子連接至骨架模組，且選擇性地，任何其他結合模組係或皆通過連接子連接至骨架模組。
項2定義了第一結合模組與任何一或多個其他結合模組通過連接子連接至骨架模組。上面揭示了可用於此具體實施例及任何後續具體實施例之可能的連接子。
3.    如項1之蛋白分子，其中第一結合模組係插入骨架模組之圈環區之內，且選擇性地，任何其他結合模組係或皆插入骨架模組之圈環區之內。
項3定義了第一結合模組與任何一或多個其他結合模組係插入骨架模組之圈環區之內。上面揭示了可能的圈環區。彼等圈環區可由其適合插入胜肽適體。
4.    如項1-3中任一項之蛋白分子，其中第一抗原結合位點 結合至因子IXa，且第二抗原結合位點結合至因子X。
項4定義了骨架模組為前面論及之「IXa/X」骨架。彼等骨架模組本身為雙特異性。
5.    如項1-4中任一項之蛋白分子，其中第一結合模組之第三抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
在項5中，定義了第一結合模組之第三抗原結合位點的可能標靶。結合模組可使得蛋白分子具有三價雙特異性或三價三特異性。
6.    如項5之蛋白分子，其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
項6意指蛋白分子為三價三特異性。在此具體實施例中，結合模組提供第三價（third valency）與特異性。此蛋白分子類似圖2的，除了亦涵蓋僅包含一個結合模組之蛋白分子以外。
7.    如項5之蛋白分子，其中第三抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
項7意指蛋白分子為三價雙特異性。在此具體實施例中，結合模組提供第三價。此蛋白分子將類似於圖1中的「3乘1」或「1乘3」分子，除了亦涵蓋僅包含一個結合模組之蛋白分子以外。
8.    如項7之蛋白分子，其中第一結合模組為scFv或scFab。
項8進一步定義了包含IXa/X骨架之三價雙特異性 具體實施例的第一結合模組。
9.    如項8之蛋白分子，其中第一結合模組包含： （i）     HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）   表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在項9中，第一結合模組定義為包含結合臂（binding arms）之CDRs，其經證實可結合至因子IXa或因子X。
10.  如項9之蛋白分子，其中第一結合模組為scFv且包含： （i）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
在項10中，第一結合模組定義為包含可變結構域序列，其經證實可結合至因子IXa或因子X。
11.  如項9-10中任一項之蛋白分子，其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
在項11中，CDRs侷限於實例中蛋白分子所使用的特異性結合臂。具有「W」之臂代表結合至因子X，且具有「V」之臂代表結合至因子IXa。
12.  如項6之蛋白分子，其中第一結合模組為scFv或scFab。
項12進一步定義了包含IXa/X骨架之三價三特異性 具體實施例的第一結合模組。
13.  如項12之蛋白分子，其中第一結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： VL結構域為SEQ ID NO: 184且VH結構域為SEQ ID NO: 187， VL結構域為SEQ ID NO: 185且VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 VL結構域為SEQ ID NO: 186且VH結構域為SEQ ID NO: 189。
在項13中，第一結合模組係通過序列資訊進一步定義。SEQ ID NO: 184與SEQ ID NO: 187係含於巴維昔單抗，其已知結合β2-醣蛋白I之結構域II。SEQ ID NO: 185與SEQ ID NO: 188係含於PS72，其已知結合磷脂絲胺酸（Bujak et al., 2015. Invest New Drugs. 33（4）:791-800）。SEQ ID NO: 186與SEQ ID NO: 189係含於抗LIBS抗體，其已知結合GPIIbIIIa（Stoll et al., 2007. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27（5）:1206-12）。
14.  如項13之蛋白分子，其中第一結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
在項14中，第一結合模組係由特定序列定義，其中SEQ ID NO:190為巴維昔單抗、SEQ ID NO: 191為PS72、及SEQ ID NO: 192為抗LIBS抗體。
15.  如項6之蛋白分子，其中第一結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
在項15中，第一結合模組為β2-醣蛋白I之結構域V，其已知結合磷脂絲胺酸。
16.  如項1-15中任一項之蛋白分子，其中骨架模組為抗體或其二價片段。
17.  如項16之蛋白分子，其中骨架模組為抗體。
18.  如項1-17中任一項之蛋白分子，其中骨架模組包含二個重鏈及二個輕鏈。
19.  如項18之蛋白分子，其中一輕鏈包含融合至κ恆定結構域之輕鏈可變結構域，且其他輕鏈包含融合至λ恆定結構域之可變輕鏈結構域。
在項16-19中，「IXa/X」骨架係由許多結構特徵定義。特別的是，項19將「IXa/X」骨架侷限在κλ抗體。
20.  如項18-19中任一項之蛋白分子，其中骨架模組包含： （i）     二個重鏈，其包含相同的CDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）   一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （iii）一個輕鏈，其包含表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在項20中，骨架模組定義為包含結合臂之CDR序列，其經證實結合至因子IXa或因子X。
21.  如之蛋白分子項20，其中（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在項21中，描述了特異性因子X結合臂序列。彼等臂序列係用於實例中指定的蛋白分子。
22.  如項20-21中任一項之蛋白分子，其中（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在項22中，描述了特異性因子IXa結合臂序列。彼等臂序列係用於實例中指定的蛋白分子。
23.  如項20-22中任一項之蛋白分子，其中（ii）與（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3分別為表1與表2a揭示之 W88與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W127與V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， V149與W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W128與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W128與V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W126與V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W83與V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W88與V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或 W83與V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
在項22中，描述了特異性因子IXa結合臂序列（「V」序列）與特異性因子X結合臂序列（「W」序列）的組合。彼等臂序列組合係用於實例中指定的蛋白分子。
24.  如項18-19中任一項之蛋白分子，其中骨架模組包含： （i）     二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）   一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）一個輕鏈，其包含表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。
在項24中，骨架模組係定義為包含結合臂之可變結構域序列，其經證實可結合至因子IXa或因子X。
25.  如項24之蛋白分子，其中（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，以及 （iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。
在項25中，描述了特異性因子IXa結合臂序列（「V」序列）與特異性因子X結合臂序列（「W」序列）。彼等臂序列係用於實例中指定的蛋白分子。
26.  如項24-25中任一項之蛋白分子，其中（ii）與（iii）之VL分別為表3與表4a揭示之W88與V198之VL， W127與V202之VL， V149與W128之VL， W128與V198之VL， W128與V141之VL， W162與V204之VL， W83與V217之VL， W88與V90之VL，或 W83與V43之VL。
在項26中，描述了特異性因子IXa結合臂序列（「V」序列）與特異性因子X結合臂序列（「W」序列）的組合。彼等臂序列組合係用於實例中指定的蛋白分子。
27.  如項1-3中任一項之蛋白分子，其中第一抗原結合位點與第二抗原結合位點之每一者結合至因子IXa，或第一抗原結合位點與第二抗原結合位點之每一者結合至因子X。
在項27中，蛋白分子包含單特異性骨架，其中骨架模組之抗原結合位點兩者結合至因子IXa或因子X。具有僅一個抗原結合位點之僅一個結合模組之單特異性骨架的具體實施例可僅為雙特異性三價 ，係因蛋白分子必須包含至少一個結合至因子IXa的抗原結合位點與一個結合至因子X的抗原結合位點。
28.  如項27之蛋白分子，其中第三抗原結合位點結合至因子IXa或因子X。
在項28中，第一結合模組的抗原結合位點結合至因子IXa或因子X。此蛋白分子之結構與圖1所示之「2乘2」拓撲結構類似，且此具體實施例所包含的僅單一結合模組之蛋白分子除外。可利用諸如將因子X結合scFv融合至包含κ恆定結構域之因子IXa結合輕鏈的C端，並使用一包含λ恆定結構域以結合至因子IXa的第二輕鏈，實現此類拓撲結構。
29.  如項28之蛋白分子，其中第一結合模組為scFv或scFab。
項29-32隨後以類似於項8-11的方式定義了結合至因子IXa或因子X的第一結合模組。
30.  如項29之蛋白分子，其中第一結合模組包含： （i）     HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）   表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，
31.  如項30之蛋白分子，其中第一結合模組包含： （i）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
32.  如項30-31中任一項之蛋白分子，其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
33.  如項27-32中任一項之蛋白分子，其中骨架模組為抗體或其二價片段。
在項33-41中，藉由合併越來越多的結構與序列訊息，進一步定義單特異性骨架。前面描述的因子IXa與因子X結合臂亦在彼等項中描述。
34.  如項33之蛋白分子，其中骨架模組為抗體。
35.  如項27-34中任一項之蛋白分子，其中骨架模組包含二個重鏈及二個輕鏈。
36.  如項35之蛋白分子，其中骨架模組包含： （i）     二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3；以及 （ii）   二個輕鏈，各包含表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
37.  如項36之蛋白分子，其中二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
38.  如項36之蛋白分子，其中二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
欲避免任何疑問，項36-38中任一項之具體實施例為其中的二個輕鏈包含相同的LCDR1、LCDR2、及LCDR3序列的情形。
39.  如項36之蛋白分子，其中骨架模組包含： （i）     二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）   二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。
40.  如項39之蛋白分子，其中二個輕鏈之每一者之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL。
41.  如項39之蛋白分子，其中二個輕鏈之每一者之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。
欲避免任何疑問，項39-41中任一項之具體實施例為其中的二個輕鏈包含相同的VL序列的情形。
42.  如項1-41中任一項之蛋白分子，其中蛋白分子進一步包含至少一包含第四抗原結合位點的第二結合模組。
項42描述一具體實施例，其中蛋白分子包含第一與第二結合模組。此具體實施例涵蓋之蛋白分子包括圖1與圖2所示之四價蛋白分子。如圖1與圖2所示，第二結合模組有助於蛋白分子的四價，亦有助於使蛋白分子成為三或四特異性。
項42描述一具體實施例，其中第一與第二結合模組相同，且項43-53使得第二結合模組不同於第一結合模組（使其四特異性）。
43.  如項42之蛋白分子，其中第二結合模組與第一結合模組相同。
44.  如項42之蛋白分子，其中第四抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
45.  如項44之蛋白分子，其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
項45亦涵蓋三特異性多價，其包含如圖3所示之單特異性骨架。其可利用諸如包含κ恆定結構域之輕鏈與包含λ恆定結構域之輕鏈而實現。從兩個方面來說，兩個輕鏈可包含結合至因子IXa的LCDR，但一個輕鏈可能是對因子X特異的scFv融合，而另一個輕鏈可能是融合至磷脂絲胺酸的scFv。舉例而言，兩個輕鏈可包含結合至因子IXa的LCDRs，其中一個輕鏈可融合至對因子X具有特異性的scFv且另一個輕鏈可融合至對磷脂絲胺酸具有特異性的scFv。
46.  如項44之蛋白分子，其中第四抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
47.  如項46之蛋白分子，其中第二結合模組為scFv或scFab。
48.  如項47之蛋白分子，其中第二結合模組包含： （i）     HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）   表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
49.  如項48之蛋白分子，其中第二結合模組為scFv且包含： （i）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
50.  如項45之蛋白分子，其中第二結合模組為scFv或scFab。
51.  如項50之蛋白分子，其中第二結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： VL結構域為SEQ ID NO: 184且VH結構域為SEQ ID NO: 187， VL結構域為SEQ ID NO: 185且VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 VL結構域為SEQ ID NO: 186且VH結構域為SEQ ID NO: 189。
52.  如項51之蛋白分子，其中第二結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
53.  如項45之蛋白分子，其中第二結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
54.  如項42-53中任一項之蛋白分子，其中蛋白分子進一步包含至少一包含第五抗原結合位點的第三結合模組。
項54描述一具體實施例，其中蛋白分子包含第一、第二、及第三結合模組。此具體實施例涵蓋之蛋白分子包括五價蛋白分子。第三結合模組有助於蛋白分子的五價，且亦有助於使蛋白分子成為三、四、或五特異性。
項55使得形成具體實施例，其中三個結合模組相同，或三個結合模組中僅二個相同。項56-65使得第三結合模組不同於第一與第二結合模組。
55.  如項54之蛋白分子，其中第三結合模組與第一結合模組相同。
56.  如項54之蛋白分子，其中第五抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
57.  如項56之蛋白分子，其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
58.  如項56之蛋白分子，其中第五抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
59.  如項58之蛋白分子，其中第三結合模組為scFv或scFab。
60.  如項59之蛋白分子，其中第三結合模組包含： （i）     HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）   表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如項60之蛋白分子，其中第三結合模組為scFv且包含： （i）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
62.  如項57之蛋白分子，其中第三結合模組為scFv或scFab。
63.  如項62之蛋白分子，其中第三結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： VL結構域為SEQ ID NO: 184且VH結構域為SEQ ID NO: 187， VL結構域為SEQ ID NO: 185且VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 VL結構域為SEQ ID NO: 186且VH結構域為SEQ ID NO: 189。
64.  如項63之蛋白分子，其中第三結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
65.  如項57之蛋白分子，其中第三結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
66.  如項54-65中任一項之蛋白分子，其中蛋白分子包含至少一包含第六抗原結合位點的第四結合模組。
項66描述一具體實施例，其中蛋白分子包含第一、第二、第三、及第四結合模組。此具體實施例涵蓋之蛋白分子包括六價蛋白分子。第四結合模組有助於蛋白分子之六價，且亦有助於使蛋白分子成為三、四、或五特異性。六價三特異性蛋白分子之實例如圖3所示。
項67使得形成具體實施例，其中四個結合模組相同，且項68使得在具體實施例中，舉例而言，第一與第三結合模組相同，且第一與第二結合模組相同，如圖3所示。項69-78使得第四結合模組不同於第一、第二、及第三結合模組。
67.  如項66之蛋白分子，其中第四結合模組與第一結合模組相同。
68.  如項66之蛋白分子，其中第四結合模組與第三結合模組相同。
69.  如項66之蛋白分子，其中第六抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
70.  如項69之蛋白分子，其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
71.  如項69之蛋白分子，其中第六抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
72.  如項71之蛋白分子，其中第四結合模組為scFv或scFab。
73.  如項72之蛋白分子，其中第四結合模組包含： （i）     HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）   表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如項73之蛋白分子，其中第四結合模組為scFv且包含： （i）VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
75.  如項70之蛋白分子，其中第四結合模組為scFv或scFab。
76.  如項75之蛋白分子，其中第四結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： VL結構域為SEQ ID NO: 184且VH結構域為SEQ ID NO: 187， VL結構域為SEQ ID NO: 185且VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 VL結構域為SEQ ID NO: 186且VH結構域為SEQ ID NO: 189。
77.  如項76之蛋白分子，其中第四結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
78.  如項70之蛋白分子，其中第四結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
79.  如項66-78中任一項之蛋白分子，其中蛋白分子包含至少一包含第七抗原結合位點的第五結合模組。
80.  如項79之蛋白分子，其中蛋白分子包含至少一包含第八抗原結合位點的第六結合模組。
81.  如項79-80中任一項之蛋白分子，其中第七及/或第八抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
項79-81容許進一步之結合模組。然而，可連接至骨架模組的結合模組數量並無特別侷限，且可從本文揭示內容得出各種不同種類的拓撲結構。圖4提供進一步之示例性拓撲結構，且亦涵蓋於本發明之中。
82.  一醫藥組合物，其包含如項1-81中任一項之蛋白分子及醫藥上可接受載體及/或稀釋劑。
83.  如項1-81中任一項之蛋白分子，或如項82之醫藥組合物，以用作藥劑。
84. 如項1-81中任一項之蛋白分子或如項82之醫藥組合物，以在治療及/或預防出血性疾病之方法中使用，其中病患或動物係投予一治療上有效量之蛋白分子或醫藥組合物。
85.  如項84之蛋白分子或醫藥組合物之用途，其中出血性疾病為A型血友病或後天性血友病（acquired hemophilia）。
在進一步之態樣中，本發明包含下列各項。彼等項可結合上述態樣或具體實施例之任一者。
1.    一具有促凝血活性的蛋白分子，其包含： （i）     一包含第一抗原結合位點與第二抗原結合位點的骨架模組；以及 （ii）   至少一包含第三抗原結合位點的第一結合模組； 其中抗原結合位點之至少一者結合至因子IXa且抗原結合位點之至少一者結合至因子X。
2.    如項1之蛋白分子，其中第一結合模組通過連接子連接至骨架模組，且選擇性地，任何其他結合模組係或皆通過連接子連接至骨架模組。
3.    如項1之蛋白分子，其中第一結合模組係插入骨架模組之圈環區之內，且選擇性地，任何其他結合模組係或皆插入骨架模組之圈環區之內。
4.    如項1-3中任一項之蛋白分子，其中第一抗原結合位點 結合至因子IXa，且第二抗原結合位點結合至因子X。
5.    如項1-4中任一項之蛋白分子，其中第一結合模組之第三抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
6.    如項5之蛋白分子，其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
7.    如項5之蛋白分子，其中第三抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
8.    如項7之蛋白分子，其中第一結合模組為scFv或scFab。
9.    如項8之蛋白分子，其中第一結合模組包含： （i）     HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）   表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
10.  如項9之蛋白分子，其中第一結合模組為scFv且包含： （i）     VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）   VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
11.  如項9-10中任一項之蛋白分子，其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
12.  如項5或6之蛋白分子，其中第一結合模組為scFv或scFab。
13.  如項12之蛋白分子，其中第一結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： VL結構域為SEQ ID NO: 184且VH結構域為SEQ ID NO: 187， VL結構域為SEQ ID NO: 185且VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 VL結構域為SEQ ID NO: 186且VH結構域為SEQ ID NO: 189。
14.  如項13之蛋白分子，其中第一結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
15.  如項5或6之蛋白分子，其中第一結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
16.  如項1-15中任一項之蛋白分子，其中骨架模組為抗體或其二價片段。
17.  如項16之蛋白分子，其中骨架模組為抗體。
18.  如項1-17中任一項之蛋白分子，其中骨架模組包含二個重鏈及二個輕鏈。
19.  如項18之蛋白分子，其中骨架模組的一個輕鏈包含融合至κ恆定結構域之輕鏈可變結構域，且骨架模組的其他輕鏈包含融合至λ恆定結構域之可變輕鏈結構域。
20.  如項18-19中任一項之蛋白分子，其中骨架模組包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的CDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）     一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （iii）   一個輕鏈，其包含表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
21.  如項20之蛋白分子，其中（ii）之LCDR1、LCDR2、及LDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
22.  如中任一項之蛋白分子項20-21，其中（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
23.  如項20-22中任一項之蛋白分子，其中（ii）與（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR 3分別為表1與表2a揭示之 W88與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W127與V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， V149與W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W128與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W128與V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W126與V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W83與V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W88與V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或 W83與V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
24.  如項18-19中任一項之蛋白分子，其中骨架模組包含： （i）     二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）   一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）一個輕鏈，其包含表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。
25.  如項24之蛋白分子，其中（ii）之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，以及 （iii）之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。
26.  如項24-25中任一項之蛋白分子，其中（ii）與（iii）之VL分別為表3與表4a揭示之W88與V198之VL， W127與V202之VL， V149與W128之VL， W128與V198之VL， W128與V141之VL， W162與V204之VL， W83與V217之VL， W88與V90之VL，或 W83與V43之VL。
27.  如項1-3中任一項之蛋白分子，其中第一抗原結合位點與第二抗原結合位點之每一者結合至因子IXa，或第一抗原結合位點與第二抗原結合位點之每一者結合至因子X。
28.  如項27之蛋白分子，其中第三抗原結合位點結合至因子IXa或因子X。
29.  如項28之蛋白分子，其中第一結合模組為scFv或scFab。
30.  如項29之蛋白分子，其中第一結合模組包含： （i）  HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）     表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如項30之蛋白分子，其中第一結合模組包含： （i）     VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）   VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
32.  如項30-31中任一項之蛋白分子，其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為源自表1與表2a揭示之V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
33.  如項27-32中任一項之蛋白分子，其中骨架模組為抗體或其二價片段。
34.  如項33之蛋白分子，其中骨架模組為抗體。
35.  如項27-34中任一項之蛋白分子，其中骨架模組包含二個重鏈及二個輕鏈。
36.  如項35之蛋白分子，其中骨架模組包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
37.  如項36之蛋白分子，其中二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W126之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
38.  如項36之蛋白分子，其中二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2a揭示之V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
39.  如項36之蛋白分子，其中骨架模組包含： （i）  二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii）     二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。
40.  如項39之蛋白分子，其中二個輕鏈之每一者之VL為表3揭示之W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL。
41.  如項39之蛋白分子，其中二個輕鏈之每一者之VL為表4a揭示之V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。
42.  如項1-41中任一項之蛋白分子，其中蛋白分子進一步包含至少一包含第四抗原結合位點的第二結合模組。
43.  如項42之蛋白分子，其中第二結合模組與第一結合模組相同。
44.  如項42之蛋白分子，其中第四抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
45.  如項44之蛋白分子，其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
46.  如項44之蛋白分子，其中第四抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
47.  如項46之蛋白分子，其中第二結合模組為scFv或scFab。
48.  如項47之蛋白分子，其中第二結合模組包含： （i）  HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）     表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
如項48之蛋白分子，其中第二結合模組為scFv且包含： （i）     VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）   VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
50.  如項44或45之蛋白分子，其中第二結合模組為scFv或scFab。
51.  如項50之蛋白分子，其中第二結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： VL結構域為SEQ ID NO: 184且VH結構域為SEQ ID NO: 187， VL結構域為SEQ ID NO: 185且VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 VL結構域為SEQ ID NO: 186且VH結構域為SEQ ID NO: 189。
52.  如項51之蛋白分子，其中第二結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
53.  如項44或45之蛋白分子，其中第二結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
54.  如項42-53中任一項之蛋白分子，其中蛋白分子進一步包含至少一包含第五抗原結合位點的第三結合模組。
55.  如項54之蛋白分子，其中第三結合模組與第一結合模組相同。
56.  如項54之蛋白分子，其中第五抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
57.  如項56之蛋白分子，其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
58.  如項56之蛋白分子，其中第五抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
59.  如項58之蛋白分子，其中第三結合模組為scFv或scFab。
60.  如項59之蛋白分子，其中第三結合模組包含： （i）  HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）     表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
61.  如項60之蛋白分子，其中第三結合模組為scFv且包含： （i）     VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）   VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
62.  如項56或57之蛋白分子，其中第三結合模組為scFv或scFab。
63.  如項62之蛋白分子，其中第三結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： VL結構域為SEQ ID NO: 184且VH結構域為SEQ ID NO: 187， VL結構域為SEQ ID NO: 185且VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 VL結構域為SEQ ID NO: 186且VH結構域為SEQ ID NO: 189。
64.  如項63之蛋白分子，其中第三結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
65.  如項56或57之蛋白分子，其中第三結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
66.  如項54-65中任一項之蛋白分子，其中蛋白分子包含至少一包含第六抗原結合位點的第四結合模組。
67.  如項66之蛋白分子，其中第四結合模組與第一結合模組相同。
68.  如項66之蛋白分子，其中第四結合模組與第三結合模組相同。
69.  如項66之蛋白分子，其中第六抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
70.  如項69之蛋白分子，其中磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
71.  如項69之蛋白分子，其中第六抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
72.  如項71之蛋白分子，其中第四結合模組為scFv或scFab。
73.  如項72之蛋白分子，其中第四結合模組包含： （i）  HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）     表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
74.  如項73之蛋白分子，其中第四結合模組為scFv且包含： （i）  VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）     VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2a揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
75.  如項69或70之蛋白分子，其中第四結合模組為scFv或scFab。
76.  如項75之蛋白分子，其中第四結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： VL結構域為SEQ ID NO: 184且VH結構域為SEQ ID NO: 187， VL結構域為SEQ ID NO: 185且VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 VL結構域為SEQ ID NO: 186且VH結構域為SEQ ID NO: 189。
77.  如項76之蛋白分子，其中第四結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
78.  如項69或70之蛋白分子，其中第四結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
79.  如項66-78中任一項之蛋白分子，其中蛋白分子包含至少一包含第七抗原結合位點的第五結合模組。
80.  如項79之蛋白分子，其中蛋白分子包含至少一包含第八抗原結合位點的第六結合模組。
81.  如項79-80中任一項之之蛋白分子，其中第七及/或第八抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
82.  一醫藥組合物，其包含如項1-81中任一項之蛋白分子及醫藥上可接受載體及/或稀釋劑。
83.  如項1-81中任一項之蛋白分子，或如項82之醫藥組合物，以用作藥劑。
84. 如項1-81中任一項之蛋白分子或如項82之醫藥組合物，以在治療及/或預防出血性疾病之方法中使用，其中病患或動物係投予一治療上有效量之蛋白分子或醫藥組合物。
85.  如項84之蛋白分子或醫藥組合物之用途，其中出血性疾病為A型血友病或後天性血友病。醫療方法
本發明亦提供本發明蛋白分子或醫藥組合物，以用作藥劑。此外，本發明提供本發明蛋白分子或醫藥組合物，以在治療及/或預防出血性疾病之方法中使用，其中病患或動物係投予一治療上有效量之蛋白分子。
亦提供一治療及/或預防出血性疾病的方法，其中病患或動物係投予一治療上有效量的本發明蛋白分子或醫藥組合物。此外，本發明提供本發明蛋白分子或醫藥組合物之用途，用於製造治療及/或預防出血性疾病之藥劑。
在各個方面，凝血或出血性疾病係因缺乏凝血因子所引起。本領域之技術人員將理解到，與缺乏凝血因子相關的凝血或出血性疾病類型。在一些方面，凝血或出血性疾病可為血友病或馮威里氏症（von Willebrand disease）。在另一方面，凝血或出血性疾病為A型血友病或後天性血友病。在一特定方面，凝血或出血性疾病為A型血友病。在另一方面，凝血或出血性疾病為後天性血友病，其中受試者不再產生FVIII。
在各個方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物可投予患有輕度A型血友病、中度A型血友病、或重度A型血友病之受試者。在另一方面，本文揭示之蛋白分子或醫藥組合物可投予因子血漿濃度為6%至30%、2%至5%、或1%或以下的受試者。
在一些方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物可投予患有A型血友病的受試者或有外傷時懷疑患有A型血友病的受試者。在另一方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物可投予患有A型血友病的受試者或有存在外傷時懷疑患有A型血友病的受試者。在另一方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物可投予具有外傷的受試者，直到傷口癒合。在一些方面，外傷可包括但不侷限於，擦傷（abrasion）、撕裂傷（laceration）、穿刺傷（puncture）、或撕脫傷（avulsion）。
在一些方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物可在外科手術、嚴重受傷、或牙科手術之前、過程中、或之後投予患有A型血友病或懷疑患有A型血友病的受試者。
在一些方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物可投予患有A型血友病或懷疑患有A型血友病及有經歷自發性出血的受試者。在另一方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物可投予患有A型血友病或懷疑患有A型血友病及在一週內有經歷過一次、二次、或多次出血的受試者。
在各個方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物可投予患有或懷疑患有A型血友病的任何年齡群組受試者。在一些方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物可投予患有或懷疑患有A型血友病的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、或17歲年齡孩童。在另一方面，本發明之蛋白分子或其醫藥組合物可投予患有或懷疑患有A型血友病的嬰兒。
在又另一方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物可投予患有或懷疑患有A型血友病之0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12個月年齡大的嬰兒。
在一些方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物在第一次出血發作之前投予較早年齡的受試者。
在其他方面，在第一次出血發作之前投予本發明之蛋白分子或醫藥組合物可防止進一步出血及將來發展成關節損傷。
在一些具體實施例中，投予受試者本發明之蛋白分子或醫藥組合物可具有以下作用，但不侷限於，止血、減輕疼痛、及改進活動力。
亦提供在有需求之受試者中促進FX活化的方法，其包含投予受試者一治療上有效量之本發明蛋白分子或醫藥組合物。
亦提供在有需求之受試者中減少出血發作之頻率或程度的方法，其包含投予受試者一有效量之本發明蛋白分子或醫藥組合物。
在一些方面，受試者已發展出、有發展的趨勢、及有發展出針對因子VIII（「FVIII」）之抑制劑的風險。在一些方面，針對FVIII之抑制劑為針對FVIII的中和抗體。在一些方面，受試者正在接受FVIII治療或其為適合FVIII治療（如FVIII替代療法）的候選物。
在一些方面，出血發作係關節血腫、肌肉出血、口腔出血、出血、肌肉出血、口腔出血、創傷、創傷性頭炎（trauma capitis）、胃腸道出血、顱內出血、腹腔內出血、胸腔內出血、骨折、中樞神經系統出血、咽後間隙出血（bleeding in the retropharyngeal space）、腹膜後間隙出血（bleeding in the retroperitoneal space）、骨鞘出血（bleeding in the illiopsoas sheath）、或其任何組合之結果。
本發明亦提供一在有需求之受試者中治療凝血障礙的方法，包含投予受試者一有效量之本發明蛋白分子或醫藥組合物。
在一些方面，凝血障礙為A型血友病或B型血友病。在一些方面，受試者為人類受試者。
在一些方面，受試者正在接受或已接受過FVIII替代療法。在一些態樣中，本發明蛋白分子或醫藥組合物與血友病療法組合使用。在一些態樣中，血友病療法為FVIII替代療法。在一些方面，本發明蛋白分子或醫藥組合物在血友病療法投予之前、過程中、或之後投予。在一些態樣中，本發明蛋白分子或醫藥組合物係以靜脈或皮下方式投予。
在一些方面，投予本發明之蛋白分子或醫藥組合物可減少突破性出血發作（break-through bleeding episodes）、自發性出血發作、或急性出血的頻率。在一些態樣中，投予本發明之蛋白分子或醫藥組合物可使年度出血率（annualized bleed rate）減少5%、10%、20%、30%、或50%。
本發明之蛋白分子或醫藥組合物可利用適合欲治療病況之任何途徑投予。本發明之蛋白分子或醫藥組合物典型上將以非經口（亦即輸注、皮下、肌內、靜脈、或皮內）方式投予。在一些態樣中，本發明之蛋白分子或醫藥組合物係皮下方式投予。
在特定方面，本發明之蛋白分子或醫藥組合物係間歇或間斷投予。在各個方面，經由注射（如皮下注射）投予本發明蛋白分子之劑量濃度，其範圍約0.0001 mg/kg至約100 mg/kg體重。
在一些方面，投予本發明之蛋白分子或醫藥組合物，直至疾病進展或出現不可接受之毒性。 實施例 實施例 1 ：以包含固定之可變重鏈的人類 scFv 庫（ libraries ）進行噬菌體顯示（ phage display ）選取
Vaughan等人描述了構築及處理顯示在M13噬菌體上之人類scFv庫的一般程序（Nat. Biotech. 1996, 14:309-314），在此皆併入本案以作為參考資料。用於選取及篩選的庫所編碼的scFv皆共有相同的VH結構域，且僅在VL結構域中呈現多樣化。用於產生固定之VH庫及其用於辨別與組裝雙特異性抗體的方法係描述於US 2012/0184716與WO 2012/023053，其每一者在此皆併入本案以作為參考資料。辨別scFv結合至人類因子IXa（hFIXa）或人類因子X（hFX）之程序描述如下。
蛋白選取。 在室溫下的旋轉混合器上，以包含3%（w/v）脫脂奶的PBS阻斷scFv噬菌體庫（1012 Pfu）等分試樣一小時。經阻斷之噬菌體在室溫下的旋轉混合器上以鏈親和素（streptavidin）磁珠（Dynabeads™ M-280，Dynal）進行一小時棄選反應。經棄選之噬菌體與鏈親和素磁珠捕獲的體外生物素化hFIXa或hFX（100 nM）在室溫下之旋轉混合器上培養2小時。利用磁力架（magnetic stand）捕獲磁珠，接著以PBS/0.1% Tween 20清洗五次及PBS清洗二次。在室溫下之旋轉混合器上，以100 nM TEA溶析噬菌體30分鐘。溶析之噬菌體與磁珠以Tris-HCl 1M pH 7.4中和，直接加入10 ml之指數生長的TG1細胞中，並在37°C下緩慢振盪（90 rpm）培養1小時。將感染的TG1等分試樣系列稀釋，以滴定選取結果。剩下的感染之TG1以3800 rpm旋轉10分鐘，重懸於2 ml 2xTY中，並鋪在2xTYAG（含有100 µg/ml安比西林與2%葡萄糖的2xTY培養基）瓊脂生物試驗盤上。在30°C下培養隔夜後，將10 ml的2xTY添加至培養盤中，將細胞從表面刮下並移至50 ml聚丙烯試管中。將50%甘油溶液加入細胞懸液中，得到17%甘油的最終濃度。將各選取回合的等分試樣保存在-80°C。
噬菌體拯救（ Phage rescue ） 。將50 µl先前各選取回合取得的細胞懸液加入50 ml的2xTYAG中，並在37°C下攪拌（240 rpm）生長，直到OD600 達到0.3至0.5為止。然後，培養物以1.2x1011 M13KO7輔助噬菌體進行超感染（super-infected），並在37°C下（90 rpm）培養1小時。利用3800 rpm離心細胞10分鐘，移除培養基，並將沉澱物重懸於50 ml的2xTYAK中（100 µg/ml 安比西林；50 µg/ml卡那黴素），以更換培養基。然後，培養物在30°C下（240 rpm）生長隔夜。隔天，以10 μl含有上清液的噬菌體用於下一回合選取。實施例 2 ：篩選結合至 hFIXa 或 hFX 的 scFv
製備 scFv 周質（ periplasmic ）已進行結合試驗。 將個別的TG1殖株接種在96孔深孔培養盤中，其中每孔含有0.9 ml的2xTYAG培養基（0.1%葡萄糖），並在37°C下生長5-6小時（240 rpm）。接著，每孔加入100 µl含有0.2 mM IPTG的2xTY培養基，得到最終濃度為0.02 mM IPTG。培養盤在30°C下以240 rpm振盪培養隔夜。深孔培養盤在4°C下以3200 rpm離心10分鐘，並小心移除上清液。將沉澱物重懸於150 µl TES緩衝液中（50 mM Tris-HCl（pH 8）、1 mM EDTA（pH 8）、20%蔗糖，輔以完全蛋白酶抑制劑，Roche）。加入150 µl經稀釋之TES緩衝液（1:5 TES:水的稀釋），產生低張衝擊（hypotonic shock），並在冰上培養30分鐘。培養盤在4°C下以4000 rpm離心10分鐘，以產生沉澱細胞與碎片。將上清液小心移至96孔微量滴定盤中，並置於冰上，以便立即在功能試驗或結合試驗中測試。
結合 。利用CellInsight技術，在同質性試驗中，進行scFv結合至hFIXa或hFX的篩選。在384孔透明底培養盤（Corning）各孔中混合下列試劑：30 µl鏈親和素聚苯乙烯磁珠懸液（Polysciences；3000顆磁珠/孔），其塗佈生物素化之hFIXa或hFX或對照組蛋白（hFII）；60 µl的阻斷性scFv周質製備物；10 µl的檢測緩衝液（含有5 µg/ml小鼠抗c-myc抗體的PBS；以1：200稀釋的抗小鼠Fc AlexaFluor®647抗體）。在600 rpm混合5分鐘後，384孔培養盤在室溫下培養2小時，並在CellInsightTM CX5高含量篩選平台（Thermo Fisher Scientific）上讀取。選擇產生針對hFIXa或hFX而非hFII之特定訊號的scFv表現殖株，進行進一步分析或定序。
噬菌體殖株定序 。將單一TG1殖株接種至96孔深孔培養盤中，其中每孔含有1 ml LBAG培養基（含有100 µg/ml安比西林與2%葡萄糖的LB培養基），並在37°C之240 rpm下生長隔夜。DNA利用Zyppy-96 Plamisd Miniprep套組（Zymo Research）萃取。經沖提之DNA（5 µl）以fdtseqlong引子（5’-GTCGTCTTTCCAGACGTTAGTAAATG-3’（SEQ ID NO: 363））進行定序。實施例 3 ：將固定之 VH 候選物重定格式為（單特異性） IgG 且在哺乳類動物細胞中短暫表現
在篩選之後，將針對hFIXa或hFX的scFv候選物重定格式為IgG，並利用瞬時轉染在PEAK細胞中表現。以特異性寡核苷酸擴增選取之scFv的VH與VL序列，並將其選殖至含有重鏈與輕鏈恆定結構域之表現載體中，且構築體以定序驗證。利用Lipofectamine 2000轉染試劑（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）將表現載體轉染至哺乳類動物細胞。在50 mL完全DMEM中，在各個T175燒瓶中，針對107 個細胞，以含有30 µg DNA與42 µL Lipofectamine 2000轉染試劑（Invitrogen）之2 mL DMEM的混合物進行瞬時轉染。
利用Octet RED96及蛋白A塗佈之生物感測器（Pall ForteBio），測定IgG表現。依據抗體濃度，在轉染後7至10天收取上清液，並以2000 rpm離心10 min使之澄清。利用一親和力層析步驟，及FcXL樹脂（Thermo Fischer Scientific），純化總IgGs。實施例 4 ：包含雜交輕鏈之雙特異性抗體的產生
組裝KL抗體之一方法為共同表現一個完整κ類型之可變輕鏈（亦即可變與恆定κ結構域）與一個完整λ類型（亦即可變與恆定λ結構域）之可變輕鏈以及一普通重鏈（亦即可變與恆定重鏈結構域）。然而，亦可能使用二個相同類型的可變結構域（亦即二個κ可變結構域或二個λ可變結構域）並產生雜交輕鏈。在此情況下，λ輕鏈之可變結構域可融合至κ類型之恆定結構域或反之κ輕鏈之可變結構域可融合至λ類型之恆定結構域，如US 2012/0184716與WO 2012/023053所示。針對數個抗FIXa與抗FX臂，可產生此類雜交鏈。包含雜交鏈之bsAb的下游純化遵循相同策略及親和純化樹脂， 亦即一個輕鏈包含κ恆定結構域且其他的包含λ恆定結構域。實施例 5 ：攜帶 λ 與 κ 恆定輕鏈結構域之雙特異性抗體的表現與純化
在相同細胞中同時表現一個重鍊與二條輕鏈，可導致三個不同抗體形式、單特異性抗體、及一個bsAb的組裝。可以不同方式達成同時表現，例如，轉染多個表現一些欲共同表現之鏈的載體，或使用驅動多個基因表現的載體。
利用單一載體表現 。如US 2012/0184716與WO 2012/023053所述，預先產生pNovi κHλ（亦即pNovi Kappa H Lambda）載體，使能共同表現一個重鏈、一個κ輕鍊、及一個λ輕鏈，其每一者在此併入本案以作為參考資料。此三基因之表現係由人類巨細胞病毒啟動子（hCMV）驅動，該載體亦包含一麩醯胺酸合成酶基因（GS），其能選取與建立穩定細胞株。將抗FIXa或抗FX之VH與VL基因選殖至上述載體pNovi κHλ中，以在哺乳類動物細胞中瞬時表現。
經由共同轉染二載體的表現 。欲快速篩選bsAb抗體候選物之生物活性而無需其他選殖步驟，在Peak細胞中亦進行以實施例3所述之載體共轉染。以Lipofectamine 2000轉染試劑（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）將表現載體轉染至哺乳類動物細胞中。使用包含20 + 20 µg DNA和60 µL Lipofectamine 2000轉染試劑的2 mL混合物進行瞬時轉染。 在50 mL完整DMEM中，每個T175燒瓶中的107個細胞的DMEM數量。在50 mL完全DMEM中，在每一T175燒瓶中，針對107 個細胞，以含有20+20 µg DNA與60 µL Lipofectamine 2000轉染試劑之2 mL DMEM的混合物進行瞬時轉染。利用Octet RED96及蛋白A塗佈之生物感測器（Pall ForteBio），測定IgG表現。依據抗體濃度，在轉染7至10天後，收取上清液。
雙特異性抗體純化 。在抗體產生7-10天後，收取上清液，並以2000 rpm離心10 min使之澄清。利用一親和力層析步驟，及FcXL樹脂（Thermo Fischer Scientific），純化總IgGs。隨後，需要二個額外的親和層析步驟，以分離KL抗體，並去除二個單特異性mAbs：一個是在KappaSelect樹脂（GE Healthcare）上進行純化以去除IgGλλ（亦即包含二個λ類型輕鏈的IgG）且一個是在LambdaFabSelect樹脂（GE Healthcare）上純化以去除IgG（亦即包含二個κ類型輕鏈的IgG）。
溶析係以pH 3.0的50 mM甘胺酸進行。在純化後，利用在Amicon Ultra-4離心過濾器（其配備Ultracel 50 kDa薄膜（Merck Millipore），且事先以配製緩衝液平衡）進行除鹽，並在25 mM組胺酸、125 mM NaCl（pH 6.0）中配製KL抗體。
最終產物以Nanodrop定量。經純化之雙特異性抗體在變性與還原條件下進行電泳分析。使用Agilent 2100 Bioanalyzer與Protein 80套組，如製造商所述（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）。將4 µL純化樣本與補充二硫蘇糖醇（DTT；Sigma Aldrich，St. Louis，MO）的樣本緩衝液混合。樣本在95°C下加熱5分鐘，接著填充在晶片上。實施例 6 ：先導抗 FIXa 與抗 FX 臂的優化
當數個抗FIXa與抗FX抗體組合成雙特異性抗體時，選取FVIII擬似活性增加者進行優化。
所有彼等抗體共享相同的可變重鏈，但具有不同的可變輕鏈。藉由將多樣性導入可變輕鏈結構域之CDR1、CDR2、及CDR3中，而重鏈可變結構域保持不變，產生數個顯示scFv變體的噬菌體庫。針對各候選物，產生至少5x109 個轉形體之庫。彼等庫係用於實施例1所述之噬菌體顯示選取。使用目標濃度在10-100 nM的範圍，可保持較低的選取條件嚴格度，從而可富集具有廣泛親和力的候選物。在選取後，篩選能結合至FIXa或FX的能力變體。接著，將給予結合其個別靶標之特定訊號的候選物scFv重定格式為本發明所涵蓋之不同抗體構築體，其表現成多價抗體變體，並在功能試驗中確認與測試，如實施例7所述。實施例 7 ：校準式自動化血栓試驗（ Calibrated automated thrombography assay ）
利用校準式自動化血栓術（CAT）（由Hemker et al., 2003. Pathophysiol Haemost Thromb. 33（1）:4-15描述之方法）評估凝血酶產生（TG）。本試驗基於螢光測定，該螢光係由凝血酶隨時間切割螢光受質Z‑G‑G‑R‑AMC而產生。針對各血漿樣本，都包括一凝血酶校準器，以校正內部過濾器效果、血漿之不同顏色、受質耗竭、及儀器差異。
欲維持血漿背景質恆定，以乏血小板血漿合併之人類血漿（PPP, George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KS, USA）作為基質。 藉由將PPP與熱失活之抗人類FVIII山羊血漿（4488貝什斯達單位[Bethesda units；BU]/mL）混合，模擬血友病條件（參見, Knappe et al., 2013. Thromb Haemost. 109:450-457），得到抑制劑濃度50 BU/mL。
將預熱的（37°C）FVIII抑制血漿（80 µL）加入96孔微量培養盤（Immulon 2HB, U型底; Thermo Electron）之各孔中。凝血酶的產生係由10 µL的PPP試劑LOW（Thrombinoscope BV, Maastricht, The Netherlands）驅動，該試劑包含重組型人類組織因子（rTF）、磷脂質混合物（48 µM）（MP試劑, Thrombinoscope BV, Maastricht, The Netherlands）、及62 µg/mL玉米胰蛋白酶抑制劑（Hematologic Technologies Inc., Essex Junction, VT, USA或Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN, USA）。選擇最終TF濃度為1 pM，以在試驗系統中提供FVIII的敏感性。藉由在空白或樣本中加入10 µL HNa-BSA緩衝液，將最終試驗孔的體積調整至120 µL。藉由將20 µL含有螢光受質的FluCa試劑（Thrombinoscope BV, Maastricht, The Netherlands）與Hepes緩衝之CaCl2 （100 mM）分配至各孔，開始產生凝血酶。螢光測定係於37°C下的Fluoroskan Ascent®讀盤儀（Thermo Labsystems, Helsinki, Finland；filters 390 nm excitation and 460 nm emission）中進行90分鐘，其中測定間隔為20秒鐘。所有樣本以二重複方式分析。所得之TG曲線參數以Thrombinoscope™軟體（Thrombinoscope BV, Maastricht, The Netherlands）計算。以凝血酶校正器（Thrombinoscope BV, Maastricht, The Netherlands）作為參考組，得出測試孔中凝血酶之莫耳濃度。紀錄各TG曲線尖峰的凝血酶數量（尖峰凝血酶，nM；Cmax ）、滯留時間（開始測定至開始產生凝血酶的時間間隔）、尖峰時間（開始測定與Cmax 的時間間隔）、及內源性凝血酶 潛力（凝血酶濃度與時間曲線下面積）。以Microsoft Excel 2010及/或GraphPad Prism 7進行進一步分析。在GraphPad Prism 7中繪圖。結果
在FVIII抑制之血漿中，加入Hemlibra（100 nM）會造成TG適度增加，其中尖峰凝血酶濃度為15.8 ± 0.97 nM（圖5-10）。正常血漿池（pool）與FVIII抑制之正常血漿造成的尖峰凝血酶濃度分別為77.2 ± 7.16 Nm與11.0 ± 0.96 nM。表 12 ：在不同抗體變體濃度下的尖峰凝血酶濃度
構築體編號 名稱 在300 nM（* = 200 nM）抗體濃度下的尖峰凝血酶（nM）。 在100 nM（* = 60 nM）抗體濃度下的尖峰凝血酶（nM）。 在25 nM（* = 30 nM）抗體濃度下的尖峰凝血酶（nM）。 在6.3 nM（* = 10 nM）抗體濃度下的尖峰凝血酶（nM）。
1 BAX#89 30.4* 25* nd 19.7
2 BAX#87 20.5* 16.9* nd 13.8
3 BAX#144 4.3 14.5 22.1 18.4
4 BAX#145 10.1 45.8 60.8 24.9
5 BAX#138 26.6 43.9 46.3 20.7
6 BAX#146 16.1 60.4 85.0 36.0
7 BAX#148 53.3 91.5 62.2 21.1
8 LEX#105 42.0 77.6 67.6 40.4
9 LEX#69 46.5 72.0 83.8 38.1
10 LEX#68 39.0 55.7 59.0 27.9
11 LEX#41 nd 46.7 16.3 14.7
12 LEX#40 nd 36.8 23.5 22.1
13 LEX#36 nd 13.6 13.5 12.6
14 LEX#39 nd 13.1 12.4 11.0
15 LEX#38 nd 25.1 21.2 20.5
16 LEX#103 34.2 62.9 49.3 26.6
17 LEX#102 35.4 64.2 48.5 26.2
18 LEX#99（N=3） 27.4 47.8 47.5* 32.8*
19 LEX#53 nd 64.6 48.5 23.0
20 LEX#59 20.3 27.9 23.4 15.2
21 LEX#75 44.7 68.6 49.6 22.6
22 LEX#74 50.2 75.3 48.6 21.0
23 LEX#73 57.1 77.5 49.9 21.4
24 LEX#72（N=3） 56.0 81.0 64.6* 41.3*
25 LEX#71 59.2 75.6 47.3 22.0
26 LEX#63 16.4 23.8 23.4 18.2
27 LEX#60 32.4 64.5 56.1 28.8
28 LEX#97 24.6 59.7 47.1 25.1
29 LEX#96 24.5 61.0 45.9 24.9
30 LEX#88 43.3 85.8 56.1 23.7
31 LEX#87 52.1 97.7 64.2 25.9
32 LEX#86 56.5 100.5 65.9 26.8
33 LEX#85（N=3） 37.3 83.9 81.5* 57.9*
34 LEX#84 59.2 97.2 56.0 23.2
35 LEX#12 nd 60.0 54.7 20.5
36 LEX#2 nd 37.6 30.2 20.8
37 LEX#95 44.7 87.9 56.3* 24.6*
38 LEX#121（N=3） 56.2 81.3 63.7* 42.3*
39 LEX#129（N=3） 47.6 70.2 63.6* 40.9*
40 LEX#131（N=3） 49.2 69.5 67.9* 57.6*
41 LEX#134 80.0 94.0 92.3* 67.9*
42 LEX#135（N=3） 107.4 120.6 92.7* 47.3*
43 LEX#143（N=3） 53.4 92.5 82.8* 55.6*
44 LEX#153（N=3） 45.5 89.2 92.3* 63.3*
45 LEX#157（N=3） 53.7 107.3 120.2* 84.4*
46 LEX#161 48.4 83.5 76.0* 50.7*
47 LEX#167（N=3） 40.9 72.7 64.5* 39.6*
48 LEX#168（N=3） 36.2 85.5 97.6* 77.8*
49 LEX#169（N=3） 18.7 64.5 76.1* 59.0*
  Hemlibra（N=10） 25.7 16 13.3* 12.7*
當以SIA而非Hemlibra時，未得到不同結果。實施例 8 ：利用 Octet 測定 FIXa 與 FX 的結合反應
在HTX儀器之高通量模式下，以雙層干涉儀（bilayer interferometry, Octet）研究抗體結合的動力學。抗人類Fab-CH1第二代（FAB2G）感測器在PBST緩衝液（1x PBS containing 0.05% tween-20）中離線加水（re-hydrated off-line）10 min，並在試驗過程中進行3至5秒鐘的剝離與再生步驟調節，其中分別使用500 mM磷酸及40 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM NaCl緩衝液。隨後，抗體以3.3 µg/ml恆定濃度固定在PBST中5分鐘，得到固定濃度為約2.5 nm。隨後，傳感器在試驗緩衝液（40 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、0.05%BSA、及0.05%tween-20）中平衡60秒，並結合至100 nM的人類FIXa、人類FX、或人類FIXa與FX之混合物（每一者亦為100 nM），接著在試驗緩衝液中分析300秒的結合反應與300秒的分離反應。在同一組傳感器上總共進行三次連續的剝離、再生、抗體填載、及因子結合循環，以測定抗體對所有不同因子的結合。在各實驗中，運行具有非相關結合特異性之夏爾（Shire）專有對照組抗體，以作為參考組。以附帶分析軟體（11.0版）的儀器進行分析。將Octet記錄曲線（traces）扣除參考組，在結合（association）之前以平均-5與0 sec對齊，隨後藉由對齊分離（dissociation），校正步驟間位移（inter-step shift）。應用薩維茨基-戈萊濾波法（Savitzky-Golay filtering）。藉由測定在結合期結束時的反應值，分析結合反應。所有測定皆在室溫下（~21-23ºC）以1000 rpm轉速進行。結果 表 13 ：在結合期結束時抗體與因子 IXa 及 / 或因子 X 之間的結合反應（ nm ）
構築體編號 名稱 FIXa（nm） FX（nm） FIXa + FX（nm）
1 BAX#89 0.37 0.26 0.52
2 BAX#87 0.24 0.27 0.40
3 BAX#142 ND ND ND
4 BAX#144 0.74 0.64 1.12
5 BAX#145 0.42 0.72 1.00
6 BAX#138 0.42 0.58 0.85
7 BAX#146 0.48 0.88 1.14
8 BAX#148 0.58 0.58 1.03
9 BAX#137 1.12 0.13 1.14
10 LEX#105 0.22 0.46 0.51
11 LEX#69 0.58 0.61 1.02
12 LEX#68 0.53 0.48 0.83
13 LEX#41 0.30 0.43 0.64
14 LEX#40 ND ND ND
15 LEX#36 ND ND ND
16 LEX#39 ND ND ND
17 LEX#38 ND ND ND
18 LEX#103 0.20 0.38 0.49
19 LEX#102 0.22 0.41 0.51
20 LEX#99 0.23 0.40 0.51
21 LEX#53 0.48 0.50 0.84
22 LEX#59 0.27 0.15 0.33
23 LEX#75 0.50 0.20 0.59
24 LEX#74 0.55 0.22 0.63
25 LEX#73 0.45 0.19 0.53
26 LEX#72 0.39 0.18 0.49
27 LEX#71 0.40 0.19 0.49
28 LEX#63 0.28 0.25 0.45
29 LEX#60 0.24 0.48 0.61
30 LEX#97 0.44 0.44 0.78
31 LEX#96 0.44 0.45 0.78
32 LEX#88 0.43 0.41 0.74
33 LEX#87 0.43 0.40 0.72
34 LEX#86 0.43 0.41 0.74
35 LEX#85 0.43 0.42 0.73
36 LEX#84 0.46 0.42 0.75
37 LEX#12 0.29 0.70 0.88
38 LEX#2 ND ND ND
39 LEX#3 ND ND ND
37 LEX#95 0.44 0.42 0.76
38 LEX#121 0.20 0.58 0.60
39 LEX#129 0.16 0.53 0.55
40 LEX#131 0.13 0.56 0.57
41 LEX#134 0.23 0.62 0.65
42 LEX#135 0.20 0.31 0.40
43 LEX#143 0.44 0.39 0.65
44 LEX#153 0.32 0.81 0.86
45 LEX#157 0.44 0.42 0.68
46 LEX#161 0.35 0.79 0.89
47 LEX#167 0.24 0.83 0.86
48 LEX#168 0.67 0.87 1.18
49 LEX#169 0.59 0.79 1.06
  Hemlibra ND ND ND
  西那吉斯（Synagis） ND ND ND
實施例 9 ： ELISAs 磷脂質 ELISA 材料
Dulbecco’s PBS與FBS購自Gibco。無水氯化鈣與BSA購自Sigma，且1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷酸-L-絲胺酸與1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼亦然。在96孔培養盤（LumiNunc MaxiSorp，購自Nunc）中進行ELISAs。抗體由Icosagen（Estonia）、Absolute Antibody（UK）、或內部(Lexington/Cambridge, MA, USA)製造。在檢測方面，使用購自Sigma的商用抗體。方法
將磷脂質溶於甲醇，最終濃度為20µg/ml。將50 µl之本溶液加入96孔微量滴定盤中，使得最終塗佈濃度達到10 µg/ml。在溶劑蒸發後，滴定盤在+4°C下以5% BSA或10% FBS阻斷，兩者在含有2 mmol/L Ca2+ 之Dulbecco’s PBS中稀釋。滴定盤以PBS（無Ca2+ ）清洗四次。抗體在PBS中稀釋成初始濃度2.5 µg/ml。在個別的阻斷緩衝液中進行系列2倍稀釋，並以每孔100 µl加入滴定盤中。隨後，滴定盤在室溫下培養45 min。在清洗之後，以山葵過氧化酶（horseradish peroxidase）山羊抗人類IgG抗體（以1:10.000稀釋）進行檢測（在室溫下培養45 min）。藉由加入100 µl TMB，檢測第二試劑。在培養10 min之後，將100 µl的1.8M硫酸加入各孔中，接著以微量盤讀儀在450 nm下讀取滴定盤。β 2- 醣蛋白 I ELISA 材料
Dulbecco’s PBS與FBS購自Gibco。氯化鈣二水合物與BSA購自Sigma。rhApoH脂蛋白元H（重組型人類β2GP1）購自R&D Systems。96孔培養盤（LumiNunc MaxiSorp）購自Nunc。抗體由Icosagen（Estonia）、Absolute Antibody（UK）、或內部(Lexington/Cambridge，MA，USA)製造。在檢測方面，使用購自Sigma的商用抗體。方法
將rhApoH溶於Dulbecco’s PBS至濃度為10 µg/ml。將100 µl此溶液加入96孔微量滴定盤中。在+4°C下培養隔夜後，滴定盤在+4°C下以稀釋於含有2 mmol/L Ca2+ 的Dulbecco’s PBS阻斷2小時。
滴定盤以PBS（無Ca2+ ）清洗四次。抗體在PBS中稀釋成初始濃度2.5 µg/ml。在阻斷緩衝液中進行系列2倍稀釋，並以每孔100 µl加入滴定盤中。隨後，滴定盤在室溫下培養45 min。在清洗之後，以山葵過氧化酶山羊抗人類IgG抗體（以1:10.000稀釋）進行檢測（在室溫下培養45 min）。藉由加入100 µl TMB，檢測第二試劑。在培養10 min之後，將100 µl的1.8M硫酸加入各孔中，接著以微量盤讀儀在450 nm下讀取滴定盤。GPIIbIIIa ELISA 材料
Dulbecco’s PBS與FBS購自Gibco。氯化鈣二水合物與BSA購自Sigma。天然人類整合素α2b+β3蛋白購自abcam。96孔培養盤（LumiNunc MaxiSorp）購自Nunc。抗體由Icosagen（Estonia）、Absolute Antibody（UK）、或內部(Lexington/Cambridge，MA，USA)製造。在檢測方面，使用購自Sigma的商用抗體。在檢測方面，使用購自Sigma的商用抗體。方法
將天然人類整合素α2b+β3蛋白溶於Dulbecco’s PBS，使濃度達到10 µg/ml。將100 µl之本溶液加入96孔微量滴定盤中，使得最終塗佈濃度達到10 µg/ml。在+4°C下培養隔夜後，滴定盤在+4°C下以稀釋於含有2 mmol/L Ca2+ 的5% BSA阻斷2小時。
滴定盤以PBS（無Ca2+ ）清洗四次。抗體在PBS中稀釋成初始濃度2.5 µg/ml。在阻斷緩衝液中進行系列2倍稀釋，並以每孔100 µl加入滴定盤中。隨後，滴定盤在室溫下培養45 min。在清洗之後，以山葵過氧化酶山羊抗人類IgG抗體（以1:10.000稀釋）進行檢測（在室溫下培養45 min）。藉由加入100 µl TMB，檢測第二試劑。在培養10 min之後，將100 µl的1.8M硫酸加入各孔中，接著以微量盤讀儀在450 nm下讀取滴定盤。實施例 10 ：具有因子 IXa 與 X 輕鏈特異性之雙特異性抗體在 A 型血友病血漿中改進凝血酶產生
在本發明全文中，進行以下操作且揭示於此：
背景： 藉由橋接FIXa與FX，雙特異性抗體（bsAbs）部分模擬活化型因子（F）VIII的功能。其促進FX活化，並在血友病條件下改進止血潛力。κλ抗體平台使得能發展bsAbs，其中輕鏈驅動特定標靶的結合。κλ抗體之原始人類IgG架構適合用於長期療法。
目的： 欲鑑定靶向FIXa與FX的bsAbs，可在A型血友病病患血漿中顯著增加凝血酶生成。
方法： 利用噬菌體顯示法，選取針對FIX（a）與FX（a）的抗體。欲產生κλ抗體，將一個常見重鏈與二個輕鏈共同表現。細胞培養上清液的功能篩選鑑定出許多命中物（hits），並進一步優化。純化有前景的bsAbs，並在A型血友病血漿中進行FXIa驅動之凝血酶生成（TG）試驗及Octet測定，進行活性測試，以評估結合特性。
結果： 始於350個FIXa與FX結合物，接著進行廣泛優化，篩選出超過17,000個bsAbs，並表現、純化、及鑑定出1200個獨特的bsAbs。在TG試驗中，bsAbs之特異性、結合能力、標靶結合區域、及/或其促凝血作用皆不同。舉例而言，bsAbs在10-300 nM的濃度範圍內，TG逐漸增加。有些bsAbs的最大尖峰凝血酶大於350 nM。相比之下，正常血漿對照組顯示，尖峰凝血酶為525 nM。彼等結果顯示，FIXa/FX以不同的結合性質結合bsAbs，可導致類似的功能結果。
結論： κλ抗體之技術用於產生大量針對FIXa/FX的原始人類bsAbs。κλ抗體之優化使得改進FIXa/FX的結合特性，從而導致A型血友病病患血漿中的TG顯著增加。優化工作將持續為將來的A型血友病有效提供不同的以抗體為主的療法。
圖 1 ： 雙特異性多價蛋白分子之示意圖。「3乘1」拓撲結構之特徵在於，具有三個結合至因子IXa的抗原結合位點及一個結合至因子X的抗原結合位點。「1乘3」拓撲結構之特徵在於具有三個結合至因子X的抗原結合位點及一個結合至因子IXa的抗原結合位點。「2乘2」拓撲結構之特徵在於具有二個結合至因子X的抗原結合位點及二個結合至因子IXa的抗原結合位點。結合至因子IXa的抗原結合位點及結合至因子X的抗原結合位點可於「2乘2」構築體予以轉換。此外，「1乘3」與「3乘1」構築體之結合模組不侷限於連接至重鏈之C端，但亦可連接至重鏈之N端或輕鏈之N端或C端。本文所述之所有結合模組係通過連接子連接至骨架模組。圖 2 ： 三特異性多價蛋白分子之示意圖。具體而言，包含「IXa/X」型骨架的三特異性多價蛋白分子。此分子之拓撲結構的特徵在於，本分子包含結合至因子IXa的抗原結合位點、結合至因子X的抗原結合位點、及可結合至另一增進本分子促凝血活性之靶標的第三與第四抗原結合位點。標記為「Z」的結合模組可為任一包含抗原結合位點的結合模組，其結合至因子IXa或因子X以外之任何他者。此外，結合模組不侷限於連接至重鏈之C端，但亦可連接至重鏈之N端或輕鏈之N端或C端。所有結合模組係通過連接子連接至骨架模組。圖 3 ： 三特異性多價蛋白分子之示意圖。具體而言，三特異性多價蛋白分子之特徵包含「2乘2」拓撲結構及二個各包含抗原結合位點的額外結合模組。二個額外的抗原結合位點結合至另一標靶，可增進分子促凝血活性。標記「Z」的結合模組可為任一包含抗原結合位點的結合模組，其結合至因子IXa或因子X以外之任何他者。此外，結合至因子IXa的抗原結合位點及結合至因子X的抗原結合位點可於圖3所示構築體之任一者予以轉換。本文所示之所有結合模組係通過連接子連接至骨架模組。圖 4 ：本發明可能涵蓋的不同拓撲結構示意圖。標記為「Z」的結合模組具有選擇性，且可以任何包含結合至因子IXa或因子X以外之任何他者之抗原結合位點的任一結合模組替代。此外，可將結合至因子IXa的抗原結合位點及結合至因子X的抗原結合位點轉換成圖4所示構築體之任一者。A）在此具體實施例中，二個結合模組係通過連接子連接至重鏈之N端、二個結合模組係通過連接子連接至輕鏈之C端、及二個結合模組係通過連接子連接至重鏈之C端。B）在此具體實施例中，二個結合模組係通過連接子連接至輕鏈之C端及二個串接的結合模組係連接至各重鏈之C端。C）此具體實施例為（A）之置換。顯然，如本文所討論，結合模組可互換。D）此具體實施例為（A）與（C）之置換。顯然，如本文所討論，結合模組可互換。E）在此具體實施例中，二個結合模組係通過連接子連接至輕鏈之C端，且三個串接的結合模組係連接至各重鏈之C端。F）在此具體實施例中，二個結合模組（其為Fabs或scFabs）係通過連接子連接至輕鏈之N端。G）在此具體實施例中，二個結合模組（其為scFvs）係插入骨架模組之CH1與CH2結構域之間。圖 5 ： 不同蛋白分子在100 nM濃度下的凝血酶尖峰值（peak thrombin values）。此圖提供許多構築體之間的比較，彼等構築體包含類似的抗原結合位點序列，卻包含不同的連接子。圖 6 ： 不同蛋白分子在100 nM濃度下的凝血酶尖峰值。此圖提供許多構築體之間的比較，彼等構築體包含類似的抗原結合位點序列，卻包含不同的連接子。圖 7 ： 不同蛋白分子在100 nM濃度下的凝血酶尖峰值。此圖提供許多三特異性構築體之間的比較，彼等構築體包含巴維昔單抗（bavituximab）。圖 8 ： 不同蛋白分子在100 nM濃度下的凝血酶尖峰值。此圖提供許多三特異性構築體之間的比較，彼等構築體包含β2-醣蛋白I之結構域V。圖 9 ： 不同蛋白分子在100 nM濃度下的凝血酶尖峰值。此圖提供許多構築體之間的比較，彼等構築體為雙特異性且多價。圖 10 ： 不同蛋白分子在100 nM濃度下的凝血酶尖峰值。此圖提供許多具有2乘2拓撲結構之不同構築體之間的比較。圖 11 ： 實施例9中所述之β2-醣蛋白I ELISA的結果。彼等結果顯示，包含巴維昔單抗的構築體仍能結合β2-醣蛋白I之結構域II。以Lex#4作為陰性對照組。Lex#4為雙特異性KL抗體，其包含V217之VL結構域、W83之VL結構域、及VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4。SIA為HEK293細胞產生之經純化、雙特異性、雙價抗FIX（a）、抗FX（a）抗體，依據公開的胺基酸序列（WHO Drug Information Vol. 29，No. 2，2015 - Proposed International Nonproprietary Names，List 113，World Health Organization），其序列與Hemlibra的相同。圖 12 ： 實施例9中所述之磷脂質ELISA（Phospholipid ELISA）結果。彼等結果顯示，包含β2-醣蛋白I之結構域V的構築體仍能結合至磷脂絲胺酸。以Lex#4作為對照組。Lex#4為雙特異性KL抗體，其包含V217之VL結構域、W83之VL結構域、及VH結構域，其中VH結構域為SEQ ID NO: 4。SIA為HEK293細胞產生之經純化、雙特異性、雙價抗FIX（a）、抗FX（a）抗體，依據公開的胺基酸序列（WHO Drug Information Vol. 29，No. 2，2015 - Proposed International Nonproprietary Names，List 113，World Health Organization），其序列與Hemlibra的相同。圖 13 ： 實施例9中所述之GPIIbIIIa結果。彼等結果顯示，包含抗LIBS之構築體仍能結合至GPIIbIIIa。以Lex#1作為陰性對照組。Lex#1與Lex#36相同，除了Lex#1不含結合模組以外。
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Claims (85)

  1. 一種具有促凝血活性的蛋白分子，其包含： （i）       一包含第一抗原結合位點與第二抗原結合位點的骨架模組；以及 （ii）     至少一包含第三抗原結合位點的第一結合模組； 其中該抗原結合位點之至少一者結合至因子IXa且該抗原結合位點之至少一者結合至因子X。
  2. 如請求項1之蛋白分子，其中該第一結合模組通過連接子連接至該骨架模組，且選擇性地，任何其他結合模組係或皆通過連接子連接至該骨架模組。
  3. 如請求項1之蛋白分子，其中該第一結合模組係插入該骨架模組之圈環區（loop region）之內，且選擇性地，任何其他結合模組係或皆插入該骨架模組之圈環區之內。
  4. 如請求項1至3中任一項之蛋白分子，其中該第一抗原結合位點結合至因子IXa，且該第二抗原結合位點結合至因子X。
  5. 如請求項1至4中任一項之蛋白分子，其中該第一結合模組之第三抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸（phosphatidylserine）、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
  6. 如請求項5之蛋白分子，其中該磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素（lactadherin）、氧化固醇结合蛋白（oxysterol binding protein）、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素（α5 β3 integrin）、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白（annexin）、或β2-醣蛋白I，較佳地其中該膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
  7. 如請求項5之蛋白分子，其中該第三抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
  8. 如請求項7之蛋白分子，其中該第一結合模組為scFv或scFab。
  9. 如請求項8之蛋白分子，其中該第一結合模組包含： （i）       HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii）     表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  10. 如請求項9之蛋白分子，其中該第一結合模組為scFv且包含： （i）       VH結構域，其中該VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii）     VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中該LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
  11. 如請求項9至10中任一項之蛋白分子，其中該LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W206、W198、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
  12. 如請求項5或6之蛋白分子，其中該第一結合模組為scFv或scFab。
  13. 如請求項12之蛋白分子，其中該第一結合模組包含VL結構域及VH結構域，其中： 該VL結構域為SEQ ID NO: 184且該VH結構域為SEQ ID NO: 187， 該VL結構域為SEQ ID NO: 185且該VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 該VL結構域為SEQ ID NO: 186且該VH結構域為SEQ ID NO: 189。
  14. 如請求項13之蛋白分子，其中該第一結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
  15. 如請求項5或6之蛋白分子，其中該第一結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
  16. 如請求項1至15中任一項之蛋白分子，其中該骨架模組為抗體或其二價片段。
  17. 如請求項16之蛋白分子，其中該骨架模組為抗體。
  18. 如請求項1至17中任一項之蛋白分子，其中該骨架模組包含二個重鏈及二個輕鏈。
  19. 如請求項18之蛋白分子，其中該骨架模組之一輕鏈包含一融合至κ恆定結構域之輕鏈可變結構域且該骨架模組之其他輕鏈包含一融合至λ恆定結構域之可變輕鏈結構域。
  20. 如請求項18至19中任一項之蛋白分子，其中該骨架模組包含： （i）        二個重鏈，其包含相同的CDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3； （ii）      一個輕鏈，其包含表1揭示之因子X結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3；以及 （iii）   一個輕鏈，其包含表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  21. 如請求項20之蛋白分子，其中（ii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W162之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  22. 如請求項20至21中任一項之蛋白分子，其中（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  23. 如請求項20至22中任一項之蛋白分子，其中（ii）與（iii）之LCDR1、LCDR2、及LCDR 3分別為表1與表2b揭示之 W88與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W127與V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， V149與W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W128與V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W128與V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W126與V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W83與V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W206與V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3， W88與V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或 W83與V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  24. 如請求項18至19中任一項之蛋白分子，其中該骨架模組包含： （i）       二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中該VH結構域為SEQ ID NO: 4； （ii）     一個輕鏈，其包含表3揭示之因子X結合輕鏈之任一者之VL；以及 （iii）  一個輕鏈，其包含表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。
  25. 如請求項24之蛋白分子，其中（ii）之VL為表3揭示之W206之VL、W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL，以及 （iii）之VL為表4b揭示之V43之VL、V245之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。
  26. 如請求項24至25中任一項之蛋白分子，其中（ii）與（iii）之VL分別為表3與表4b揭示之W88與V198之VL， W127與V202之VL， V149與W128之VL， W128與V198之VL， W206與V245之VL， W128與V141之VL， W162與V204之VL， W83與V217之VL， W88與V90之VL，或 W83與V43之VL。
  27. 如請求項1至3中任一項之蛋白分子，其中該第一抗原結合位點與該第二抗原結合位點之每一者結合至因子IXa，或該第一抗原結合位點與該第二抗原結合位點之每一者結合至因子X。
  28. 如請求項27之蛋白分子，其中該第三抗原結合位點結合至因子IXa或因子X。
  29. 如請求項28之蛋白分子，其中該第一結合模組為scFv或scFab。
  30. 如請求項29之蛋白分子，其中該第一結合模組包含： （i）   HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii） 表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  31. 如請求項30之蛋白分子，其中該第一結合模組包含： （i）   VH結構域，其中該VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii） VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中該LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
  32. 如請求項30至31中任一項之蛋白分子，其中該LCDR1、LCDR2、及LCDR3係源自表1與表2b揭示之W206、W198、V198、V202、W128、W88、W127、V212、或W162。
  33. 如請求項27至32中任一項之蛋白分子，其中該骨架模組為抗體或其二價片段。
  34. 如請求項33之蛋白分子，其中該骨架模組為抗體。
  35. 如請求項27至34中任一項之蛋白分子，其中該骨架模組包含二個重鏈及二個輕鏈。
  36. 如請求項35之蛋白分子，其中該骨架模組包含： （i）   二個重鏈，其包含相同的HCDRs，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO:3；以及 （ii） 二個輕鏈，各包含表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  37. 如請求項36之蛋白分子，其中該二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之W206之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W83之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W88之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W128之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，W127之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或W162之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  38. 如請求項36之蛋白分子，其中該二個輕鏈之每一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表2b揭示之V320之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V305之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V155之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V245之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V43之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V90之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V141之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V149之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V198之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V202之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V204之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，V212之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，或V217之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  39. 如請求項36之蛋白分子，其中該骨架模組包含： （i）   二個重鏈，其包含相同的VH結構域，其中該VH結構域為SEQ ID NO: 4；以及 （ii） 二個輕鏈，各包含表3揭示之因子X結合輕鏈或表4b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之VL。
  40. 如請求項39之蛋白分子，其中該二個輕鏈之每一者之VL為表3揭示之W206之VL、W83之VL、W88之VL、W128之VL、W127之VL、或W162之VL。
  41. 如請求項39之蛋白分子，其中該二個輕鏈之每一者之VL為表4b揭示之V320之VL、V305之VL、V155之VL、V245之VL、V43之VL、V90之VL、V141之VL、V149之VL、V198之VL、V202之VL、V204之VL、V212之VL、或V217之VL。
  42. 如請求項1至41中任一項之蛋白分子，其中該蛋白分子更包含至少一包含第四抗原結合位點的第二結合模組。
  43. 如請求項42之蛋白分子，其中該第二結合模組與第一結合模組相同。
  44. 如請求項42之蛋白分子，其中該第四抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
  45. 如請求項44之蛋白分子，其中該磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中該膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
  46. 如請求項44之蛋白分子，其中該第四抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
  47. 如請求項46之蛋白分子，其中該第二結合模組為scFv或scFab。
  48. 如請求項47之蛋白分子，其中該第二結合模組包含： （i）   HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii） 表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  49. 如請求項48之蛋白分子，其中該第二結合模組為scFv且包含： （i）   VH結構域，其中該VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii） VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中該LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
  50. 如請求項44或45之蛋白分子，其中該第二結合模組為scFv或scFab。
  51. 如請求項50之蛋白分子，其中該第二結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： 該VL結構域為SEQ ID NO: 184且該VH結構域為SEQ ID NO: 187， 該VL結構域為SEQ ID NO: 185且該VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 該VL結構域為SEQ ID NO: 186且該VH結構域為SEQ ID NO: 189。
  52. 如請求項51之蛋白分子，其中該第二結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
  53. 如請求項44或45之蛋白分子，其中該第二結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
  54. 如請求項42至53中任一項之蛋白分子，其中該蛋白分子更包含至少一包含第五抗原結合位點的第三結合模組。
  55. 如請求項54之蛋白分子，其中該第三結合模組與第一結合模組相同。
  56. 如請求項54之蛋白分子，其中該第五抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
  57. 如請求項56之蛋白分子，其中該磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中該膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
  58. 如請求項56之蛋白分子，其中該第五抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
  59. 如請求項58之蛋白分子，其中該第三結合模組為scFv或scFab。
  60. 如請求項59之蛋白分子，其中該第三結合模組包含： （i）   HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii） 表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  61. 如請求項60之蛋白分子，其中該第三結合模組為scFv且包含： （i）   VH結構域，其中該VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii） VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中該LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
  62. 如請求項56或57之蛋白分子，其中該第三結合模組為scFv或scFab。
  63. 如請求項62之蛋白分子，其中該第三結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： 該VL結構域為SEQ ID NO: 184且該VH結構域為SEQ ID NO: 187， 該VL結構域為SEQ ID NO: 185且該VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 該VL結構域為SEQ ID NO: 186且該VH結構域為SEQ ID NO: 189。
  64. 如請求項63之蛋白分子，其中該第三結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
  65. 如請求項56或57之蛋白分子，其中該第三結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
  66. 如請求項54至65中任一項之蛋白分子，其中該蛋白分子包含至少一包含第六抗原結合位點的第四結合模組。
  67. 如請求項66之蛋白分子，其中該第四結合模組與第一結合模組相同。
  68. 如請求項66之蛋白分子，其中該第四結合模組與第三結合模組相同。
  69. 如請求項66之蛋白分子，其中該第六抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
  70. 如請求項69之蛋白分子，其中該磷脂絲胺酸結合蛋白為Z蛋白、組織因子、因子VIII、LOX-1、乳凝集素、氧化固醇结合蛋白、C蛋白、S蛋白、因子II（前凝血酶）、因子V、因子VII、Mer、α5 β3 整合素、CR3補體受體、CR4補體受體、磷脂絲胺酸受體、膜聯蛋白、或β2-醣蛋白I，較佳地其中該膜聯蛋白為膜聯蛋白V。
  71. 如請求項69之蛋白分子，其中該第六抗原結合位點結合至一選自於由因子IXa及因子X所組成列表之磷脂絲胺酸結合蛋白。
  72. 如請求項71之蛋白分子，其中該第四結合模組為scFv或scFab。
  73. 如請求項72之蛋白分子，其中該第四結合模組包含： （i）   HCDR1、HCDR2、及HCDR3，其中HCDR1為SEQ ID NO: 1、HCDR2為SEQ ID NO: 2、及HCDR3為SEQ ID NO: 3； （ii） 表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3。
  74. 如請求項73之蛋白分子，其中該第四結合模組為scFv且包含： （i）   VH結構域，其中該VH結構域為SEQ ID NO: 183； （ii） VL結構域，其由LCDR1、LCDR2、LCDR3、及四個框架區組成， 其中該LCDR1、LCDR2、及LCDR3為表1揭示之因子X結合輕鏈或表2b揭示之因子IXa結合輕鏈之任一者之LCDR1、LCDR2、及LCDR3，以及 其中FW1為SEQ ID NO: 179、FW2為SEQ ID NO: 180、FW3為SEQ ID NO: 181、及FW4為SEQ ID NO: 182。
  75. 如請求項69或70之蛋白分子，其中該第四結合模組為scFv或scFab。
  76. 如請求項75之蛋白分子，其中該第四結合模組包含VL結構域與VH結構域，其中： 該VL結構域為SEQ ID NO: 184且該VH結構域為SEQ ID NO: 187， 該VL結構域為SEQ ID NO: 185且該VH結構域為SEQ ID NO: 188，或 該VL結構域為SEQ ID NO: 186且該VH結構域為SEQ ID NO: 189。
  77. 如請求項76之蛋白分子，其中該第四結合模組為SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、或SEQ ID NO: 192。
  78. 如請求項69或70之蛋白分子，其中該第四結合模組包含β2-醣蛋白I之結構域V。
  79. 如請求項66至78中任一項之蛋白分子，其中該蛋白分子包含至少一包含第七抗原結合位點的第五結合模組。
  80. 如請求項79之蛋白分子，其中該蛋白分子包含至少一包含第八抗原結合位點的第六結合模組。
  81. 如請求項79至80中任一項之蛋白分子，其中該第七及/或第八抗原結合位點結合至磷脂絲胺酸、磷脂絲胺酸結合蛋白、或血小板表面標記。
  82. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至81中任一項之蛋白分子及醫藥上可接受載體及/或稀釋劑。
  83. 如請求項1至81中任一項之蛋白分子，或如請求項82之醫藥組合物，以作為藥劑。
  84. 如請求項1至81中任一項之蛋白分子或如請求項82之醫藥組合物，以在治療及/或預防出血性疾病之方法中使用，其中病患或動物係投予一治療上有效量之該蛋白分子或該醫藥組合物。
  85. 如請求項84之蛋白分子或醫藥組合物之用途，其中該出血性疾病為A型血友病或後天性血友病（acquired hemophilia）。
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