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TW202033518A - Kras g12c 抑制劑 - Google Patents

Kras g12c 抑制劑 Download PDF

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TW202033518A
TW202033518A TW108136024A TW108136024A TW202033518A TW 202033518 A TW202033518 A TW 202033518A TW 108136024 A TW108136024 A TW 108136024A TW 108136024 A TW108136024 A TW 108136024A TW 202033518 A TW202033518 A TW 202033518A
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TW
Taiwan
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compound
pharmaceutically acceptable
cancer
acceptable salt
kras
Prior art date
Application number
TW108136024A
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English (en)
Inventor
大衛 安東尼 巴達
大衛 安德魯 寇特
瑞恩 詹姆士 林德
聖彬 潘
艾拉米 莫哈梅 沙德 利亞
Original Assignee
美商美國禮來大藥廠
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Filing date
Publication date
Application filed by 美商美國禮來大藥廠 filed Critical 美商美國禮來大藥廠
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Abstract

本發明提供以下式I化合物

Description

KRAS　G12C　抑制劑
本發明係關於新穎2-胺基苯并噻唑化合物及其醫藥學上可接受之鹽、包括2-胺基苯并噻唑化合物及鹽之醫藥組合物及使用該等化合物及鹽治療癌症之方法，該等癌症諸如肺癌、大腸直腸癌、胰臟癌、膀胱癌、子宮頸癌或食道癌。本發明亦包括新穎2-胺基苯并噻唑化合物與CDK4及CDK6抑制劑玻瑪西林(abemaciclib)、EGFR小分子抑制劑、EGFR單株抗體西妥昔單抗、抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體之組合。
MAPK/ERK信號傳導路徑將細胞外刺激轉送至細胞核，由此調節不同細胞反應，包括細胞增殖、分化及凋亡。KRas蛋白為MAPK/ERK信號傳導路徑之引發劑，且充當負責誘導細胞分裂之開關。在其非活性狀態中，KRas結合鳥苷二磷酸(GDP)，有效地發送負信號以抑制細胞分裂。回應於細胞外信號，KRas經異位活化，從而允許核苷酸由GDP轉換成鳥苷三磷酸(GTP)。在其GTP結合之活性狀態中，KRas募集且活化傳播生長因子誘導之信號所需的蛋白質，以及其他細胞信號受體。由KRas-GTP募集的蛋白質之實例為c-Raf及PI3-激酶。作為GTP酶之KRas將結合GTP轉化回GDP，由此使其自身返回至非活性狀態，且再次傳播信號以抑制細胞分裂。KRas功能獲得型突變展現GTP結合程度增加及使GTP轉化成GDP之能力降低。結果為促進癌細胞生長之MAPK/ERK信號增加。密碼子12處之KRas的誤義突變為最常見突變且顯著削弱GTP酶活性。
已在約30%之人類癌症中鑑別出致癌KRas突變，且證明該等突變會活化多個下游信號傳導路徑。儘管KRas突變普遍存在，但其為一種困難的治療目標。(Cox, A.D.Drugging the Undruggable RAS:  Mission Possible? Nat. Rev. Drug Disc. 2014, 13, 828-851; Pylayeva-Gupta, y 等人RAS Oncogenes: Weaving a Tumorigenic Web. Nat. Rev. Cancer 2011, 11, 761-774)。
WO2015/054572及WO2016/164675揭示能夠結合於KRas G12C之某些喹唑啉衍生物。WO2016/044772亦揭示使用此類喹唑啉衍生物之方法。
仍需要提供替代的小分子KRas抑制劑。特定言之，需要提供適用於治療癌症之較有效的可經口遞送之KRas抑制劑。更特定言之，需要提供特異性抑制KRas GTP活性之小分子抑制劑。亦需要提供在相同或降低之KRas抑制活性下展現更高功效的小分子KRas抑制劑。此外，需要提供展現更好的藥物動力學/藥力學特性之KRas抑制劑。此外，需要提供更有效的KRas抑制劑，其展現功效增加且不良效應減少或最小化。本發明藉由提供新穎KRas抑制劑解決此等需要中之一或多者。
本發明提供一種式I化合物：
Figure 02_image005
其中m為0-2；各R1為F；且R2係選自：H、F及Cl；或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，R2為F。在另一實施例中，R2為Cl。在另一實施例中，m為0。在另一實施例中，m為1。在另一實施例中，提供呈游離鹼形式之式I化合物。在又另一實施例中，提供呈醫藥學上可接受之鹽形式之式I化合物。
本發明亦提供選自以下式II-VII中之任一者之化合物：
Figure 02_image007
； 或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，提供呈醫藥學上可接受之鹽形式的式II-VII化合物。
本發明亦提供選自式II、V及VI中之任一者之化合物：
Figure 02_image009
； 或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供一種式II化合物，其為：
Figure 02_image011
或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，提供呈醫藥學上可接受之鹽形式的式II化合物。在另一實施例中，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。在另一實施例中，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。
本發明亦提供一種式III化合物，其為：
Figure 02_image013
或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，提供呈醫藥學上可接受之鹽形式的式III化合物。
本發明亦提供一種式IV化合物，其為：
Figure 02_image015
或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，提供呈醫藥學上可接受之鹽形式的式IV化合物。
本發明亦提供一種式V化合物，其為：
Figure 02_image017
或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，提供呈醫藥學上可接受之鹽形式之式V化合物。
本發明亦提供一種式VI化合物，其為：
Figure 02_image019
或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，提供呈醫藥學上可接受之鹽形式之式VI化合物。
本發明亦提供一種式VII化合物，其為：
Figure 02_image021
或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，提供呈醫藥學上可接受之鹽形式的式VII化合物。
本發明亦提供一種式VIII化合物，其為：
Figure 02_image023
或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，提供呈醫藥學上可接受之鹽形式的式VIII化合物。
本發明亦提供一種式IX化合物，其為：
Figure 02_image025
或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，提供呈醫藥學上可接受之鹽形式之式IX化合物。
本發明亦提供一種式II化合物，其為呈結晶鹽形式之1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮。本發明亦提供結晶1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮半丙二酸鹽。本發明亦提供呈結晶形式之1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮半丙二酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在5.4°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：13.5°、7.1°及23.0°。本發明亦提供結晶1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸鹽。本發明亦提供呈結晶形式之1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°。
本發明亦提供一種醫藥組合物，其包含根據式I-IX中之任一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。較佳地，化合物為式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。較佳地，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。
本發明亦提供一種治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之根據式I-IX中任一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，化合物為式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。較佳地，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。在一個實施例中，癌症為肺癌、大腸直腸癌、胰臟癌、膀胱癌、子宮頸癌或食道癌。在較佳實施例中，癌症為非小細胞肺癌、胰臟癌或大腸直腸癌。在再更佳實施例中，癌症為非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為非小細胞肺癌。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為胰臟癌。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為大腸直腸癌。
本發明亦包含一種治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之根據式I-IX中任一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該癌症具有一或多種表現突變KRas G12C蛋白之細胞。較佳地，化合物為式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。較佳地，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。在另一實施例中，癌症為非小細胞肺癌，其中該癌症具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。在另一實施例中，癌症為大腸直腸癌，其中該癌症具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。在又另一實施例中，癌症為胰臟癌，其中該癌症具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。在另一個實施例中，本發明包含一種治療患有其他來源之癌症的KRas G12C突變的方法。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為非小細胞癌，更佳該非小細胞癌具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為胰臟癌，更佳該胰臟癌具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為大腸直腸癌，更佳該大腸直腸癌具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。
本發明亦提供一種調節有需要之患者之突變KRas G12C酶的方法，其係藉由投與根據式I-IX中之任一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，化合物為式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。較佳地，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。較佳地，該方法包含抑制人類KRas G12C酶。
本發明亦提供一種治療有需要之患者之癌症的方法，其中該患者患有經確定表現KRas G12C突變蛋白之癌症。較佳地，化合物為式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。較佳地，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。該方法包含向患者投與有效量之式I-IX中任一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。一或多種癌細胞之G12C突變狀態可藉由多種此項技術中之檢定測定。通常，獲得含有一或多個癌細胞之一或多種活檢體，且對其進行定序及/或聚合酶鏈反應(PCR)。循環無細胞DNA亦可用於例如晚期癌症中。用於測定突變狀態(例如一或多種癌細胞或循環無細胞DNA中之G12C突變狀態)之定序及PCR技術之非限制性實例包括直接定序、下一代定序、反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、多重PCR及焦磷酸定序及多重分析物分析。
本發明亦提供用於療法中之根據式I-IX中之任一者之化合物。較佳地，化合物為式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。較佳地，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。化合物或其醫藥學上可接受之鹽可用於治療癌症。較佳地，癌症為肺癌、大腸直腸癌、胰臟癌、膀胱癌、子宮頸癌或食道癌。在較佳實施例中，癌症為非小細胞肺癌、胰臟癌或大腸直腸癌。在再更佳實施例中，癌症為非小細胞肺癌。在其他實施例中，癌症具有一或多種表現突變KRas G12C蛋白之癌細胞。較佳地，該癌症係選自：KRas G12C突變非小細胞肺癌、KRas G12C突變大腸直腸癌及KRas G12C突變胰臟癌。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為非小細胞肺癌，更佳該非小細胞肺癌具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為胰臟癌，更佳該胰臟癌具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為大腸直腸癌，更佳該大腸直腸癌具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。
本發明亦提供根據式I-IX中任一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療癌症之藥劑。較佳地，化合物為式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。較佳地，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。較佳地，癌症為肺癌、大腸直腸癌、胰臟癌、膀胱癌、子宮頸癌或食道癌。在較佳實施例中，癌症為非小細胞肺癌、胰臟癌或大腸直腸癌。在再更佳實施例中，癌症為非小細胞肺癌。在其他實施例中，癌症具有一或多種表現突變KRas G12C蛋白之癌細胞。較佳地，該癌症係選自KRas G12C突變非小細胞肺癌、KRas G12C突變大腸直腸癌及KRas G12C突變胰臟癌。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為非小細胞癌，更佳該非小細胞癌具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為胰臟癌，更佳該胰臟癌具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。在另一較佳實施例中，化合物為式II化合物，更佳為式II化合物之甲磺酸鹽，甚至更佳為式II化合物之結晶甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°，且癌症為大腸直腸癌，更佳該大腸直腸癌具有一或多種表現KRas G12C突變蛋白之細胞。
本發明亦提供包含根據式I-IX中之任一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及玻瑪西林或其醫藥學上可接受之鹽的組合，其用於同時、分別或依序用於治療癌症。較佳地，化合物為式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。較佳地，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。在其他實施例中，癌症具有一或多種表現突變KRas G12C蛋白之癌細胞。較佳地，該癌症係選自KRas G12C突變非小細胞肺癌、KRas G12C突變大腸直腸癌及KRas G12C突變胰臟癌。
本發明亦提供包含根據式I-IX中任一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及EGFR抑制劑或其醫藥學上可接受之鹽的組合，其用於同時、分別或依序用於治療癌症。較佳地，化合物為式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。較佳地，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。較佳地，EGFR抑制劑為埃羅替尼。較佳地，EGFR抑制劑為阿法替尼。較佳地，EGFR抑制劑為西妥昔單抗。在其他實施例中，癌症具有一或多種表現突變KRas G12C蛋白之癌細胞。較佳地，該癌症係選自KRas G12C突變非小細胞肺癌、KRas G12C突變大腸直腸癌及KRas G12C突變胰臟癌。
本發明亦提供包含根據式I-IX中任一者之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及抗計劃性細胞死亡抗體之組合，其用於同時、分別或依序用於治療癌症。較佳地，化合物為式II化合物或其醫藥學上可接受之鹽。較佳地，式II化合物之鹽為甲磺酸鹽。較佳地，式II化合物之鹽為半丙二酸鹽。在其他實施例中，癌症具有一或多種表現突變KRas G12C蛋白之癌細胞。較佳地，該癌症係選自KRas G12C突變非小細胞肺癌、KRas G12C突變大腸直腸癌及KRas G12C突變胰臟癌。
本申請案主張2018年10月15日申請之美國臨時申請案第62/745,502號之優先權，其內容以全文引用的方式併入本文中。
如本文所使用之術語「醫藥學上可接受之鹽」係指被認為對臨床及/或獸用可接受的化合物之鹽。醫藥學上可接受之鹽之實例及用於製備其之常見方法可見於「Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use」P. Stahl, 等人, 第二修訂版, Wiley-VCH, 2011及S.M. Berge, 等人, 「Pharmaceutical Salts」,Journal of Pharmaceutical Sciences , 1977, 66(1), 1-19。
本發明之醫藥組合物可使用醫藥學上可接受之添加劑製備。如本文所使用之術語「(一或多種)醫藥學上可接受之添加劑」用於醫藥組合物，係指與組合物或調配物之其他添加劑可相容且對患者無害的一或多種載劑、稀釋劑及賦形劑。用於其製備之醫藥組合物及方法之實例可見於「Remington: The Science and Practice of Pharmacy 」, Loyd, V., 等人編, 第22版, Mack Publishing Co., 2012。醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑及賦形劑之非限制性實例包括以下：鹽水、水、澱粉、糖、甘露醇及二氧化矽衍生物；黏合劑，諸如羧甲基纖維素、海藻酸鹽、明膠及聚乙烯吡咯啶酮；高嶺土及膨潤土；及聚乙基二醇。
如本文所用，術語「有效量」係指有效治療病症或疾病(諸如癌病變或異常細胞生長及/或細胞分裂之進程)之劑量的量。作為熟習此項技術者之主治診斷醫師可易於藉由使用習知技術且藉由觀察在類似情況下得到之結果來測定有效量。每天治療之劑量通常處於每天約1 mg或每天兩次與每天1000 mg或每天兩次之間，更佳每天100 mg或每天兩次與每天900 mg或每天兩次之間的範圍內。在測定化合物之有效量或劑量時考慮之因素包括：是否將投與化合物或其鹽；與其他藥劑之共同投與(若使用)；待治療之患者之種類；患者之身材、年齡及一般健康狀況；參與程度或病症之階段及/或嚴重程度；個別患者之反應；投與模式；所投與製劑之生物可用性特徵；所選擇之劑量方案；及其他伴隨藥物之用途。
治療醫師、獸醫或其他醫學人員將能夠測定出用於治療有需要之患者的化合物之有效量。較佳醫藥組合物可調配為用於經口投與之錠劑或膠囊、用於經口投與之溶液或可注射溶液。錠劑、膠囊或溶液可以對於治療需要治療癌症之患者有效之量包括本發明化合物。
如本文所使用，術語「治療(treating、to treat或treatment」包括減緩、降低或逆轉現有症狀、病症、病況之進程或嚴重程度，其可包括特異性減緩癌病變之生長或異常細胞生長及/或細胞分裂之進程。
如本文所用，術語「患者」係指需要治療之哺乳動物。較佳地，患者為需要治療癌症(例如患有KRas G12C突變之癌症)之人類。
某些縮寫定義如下：「AcOH」係指乙酸；「ACN」係指乙腈；「DCM」係指二氯甲烷；「DIPEA」係指N,N-二異丙基乙胺；「DMAP」係指4-二甲胺基吡啶；「DMF」係指N,N-二甲基甲醯胺；「DMSO」係指二甲亞碸；「DTT」係指二硫蘇糖醇；「EDTA」係指乙二胺四乙酸；「EGTA」係指乙二醇-雙(β-胺基乙基醚)-N,N,N',N'-四乙酸；「ELISA」係指酶聯結免疫吸附劑檢定；「Et2 O」係指乙醚；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「FBS」係指胎牛血清；「HPLC」係指高效液相層析；「h」、「hr」或「hrs」係指(一或多個)小時；「HRP」係指辣根過氧化酶；「IPA」係指異丙醇；「LC-ES/MS」係指液相層析-電噴質譜分析；「LC-MS」係指液相層析質譜分析；「MeOH」係指甲醇；「min」或「mins」係指(一或多個)分鐘；「MTBE」係指甲基第三丁基醚；「NaOAc」係指乙酸鈉；「NaOMe」係指甲醇鈉；「NMP」係指1-甲基吡咯啶-2-酮；「PCR」係指聚合酶鏈反應；「RT」或「rt」係指室溫；「THF」係指四氫呋喃；「TEA」係指三甲胺；「TF2 O」係指三氟甲烷磺酸酐；「TFA」係指三氟乙酸。
個別異構體、對映異構體、非對映異構體及滯轉異構體可藉由在合成下文所列之化合物之任何適宜時間點，藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析法之方法分離或解析（參見例如，J. Jacques等人, 「Enantiomers, Racemates, and Resolutions 」, John Wiley and Sons, Inc., 1981及E.L. Eliel及S.H. Wilen,「Stereochemistry of Organic Compounds 」, Wiley-Interscience, 1994）。本發明包括某些化合物，其為滯轉異構體且其可以不同構形或作為不同旋轉異構物存在。滯轉異構體為以由圍繞單鍵之受限旋轉產生之不同構形存在的化合物。若圍繞單一旋轉之能量障壁足夠高且相互轉化之速率足夠慢以允許個別旋轉異構體彼此分離，則滯轉異構體可分離為單獨化學物種。
式I-IX中任一者之化合物易於轉化成且可經分離作為醫藥學上可接受之鹽。鹽形成可發生在添加醫藥學上可接受之酸時以形成酸加成鹽。鹽亦可在去除氮或氧之保護基(亦即移除保護基)同時形成。用於鹽形成之實例、反應及條件可見於Gould, P.L., 「Salt selection for basic drugs,」International Journal of Pharmaceutics ,33 : 201-217 (1986)；Bastin, R.J., 等人「Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities,」Organic Process Research and Development ,4 : 427-435 (2000)；及Berge, S.M.,等人, 「Pharmaceutical Salts,」Journal of Pharmaceutical Sciences ,66 : 1-19, (1977)中。較佳地，鹽為甲磺酸鹽。較佳地，鹽為半丙二酸鹽。
本發明化合物或其鹽可藉由多種程序製備，該等程序中之一些在以下製備及實例中加以說明。各所述途徑之特定合成步驟可以不同方式或連同不同流程之步驟組合以製備本發明化合物或鹽。於以下製備中各步驟之產物可藉由習知方法回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶。
流程 1
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流程1描繪二氟化合物 5 之製備。市售三氟苯基硫脲 1 可藉由用適當強鹼處理來環化以獲得胺基苯并噻唑 2 。用溴及適合強酸可實現後續溴化得到化合物 3 。可使用適合的酐或氯甲酸烷酯保護化合物 3 之一級胺以獲得溴苯并噻唑化合物 4 。溴苯并噻唑 4 可用適當硼酸酯及鋰化試劑官能基化為
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酸 5 。
流程 2
Figure 02_image029
流程2描繪
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酸12 之製備，其中m=0-2且R1為F。可藉由用可接受經取代及市售的甲氧基-苯胺處理，同時維持冷卻反應溫度來實現由市售異硫氰酸苯甲醯酯 6 形成硫脲，得到硫脲 7 。可藉由在添加溴之後在氯仿中回流硫脲 7 實現環化，以提供甲氧基胺基苯并噻唑 8 。 8 之去甲基化及N保護可藉由添加BBr3 來達成，同時維持在惰性氛圍下之冷反應混合物，隨後保護一級胺以提供N經保護之胺基苯并噻唑 10 。N經保護之胺基苯并噻唑 10 可用鹼及適當的磺酸酐或磺醯氯處理，得到三氟甲烷磺酸酯 11 。三氟甲烷磺酸酯向
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酸之轉化可利用多種金屬催化劑、鹼及
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酸酯或酸源進行以提供胺基苯并噻唑
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酸 12 。
流程 3
Figure 02_image031
流程3描繪式I之製備，其中m為0-2，R1為F且R2為H、F或Cl。可如US 9,840,516中所描述製備起始哌嗪喹唑啉 13 。可使用來自流程1之化合物 13 及化合物 5 或來自流程2之化合物 12 採用鈴木偶合以提供經取代之喹唑啉 14 。使化合物 14 上之兩個胺基脫保護，得到中間物 15 。最後，根據式I之化合物可藉由用在極性非質子或質子溶劑中之鹼及適當酸氯化物處理二胺 15 來形成。
製備及實例 以下製備及實例進一步說明本發明且表示本發明化合物之典型合成，但不應理解為以任何方式限制本發明之範疇。試劑及起始物質為易於獲得的或可藉由已知程序或藉由採用各種修改為易於合成的，該等修改可由一般熟習此項技術者做出。
化合物可藉由在Agilent HP1100液相層析系統上進行之液相層析-電噴質譜分析(LC-ES/MS)來表徵。在連接至HP1100 HPLC之質量選擇性偵測器四極質譜儀上進行電噴質譜分析量測(在正及/或負模式中獲得)。LC-MS條件(低pH)：管柱：PHENOMENEX® GEMINI® NX C-18 2.1 × 50 mm 3.0 μm；梯度：3分鐘內5-100% B，隨後100% B 0.75分鐘；管柱溫度：50℃+/- 10℃；流動速率：1.2 mL/min；溶劑A：具有0.1% HCOOH之去離子水；溶劑B：含0.1%甲酸之ACN；波長214 nm。替代LC-MS條件(高pH)：管柱：WATERSTM XTERRA® MS C-18管柱2.1 × 50 mm，3.5 m；梯度：5% 溶劑A 0.25分鐘，3分鐘內5%至100%溶劑B及100%溶劑B 0.5分鐘或3分鐘內10%至100%溶劑B及100%溶劑B 0.75分鐘之梯度；管柱溫度：50℃+/- 10℃；流動速率：1.2 mL/min；溶劑A：10 mM NH4 HCO3 pH 9；溶劑B：ACN；波長：214 nm。
製備型逆相層析法在配備有質量選擇性偵測器質譜儀及Leap自動進樣器/分液收集器之Agilent 1200 LC-ES/MS上進行。高pH方法在75 × 30 mm PHENOMENEX® GEMINI® -NX、5 µm粒度管柱上運行，該柱具有10 × 20 mm保護管柱。流動速率為85 mL/min。溶析液為含10 mM碳酸氫銨(pH 10)之ACN。
製備 1 6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-胺
Figure 02_image033
在N2 下合併NaH (14.6 g，1.5當量)及NMP (400 mL)。每3-4分鐘以約5 g份添加(2,3,4-三氟苯基)硫脲(50.0 g，243 mmol)。在室溫下攪拌兩小時，隨後在100℃下攪拌90分鐘。冷卻至室溫且將反應混合物倒入冰/水(2.5 L)中。添加MTBE且分離各層。經無水Na2 SO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液。用DCM (75 mL)稀釋，隨後用己烷(425 mL)稀釋。音波處理、過濾、用己烷洗滌且在真空下乾燥，得到呈灰白色固體狀之標題化合物(33.5 g，74%)。MS (ES)m/z = 187 (M+H)。
製備 2 4-溴-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-胺
Figure 02_image035
將NaOAc (31.0 g，2.0當量)添加至6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-胺(35.0 g，188 mmol)於AcOH (625 mL)中之溶液中。歷經75分鐘逐滴添加溴(1.0 M於AcOH中，230 mL，1.2當量)。在室溫下攪拌三小時。在真空中濃縮反應混合物至接近乾燥。用水(1.4 L)、MTBE (1 L)及EtOAc (800 mL)稀釋。分離各層。用飽和NaCl水溶液洗滌有機物。用EtOAc合併水層。分離各層。用MTBE合併水層。分離各層。經無水Na2 SO4 乾燥經合併之有機物，過濾，且在真空中濃縮。用DCM (150 mL)稀釋且音波處理。在真空中濃縮混合物至約100 mL且冷卻至室溫。過濾，用己烷洗滌且在真空下乾燥，得到呈灰白色固體狀之標題化合物(44.4 g，89%)。MS (ES)m/z = (79 Br/81 Br) 265/267 (M+H)。
製備 3 (4-溴-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-基)胺基甲酸第三丁酯
Figure 02_image037
將DMAP (0.4 g，0.02當量)及DIPEA (35 mL，1.2當量)添加至4-溴-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-胺(44.4 g，168 mmol)於THF (1 L)中之溶液中。在N2 下置放。添加二碳酸二-第三丁酯(42.5 g，1.2當量)。在室溫下攪拌2.5小時。添加MeOH (50 mL)及飽和NaHCO3 水溶液(100 mL)。在真空中濃縮反應混合物至接近乾燥。用水(700 mL)及飽和NaHCO3 水溶液(150 mL)稀釋。添加MTBE (750 mL)且分離各層。用飽和NaCl水溶液洗滌有機層。經無水Na2 SO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液，得到呈黃色固體狀之標題化合物(60.6 g，99%)。MS (ES)m/z = (79 Br/81 Br) 363/365 (M-H)。
製備 4 {2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基}
Figure 108136024-A0101-12-0030-1
酸
Figure 02_image039
將(4-溴-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-2-基)胺基甲酸第三丁酯(2.0 g，5.5 mmol)添加至燒瓶中。用N2 淨化且添加THF (27 mL)。添加硼酸三異丙酯(3.8 mL，3.0當量)。在N2 下冷卻至-78℃。逐滴添加正丁基鋰(2.5 M於己烷中，6.6 mL，3.0當量)，保持內部反應溫度低於-60℃。歷經30分鐘升溫至-30℃至-35℃。在-30℃下攪拌30分鐘。用飽和NH4 Cl水溶液淬滅。用DCM及水稀釋。分離各層。用飽和NaCl水溶液洗滌有機物。經Na2 SO4 乾燥有機物，過濾，且在真空中濃縮濾液。用己烷稀釋且音波處理。加熱至50℃且冷卻至室溫。過濾，收集呈白色固體狀之標題化合物(1.2 g，65%)。MS (ES)m/z = 331 (M+H)。
製備 5 N-(5-氟-2-甲氧基苯基)硫脲
Figure 02_image041
合併異硫氰酸苯甲醯酯(110 g，671 mmol)及THF (875 mL)。在N2 下冷卻至5℃。逐滴添加5-氟-2-甲氧基苯胺(83.2 mL，1.05當量)，保持內部反應溫度低於10℃。升溫至室溫且攪拌30分鐘。添加5 M NaOH水溶液(161 mL，1.20當量)及水(200 mL)。在回流下加熱3.5小時。添加水(500 mL)及乙酸異丙酯(800 mL)。冷卻至室溫。添加濃縮HCl水溶液以將pH調節至約9-10。分離各層。經無水MgSO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液。添加EtOAc (360 mL)及己烷(840 mL)。在回流下加熱五分鐘。冷卻至-20℃且靜置隔夜。過濾且用冷己烷洗滌所收集之固體，得到呈無色固體狀之標題化合物(118 g，88%)。MS (ES)m/z = 201 (M+H)。
製備 6 N-(3,5-二氟-2-甲氧基苯基)硫脲
Figure 02_image043
合併異硫氰酸苯甲醯酯(3.2 mL，24 mmol)及THF (100 mL)。逐滴添加3,5-二氟-2-甲氧基苯胺(4.0 g，1.0當量)。在室溫下攪拌三小時。在真空中濃縮反應混合物。添加THF (100 mL)及1 M NaOH水溶液(14 mL，1.2當量)。在80℃下加熱隔夜。在真空中濃縮反應混合物。用1:1 EtOAc:DCM稀釋，音波處理且過濾。真空濃縮濾液。以正相層析法純化，用0-50% EtOAc/DCM梯度溶離，得到標題化合物(3.5 g，67%)。MS (ES)m/z = 219 (M+H)。
製備 7 7-氟-4-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-胺溴化氫
Figure 02_image045
合併N-(5-氟-2-甲氧基苯基)硫脲(118 g，571 mmol)及CHCl3 (2 L)。在N2 下冷卻至5℃。逐滴添加Br2 (30.1 mL，1.02當量)，維持內部反應溫度低於7℃。在0℃下攪拌30分鐘。在回流下加熱2.25小時。冷卻至-20℃且靜置隔夜。過濾且用冷己烷洗滌，得到呈黃色固體狀之標題化合物(141 g，89%)。MS (ES)m/z = 199 (M+H)。
製備 8 5,7-二氟-4-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-胺溴化氫
Figure 02_image047
以類似於描述於製備7中之方法的方式製備標題化合物。MS (ES)m/z 217 (M+H)。
製備 9 2-胺基-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-醇
Figure 02_image049
合併5,7-二氟-4-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-胺溴化氫(4.0 g，13 mmol)及DCM (70 mL)。冷卻至0℃。添加BBr3 (1.0 M於DCM中，34 mL，2.5當量)。使其緩慢升溫至室溫且攪拌隔夜。小心地用MeOH (100 mL)淬滅。在室溫下攪拌30分鐘。用飽和NaHCO3 水溶液稀釋。在室溫下攪拌30分鐘。過濾，得到呈白色固體狀之標題化合物(2.7 g，92%)。MS (ES)m/z = 203 (M+H)。
製備 10 (5,7-二氟-4-羥基-1,3-苯并噻唑-2-基)胺基甲酸第三丁酯
Figure 02_image051
合併2-胺基-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-醇(2.5 g，12 mmol)及THF (60 mL)。添加TEA (3.4 mL，2.0當量)、DMAP (0.3 g，0.2當量)及二碳酸二-第三丁酯(4.2 g，1.5當量)。在室溫下攪拌隔夜。在真空中濃縮反應混合物。添加MeOH (60 mL)及NaOMe (3.4 g，5.0當量)。在室溫下攪拌隔夜。倒入冰/水之混合物中。過濾以移除固體。將濃縮HCl水溶液添加至濾液中以將pH調節至約5。用DCM稀釋。分離各層。經無水硫酸鈉乾燥有機物，過濾，且在真空中濃縮，得到呈淡棕色固體狀之標題化合物(1.4 g，31%)。MS (ES)m/z = 301 (M-H)。
製備 11 2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-醇溴化氫
Figure 02_image053
在N2 下冷卻DCM (1.5 L)至0℃。經由插管添加BBr3 (150 mL，3.1當量)。歷經15分鐘逐份添加7-氟-4-甲氧基-1,3-苯并噻唑-2-胺溴化氫(141 g，506 mmol)。使反應混合物緩慢升溫至室溫且攪拌隔夜。冷卻至0℃且用MeOH小心地淬滅，保持內部溫度低於10℃。使氣體輸出鼓泡至冷的5 M NaOH水溶液中。過濾且用冷DCM洗滌所收集之固體，得到呈無色固體狀之標題化合物(117 g，87%)。MS (ES)m/z = 185 (M+H)。
製備 12 (7-氟-4-羥基-1,3-苯并噻唑-2-基)胺基甲酸第三丁酯
Figure 02_image055
合併2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-醇溴化氫(117 g，441 mmol)及1,4-二噁烷(1.5 L)。冷卻至10℃。添加TEA (129 mL，2.1當量)且保持內部反應溫度低於15℃。添加DMAP (2.7 g，0.05當量)及二碳酸二-第三丁酯(228 g，2.3當量)。使反應混合物緩慢升溫至室溫且攪拌兩天。用水、EtOAc及飽和NaCl水溶液稀釋。分離各層。收集且在真空中濃縮有機層。添加MeOH (900 mL)及NaOMe (5 M於MeOH中，132 mL，1.5當量)。在室溫下攪拌隔夜。添加額外NaOMe (5 M於MeOH中，10 mL，0.11當量)。在室溫下攪拌三小時。在真空中濃縮。用水及EtOAc稀釋。分離各層。經無水MgSO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液直至固體形成。用己烷稀釋。過濾且用己烷洗滌所收集之固體，得到呈淡褐色固體狀之標題化合物(97.2 g，78%)。MS (ES)m/z = 283 (M-H)。
製備 13 三氟甲烷磺酸2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-酯
Figure 02_image057
合併(7-氟-4-羥基-1,3-苯并噻唑-2-基)胺基甲酸第三丁酯(116 g，407 mmol)、DCM (1.4 L)及吡啶(66 mL，2.0當量)。在N2 下冷卻至5℃。逐滴添加TF2 O (83 mL，1.2當量)，同時保持內部反應溫度低於10℃。用水稀釋。分離各層。用10%檸檬酸水溶液洗滌有機層。經無水MgSO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液。以正相層析法純化，用25-28% B/A梯度(A：己烷，B：25% DCM/EtOAc)溶離，得到呈黃色固體狀之標題化合物(123 g，73%)。MS (ES)m/z = 415 (M-H)。
製備 14 三氟甲烷磺酸2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-酯
Figure 02_image059
以類似於描述於製備13中之方法的方式製備標題化合物。MS (ES)m/z 433 (M+H)。
製備物 15 {2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基}
Figure 108136024-A0101-12-0030-1
酸
Figure 02_image061
在1,4-二噁烷(20 mL)中合併三氟甲磺酸2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-酯(1.7 g，3.9 mmol)、乙酸鉀(1.1 g，2.9當量)及雙(頻哪醇根基)二硼(8.0 g，8.1當量)。用N2 噴氣十分鐘。添加1,1'-雙(二苯膦基)二茂鐵-二氯化鈀(ii)二氯甲烷錯合物(0.48 g，0.15當量)。在100℃下加熱隔夜。添加雙(頻哪醇根基)二硼(2.5 g，2.5當量)及1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵-二氯化鈀(ii)二氯甲烷錯合物(0.48 g，0.15當量)。在100℃下加熱八小時。冷卻至室溫。在真空中濃縮反應混合物。用EtOAc稀釋。經由矽藻土及小二氧化矽膠墊過濾。真空濃縮濾液。以正相層析法純化，用0-100% B/A梯度(A：己烷，B：10% MeOH/EtOAc)溶離，得到呈棕色固體狀之標題化合物(0.41 g，32%)。MS (ES)m/z = 331 (M+H)。
製備 16 {2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}
Figure 108136024-A0101-12-0030-1
酸
Figure 02_image063
在1,4-二噁烷(240 mL)中合併三氟甲烷磺酸2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-酯(20.0 g，48.1 mmol)、乙酸鉀(14.2 g，3.0當量)、雙(頻哪醇根基)二硼(97.7 g，8.0當量)及肆(三苯基膦)鈀(0) (5.55 g，0.10當量)。用N2 噴氣十分鐘。在80℃下加熱隔夜。冷卻至室溫且用水及EtOAc稀釋。分離各層。經無水MgSO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液。添加丙酮(500 mL)、水(500 mL)及NH4 OAc (112 g，30當量)。添加NaIO4 (309 g，30當量)，同時保持內部反應溫度在18-23℃之間。在室溫下劇烈攪拌隔夜。用EtOAc稀釋。攪拌30分鐘，經由矽藻土過濾且分離各層。在真空中濃縮有機層。用飽和NaCl水溶液稀釋水層且用EtOAc萃取兩次。將有機萃取物與先前經濃縮之有機層合併。多次洗滌，首先用水洗滌，隨後用飽和NaCl水溶液洗滌，隨後用水及飽和NaHCO3 水溶液(pH約7)洗滌。經無水MgSO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液。用少量DCM在己烷中漿化。過濾且用己烷洗滌所收集之固體，得到呈褐色固體狀之標題化合物(13.4 g，89%)。MS (ES)m/z = 313 (M+H)。
製備 17 {2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1,3-苯并噻唑-4-基}
Figure 108136024-A0101-12-0030-1
酸
Figure 02_image065
合併(4-溴-1,3-苯并噻唑-2-基)胺基甲酸第三丁酯(8.0 g，24 mmol)及THF (115 mL)。在N2 下置放。逐份添加NaH (60質量%於石蠟油中，1.5 g，1.5當量)。在室溫下攪拌十分鐘，隨後冷卻至-78℃。逐滴添加正丁基鋰(2.5 M於己烷中，15 mL，1.5當量)。攪拌25分鐘。逐滴添加硼酸三異丙酯(17 mL，3.0當量)。攪拌25分鐘且隨後使反應混合物升溫至室溫。用飽和NH4 Cl水溶液淬滅。用EtOAc、水及飽和NaCl水溶液稀釋。分離各層。經無水MgSO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液。在己烷中漿化。過濾且用己烷洗滌所收集之固體。部分濃縮濾液，溶解於最少量EtOAc中，添加己烷，過濾且用己烷洗滌，得到更多固體。重複直至不再形成固體為止。合併固體，得到標題化合物(6.2 g，87%)。MS (ES)m/z = 295 (M+H)。
製備 18 4-(7-溴-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯
Figure 02_image067
在DCM (68 mL)中合併7-溴-4,6-二氯-8-氟喹唑啉(2.0 g，6.9 mmol；參見US 9,840,516)及哌嗪-1-甲酸第三丁酯(3.8 g，3.0當量)。添加TEA (9.6 mL，10當量)。在35℃下在N2 下攪拌隔夜。在真空中濃縮反應混合物。用EtOAc及水稀釋。用飽和NaCl水溶液洗滌有機層。經無水MgSO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液。用DCM及己烷稀釋，隨後過濾。真空濃縮濾液。以正相層析法純化，用0-5% MeOH/EtOAc梯度溶離，得到標題化合物(2.5 g，80%)。MS (ES)m/z = (79 Br/81 Br) 445/447 (M+H)。
製備 19 4-(7-溴-6-氯喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯
Figure 02_image069
在ACN (70 mL)中合併7-溴-4,6-二氯喹唑啉(5.4 g，16 mmol；參見US 9,840,516)及哌嗪-1-甲酸第三丁酯(3.3 g，1.1當量)。添加K2 CO3 (4.5 g，2.0當量)。在60℃下攪拌4.5小時。冷卻至室溫。歷經15分鐘添加水(200 mL)。過濾且在真空下乾燥，得到呈白色固體狀之標題化合物(6.8 g，98%)。MS (ES)m/z = (79 Br/81 Br) 427/429 (M+H)。
製備 20 4-(7-溴-6,8-二氯喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯
Figure 02_image071
以類似於描述於製備19中之方法的方式製備標題化合物。MS (ES)m/z 463 (M+H)
製備 21 4-(7-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯
Figure 02_image073
在1,4-二噁烷(10 mL)及水(3 mL)中合併4-(7-溴-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯(0.60 g，1.4 mmol)、{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}
Figure 108136024-A0101-12-0030-1
酸(0.47 g，1.1當量)及磷酸鉀(0.43 g，1.5當量)。用N2 噴氣十分鐘。添加1,1'-雙(二-第三丁基膦基)二茂鐵二氯化鈀(0.085 g，0.10當量)。在90℃下攪拌105分鐘。冷卻至室溫。用水(1 mL)稀釋且經由矽藻土過濾。用EtOAc洗滌。在真空中濃縮濾液且藉由正相層析純化，用20%丙酮/己烷溶離，得到呈白色固體狀之標題化合物(0.85 g，89%)。MS (ES)m/z = 633 (M+H)。
類似於描述於製備21中之方法製備表1中之以下化合物。表 1
Prep # 化學名稱 結構 MS (ES)m/z (M+H)
22 4-(7-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯
Figure 02_image075
 651
23 4-(7-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯
Figure 02_image077
 615
24 4-(7-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6,8-二氯喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯
Figure 02_image079
 649
25 4-(7-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯
Figure 02_image081
 615
26 4-(7-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯   
Figure 02_image083
 651
製備 27 KRas 探針（KRas Probe） N-(2-{2-[2-({6-氯-8-氟-7-(3-羥基萘-1-基)-4-[4-(丙-2-烯醯基)哌嗪-1-基]喹唑啉-2-基}胺基)乙氧基]乙氧基}乙基)-5-[(3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊醯胺
Figure 02_image085
步驟 A ：合併4-(7-溴-2,6-二氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯(0.51 g，1.1 mmol)及IPA (5 mL)。添加DIPEA (0.55 mL，3.0當量)及5-[(3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]-N-[2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙基]戊醯胺(0.48 g，1.2當量)。於微波反應器中加熱至120℃維持六小時。冷卻至室溫。用飽和NH4 Cl水溶液及含25% IPA之CHCl3 稀釋。分離各層。用飽和NaCl水溶液洗滌有機層。經無水Na2 SO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液。以正相層析法純化，用50-100% B/A梯度(A：己烷，B：10% MeOH/DCM)溶離，得到呈黃色固體狀之4-{7-溴-6-氯-8-氟-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊醯基}胺基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸第三丁酯(0.68g，78%)。MS (ES)m/z = 819 (M+H)。
步驟 B ：合併4-{7-溴-6-氯-8-氟-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊醯基}胺基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸第三丁酯(0.30g，0.37mmol)、1,4-二噁烷(4 mL)及水(0.75mL)。添加K2 CO3 (0.24 g，3.0當量)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼㖦-2-基)萘-2-醇(0.20 g，2.0當量)及肆(三苯基膦)鈀(0) (0.085 g，0.20當量)。在85℃下在N2 下攪拌12小時。冷卻至室溫。過濾以移除固體。用飽和NH4 Cl水溶液及EtOAc稀釋濾液。分離各層。用飽和NaCl水溶液洗滌有機層。經無水Na2 SO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液。以正相層析法純化，用90-100% B/A梯度(A：己烷，B：10% MeOH/DCM)溶離，得到呈黃色固體狀之4-{6-氯-8-氟-7-(3-羥基萘-1-基)-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊醯基}胺基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸第三丁酯(0.31 g，96%)。MS (ES)m/z = 881 (M+H)。
步驟 C ：冷卻4-{6-氯-8-氟-7-(3-羥基萘-1-基)-2-[(2-{2-[2-({5-[(3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊醯基}胺基)乙氧基]乙氧基}乙基)胺基]喹唑啉-4-基}哌嗪-1-甲酸第三丁酯(0.31g，0.35 mmol)於MeOH (4mL)中之溶液至0℃。添加HCl(3 M於MeOH中，6 mL，50當量)且在0℃下攪拌30分鐘。升溫至室溫且攪拌隔夜。在真空中濃縮反應混合物。用DCM稀釋且在真空中濃縮。用己烷稀釋且在室溫下攪拌兩小時。過濾且在真空下乾燥所得固體，得到N-{2-[2-(2-{[6-氯-8-氟-7-(3-羥基萘-1-基)-4-(哌嗪-1-基)喹唑啉-2-基]胺基}乙氧基)乙氧基]乙基}-5-[(3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊醯胺氯化氫。藉由與DIPEA (0.16 mL，4.0當量)在DCM (2.5 mL)中合併來中和此氫氯酸鹽(0.19 g，0.23 mmol)。冷卻至-78℃。添加氯化丙烯醯基(0.5 M於DCM中，0.4 mL，0.9當量)。30分鐘後，升溫至室溫。在一小時之後，用MeOH (1 mL)稀釋且在真空中濃縮反應混合物。以逆相層析法純化，用35-60% B/A梯度(A：10 mM NH4 HCO3 水溶液，具有5% MeOH；B：ACN)溶離，得到呈白色固體狀之標題化合物(0.027 g，14%)。MS (ES)m/z = 835 (M+H)。
實例 1 1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮
Figure 02_image087
將TFA (2 mL)添加至4-(7-{2-[(第三丁氧基羰基)胺基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基}-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基)哌嗪-1-甲酸第三丁酯(0.76 g，1.2 mmol)於DCM(10 mL)中之溶液中。在室溫下攪拌三天。在真空中濃縮反應混合物。用DCM稀釋且在真空中濃縮；重複三次。用Et2 O (30 mL)稀釋且在室溫下快速攪拌三小時。過濾且在真空下乾燥，得到4-[6-氯-8-氟-4-(哌嗪-1-基)喹唑啉-7-基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-2-胺二三氟乙酸。
在2-甲基四氫呋喃(5 mL)及水(5 mL)中合併4-[6-氯-8-氟-4-(哌嗪-1-基)喹唑啉-7-基]-7-氟-1,3-苯并噻唑-2-胺二三氟乙酸(0.50 g，0.91 mmol)及碳酸鉀(0.56 g，4.4當量)。冷卻至0℃。添加氯化丙烯醯基(0.5 M於2-甲基四氫呋喃中，2.0 mL，1.1當量)。在五分鐘之後，用EtOAc及水稀釋。分離各層。用飽和NaCl水溶液洗滌有機層。經無水Na2 SO4 乾燥有機層，過濾，且在真空中濃縮濾液。將殘餘物溶解於DCM (5 mL)中。快速攪拌且緩慢添加己烷(15 mL)。在室溫下攪拌15分鐘，過濾且真空乾燥所收集之固體，得到呈白色固體狀之標題化合物(0.32 g，72%)。MS (ES)m/z = 487 (M+H)。
使用上文所描述之適當製備22-26製備類似於描述於實例1中之方法的表2中之以下實例。表 2
Ex # 化學名稱 結構 MS (ES)m/z (M+H) 產率
2 1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6,8-二氯喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮
Figure 02_image089
 503 66%
3 1-{4-[7-(2-胺基-6,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮   
Figure 02_image091
 505 70%
4 1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮   
Figure 02_image093
 469 15%
5 1-{4-[7-(2-胺基-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮   
Figure 02_image095
 469 86%
6A‡ 1-{4-[7-(2-胺基-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮滯轉異構體1   
Figure 02_image097
 505 23%
6B‡ 1-{4-[7-(2-胺基-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮滯轉異構體2
Figure 02_image099
 505 23%
‡ 在以下對掌性層析條件下，分離1-{4-[7-(2-胺基-5,7-二氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮(0.062g)，得到標題化合物(0.025 g及0.025 g)：滯轉異構體1＞99% ee，40% EtOH/60% CO2 ，80 mL/min，21 x 250 mm，Chiralcel® OD-H。MS (ES)m/z = 505 (M+H)。滯轉異構體2＞99% ee，40% EtOH/60% CO2 ，80 mL/min，21 x 250 mm，Chiralcel® OD-H。MS (ES)m/z = 505 (M+H)。以下說明實例6之兩種滯轉異構體之結構。
Figure 02_image101
實例 7 1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；半丙二酸鹽
Figure 02_image103
將9:1 THF:水(2.2 mL)添加至含有1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮(199 mg，0.409 mmol)之小瓶中，得到黃色溶液。在獨立小瓶中，添加THF (0.1 mL)至丙二酸(48 mg，1.1當量)以獲得無色溶液。將丙二酸溶液添加至實例1溶液且用0.1 mL THF沖洗。在週期性加種晶下分批添加EtOAc (5 mL)，得到混濁混合物。在真空中部分濃縮混合物以移除溶劑。經由濃縮移除約5.4 g總質量，以形成懸浮液。在室溫下攪拌混合物，得到濃稠懸浮液。添加EtOAc (1.5 mL)以使懸浮液變稀且隨後過濾，且用EtOAc (5 mL)沖洗來自小瓶之所有固體。在真空烘箱中在50℃下乾燥固體，得到呈淺黃色固體狀之標題化合物(177 mg，79%)。1 H NMR (DMSO-d6 ): δ 12.64 (br s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.00 (d,J = 1.4 Hz, 1H), 7.92 (br s, 2H), 7.25 (dd,J = 8.4, 5.7 Hz, 1H), 7.06 (dd,J = 9.1, 8.6 Hz, 1H), 6.81 (dd,J = 16.8, 10.5 Hz, 1H), 6.16 (dd,J = 16.8, 2.4 Hz, 1H), 5.73 (dd,J = 10.5, 2.4 Hz, 1H), 3.86-3.96 (m, 4H), 3.82 (br s, 2H), 3.75 (br s, 2H), 3.22 (s, 1H)。晶種製備：添加9:1 THF:水(5 mL)至1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮(149 mg，0.306 mmol)，隨後添加丙二酸(50 mg，1.55當量)。在N2 下乾燥溶液48小時。將EtOAc (5 mL)添加至所得油中且在50℃下攪拌2小時以形成白色固體之漿料。過濾以得到1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；半丙二酸鹽晶體用於接種。
實例 8 1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；甲磺酸鹽
Figure 02_image105
將1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮(6.56 g，13.5 mmol)添加至燒瓶中。添加9:1 THF:水(55 mL)且加熱混合物至50℃。過濾所得溶液且用9:1 THF:水(3.3 mL)沖洗。將經過濾溶液裝入注射器，且置放於注射泵中。單獨地，將甲磺酸(0.83 mL，0.95當量)添加至THF (13 mL)中。將此溶液裝入注射器且置放於第二注射泵中。將1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸鹽晶種(65 mg)連同THF (13 mL)一起添加至燒瓶中。在室溫下攪拌晶種漿料。以0.225 mL/min之1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮溶液及0.0575 mL/min之甲磺酸溶液開始，將1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮溶液及甲磺酸溶液添加至晶種漿料。1小時之後，將添加速率分別增加至0.3 mL/min及0.077 mL/min。再過1小時之後，將添加速率分別增加至0.45 mL/min及0.115 mL/min。在共添加完成之後，攪拌漿料約45分鐘。過濾漿料且用95:5 THF:水(2×13 mL)沖洗。在50℃下在真空下乾燥濕濾餅至恆重。分離呈白色固體狀之標題化合物(6.22 g，79%)。1 H NMR (400 MHz, DMSO-d6 , 25ºC): δ = 8.82 (s, 1H), 8.17 (d,J = 1.2 Hz, 1H), 7.98 (br s, 2H), 7.29 (dd,J = 8.5, 5.7 Hz, 1H), 7.11 (t,J = 8.8 Hz, 1H), 6.82 (dd,J = 16.7, 10.4 Hz, 1H), 6.19 (dd,J = 16.7, 2.4 Hz, 1H), 5.76 (dd,J = 10.4, 2.4 Hz, 1H), 4.12-4.25 (m, 4H), 3.90 (br s, 2H), 3.81 (br s, 2H), 2.35 ppm (s, 3H)。晶種製備：在60℃下加熱1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮(218 mg，0.448 mmol)於THF (3 mL)中之混合物。將稀釋於THF (2 mL)中之甲磺酸(40 µL)添加至混合物中。將THF (10 mL)添加至所得漿料中且在室溫下攪拌。過濾且在氮氣下乾燥所收集之固體15分鐘，得到1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；用於接種之甲磺酸鹽晶體。
實例 9 結晶形態之X射線粉末繞射(XRPD) 獲得在35 kV及50 mA下操作，配備有CuKα源及Vantec偵測器的Bruker D4 Endeavor X射線粉末繞射儀上之結晶固體的XRPD圖案。掃描4與40 2θ°之間的樣品，其中步長為0.008 2θ°且掃描速率為0.5秒/步，且使用1.0 mm散度，6.6 mm固定抗散射及11.3 mm探測器狹縫。將乾燥粉末封裝在石英樣本固持器上且使用玻璃載片獲得光滑表面。在室溫及相對濕度下收集晶形繞射圖。在全部圖案基於內部NIST 675標準位移之後測定在MDI-Jade中晶體峰位置，峰在8.853及26.774 2θ°處。結晶學技術中已熟知，對於任何既定晶形，歸因於由諸如晶體形態及習性之因素所產生之較佳定向，繞射峰之相對強度可變化。在存在較佳定向之效應之情況下，峰強度改變，但多晶型物之特徵峰位置不變。參見例如The United States Pharmacopeia #23，National Formulary #18，第1843-1844頁，1995。此外，結晶學技術中亦熟知，對於任何既定晶形，角峰位置可略微變化。舉例而言，峰位置可能由於分析樣本時之溫度變化、樣本移位或是否存在內部標準物而位移。在本發明之情況下，假定± 0.2 2θ°之峰位置變化以考慮到此等潛在變化而不妨礙指定晶形之明確識別。可基於區分峰之任何獨特組合進行晶形之確認。
實例 9a 1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；半丙二酸鹽之XRPD 結晶半丙二酸鹽形式之製備樣品的特徵為使用CuKα輻射之XRPD圖案具有如描述於下表3中之繞射峰(2-θ值)，且尤其具有在5.4°處之峰以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：13.5°、7.1°及23.0°；同時繞射角之公差為0.2度。表 3 ：實例1之結晶半丙二酸酯之XRPD峰。
峰 角度+/- 0.2 (2θ°) 相對強度(最強峰之%)
1 5.4 100.00
2 6.4 22.00
3 7.1 49.10
4 11.1 34.50
5 13.5 66.20
6 15.2 28.60
7 17.1 23.20
8 20.7 26.50
9 21.2 24.80
10 23.0 39.80
實例 9b 1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮；甲磺酸鹽之XRPD 結晶甲磺酸鹽之製備樣品的特徵為使用CuKα輻射之XRPD圖案具有如描述於下表4中之繞射峰(2-θ值)，且尤其具有在6.1°處之峰以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°；同時繞射角之公差為0.2度。表 4 ：實例1之結晶甲磺酸鹽之XRPD峰
峰 角度 +/- 0.2 (2θ°) 相對強度(最強峰之%)
1 6.1 100.00
2 13.2 22.10
3 14.2 17.70
4 18.6 24.30
5 19.8 24.20
6 20.3 20.90
7 21.3 42.10
8 23.9 18.30
9 24.6 19.60
10 25.4 21.90
生物檢定 KRas G12C 探針（KRas G12C Probe）佔有率 TR-FRET 檢定 此檢定量測抑制劑與探針競爭結合且共價修飾密碼子12上之KRas G12C的能力。信號藉由時差式螢光轉移產生，該螢光轉移在結合於KRas G12C銪標記之抗組胺酸標籤抗體LanthaScreen(Eu Anti-His抗體)之抗體上之銪與經由抗生蛋白鏈菌素及生物素化抑制劑(「KRas探針」，參見製備27) 結合於KRas G12C之螢光Tracer 647 (Alexa Fluor™)之間。
抑制劑以劑量反應形式由含10 mM儲備液之100% DMSO測試。使用Labycyte Echo® 555來稀釋且將含有10點、2.8倍連續稀釋液之每孔100 nL轉移至檢定盤。製備檢定盤之兩個複本以量測抑制劑與KRas G12C一起培育5及60分鐘之後的效能。將His標記之KRas G12C (20 nM)添加至檢定緩衝液(20 mM參-HCl，pH 7.5，0.01% TX-100及1 mM DTT)中之盤中。培育5或60分鐘之後，添加1 µM KRas探針且使其共價修飾游離KRas G12C 1小時。此在含有Eu Anti-His抗體及抗生蛋白鏈菌素塗佈之Tracer 647 (均來自Life Technologies)之緩衝液中稀釋4倍，得到KRas G12C (5 nM)、Anti-His抗體(2 nM)、KRas探針(300 nM)及經抗生蛋白鏈菌素塗佈之Tracer 647 (500 nM)。30分鐘後，在Envision™盤讀取器上讀取螢光信號(在340 nM下激發、在665 nM下跟蹤器發光及在615 nM下抗體發光)。最大對照孔缺乏抑制劑且最小對照孔缺乏抑制劑與KRas G12C。信號比率(在615處em/在665處em)使用以下等式轉化成抑制%：抑制% =100- [(測試化合物信號-中值最小信號) / (中值最大信號-中值最小信號) ×100]。IC50 藉由使用Genedata Screener®將各抑制劑濃度下之抑制%擬合至四個參數非線性對數等式來測定： y = (A+((B-A) / (1 + ((C/x)^D))))其中，y=抑制%，A=最小漸近線，B=最大漸近線，C=相對IC50 ，或在兩個漸近線之擬合範圍內產生50%抑制的抑制劑濃度，且D=希爾斜率(Hill Slope)。
大體上如上文所述本發明範疇內之化合物在此檢定中經評估。在此檢定中評估之本發明之例示性化合物展現小於500 nM之IC50 用於60分鐘培育，且小於1200 nM之IC50 用於5分鐘培育。在此檢定中評估之實例1之化合物在5及60分鐘時分別展現0.025及0.024 µM之IC50 ，n=5。此資料表明，如表5中所述，實例之化合物在此結合檢定中展現KRas G12C抑制活性。表 5
化合物 TR-FRET 60 min (uM) pERK (uM) RAS-GTP (uM)
實例1 0.024  (n=4) 0.00566  (n=13) 0.0371  (n=10)
實例2 0.0476  (n=4) 0.0194  (n=5) 0.148  (n=5)
實例3 0.0209  (n=4) 0.0153  (n=7) 0.166  (n=8)
實例4 0.0250  (n=4) 0.0271  (n=5) 0.234  (n=5)
實例5 0.0278  (n=2) 0.00973  (n=6) 0.104  (n=5)
實例6a ＜0.0189 (n=2) 0.00394  (n=2) 0.0117  (n=3)
實例6b 0.449  (n=1) 0.256  (n=2) 0.743  (n=3)
Figure 02_image107
 0.578  (n=3) 1.60  (n=2) 3.78  (n=2)
Figure 02_image109
 0.0452  (n=201) 0.204  (n=6) 0.392  (n=199)
Figure 02_image111
 82.2  (n=4) ＞5.00  (n=4) ＞50.0  (n=4)
發現於WO2015/0545572中之比較化合物。
以上資料證明，相較於此項技術中之某些KRas G12C抑制劑，實例1在效能方面具有出人意料的改良。
H358 細胞磷酸 -ERK AlphaLISA® 此檢定用於量測測試化合物抑制p-ERK1/2 (人類肺癌細胞H358 (ATCC CRL-5807)中之KRas之下游效應子)之磷酸化的能力。簡言之，AlphaLISA® SureFire® Ultra™ p-ERK 1/2 (Thr202/Tyr204)檢定為一種夾心免疫檢定，其使用α技術(Perkin Elmer Cat# ALSU-PERK-A50K)，用以定量偵測細胞溶解物中之磷酸-ERK 1/2 (於ERK1中之Thr202/Tyr204，或於ERK2中之Thr185/Tyr187上磷酸化)。
H358細胞在含有10%FBS (GIBCO Cat#: 10082-147)的100 µL培養基(RPMI 1640, GIBCO Cat# 22400-071)中，以每孔40K細胞塗於96孔盤(Costar #3596)中，且在37℃，5%CO2 下在潮濕塔盤中培育隔夜。第二天早晨，將10 µL經連續稀釋(3倍)之測試化合物(50 µM最高濃度)及10 uL對照物(最大信號孔：5% DMSO及最小信號孔：2 µM之N-(3-{3-環丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)胺基]-6,8-二甲基-2,4,7-三側氧基-3,4,6,7-四氫吡啶并[4,3-D]嘧啶-1(2H)-基}苯基)乙醯胺(曲美替尼作為陽性對照物)添加至細胞盤中，且在潮濕塔盤中在37℃/5% CO2 下培育2小時。在室溫下製備含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合液之溶解緩衝液。藉由在水槽中倒置及震盪細胞盤移除培養基，且隨後吸墨至紙巾上。將溶解緩衝液添加至細胞盤(每孔50 µL)中且在室溫下在震盪器上培育盤10分鐘。對於p-ERK偵測，將受體珠粒用緩衝液稀釋於懸浮液混合物中。使用Starlett液體處置器，將5 µL受體珠粒及2 µL細胞裂解物作為單步驟尖端稀釋轉移至384孔檢定盤。用箔密封檢定盤且在室溫下培育2小時。將供體珠粒用緩衝液稀釋於懸浮液混合物中。使用Starlet，將5 µL供體珠粒添加至檢定盤中，隨後將檢定盤用箔密封及包裹。在室溫下在暗處培育盤2小時。隨後使用發光程序在EnVision™盤讀取器(Perkin Elmer)上讀取檢定盤。
使用以下等式將信號轉化為抑制%：抑制% =100- [(測試化合物信號-中值最小信號) / (中值最大信號-中值最小信號) ×100]。最大信號為無抑制劑之對照孔。最小信號為含有足以完全抑制活性之參考抑制劑的對照孔。IC50 藉由使用Genedata Screener®將各抑制劑濃度下之抑制%擬合至四個參數非線性對數等式來測定：y = (A+((B-A) / (1 + ((C/x)^D)))) 其中，y=抑制%，A=最小漸近線，B=最大漸近線，C=相對IC50 ，或在兩個漸近線之擬合範圍內產生50%抑制的抑制劑濃度，且D=希爾斜率。
大體上如上文所述本發明範疇內之化合物在此檢定中經評估。實例之化合物展現小於0.300 µM之相對IC50 。在此檢定中，實例1之化合物展現0.0057 µM之相對IC50 ，n=13。此資料表明，在此細胞檢定中，實例之化合物展現KRas G12C抑制活性。
H358 細胞活性 RAS GTP 酶 ELISA 此檢定用於量測測試化合物抑制人類肺癌細胞H358 (ATCC CRL-5807)中之組成型RAS GTP酶活性之能力。RAS GTP酶ELISA套組(Active Motif Cat# 52097)含有預塗有麩胱甘肽之96孔盤以捕獲套組供應之GST-Raf-RBD蛋白。細胞提取物中活化RAS (GTP結合)特異性結合於Raf-RBD。用識別人類KRas之一級抗體偵測結合之RAS。與HRP結合之二級抗體識別一級抗體且產生溶液提供化學發光讀數。
將H358細胞以80,000個細胞/孔塗於90 µL無血清培養基(RPMI 1640，GIBCO)中且在37℃/5% CO2 下培育隔夜。第二天早晨，將10 µL經連續稀釋(3倍)之測試化合物(500 µM最高濃度)及10 uL對照物(最大信號孔：5% DMSO及最小信號孔：500µM LSN3429410作為抑制劑)添加至細胞盤中，且在37℃/5% CO2 下培育2小時。製備含有蛋白酶抑制劑混合液及GST-Raf-RBD之完整溶解/結合緩衝液，且將其儲存在冰上。在細胞盤培育完成一小時之前，在溶解/結合緩衝液中稀釋50 µL GST-Raf-RBD，且向ELISA檢定盤中添加緩衝液且在4℃下在平緩搖盪下培育1小時。2小時後，用100 µL冰冷PBS洗滌細胞且用100 µL溶解/結合緩衝液溶解。在室溫下震盪細胞盤10分鐘。隨後在室溫下以1500 rpm離心細胞盤10分鐘。在此時間期間，在室溫下製備1×洗滌緩衝液且隨後用於洗滌(3×100 µL)經GST-Raf-RBD塗佈之檢定盤。洗滌之後，將50 µL細胞溶解物添加至經GST-Raf-RBD塗佈之檢定盤中且在室溫下在輕微震盪下培育1小時。在此培育期期間，製備1×抗體結合緩衝液且使其達到室溫。檢定盤用1×洗滌緩衝液洗滌3×100µL，且隨後添加50 µL一級抗體(在1×抗體結合緩衝液中以1:500稀釋)。在室溫下培育盤1小時。檢定盤用1×洗滌緩衝液洗滌3×100 µl，且隨後添加50 µL二級抗體(在1×抗體結合緩衝液中以1:5000稀釋)且在室溫下培育1小時。檢定盤用1×洗滌緩衝液洗滌4 x 100 µL且隨後在室溫下添加50 µL化學發光工作溶液。隨後使用發光程序在EnVision™盤讀取器(Perkin Elmer)上讀取檢定盤。
使用以下等式將信號轉化為抑制%：抑制% =100- [(測試化合物信號-中值最小信號) / (中值最大信號-中值最小信號) ×100]。最大信號為無抑制劑之對照孔。最小信號為含有足以完全抑制活性之參考抑制劑的對照孔。IC50 藉由使用Genedata Screener®將各抑制劑濃度下之抑制%擬合至四個參數非線性對數等式來測定：y = (A+((B-A) / (1 + ((C/x)^D)))) 其中，y=抑制%，A=最小漸近線，B=最大漸近線，C=相對IC50 ，或在兩個漸近線之擬合範圍內產生50%抑制的抑制劑濃度，且D=希爾斜率。
大體上如上文所述本發明範疇內之化合物在此檢定中經評估。實例之化合物展現小於0.750 µM之相對IC50 。在此檢定中，實例1之化合物展現0.037 µM之相對IC50 ，n=10。此資料表明，實例之化合物在此人類肺癌細胞培養物中展現KRas-GTP抑制活性。
3D H358 細胞增殖檢定 人類肺癌細胞H358，(ATCC CRL-5807)用於在3D增殖檢定中評估化合物抑制。藉由CellTiterGlo® 3D試劑(Promega G9683)偵測信號反映細胞增殖。使細胞在補充有10%熱滅活FBS及0.1 mg/ml青黴素/鏈黴素之RPMI 1640 (GIBCO®)中生長。在生長階段中培養H358細胞，且每孔五千個細胞經80 µl/孔之培養基塗於黑色孔透明圓形底部96孔超低附著表面板(Corning® Cat 4520)中。將細胞在37℃下於潮濕箱中培育隔夜。將20 µl/孔連續稀釋之測試化合物添加至盤中，隨後培育96小時。使盤達到室溫且添加相等體積之室溫CellTiterGlo® 3D試劑。盤在室溫下在750 RPM下震盪10分鐘。在室溫下培育1小時以穩定信號之後，在EnVision™盤讀取器上量測發光信號。使用以下等式將信號轉化為抑制%：抑制% =100- [(測試化合物信號-中值最小信號) / (中值最大信號-中值最小信號) ×100]。最大信號為無抑制劑之對照孔。最小信號為含有足以完全抑制細胞增殖之參考抑制劑的對照孔。IC50 藉由使用Genedata Screener®將各抑制劑濃度下之抑制%擬合至四個參數非線性對數等式來測定：y = (A+((B-A) / (1 + ((C/x)^D))))其中，y=抑制%，A=最小漸近線，B=最大漸近線，C=相對IC50 ，或在兩個漸近線之擬合範圍內產生50%抑制的抑制劑濃度，且D=希爾斜率。
大體上如上文所述本發明範疇內之化合物在此檢定中經評估。實例1之化合物在此檢定中展現小於0.0116 µM之相對IC50 。此資料展示實例1之化合物抑制H358人類肺癌細胞之增殖。
CellTiterGlo 細胞增殖檢定 收集一組含有KRas G12C或其他KRas突變之腫瘤細胞株(表6)。所有細胞株係來自ATCC或所指示之其他來源。
通常，在補充有10% FBS (GIBCO，Invitrogen)之RPMI1640或達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium) (DMEM，GIBCO)中培養細胞。對於維持在上述生長培養基中之2D培養物細胞(4×103 個/孔)，在治療前一天將其塗於96孔組織培養盤Corning® Cat. 3603)。對於3D培養物，將8000個細胞/孔接種於96孔超低附著組織培養盤(Corning, #3474)。細胞經化合物處理96小時，且隨後根據製造商的說明及EnVision™盤讀取器，使用CellTiterGlo®發光細胞存活率檢定® (對於2D培養物Promega #G7572及對於3D培養物Promega #G9683)分析存活率。非線性回歸及S形劑量-反應曲線經GraphPad Prism 4®軟件用於計算半最大抑制濃度(IC50 )。表 6 ：一組KRas G12C突變腫瘤細胞株中實例1之活體外抗增殖活性
細胞株 KRas 突變 癌症類型 2D 細胞增殖中之 IC50 (µM ) 3D 球形細胞增殖中之 IC50 (µM )
EL3187 G12C 肺 0.003 0.013
Calu-1 G12C 肺 0.024 (n=3) 0.001
H358 G12C 肺 0.041(n=5) 0.026(n=2)
H23 G12C 肺 0.080 0.031
H2122 G12C 肺 0.187(n=3) 0.017(n=2)
H1373 G12C 肺 0.209 0.020
HCC-44 G12C 肺 0.221 nd
LXFA-983L G12C 肺 1.339(n=4) 0.050
LU-99 G12C 肺 1.568 0.659
H1792 G12C 肺 3.933(n=4) 3.836
H2030 G12C 肺 6.881(n=3) 0.003
SW1573 G12C 肺 16.723 nd
D122-96 G12C 肺(小鼠) 0.126(n=3) 0.069(n=3)
SW1463 G12C 結腸 0.013 nd
SW837 G12C 直腸 0.169(n=4) 0.126
Miapaca-2 G12C 胰臟 0.014(n=4) 0.086
UM-UC-3 G12C 膀胱 0.124 0.075
SW756 G12C 子宮頸 1.153(n=4) 7.827
Kyse-410 G12C 食道 2.942(n=4) 0.471
A427 G12D 肺 10.130 18.58(n=2)
H460 Q61H 肺 11.557 6.073
Calu-6 Q61K 肺 12.050 19.54(n=2)
H441 G12V 肺 16.484 7.888
A549 G12S 肺 17.697 5.944
H1975 野生型 肺 18.690 6.196
HCC827 野生型 肺 18.926 4.629
注意：nd：未進行；n：檢定數目
資料指示實例1之化合物抑制表6中所列之KRas G12C突變腫瘤細胞株的生長。
如表6中所概述，實例1之化合物在2D及3D培養條件中展現對大部分具有KRas G12C突變之腫瘤細胞的抗增殖活性。在具有KRas G12S突變之A549細胞中，實例1之化合物在2D或3D檢定中展現極少活性，表明實例1選擇性抑制具有KRas G12C突變之腫瘤細胞。
KRas G12C 藥力學 (PD) 標記物及 H358 及 H2122 異種移植模型之腫瘤生長之抑制 為評估化合物之活體內靶向抑制及抗腫瘤功效，將人類肺癌細胞、H358或H2122植入裸小鼠異種移植腫瘤模型中。H358或H2122細胞(1:1 Matrigel®混合物中之10×106 ，0.2 mL總體積)藉由皮下注射植入雌性裸小鼠之後腿中 (Harlan Laboratories)。每組總共5隻小鼠用於功效研究，且每組總共3-4隻小鼠用於目標接合及PD研究。用經口投與(管飼)測試化合物或媒劑(20% Captisol®, 25 mM磷酸酯，pH 2.0，在0.2 mL體積中，當腫瘤尺寸達到約300 mg時)起始處理。隨時間推移監測腫瘤生長及體重，以評估功效及毒性症狀。一週進行兩次腫瘤之二維量測且基於中軸長度及中軸寬度計算腫瘤體積。將腫瘤體積資料轉化成對數尺度以將時間及處理組之差異等化。使用SAS軟體(版本8.2)中之混合程序，對數體積資料藉由時間及處理經雙向重複量測變異分析而分析之。用於重複量測之相關模型為空間功率。在各時間點將處理組與對照組相比較。混合程序亦單獨用於各處理組以計算在各時間點之經調節之平均值及標準差。兩個分析均解釋各動物內之自相關。繪製各處理組與時間的經調節之平均值及標準差。
對於活體內目標抑制及PD分析，藉由乾冰上之研缽及研杵研磨腫瘤，且將腫瘤片段添加至含有1% Triton X100、25 mM Tris pH7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA及1 mM具有Halt蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合液(Thermo Scientific, 目錄編號1861281)之EGTA的800 µL溶解緩衝液中，該溶解緩衝液在溶解基質D管 (MP Biomedical®,目錄編號6913-500)中，每管具有一個額外大型珠粒(MP Biomedical® 1/4"陶瓷球形珠粒目錄編號6540-412)。腫瘤片段在Thermo Bio101®快速製備型 (FP120)中於設定為4均質化15分鐘，同時冷卻總共2次。溶解物在4℃下以14,000 rpm旋轉10分鐘以澄清。使用BioRad Dc®蛋白檢定對溶解物上清液進行蛋白質估計，且溶解物在來自Ras GTPase Chemi ELISA Kit® (Active Motif, 目錄編號52097)之完全溶解/結合緩衝液中稀釋。活性KRas ELISA如下進行：將經麩胱甘肽塗佈之ELISA孔與經稀釋之RAF1-GST一起在完全溶解/結合緩衝液中在4℃下在輕微攪拌下培育1小時。用洗滌緩衝液洗滌孔3次且將100 μg溶解物添加至各孔中且在室溫下在輕度攪拌下培育1小時。將各孔額外洗滌3次，隨後將在抗體結合緩衝液中稀釋之一級抗體添加至各孔中。培育盤1小時。將各孔再洗滌3次，隨後向各孔添加稀釋於抗體結合緩衝液中之HRP-結合二級抗體。將盤在室溫下培育1小時。洗滌ELISA孔4次，添加化學發光試劑且隨後讀取發光。對於pERK Meso Scale Discovery ELISA，使用25 µg含有0.1% SDS之蛋白質；對於pMEK Meso Scale Discovery ELISA，使用50 µg無SDS之蛋白質。用於pERK及pMEK之Meso Scale Discovery Whole Cell Lysate Kits由 Meso Scale Discovery提供。
在肺癌 H388 異種移植模型中之劑量及濃度依賴性活體內目標抑制及 藥力學效應 ： 在肺癌H358小鼠異種移植模型中以1至100 mg/kg之劑量範圍給藥實例1之化合物。在單次給藥後4小時收集腫瘤樣品。如上文所描述製備腫瘤溶解物且量測pERK、pMEK及活性KRas之抑制。結果提供於表7中；在4小時之1至100 mg/kg之單次給藥治療之後，實例1之化合物展現pERK、pMEK及活性KRas之劑量依賴性抑制。基於此劑量依賴性靶向抑制，對於活性KRas、pERK及pMEK，達成50%靶向抑制(TED50 )之劑量分別為11.2、9.78及11.19 mg/kg。另外，使用質譜量測在不同劑量下實例1之化合物之電漿暴露。對於活性KRas、pERK及pMEK，達成50%靶向抑制(TEC50 )之血漿濃度分別為574.4、474.4及515.3 nM。表 7 ：H358異種移植小鼠模型中pERK、pMEK及活性Kras之劑量依賴性抑制
劑量(mg/kg) pERK抑制% pMEK抑制% 活性KRas抑制%
媒劑 0 0 0
100 83.5 85.8 87.4
30 84.2 82.1 83.2
10 47.8 43.1 40.9
3 16.4 11.1 -2.9
1 5.5 -6.2 -1.9
在肺癌 H388 異種移植小鼠模型中之時間依賴性活體內目標抑制及藥力學效應 亦以10及30 mg/kg給藥實例1之化合物。在單次給藥之後，在進行後2、4、8、12及24小時收集腫瘤樣品。如上文所描述製備腫瘤溶解物且量測pERK、pMEK及活性KRas之抑制。結果提供於表8中。在10或30 mg/kg之單次給藥治療之後，實例1之化合物展現pERK、pMEK及活性KRas之時間依賴性抑制。在10 mg/kg下，自2-12小時觀測到61-83% pERK抑制，且在24小時時pERK抑制降低至45%。對於pMEK抑制，自2-12小時觀測到49-78%抑制，其在24小時時降低至30%。對於活性Kras，自2-24小時達成21-61%抑制。在30 mg/kg下，在單次給藥之後自2-24小時達成63-87% pERK抑制、35-89% pMEK抑制及29-70%活性KRas抑制。表 8 ：pERK、pMEK及活性KRas之時間依賴性抑制
   小時 pERK抑制% pMEK抑制% 活性KRas抑制%
媒劑 4 0 0 0
10 mg/kg 2 61.7 49.2 26.1
4 73.5 59.5 32.9
8 69.2 62.4 30
12 83 77.9 61.1
24 45 30.4 21.5
30 mg/kg 2 83.1 81.4 70.4
4 87.3 89.3 65
8 86.5 81.8 66.5
12 77.4 65.8 28.7
24 63.4 35 37.7
在肺癌 H2122 異種移植小鼠模型中之劑量及時間依賴性活體內目標抑制及 藥力學效應 實例1之化合物以10、30及100 mg/kg給藥。在單次給藥之後，在不同時間點收集腫瘤樣品。如上文所描述製備腫瘤溶解物。如上文所描述量測pERK、pMEK及活性KRas之抑制。如表9中所證明，在4小時，在單次給藥治療10、30或100 mg/kg之後，實例1之化合物展現pERK、pMEK及活性KRas之劑量依賴性抑制。此等PD標記物之抑制藉由劑量自10-100 mg/kg增加而增加。實際上，實例1之化合物在此模型中展現時間依賴性目標抑制及PD效應。在10 mg/kg下，自2-12小時觀測到7-47% pERK抑制、0-60% pMEK抑制及26-37%活性KRas抑制。此PD標記物之抑制在24小時時降低。在30 mg/kg下，在單次給藥之後自2-124小時達成49-76% pERK抑制、45-78% pMEK抑制及26-79%活性KRas抑制。此等PD標記物之抑制在24小時時降低(表6)。表 9 ：在肺癌H2122異種移植模型中化合物實例1對pERK、pMEK及活性KRas之劑量及時間依賴性抑制
   小時 pERK抑制% pMEK抑制% 活性KRas抑制%
媒劑 4 0 0 0
10 mg/kg 2 46.8 45.9 25.8
4 47 60.4 32.3
8 34.5 25.7 34.7
12 7.2 -0.4 37.1
24 -2.8 -8.4 16.7
30 mg/kg 2 75.6 62.4 57.5
4 75.3 77.5 78.8
8 67.4 72.2 67
12 48.8 44.7 46.5
24 20.4 -15.5 26.1
100 mg/kg 4 79.1 79.7 90.6
肺癌 H358 異種移植小鼠模型中之抗腫瘤生長活性 ： 在肺癌H358小鼠異種移植模型中測定實例1之化合物之抗腫瘤活性。H358肺腫瘤細胞(10×106 )藉由皮下注射植入雌性裸小鼠之後腿中(Taconic Biosciences)。每組總共5隻小鼠用於功效研究，用經口投與(管飼)測試化合物或媒劑(20% Captisol®, 25 mM磷酸酯，pH 2.0，在0.2 mL體積中，每日一次或兩次，持續28天當腫瘤尺寸達到約300 mg時起始處理。隨時間推移監測腫瘤生長及體重，如上文所描述之在對KRas G12C藥力學(PD)標記物及H358及H2122異種移植模型之腫瘤生長之抑制的說明中，以評估功效及毒性症狀。在每天一次給藥時程之10 mg/kg下，觀測到42.7%腫瘤生長抑制。在每天兩次給藥時程之10 mg/kg下，觀測到-1.98%腫瘤消退。在每日一次或每日兩次給藥時程之30 mg/kg下，分別達成約-33.98%及-74.35%腫瘤進展。經由整個研究未觀測到顯著動物體重損失。
肺癌 H2122 異種移植小鼠模型中之抗腫瘤生長活性 亦在肺癌H2122異種移植模型中測定實例1之化合物之抗腫瘤活性。H2122肺腫瘤細胞(10×106 )藉由皮下注射植入雌性裸小鼠之後腿中(Taconic Biosciences)。每組總共5隻小鼠用於功效研究。用經口投與(管飼)測試化合物或媒劑(20% Captisol®, 25 mM磷酸酯，pH 2.0，在0.2 mL體積中，每日一次或兩次，持續28天當腫瘤尺寸達到約300 mg時起始處理。隨時間推移監測腫瘤生長及體重，如上文所描述之在對KRas G12C藥力學(PD)標記物及H358及H2122異種移植模型之腫瘤生長之抑制的說明中，以評估功效及毒性症狀。當以30 mg/kg每天一次或每天兩次給藥實例1之化合物時，分別觀測到77.17%及72.97%腫瘤生長抑制。在100 mg/kg每天一次給藥時程下，觀測到91.06%腫瘤抑制。經由整個研究未觀測到顯著動物體重損失。
其他肺癌模型及大腸直腸癌、胰臟癌及食道癌之異種移植模型中之抗腫瘤生長活性 除了H358及H2122異種移植模型之外，在肺癌、大腸直腸癌、胰臟癌及食道癌之多種其他異種移植或患者衍生異種移植(PDX)模型中以不同劑量測試化合物實例1。單藥療法之抗腫瘤生長或消退活性概述於表10中。如表10中所說明，化合物實例1證明5至100 mg/kg之所有此等模型中的抗腫瘤活性，表明實例1對具有KRas G12C突變之癌症(包括肺癌、大腸直腸癌、胰臟癌及食道癌)有活性。表 10 ：化合物實例1在28天肺癌、大腸直腸癌、胰臟癌及食道癌異種移植或PDX模型中之抗腫瘤生長活性.
異種移植 / PDX 模型 組織 腫瘤生長抑制 (%) 或消退 (-%)
5 mg/kg 10 mg/kg 15 mg/kg 20 mg/kg 30 mg/kg 50 mg/kg 100 mg/kg
QD BID QD BID QD BID QD QD BID QD QD BID
H358 肺 nd nd 42.7 -1.98 nd nd nd -33.98 -74.35 nd nd nd
H2122 肺 nd nd nd nd nd nd nd 77.2 72.97 nd 91.1 nd
H1373 肺 nd nd nd nd nd -60 nd -52.4 -71.6 nd nd nd
H2030 肺 nd nd nd nd nd 82 nd 75.1 91.9 nd nd nd
HCC44 肺 nd nd nd nd nd 93.4 nd 85.4 -16.5 nd nd nd
EL3187 (PDX) 肺 nd nd nd nd nd nd nd -100 -100 nd -100 -100
EL3187 (PDX) 肺 94 -65 nd nd -75 -80 nd -85.4 -92.5 nd nd nd
EL2661 (PDX) 肺 nd nd 46.5 nd nd nd 58.6 97.6 -8.6 nd nd
SW837 大腸直腸 nd nd nd nd nd -17 nd -10.8 -46.1 nd nd nd
SW1463 大腸直腸 nd nd nd nd nd -27 nd -13.9 -47.9 nd nd nd
MiaPaca-2 胰臟 nd nd 44.4 75.48 nd nd nd 95.6 -49.6 nd nd nd
KYSE-410 食道 nd nd nd nd nd 21.2 nd 74.5 -9 nd nd nd
注意：nd：未進行 正值指示腫瘤生長抑制%，且負數指示腫瘤消退%。
與 CDK4 及 CDK6 抑制劑玻瑪西林、 EGFR 小分子抑制劑或 EGFR 單株抗體西妥昔單抗之組合功效 除單藥療法之外，獲得化合物實例1與其他靶向療法(諸如CDK4及CDK6抑制劑玻瑪西林、EGFR小分子抑制劑埃羅替尼及EGFR單株抗體西妥昔單抗)之組合功效。用於此研究之細胞株獲自ATCC且在ATCC推薦之條件下生長，但其中LXFA-983L係獲自Oncotest/Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA及D122-96，其係獲自L. Eisenbach (Weizman Institute of Science, Rehovot, Israel)-均在推薦條件下生長。所有細胞株均具有KRAS G12C突變。增殖檢定係以4天生長檢定形式使用細胞TiterGlo®作為讀數進行。簡言之，將細胞塗於96孔細胞盤中且使其在37℃下黏附隔夜。第二天，細胞經化合物處理，單一處理或組合處理。首先，將測試化合物在DMSO中連續稀釋，隨後用1% DMSO以5×濃度稀釋於培養基中，且最後添加於培養基中之細胞中以稀釋至1×。將細胞在37℃下再培育4天。在培育期結束時，將細胞TiterGlo®試劑混合且添加至孔中。10分鐘後，藉由Perkin Elmer Envision儀器讀取發光。產生由單一處理及組合處理之4參數數理邏輯模型產生之絕對IC50 值，隨後為各組合處理及細胞株之組合指數。當添加在一起時，基於各化合物之總濃度調節組合IC50 值。(實例：對於化合物1與化合物2之1:1濃度比，組合IC50 增加2倍)。組合指數(CI)量測組合療法之效能不同於預期-若-加成效能之程度且係基於加成性之洛伊(Loewe)定義。
Figure 02_image113
其中 •
Figure 02_image115
及
Figure 02_image115
為當組合給出時產生效應y之療法A及B之濃度 •
Figure 02_image117
及
Figure 02_image119
為當單獨給出時產生效應y之A及B之濃度 組合指數之生物學解釋如下：若組合指數＜0.5，則為協同的，若組合指數在0.5與2之間，則為加成的，且若組合指數＞2，則為拮抗的。
如表11中所示，實例1與玻瑪西林之組合在抑制具有KRas G12C突變之腫瘤細胞方面具有加成或協同功效。在所測試之16個細胞株中，基於組合指數11個細胞株具有加成效應，且5個細胞株具有協同效應，這表明實例1與玻瑪西林之組合可為具有KRas G12C突變之癌症患者提供益處。表 11 ： 一組KRas G12C突變腫瘤細胞株中實例1與CDK4及CDK6抑制劑玻瑪西林之組合的活體外抗增殖活性
實例1 玻瑪西林 實例 1+ 玻瑪西林 實例 1+ 玻瑪西林
細胞株 絕對 IC50 (µM ) 絕對 IC50 (µM ) 絕對 IC50 (µM ) 組合指數 ( 平均值 )
SW1463 0.0141 0.3277 0.01973 0.72696
Calu-1 0.0145 ＞10 ＜0.006 0.5774
MIA Paca-2 0.022 0.7548 0.02555 0.58442
H358 0.0419 1.2282 0.05823 0.71787
SW837 0.1012 3.5944 0.11775 0.59297
D122-96 0.1245 5.0483 0.13213 0.54265
H1373 0.1326 ＞10 0.51073 1.934
H23 0.2353 4.9715 0.22485 0.50279
H1792 0.3372 1.0984 0.21347 0.4134
KYSE-410 0.7622 3.0066 0.54635 0.43791
SW756 0.8646 4.9808 0.81149 0.57949
H2030 1.6866 9.034 4.43716 1.56279
UM-UC-3 1.8347 1.7175 0.52266 0.30115
LXFA-983L 2.5915 ＞10 2.14941 0.4404
H2122 2.8704 0.5475 0.66374 0.71868
SW1573 ＞10 0.996 0.44059 0.22119
如表12中所示，實例1與EGFR小分子抑制劑埃羅替尼之組合在抑制具有KRas G12C突變之腫瘤細胞方面具有加成或協同功效。在所測試之16個細胞株中，基於組合指數11個細胞株具有加成效應，5個細胞株具有協同效應，且1個細胞株無效應，這表明實例1與埃羅替尼之組合可為具有KRas G12C突變之癌症患者提供益處。表 12 ： 一組KRas G12C突變腫瘤細胞株中實例1與EGFR小分子抑制劑埃羅替尼之組合的活體外抗增殖活性
實例 1 埃羅替尼 實例 1+ 埃羅替尼 實例 1+ 埃羅替尼
細胞株 絕對 IC50 (µM ) 絕對 IC50 (µM ) 絕對 IC50 (µM ) 組合指數 ( 平均值 )
SW1463 0.014 0.446 0.022 0.821
Calu-1 0.021 ＞10 0.036 0.814
MIA Paca-2 0.019 ＞10 ＜0.006 0.999
H358 0.051 0.247 0.086 1.009
SW837 0.164 ＞10 0.17 0.519
D122-96 0.111 ＞10 0.195 0.873
H1373 1.862 ＞10 2.258 0.323
H23 0.295 ＞10 0.155 0.888
H1792 3.007 ＞10 3.588 0.745
KYSE-410 1.586 0.469 0.91 1.227
SW756 0.264 ＞10 0.139 0.262
H2030 ＞10 1.477 3.280 1.141
UM-UC-3 3.645 ＞10 3.244 0.453
LXFA-983L 4.715 2.820 0.665 0.189
H2122 2.391 0.352 0.492 0.794
SW1573 ＞10 ＞10 NA NA
如表13中所示，實例1與EGFR單株抗體西妥昔單抗之組合一般在抑制具有KRas G12C突變之腫瘤細胞方面具有加成或協同功效。在所測試之16個細胞株中，基於組合指數6個細胞株具有加成效應，7個細胞株具有協同效應，2個細胞株具有拮抗效應，且1個細胞株無效應，這表明實例1與西妥昔單抗之組合可為大多數具有KRas G12C突變之癌症患者提供益處。表 13 ： 一組KRas G12C突變腫瘤細胞株中實例1與EGFR單株抗體西妥昔單抗之組合的活體外抗增殖活性
細胞株 實例 1 西妥昔單抗 實例 1+ 西妥昔單抗 實例 1+ 西妥昔單抗
絕對 IC50 (µM ) 絕對 IC50 ( µg /mL) 絕對 IC50 (µM ) 增強指數 ( 平均值 )
SW1463 0.0141 ＞20 0.00553 0.07649
Calu-1 0.0145 ＞20 ＜0.003 0.4006
MIA Paca-2 0.022 ＞20 0.01931 0.84494
H358 0.0419 ＞20 0.00578 0.12504
SW837 0.1012 ＞20 0.01254 0.11803
D122-96 0.1245 ＞20 0.09372 0.75219
H1373 0.1326 ＞20 0.97025 6.7919
H23 0.2353 ＞20 0.19644 0.84001
H1792 0.3372 ＞20 0.65556 1.77915
KYSE-410 0.7622 ＞20 1.02012 1.10193
SW756 0.8646 ＞20 0.12534 0.13355
H2030 1.6866 ＞20 7.73078 6.3229
UM-UC-3 1.8347 ＞20 1.44949 0.6735
LXFA-983L 2.5915 ＞20 0.02627 0.011
H2122 2.8704 ＞20 0.22727 0.07545
SW1573 ＞10 ＞20 ＞10 NA
為了進一步證實實例1與玻瑪西林、EGFR小分子抑制劑或EGFR單株抗體西妥昔單抗之組合之加成或協同效應，在6個異種移植或PDX模型(3個肺，2個大腸直腸及1個胰臟)中進行活體內組合研究。如表14中所示，在所測試之所有6個模型中實例1與玻瑪西林之組合具有比單藥療法更好之抗腫瘤活性。在許多情況下，藉由此組合達成顯著腫瘤消退，這表明實例1與玻瑪西林之組合對具有KRas G12C突變之癌症患者具有潛在益處。
另外，亦在4個異種移植或PDX模型中評估實例1與EGFR單株抗體西妥昔單抗之組合。如表14中所概述，在兩種大腸直腸異種移植模型(SW837、SW1463)中，實例1與西妥昔單抗之組合證明比單藥療法更好的腫瘤生長消退，這表明實例1與EGFR單株抗體西妥昔單抗之組合可對具有KRas G12C突變之大腸直腸癌患者具有益處。表 14 ： 腫瘤異種移植或PDX模型中實例1與玻瑪西林或西妥昔單抗之組合的活體內抗腫瘤活性
異種移植 / PDX 腫瘤類型 實例 1 (mg/kg) 玻瑪西林 實例 1+ 玻瑪西林 西妥昔單抗 實例 1+ 西妥昔單抗
30 100 50 mg/kg 30 + 50 mg/kg 20 mg/kg 30 + 20 mg/kg
QDx28 QDx28 QDx28 QDx28 BIWx4 QDx28/BIWx4
H2122 肺 77.2    79.3 -7.5      
H2122 肺    -1.4 79.1 -23.4      
H358 肺 -33.4       -73.5      
SW837 大腸直腸 -51.8    -2.13 -59.88 58.49 -68.51
SW1463 大腸直腸 -21.4    55.1 -32.6 81.1 -45.8
MiaPaca-2 胰臟 91.22    46.88 -40.27 -20.8 93.09
亦在EL3187肺癌PDX模型中評估實例1與EGFR小分子抑制劑埃羅替尼或阿法替尼之組合。如表15中所概述，實例1與埃羅替尼或阿法替尼之組合證明顯著的腫瘤生長消退及比單藥療法更好的抗腫瘤活性，這表明實例1與EGFR小分子抑制劑之組合可對具有KRas G12C突變之肺癌患者具有顯著益處。表 15 ： 在PDX模型中實例1在組合EGFR小分子抑制劑中之活體內抗腫瘤活性
異種移植 / PDX 腫瘤類型 實例 1 (mg/kg) 埃羅替尼 實例 1 + 埃羅替尼 阿法替尼 實例 1 + 阿法替尼
5 25 mg/kg 5 + 25 mg/kg 25 mg/kg 5 + 25 mg/kg
QDx28 QDx28 QDx28 QDx28 QDx28
EL3187 (PDX) 肺 94.8 7.8 -98.8 17.1 -69.6
與免疫療法、抗 PD-1 或抗 PD-L1 抗體之組合功效 使用小鼠同基因型模型評估KRas G12C抑制及免疫療法組合之效應。在此模型中，藉由CRISPR基因嵌入於CT-26細胞株(小鼠大腸直腸腫瘤細胞株)中，將KRas G12D突變轉化成KRas G12C突變。藉由基因及功能性表徵證實KRas G12C基因嵌入。經工程改造之細胞株稱為CT-26-H4/KRas G12C。將此等細胞植入至Balb/c小鼠，且化合物治療在腫瘤細胞植入後6天開始。在此研究中，實例1與抗PD-L1或抗PD-1抗體組合，其中給藥時程列舉於表16中。PD-1及PD-L1抑制劑在此項技術中已知且包括德瓦魯單抗(durvalumab)、帕博利珠單抗(pembrolizumab)及納武單抗(nivolumab)。如表16中所示，實例1證明顯著單一藥劑活性，在3週給藥結束時具有平均96%腫瘤生長抑制及10% (10隻動物中有1隻)完全反應(CR)。抗PD-L1抗體展示38%腫瘤生長抑制且無完全反應，且抗PD-1抗體展示82%腫瘤生長抑制及10%完全反應。然而，實例1與抗PD-L1或抗PD-1抗體之組合達成顯著更好的抗腫瘤活性。在3週給藥結束時，與PD-L1或PD-1之組合分別展示-56%及-51%腫瘤消退，以及80%及89%完全反應。3週之後，停止化合物治療且除抗PD-1組中之1隻動物之外，單藥療法組中之所有腫瘤開始再生長。然而，兩個組合組中之腫瘤不具有再生跡象。最後一次給藥後40天，組合組維持80%及89%完全反應，指示組合組中之腫瘤消除。此等結果表明，實例1與抗PD-L1或抗PD-1抗體之組合可對具有KRas G12C突變之癌症患者具有顯著益處。表 16 ： CT-26-H4/KRas G12C同基因型模型中實例1與免疫療法(抗PD-1或抗PD-L1抗體)之組合的活體內抗腫瘤活性
治療 給藥時程 在第28天治療結束 治療後40天
腫瘤生長抑制% 消退% 完全反應(CR)/組小鼠(%CR) 完全反應(CR)/組小鼠(% CR)
媒劑 BID x 21 0    0/10 (0%) 0/10 (0%)
實例1 30 mg/kg BID x 21, PO 96    1/10 (10%) 0/10 (0%)
PD-L1抗體(LSN3428712) 500 ug/小鼠, Q7D x 3, IP 38    0/10 (0%) 0/10 (0%)
PD-1抗體(RMP1-14) 250 ug/小鼠, BIW x 3, IP 82    1/10 (10%) 1/10 (10%)
實例1+PD-L1抗體 30 mg/kg BID x 21, PO; 500 ug/小鼠, Q7Dx3, IP    -56 8/10 (80%) 8/10 (80%)
實例1+PD-1抗體 30 mg/kg BID x 21, PO; 250 ug/小鼠, BIWx3, IP    -51 8/9 (89%) 8/9 (89%)
Figure 108136024-A0101-11-0001-1

Claims (24)

  1. 一種下式化合物，
    Figure 03_image121
    ， 其中m為0-2； 各R1為F；且 R2係選自：H、F及Cl； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之化合物，其選自：
    Figure 03_image123
    ； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如請求項1或2之化合物，其選自：
    Figure 03_image125
    ； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  4. 一種化合物，其為：
    Figure 03_image127
    ； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  5. 如請求項4之化合物，其為1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮半丙二酸鹽。
  6. 如請求項4之化合物，其為1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸鹽。
  7. 如請求項4或請求項5之化合物，其為結晶1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮半丙二酸鹽。
  8. 如請求項7之化合物，其為結晶1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮半丙二酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在5.4°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：13.5°、7.1°及23.0°。
  9. 如請求項4或請求項6之化合物，其為結晶1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸鹽。
  10. 如請求項9之化合物，其為結晶1-{4-[7-(2-胺基-7-氟-1,3-苯并噻唑-4-基)-6-氯-8-氟喹唑啉-4-基]哌嗪-1-基}丙-2-烯-1-酮甲磺酸鹽，其特徵為使用CuKα輻射，在2θ ± 0.2°中，X射線粉末繞射圖具有在6.1°處出現之特徵峰，以及選自由以下各者組成之群的一或多個峰：21.3°、18.6°及19.8°。
  11. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  12. 如請求項1至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於療法中。
  13. 如請求項1至10中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療癌症。
  14. 如請求項13所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該癌症為肺癌、大腸直腸癌、胰臟癌、膀胱癌、子宮頸癌或食道癌。
  15. 如請求項14所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該癌症為非小細胞肺癌，其中一或多種細胞表現KRas G12C突變蛋白。
  16. 如請求項14所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該癌症為大腸直腸癌，其中一或多種細胞表現KRas G12C突變蛋白。
  17. 如請求項14所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該癌症為胰臟癌，其中一或多種細胞表現KRas G12C突變蛋白。
  18. 如請求項14所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中在投與該化合物或其醫藥學上可接受之鹽之前，患者患有經確定具有一或多種表現該KRas G12C突變蛋白之細胞的癌症。
  19. 如請求項14至18中任一項所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其進一步包含同時、分別或依序投與有效量之玻瑪西林(abemaciclib)或其醫藥學上可接受之鹽。
  20. 如請求項14至18中任一項所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其進一步包含同時、分別或依序投與有效量之EGFR抑制劑或其醫藥學上可接受之鹽。
  21. 如請求項20所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該EGFR抑制劑為埃羅替尼(erlotinib)或其醫藥學上可接受之鹽。
  22. 如請求項20所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該EGFR抑制劑為阿法替尼(afatinib)或其醫藥學上可接受之鹽。
  23. 如請求項20所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中該EGFR抑制劑為西妥昔單抗(cetuximab)。
  24. 如請求項14至18中任一項所用之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其進一步包含同時、分別或依序投與有效量之抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。
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