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TW202028245A - Dll3單域抗體及其治療性組合物 - Google Patents

Dll3單域抗體及其治療性組合物 Download PDF

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TW202028245A
TW202028245A TW108136743A TW108136743A TW202028245A TW 202028245 A TW202028245 A TW 202028245A TW 108136743 A TW108136743 A TW 108136743A TW 108136743 A TW108136743 A TW 108136743A TW 202028245 A TW202028245 A TW 202028245A
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dll3
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polypeptide construct
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伯瑞登 Ｐ 艾克曼
麥克 Ｄ 卡布蘭
凱特琳 Ｍ 威爾斯
羅杰 Ａ 潘迪
安潔莉卡 Ｎ 珊那布里爾
思尼 Ａ 巴恩斯
瑪格麗特 Ｅ 哈爾
約翰 Ｃ 湯門
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美商英伊布里克斯公司
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Abstract

本發明提供特異性結合DLL3之結合多肽。更具體言之，本文提供結合DLL3之融合蛋白，其包括多價及/或多特異性構築體及嵌合抗原受體。亦提供含有該等多肽之醫藥組合物；編碼該等多肽之核酸分子以及其載體及細胞；以及所提供之DLL3結合多肽用於治療諸如癌症之疾病及病狀的使用方法及用途。

Description

DLL3單域抗體及其治療性組合物
本發明一般提供特異性結合DLL3之結合多肽。更具體言之，本發明係關於至少結合DLL3之融合蛋白，其包括多價及/或多特異性構築體及嵌合抗原受體。本發明亦提供編碼該等多肽之核酸分子以及其載體及細胞；以及所提供之DLL3結合多肽用於治療諸如癌症之疾病及病狀的使用方法及用途。
δ樣配位體3 (DLL3)為一種抑制性Notch路徑配位體，其高度上調且異常表現於腫瘤及癌細胞(包括小細胞肺癌(SCLC)及高度神經內分泌腫瘤之細胞)之細胞表面上。DLL3在人類之多種癌症(包括實體腫瘤)上的表現使得DLL3成為所需治療目標。需要經改良之靶向DLL3之治療性分子及藥劑。本文提供滿足此類需求之實施例。
本文提供一種DLL3結合多肽構築體，其包含至少一個特異性結合DLL3的僅重鏈之可變域(DLL3 VHH域)。在一些實施例中，DLL3結合構築體包含結合至除DLL3之外之目標的一或多個其他結合域。
本文提供一種DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含：互補決定區1 (CDR1)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335及456；互補決定區2 (CDR2)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、384、410及411；及互補決定區3 (CDR3)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、395及412-415，且結合DLL3。
本文提供一種DLL3結合多肽構築體，其包含至少一個特異性結合DLL3之僅重鏈之可變域(DLL3 VHH域)，該可變域包含：互補決定區1 (CDR1)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335及456；互補決定區2 (CDR2)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、384、410及411；及互補決定區3 (CDR3)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、395及412-415，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含：互補決定區1 (CDR1)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335及456；互補決定區2 (CDR2)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352及353；及互補決定區3 (CDR3)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366及367，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，DLL3為人類DLL3。在一些實施例中，DLL3具有SEQ ID NO: 86中所示之序列或其成熟形式，其缺乏信號序列。在一些實施例中，DLL3具有SEQ ID NO: 87中所示之序列或其成熟形式，其缺乏信號序列。
在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域為人類化的。在一些實施例中，DLL3 VHH為駱駝科VHH。在一些實施例中，DLL3 VHH為駱駝科VHH之人類化形式。
在所提供之任何一些實施例中，一或多個其他結合域結合至免疫細胞上的活化受體。在一些實施例中，免疫細胞為T細胞。在所提供之任何一些實施例中，活化受體為CD3 (CD3ε)。在一些實例中，實施例之DLL3結合多肽構築體具有針對DLL3與CD3的雙特異性。在一些實施例中，免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
在所提供之任何一些實施例中，活化受體為CD16 (CD16a)。在一些實例中，DLL3結合多肽構築體具有針對DLL3與CD16a的雙特異性。
在所提供之任何一些實施例中，一或多個其他結合域結合至細胞介素受體。
在所提供之任何一些實施例中，一或多個其他結合域包含抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，一或多個其他結合域為單價的。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段為Fv、經二硫鍵穩定之Fv (dsFv)、scFv、Fab、單域抗體(sdAb)、VNAR或VHH。在一些實施例中，單域抗體(sdAb)為駱駝科VHH。在一些實施例中，單域抗體(sdAb)為駱駝科VHH之人類化形式。
在所提供之任何一些實施例中，一或多個其他結合域為細胞介素或其截短之片段或變異體，其能夠結合至細胞介素受體。在一些實施例中，細胞介素為干擾素，或干擾素之截短之片段或變異體。在一些實施例中，干擾素為第I型干擾素或第II型干擾素；為第I型干擾素之截短之片段或變異體；或第II型干擾素之截短之片段或變異體。在一些實施例中，第I型干擾素為IFN-α或IFN-β或其截短之片段或變異體；或第II型干擾素為IFN-γ或其截短之片段或變異體。
在所提供之任何一些實施例中，多肽包含免疫球蛋白Fc區。在一些實施例中，多肽包含連接至少一個VHH域與一或多個其他結合域之免疫球蛋白Fc區。在一些實施例中，DLL3結合多肽構築體為二聚體。在一些實施例中，Fc區為均二聚體Fc區。
在所提供之任何一些實施例中，Fc區包含SEQ ID NO: 8、10、11、12或13中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 8、10、11、12或13中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，Fc區為人類IgG1。
在所提供之任何一些實施例中，DLL3結合多肽構築體為二聚體。在一些實施例中，Fc區為均二聚體Fc區。
在所提供之任何一些實施例中，Fc區為人類IgG1。
在所提供之任何一些實施例中，Fc區包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些實施例中，Fc區為雜二聚體Fc區。在一些實施例中，Fc區展現效應功能。在一些實施例中，Fc區包含含有一或多個胺基酸修飾的多肽，該修飾減少效應功能且/或減少對選自Fcγ受體或C1q之效應分子的結合。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾為Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者的缺失。
在所提供之任何一些實施例中，Fc區包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 244-318及455中之任一者中所示之VHH域序列或與SEQ ID NO: 244-318及455中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 102、244-318、401-409、416、455、476-480-488及507-518中之任一者中所示之VHH域序列，或與SEQ ID NO: 102、244-318、401-409、416、455、476-480-488及507-518中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-480-488及507-518中之任一者中所示之VHH域序列，或與SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-480-488及507-518中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所示之VHH域序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 244、(ii)SEQ ID NO: 244之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 244展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325及326組成之群的胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 336、337及338組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 354中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 319、336及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 319、337及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 319、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 321、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 322、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 323、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 324、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 325、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 326、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在上述任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 245-257中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 258、(ii)SEQ ID NO: 258之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 258展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 327中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 339中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 355中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 327、339及335中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 259-263中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 264、(ii) SEQ ID NO: 264之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 264展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 328、329或456中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 340中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列；結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 328、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 329、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 456、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在上述任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 265-274、416或455中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 265-274或416或455之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 265-274或416或455之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 275、(ii) SEQ ID NO: 275之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 275展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 341中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 357中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 276-279中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 276-279中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 276-279中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 280、(ii) SEQ ID NO: 280之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 280展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 330中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 342中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 358中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281-286中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 287、(ii) SEQ ID NO: 287之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 287展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 345、346及347組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 359、360及361組成之群的胺基酸序列；且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、345及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、346及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、347及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、345及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、345及361中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、347及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，所提供之上述任何DLL3 VHH域結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 299、(ii) SEQ ID NO: 299之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 299展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 331中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 331、348及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 331、349及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 331、350及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，所提供之上述任何DLL3 VHH域結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 300-305中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 300-305中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 300-305中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 507、(ii) SEQ ID NO: 507之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 507展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 306、(ii) SEQ ID NO: 306之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 306展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 332中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 362中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 332、348及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 332、349及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 332、350及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 300-305中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 307-313中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 307-313中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 508-514中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 401、(ii) SEQ ID NO: 401之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 401展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 384、410及411組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 395、412、413、414及415組成之群的胺基酸序列；且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、384及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、410及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、411及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、384及412中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、384及413中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、384及414中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、384及415中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 402-409中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 402-409中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 402-409中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 481-488中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 333、351及363中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含334、352及364中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含320、353及365中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含334、339及366中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含335、348及367中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在所提供之任何一些實施例中，DLL3 VHH域結合DDL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 314、315、316、317或318、(ii) SEQ ID NO: 314、315、316、317或318之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 314、315、316、317或318展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域闡述於SEQ ID NO: 314、315、316、317或318中，且結合DLL3。在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517、(ii) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 314、518、515、516或517展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域闡述於SEQ ID NO: 314、518、515、516或517中，且結合DLL3。
在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 244中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 251中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 264中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 268中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 275中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 287中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 299中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 507中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 314中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 518中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 515中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 516中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 517中所示之VHH域序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 455中所示之VHH域序列。
在所提供之任何一些實施例中，DLL3 VHH域可以在其N端及/或C端包含其他胺基酸，諸如用於連接至另一胺基酸序列(諸如另一多肽)的其他胺基酸。在所提供之任何一些實施例中，DLL3 VHH域可以包含柔性連接子，諸如甘胺酸連接子或主要由胺基酸甘胺酸及絲胺酸構成的連接子，在本文中標示為GS連接子。本發明之此類連接子可具有各種長度，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個胺基酸的長度。在一些實施例中，連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；及GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)；Gly-Gly (GG)、GGG, GGGG (SEQ ID NO: 5)；GGGGG (SEQ ID NO: 6)及GGGGGG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，連接子為(GGGGS)n，其中n為1至5 (SEQ ID NO: 123)；(GGGGGS)n，其中n為1至4 (SEQ ID NO: 124)；GGGGS (SEQ ID NO: 125)；GGGGGS (SEQ ID NO: 126)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 127)；GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 128)；GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 129)；或PGGGG (SEQ ID NO: 450)。在一些實施例中，連接子為GG連接子。在一些實施例中，DLL3結合多肽包括GS連接子與甘胺酸連接子之組合。在一些實施例中，DLL3 VHH域可以在其C端包含其他連接子，諸如用於連接至另一胺基酸序列(諸如另一多肽)的連接子。在所提供之任何一些實施例中，DLL3 VHH域可以在其N端包含連接子，諸如用於連接至另一胺基酸序列(諸如另一多肽)的連接子。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 244、(ii)SEQ ID NO: 244之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 244展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。
本文提供一種多特異性多肽構築體，其包含：(a)第一組分，該第一組分包含含有第一Fc多肽及第二Fc多肽的雜二聚體Fc區，及(b)第二組分，該第二組分包含含有重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)的抗CD3抗體或抗原結合片段，其中構成該抗CD3抗體或抗原結合片段的VH及VL連接至雜二聚體Fc之相對多肽，其中第一及第二組分藉由連接子偶合，其中雜二聚體Fc區定位於抗CD3抗體的N端；且其中第一及第二組分中之一或兩者包含至少一個含有特異性結合DLL3之VHH域(DLL3 VHH域)的抗原結合域。在特定實施例中，DLL3 VHH域可以包括所提供的任何DLL3 VHH域序列，包括如上文所述或本文中在別處所述的任一者。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體至少包含：(i)第一多肽，該第一多肽包含雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子，及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域；及(ii)第二多肽，該第二多肽包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與第一多肽中存在的連接子相同)，及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中之另一者，其中第一與第二多肽中之一或兩者包含至少一個DLL3 VHH域。
在一些實施例中，相較於均二聚體Fc區之多肽，視情況相較於SEQ ID NO: 8中所示之Fc多肽或其免疫活性片段，雜二聚體Fc區之第一與第二Fc多肽中之一或兩者包含至少一個誘導雜二聚化的修飾。在一些實施例中，雜二聚體Fc區之第一與第二Fc多肽中之每一者獨立地包含至少一個胺基酸修飾。在一些實施例中，雜二聚體Fc區之第一與第二Fc多肽中之每一者包含臼包杵修飾或包含增強多肽之靜電互補性的電荷突變。
在一些實施例中，胺基酸修飾為臼包杵修飾。在一個實施例中，雜二聚體Fc區之第一Fc多肽包含選自以下之修飾：Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val及其組合，且雜二聚體Fc區之第二Fc多肽包含修飾Thr366Trp。在此類實施例中，第一與第二Fc多肽可以進一步包含非半胱胺酸殘基向半胱胺酸殘基的修飾，其中第一Fc多肽之修飾存在於位置Ser354及Tyr349之一，且第二Fc多肽之修飾存在於位置Ser354及Tyr349中之另一者處。
在一些實施例中，胺基酸修飾為增強多肽之靜電互補性的電荷突變。在一些實施例中，第一及/或第二Fc多肽或第一與第二Fc多肽中之每一者包含位於互補位置的修飾，其中該修飾為置換成具有與另一多肽之互補胺基酸相反之電荷的胺基酸。
在所提供之任何一些實施例中，雜二聚體Fc區之第一或第二Fc多肽之一進一步包含位於殘基Ile253之修飾。在一些實施例中，修飾為Ile253Arg。在一些實施例中，雜二聚體Fc區之第一或第二Fc多肽之一進一步包含位於殘基His435之修飾。在一些實施例中，修飾為His435Arg。
在一些實施例中，所提供之任何多肽或構築體之Fc區包含缺乏Lys447的多肽。
在一些實施例中，所提供之任何多肽或構築體的Fc區包含至少一個增強FcRn結合的修飾。在一些實施例中，該修飾存在於選自由以下組成之群的位置：Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434及其組合。在一些實施例中，該修飾係選自由以下組成之群：Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S及其組合。在一些實施例中，該修飾存在於位置Met252及位置Met428。在一些實施例中，該修飾為Met252Y及Met428L。在一些實施例中，該修飾為Met252Y及Met428V。
在所提供之任何一些實施例中，雜二聚體Fc區之第一Fc多肽包含SEQ ID NO: 103、107、115或117中之任一者中所示之胺基酸序列，且雜二聚體Fc區之第二Fc多肽包含SEQ ID NO: 104、108、111、113、119或121中之任一者中所示之胺基酸序列。
在所提供之任何一些實施例中，所提供之多肽或構築體的Fc區包含含有至少一個胺基酸修飾的多肽，該修飾減少效應功能且/或減少對選自Fcγ受體或C1q之效應分子的結合。在一些實施例中，一或多個胺基酸修飾為Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者的缺失。
在所提供之任何一些實施例中，雜二聚體Fc區之第一Fc多肽包含SEQ ID NO: 105、109、116或118中之任一者中所示之胺基酸序列，且雜二聚體Fc區之第二Fc多肽包含SEQ ID NO: 106、110、112、114、120或122中之任一者中所示之胺基酸序列。
在所提供之任何一些實施例中，抗CD3抗體或抗原結合片段為單價的。在一些實施例中，抗CD3抗體或抗原結合片段為Fv抗體片段。在一些實施例中，Fv抗體片段為經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。
在一些實施例中，抗CD3抗體或抗原結合片段不是單鏈抗體，例如不是單鏈可變片段(scFv)。
在一些實施例中，抗CD3抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其包含胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)；VH CDR2，其包含胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)；VH CDR3，其包含胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)；VL CDR1，其包含胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)；VL CDR2，其包含胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)；及VL CDR3，其包含胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)。在一些實施例中，抗CD3抗體或抗原結合片段包含：VH，其具有SEQ ID NO: 35-65中之任一者的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 35-65中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列；及VL，其具有SEQ ID NO: 66-84及368中之任一者的胺基酸序列或與SEQ ID NO: 66-84及368中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。在一些實施例中，抗CD3抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及SEQ ID NO: 75之胺基酸序列。在一些實施例中，抗CD3抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及SEQ ID NO: 368之胺基酸序列。
在一些實施例中，抗CD3抗體或抗原結合片段之VL連接至雜二聚體Fc之第一Fc多肽，且抗CD3抗體或抗原結合片段之VH連接至雜二聚體Fc之第二Fc多肽。
在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域多特異性多肽構築體之相對於Fc區定位於胺基端且/或相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區定位於羧基端。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體包含特異性結合DLL3的第一DLL3 VHH域及特異性結合DLL3的第二DLL3 VHH域。在特定實施例中，第一DLL3 VHH域及第二DLL3 VHH域可以獨立地包括所提供的任何DLL3 VHH域序列，包括如上文所述或本文中在別處所述的任一者。在一些實施例中，第一與第二DLL3 VHH域相同。在一些實施例中，第一與第二DLL3VHH域不同。在一些實施例中，第一與第二DLL3 VHH域結合DLL3之不同或不重疊抗原決定基，且/或不競爭結合至DLL3。
在一些實施例中，第一或第二DLL3 VHH域相對於多特異性構築體之Fc區定位於胺基端且第一或第二DLL3 VHH域中之另一者相對於多特異性構築體之CD3結合區定位於羧基端。
在所提供之多特異性多肽構築體之任何一些實施例中，第一組分依N端至C端的次序包含結合DLL3的第一DLL3 VHH域、雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH域；且第二多肽依N端至C端的次序包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與存在於第一組分中的連接子相同)，及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中之另一者。
在一些實施例中，第一與第二組分中之一或兩者包含至少一個結合共刺激受體的共刺激受體結合區(CRBR)。在一些實施例中，至少一個共刺激受體結合區(CRBR)相對於多特異性多肽構築體之Fc區定位於胺基端且/或相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區定位於羧基端。在一些實施例中，多特異性多肽構築體僅包含一個共刺激受體結合區(CRBR)。
在所提供之多特異性多肽構築體的任何一些實施例中，第一組分依N端至C端之次序包含結合DLL3之第一DLL3 VHH域；雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH域；且第二組分包含CRBR且依N端至C端之次序包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與存在於第一組分中的連接子相同)、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中的另一者，其中該CRBR相對於Fc區定位於胺基端或相對於第二組分之抗CD3抗體或抗原結合片段定位於羧基端。
在一些實施例中，至少一個共刺激受體結合區(CRBR)為或包含共刺激受體之原生同源結合搭配物的胞外域或其結合片段，或其變異體，其對共刺激受體展現結合活性。在一些實施例中，至少一個共刺激受體結合區(CRBR)為選自由以下組成之群的抗體或其抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體，及單域輕鏈抗體。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段為Fv、scFv、Fab、單域抗體(VHH域)、VNAR或VHH。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為VHH域。在一些實施例中，VHH域為人類或人類化VHH域。
在所提供之任何一些實施例中，至少一個共刺激受體結合區(CRBR)結合選自以下之共刺激受體：41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化因子及CAML相互作用因子(TACI)，及NKG2D。在一些實施例中，至少一個共刺激受體結合區(CRBR)結合選自以下之共刺激受體：41BB (CD137)、OX40 (CD134)及糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)。
在一些實施例中，至少一個共刺激受體結合區(CRBR)包含SEQ ID NO: 210中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 210中所示之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列，且結合4-1BB。
在一些實施例中，至少一個共刺激受體結合區(CRBR)包含SEQ ID NO: 210中所示之胺基酸序列且結合4-1BB。
在一些實施例中，至少一個共刺激受體結合區(CRBR)包含SEQ ID NO: 470中所示之胺基酸序列且結合4-1BB。
在一些實施例中，第一及第二組分中之一或兩者包含至少一個結合抑制性受體之抑制性受體結合區(IRBR)。在一些實施例中，至少一個抑制性受體結合區(IRBR)相對於多特異性多肽構築體之Fc區定位於胺基端且/或相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區定位於羧基端。在一些實施例中，多特異性多肽構築體僅包含一個抑制性受體結合區(IRBR)。
在所提供之多特異性多肽構築體的任何一些實施例中，第一組分依N端至C端的次序包含：結合DLL3的第一DLL3 VHH域、雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH域；且第二組分包含IRBR且依N端至C端的次序包含：雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與存在於第一組分中的連接子相同)、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中的另一者，其中IRBR相對於Fc區定位於胺基端或相對於第二組分之抗CD3抗體或抗原結合片段定位於羧基端。
在一些實施例中，至少一個IRBR為或包含抑制性受體之原生同源結合搭配物的胞外域或其結合片段，或其變異體，其對抑制性受體展現結合活性。在一些實施例中，至少一個IRBR為選自由以下組成之群的抗體或其抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。在一些實施例中，該抗體或其抗原結合片段為Fv、scFv、Fab、單域抗體(VHH域)、VNAR或VHH。在一些實施例中，抗體或抗原結合片段為VHH域。在一些實施例中，VHH域為人類或人類化VHH域。在一些實施例中，至少一個IRBR結合選自以下之抑制性受體：PD-1、CTLA-4、TIGIT、VISTA及TIM3。在一些實施例中，至少一個IRBR結合PD-1。
在多特異性多肽構築體之所提供之任何一些實施例中，第一組分依N端至C端的次序包含：結合DLL3的第一DLL3 VHH域、雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH；且第二組分依N端至C端的次序包含：IRBR或CRBR之一、雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與存在於第一組分中的連接子相同)、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中的另一者，及CRBR或IRBR中的另一者。
在所提供之任何一些實施例中，連接子為肽或多肽連接子。在一些實施例中，連接子具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸的長度。
在一些實施例中，連接子為不可裂解連接子，諸如包含GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO: 125)、GGGGGS (SEQ ID NO: 126)及其組合的連接子。在一些實施例中，連接子為或包含序列GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 127)。
在一些實施例中，連接子為可裂解連接子，諸如充當蛋白酶受質的多肽。在一些實施例中，蛋白酶係由免疫效應細胞、腫瘤或存在於腫瘤微環境中的細胞產生。在一些實施例中，蛋白酶係由免疫效應細胞產生，且免疫效應細胞為活化T細胞、自然殺手(NK)細胞或NK T細胞。在一些實施例中，蛋白酶為間質蛋白酶、基質金屬蛋白酶(MMP)、顆粒酶B，或其組合。在一些實施例中，可裂解連接子包含胺基酸序列GGSGGGGIEPD IGGSGGS (SEQ ID NO: 171)。
本文提供一種分離的單域抗體，其結合DLL3且含有本文提供的任何DLL3 VHH域序列，包括如上文所述或本文中在別處所述的任一者。
本文提供一種結合DLL3的分離單域抗體，包含：互補決定區1 (CDR1)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列；SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335及456；互補決定區2 (CDR2)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、384、410及411；及互補決定區3 (CDR3)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366及367、395及412-415。
本文提供編碼本文所提供之任何DLL3結合多肽構築體的聚核苷酸。
本文亦提供編碼本文所提供之任何多特異性多肽構築體或其第一或第二多肽的聚核苷酸。在一些實施例中，聚核苷酸包括編碼所提供之多特異性多肽構築體之第一多肽的第一核酸及編碼所提供之多特異性多肽構築體之第二多肽的第二核酸，其中第一與第二核酸序列藉由內部核糖體進入位點(IRES)分隔；或編碼自裂解肽或引起核糖體跳躍的肽(諸如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸。
亦提供編碼所提供之任何單域抗體的聚核苷酸。
亦提供編碼所提供之任何聚核苷酸的載體，諸如表現載體。
本文提供一種細胞，其包含所提供之一或多種聚核苷酸中的任一者或所提供之一或多種載體中的任一者。
本文提供一種製備多肽的方法，包括將所提供之一或多種聚核苷酸或一或多種載體中的任一者引入細胞中及在產生多特異性多肽構築體的條件下培養細胞。本文提供藉由本文所提供之任一種方法產生的多肽。
本文提供一種包含嵌合抗原受體的工程化免疫細胞，該嵌合抗原受體包含含有所提供之任何DLL3 VHH域序列單域抗體的胞外域；跨膜域；及胞內信號傳導域。
本文提供一種醫藥組合物，其包含所提供之DLL3結合多肽、多特異性多肽構築體、單域抗體或工程化免疫細胞中之任一者。
本文提供一種刺激或誘導個體之免疫反應的方法，該方法包含向有需要之個體投與所提供之DLL3結合多肽、多特異性多肽構築體、單域抗體或工程化免疫細胞中之任一者或醫藥組合物。
本文亦提供一種治療個體之疾病或病狀的方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之本文所述之任一種DLL3結合多肽、本文所述之任一種多特異性多肽構築體、本文所述之任一種單域抗體、本文所述之任一種工程化免疫細胞，或本文所描述之任一種醫藥組合物。
對相關申請案之交叉參考
本申請案主張以下美國臨時申請案的優先權：62/744,638，2018年10月11日申請，名稱為「DLL3單域抗體及其治療性組合物」；62/832,265，2019年4月10日申請，名稱為「DLL3單域抗體及其治療性組合物」；及62/877,815，2019年7月23日申請，名稱為「DLL3單域抗體及其治療性組合物」，該等美國臨時申請案的內容以全文引用之方式併入本文用於所有目的。序列表以引用之方式併入
本申請案與序列表一起正以電子格式申請。序列表以2019年10月8日建立的名稱為744952000641SeqList.TXT的檔案提供，其大小為431千位元組。電子格式之序列表中之資訊以全文引用之方式併入本文中。
本文提供特異性結合至DLL3之多肽，下文中亦稱為DLL3結合多肽。在一些實施例中，所提供之結合多肽包含至少一個結合DLL3之VHH域。在一些實施例中，本文提供之DLL3結合多肽包含一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個各自個別地結合DLL3之VHH域。在一些實施例中，本文提供之DLL3結合多肽包含一個、兩個、三個或四個結合DLL3之VHH域。在一些實施例中，DLL3結合多肽為單特異性的。在一些實施例中，DLL3結合多肽為多特異性的。舉例而言，所提供之DLL3結合多肽包括可包含至少一個結合DLL3之VHH域及結合一或多種除DLL3外之目標蛋白之一或多個其他結合域、諸如一或多個其他VHH域的多肽。
在一些實施例中，DLL3結合多肽包含至少一個結合DLL3之VHH域及Fc域。在一些實施例中，本文提供之DLL3結合多肽包含一個、兩個、三個或四個結合DLL3之VHH域及Fc域。在一些實施例中，Fc域介導DLL3結合多肽在生理條件下之二聚以便形成使DLL3結合位點之數量加倍之二聚體。舉例而言，包含三個結合DLL3之VHH域及Fc區之DLL3結合多肽係三價之單體形式，但在生理條件下，Fc區可介導二聚，使得DLL3結合多肽在該等條件下以六價二聚體形式存在。
DLL3為δ蛋白質配位體家族成員。δ蛋白質配位體家族充當以DSL域、EGF重複及跨膜域為特徵的Notch配位體。DLL3高度表現於胎兒腦中，而非正常成人組織中。相比之下，DLL3表現於多種腫瘤細胞及腫瘤血管(包括(但不限於)小細胞肺癌(SCLC)、大細胞神經內分泌癌(LCNEC)及卵巢癌)之表面上。在正常發育過程中，與Notch活化δ蛋白質家族成員相反，DLL3抑制順式作用型與反式作用型Notch路徑活化，此抑制係藉由分別與Notch及DLL1相互作用且將其再引向或保持於晚期核內體/溶酶體隔室或高爾基體中，藉此阻止其局域化於細胞表面(Chapman等人, 2011, Hum Mol Genet. 20(5):905-16.；Serth等人, 2015, PLoS One. 10(4):e0123776.)。值得注意的是，在神經內分泌腫瘤中，Notch活化抑制腫瘤生長(Kunnimalaiyaan及Chen, 2007, Oncologist. 12(5):535-42)。此等觀測結果表明，藉由下調Notch信號傳導，DLL3可能與神經內分泌表型相關，從而導致神經內分泌腫瘤發生。DLL3表現在正常成人組織中極其有限，但在惡性SCLC、LCNEC、黑色素瘤、神經膠母細胞瘤、肺外神經內分泌癌瘤(NEC)中廣泛存在(Saunders等人, 2015, Sci Transl Med. 2015, 7(302): 302ra136；Peng等人, 2016, J. Clin. Oncol., 34,第15期_增刊11611-11611)。另外，腫瘤組織上的DLL3表現量高與以下相關：晚期腫瘤階段及/或神經膠母細胞瘤、髓質甲狀腺及神經內分泌胰臟癌的存活率較差(Peng等人, 2016, J. Clin. Oncol., 34,第15期_增刊11611-11611)、SCLC及LCNEC (Saunders等人, 2015, Sci Transl Med. 2015, 7(302): 302ra136)，以及一些卵巢癌(Hu等人, 2014, Cancer Res. 74(12): 3282-3293)。
典型人類DLL3之例示性序列如下所示：MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRP AGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREVATPLFPPLHTGRAGQRQHLLFPYPSSILSVK  (SEQ ID NO:86，信號序列加有下劃線)
非典型人類DLL3之例示性序列如下所示：MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRP AGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREA (SEQ ID NO:87，信號序列加有下劃線)
在一些情況下，所提供之DLL3結合多肽直接阻斷或抑制DLL3之活性，在一些態樣中，其可用作治療劑以抑制或減少腫瘤細胞生長或存活。
提供多種DLL3多肽結合形式。在一些實例中，DLL3結合多肽包括DLL3 VHH-Fc多肽。在一些實施例中，Fc為展現免疫效應活性之Fc，該免疫效應活性諸如一或多種效應功能，諸如抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。
在一些實施例中，所提供之DLL3結合多肽可用於刺激個體之免疫反應，在一些態樣中，其治療個體之疾病或病症，諸如癌症。在一些態樣中，本文提供之DLL3結合多肽，諸如DLL3-Fc，可結合至表現DLL3之腫瘤細胞且誘發針對表現DLL3之腫瘤細胞之主動免疫反應。在一些情況下，主動免疫反應可引起癌細胞死亡(例如抗體結合至癌細胞誘發細胞凋亡式細胞死亡)，或抑制癌細胞之生長(例如阻斷細胞週期進展)。在其他情況下，本文提供之DLL3結合多肽，諸如DLL3 VHH-Fc，可結合至癌細胞且抗體依賴性細胞毒性(ADCC)可消除該DLL3結合多肽所結合之癌細胞。在一些情況下，所提供之DLL3 VHH結合多肽亦可活化細胞與體液免疫反應，且募集更多自然殺手細胞或增加進一步活化個體免疫系統以破壞癌細胞之細胞介素(例如IL-2、IFN-γ、IL-12、TNF-α、TNF-β等)的產生。在另一實施例中，DLL3結合多肽，諸如DLL3 VHH-Fc，可結合至癌細胞，且巨噬細胞或其他吞噬細胞可諸如經由CDC或ADCP過程調理癌細胞。
在其他態樣中，本文亦提供展現多特異性結合之VHH結合多肽。在一些情況下，結合多肽包括對DLL3及諸如CD3之T細胞抗原展現雙重親和力之多肽。在一些態樣中，此類雙重親和力分子能夠在結合腫瘤表現之DLL3時接合或活化腫瘤部位處之T細胞。詳言之，本文提供之此類分子尤其為展現限制性CD3結合之分子。本文亦提供表現含有DLL3結合多肽之嵌合抗原受體的經工程改造之細胞，諸如經工程改造之T細胞。
本申請案中所提及之所有公開案，包括專利文件、科學論文及資料庫，出於所有目的均以全文引用之方式併入本文中，其引用之程度如同各個別公開案以引用之方式個別地併入一般。若本文所闡述之定義與以引用方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他公開案中所闡述之定義相反或在其他方面不一致，則以本文所闡述之定義為準，而非以引用方式併入本文中之定義為準。
本文所述或所提及之技術及程序通常很好理解且普遍使用習知方法由熟習此項技術者採用，諸如以下文獻中所述之廣泛利用之方法：Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual第3版(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel等人編輯, (2003))；系列METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames及G. R. Taylor編輯(1995))；Harlow及Lane編輯(1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, 及ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney編輯(1987))；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編輯, 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis編輯, 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R. I. Freshney)編輯, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather及P. E. Roberts, 1998) Plenum Press；Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths及D. G. Newell編輯, 1993-8) J. Wiley及Sons；Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir及C. C. Blackwell編輯)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller及M. P. Calos編輯, 1987)；PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編輯, 1994)；Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan等人編輯, 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C. A. Janeway及P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；Antibodies: A Practical Approach (D. Catty.編輯, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd及C. Dean編輯, Oxford University Press, 2000)；Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow及D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti及J. D. Capra編輯, Harwood Academic Publishers, 1995)；以及Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita等人編輯, J.B. Lippincott Company, 1993)；及其最新型式。
本文所使用之章節標題僅出於組織之目的且不應理解為限制所描述之主題。I. 定義
除非另外定義，否則結合本發明使用之科學與技術術語將具有一般技術者通常理解之含義。此外，除非上下文另有需要或另外明確地指出，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。對於各種來源或參考文獻之間有關定義之任何矛盾，以本文所提供之定義為準。
應瞭解，本文所述之本發明實施例包括「由」實施例「組成」及/或「基本上由」實施例「組成」。除非另外指出，否則如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。術語「或」在本文中之使用不意圖暗示替代方案係互相排斥的。
在本申請案中，除非明確地敍述或熟習此項技術者所瞭解，否則「或」之使用意謂「及/或」。在多重附屬項之情況下，「或」之使用重新提及超過一個前述獨立項或附屬項。
如本文所用，術語「約」係指熟習此項技術者易於知曉之各別值的常見誤差範圍。本文中提及「約」某一值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，涉及「約X」之描述包括「X」之描述。
術語「核酸分子」、「核酸」及「多核苷酸」可互換使用，且係指核苷酸聚合物。此類核苷酸聚合物可含有天然及/或非天然核苷酸且包括(但不限於) DNA、RNA及PNA。「核酸序列」係指包含於核酸分子或多核苷酸中之核苷酸線性序列。
如本文所用之術語「經分離之多核苷酸」應意謂基因組、cDNA或合成來源或其某一組合之多核苷酸，藉助於其來源，該分離之多核苷酸(1)不與自然界中發現之多核苷酸之全部或一部分相關聯，(2)可操作地連接於在自然界中其未連接之多核苷酸，或(3)在自然界中不作為較大序列之部分存在。
術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物，且不限於最小長度。胺基酸殘基之此類聚合物可含有天然或非天然胺基酸殘基且包括但不限於胺基酸殘基之肽、寡肽、二聚體、三聚體及多聚體。全長蛋白與其片段皆涵蓋於該定義中。該術語亦包括多肽之表現後修飾，例如糖基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化及類似修飾。此外，出於本發明之目的，「多肽」係指一種蛋白質，其包括對天然序列之修飾，諸如缺失、添加及取代(實際上通常係保守的)，只要該蛋白質保持所需活性即可。此等修飾可為有意的，如經由定點突變誘發；或可為偶然的，諸如經由產生蛋白質之宿主的突變或因PCR擴增所致的誤差。
本文所提及之術語「經分離之蛋白質」意謂如下目標蛋白質，其(1)不含至少一些通常在自然界中發現與其在一起之其他蛋白質，(2)基本上不含來自相同來源，例如來自相同物種之其他蛋白質，(3)由來自不同物種之細胞表現，(4)已與在自然界中其相關聯之至少約50%多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他材料分離，(5)不與在自然界中「分離之蛋白質」相關聯之蛋白質部分相關聯(藉由共價或非共價相互作用)，(6)可操作地與在自然界中其不相關聯之多肽相關聯(藉由共價或非共價相互作用)，或(7)在自然界中不存在。此類經分離之蛋白質可由基因組DNA、cDNA、mRNA或其他RNA編碼，可為合成來源，或其任何組合。在某些實施例中，經分離之蛋白質實質上為純的或實質上不含在其天然環境中發現之將干擾其使用(治療、診斷、預防、研究或其他)的蛋白質或多肽或其他污染物。
如本文所用，「實質上純」意謂對象物種為存在之主要物種(亦即以莫耳計，其比組合物中之任何其他個別物種更豐富)，且實質上純化之部分為其中對象物種佔存在之所有大分子物種之至少約50%(以莫耳計)的組合物。一般而言，實質上純組合物將包含超過組合物中存在之所有大分子物種之約80%，例如在一些實施例中，超過約85%、90%、95%及99%。在一些實施例中，對象物種純化至基本均質性(無法藉由習知偵測方法在組合物中偵測到污染物種)，其中組合物基本上由單一大分子物種組成。
如本文所用之術語「可操作地連接」係指進行如此描述之組分之位置處於准許其以其預期方式起作用的關係中。「可操作地連接」至編碼序列之控制序列係以使編碼序列之表現在與控制序列相容之條件下達成的方式接合。
術語「特異性結合」於抗原或抗原決定基為此項技術中充分瞭解之術語，且用於測定該特異性結合之方法亦為此項技術中熟知。若分子與特定細胞或物質之反應或締合比其與替代性細胞或物質更頻繁、更快速，持續時間更長及/或親和力更大，則稱其呈現「特異性結合」或「較佳結合」。若單域抗體(sdAb)或含VHH多肽與目標之結合比其與其他物質之結合親和力、親合力更大、更容易及/或持續時間更長，則其「特異性結合」或「優先結合」於目標。舉例而言，特異性或優先結合至DLL3抗原決定基之sdAb或含VHH多肽為與此抗原決定基之結合比其與其他DLL3抗原決定基或非DLL3抗原決定基之結合親和力、親合力更大、更容易及/或持續時間更長的sdAb或含VHH多肽。藉由閱讀此定義，亦應理解；例如特異性或優先結合至第一目標之sdAb或含VHH多肽可能或可能不特異性或優先結合至第二目標。由此，「特異性結合」或「優先結合」未必需要(儘管其可包括)獨佔式結合。一般而言，但不一定，提及結合意謂優先結合。「特異性」係指結合蛋白選擇性地結合抗原之能力。
如本文所用之術語「抗原決定基」係指抗原結合分子(例如sdAb或含VHH多肽)在目標分子(例如抗原，諸如蛋白質、核酸、碳水化合物或脂質)上結合之位點。抗原決定基常常包括一組表面具有化學活性之分子，諸如胺基酸、多肽或糖側鏈，且具有特定三維結構特徵以及荷質比特徵。抗原決定基可由目標分子之相鄰及/或並接非相鄰殘基(例如胺基酸、核苷酸、糖、脂質部分)形成。由相鄰殘基(例如胺基酸、核苷酸、糖、脂質部分)形成之抗原決定基通常在暴露於變性溶劑時得以保留，而藉由三級摺疊形成之抗原決定基通常在用變性溶劑處理時丟失。抗原決定基可包括(但不限於)至少3個、至少5個或8-10個殘基(例如胺基酸或核苷酸)。在一些實施例中，抗原決定基之長度小於20個殘基(例如胺基酸或核苷酸)、小於15個殘基或小於12個殘基。若兩個抗體對某個抗原展現競爭性結合，則其可能結合該抗原內之同一個抗原決定基。在一些實施例中，可藉由距抗原結合分子上之CDR殘基之某一最小距離鑑別抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基可藉由以上距離來鑑別，且進一步侷限於與抗原結合分子之殘基與抗原殘基之間的鍵(例如氫鍵)相關的彼等殘基。抗原決定基亦可藉由各種掃描來鑑別，例如丙胺酸或精胺酸掃描可指示出抗原結合分子可進行相互作用之一或多個殘基。除非明確表示，否則作為抗原決定基之一組殘基不排除其他殘基作為特定抗原結合分子之抗原決定基的一部分。實際上，該組之存在表示最小的一系列抗原決定基(或一組物種)。因此，在一些實施例中，鑑別為抗原決定基之一組殘基表示該抗原之最小相關抗原決定基，而非抗原上之抗原決定基的排他性殘基清單。
「非線性抗原決定基」或「構形抗原決定基」包含在對抗原決定基具有特異性之抗原結合分子所結合之抗原蛋白質內的非相鄰多肽、胺基酸及/或糖。在一些實施例中，至少一個殘基將與抗原決定基之其他所指出之殘基不相鄰；然而，一或多個殘基亦可與其他殘基相鄰。
「線性抗原決定基」包含在對抗原決定基具有特異性之抗原結合分子所結合之抗原蛋白質內的相鄰多肽、胺基酸及/或糖。應注意，在一些實施例中，並非線性抗原決定基內之每一個殘基均需要與抗原結合分子直接結合(或與鍵相關)。在一些實施例中，線性抗原決定基可來自用實際上由線性抗原決定基序列組成之肽進行免疫接種，或來自與蛋白質之剩餘部分相對分離之蛋白質結構部分(以使得抗原結合分子可至少主要地，僅與該序列部分相互作用)。
術語「抗體」及「抗原結合分子」就最廣義而言可互換使用，且涵蓋包含抗體樣抗原結合域之各種多肽，包括(但不限於)習知抗體(通常包含至少一個重鏈及至少一個輕鏈)、單域抗體(sdAb，其僅包含一個通常類似於重鏈之鏈)、含VHH多肽(包含至少一個重鏈、僅包含抗體可變域或VHH之多肽)及前述任一者之片段，只要其展現所需抗原結合活性即可。在一些實施例中，抗體包含二聚結構域。此等二聚結構域包括(但不限於)重鏈恆定域(包含CH1、鉸鏈、CH2及CH3，其中CH1通常與輕鏈恆定域CL配對，而鉸鏈調節二聚作用)及Fc域(包含鉸鏈、CH2及CH3，其中鉸鏈調節二聚作用)。
術語抗體亦包括(但不限於)嵌合抗體、人類化抗體及各種物種之抗體，諸如駱駝(包括駱馬)、鯊魚、小鼠、人類、食蟹獼猴等。
術語「可變區」或「可變域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原之結合的結構域。原生抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH 及VL )的可變域通常具有類似結構，其中各結構域包含四個保守性構架區(FR)及三個CDR。(參見例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版, W.H. Freeman and Co.,第91頁(2007)。單一VH 或VL 域可足夠賦予抗原結合特異性，例如單域抗體，諸如VHH。此外，可使用來自結合抗原之抗體的VH 或VL 域分離結合特定抗原之抗體以分別篩選互補VL 或VH 域之庫。參見例如Portolano等人, J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson等人, Nature 352:624-628 (1991)。
「抗體片段」或「抗原結合片段」係指除習知或完整抗體外包含習知或完整抗體之至少含有結合抗原之可變區的部分的分子。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、單鏈Fv (sdFv)、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2 ；雙功能抗體；線性抗體；僅僅包含VH 區(VHH)之單域抗體。
如本文所用，提及結合分子時「單價」係指結合分子具有單個對目標抗原具有特異性之抗原識別位點。單價結合分子之實例包括例如單價抗體片段、具有抗體樣結合特性之蛋白質結合分子或MHC分子。單價抗體片段之實例包括(但不限於)Fab片段、Fv片段及單鏈Fv片段(scFv)。
術語「單域抗體」、「sdAb」、「VHH」在本文中可互換地使用以指具有單個單體結構域抗原結合/識別結構域之抗體。此類抗體包括駱駝抗體或鯊魚抗體。在一些實施例中，VHH包含三個CDR及四個構架區，稱為FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。在一些實施例中，VHH可在N端或C端截短，以使得其僅僅包含部分FR1及/或FR4，或缺乏彼等構架區中之一或兩者，只要VHH實質上維持抗原結合及特異性即可。
術語「含VHH多肽」係指包含至少一個VHH結構域之多肽。在一些實施例中，VHH多肽包含兩個、三個或四個或更多個VHH域，其中各VHH域可相同或不同。在一些實施例中，含VHH多肽包含Fc域。在一些此類實施例中，VHH多肽可形成二聚體。含VHH多肽之非限制性結構包括VHH1 -Fc、VHH1 -VHH2 -Fc及VHH1 -VHH2 -VHH3 -Fc，其中VHH1 、VHH2 及VHH3 可相同或不同。在此等結構之一些實施例中，一個VHH可經連接子連接至另一VHH，或一個VHH可經連接子連接至Fc。在一些此類實施例中，連接子包含1-20個胺基酸，較佳為1-20個主要包含甘胺酸且視情況包含絲胺酸之胺基酸。在一些實施例中，當含VHH多肽包含Fc時，其形成二聚體。因此，若結構VHH1 -VHH2 -Fc形成二聚體，則認為其為四價的(亦即，二聚體具有四個VHH域)。類似地，若結構VHH1 -VHH2 -VHH3 -Fc形成二聚體，則認為其係六價的(亦即，二聚體具有六個VHH域)。
如本文所用，DLL3結合多肽為特異性結合DLL3之多肽或蛋白質。通常，本文中DLL3結合多肽為含有至少一個結合DLL3之VHH域的含VHH多肽。DLL3結合多肽包括結合物，包括融合蛋白。DLL3結合多肽包括融合蛋白，包括含有Fc域之融合蛋白。在一些實施例中，DLL3結合多肽含有兩個、三個或四個或更多個各特異性結合至DLL3之VHH域，其中各VHH域可相同或不同。在一些實施例中，DLL3結合多肽為多價的。在一些實施例中，DLL3結合多肽為多特異性的。在一些情況下，DLL3結合多肽可含有一或多個結合至除DLL3外之一或多種其他或其他抗原的其他結構域。
術語「單株抗體」係指實質上均質之抗體群體之抗體(包括sdAb或含VHH多肽)，亦即，構成此群體之個別抗體除可能少量存在之可能天然存在之突變以外均相同。單株抗體針對單一抗原位點具有高度特異性。另外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，單株抗體之樣品可結合至抗原上之同一抗原決定基。修飾語「單株」指示抗體之特徵為自實質上均質之抗體群體獲得，且不應理解為需要藉由任何特定方法來產生該抗體。舉例而言，單株抗體可藉由Kohler及Milstein, 1975, Nature 256:495首次描述之融合瘤方法製造，或可藉由諸如美國專利第4,816,567號中所述之重組DNA方法製造。舉例而言，單株抗體亦可自使用McCafferty等人，1990, Nature 348:552-554中所描述之技術生成的噬菌體文庫中分離。
術語「CDR」表示互補決定區，如由熟習此項技術者用至少一種鑑別方式所定義。所給定CDR或FR之確切胺基酸序列邊界可容易使用多種熟知方案中之任一者確定，包括以下文獻中所述之方案：Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,第5版Public Health Service」, National Institutes of Health, Bethesda, MD (「Kabat」編號方案)；Al-Lazikani等人, (1997) JMB 273,927-948 (「Chothia」編號方案)；MacCallum等人, J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996),「Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography」, J. Mol. Biol. 262, 732-745.」(「接觸」編號方案)；Lefranc MP等人,「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」, Dev Comp Immunol, 2003年1月;27(1):55-77 (「IMGT」編號方案)；Honegger A及Plückthun A,「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool」, J Mol Biol, 2001年6月8日;309(3):657-70, (「Aho」編號方案)；以及Martin等人,「Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm」, PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, (「AbM」編號方案)。
所給定CDR或FR之邊界可根據鑑別所用之方案而變化。舉例而言，Kabat方案係基於結構比對，而Chothia方案係基於結構資訊。Kabat與Chothia兩種方案之編號均基於最常用抗體區域序列長度，其中在一些抗體中出現由插入字母(例如「30a」)表示之插入以及缺失。兩種方案使得某些插入及缺失(「插入缺失」)位於不同位置，產生不同編號。接觸方案係基於對複雜晶體結構之分析，且在多個方面與Chothia編號方案類似。AbM方案為介於Kabat與Chothia定義之間的折衷，其基於由Oxford Molecular之AbM抗體模型化軟體使用之方案。
在一些實施例中，CDR可根據Chothia編號方案、Kabat編號方案、Kabat與Chothia之組合、AbM定義及/或接觸定義中之任一者來定義。VHH包含三個CDR，稱為CDR1、CDR2及CDR3。下表1列出分別如藉由Kabat、Chothia、AbM及接觸方案所鑑別的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3之例示性位置邊界。對於CDR-H1，殘基編號使用Kabat及Chothia兩種編號方案來列出。FR位於CDR之間，例如FR-H1位於CDR-H1之前，FR-H2位於CDR-H1與CDR-H2之間，FR-H3位於CDR-H2與CDR-H3之間等等。應注意，因為所示Kabat編號方案使得插入位於H35A及H35B處，所以視環長度而定，Chothia CDR-H1環之末端在使用所示Kabat編號規約進行編號時在H32與H34之間變化。
表 1 .根據各種編號方案得到之CDR邊界
CDR Kabat Chothia AbM 接觸
CDR-H1 (Kabat編號1 ) H31--H35B H26--H32..34 H26--H35B H30--H35B
CDR-H1 (Chothia編號2 ) H31--H35 H26--H32 H26--H35 H30--H35
CDR-H2 H50--H65 H52--H56 H50--H58 H47--H58
CDR-H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101
1 - Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 2 - Al-Lazikani等人, (1997) JMB 273,927-948
因此，除非另外說明，否則既定抗體或其區域(諸如其可變區)的「CDR」或「互補決定區」或個別指定之CDR (例如CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)應理解為涵蓋如藉由任一前述方案所定義之互補決定區(或具體互補決定區)。舉例而言，在陳述特定CDR (例如CDR-H3)含有既定VHH胺基酸序列中相應CDR之胺基酸序列的情況下，應瞭解此類CDR具有VHH內如藉由任一前述方案所定義的相應CDR (例如CDR-H3)之序列。在一些實施例中，指定具體CDR序列。使用多種編號方案來描述所提供之抗體之例示性CDR序列(參見例如表1)，但應瞭解，所提供之抗體可包括如根據其他上述編號方案中之任一者或熟練技術人員已知之其他編號方案描述的CDR。
如本文所用，「結合物」、「結合」或其語法變化形式係指兩種或更多種化合物藉由此項技術中已知之任何接合或連接方法接合或連接在一起，導致形成另一化合物。其亦可指藉由將兩種或更多種化合物接合或連接在一起所產生之化合物。舉例而言，直接或間接地連接至一或多種化學部分或多肽之VHH域為例示性結合物。此類結合物包括融合蛋白，藉由化學結合物產生之結合物及藉由任何其他方法產生之結合物。
免疫球蛋白Fc融合物(「Fc-融合物」)，諸如VHH-Fc，為包含一或多個VHH域可操作地連接於免疫球蛋白之Fc區的分子免疫球蛋白Fc區可間接或直接連接至一或多個VHH域。各種連接子為此項技術中已知的且可視情況用於連接Fc與融合搭配物以產生Fc-融合物。在一些此類實施例中，連接子包含1-20個胺基酸，較佳為1-20個主要包含甘胺酸且視情況包含絲胺酸之胺基酸。相同物種之Fc-融合物可二聚形成Fc-融合均二聚體，或使用不相同物種以形成Fc-融合雜二聚體。在一些實施例中，Fc為哺乳動物Fc，諸如人類Fc。
如本文所用，術語「重鏈恆定區」係指包含至少三個重鏈恆定域CH 1、鉸鏈、CH 2及CH 3的區域。當然，除非另外指出，否則該等結構域內不改變功能之缺失及變化涵蓋在術語「重鏈恆定區」之範圍內。非限制性例示性重鏈恆定區包括γ、δ及α。非限制性例示性重鏈恆定區亦包括ε及μ。各重鏈恆定區對應於抗體同型。舉例而言，包含γ恆定區之抗體係IgG抗體，包含δ恆定區之抗體係IgD抗體且包含α恆定區之抗體係IgA抗體。另外，包含μ恆定區之抗體係IgM抗體，且包含ε恆定區之抗體係IgE抗體。某些同型可進一步細分為子類。舉例而言，IgG抗體包括(但不限於) IgG1 (包含γ1 恆定區)、IgG2 (包含γ2 恆定區)、IgG3 (包含γ3 恆定區)及IgG4 (包含γ4 恆定區)抗體；IgA抗體包括(但不限於) IgA1 (包含α1 恆定區)及IgA2 (包含α2 恆定區)抗體；且IgM抗體包括(但不限於) IgM1及IgM2。
如本文所用，「Fc區」係指包含CH2及CH3之重鏈恆定區之部分。在一些實施例中，Fc區包含鉸鏈、CH2及CH3。在各種實施例中，當Fc區包含鉸鏈時鉸鏈介導兩個含Fc之多肽之間的二聚。Fc區可為本文所論述之任何抗體重鏈恆定區同型。在一些實施例中，Fc區為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
「功能Fc片段」具有原生序列Fc區之「效應功能」。例示性「效應功能」包括Fc受體結合；Clq結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；以及B細胞活化等。該等效應功能一般需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合且可使用各種分析評估。
「原生序列Fc區」包含與在自然界中發現之Fc區之胺基酸序列相同的胺基酸序列。原生序列人類Fc區包括原生序列人類IgG1 Fc區(非A及A異型)；原生序列人類IgG2 Fc區；原生序列人類IgG3 Fc區；及原生序列人類IgG4 Fc區以及其天然存在之變異體。
「變異Fc區」包含與原生序列Fc區之胺基酸序列相差至少一個胺基酸修飾的胺基酸序列。在一些實施例中，「變異Fc區」包含與原生序列Fc區之胺基酸序列相差至少一個胺基酸修飾，但保留原生序列Fc區之至少一種效應功能的胺基酸序列。在一些實施例中，變異Fc區相比於原生序列Fc區或相比於親本多肽之Fc區具有至少一個胺基酸取代，例如在原生序列Fc區中或在親本多肽之Fc區中約一個至約十個胺基酸取代，且較佳約一個至約五個胺基酸取代。在一些實施例中，本文中之變異Fc區與原生序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區具有至少約80%序列一致性、至少約90%序列一致性、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。
一般而言，免疫球蛋白重鏈或其部分，諸如Fc區中殘基之編號為Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest ,第5版Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)中EU索引之編號。「如Kabat中之EU索引」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。
「Fc受體」或「FcR」描述與抗體之Fc區結合之受體。在一些實施例中，FcγR係原生人類FcR。在一些實施例中，FcR係結合IgG抗體之FcR (γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括彼等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA (「活化受體」)及FcγRIIB (「抑制受體」)，兩者具有相似的胺基酸序列，不同之處主要在於其細胞質域。活化受體FcγRIIA在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)。抑制受體FcγRIIB在其細胞質域中含有基於免疫受體酪胺酸之抑制模體(ITIM)。(參見例如Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))。FcR評述於例如Ravetch及Kinet,Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel等人,Immunomethods 4:25-34 (1994)；及de Haas等人,J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)。其他FcR，包括將來鑑別之FcR，涵蓋於本文術語「FcR」中。舉例而言，術語「Fc受體」或「FcR」亦包括新生兒受體FcRn，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人,J. Immunol. 117:587 (1976)及Kim等人,J. Immunol. 24:249 (1994))且調節免疫球蛋白之穩態。與FcRn之結合的量測方法係已知的(參見例如Ghetie及Ward,Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie等人,Nature Biotechnology , 15(7):637-640 (1997)；Hinton等人,J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；WO 2004/92219 (Hinton等人)。
如本文所論述，如本文所用之「接受體人類構架」係包含源自人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之重鏈可變域(VH )構架之胺基酸序列的構架。源自人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含與其相同之胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列改變。在一些實施例中，在諸如VHH之單一抗原結合域中之所有人類構架中，胺基酸改變之數量少於10、或少於9、或少於8、或少於7、或少於6、或少於5、或少於4、或少於3。
如本文所用，「嵌合抗原受體」或「CAR」係指一種經工程改造之受體，其經由抗原結合域將抗原特異性引入至其進行工程改造之細胞(例如T細胞，諸如原始T細胞、中樞記憶T細胞、效應記憶T細胞或其組合)，因此將抗原結合域之抗原結合特性與T細胞之T細胞活性(例如溶解能力及自我更新)組合。CAR通常包括細胞外抗原結合域(胞外域)、跨膜域及胞內信號傳導域。胞內信號傳導域一般含有至少一個例如源自CD3ζ之ITAM信號傳導域及視情況選用之至少一個例如源自CD28或4-1BB之共刺激信號傳導域。在本文提供之CAR中，VHH域形成抗原結合域且當在細胞中表現時位於細胞外側。
「親和力」係指分子(例如抗體或含VHH多肽)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和的強度。分子X對其搭配物Y之親和力或表觀親和力一般可分別由解離常數(KD )或KD- 表觀 來表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法(諸如ELISA KD 、KinExA、流動式細胞測量術及/或表面電漿子共振裝置)，包括本文所述之彼等方法來量測。此等方法包括(但不限於)涉及BIAcore®、Octet®或流動式細胞測量術之方法。
如本文所用之術語「KD 」係指抗原結合分子/抗原相互作用之平衡解離常數。當本文中使用術語「KD 」時，其包括KD 及KD -表觀 。
在一些實施例中，藉由流動式細胞測量術，使用表現抗原之細胞株且將在每種抗體濃度下量測之平均螢光擬合至非線性單位點等式(Prism Software graphpad)中來量測抗原結合分子之KD 。在一些此類實施例中，KD 為KD -表觀 。
術語「生物活性」係指分子之任一種或多種生物特性(無論是在活體內發現為天然存在的抑或藉由重組手段提供或實現的)。生物特性包括(但不限於)結合配位體、誘發或增加細胞增殖(諸如T細胞增殖)及誘發或增加細胞介素之表現。
「親和力成熟」含VHH多肽係指相較於不具有一或多個改變之親本含VHH多肽，具有此類改變之含VHH多肽，此類改變改良含VHH多肽對抗原之親和力。
如本文所用之「人類化VHH」係指其中一或多個構架區已實質上經人類構架區置換之VHH。在一些情況下，人類免疫球蛋白之某些構架區(FR)殘基經對應非人類殘基置換。此外，人類化VHH可包含在原始VHH或人類構架序列中均未發現，但包括在內以進一步改進及優化VHH或含VHH多肽之效能的殘基。在一些實施例中，人類化之含VHH多肽包含人類Fc區。應瞭解，人類化序列可藉由其一級序列鑑別且未必表示該抗體產生之過程。
如本文所用之術語「實質上相似」或「實質上相同」表示兩個或更多個數值之間的相似度足夠高，使得在藉由該值量度之生物特徵的背景下，熟習此項技術者將認為該兩個或更多個值之間的差異具有極小或無生物及/或統計顯著性。在一些實施例中，兩個或更多個實質上相似值相差不超過約以下任一個：5%、10%、15%、20%、25%或50%。
多肽「變異體」意謂在比對序列且必要時引入間隙以達到最大序列一致性百分比之後，且不考慮任何保守取代為序列一致性之一部分，與原生序列多肽具有至少約80%胺基酸序列一致性的生物活性多肽。該等變異體包括例如在多肽之N端或C端添加或缺失一或多個胺基酸殘基的多肽。在一些實施例中，變異體將具有至少約80%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，變異體將具有至少約90%胺基酸序列一致性。在一些實施例中，變異體與原生序列多肽將具有至少約95%胺基酸序列一致性。
如本文所用之關於肽、多肽或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」及「同源性」定義為在比對序列且必要時引入間隙以達到最大序列一致性百分比之後，且不考慮任何保守取代為序列一致性之一部分，候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術內之各種方式實現，例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGNTM (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可測定用於量測比對之適當參數，包括用於達成所比較序列之全長內之最大比對所需的任何演算法。
胺基酸取代可包括(但不限於)將多肽中之一個胺基酸替換為另一個胺基酸。例示性取代展示於表2中。胺基酸取代可引入所關注抗體及針對所需活性篩選出之產物中，該活性例如抗原結合之保留/改良、免疫原性降低、或ADCC或CDC之改善。
表 2
原始殘基 例示性取代
Ala (A) Val；Leu；Ile
Arg (R) Lys；Gln；Asn
Asn (N) Gln；His；Asp、Lys；Arg
Asp (D) Glu；Asn
Cys (C) Ser；Ala
Gln (Q) Asn；Glu
Glu (E) Asp；Gln
Gly (G) Ala
His (H) Asn；Gln；Lys；Arg
Ile (I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸
Leu (L) 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
Lys (K) Arg；Gln；Asn
Met (M) Leu；Phe；Ile
Phe (F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Pro (P) Ala
Ser (S) Thr
Thr (T) Val；Ser
Trp (W) Tyr；Phe
Tyr (Y) Trp；Phe；Thr；Ser
Val (V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組： (1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； (2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln； (3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg； (5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro； (6)芳族∶Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要此等類別中之一者之成員換成另一個類別。
術語「載體」用於描述可經工程改造以含有可在宿主細胞中繁殖之經選殖多核苷酸的多核苷酸。載體可包括以下元件中之一或多個：複製起點、一或多個調控所關注多肽之表現的調控序列(諸如啟動子及/或強化子)及/或一或多個可選擇標記物基因(諸如抗生素抗性基因及可用於比色分析中之基因，例如β-半乳糖)。術語「表現載體」係指用於在宿主細胞中表現所關注多肽之載體。
「宿主細胞」係指可為或已為載體或經分離多核苷酸之接受體的細胞。宿主細胞可為原核細胞或真核細胞。例示性真核細胞包括哺乳動物細胞，諸如靈長類動物或非靈長類動物細胞；真菌細胞，諸如酵母；植物細胞；以及昆蟲細胞。非限制性例示性哺乳動物細胞包括(但不限於) NSO細胞、PER.C6®細胞(Crucell)以及293及CHO細胞，以及其衍生物，諸如293-6E、CHO-DG44、CHO-K1、CHO-S及CHO-DS細胞。宿主細胞包括單個宿主細胞之後代，且後代可能由於自然、偶然或故意突變而不一定與原始母細胞完全一致(在形態或基因組DNA互補方面)。宿主細胞包括在活體內經本文提供之多核苷酸轉染之細胞。
如本文所用，術語「經分離」係指分子已與自然界中通常發現與其一起或產生的至少一些組分分離。舉例而言，當多肽與產生多肽之細胞的至少一些組分分離時，該多肽稱為「經分離」。在多肽在表現後由細胞分泌的情況下，使含有該多肽之清液層與產生其之細胞在實體上分離視為「分離」多肽。類似地，當多核苷酸不為在自然界中其中通常發現該多核苷酸的較大多核苷酸(諸如在DNA多核苷酸之情況下基因組DNA或粒線體DNA)之一部分或與產生該多核苷酸之細胞的至少一些組分分離(例如在RNA多核苷酸之情況下)時，多核苷酸稱為「經分離」。因此，宿主細胞內部之載體中所含的DNA多核苷酸可稱為「經分離」。
術語「個體(individual)」與「個體(subject)」在本文中可互換使用，係指動物；例如哺乳動物。術語患者包括人類及獸醫學個體。在一些實施例中，提供治療哺乳動物之方法，該等哺乳動物包括(但不限於)人類、嚙齒動物、猿猴、貓科動物、犬科動物、馬科動物、牛科動物、豬科動物、綿羊、山羊、哺乳類實驗動物、哺乳類農畜、哺乳類運動動物及哺乳類寵物。個體可為雄性或雌性且可為任何適齡個體，包括嬰兒、幼年、青年、成年及老年個體。在一些實例中，「個體(individual或subject)」係指需要治療疾病或病症之個體。在一些實施例中，接受治療之個體可為患者，指出以下事實：該個體已鑑別為患有與該治療有關聯之病症，或有極大的風險患上該病症。在特定實施例中，個體為人類，諸如人類患者。
如本文所用，「疾病」或「病症」係指需要及/或期望治療之病狀。
除非另外指出，否則術語「腫瘤細胞」、「癌細胞」、「癌症」、「腫瘤」及/或「贅瘤」在本文中可互換使用，且係指展現不可控之生長及/或細胞存活異常增加及/或抑制細胞凋亡，干擾身體器官及系統之正常功能的細胞。此定義中包括良性及惡性癌症、息肉、增生以及潛伏性腫瘤或微小轉移灶。
術語「癌症」及「腫瘤」涵蓋實體癌症及血液/淋巴癌，且亦涵蓋惡性、潛在惡性及良性生長，諸如異常增生。此定義中亦包括具有免疫系統無法阻止(例如免疫逃避及免疫逃脫機制)之異常增殖的細胞(例如病毒感染細胞)。例示性癌症包括(但不限於)∶基底細胞癌、膽道癌；膀胱癌；骨癌；大腦及中樞神經系統癌症；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛膜癌；結腸及直腸癌；結締組織癌；消化系統癌症；子宮內膜癌；食道癌；眼癌；頭頸癌；胃癌(包括胃腸癌)；神經膠母細胞瘤；肝癌；肝瘤；上皮細胞內贅瘤；腎臟癌或腎癌；喉癌；白血病；肝癌；肺癌(例如小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀細胞癌)；黑素瘤；骨髓瘤；神經母細胞瘤；口腔癌(唇癌、舌癌、口癌及咽癌)；卵巢癌；胰臟癌；前列腺癌；視網膜母細胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；呼吸系統癌症；唾液腺癌；肉瘤；皮膚癌；鱗狀細胞癌；胃癌；睪丸癌；甲狀腺癌；子宮或子宮內膜癌；泌尿系統癌症；外陰癌；淋巴瘤，包括霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤，以及B細胞淋巴瘤(包括低級/濾泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴球性(SL) NHL；中級/濾泡性NHL；中級彌漫性NHL；高級免疫母細胞NHL；高級淋巴母細胞NHL；高級小無核裂細胞NHL；腫塊性病變NHL；套細胞淋巴瘤；AIDS相關淋巴瘤；以及瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's Macroglobulinemia)；慢性淋巴球性白血病(CLL)；急性淋巴母細胞白血病(ALL)；毛細胞白血病；慢性骨髓母細胞白血病；以及其他癌瘤及肉瘤；及移植後淋巴增生性病症(PTLD)，以及與母斑病、水腫(諸如與腦瘤相關)及梅格斯氏症狀(Meigs' syndrome)相關之異常血管增生。
如本文所用之術語「非腫瘤細胞」係指正常細胞或組織。例示性非腫瘤細胞包括(但不限於)∶T細胞、B細胞、自然殺手(NK)細胞、自然殺手T (NKT)細胞、樹突狀細胞、單核球、巨噬細胞、上皮細胞、纖維母細胞、肝細胞、間質性腎細胞、纖維母細胞樣滑膜細胞、骨母細胞以及位於乳房、骨骼肌、胰臟、胃、卵巢、小腸、胎盤、子宮、睪丸、腎臟、肺、心臟、大腦、肝、前列腺、結腸、淋巴器官、骨及骨來源間葉幹細胞中之細胞。如本文所用之術語「位於周邊之細胞或組織」係指並非位於腫瘤細胞附近及/或腫瘤微環境內部之非腫瘤細胞。
如本文所用之術語「腫瘤微環境內之細胞或組織」係指圍繞及/或餵飼腫瘤細胞之細胞、分子、細胞外基質及/或血管。腫瘤微環境內之例示性細胞或組織包括(但不限於)∶腫瘤血管結構；浸潤腫瘤之淋巴球；纖維母細胞網狀細胞；內皮祖細胞(EPC)；癌症相關纖維母細胞；外被細胞；其他基質細胞；細胞外基質之組分(ECM)；樹突狀細胞；抗原呈遞細胞；T細胞；調節性T細胞(Treg細胞)；巨噬細胞；嗜中性白血球；骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)及位於腫瘤附近之其他免疫細胞。如下文中所述，此項技術中熟知用於鑑別腫瘤細胞及/或位於腫瘤微環境內之細胞/組織的方法。
在一些實施例中，「增加」或「減少」分別係指統計學上顯著之增加或減少。如熟習此項技術者將顯而易見，「調節」亦可包括與相同條件但不存在測試劑之情形相比，實現目標或抗原對其配位體、結合搭配物、用於締合成均多聚體或雜多聚體形式之搭配物或受質的親和力、親合力、特異性及/或選擇性的變化(可為增加或減少)；實現目標或抗原對存在該目標或抗原之介質或周圍環境中之一或多種條件(諸如pH、離子強度、輔因子之存在等)的敏感性的變化(可為增加或減少)；及/或細胞增殖或細胞介素產生。視所涉及之目標而定，此可藉由任何合適方式及/或使用本身已知或本文所述之任何合適分析來確定。
如本文所用，「免疫反應」意謂涵蓋足以抑制或阻止疾病發作或緩解疾病症狀(例如癌症或癌轉移)之細胞及/或體液免疫反應。「免疫反應」可包含先天性及適應性免疫系統兩者之態樣。
如本文所用，術語疾病、病症或病狀之「治療(treating)」、「治療(treatment)」或「療法(therapy)」係一種獲得有益或所期望之臨床結果的方法。如本文所用之「治療」涵蓋針對包括人類之哺乳動物之疾病的治療劑之任何投與或施用。出於本發明之目的，有益或所期望之臨床結果包括但不限於以下之任一種或多種：減輕一或多種症狀、減弱疾病程度、預防或延遲疾病擴散(例如轉移，例如轉移至肺或淋巴結)、預防或延遲疾病復發、延遲或減緩疾病進展、改善疾病病狀、抑制疾病或疾病進展、抑制或減緩疾病或其進展、阻滯其發展及緩解(無論部分抑或完全)。「治療」亦涵蓋減輕增生性疾病之病理後果。本文所提供之方法涵蓋此等治療態樣中之任一種或多種。按照以上內容，術語治療不需要百分之一百移除病症之所有態樣。
如在癌症情況下，在本文所用之術語癌症之「治療」或「抑制(inhibit)」、「抑制(inhibiting)」或「抑制(inhibition)」係指以下中之至少一者：腫瘤生長速率之統計顯著降低；腫瘤生長中止；或如藉由諸如(但不限於)實體腫瘤反應評估標準(RECIST)的指標所量測，腫瘤之尺寸、質量、代謝活性或體積減小；或無進展存活期(PFS)或總存活期(OS)之統計顯著增加。
「改善」意謂與未投與治療劑相比，一或多種症狀得以減輕或好轉。「改善」亦包括症狀之持續時間縮短或減少。
疾病或病症之「預防(preventing)」、「預防(prophylaxis)」或「預防(prevention)」係指單獨或與另一化合物組合投與醫藥組合物，以預防疾病或病症或者疾病或病症之一些或全部症狀的出現或發作，或降低疾病或病症發作之可能性。
術語「抑制(inhibition)」或「抑制(inhibit)」係指任何表型特徵之減少或停止，或該特徵之發生率、程度或可能性降低或停止。「降低」或「抑制」係使活性、功能及/或量相較於參考物減少、降低或停滯。在一些實施例中，「降低」或「抑制」意謂能夠引起總體減少10%或更大。在一些實施例中，「降低」或「抑制」意謂能夠引起總體減小50%或更大。在一些實施例中，「降低」或「抑制」意謂能夠引起總體減少75%、85%、90%、95%或更大。在一些實施例中，一段時間內上文所述量相對於同一段時間內之對照而言受到抑制或減少。
如本文所用，「延遲疾病發展」意謂延緩、阻礙、減緩、阻滯、穩定、遏制及/或延遲疾病(諸如癌症)之發展。此延遲可具有不同時間長度，視所治療之疾病及/或個體的病史而定。如熟習此項技術者顯而易見，充分或顯著延遲可實際上涵蓋預防，因為該個體不發展該疾病。舉例而言，可延遲晚期癌症，諸如癌轉移發展。
如本文所用，「預防」包括在某一疾病在可能易患該疾病但尚未診斷患有該疾病之個體中的出現或復發方面提供預防作用。除非另外規定，否則術語「降低」、「抑制」或「預防」不表示或不需要一直完全預防，而僅在所量測之時間段內。
術語「抗癌劑」在本文中以最廣含義使用，係指用於治療一或多種癌症之藥劑。示例類別之此等藥劑包括(但不限於)化學治療劑、抗癌生物製劑(諸如細胞介素、受體細胞外域-Fc融合物及抗體)、放射線療法、CAR-T療法、治療性寡核苷酸(諸如反義寡核苷酸及siRNA)及溶瘤病毒。
術語「生物樣品」意謂一定量之來自活物或先前活物的物質。該等物質包括(但不限於)血液(例如全血)、血漿、血清、尿液、羊水、滑液、內皮細胞、白血球、單核球、其他細胞、器官、組織、骨髓、淋巴結及脾臟。
術語「對照」或「參考」係指已知不含分析物之組合物(「陰性對照」)或已知含有分析物之組合物(「陽性對照」)。陽性對照可包含已知濃度之分析物。
術語「有效量」或「治療有效量」係指如例如藉由改善或消除症狀及/或疾病病因，含有活性成分(例如sdAb或含VHH多肽)之組合物在單獨(亦即，呈單一療法形式)或與其他治療劑組合投與患者時使疾病進展在統計學上顯著減少的量及/或濃度。有效量可為減輕、減少或緩解至少一種與疾病或病症相關之症狀或生物反應或效應、預防疾病或病症進展或改善患者之生理功能的量。含有活性劑之組合物的治療有效量可根據諸如疾病病狀、個體之年齡、性別及體重及活性劑在個體中引發所需反應之能力而變化。治療有效量亦為治療有益作用超過活性劑之任何毒性或有害作用的量。治療有效量可以一或多次投藥遞送。治療有效量係指可有效在所必需之劑量及時間下達成所要治療及/或預防結果之量。
如本文所用，組合物係指兩種或更多種產物、物質或化合物(包括細胞)之任何混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、粉末、膏劑、水溶液、非水溶液或其任何組合。
術語「醫藥調配物」及「醫藥組合物」係指所呈形式允許活性成分之生物活性有效，且不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分的製劑。因此，其為適合於醫藥學上用於哺乳動物個體，常常人類之組合物。醫藥組合物通常包含有效量之活性劑(例如sdAb或含VHH多肽)及載劑、賦形劑或稀釋劑。載劑、賦形劑或稀釋劑通常分別為醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。此類調配物可為無菌的。
「醫藥學上可接受之載劑」係指此項技術中習知之無毒固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、囊封材料、調配助劑或載劑，其與治療劑一起使用，一起構成向個體投與之「醫藥組合物」。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒且與調配物之其他成分相容。醫藥學上可接受之載劑適於所用之調配物。
與一或多種其他治療劑「組合」投與包括同時(並行)投藥及按任何次序依次投藥。
術語「並行」在本文中用以指投與兩種或更多種治療劑，其中至少部分一投與在時間上重疊，或其中一種治療劑之投與落在相對於投與另一種治療劑之相對短之時間段內，或其中兩種藥劑之治療作用重疊至少一段時間。
術語「依次」在本文中用以指時間上不重疊地投與兩種或更多種治療劑，或其中該等藥劑之治療作用不重疊。
如本文所用，「結合」係指除一種治療模式以外，亦投與另一種治療模式。因此，「結合」係指在向個體投與一種治療模式之前、期間或之後投與另一種治療模式。
術語「藥品說明書」用以指通常包括於治療性產品之商業包裝中的說明，其含有關於與使用此類治療性產品有關之適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或警告的資訊。
「製品」為包含至少一種試劑的任何製造品(例如包裝或容器)或套組，該至少一種試劑例如為用於治療疾病或病症(例如癌症)之藥物，或用於特異性偵測本文所述之生物標記物的探針。在一些實施例中，製造品或套組係以單元形式推銷、分銷或出售以用於執行本文所述方法。
術語「標記」及「可偵測標記」意謂例如附著至抗體或抗原以使得特異性結合對之成員之間的反應(例如，結合)可偵測之部分。特異性結合對之標記成員稱為「可偵測地標記」。因此，術語「經標記之結合蛋白」係指併入有標記以便鑑別結合蛋白之蛋白質。在一些實施例中，標記係可產生可藉由目視或儀器手段偵測之信號的可偵測標記物，例如併入經放射性標記之胺基酸或附接至具有可藉由標記抗生物素蛋白(例如含有可藉由光學或比色方法偵測之螢光標記物或酶活性的抗生蛋白鏈菌素)偵測之生物素基部分的多肽。用於多肽之標記的實例包括(但不限於)以下各者：放射性同位素或放射性核素(例如3 H、14 C、35 S、90 Y、99 Tc、111 In、125 I、131 I、177 Lu、166 Ho或153 Sm)；色素原、螢光標記(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系磷光體(lanthanide phosphor))、酶標記(例如辣根過氧化酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；化學發光標記物；生物素基；由二級報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、二級抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)；及磁化劑，諸如釓螯合物。常用於免疫分析之標記之代表性實例包括產生光之部分，例如吖錠化合物，及產生螢光之部分，例如螢光素。就此而言，部分自身可能未可偵測地標記，但可在與又一部分反應之後變得可偵測。II . 結合 DLL3 的 VHH 域
本文提供DLL3結合多肽，其為含有至少一個特異性結合至DLL3之VHH域的含VHH多肽。在一些實施例中，VHH域結合人類DLL3。在所提供之任何一些實施例中，VHH域結合具有SEQ ID NO: 86中所示之序列的DLL3或其成熟形式，其缺乏信號序列。在所提供之任何一些實施例中，VHH域結合具有SEQ ID NO: 87中所示之序列的DLL3或其成熟形式，其缺乏信號序列。
在一些實施例中，含VHH多肽併有本文所提供之VHH域的多個複本。在此類實施例中，含VHH多肽可以併有相同VHH域的多個複本。在一些實施例中，含VHH多肽可併有VHH域的多個複本，該等複本雖不同，但識別DLL3上之相同抗原決定基。含VHH多肽可形成多種形式，包括如下文章節III中所述的任何形式。
VHH域為抗體片段，其為能夠選擇性地結合至特定抗原之單一單體抗體可變域。在分子量僅為12-15 kDa的情況下，VHH域(亦稱為單域抗體)比由兩條蛋白重鏈及兩條輕鏈構成之常見抗體(150-160 kDa)小得多，且甚至小於Fab片段(約50 kDa，一條輕鏈及半條重鏈)及單鏈可變片段(約25 kDa，兩個可變域：一個來自輕鏈及一個來自重鏈)。
單域抗體為互補決定區為單域多肽之一部分的抗體。實例包括(但不限於)重鏈抗體、天然缺乏輕鏈之抗體、來源於習知4鏈抗體之單域抗體、經工程改造之抗體及除來源於抗體之骨架以外的單域骨架。單域抗體可來源於任何物種，包括但不限於小鼠、人類、駱駝、駱馬、羊駝、小羊駝、栗色駱馬、鯊魚、山羊、兔及/或牛。在一些實施例中，如本文所用之單域抗體為天然存在之單域抗體，稱為缺乏輕鏈之重鏈抗體。為求清楚，此來源於天然缺乏輕鏈之重鏈分子的可變域在本文中稱為VHH，以與四鏈免疫球蛋白之習知VH區分。此類VHH分子可來源於駱駝科物種，例如駱駝、駱馬、單峰駝、羊駝、小羊駝及栗色駱馬中產生之抗體。除駱駝科之外的其他物種可產生天然缺乏輕鏈之重鏈抗體；此類VHH屬於本發明之範疇內。
用於篩選對DLL3具有所需特異性之VHH域，包括VHH結合多肽的方法包括(但不限於)酶聯免疫吸附分析(ELISA)、酶分析、流動式細胞測量術及此項技術中已知之其他免疫介導技術。
本文提供之所提供VHH域尤其為DLL3 VHH (源自駱馬)及人類化序列，諸如下文描述之任一者。
在一些實施例中，結合DLL3之VHH域可人類化。人類化抗體(諸如含VHH多肽)適用作治療性分子，此係因為人類化抗體減少或消除對非人類抗體之人類免疫反應，人類免疫反應可引起對抗體治療劑之免疫反應且減小治療劑之效力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中CDR (或其一部分)來源於非人類抗體，且FR (或其一部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如CDR殘基源自之抗體)之相應殘基取代，從而例如恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson, (2008)Front. Biosci. 13: 1619-1633，且進一步描述於例如Riechmann等人, (1988)Nature 332:323-329；Queen等人, (1989)Proc. Natl Acad. Sci USA 86: 10029-10033；美國專利第5, 821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409；Kashmiri等人, (2005)Methods 36:25-34；Padlan, (1991)Mol. Immunol. 28:489-498 (描述「表面重塑」)；Dall'Acqua等人, (2005)Methods 36:43-60 (描述「FR改組」)；以及Osbourn等人, (2005)Methods 36:61-68及Klimka等人, (2000)Br. J. Cancer , 83:252-260 (描述FR改組之「引導選擇」方法)。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)∶使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人(1993)J. Immunol. 151 :2296)；來源於具有重鏈可變區特定亞群之人類抗體之共同序列的構架區(參見例如Carter等人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 89:4285；及Presta等人(1993)J. Immunol , 151:2623)；人類成熟(體細胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson, (2008)Front. Biosci. 13:1619-1633)；及來源於篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人, (1997)J. Biol. Chem . 272: 10678-10684及Rosok等人, (1996)J. Biol. Chem. 271 :22611-22618)。通常由人類FR區置換VHH之FR區來製備人類化VHH。在一些實施例中，置換人類FR之某些FR殘基來改良人類化VHH之一或多種特性。具有此類置換殘基之VHH域在本文中仍稱為「人類化」。
本文提供一種結合DLL3的VHH域，其中VHH域包含選自SEQ ID NO: 102、244-318、401-409、416、455及476-480-488、507-518中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 102、244-318、401-409、416、455及476-480-488、507-518中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供的DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 319-335或456中之任一者中所示之CDR1、SEQ ID NO: 336-353、384、410及411中之任一者中所示之CDR2，及SEQ ID NO: 354-367、395及412-415中之任一者中所示之CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 102、244-318、401-409、416、455及476-480-488、507-518中之任一者中所示之胺基酸序列，或與選自SEQ ID NO: 102、244-318、401-409、416、455及476-480-488、507-518中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 102、244-318、401-409、416、455及476-480-488、507-518中之任一者中所示之胺基酸序列。
本文提供一種結合DLL3的VHH域，其中VHH域包含選自SEQ ID NO: 244-318及455中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 244-318及455中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供的DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 319-335中之任一者中所示之CDR1、SEQ ID NO: 336-353中之任一者中所示之CDR2，及SEQ ID NO: 354-367中之任一者中所示之CDR3。所提供之DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 1-114中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 244-318中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 244-318及455中之任一者中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 244或與SEQ ID NO: 244中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 244中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 244中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域為SEQ ID NO: 244中所示之胺基酸序列之人類化變異體。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326中之任一者中所示之CDR1；SEQ ID NO: 336、337、338中之任一者中所示之CDR2；及SEQ ID NO: 354中所示之CDR3。
在一些實施例中，本文中提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 319、336及354中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 319、337及354中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 319、338及354中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、338及354中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 321、338及354中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 322、338及354中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 323、338及354中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 324、338及354中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 325、338及354中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 326、338及354中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。
在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 245-257中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 245-257中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。
在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 245-257中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 258或與SEQ ID NO: 258中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 258中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 258中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域為SEQ ID NO: 258中所示之胺基酸序列之人類化變異體。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 327中所示之CDR1、SEQ ID NO: 339中所示之CDR2及SEQ ID NO: 355中所示之CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 327、339及335中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。
在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 259-263中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 259-263中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。
在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 259-263中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 264或與SEQ ID NO: 264中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 264中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 264中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域為SEQ ID NO: 264中所示之胺基酸序列之人類化變異體。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 328、329或456中所示之CDR1、SEQ ID NO: 340中所示之CDR2及SEQ ID NO: 356中所示之CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 328、340及356中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 329、340及356中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 456、340及356中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。
在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。
在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 275或與SEQ ID NO: 275中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 275中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 105中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域為SEQ ID NO: 275中所示之胺基酸序列之人類化變異體。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320中所示之CDR1、SEQ ID NO: 341中所示之CDR2及SEQ ID NO: 357中所示之CDR3。
在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 276-279或479中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 276-279或479中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。
在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 276-279或479中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 276-279或479中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 276-279或479中之任一者中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 280或與SEQ ID NO: 280中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 280中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 280中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域為SEQ ID NO: 280中所示之胺基酸序列之人類化變異體。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 330中所示之CDR1、SEQ ID NO: 342中所示之CDR2及SEQ ID NO: 358中所示之CDR3。
在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 281-286中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 281-286中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。
在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 281-286中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 287或與SEQ ID NO: 287中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 287中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 287中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域為SEQ ID NO: 287中所示之胺基酸序列之人類化變異體。
在一些實施例中，本文所提供的DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320中所示之CDR1；SEQ ID NO: 345、346、347中之任一者中所示之CDR2；及SEQ ID NO: 359、360、361中之任一者中所示之CDR3。
在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、345及359中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、346及359中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、347及359中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、345及360中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、345及361中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、347及360中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。
在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。
在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 299或與SEQ ID NO: 299中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 299中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 299中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域為SEQ ID NO: 299中所示之胺基酸序列之人類化變異體。
在一些實施例中，本文所提供的DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 331中所示之CDR1；SEQ ID NO: 348、349、350中之任一者中所示之CDR2；及SEQ ID NO: 356中所示之CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 331、348及356中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 331、349及356中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 331、350及356中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。
在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 300-305或480中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 300-305或480中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。
在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 300-305或480中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 300-305或480中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 300-305或480中之任一者中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 306或與SEQ ID NO: 306中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 306中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 306中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域為SEQ ID NO: 306中所示之胺基酸序列之人類化變異體。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 507或與SEQ ID NO: 507中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 507中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 507中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域為SEQ ID NO: 507中所示之胺基酸序列之人類化變異體。
在一些實施例中，本文所提供的DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 332中所示之CDR1；SEQ ID NO: 348、349、350中之任一者中所示之CDR2；及SEQ ID NO: 362中所示之CDR3。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 332、348及362中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 332、349及362中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 332、350及362中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。
在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 307-313中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 307-313中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。
在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 307-313中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 307-313中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 307-313中之任一者中所示之胺基酸序列。
在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 508-514中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 508-514中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。
在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 508-514中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 401或與SEQ ID NO: 401中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3。在一些實施例中，DLL3 VHH域具有SEQ ID NO: 401中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 401中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域為SEQ ID NO: 401中所示之胺基酸序列之人類化變異體。
在一些實施例中，本文所提供的DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320中所示之CDR1；SEQ ID NO: 384、410、411中之任一者中所示之CDR2；及SEQ ID NO: 395、412、413、414、415中之任一者中所示之CDR3。
在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、384及395中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、410及395中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、411及395中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、384及412中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、384及413中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、384及414中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，本文提供之DLL3 VHH域含有SEQ ID NO: 320、384及415中之任一者中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。
在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 402-409中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 402-409中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。在一些態樣中，結合DLL3的VHH域包含選自SEQ ID NO: 481-488中之任一者之VHH胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 481-488中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所含的CDR1、CDR2及CDR3。
在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 402-409中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 402-409中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 402-409中之任一者中所示之胺基酸序列。在一些情況下，所提供之DLL3 VHH域為人類化變異體，其具有SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 481-488中之任一者之VH H區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3人類化VHH域具有SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列。III. 含有 DLL3 結合多肽之融合蛋白及結合物
本文提供含有DLL3結合多肽之融合蛋白及結合物，該等DLL3結合多肽含有至少一個特異性結合DLL3之VHH域直接或間接地連接至一或多個其他結構域或部分。在一些實施例中，本發明之融合蛋白或結合物由單一多肽構成。在其他實施例中，本發明之融合蛋白或結合物由超過一種多肽構成。在一些實施例中，本發明之DLL3結合多肽併有至少一個特異性結合DLL3之VHH域。在一些態樣中，DLL3結合多肽為多價的。在一些實施例中，DLL3結合多肽包括特異性結合DLL3之VHH域的兩個或更多個複本，例如特異性結合DLL3之VHH域的三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、或六個或更多個複本。在某些態樣中，DLL3結合多肽為多特異性的。例如在一些情況下，一或多個其他域可為結合至一或多種其他抗原或蛋白質之一或多個其他結合域。
在一些實施例中，本發明之DLL3結合多肽包括兩個或更多個經由胺基酸連接子可操作地連接之多肽序列。在一些實施例中，此等連接子主要由胺基酸甘胺酸及絲胺酸組成，在本文中表示為GS連接子。本發明之融合蛋白之GS-連接子可具有各種長度，例如長度為5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個胺基酸。在一些實施例中，GS-連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；及GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，連接子為包含甘胺酸殘基之柔性連接子，諸如(藉助於非限制性實例) GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 5)、GGGGG (SEQ ID NO: 6)及GGGGGG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，DDL3結合多肽包括GS連接子與甘胺酸連接子之組合。在一些實施例中，連接子為(GGGGS)n，其中n為1至5 (SEQ ID NO: 123)；(GGGGGS)n，其中n為1至4 (SEQ ID NO: 124)；GGGGS (SEQ ID NO: 125)；GGGGGS (SEQ ID NO: 126)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 127)；GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 128)；GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 129)；或PGGGG (SEQ ID NO: 450)。在一些實施例中，連接子為GS連接子。在一些實施例中，DLL3結合多肽包括GS連接子與甘胺酸連接子之組合。A.  Fc 融合物
本文提供一種DLL3結合多肽，其為含有至少一個本文提供之結合DLL3之VHH域及Fc域的融合蛋白。在一些實施例中，本文提供之DLL3結合多肽包含一個、兩個、三個或四個結合DLL3之VHH域及Fc域。
在一些實施例中，在一些態樣中，融合蛋白中免疫球蛋白Fc區之併入可由兩種多肽構成，該兩種多肽一起形成二聚體。在一些實施例中，Fc域介導DLL3結合多肽在生理條件(諸如當自細胞表現時)下之二聚以便形成使DLL3結合位點之數量加倍之二聚體。舉例而言，包含三個結合DLL3之VHH域及Fc區之DLL3結合多肽係三價之單體形式，但Fc區可介導二聚，使得DLL3結合多肽在該等條件下以六價二聚體形式存在。在一些實施例中，DLL3 VHH域與IgG Fc區融合且在此等實施例中，融合蛋白為每分子具有兩個DLL3 VHH域之二價分子。在一些實施例中，兩個DLL3結合域(2×)與IgG Fc區融合且在此等實施例中，融合蛋白為每分子具有四個DLL3 VHH域之四價分子。在一些實施例中，三個DLL3結合域(3×)與IgG Fc區融合且在此等實施例中，融合蛋白為每分子具有六個DLL3 VHH域之六價分子。
在一些實施例中，多價DLL3結合多肽為二價的。在一些實施例中，本發明之二價DLL3結合多肽包括具有以下結構之DLL3結合多肽之兩個複本∶(DLL3 VHH)-連接子-Fc。在一些實施例中，多價DLL3結合多肽為四價的。在一些實施例中，本發明之四價DLL3結合多肽包括具有以下結構之DLL3多肽之兩個複本∶(DLL3 VHH)-連接子-(DLL3 VHH)-連接子-Fc。在一些實施例中，多價DLL3結合多肽為六價的。在一些實施例中，本發明之六價DLL3結合多肽包括具有以下結構之DLL3多肽之兩個複本∶(DLL3 VHH)-連接子-(DLL3 VHH)-連接子-(DLL3 VHH)-連接子-Fc。
在一些情況下，Fc區之CH3域可用作均二聚域，以使得所得到之融合蛋白係由兩個一致多肽形成。在其他情況下，Fc區之CH3二聚體介接區可突變以便能夠實現雜二聚化。舉例而言，雜二聚域可併入至融合蛋白中，以使得構築體為不對稱之融合蛋白。
在任一所提供實施例中，DLL3 VHH域可為如上所述之任一種VHH域。在一些實施例中，DLL3 VHH域為結合DLL3之人類化VHH域。
在各種實施例中，DLL3結合多肽中包括之Fc域係人類Fc域或來源於人類Fc域。在一些實施例中，融合蛋白含有免疫球蛋白Fc區。在一些實施例中，免疫球蛋白Fc區為選自由IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型及IgG4子類組成之群的IgG同型。
在一些實施例中，免疫球蛋白Fc區或其免疫活性片段為IgG同型。舉例而言，融合蛋白之免疫球蛋白Fc區為人類IgG1同型，其具有以下胺基酸序列∶
Figure 02_image001
在一些實施例中，免疫球蛋白Fc區或其免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 8之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG1多肽序列。
在一些實施例中，在本發明之融合蛋白包括Fc多肽之情況下，Fc多肽發生突變或修飾。在一些情況下，突變包括一或多個使Fc多肽之效應功能減少的胺基酸取代。已知改變、諸如減少效應功能之Fc多肽突變的各種實例，包括如下所述之任一種。在一些實施例中，除非提及特定SEQ ID NO時描述，否則對Fc區中之胺基酸取代之提及係藉由Kabat之EU編號(亦稱為Kabat編號)。EU編號係已知的且根據最新之IMGT Scientific Chart (IMGT®，the international ImMunoGeneTics information system®，http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html (建立：2001年5月17日，最新更新：2013年1月10日)及如Kabat, E.A.等人Sequences of Proteins of Immunological interest.第5版US Department of Health and Human Services, NIH公開案第91-3242號(1991)中報導之EU索引。
在一些實施例中，展現減少之效應功能的Fc區可為需要結合DLL3或CD3但某些效應功能(諸如CDC及ADCC)係不必要或有害之應用的理想候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以證實CDC及/或ADCC活性之降低/消除。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保多特異性多肽構築體及/或其裂解組分缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於以下中：美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom, I.等人Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986))及Hellstrom, I等人,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；美國專利第5,821,337號(參見Bruggemann, M.等人,J. Exp. Med . 166:1351-1361 (1987))。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如用於流動式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性分析(CellTechnology, Inc. Mountain View, Calif.)；及CytoTox 96™非放射性細胞毒性分析(Promega, Madison, Wis.))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及自然殺手(NK)細胞。或者或另外，可例如在動物模型中活體內評估所關注之分子之ADCC活性，諸如Clynes等人Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)中所揭示。亦可進行C1q結合分析以證實多特異性多肽構築體或其裂解組分無法結合C1q，因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人,J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M. S.等人,Blood 101:1045-1052 (2003)；及Cragg, M. S.及M. J. Glennie,Blood 103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法測定FcRn結合及活體內清除率/半衰期(參見例如Petkova, S. B.等人,Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006))。
在一些實施例中，人類IgG Fc區經修飾以改變抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如以下中所述之胺基酸修飾：Natsume等人, 2008 Cancer Res, 68(10): 3863-72；Idusogie等人, 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5；Moore等人, 2010 mAbs, 2(2): 181-189；Lazar等人, 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010；Shields等人, 2001 JBC, 276(9): 6591-6604；Stavenhagen等人, 2007 Cancer Res, 67(18): 8882-8890；Stavenhagen等人, 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164；Alegre等人, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468；Kaneko及Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11中評述。
增強ADCC之突變之實例包括在Ser239及Ile332處之修飾，例如Ser239Asp及Ile332Glu (S239D、I332E)。增強CDC之突變之實例包括在Lys326及Glu333處之修飾。在一些實施例中，Fc區在此等位置中之一或兩處經修飾，例如使用Kabat編號系統之Lys326Ala及/或Glu333Ala (K326A及E333A)。
在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在以下位置中之一或多處改變以減少Fc受體結合∶Leu 234 (L234)、Leu235 (L235)、Asp265 (D265)、Asp270 (D270)、Ser298 (S298)、Asn297 (N297)、Asn325 (N325)、Ala327 (A327)或Pro329 (P329)。例如，Leu 234Ala (L234A)、Leu235Ala (L235A)、Leu235Glu (L235E)、Asp265Asn (D265N)、Asp265Ala (D265A)、Asp270Asn (D270N)、Ser298Asn (S298N)、Asn297Ala (N297A)、Pro329Ala (P329A)或Pro239Gly (P329G)、Asn325Glu (N325E)或Ala327Ser (A327S)。在較佳實施例中，Fc區內之修飾減少與Fc受體-γ受體之結合，同時對與新生兒Fc受體(FcRn)之結合影響最小。
在一些實施例中，人類IgG1 Fc區在胺基酸Asn297 (Kabat編號)處經修飾以防止融合蛋白糖基化，例如Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸Leu235 (Kabat編號)處經修飾以改變Fc受體相互作用，例如Leu235Glu (L235E)或Leu235Ala (L235A)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸Leu234 (Kabat編號)處經修飾以改變Fc受體相互作用，例如Leu234Ala (L234A)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸Leu234 (Kabat編號)處經修飾以改變Fc受體相互作用，例如Leu235Glu (L235E)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸234與235處發生改變，例如Leu234Ala及Leu235Ala (L234A/L235A)或Leu234Val及Leu235Ala (L234V/L235A)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸234、235及297處發生改變，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Asn297Ala (L234A/L235A/N297A)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸234、235及329處發生改變，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Pro239Ala (L234A/L235A/P329A)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸Asp265 (Kabat編號)處經修飾以改變Fc受體相互作用，例如Asp265Ala (D265A)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸Pro329 (Kabat編號)處經修飾以改變Fc受體相互作用，例如Pro329Ala (P329A)或Pro329Gly (P329G)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸265與329處發生改變，例如Asp265Ala及Pro329Ala (D265A/P329A)或Asp265Ala及Pro329Gly (D265A/P329G)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸234、235及265處發生改變，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Asp265Ala (L234A/L235A/D265A)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸234、235及329處發生改變，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Pro329Gly (L234A/L235A/P329G)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在胺基酸234、235、265及329處發生改變，例如Leu234Ala、Leu235Ala、Asp265Ala、Pro329Gly(L234A/L235A/D265A/P329G)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區在Gly235處發生改變以減少Fc受體結合。舉例而言，其中Gly235自融合蛋白缺失。在一些實施例中，人類IgG1 Fc區在胺基酸Gly236處經修飾以增強與CD32A之相互作用，例如Gly236Ala (G236A)。在一些實施例中，人類IgG1 Fc區缺乏Lys447 (Kabat等人1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，融合蛋白之Fc區缺乏以下位置中之一或多處的胺基酸以減少Fc受體結合：Glu233 (E233)、Leu234 (L234)或Leu235 (L235)。在一些實施例中，融合蛋白之Fc區缺乏以下位置中之一或多處的胺基酸：Glu233 (E233)、Leu234 (L234)或Leu235 (L235)，且在Asp265 (D265)、Asn297 (N297)或Pro329 (P329)中之一或多處經修飾以減少Fc受體結合。舉例而言，DLL3結合多肽中包括之Fc區來源於人類Fc域，且在對應於IgG1之較低鉸鏈中包含三個胺基酸缺失E233、L234及L235。在一些態樣中，此類Fc多肽不嚙合FcγRs且因此稱為「效應沉默」或「無效應」。舉例而言，Fc缺失此三個胺基酸將減少補體蛋白C1q結合。在一些實施例中，具有Fc缺失此三個胺基酸之Fc區的多肽保留與FcRn之結合，因此具有延長之半衰期及穿胞運輸，此與FcRn介導之再循環相關聯。此類經修飾Fc區稱為「Fc xELL」或「Fc缺失」且具有以下胺基酸序列∶
Figure 02_image003
在一些實施例中，免疫球蛋白Fc區或其免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 9之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG1多肽序列。
在一些實施例中，人類IgG Fc區經修飾以增強FcRn結合。增強與FcRn之結合之Fc突變的實例為Met252Tyr、Ser254Thr、Thr256Glu (分別為M252Y、S254T、T256E) (Kabat編號，Dall' Acqua等人2006, J. Biol Chem Vol. 281(33) 23514-23524)、Met428Leu及Asn434Ser (M428L、N434S) (Zalevsky等人2010 Nature Biotech,第28卷(2) 157-159)或Met252Ile、Thr256Asp、Met428Leu (分別為M252I、T256D、M428L) (Kabat等人1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，DLL3結合多肽中包括之Fc域來源於人類Fc域且包含突變M252Y及M428V，本文中稱為「Fc-YV」。在一些實施例中，經突變或修飾之Fc多肽包括以下突變∶使用Kabat編號系統，M252Y及M428L。在一些實施例中，該等突變在核內體之酸性pH下(接近6.5)增強與FcRn之結合，而在中性pH(約7.2)下失去可偵測之結合，從而增強FcRn介導之再循環且半衰期延長。
在本文所提供之多特異性多肽構築體的特定實施例中，DLL3結合多肽中包括之Fc域來源於人類Fc域且包含誘發雜二聚化之突變。在一些實施例中，此類突變包括稱為「杵」及「臼」突變之突變。舉例而言，在CH3域內Thr366處進行胺基酸修飾，其在經更大胺基酸，例如Try (T366W)置換時能夠優先與在位置Thr366、Leu368及Tyr407處胺基酸經修飾為較小胺基酸，例如分別為Ser、Ala及Val (T366S/L368A/Y407V)之第二CH3域配對。在一些實施例中，「杵」Fc域包含突變T366W。在一些實施例中，「臼」Fc域包含突變T366S、L368A及Y407V。可藉由引入二硫鍵，例如藉由將相對CH3域上之Ser354變為Cys (S354C)及Y349變為Cys (Y349C)進一步穩定經由CH3修飾之雜二聚(綜述於Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15中)。在一些實施例中，用於雜二聚化之Fc域包含其他突變，諸如雜二聚體Fc對之第一成員上之突變S354C，其與雜二聚體Fc對之第二成員上之相應突變Y349C形成不對稱雙硫鍵。在一些實施例中，雜二聚體Fc對之一個成員包含修飾H435R或H435K以避免蛋白A結合，同時保持FcRn結合。在一些實施例中，雜二聚體Fc對之一個成員包含修飾H435R或H435K，而雜二聚體Fc對之第二成員在H435處不經修飾。在各種實施例中，臼Fc域包含修飾H435R或H435K (在一些情況下當修飾為H435R時稱為「臼-R」)，而杵Fc域不包含。在一些情況下，相對於可能存在之均二聚臼Fc域，臼-R突變改良雜二聚體之純化。
在一些實施例中，人類IgG Fc區經修飾以防止二聚。在此等實施例中，本發明之融合蛋白為單體。例如殘基Thr366修飾為帶電殘基，例如Thr366Lys、Thr366Arg、Thr366Asp或Thr366Glu (分別為T366K、T366R、T366D或T366E)防止CH3-CH3二聚。
在一些實施例中，融合蛋白之免疫球蛋白Fc區或免疫活性片段為人類IgG2同型，其具有以下胺基酸序列∶
Figure 02_image005
在一些實施例中，融合物或其免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 10之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG2多肽序列。
在一些實施例中，人類IgG2 Fc區在胺基酸Asn297處經修飾，例如防止抗體糖基化，例如Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些實施例中，人類IgG2 Fc區缺乏Lys447 (Kabat等人1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，融合蛋白之免疫球蛋白Fc區或免疫活性片段為人類IgG3同型，其具有以下胺基酸序列∶
Figure 02_image007
在一些實施例中，抗體或其免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 11之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG3多肽序列。
在一些實施例中，人類IgG3 Fc區在胺基酸Asn297 (Kabat編號)處經修飾，以防止抗體糖基化，例如Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些實施例中，人類IgG3 Fc區在胺基酸435處經修飾以延長半衰期，例如Arg435His (R435H)。在一些實施例中，人類IgG3 Fc區缺乏Lys447 (Kabat等人1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，融合蛋白之免疫球蛋白Fc區或免疫活性片段為人類IgG4同型，其具有以下胺基酸序列∶
Figure 02_image009
Figure 02_image011
在一些實施例中，抗體或其免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 12之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG4多肽序列。
在一些實施例中，融合蛋白之免疫球蛋白Fc區或免疫活性片段為人類IgG4同型，其具有以下胺基酸序列∶
Figure 02_image013
在一些實施例中，抗體或其免疫活性片段包含與SEQ ID NO: 13之胺基酸序列至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之人類IgG4多肽序列。
在一些實施例中，人類IgG4 Fc區在胺基酸235處經修飾以改變Fc受體相互作用，例如Leu235Glu (L235E)。在一些實施例中，人類IgG4 Fc區在胺基酸Asn297 (Kabat編號)處經修飾，以防止抗體糖基化，例如Asn297Ala (N297A)或Asn297Asp (N297D)。在一些實施例中，人類IgG4 Fc區缺乏Lys447 (Kabat等人1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest之EU索引)。
在一些實施例中，融合蛋白含有來源於免疫球蛋白鉸鏈區之多肽。鉸鏈區可選自任一人類IgG子類。舉例而言，融合蛋白可含有具有序列EPKSSDKTHTCPPC (SEQ ID NO: 14)之經修飾IgG1鉸鏈，其中在與輕鏈之C端半胱胺酸形成二硫鍵的Cys220中，突變成絲胺酸，例如Cys220Ser (C220S)。在其他實施例中，融合蛋白含有具有序列DKTHTCPPC (SEQ ID NO: 15)之截短鉸鏈。
在一些實施例中，融合蛋白具有來自IgG4之經修飾鉸鏈，其經修飾以防止或減少鏈交換，例如Ser228Pro (S228P)，具有序列ESKYGPPCPPC (SEQ ID NO: 16)。在一些實施例中，融合蛋白含有連接多肽。在其他實施例中，融合蛋白含有連接子及鉸鏈多肽。
在一些實施例中，Fc區在N297處缺乏或具有減少之附接至N連接聚糖鏈之岩藻糖。存在大量防止岩藻糖基化之方式，包括(但不限於)在缺乏FUT8之細胞株中產生；添加抑制劑至哺乳動物細胞培養基，例如栗樹精胺；以及生產細胞株之代謝工程改造。
在一些實施例中，Fc區經工程改造以消除在人類中發現之預先存在之抗體的識別。在一些實施例中，本發明之含VHH多肽藉由位置Leu11之突變，例如Leu11Glu (L11E)或Leu11Lys (L11K)進行修飾。在其他實施例中，本發明之單域抗體藉由羧基端區域中之改變進行修飾，例如末端序列具有序列GQGTLVTVKPGG (SEQ ID NO: 17)或GQGTLVTVEPGG (SEQ ID NO: 18)或其修飾。在一些實施例中，本發明之含VHH多肽藉由位置11之突變及藉由羧基端區域中之改變進行修飾。
在一些實施例中，本發明之融合蛋白之一或多種多肽經由胺基酸連接子可操作地連接。在一些實施例中，此等連接子主要由胺基酸甘胺酸及絲胺酸組成，在本文中表示為GS連接子。本發明之融合蛋白之GS連接子可具有各種長度，例如長度為5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個胺基酸。
在一些實施例中，GS-連接子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；及GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，連接子為柔性連接子，其為包含甘胺酸殘基之甘胺酸連接子，諸如(藉助於非限制性實例) GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 5)、GGGGG (SEQ ID NO: 6)及GGGGGG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，連接子為(GGGGS)n，其中n為1至5 (SEQ ID NO: 123)；(GGGGGS)n，其中n為1至4 (SEQ ID NO: 124)；GGGGS (SEQ ID NO: 125)；GGGGGS (SEQ ID NO: 126)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 127)；GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 128)；GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 129)；或PGGGG (SEQ ID NO: 450)。在一些實施例中，融合蛋白可包括GS連接子與甘胺酸連接子之組合。 B.結合物
本文提供含有至少一個本文提供之特異性結合DLL3之VHH域及一或多個其他部分的結合物。其他部分可為治療劑，諸如細胞毒性劑，或可為偵測劑。在一些實施例中，部分可為靶向部分、小分子藥物(小於500道爾頓莫耳質量之非多肽藥物)、毒素、細胞生長抑制劑、細胞毒性劑、免疫抑制劑、適合於診斷目的之放射性試劑、用於治療目的之放射性金屬離子、前藥活化酶、增加生物半衰期之試劑或診斷劑或可偵測試劑。
在一些實施例中，結合物為含有一或多個本文提供之DLL3 VHH域結合至治療劑的抗體藥物結合物(ADC，亦稱為免疫結合物)，其具有細胞毒性，抑制細胞生長，或者提供一些治療益處。在一些實施例中，細胞毒性劑為化學治療劑、藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即，放射性結合物)。在一些實施例中，本發明提供之抗體藥物結合物允許藥物部分靶向遞送至腫瘤。在一些情況下，此可引起腫瘤細胞之靶向殺死。
在一些實施例中，提供一種結合DLL3之結合物，其包含至少一個本文提供之DLL3 VHH域與治療劑結合。在一些實施例中，治療劑包括例如道諾黴素(daunomycin)、小紅莓(doxorubicin)、甲胺喋呤(methotrexate)及長春地辛(vindesine)(Rowland等人, Cancer Immunol. Immunother. 21:183-187, 1986)。在一些實施例中，治療劑具有細胞內活性。在一些實施例中，結合DLL3之結合物經內化且治療劑為阻斷細胞之蛋白質合成，引起細胞死亡之細胞毒素。在一些實施例中，治療劑為包含具有核糖體不活化活性之多肽的細胞毒素，包括例如白樹素、波甘寧(bouganin)、沙泊寧(saporin)、蓖麻毒素、蓖麻毒素A鏈、欖香膠素(bryodin)、白喉毒素、侷限麴菌素(restrictocin)、綠膿桿菌外毒素A及其變異體。在一些實施例中，在治療劑為包含具有核糖體不活化活性之多肽之細胞毒素的情況下，結合DLL3之結合物必須在結合至目標細胞後內化以使該蛋白質對細胞具細胞毒性。
在一些實施例中，提供一種結合DLL3之結合物，其包含至少一個本文提供之DLL3 VHH域與毒素結合。在一些實施例中，毒素包括例如細菌毒素(諸如白喉毒素)、植物毒素(諸如蓖麻毒素)、小分子毒素(諸如格爾德黴素(geldanamycin))(Mandler等人, J. Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581 (2000)；Mandler等人, Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025- 1028 (2000)；Mandler等人, Bioconjugate Chem. 13:786-791 (2002))、類美登素(maytansinoid)(EP 1391213；Liu等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996))及卡奇黴素(calicheamicin)(Lode等人, Cancer Res. 58:2928 (1998)；Hinman等人, Cancer Res. 53:3336-3342 (1993))。毒素可藉由包括微管蛋白結合、DNA結合或拓樸異構酶抑制之機制發揮其細胞毒性及細胞生長抑制作用。
在一些實施例中，提供一種結合DLL3之結合物，其包含至少一個本文提供之DLL3 VHH域與標記結合，該標記可間接或直接產生可偵測信號。此等IgSF結合物可用於研究或診斷應用，諸如用於活體內偵測癌症。標記較佳能夠直接或間接產生可偵測信號。舉例而言，標記可為射線不透的或放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、123I、125I、131I；螢光(螢光團)或化學發光(發色團)化合物，諸如螢光異硫氰酸鹽、若丹明或螢光素；酶，諸如鹼性磷酸酶、β-半乳糖或辣根過氧化酶；顯影劑；或金屬離子。在一些實施例中，標記為用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如99Tc或123I，或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，MRI)之自旋標記，諸如鋯-89、碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。鋯-89可與多種金屬螯合劑錯合且結合至抗體，例如用於PET成像(WO 2011/056983)。
結合DLL3之結合物可使用此項技術中已知之任何方法製備。參見例如WO 2009/067800、WO 2011/133886及美國專利申請公開案第2014322129號，其以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，附接可為共價或非共價的，例如經由生物素-抗生蛋白鏈菌素非共價相互作用。在一些實施例中，1個、2個、3個、4個、5個或更多個可相同或不同之部分與DLL3 VHH域結合、連接或融合，以形成結合DLL3之結合物。在一些實施例中，此類部分使用此項技術中已知及下文描述之多種分子生物學或化學結合及連接方法附接至VHH域。在一些實施例中，連接子，諸如肽連接子、可裂解連接子、不可裂解連接子或幫助結合反應之連接子，可用於將效應部分連接或結合至變異型多肽或免疫調節蛋白。
在一些實施例中，DLL3 VHH域經由連接子(L)結合至一或多個部分，例如每個VHH約1至約20個藥物部分。在一些實施例中，結合DLL3之結合物包含以下組分∶(VHH域)、(L)q 及(部分)m ，其中VHH域為如所描述能夠特異性結合DLL3之所述VHH域中之任一者；L為用於連接蛋白質或多肽至部分之連接子；m為至少1；q為0或更多；且所得結合DLL3之結合物結合至DLL3。在特定實施例中，m為1至4且q為0至8。
連接子可由一或多個連接子組分組成。為共價附接抗體與藥物部分，連接子通常具有兩個反應性官能基，亦即在反應意義上二價。已知適用於附接兩個或更多個功能性或生物活性部分，諸如肽、核酸、藥物、毒素、抗體、半抗原及報導體基團之二價連接子試劑，且已描述得到結合物之方法(Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York,第234-242頁)。
例示性連接子組分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(「MC」)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」)、丙胺酸-苯丙胺酸(「ala-phe」)、對胺基苯甲氧基羰基(「PAB」)、N-丁二醯亞胺基4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(「SPP」)、N-丁二醯亞胺基4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1甲酸酯(「SMCC」)及N-丁二醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(「SIAB」)。
在一些實施例中，連接子可包含胺基酸殘基。例示性胺基酸連接子組分包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性二肽包括：纈胺酸-瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)。例示性三肽包括：甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。包含胺基酸連接子組分之胺基酸殘基包括天然存在之殘基以及次要胺基酸及非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸連接子組分可在其選擇性方面經設計及優化，以藉由特定酶，例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D、胞漿素蛋白酶進行酶促裂解。
VHH域與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白質偶合劑製得，諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二醯亞胺酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如二丁二醯亞胺基受質)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙-(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
抗體藥物結合物可藉由熟習此項技術者已知之多種方法、諸如有機化學反應、條件及試劑製備。在一個實施例中，方法包括∶(1)使VHH域之親核性基團與二價連接子試劑反應，以經由共價鍵形成VHH-L，接著與藥物部分D反應；以及(2)藥物部分之親核性基團與二價連接子試劑反應，以經由共價鍵形成D-L，接著與VHH域之親核性基團反應。
包括VHH域之抗體上之親核性基團包括(但不限於)∶(i) N端胺基；(ii)側鏈胺基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)其中抗體經糖基化之糖羥基或胺基。胺、硫醇及羥基為親核性的且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電性基團反應形成共價鍵，該等親電性基團包括∶(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。可經由離胺酸與2-亞胺基硫雜環戊烷(特氏試劑(Traut's reagent))之反應將其他親核性基團引入至抗體中，使得胺轉化成硫醇。反應性硫醇基可藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多個半胱胺酸殘基而引入至抗體(或其片段)中(例如，製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之突變抗體)。
諸如抗體藥物結合物之結合物亦可藉由對抗體、諸如VHH域進行修飾以引入親電性部分而產生，該等親電性部分可與連接子試劑或藥物上之親核性取代基反應。糖基化抗體之糖可經例如過碘酸鹽氧化試劑氧化，形成醛基或酮基，其可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可例如藉由硼氫化物試劑還原，以形成穩定之胺鍵。在一個實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉反應可在蛋白質中產生羰基(醛及酮)，其可與藥物上之適當基團反應(Hermanson, Bioconjugate Techniques)。在另一實施例中，含有N端絲胺酸或蘇胺酸殘基之蛋白質可與偏過碘酸鈉反應，產生醛代替第一胺基酸。此類醛可與藥物部分或連接子親核試劑反應。
同樣，藥物部分上之親核性基團包括(但不限於)：能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電性基團反應形成共價鍵的胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，該等親電性基團包括∶(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。
或者，可例如藉由重組技術或肽合成製得含有VHH域及細胞毒性劑之融合蛋白。DNA之長度可包含編碼結合物之兩個部分之各別區域，該等區域彼此相鄰或由編碼不破壞結合物之所要性質之連接肽的區域隔開。C. 多特異性形式
本文提供多特異性DLL3結合多肽，其含有至少一個結合DLL3之VHH域及一或多個其他結合域。通常一或多個其他結構域結合至除DLL3外之第二抗原或蛋白質。在一些實施例中，一或多個其他域為對第二抗原或蛋白質具有特異性之抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，其他域為VHH域。
在一些實施例中，多特異性DLL3結合多肽包含至少一個結合DLL3之VHH域及至少一個結合第二抗原或蛋白質之其他結合域。在一些實施例中，此第二抗原為腫瘤相關抗原(TAA)或腫瘤微環境相關抗原(TMEAA)。在一些實施例中，此第二抗原為免疫調節抗原，其中該抗原與增強或抑制免疫細胞中之信號傳導路徑相關。
在一些情況下，多特異性DLL3結合多肽可進一步含有Fc域，諸如上述任一者。在一些實施例中，本文提供之多特異性DLL3結合多肽包含至少一個結合DLL3之VHH域、至少一個結合第二抗原或蛋白質之其他結合域及Fc域。在一些實施例中，Fc域介導多特異性DLL3結合多肽在生理條件下之二聚以便形成使DLL3及其他抗原或蛋白質之結合位點之數量加倍之二聚體。
下文描述非限制性例示性多特異性DLL3結合多肽。 1. 雙特異性 T 細胞接合分子
在一些實施例中，DLL3結合多肽為一種雙特異性構築體，其為或包含至少一個本文提供之DLL3 VHH域及至少一個能夠結合至T細胞上表現之表面分子的其他結合分子。在一些實施例中，表面分子為T細胞活化組分，諸如T細胞受體複合物之組分。在特定態樣中，表面分子為在T細胞上表現且能夠在與抗原結合分子相互作用時誘發T細胞活化之活化T細胞抗原。例如在一些態樣中，抗原結合分子與活化T細胞抗原之相互作用可藉由觸發T細胞受體複合物之信號級聯來誘發T細胞活化。已知適於量測T細胞活化之分析，且包括任何量測或評估增生、分化、細胞介素分泌、細胞毒活性及/或一或多種活化標記物表現之分析。在一些實施例中，此類DLL3結合多肽與其兩個目標，在目標細胞上表現之DLL3及在T細胞上表現之T細胞分子，例如活化T細胞抗原之同時或幾乎同時結合可引起目標細胞與T細胞之間暫時相互作用，藉此引起T細胞活化，例如細胞毒活性，且隨後使目標細胞溶解。
在一些實施例中，諸如活化T細胞抗原之T表面分子為CD3或為CD2。具體而言，所提供之雙特異性DLL3結合多肽能夠特異性結合在人類T細胞上表現之活化T細胞抗原，諸如人類CD3或人類CD3。在特定態樣中，特異性針對活化T細胞抗原(例如CD3或CD2)之其他域為抗體或抗原結合片段。在一些實施例中，DLL3結合多肽可為雙特異性抗體T細胞接合分子，其含有至少一個特異性結合至DLL3之DLL3 VHH域及其他結合分子，該其他結合分子為對T細胞之活化組分(例如T細胞表面分子，例如CD3或CD2)具有特異性之抗體或抗原結合片段。
雙特異性抗體T細胞接合分子尤其為雙特異性T細胞接合分子(BiTE)，其含有藉由柔性連接子融合之串聯scFv分子(參見例如Nagorsen及Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)、經由例如柔性連接子彼此融合之串聯scFv分子且進一步含有由能夠穩定締合之第一及第二次單元構成之Fc域(WO2013026837)；雙功能抗體及其衍生物，包括串聯雙功能抗體(Holliger等人, Prot Eng 9, 299-305 (1996)；Kipriyanov等人, J Mol Biol 293, 41-66 (1999))；雙重親和力再靶向(DART)分子，其可包括具有C端二硫橋鍵之雙功能抗體形式；或特瑞單抗(triomab)，其包括完全雜交小鼠/大鼠IgG分子(Seimetz等人, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010))。可使用本文提供之DLL3 VHH結構域中之任一者產生任一以上分子之類似形式。
在一些實施例中，特異性針對活化T細胞抗原之其他結合域為選自Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv、經二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)、scAb、dAb、單域重鏈抗體(VHH)或單域輕鏈抗體之抗原結合片段。在一些實施例中，其他結合域就結合活化T細胞抗原(諸如CD2或CD3)而言為單價的。
在一些實施例中，其他結合域能夠結合至CD3或CD3複合物。CD3複合物為成熟T淋巴球中彼此及與T細胞受體非共價締合的至少五個膜結合多肽之複合物。CD3複合物包括γ、δ、ε、ζ及η鏈(亦稱為次單元)。在一些實施例中，其他結合分子為能夠特異性結合至CD3或CD3複合物之抗體或抗原結合片段，亦稱為CD3結合域。在一些實施例中，能夠結合CD3或CD3複合物之CD3結合域包括抗CD3 Fab片段、抗CD3 F(ab')2 片段、抗CD3 Fv片段、抗CD3 scFv、抗CD3 dsFv、抗CD3 scAb、抗CD3 dAb、抗CD3單域重鏈抗體(VHH)及抗CD3單域輕鏈抗體之一或多個複本。在一些實施例中，抗CD3結合域就結合CD3而言為單價的。
在一些情況下，CD3結合域識別CD3ε鏈。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括抗CD3ε Fab片段、抗CD3ε F(ab')2 片段、抗CD3ε Fv片段、抗CD3ε scFv、抗CD3ε dsFv、抗CD3ε scAb、抗CD3ε dAb、抗CD3ε單域重鏈抗體(VHH)及抗CD3ε單域輕鏈抗體之一或多個複本。在一些實施例中，抗CD3ε結合域就結合CD3ε而言為單價的。
例示性的針對CD3或CD3複合物之單株抗體包括(但不限於) OKT3、SP34、UCHT1或64.1或其抗原結合片段(參見例如June, 等人, J. Immunol. 136:3945-3952 (1986)；Yang,等人, J. Immunol. 137:1097-1100 (1986)；及Hayward,等人, Immunol. 64:87-92 (1988))。在一些態樣中，例如藉由固定或定位於細胞或繫栓之抗CD3抗體使CD3叢集在T細胞上引起T細胞活化，類似於T細胞受體之嚙合，但與其純系典型特異性無關。在一個實施例中，CD3結合域單價且特異性結合CD3抗原，且來源於OKT3 (ORTHOCLONE-OKT3™(莫羅莫那(muromonab)-CD3)；人類化OKT3 (美國專利第7,635,475號及公開之國際申請案第WO2005040220號)；SP34 (Pessano等人The EMBO Journal. 4: 337-344, 1985)；SP34之人類化變異體(WO2015001085)；Teplizumab™(MGA031，Eli Lilly)；US2011/0275787中所述之抗CD3結合分子；UCHT1 (Pollard等人1987 J Histochem Cytochem. 35(11):1329-38；WO2000041474)；NI0401 (WO2007/033230)；維西珠單抗(visilizumab) (美國專利第5,834,597號)；BC-3 (Anasetti等人, Transplantation 54: 844 (1992)；H2C (描述於PCT公開案第WO2008/119567號中)；V9 (描述於Rodrigues等人, Int J Cancer增刊7, 45-50 (1992)及美國專利第6,054,297號中))。其他抗CD3抗體亦可用於本文提供之構築體中，包括以下中所述之任一種：國際公開PCT申請案第WO199404679號、第WO2008119567號、第WO2015095392號、第WO2016204966號、第WO2019133761號；公開專利申請案第US20170369563號、第US20180194842號、第US20180355038號；美國專利第7,728,114號、第7,381,803號、第7,994,289號。
在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO: 19中所示之可變重鏈(VH)及/或SEQ ID NO: 20中所示之可變輕鏈，或與此等序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%一致性之VH及/或VL序列，且特異性結合CD3。在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO: 19中所示之可變重鏈(VH)之CDRH1、CDRH2及CDRH3及SEQ ID NO: 20中所示之可變輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3。在一些情況下，CD3結合區包含SEQ ID NO: 19中所示之VH序列之人類化型式及SEQ ID NO: 20中所示之VL序列之人類化型式。在一些實施例中，CD3結合區可含有SEQ ID NO 21、22、23中之任一者中所示的人類化OKT3來源VH域序列及/或SEQ ID NO 24、25、26中之任一者中所示的VL域序列，或與此等序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%一致性之VH及/或VL序列，且特異性結合CD3。在一些實施例中，CD3結合域為Fab、scFv、Fv或dsFv，其含有以上VH及VL序列之任何組合，尤其SEQ ID NO: 21、22、23中之任一者中所示之VH序列與SEQ ID NO: 24、25、26中之任一者中所示之VL序列的任何組合。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括至少包括胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)之VH CDR1序列；至少包括胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)之VH CDR2序列；至少包括胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)之VH CDR3序列；至少包括胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)之VL CDR1序列；至少包括胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)之VL CDR2序列；及至少包括胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)之VL CDR3序列。在一些實施例中，CD3結合域為Fab、scFv、Fv或dsFv，其含有至少包括胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)之VH CDR1序列；至少包括胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)之VH CDR2序列；至少包括胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)之VH CDR3序列；至少包括胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)之VL CDR1序列；至少包括胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)之VL CDR2序列；及至少包括胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)之VL CDR3序列。
在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO: 27中所示之可變重鏈(VH)及/或SEQ ID NO: 28中所示之可變輕鏈，或與此等序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%一致性之VH及/或VL序列，且特異性結合至CD3。在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO: 27中所示之可變重鏈(VH)之CDRH1、CDRH2及CDRH3及SEQ ID NO: 28中所示之可變輕鏈之CDRL1、CDRL2及CDRL3。在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO: 29、30及31中分別所示之CDRH1、CDRH2及CDRH3及SEQ ID NO: 32、33及34中分別所示之CDRL1、CDRL2及CDRL3可變輕鏈。在一些情況下，CD3結合區包含SEQ ID NO: 27中所示之VH序列之人類化型式及SEQ ID NO: 28中所示之VL序列之人類化型式。在一些實施例中，CD3結合區可含有SEQ ID NO 35-65、453、454或460中之任一者中所示的人類化VH域序列及/或SEQ ID NO: 66-84、368、451或452中之任一者中所示的VL域序列，或與此等序列具有至少60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%一致性之VH及/或VL序列，且特異性結合至CD3。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。
在一些實施例中，CD3結合域為Fab、scFv、Fv或dsFv，其含有以上VH及VL序列之任何組合，尤其SEQ ID NO: 35-65、453、454或460中之任一者中所示之VH序列與SEQ ID NO: 66-84、368、451或452中之任一者中所示之VL序列的任何組合。在一些實施例中，抗CD3結合域為Fab、scFv、Fv或dsFv，其含有包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列之可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列之可變輕鏈(VL)。
在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO: 519、520、523或524中之任一者中所示之可變重鏈(VH)。在一些實施例中，CD3結合域含有SEQ ID NO: 521、522、525或526中之任一者中所示之可變輕鏈(VL)。
所提供之雙特異性構築體可格式化成含有至少一個DLL3 VHH域及至少一個特異性針對活化T細胞抗原之其他域(諸如CD3結合域)的大量形式中之任一種。
在一個實施例中，雙特異性構築體為雙特異性單域抗體連接Fab (S-Fab)，其含有直接或間接地連接至特異性針對T細胞活化抗原(例如CD3)之Fab抗原結合片段(諸如抗CD3 Fab)的至少一個所述DLL3 VHH域。針對T細胞活化抗原之Fab，例如抗CD3 Fab，可含有所述VH及VL序列中之任一者。在一些實施例中，DLL3 VHH域連接至抗CD3 Fab之VH或VL鏈之C端。在一些實施例中，S-Fab可進一步加以修飾，諸如藉由與聚乙二醇(PEG)、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺(HPMA)共聚物、蛋白質(諸如白蛋白)、聚麩胺酸結合或血漿半衰期延長(Pan等人, (2018) International Jounral of Nanomedicine, 2018:3189-3201)。
在另一個實施例中，雙特異性構築體為scFv-單域抗體，其中構築體含有直接或間接地連接至scFv的至少一個所述DLL3 VHH，該scFv含有特異性針對T細胞活化抗原(例如CD3)之抗原結合域的VH及VL。針對T細胞活化抗原之scFv，例如抗CD3 scFv，可含有所述VH及VL序列中之任一者。在一些實施例中，VHH域及scFv藉由連接子，諸如肽連接子連接。在一些實施例中，肽連接子可為如本文所述之肽連接子。在一些實施例中，VHH域及scFv各自連接至Fc區，諸如Fc區之N端，視情況經由鉸鏈區或連接子(例如肽連接子)連接。Fc區可為本文所述之任一者，諸如人類Fc區或其變異體，例如人類IgG1 Fc區或其變異體。在特定實施例中，Fc區係由變異型Fc域(例如變異型人類IgG1域)形成，該等Fc域發生突變或經修飾以促進雜二聚化，其中不同多肽可二聚而產生雜二聚體。
在另一實施例中，CD3結合域為單域抗體，諸如特異性結合至CD3之VHH域。單域抗體(包括結合至CD3之VHH域)已為人所知，參見例如公開之美國專利申請案第US20160280795號。在一些實施例中，CD3結合域為SEQ ID NO: 85中所示之抗CD3 VHH；或展現出與SEQ ID NO: 85至少60%、70%、80%、90%、95%、97%、98%、99%一致性之序列，且特異性結合至CD3。在此類態樣中，本文提供之雙特異性構築體可包括至少一個DLL3 VHH域及至少一個CD3 VHH域。為將構築體格式化，在一些情況下，各VHH域連接至Fc區，諸如Fc區之N端，視情況經由鉸鏈區或連接子(例如肽連接子)連接。Fc區可為本文所述之任一者，諸如人類Fc區或其變異體，例如人類IgG1 Fc區或其變異體。在特定實施例中，Fc區係由變異型Fc域(例如變異型人類IgG1域)形成，該等Fc域發生突變或經修飾以促進雜二聚化，其中不同多肽可二聚而產生雜二聚體。
在上述實施例中，為促進雜二聚而對Fc區進行的例示性修飾已為人所知，包括如下文所述之任一者，例如表3。在一些實施例中，雜二聚體Fc中之一種Fc多肽包含SEQ ID NO: 103、107、115、440或446中之任一者中所述的胺基酸序列，且雜二聚體Fc中之另一種Fc多肽含有SEQ ID NO: 104、108、111、113、119、121、441、444、448中之任一者中所述的胺基酸序列。在一些實施例中，雜二聚體Fc中之一種Fc多肽包含SEQ ID NO: 105、109、116、118、442或447中之任一者中所述的胺基酸序列，且雜二聚體Fc中之另一種Fc多肽包含SEQ ID NO: 106、110、112、114、120、122、443、445或449中之任一者中所述的胺基酸序列。 2. 限制性 CD3 多特異性構築體
在一些實施例中，DLL3結合多肽為一種多特異性多肽構築體，其為限制性T細胞接合融合蛋白。在特定態樣中，本文提供之限制性多特異性構築體結合諸如CD3之活化T細胞抗原及DLL3。本文提供之限制性多特異性多肽構築體至少包括：包括免疫球蛋白Fc區之第一組分；包括至少結合CD3之結合域之一或多個複本的第二組分(在本文中稱為抗CD3結合域或CD3結合域，該等為在本文中可互換使用之術語)；及接合第一組分與第二組分之連接子，諸如多肽連接子。在所提供之多特異性多肽構築體中，第一及第二組分中之一或兩者含有至少一個DLL3 VHH域，該DLL3 VHH域在結合至抗原時進行嚙合，致使限制性CD3結合區實質上能夠結合CD3。圖 3A 至圖 3E 描繪限制性多特異性構築體之例示性形式。
在一些實施例中，就結合CD3及隨後活化T細胞之能力而言，本文提供之限制性多特異性多肽構築體呈兩種狀態存在∶(1)當任一或所有抗原結合域均不結合至DLL3，使得CD3結合受限且避免或減少T細胞相互作用時，出現「非活性」狀態；及(2)在任一或所有抗原結合域結合抗原，使得CD3結合區能夠結合CD3且允許T細胞相互作用時，出現「活性」狀態。
在一些實施例中，Fc區經由連接子連接於CD3結合域。在一些實施例中，Fc區經由不可裂解連接子連接於CD3結合區。在一些實施例中，Fc區經由可裂解連接子或其他方面不穩定之連接子連接於CD3結合區。在一些實施例中，可裂解連接子為可在蛋白酶存在下特異性裂解之連接子。在一些態樣中，在可裂解連接子裂解後CD3結合得到增強。在一些此類態樣中，「活性」狀態可經由若干機制進一步擴增，該等機制包括經由使接合CD3結合區與Fc區之連接子裂解。在一些實施例中，可裂解連接子為含有蛋白酶受質識別位點之連接子。在一些實施例中，在Fc區及CD3結合區藉由可裂解連接子連接之情況下，在連接子內裂解可增強CD3結合。
此外，在Fc區及CD3結合區藉由可裂解連接子可操作地連接的態樣中，Fc區與CD3結合區之間的連接子裂解可將限制性多特異性多肽構築體分成第一組分及第二組分。視限制性多特異性多肽構築體之組成而定，第一組分及第二組分可具有不同功能。在一些實施例中，Fc區為展現一或多種效應功能，諸如ADCC、CDC或ADCP功能之區域。在此等實例中，本發明之限制性多特異性多肽構築體可用於產生自擴增系統。舉例而言，在一些態樣中，在Fc與CD3結合域之組分之間併入蛋白酶可裂解連接子藉由使CD3結合域完全暴露而能夠擴增T細胞活化能力。視所包括之特定連接子而定，擴增步驟可由腫瘤相關蛋白酶或藉由抗原依賴性T細胞活化後釋放之顆粒酶介導。若包括腫瘤蛋白酶可裂解連接子，則擴增藉由腫瘤或腫瘤微環境介導。而若包括顆粒酶B可裂解連接子，則擴增可在抗原依賴性活化後藉由T細胞自我介導。此外，在構築體中包括能夠實現效應之Fc的情況下，擴增可藉由自經由ADCC機制出現之NK細胞釋放的顆粒酶介導。
所提供之限制性多特異性多肽構築體包括一種組態，其中含有Fc區之第一組分在含有CD3結合區之第二組分的N端。在此類實施例中，第一組分及第二組分經由在Fc區之末端C端的連接子接合。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域位於多特異性多肽構築體之胺基端(N端)區域上。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域位於多特異性多肽構築體之羧基端(C端)區域上。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個位於多特異性多肽構築體之N端及C端區域上的DLL3 VHH結構域。
在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體為二聚體，其中二聚係由兩個多肽鏈之間的共價或非共價相互作用形成。在一些實施例中，兩個多肽鏈藉由例如鏈間二硫鍵共價鍵結於彼此。在一些實施例中，Fc區介導經由鏈間二硫鍵之二聚。在特定實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有雜二聚體Fc區，其中在一些情況下，多特異性多肽構築體之多肽鏈為不同(雜二聚體)的。在雜二聚體多特異性多肽構築體之特定實例中，CD3結合區為含有VH及VL鏈之雙鏈多肽，諸如含有VH及VL之Fv抗體片段。在一些實施例中，Fv抗體片段包括經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。
在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體係由兩種多肽形成或包括兩種多肽，包括第一多肽，該第一多肽包含雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子(例如可裂解或不可裂解連接子)、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VH域；及第二多肽，該第二多肽包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子(例如可裂解或不可裂解連接子)、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VL域。在一些實施例中，第一多肽含有一或兩個結合至DLL3之VHH域。在一些實施例中，第二多肽含有一或兩個結合至DLL3之VHH域。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個DLL3 VHH域。在一些情況下，至少一個DLL3 VHH域位於Fc多肽N端，且至少一個DLL3 VHH域位於CD3結合區之鏈的C端。
在一些實施例中，第一多肽或第二多肽或第一多肽與第二多肽兩者進一步包括結合共刺激受體之共刺激受體結合區(CRBR)。在一些實施例中，第一及/或第二多肽之CRBR可位於Fc多肽N端及/或CD3結合區之鏈的C端。
在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個結合DLL3之VHH域及至少一個結合共刺激受體之共刺激受體結合區(CRBR)。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有：(1)第一多肽，該第一多肽按N端至C端次序包含∶第一DLL3 VHH域、雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子(例如可裂解連接子)、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv或dsFv)之鏈(例如VH或VL)及第二DLL3 VHH域；以及(2)第二多肽，該第二多肽按N端至C端次序包含∶雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、相同連接子(例如相同可裂解連接子)、抗CD3抗體或抗原結合片段之另一鏈(VH或VL之另一鏈)及結合共刺激受體之共刺激受體結合區(CRBR)。
在一些實施例中，第一多肽或第二多肽或第一多肽與第二多肽兩者進一步包括結合抑制性受體之抑制性受體結合區(IRBR)。在一些實施例中，第一多肽及/或第二多肽之IRBR可位於Fc多肽N端及/或CD3結合區之鏈的C端。
在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個結合DLL3之VHH域及至少一個結合抑制性受體之抑制性受體結合區(IRBR)。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有：(1)第一多肽，該第一多肽按N端至C端次序包含∶第一DLL3 VHH域、雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子(例如可裂解或不可裂解連接子)、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv或dsFv)之鏈(例如VH或VL)及第二DLL3 VHH域；以及(2)第二多肽，該第二多肽按N端至C端次序包含∶雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、相同連接子(例如相同可裂解連接子)、抗CD3抗體或抗原結合片段之另一鏈(VH或VL之另一鏈)及結合抑制性受體之抑制性受體結合區(IRBR)。
在一些實施例中，第一多肽或第二多肽中之至少一者進一步包括結合共刺激受體之共刺激受體結合區(CRBR)，且第一多肽或第二多肽中之至少一者進一步包括結合抑制性受體之抑制性受體結合區(IRBR)。在一些實施例中，第一及/或第二多肽之CRBR可位於Fc多肽N端及/或CD3結合區之鏈的C端。在一些實施例中，第一多肽及/或第二多肽之IRBR可位於Fc多肽N端及/或CD3結合區之鏈的C端。
在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個結合DLL3之VHH域、結合共刺激受體之共刺激受體結合區(CRBR)及結合抑制性受體之抑制性受體結合區(IRBR)。在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有：(1)第一多肽，該第一多肽按N端至C端次序包含∶第一DLL3 VHH域、雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子(例如可裂解或不可裂解連接子)、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv或dsFv)之鏈(例如VH或VL)及第二DLL3 VHH域；以及(2)第二多肽，該第二多肽按N端至C端次序包含∶IRBR或CRBR中之一者、雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、相同連接子(例如相同可裂解或不可裂解連接子)、抗CD3抗體或抗原結合片段之另一鏈(VH或VL之另一鏈)及IRBR或CRBR中之另一者。
在下文更詳細地描述本發明之多特異性多肽構築體之各組分。a.  DLL3 VHH 抗原結合域
本發明之限制性多特異性多肽構築體包括至少一個來自本文所提供之任一者的DLL3 VHH域。在一些實施例中，至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 244-318中之任一者中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 244-318、401-409、416或455中之任一者中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 102、244-318、401-409、416、455及476-480-488、507-518中之任一者中所示之胺基酸序列。
在特定實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少兩個DLL3域。在一些情況下，至少一個DLL3 VHH域相對於雜二聚體Fc之Fc多肽定位於胺基端且至少一個DLL3 VHH域相對於CD3結合區之VH或VL鏈定位於羧基端。
在含有至少兩個或含有兩個DLL3 VHH域之限制性多特異性多肽構築體的態樣中，DLL3 VHH域各自可以結合至DLL3上之相同或重疊抗原決定基。
在含有至少兩個或含有兩個DLL3 VHH域之限制性多特異性多肽構築體的態樣中，DLL3 VHH域各自可以結合至DLL3上的不同或不重疊抗原決定基。
在一些實施例中，第一與第二DLL3 VHH域結合DLL3之不同或不重疊抗原決定基，且/或不競爭結合至DLL3。
在一些情況下，第一sdAb VHH域包含264、287、299、306或318中之任一者中所示之胺基酸序列、其人類化變異體，或與264、287、299、306或318中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3；且第二sdAb VHH域包含244、258、275、280、314、316或317中之任一者中所示之胺基酸序列、其人類化變異體，或與244、258、275、280、314、316或317中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
在一些情況下，第一VHH域包含SEQ ID NO: 251、264、267、268、287、299、306、314、318、455、507、517中之任一者中所示之胺基酸序列、其人類化變異體，或與SEQ ID NO: 251、264、267、268、287、299、306、314、318、455、507、517中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3；且第二VHH域包含SEQ ID NO: 244、251、258、267、275、280、314、315、316、317、318、455、515、516、517、518中之任一者中所示之胺基酸序列，或其人類化變異體，或與序SEQ ID NO: 244、251、258、267、275、280、314、315、316、317、318、455、515、516、517、518中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
在一些情況下，第一sdAb VHH域包含SEQ ID NO: 264中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 265-455中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 287中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 288-298中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 299中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 300-305中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 306中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 307-313或SEQ ID NO: 318中之任一者中所示之人類化變異體；且第二sdAb VHH域包含SEQ ID NO: 244中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 258中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 275中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 276-279中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 280中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 281-286、SEQ ID NO: 314、SEQ ID NO: 316或SEQ ID NO: 317中之任一者中所示之其人類化變異體。
在一些情況下，第一VHH域包含SEQ ID NO: 264中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 287中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 102、288-298中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 299中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 300-305或480中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 306中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 307-313中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 507中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 508-514、SEQ ID NO: 318或SEQ ID NO 517中之任一者中所示之其人類化變異體；且第二VHH域包含SEQ ID NO: 244中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 258中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 275中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 276-279或479中之任一者中所示之其人類化變異體、SEQ ID NO: 280中所示之胺基酸序列或SEQ ID NO: 281-286、SEQ ID NO: 314、SEQ ID NO: 316、SEQ ID NO: 515、SEQ ID NO: 516或SEQ ID NO: 317中之任一者中所示之其人類化變異體。
在一些實施例中，第一sdAbVHH域及第二sdAbVHH域包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 318；SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 306；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 306；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 299；SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 268；SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 267；SEQ ID NO: 275及SEQ ID NO: 318；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 287；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 316及SEQ ID NO: 318；SEQ ID NO: 317及SEQ ID NO: 318；或SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 318。在一些實施例中，第一sdAbVHH域及第二sdAbVHH域包含SEQ ID NO: 315及SEQ ID NO: 318中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，第一sdAbVHH域及第二sdAbVHH域包含SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 455中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，第一VHH域及第二VHH域包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 318；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 306；SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 507；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 306；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 507；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 299；SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 268；SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 267；SEQ ID NO: 275及SEQ ID NO: 318；275及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 287；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 314；SEQ ID NO: 315及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 518及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 316及SEQ ID NO: 318；SEQ ID NO: 515及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 318及SEQ ID NO: 318；SEQ ID NO: 517及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 317及SEQ ID NO: 318；SEQ ID NO: 516及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO:251及SEQ ID NO:455；SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 517；或SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 318。在一些實施例中，第一VHH域及第二VHH域包含SEQ ID NO: 315及SEQ ID NO: 318中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，第一VHH域及第二VHH域包含SEQ ID NO: 518及SEQ ID NO: 517中所示之胺基酸序列。在一些實施例中，第一VHH域及第二VHH域包含SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 455中所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，限制性多特異性多肽構築體含有至少一個DLL3 VHH域，諸如本文提供之任一者，及特異性針對另一腫瘤相關抗原(TAA)之至少一種其他抗原結合域。在一些實施例中，至少一種其他抗原結合域包括選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段的一或多個複本：Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。在特定實施例中，其他TAA抗原結合域為單鏈抗體。在一些實例中，單鏈為scFv、scAb、單域重鏈抗體或單域輕鏈抗體。例如在一些情況下，其他TAA抗原結合域包括一或多個單域抗體(sdAb)片段，例如VH H、VNAR 、經工程改造之VH 或VK 結構域。VH H可由天然駱駝科單獨重鏈抗體產生，由產生單獨重鏈抗體之經基因修飾之嚙齒動物產生，由或初始/合成駱駝科或人類化駱駝科單域抗體文庫產生。VNAR 可由軟骨魚單獨重鏈抗體產生。已執行各種方法以利用習知雜二聚體VH 及VK 域產生單體sdAb，包括特定生殖系家族之界面工程改造及選擇。
在一些實施例中，其他TAA係選自由以下組成之群：1-92-LFA-3、5T3、α-4整合素、α-V整合素、α4β1整合素、α4β7整合素、AGR2、抗Lewis-Y、Apelin J受體、APRIL、B7-H3、B7-H4、BAFF、BTLA、C5補體、C-242、CA9、CA19-9、(Lewis a)、碳酸酐酶9、CD2、CD3、CD6、CD9、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD27、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD40L、CD41、CD44、CD44v6、CD47、CD51、CD52、CD56、CD64、CD70、CD71、CD74、CD80、CD81、CD86、CD95、CD117、CD123、CD125、CD132、(IL-2RG)、CD133、CD137、CD138、CD166、CD172A、CD248、CDH6、CEACAM5 (CEA)、CEACAM6 (NCA-90)、CLAUDIN-3、CLAUDIN-4、cMet、膠原蛋白、畸胎瘤衍化生長因子(Cripto)、CSFR、CSFR-1、CTLA-4、CTGF、CXCL10、CXCL13、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CYR61、DL44、DLK1、DLL4、DPP-4、DSG1、EDA、EDB、EGFR、EGFRviii、內皮素B受體(ETBR)、ENPP3、EpCAM、EPHA2、EPHB2、ERBB3、RSV F蛋白、FAP、FGF-2、FGF8、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、FLT-3、葉酸受體α(FRα)、GAL3ST1、G-CSF、G-CSFR、GD2、GITR、GLUT1、GLUT4、GM-CSF、GM-CSFR、GP IIb/IIIa受體、Gp130、GPIIB/IIIA、GPNMB、GRP78、HER2/neu、HER3、HER4、HGF、hGH、HVEM、玻尿酸酶、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgE、IgE受體(FceRI)、IGF、IGF1R、IL1B、IL1R、IL2、IL11、IL12、IL12p40、IL-12R、IL-12Rβ1、IL13、IL13R、IL15、IL17、IL18、IL21、IL23、IL23R、IL27/IL27R (wsx1)、IL29、IL-31R、IL31/IL31R、IL2R、IL4、IL4R、IL6、IL6R、胰島素受體、鋸齒狀配位體、鋸齒狀1、鋸齒狀2、KISS1-R、LAG-3、LIF-R、Lewis X、LIGHT、LRP4、LRRC26、Ly6G6D、LyPD1、MCSP、間皮素、MRP4、MUC1、黏蛋白-16 (MUC16、CA-125)、Na/K ATPase、NGF、呆蛋白、Notch受體、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NOV、OSM-R、OX-40、PAR2、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGFRα、PDGFRβ、PD-1、PD-L1、PD-L2、磷脂醯基-絲胺酸、P1GF、PSCA、PSMA、PSGR、RAAG12、RAGE、SLC44A4、神經鞘胺醇1磷酸酯、STEAP1、STEAP2、TAG-72、TAPA1、TEM-8、TGFβ、TIGIT、TIM-3、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TMEM31、TNFα、TNFR、TNFRS12A、TRAIL-R1、TRAIL-R2、運鐵蛋白、運鐵蛋白受體、TRK-A、TRK-B、uPAR、VAP1、VCAM-1、VEGF、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、VISTA、WISP-1、WISP-2及WISP-3。
在一些實施例中，諸如DLL3 VHH域之抗原結合域直接或間接地經由連接子連接至Fc區及/或CD3結合區。在一些實施例中，連接係經由連接子。在一些實施例中，連接子為連接肽(LP)，其可包括所述任何可撓性或剛性連接子。在一些實施例中，連接子係選自由以下組成之群：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；及GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，連接子為包含甘胺酸殘基之可撓性連接子，諸如藉助於非限制性實例GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 5)、GGGGG (SEQ ID NO: 6)及GGGGGG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，連接子為(GGGGS)n，其中n為1至5 (SEQ ID NO: 123)；(GGGGGS)n，其中n為1至4 (SEQ ID NO: 124)；GGGGS (SEQ ID NO: 125)；GGGGGS (SEQ ID NO: 126)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 127)；GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 128)；或GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 129)。在一些實施例中，連接子包括GS連接子與甘胺酸連接子之組合。b. Fc 區
限制性多特異性多肽構築體包括免疫球蛋白Fc區。一般而言，限制性多特異性多肽構築體為由各含有Fc之多肽所形成的二聚體。Fc多肽可為如上文所述之任何多肽。在特定實施例中，Fc區係由Fc域形成，該等Fc域發生突變或經修飾以促進雜二聚化，其中不同多肽可二聚而產生雜二聚體。因此，在一些實施例中，二聚體為雜二聚體，其中多特異性多肽構築體之兩個多肽鏈不同。
用於促進互補Fc多肽雜二聚化之多種方法已為人所知，參見例如Ridgway等人, Protein Eng. 9:617-621 (1996)；Merchant等人, Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)；Moore等人, (2011) MAbs, 3:546-57；Von Kreudenstein等人, MAbs, (2013) 5:646-54；Gunasekaran等人, (2010) J. Biol. Chem., 285:19637-46；Leaver-Fay等人, (2016) Structure, 24:641-51；Ha等人, (2016) Frontiers in Immunology, 7:1；Davis等人, (2010) Protein Eng Des Sel, 23:195-202；公開的國際PCT申請案第WO 1998/050431號、第WO 2009/089004號、第WO2011143545號、第WO 2014/067011號、第WO 2012/058768號、第WO2018027025號；公開的美國專利申請案第US20140363426號、第US20150307628號、第US20180016354號、第US20150239991號；及美國專利第US5731168號、第US7183076號、第US9701759號、第US9605084號及第US9650446號。促進Fc鏈雜二聚化之方法包括Fc區誘變，諸如藉由納入一組「杵臼」突變或納入對Fc實現有利於不同多肽鏈間之吸引性相互作用之靜電操縱的突變。舉例而言，在一些實施例中，雜二聚體中之Fc多肽包括改變整個Fc二聚體界面之電荷極性的突變，使得靜電匹配之Fc鏈之共表現支持有利的吸引性相互作用，藉此促進所要的Fc雜二聚體形成，而不利的排斥電荷相互作用抑制非所需之Fc均二聚體形成(Guneskaran等人(2010) JBC, 285: 19637-19646)。當在細胞中共表現時，鏈之間可能會結合，但鏈因電荷排斥力而基本上不會發生自身結合。用於產生異二聚體Fc的其他策略包括將人類IgG與IgA CH3域鏈段混合以產生互補的CH3雜二聚體，稱為SEED Fc。
雜二聚方法及變異體亦包括已公開之國際PCT申請案WO2014/145806中所述的彼等物，包括「杵與臼」突變(亦稱為「偏斜」變異體)、與「靜電操縱」或「電荷對」有關的突變及pI變異體。雜二聚變異體亦包括如美國公開申請案第US2012/0149876號或第US2018/011883號中所述的任何變異體。
在一些實施例中，為促進雜二聚化，Fc雜二聚體之兩種多肽均含有成對或互補的胺基酸修飾。Fc融合體中之多肽的例示性成對胺基酸修飾闡述於表 3 中。
表3 ： 雜二聚體 Fc 之成對胺基酸
第一Fc 多肽 第二Fc 多肽
T366W T366S/L368W/Y407V
T366W/S354C T366S/L368A/Y407V/Y349C
S364H/F405A Y349T/Y349F
T350V/L351Y/F405A/Y407V T350V/T366L/K392L/T394W
K360D/D399M/Y407A E345R/Q347R/T366V/K409V
K409D/K392D D399K/E356K
K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
L360E/K409W/Y349C Q347R/399V/F405T/S354C
K370E/K409W E357N/D399V/F405T
在一些實施例中，修飾包括將隆凸(杵)引入第一Fc多肽中及將空腔(臼)引入第二Fc多肽中，使得隆凸可定位於空腔中以促進第一與第二含Fc多肽複合。作為置換及/或修飾之目標以在多肽中產生隆凸或空腔的胺基酸典型地為界面胺基酸，該等界面胺基酸與第二多肽之界面中的一或多個胺基酸相互作用或接觸。
在一些實施例中，經修飾以含有隆凸(杵)胺基酸的第一Fc多肽包括原生或原始胺基酸置換為具有至少一個側鏈的胺基酸，該至少一個側鏈自第一Fc多肽之界面突起且因此可定位於相鄰之第二多肽界面之補償性空腔(臼)中。置換胺基酸最常為側鏈體積大於原始胺基酸殘基的胺基酸。熟習此項技術者知曉如何測定及/或評估胺基酸殘基之特性以鑑別出作為產生隆凸之理想置換胺基酸的彼等胺基酸。在一些實施例中，用於形成隆凸之置換殘基為天然存在之胺基酸殘基且包括例如精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)或色胺酸(W)。在一些實例中，鑑別用於置換之原始殘基為具有小側鏈之胺基酸殘基，諸如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。
在一些實施例中，經修飾以含有空腔(臼)的第二Fc多肽為包括原生或原始胺基酸置換為具有至少一條側鏈之胺基酸的Fc多肽，該至少一個側鏈自第二多肽界面凹入且從而能夠容納來自第一多肽界面的相應隆凸。置換胺基酸最常為側鏈體積小於原始胺基酸殘基的胺基酸。熟習此項技術者知曉如何測定及/或評估胺基酸殘基之特性以鑑別出作為用於形成空腔之理想置換殘基的彼等殘基。一般而言，用於形成空腔之置換殘基為天然存在之胺基酸且包括例如丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)。在一些實例中，經鑑別用於置換之原始胺基酸為具有大側鏈之胺基酸，諸如酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。
人類IgG1之CH3界面例如涉及位於四個反向平行β股之各域上的十六個殘基，各域的各表面隱藏著1090Å2(參見例如Deisenhofer等人, (1981) Biochemistry, 20:2361-2370；Miller等人, (1990) J Mol. Biol., 216, 965-973；Ridgway等人, (1996) Prot. Engin., 9: 617-621；美國專利第5,731,168號)。修飾CH3域以產生隆凸或空腔描述於例如美國專利第5,731,168號；國際專利申請案WO98/50431及WO 2005/063816；及Ridgway等人, (1996) Prot. Engin., 9: 617-621中。在一些實例中，修飾CH3域以產生隆凸或空腔典型地以位於兩個中心反向平行β股上之殘基為目標。目的為將所產生之隆凸藉由伸入周圍溶劑中而可容納而非被搭配物CH3域中之補償性空腔容納的風險降至最低。
舉例而言，在一些實施例中，雜二聚體Fc包括具有位於Thr366之CH3域內之胺基酸修飾的多肽，該胺基酸修飾當置換為較大體積的胺基酸(例如Try (T366W))時，能夠優先與第二CH3域成對，該第二CH3域分別在位置Thr366、Leu368及Tyr407具有體積較小胺基酸(例如Ser、Ala及Val)的胺基酸修飾(T366S/L368A/Y407V)。經由CH3修飾達成的雜二聚可進一步藉由引入二硫鍵穩定化，例如藉由將對置CH3域上的Ser354改變成Cys (S354C)及Tyr349改變成Cys (Y349C)(回顧於Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15)。
在特定實施例中，多特異性多肽構築體含有能夠介導Fc雜二聚化的第一與第二Fc，含有具有突變T366W及S354C的第一Fc多肽及具有突變T366S、L368A、Y407V及Y349C的第二Fc多肽。在一些實施例中，第一Fc多肽係選自包含SEQ ID NO: 440或446中所述之序列的Fc多肽且第二Fc多肽係選自包含SEQ ID NO: 441、444或448中所述之序列的Fc多肽。在一些實施例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 103、107、115或117中之任一者中所示的胺基酸序列，且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 104、108、111、113、119或121中之任一者中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，Fc多肽展現得到Fc介導性效應功能的特徵。在特定實例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 440中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 441或444。在一些實施例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 103中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 104或111中所述的序列。在一些實施例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 107中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 108或113中所述的序列。第一與第二Fc多肽可在構築體之任一多肽鏈上格式化。
在一些實施例中，第一與第二Fc多肽中之一或兩者可進一步包括一或多個胺基酸突變以進一步減少一或多種Fc效應功能，諸如減少Fc受體結合。減少Fc效應功能的例示性突變包括如所述的任何突變。在一些實施例中，修飾可為一或多個位置Glu233 (E233)、Leu234 (L234)或Leu235 (L235)的缺失，諸如胺基酸Glu233 (E233)、Leu234 (L234)及Leu235 (L235)之缺失。在一些實施例中，第一Fc多肽係選自包含SEQ ID NO: 442或447中所述之序列的Fc多肽且第二Fc多肽係選自包含SEQ ID NO: 443、445或449中所述之序列的Fc多肽。在一些實施例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 105、109、116或118中之任一者中所示的胺基酸序列，且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 106、110、112、114、120或122中之任一者中所示的胺基酸序列。
在特定實例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 442中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 443或445。在一些實施例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 105中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 106或112中所述的序列。在一些實施例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 109中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 110或114中所述的序列。第一與第二Fc多肽可在構築體之任一多肽鏈上格式化。
在一些實施例中，第一Fc多肽或第二Fc多肽進一步包括突變M252Y及/或M428V。在特定實例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 446中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 448中所述的序列。在一些實施例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 115中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 119中所述的序列。在一些實施例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 117中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 121中所述的序列。在其他實例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 447中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 449中所述的序列。在一些實施例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 116中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 120中所述的序列。在一些實施例中，第一Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 118中所述的序列且第二Fc多肽為或包含SEQ ID NO: 122中所述的序列。第一與第二Fc多肽可在構築體之任一多肽鏈上格式化。
可有助於促成雜二聚體之其他變異體實例為第一Fc多肽與第二Fc多肽之空間變異體(例如偏斜變異體)的任何組合或對，其選自：S364K/E357Q及L368D/K370S；L368D/K370S及S364K；L368E/K370S及S364K；T411T/E360E/Q362E及D401K；L368D/K370S及S364K/E357L、K370S及S364K/E357Q及T366S/L368A/Y407V及T366W或366S/L368A/Y407V/Y349C及T366W/S354C)，其中每一對代表第一Fc多肽及第二Fc多肽中之突變。在特定實施例中，所提供的構築體含有具有突變對L368D/K370S及S364K及E357Q的第一與第二Fc多肽。
可用於產生雜二聚體的另一種機制有時稱為「靜電操縱」，如Gunasekaran等人, J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010)中所述。此在本文中有時稱為「電荷對」。在此實施例中，利用靜電偏向形成雜二聚化。如熟習此項技術者將瞭解，此等機制亦可對pI且從而對純化具有影響，且因此在一些情況下亦可視為pI變異體。然而，由於此等變異體係為迫使發生雜二聚而產生且不作為純化工具使用，因此其歸類為「空間變異體」。在一個實施例中，第一Fc多肽可含有突變D221E/P228E/L368E且第二Fc多肽可含有突變D221R/P228R/K409R。在另一實施例中，第一Fc多肽可含有突變C220E/P228E/368E且第二Fc多肽可含有突變C220R/E224R/P228R/K409R。
在一些實施例中，pI變異體可促進雜二聚化。在一些態樣中，pI變異體可包括增大蛋白質pI (鹼性變化)的彼等變異體。在其他態樣中，pI變異體可包括減小蛋白質pI (酸性變化)的彼等變異體。在一些情況下，可以達成此等變異體之所有組合，包括其中一種Fc多肽可為野生型之組合，或顯示的pI與野生型無顯著差異的變異體，且另一種Fc多肽可具較強鹼性或較強酸性。或者，可以改變各Fc多肽，一者改變成較強鹼性且一者改變成較強酸性。在一些實施例中，至少一種Fc多肽為含有突變Q295E/N384D/Q418E/N421D的負pI變異體Fc。
在一些實施例中，空間雜二聚變異體(例如杵與臼)與pI或電荷對變異體可以組合使用。
在特定實施例中，所提供的構築體含有：(a)包含偏斜變異體S364K/E357Q的第一Fc多肽；及b)含有偏斜變異體L368D/K370S及pI變異體N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D的第二Fc多肽。在一些實施例中，第一與第二多肽中之一或兩者可含有減少Fc效應子活性的其他突變，諸如例示性突變E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。能夠介導Fc雜二聚化之此類第一Fc多肽及第二Fc多肽的實例包含SEQ ID NO: 472及473中所述的序列。第一與第二Fc多肽可在構築體之任一多肽鏈上格式化。
所得限制性多特異性多肽構築體可以藉由任何適合方法純化，諸如藉由蛋白質A或蛋白質G管柱親和層析。在編碼不同多肽之兩種核酸分子於細胞中轉型的情況下，將形成均二聚體與雜二聚體。可以調整用於表現的條件，以便有利於雜二聚體形成而非均二聚體形成。
基於雜二聚體對親和試劑之差別親和力自均二聚體回收雜二聚體的技術已為人所知。在一些態樣中，此類技術包括設計雜二聚體，以使得Fc多肽鏈之一不結合至親和試劑蛋白質A。在一些情況下，多肽鏈之一可含有一或多個胺基酸取代以消除或減少Fc雜二聚體中之多肽之一對蛋白質A試劑的親和力，參見例如WO2017134440、WO2010151792、Jendeberg等人(Jendeberg等人, (1997) J. Immunol. Methods, 201(1): 25-34。在一些此等實施例中，Fc區可在雜二聚體之一成員的蛋白質A結合位點上經修飾，以便阻止蛋白質A結合且藉此能夠更高效地純化雜二聚融合蛋白。此結合位點內的例示性修飾為Ile253，例如Ile253Arg (I253R)。在一些實施例中，修飾可為H435R或H435R/Y436F。在一些實施例中，Fc雜二聚體中之Fc多肽可含有修飾，使得其能夠結合蛋白質A，而非蛋白質G (pA+/pG-)。例示性pA+/pG胺基酸修飾包括參照人類IgGl，Fc在位置428含有絲胺酸，在位置434含有絲胺酸且在位置436視情況含有組胺酸，或在人類IgG 2、3或4中之相應位置包含此等殘基。在一些態樣中，一種IgG Fc多肽在位置428、434及視情況存在之436的此類胺基酸修飾減少或阻止蛋白質G結合，從而增強蛋白質純化。
在一些實施例中，賦予親和試劑差別親和力之任一此類修飾可與上述任一種或多種其他胺基酸修飾組合。舉例而言，I253R修飾可與T366S/L368A/Y407V修飾組合或與T366W修飾組合。T366S/L368A/Y407V修飾的Fc因二聚合界面不存在空間位阻而能夠形成均二聚體，在T336W修飾之Fc的情況下，二聚合界面存在空間位阻。因此，在一些實施例中，將I253R修飾與T366S/L368A/Y407V修飾之Fc組合，使可能已形成的任何均二聚體Fc無法純化。藉由將T366S/L368A/Y407V及H453R組合可以使用類似修飾。
在一些實施例中，雜二聚體分子之Fc區可另外含有一或多個其他Fc突變，諸如上文所述之任何突變。在一些實施例中，雜二聚體分子含有具有減少效應功能之突變的Fc區。在一些實施例中，Fc區經改變以減少Fc介導性效應功能，諸如經由減少的Fc受體結合，例如結合至FcγR的結合，但通常不是FcRn結合。
在一些實施例中，Fc區在以下一或多個位置發生突變以減少Fc受體結合：Glu233 (E233)、Leu234 (L234)或Leu235 (L235)。一或多個突變可包括E233P、L234V及/或L235A。
在特定實施例中，減少Fc效應功能(例如經由減少Fc受體結合至FcγR)之Fc區的突變包括選自以下之突變：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G或E233P/L234V/L235A/G236del、D265A/P329A、D265A/P329G、D265A/N297A、L234V/L235A/D265A、L234V/L235A/N297A、L234V/L235A/P329A，或L234V/L235A/P329G。
在一些實施例中，雜二聚體Fc中之一種Fc多肽包含SEQ ID NO: 440 (例如SEQ ID NO: 103或107)、446 (例如SEQ ID NO: 115或117)中之任一者中所示的胺基酸序列，且雜二聚體Fc中之另一種Fc多肽含有SEQ ID NO: 441 (例如SEQ ID NO: 104或108)、444 (例如SEQ ID NO: 111或113)、448 (例如SEQ ID NO: 119或121)中之任一者中所示的胺基酸序列。在一些實施例中，雜二聚體Fc中之一種Fc多肽包含SEQ ID NO: 442 (例如SEQ ID NO: 105或109)、447 (例如SEQ ID NO: 116或118)中之任一者中所示的胺基酸序列，且雜二聚體Fc中之另一種Fc多肽包含SEQ ID NO: 443 (例如SEQ ID NO: 106或110)、445 (例如SEQ ID NO: 112或114)、449 (SEQ ID NO: 120或122)中之任一者中所示的胺基酸序列。
在一些實施例中，所提供之多特異性多肽構築體的Fc區展現一或多種效應功能。在一些情況下，Fc區能夠提供Fc介導性效應功能，諸如ADCC (例如NK細胞釋放顆粒酶B)、ADCP及/或CDC。一般而言，Fc區負責效應功能，諸如補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)，此外負責抗原結合能力，其為免疫球蛋白之主要功能。另外，存在於Fc區中之FcRn序列藉由與活體內FcRn受體結合而增加活體內半衰期來起到調控血清中之IgG含量的作用。在多特異性多肽構築體含有可裂解連接子的一些實施例中，連接子裂解可以產生兩種各自具有生物活性的組分：能夠與T細胞上之CD3結合且接合的CD3結合區，在一些態樣中，其亦可含有用於向T細胞誘導共刺激信號的CRBR及/或用於向T細胞誘導抑制信號的IRBR；及與DLL3 VHH域連接的Fc區，其可以展現目標特異性效應功能。在本文所提供之特定實施例中，多特異性多肽構築體含有不可裂解連接子且在一些態樣中，可以不展現獨立的Fc介導性效應功能。
在一些實施例中，Fc區包括發生突變或經修飾以改變一或多種效應功能的Fc多肽。因此，在一些情況下，可以使用所提供的限制性多特異性多肽構築體改變(諸如減少或增強) Fc的效應功能，諸如ADCC、ADCP及/或CDC中之一或多者。減少效應功能之例示性突變包括如上文所述的任一者。
在一些實施例中，可以利用G1 m1或G1 m3異型製備IgG1 Fc多肽或其變異體，諸如下文所述的任一者。在一些實施例中，Fc區可含有人類G1 m1異型之胺基酸，諸如在位置356及358含有Asp (D)及Leu (L)的殘基，例如SEQ ID NO: 8中所述。在一些情況下，Fc多肽可含有胺基酸取代E356D及M358L以重構異型G1 m1之殘基。在其他實施例中，Fc區可含有人類G1 m3異型之胺基酸，諸如依據EU編號之位置356及358之殘基Glu (E)及Met (M)，例如SEQ ID NO: 472及473中所述。在一些情況下，Fc多肽可含有胺基酸取代D356E及L358M以重構異型G1 m3之殘基。c . CD3 結合域
限制性多特異性多肽構築體包括抗CD3結合域之一或多個複本。本發明之抗CD3結合域經由與T細胞上的CD3或CD3複合物成員接合來活化T細胞。在較佳實施例中，本發明之抗CD3結合域特異性結合CD3之ε鏈，亦稱為CD3ε。本發明之抗CD3ε結合域經由與T細胞上之CD3ε接合來活化T細胞。本發明之抗CD3結合域促效、刺激、活化及/或以其他方式增強CD3介導性T細胞活化。CD3之生物活性包括例如T細胞活化及經由CD3與T細胞受體(TCR)之抗原結合亞單元之間的相互作用達成的其他信號傳導。舉例而言，本發明之抗CD3結合域經由與T細胞上之CD3ε接合、藉由部分地或完全地調節(例如促效、刺激、活化或以其他方式增強) CD3介導性T細胞活化來完全或部分地活化T細胞。
CD3結合域可為如上文所述的任一者。在特定實施例中，CD3結合域為結合CD3ε的Fv抗體片段(在本文中稱為抗CD3ε Fv片段)。在一些實施例中，抗CD3ε Fv抗體片段為經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。在一些實施例中，抗CD3結合域就結合CD3而言為單價的。
在一些實施例中，CD3結合區為含有可變重鏈(Hv，亦稱為VH)及可變輕鏈(Lv，亦稱為VL)的Fv抗體片段，諸如所述的任一者。在此類實施例之態樣中，免疫球蛋白Fc區為含有兩種不同Fc多肽的雜二聚體Fc區，其能夠實現Fc雜二聚體中之兩種多肽之間的雜二聚體結合，諸如所述任一者。在此類實施例中，CD3結合區之可變重鏈(VH)與可變輕鏈(VL)依雜二聚體Fc之相對鏈連接。
在一些實施例中，CD3結合區為SP34之Fv或dsFv (Pessano等人, The EMBO Journal. 4: 337-344, 1985)或SP34之人類化變異體(WO2015001085)。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為Fv，諸如dsFv片段，其包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合。在一些實施例中，CD3結合域為Fv或dsFv片段，其含有至少包括胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)的VH CDR1序列；至少包括胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)的VH CDR2序列；至少包括胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)的VH CDR3序列；至少包括胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)的VL CDR1序列；至少包括胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)的VL CDR2序列；及至少包括胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)的VL CDR3序列。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為Fv，諸如dsFv片段，其包括選自SEQ ID NO: 35-65之群的重鏈可變區胺基酸序列及選自由SEQ ID NO: 66-84或368組成之群的輕鏈可變區胺基酸序列。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括與胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR1序列；與胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR2序列；與胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR3序列；與胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR1序列；與胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR2序列；及與胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR3序列。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括：至少包括胺基酸序列GFTFNTYAMN (SEQ ID NO: 461)的VH CDR1序列；至少包括胺基酸序列RIRSKYNNYATY (SEQ ID NO: 462)的VH CDR2序列；至少包括胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)的VH CDR3序列；至少包括胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)的VL CDR1序列)；至少包括胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)的VL CDR2序列；及至少包括胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)的VL CDR3序列。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括與胺基酸序列GFTFNTYAMN (SEQ ID NO: 461)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR1序列；與胺基酸序列RIRSKYNNYATY (SEQ ID NO: 462)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR2序列；與胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR3序列、與胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR1序列；與胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR2序列；及與胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR3序列。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括：至少包括胺基酸序列GFTFNTYAMN (SEQ ID NO: 461)的VH CDR1序列；至少包括胺基酸序列RIRSKYNNYATY (SEQ ID NO: 462)的VH CDR2序列；至少包括胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)的VH CDR3序列；至少包括胺基酸序列GSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 468)的VL CDR1序列；至少包括胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 469)的VL CDR2序列；及至少包括胺基酸序列ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 464)的VL CDR3序列。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括與胺基酸序列GFTFNTYAMN (SEQ ID NO: 461)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR1序列；與胺基酸序列RIRSKYNNYATY (SEQ ID NO: 462)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR2序列；與胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR3序列；與胺基酸序列GSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 468)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR1序列；與胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 469)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR2序列；及與胺基酸序列ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 464)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR3序列。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括：至少包括胺基酸序列GFTFSTYAMN (SEQ ID NO: 466)的VH CDR1序列；至少包括胺基酸序列RIRSKYNNYATY (SEQ ID NO: 467)的VH CDR2序列；至少包括胺基酸序列HGNFGDSYVSWFAY (SEQ ID NO: 463)的VH CDR3序列；至少包括胺基酸序列GSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 468)的VL CDR1序列；至少包括胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 469)的VL CDR2；及至少包括胺基酸序列ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 464)的VL CDR3序列。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括與胺基酸序列GFTFSTYAMN (SEQ ID NO: 466)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR1序列；與胺基酸序列RIRSKYNNYATY (SEQ ID NO: 467)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR2序列；與胺基酸序列HGNFGDSYVSWFAY (SEQ ID NO: 463)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VH CDR3序列；與胺基酸序列GSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 468)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR1序列；與胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 469)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR2序列；及與胺基酸序列ALWYSNHWV (SEQ ID NO: 464)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的VL CDR3序列。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括至少包括胺基酸VLWYSNRWV (SEQ ID NO: 465)的CDR3。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括與胺基酸VLWYSNRWV (SEQ ID NO: 465)至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的CDR3。
在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段的一或多個複本：Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。在一些實施例中，抗CD3結合域包括結合CD3ε的Fv抗體片段(在本文中稱為抗CD3ε Fv片段)。在一些實施例中，抗CD3ε Fv抗體片段為經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。在一些實施例中，抗CD3結合域就結合CD3而言為單價的。
在一些實施例中，CD3結合區不為單鏈抗體。舉例而言，在一些態樣中，CD3結合區不為單鏈可變片段(scFv)。
在一些實施例中，CD3結合區為含有可變重鏈(Hv，亦稱為VH)及可變輕鏈(Lv，亦稱為VL)的Fv抗體片段，諸如所述的任一者。在此類實施例之態樣中，免疫球蛋白Fc區為含有兩種不同Fc多肽的雜二聚體Fc區，其能夠達成Fc雜二聚體中之兩種多肽的雜二聚體結合，諸如章節III.C.2.b中所述的任一者。在此類實施例中，CD3結合區之可變重鏈(VH)與可變輕鏈(VL)依雜二聚體Fc的相對鏈連接。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合，該重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列包含選自SEQ ID NO: 27、28、35-84、368、451-454及460之群的胺基酸序列。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列的組合，該重鏈可變區胺基酸序列選自以下之群：SEQ ID NO: 27、35-65、453、454及460，該輕鏈可變區胺基酸序列包含選自SEQ ID NO: 28、66-84、368、451及452之群的胺基酸序列。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合的Fv片段。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合的Fv片段，該重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列包含與選自由SEQ ID NO: 35-84、368、451-454及460組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的胺基酸序列。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合的Fv片段，該重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列包含選自由SEQ ID NO: 35-84、368、451-454及460組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合的Fv片段，該重鏈可變區胺基酸序列選自SEQ ID NO: 35-65、453、454及460之群，該輕鏈可變區胺基酸序列選自由SEQ ID NO: 66-84、368、451及452組成之群。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合的Fv片段，該重鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 35-65、453、454及460組成之群的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致，該輕鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 66-84、368、451及452組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為Fv或dsFv片段，其包括與選自由SEQ ID NO: 35-65、453、454及460組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的重鏈可變區胺基酸序列，及與選自由SEQ ID NO: 66-84或368、451及452組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的胺基酸序列。在一些實施例中，抗CD3結合域為Fv或dsFv，其含有包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，抗CD3結合域為Fv或dsFv，其含有包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 368之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合的Fv片段。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合的Fv片段，該重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列包含與選自由SEQ ID NO: 27、28、35-84、368、451-454、460組成之群的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的胺基酸序列。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域為包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合的Fv片段，該重鏈可變區胺基酸序列及輕鏈可變區胺基酸序列包含選自由SEQ ID NO: 27、28、35-84、368、451-454、460組成之群之胺基酸序列。在一些實施例中，抗CD3ε Fv抗體片段包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合，該重鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 27、35-65、453、454及460組成之群的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致，該輕鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 28、66-84、368、451及452組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致。在一些實施例中，抗CD3ε Fv抗體片段包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合，該重鏈可變區胺基酸序列選自SEQ ID NO: 27、35-65、453、454及460之群，該輕鏈可變區胺基酸序列選自由SEQ ID NO: 28、66-84、368、451及452組成之群。
在一些實施例中，抗CD3ε Fv抗體片段包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合，該重鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 27、35-46、48-50、453、454及460組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致，該輕鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 28、66、68-74、76、78、80、368、451及452組成之群的胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致。在一些實施例中，抗CD3ε Fv抗體片段包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合，該重鏈可變區胺基酸序列選自SEQ ID NO: 27、35-46、48-50、453、454及460之群，該輕鏈可變區胺基酸序列選自由SEQ ID NO: 28、66、68-74、76、78、80、451及452組成之群。
在一些實施例中，抗CD3ε Fv抗體片段包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合，該重鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 27、35-46、48-50、453、454及460組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致，該輕鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 28、66、68-74、76、78、80、368、451及452組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致。在一些實施例中，抗CD3ε Fv抗體片段包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合，該重鏈可變區胺基酸序列選自SEQ ID NO: 27、35-46、48-50、453、454及460之群，該輕鏈可變區胺基酸序列選自由SEQ ID NO: 28、66、68-74、76、78、80、368、451及452組成之群。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈(VH)。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 27之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈(VH)及胺基酸序列與SEQ ID NO: 28之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列的可變重鏈(VH)。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 27之胺基酸序列的可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 28之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 453之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈(VH)。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 451之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 453之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈(VH)及胺基酸序列與SEQ ID NO: 451之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 453之胺基酸序列的可變重鏈(VH)。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 451之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 453之胺基酸序列的可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 451之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。
在特定實施例中，Fv為經二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)，其中VH -VL 雜二聚體藉由鏈間二硫鍵穩定化。在一些實施例中，鏈間二硫鍵係藉由使VH及/或VL鏈之構架位置中的位置發生突變而經工程改造。在一些實施例中，依據Kabat編號，經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv包含44突變為Cys的抗CD3 VH及100突變為Cys的抗CD3 VL。舉例而言，在一些實施例中，VH鏈含有突變G44C且VL鏈含有突變G100C，各依據Kabat編號。在一些實施例中，依據Kabat編號，經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv包含位置105突變為Cys的抗CD3 VH及位置43突變為Cys的抗CD3 VL。
在一些實施例中，抗CD3ε Fv抗體片段包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合，該重鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 47、52-65、454或460組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致，該輕鏈可變區胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 67、75、77、79、81-84、368或452組成之群之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致。在任何一些此類實施例中，抗CD3 Fv為dsFv，其具有含有突變G44C的VH鏈及含有突變G100C的VL鏈，各依據kabat編號。在一些實施例中，抗CD3εFv抗體片段包括重鏈可變區胺基酸序列與輕鏈可變區胺基酸序列之組合，該重鏈可變區胺基酸序列選自SEQ ID NO: 47、52-65、454或460之群，該輕鏈可變區胺基酸序列選自由SEQ ID NO: 67、75、77、79、81-84、368或452組成之群。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 47之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈(VH)。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 75之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 47之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈(VH)及胺基酸序列與SEQ ID NO: 75之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈(VL)。在任何一些此類實施例中，抗CD3 Fv為dsFv，其具有含有突變G44C的VH鏈及含有突變G100C的VL鏈，各依據kabat編號。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的可變重鏈(VH)。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列的可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 75之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 454之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈(VH)。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 452之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 454之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈(VH)及胺基酸序列與SEQ ID NO: 452之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈(VL)。在任何一些此類實施例中，抗CD3 Fv為dsFv，其具有含有突變G44C的VH鏈及含有突變G100C的VL鏈，各依據kabat編號。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 454之胺基酸序列的可變重鏈(VH)。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 452之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 454之胺基酸序列的可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 452之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。
在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 460之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈(VH)。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 452之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括胺基酸序列與SEQ ID NO: 460之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變重鏈(VH)及胺基酸序列與SEQ ID NO: 452之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致的可變輕鏈(VL)。在任何一些此類實施例中，抗CD3 Fv為dsFv，其具有含有突變G44C的VH鏈及含有突變G100C的VL鏈，各依據kabat編號。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 460之胺基酸序列的可變重鏈(VH)。在一些實施例中，抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 452之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。在一些實施例中，其抗CD3ε結合域包括包含SEQ ID NO: 460之胺基酸序列的可變重鏈(VH)及包含SEQ ID NO: 452之胺基酸序列的可變輕鏈(VL)。d. 連接子
限制性多特異性多肽構築體含有連接子，該連接子使含有免疫球蛋白Fc區的第一組分與含有CD3結合區的第二組分連接或偶合。在一些實施例中，連接子定位於Fc區之C端區域的末端，使得Fc區位於CD3結合區的N端。應瞭解，由於所提供的限制性多特異性多肽構築體為多聚體，諸如含有第一與第二多肽的二聚體，該等多肽一起形成第一與第二組分，因此所提供的構築體包括使Fc部分與第一多肽之CD3結合區接合的連接子及使Fc部分與第二多肽之CD3結合區接合的連接子。在一些實施例中，第一多肽包括雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子，及CD3結合區之第一域(例如VH)，且第二多肽包括雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子及CD3結合區之第二域(例如VL)。典型地，存在於限制性多特異性多肽構築體之第一與第二多肽中的連接子相同。因此，在一些實施例中，CD3結合域之各域經由連接子(諸如相同連接子)連接至Fc (諸如雜二聚體Fc)之相對多肽。
用於融合蛋白中的各種多肽連接子已為人所知(參見例如Chen等人(2013) Adv. Drug. Deliv. 65:1357-1369；及國際PCT公開案第WO 2014/099997號、第WO2000/24884號；美國專利第5,258,498號；美國專利第5,525,491號；美國專利第5,525,491號、美國專利第6,132,992號)。
在一些實施例中，選擇連接子，使得當CD3結合區連接至多特異性多肽結合物之Fc區時，CD3結合區受到限制且在多特異性多肽構築體與細胞接觸後，不能或基本上不能與細胞(例如T細胞)表面上之CD3結合或接合。可以利用各種分析評估多特異性多肽構築體對CD3的結合或接合，包括評估以下的分析：T細胞結合、使用報導體系統的NFAT活化、溶胞性T細胞活性、細胞介素產生及/或T細胞活化標記之表現。例示性分析展示於所提供的實例中。典型地，連接子亦為確保多肽構築體正確摺疊的連接子，其不展現與所連接多肽之活性或功能不一致的電荷，或與阻礙或改變所連接多肽之活性之一或多個域中之胺基酸殘基形成鍵或其他相互作用。在一些實施例中，連接子為多肽連接子。多肽連接子可為柔性連接子或剛性連接子或兩者之組合。在一些態樣中，連接子為短、中或長連接子。在一些實施例中，連接子具有至多40個胺基酸的長度。在一些實施例中，連接子具有至多25個胺基酸之長度。在一些實施例中，連接子具有至少或至少約2個胺基酸之長度。在一些態樣中，適合長度為例如至少一個且典型地少於約40個胺基酸殘基的長度，諸如2-25個胺基酸殘基、5-20個胺基酸殘基、5-15個胺基酸殘基、8-12個胺基酸。在一些實施例中，連接子為或為約2至24個胺基酸、2至20個胺基酸、2至18個胺基酸、2至14個胺基酸、2至12個胺基酸、2至10個胺基酸、2至8個胺基酸、2至6個胺基酸、6至24個胺基酸、6至20個胺基酸、6至18個胺基酸、6至14個胺基酸、6至12個胺基酸、6至10個胺基酸、6至8個胺基酸、8至24個胺基酸、8至20個胺基酸、8至18個胺基酸、8至14個胺基酸、8至12個胺基酸、8至10個胺基酸、10至24個胺基酸、10至20個胺基酸、10至18個胺基酸、10至14個胺基酸、10至12個胺基酸、12至24個胺基酸、12至20個胺基酸、12至18個胺基酸、12至14個胺基酸、14至24個胺基酸、14至20個胺基酸、14至18個胺基酸、18至24個胺基酸、18至20個胺基酸或20至24個胺基酸。在一些實施例中，連接子具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸的長度。
在某些態樣中，連接子長度愈長，則當多特異性多肽結合物結合至其抗原(例如TAA)時，CD3結合愈大。因此，在一些態樣中，連接子具有大於12個胺基酸的長度，諸如大於13、14、15、16、17或18個胺基酸的長度。在一些實施例中，連接子之長度為12至40個胺基酸、12至30個胺基酸、12至24個胺基酸、12至18個胺基酸、12至15個胺基酸、15至40個胺基酸、15至30個胺基酸、15至24個胺基酸、15至18個胺基酸、18至40個胺基酸、18至30個胺基酸、18至24個胺基酸、24至40個胺基酸、24至30個胺基酸，或30至40個胺基酸。
連接子可為天然存在的連接子、合成的連接子或兩者之組合。特別適合的連接子多肽主要包括選自甘胺酸(Gly)、絲胺酸(Ser)、丙胺酸(Ala)及蘇胺酸(Thr)的胺基酸殘基。舉例而言，連接子可含有至少75% (基於存在於肽連接子中之殘基之總數計算)(諸如至少80%、至少85%或至少90%)的選自Gly、Ser、Ala及Thr之胺基酸殘基。連接子亦可由僅Gly、Ser、Ala及/或Thr殘基組成。在一些實施例中，連接子含有1-25個甘胺酸殘基、5-20個甘胺酸殘基、5-15個甘胺酸殘基或8-12個甘胺酸殘基。在一些態樣中，適合的肽連接子典型地含有至少50%甘胺酸殘基，諸如至少75%甘胺酸殘基。在一些實施例中，肽連接子僅包含甘胺酸殘基。在一些實施例中，肽連接子僅包含甘胺酸及絲胺酸殘基。
在一些實施例中，此等連接子主要由胺基酸甘胺酸及絲胺酸組成，在本文中表示為GS連接子。在一些實施例中，連接子含有(GGS)n，其中n為1至10，諸如1至5，例如1至3，諸如GGS(GGS)n (SEQ ID NO: 474)，其中n為0至10。在特定實施例中，連接子含有序列(GGGGS)n (SEQ ID NO: 123)，其中n為1至10或n為1至5，諸如1至3。在其他實施例中，連接子含有(GGGGGS)n (SEQ ID NO: 124)，其中n為1至4，諸如1至3。連接子可包括上述任一者之組合，諸如2、3、4或5個GS、GGS、GGGGS及/或GGGGGS連接子之重複可以組合。在一些實施例中，此類連接子具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19個胺基酸的長度。
在一些實施例中，連接子為(依單字母胺基酸代碼)：GGS、GGGGS (SEQ ID NO: 125)或GGGGGS (SEQ ID NO: 126)。在一些實施例中，GS連接子包含胺基酸序列GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)；GGGGGSGGGGGSGGGGGS，亦即(G5S)3 (SEQ ID NO: 127)；GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 129)及GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 128)。在一些實施例中，連接子為GGGG (SEQ ID NO: 5)。在一些上述實例中之任一例中，絲胺酸可經丙胺酸置換(例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala))。
在一些實施例中，連接子包括具有胺基酸序列Glyx Xaa-Glyy -Xaa-Glyz (SEQ ID NO: 130)的肽連接子，其中各Xaa獨立地選自丙胺酸(Ala)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、脯胺酸(Pro)、甘胺酸(Gly)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、酪胺酸(Tyr)、天冬醯胺(Asn)、麩醯胺酸(Gln)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天冬胺酸(Asp)及麩胺酸(Glu)，且其中x、y及z各為1-5範圍內的整數。在一些實施例中，各Xaa獨立地選自由Ser、Ala及Thr組成之群。在一個特定變化形式中，x、y及z中之每一者等於3 (藉此產生具有胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 131)的肽連接子，其中各Xaa如上所述選擇。
在一些實施例中，連接子為基於(SSSSG)y (SEQ ID NO: 132)模體之重複的富絲胺酸連接子，其中y為至少1，然而y可為2、3、4、5、6、7、8及9。
在一些情況下，可能需要向肽連接子提供一些剛性。此可藉由在肽連接子之胺基酸序列中包括脯胺酸殘基來實現。因此，在一些實施例中，連接子在肽連接子之胺基酸序列中包含至少一個脯胺酸殘基。舉例而言，肽連接子可以具有胺基酸序列，其中至少25% (例如至少50%或至少75%)之胺基酸殘基為脯胺酸殘基。在一個特定實施例中，肽連接子僅包含脯胺酸殘基。
在一些態樣中，肽連接子包含至少一個半胱胺酸殘基，諸如一個半胱胺酸殘基。舉例而言，在一些實施例中，連接子包含至少一個半胱胺酸殘基及選自由Gly、Ser、Ala及Thr組成之群的胺基酸殘基。在一些此類實施例中，連接子包含甘胺酸殘基及半胱胺酸殘基，諸如僅包含甘胺酸殘基及半胱胺酸殘基。典型地，每個肽連接子包括僅一個半胱胺酸殘基。包含半胱胺酸殘基之特定連接子的一個實例包括具有胺基酸序列Glym -Cys-Glyn 之肽連接子，其中n及m各為整數1-12，例如3-9、4-8或4-7。在一個特定變化形式中，此類肽連接子具有胺基酸序列GGGGG-C-GGGGG (SEQ ID NO: 133)。
在一些實施例中，融合蛋白中之連接子為結構化或限制性連接子。在特定實施例中，結構化連接子含有序列(AP)n或(EAAAK)n (SEQ ID NO: 134)，其中n為2至20，優選4至10，包括(但不限於) AS-(AP)n-GT (SEQ ID NO: 135)或AS-(EAAAK)n-GT (SEQ ID NO: 136)，其中n為2至20，諸如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。在其他實施例中，連接子包含序列(GGGGA)n (SEQ ID NO: 137)、(PGGGS)n (SEQ ID NO: 138)、(AGGGS)n (SEQ ID NO: 139)或GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS (SEQ ID NO: 140，其中n為2至20)、(ADAAP)n (SEQ ID NO: 527，其中n為2至20)、(ADAAP)n-G (SEQ ID NO: 528，其中n為2至20)、(GEPQG)n (SEQ ID NO: 529，其中n為2至20)、(GEPQG)n-G (SEQ ID NO: 530，其中n為2至20)、(AGGEP)n (SEQ ID NO: 531，其中n為2至20)、(AGGEP)n-G (SEQ ID NO: 532，其中n為2至20)、(AGSEP)n (SEQ ID NO: 533，其中n為2至20)、(AGSEP)n-G (SEQ ID NO: 534，其中為2至20)、(GGGEQ)n (SEQ ID NO: 535，其中n為2至20)，(GGGEQ)n-G (SEQ ID NO: 536，其中n為2至20)。在一些實施例中，連接子為SSSASASSA (SEQ ID NO: 141)、GSPGSPG (SEQ ID NO: 142)、ATTTGSSPGPT (SEQ ID NO: 143)、ADAAPADAAPG (SEQ ID NO: 537)、GEPQGGEPQGG (SEQ ID NO: 538)、AGGEPAGGEPG (SEQ ID NO: 539)、AGSEPAGSEPG (SEQ ID NO: 540)，或GGGEQGGGEQG (SEQ ID NO: 541)。在一些實施例中，此類連接子藉助於其結構可對蛋白水解降解更具抗性，藉此在活體內注射時提供優勢。在一些實施例中，此類連接子帶負電荷且可更適於抑制CD3結合域結合至CD3。在一些實施例中，連接子不為可裂解連接子，亦稱為不可裂解連接子。在一些實施例中，蛋白酶不能使連接子裂解。在一些實施例中，不為可裂解連接子或不可被蛋白酶裂解的連接子為對於活體內遞送或重組產生而言通常穩定的連接子。在一些態樣中，不可被蛋白酶裂解的連接子包括不含有至少一個肽鍵的彼等連接子，所述肽鍵較佳位於可裂解肽序列內或蛋白酶識別位點處。在特定實施例中，不可裂解連接子不為蛋白酶的目標受質，使得其相較於含有相同蛋白酶之受質識別位點的連接子優先或特異性地被蛋白酶裂解。
在一些實施例中，連接子不含有特定蛋白酶之受質識別位點或裂解位點，該位點為蛋白酶之活性位點所識別、被蛋白酶裂解的序列。典型地，例如，對於絲胺酸蛋白酶而言，裂解序列係由受質中之P1-P4及P1'-P4'胺基酸構成，其中裂解發生於P1位置之後。典型地，絲胺酸蛋白酶的裂解序列為長度與多種蛋白酶之擴展受質特異性匹配的六個殘基，但視蛋白酶而定可為較長或較短的。典型地，連接子不包括被蛋白酶識別的P1-P1'易裂鍵序列。在一些態樣中，不可裂解連接子或不含有被蛋白酶特異性識別裂解之受質識別位點的連接子為蛋白酶對其之裂解作用實質性小於蛋白酶之目標受質裂解作用的連接子。
在一些實施例中，連接子為可裂解連接子。在一些態樣中，可裂解連接子為進一步包括作為蛋白酶受質之序列(因存在至少一個可在生理條件下斷裂的鍵)的連接子，諸如上述任一者。在一些情況下，可裂解連接子容易在活體內存在的特定條件下發生裂解或對此裂解敏感，諸如在暴露於細胞外蛋白酶(包括活體內存在於細胞環境中的彼等蛋白酶)之後。在一些情況下，蛋白酶可以存在於特定生理學微環境(諸如腫瘤微環境)中，藉此限制裂解可能發生的位點。
蛋白酶典型地展現特定目標受質相較於另一種非目標受質之裂解特異性或偏好。此類特異性程度可基於序列(例如連接子)之裂解速率常數測定，該速率常數為蛋白酶針對其受質之偏好及酶效率的量度。測定在多種濃度之受質存在下裂解隨時間增加之速率的任何方法可以用於計算特異性常數。舉例而言，受質連接至螢光部分，該螢光部分在蛋白酶裂解後釋放。藉由測定不同蛋白酶濃度下的裂解速率，可測定特定蛋白酶針對特定連接子的特異性裂解常數(kcat /Km )。在一些實施例中，可裂解連接子為能夠被蛋白酶以至少約1×104 M− 1 S− 1 或至少5×104 M− 1 S、至少10×104 M− 1 S、至少10×105 M−1 S或更大之速率特異性裂解的連接子。
在一些實施例中，本發明之限制性多特異性多肽構築體包括連接第一及第二組分的可裂解連接子。在一些實施例中，可裂解連接子包括可以充當蛋白酶(通常為細胞外蛋白酶)之受質的胺基酸序列。舉例而言，可裂解連接子可包括含有至少一個肽鍵的裂解序列，該至少一個肽鍵較佳位於蛋白酶之可裂解肽序列內。適合蛋白酶包括例如基質金屬蛋白酶(MMP)、半胱胺酸蛋白酶、絲胺酸蛋白酶及纖維蛋白溶酶活化因子，其在諸如類風濕性關節炎或癌症之疾病中以增強的方式形成或活化，引起過度組織降解、發炎及轉移。在特定實施例中，蛋白酶為腫瘤、活化免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)或腫瘤微環境中之細胞產生的蛋白酶。在一些實施例中，蛋白酶為顆粒酶B、間質蛋白酶或MMP，諸如MMP-2。
可以基於與表現目標之細胞鄰近之腫瘤所產生的蛋白酶及/或與多特異性多肽構築體之所需目標共定域於組織中之腫瘤所產生的蛋白酶來選擇可裂解連接子。文獻中已報導在多種癌症(例如實體腫瘤)中具有已知受質之蛋白酶水準增加。參見例如La Rocca等人, (2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421。
在一些實施例中，連接限制性多特異性多肽構築體之第一與第二組分的可裂解連接子被蛋白酶裂解，該蛋白酶係由被該等組分之一活化的免疫效應細胞產生。舉例而言，涵蓋效應子致能或增強型IgG Fc區的多特異性多肽構築體能夠在與目標抗原接合時誘發ADCC。ADCC之關鍵之處為效應細胞(亦即NK細胞及細胞毒性T細胞)釋放顆粒酶B及穿孔蛋白。釋放後，顆粒酶B以其介導細胞凋亡的穿孔蛋白依賴性方式進入目標細胞。重要的是，顆粒酶B在效應細胞與目標細胞之間的細胞外突觸內具有活性。在一些實施例中，連接多特異性多肽構築體之第一與第二組分的可裂解連接子藉由顆粒酶B裂解。顆粒酶B在多特異性多肽構築體組分之一介導的效應細胞活化期間釋放。在一些實施例中，顆粒酶B及其他蛋白酶可由免疫效應細胞(包括活化T細胞或NK細胞)產生。在一些實施例中，多特異性多肽構築體結合TAA後，T細胞藉由CD3接合活化可釋放此類蛋白酶，此類蛋白酶接著可使特定可裂解連接子裂解，藉此增強或增加CD3結合分子接合CD3之活性。在一些實施例中，裂解可以擴增或增強多特異性構築體在以未裂解狀態結合至TAA時所達成的活性。
例示性受質包括(但不限於)可被以下酶或蛋白酶中之一或多者裂解的受質：ADAMS、ADAMTS，例如ADAM8；ADAM9；ADAM10；ADAM12；ADAM15；ADAM17/TACE；ADAMDEC1；ADAMTS1；ADAMTS4；ADAMTS5；天冬胺酸蛋白酶，例如BACE或腎素；天冬胺酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶D或組織蛋白酶E；凋亡蛋白酶，例如凋亡蛋白酶1、凋亡蛋白酶2、凋亡蛋白酶3、凋亡蛋白酶4、凋亡蛋白酶5、凋亡蛋白酶6、凋亡蛋白酶7、凋亡蛋白酶8、凋亡蛋白酶9、凋亡蛋白酶10或凋亡蛋白酶14；半胱胺酸組織蛋白酶，例如組織蛋白酶B、組織蛋白酶C、組織蛋白酶K、組織蛋白酶L、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V/L2、組織蛋白酶X/Z/P；半胱胺酸蛋白酶，例如克魯茲蛋白酶(Cruzipain)；豆莢蛋白(Legumain)；卵巢腫瘤去泛素化酶-2 (Otubain-2)；KLKs，例如KLK4、KLK5、KLK6、KLK7、KLK8、KLK10、KLK11、KLK13或KLK14；金屬蛋白酶，例如穿膜肽酶(Meprin)；腦啡肽酶(Neprilysin)；PSMA；BMP-1；MMPs，例如MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP8、MMP9、MMP10、MMP11、MMP12、MMP13、MMP14、MMP15、MMP16、MMP17、MMP19、MMP20、MMP23、MMP24、MMP26或MMP27；絲胺酸蛋白酶，例如活化蛋白C、組織蛋白酶A、組織蛋白酶G、凝乳酶、凝血因子蛋白酶(例如FVIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa)、彈性蛋白酶、顆粒酶B、胍基苯甲酸蛋白酶、HtrA1、人類嗜中性球彈性蛋白酶、乳鐵蛋白、通道活化蛋白酶(Marapsin)、NS3/4A、PACE4、纖維蛋白溶酶、PSA、tPA、凝血酶、類胰蛋白酶、uPA；第II型跨膜絲胺酸蛋白酶(TTSPs)，例如DESC1、DPP-4、FAP、第二型穿膜絲胺酸蛋白酶(Hepsin)、間質蛋白酶-2、間質蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3或TMPRSS4；及其任何組合。
在一些實施例中，可裂解連接子藉由多種蛋白酶裂解，例如2種或更多種蛋白酶、3種或更多種蛋白酶、4種或更多種蛋白酶等。
在一些實施例中，選擇可裂解連接子用於特定蛋白酶，例如已知由與表現目標之細胞鄰近之腫瘤產生的蛋白酶及/或由與多特異性多肽構築體之目標共定域之腫瘤產生的蛋白酶。
在一些實施例中，可裂解連接子含有受質識別位點或特定蛋白酶裂解位點，其為蛋白酶活性位點所識別、藉由蛋白酶裂解的序列。典型地，例如，對於絲胺酸蛋白酶而言，裂解序列係由受質中之P1-P4及P1'-P4'胺基酸構成，其中裂解發生於P1位置之後。典型地，絲胺酸蛋白酶的裂解序列為長度與多種蛋白酶之擴展受質特異性匹配的六個殘基，但視蛋白酶而定可為較長或較短的。典型地，可裂解連接子包括被蛋白酶識別的P1-P1'易裂鍵序列。在一些態樣中，可裂解連接子經工程改造以引入能夠被特定蛋白酶裂解的肽鍵，例如藉由引入受質識別位點序列或蛋白酶裂解序列。
在一些實施例中，可裂解連接子包括兩種或更多種受質序列之組合。在一些實施例中，各受質序列藉由相同蛋白酶裂解。在一些實施例中，至少兩種受質序列藉由不同蛋白酶裂解。在一些實施例中，可裂解連接子包含作為顆粒酶B受質的胺基酸。在一些實施例中，顆粒酶B可裂解連接子含有具有通式P4 P3 P2 P1↓P1'的胺基酸序列(SEQ ID NO: 144)，其中P4為胺基酸I、L、Y、M、F、V或A；P3為胺基酸A、G、S、V、E、D、Q、N或Y；P2為胺基酸H、P、A、V、G、S或T；P1為胺基酸D或E；且P1'為胺基酸I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A。在一些實施例中，顆粒酶B可裂解連接子含有具有通式P4 P3 P2 P1↓P1'的胺基酸序列(SEQ ID NO: 145)，其中P4為胺基酸I或L；P3為胺基酸E；P2為胺基酸P或A；P1為胺基酸D；且P1'為胺基酸I、V、T、S或G。
在一些實施例中，顆粒酶B受質包含胺基酸序列LEAD (SEQ ID NO: 146)、LEPD (SEQ ID NO: 147)或LEAE (SEQ ID NO: 148)。在一些實施例中，可裂解連接子含有胺基酸序列，可裂解連接子包含胺基酸序列IEPDI (SEQ ID NO: 149)、LEPDG (SEQ ID NO: 150)、LEADT (SEQ ID NO: 151)、IEPDG (SEQ ID NO: 152)、IEPDV (SEQ ID NO: 153)、IEPDS (SEQ ID NO: 154)、IEPDT (SEQ ID NO: 155)、IEPDP (SEQ ID NO: 471)或LEADG (SEQ ID NO: 144)。
在一些實施例中，可裂解連接子包含作為間質蛋白酶受質的胺基酸。在一些實施例中，可裂解連接子包含序列P1QAR↓(A/V)(SEQ ID NO: 156)，其中P1為任何胺基酸。在一些實施例中，可裂解連接子包含序列RQAR(A/V)(SEQ ID NO: 157)。在一些實施例中，間質蛋白酶受質包含胺基酸序列RQAR (SEQ ID NO: 158)。在一些實施例中，可裂解連接子包含胺基酸序列RQARV (SEQ ID NO: 159)。
在一些實施例中，可裂解連接子包含作為一或多種基質金屬蛋白酶(MMPs)之受質的胺基酸。在一些實施例中，MMP為MMP-2。在一些實施例中，可裂解連接子含有通式P3 P2 P1↓P1' (SEQ ID NO: 160)，其中P3為P、V或A；P2為Q或D；P1為A或N；且P1'為L、I或M。在一些實施例中，可裂解連接子含有通式P3 P2 P1↓P1' (SEQ ID NO: 161)，其中P3為P；P2為Q或D；P1為A或N；且P1'為L或I。在一些實施例中，MMP受質包含胺基酸序列PAGL (SEQ ID NO: 162)。
在一些實施例中，可裂解連接子包含作為顆粒酶B受質之胺基酸序列與作為間質蛋白酶受質之胺基酸序列之組合。在一些實施例中，可裂解連接子包含胺基酸序列LEAD (SEQ ID NO: 146)與胺基酸序列RQAR (SEQ ID NO: 158)之組合。
在一些實施例中，可裂解連接子包含作為顆粒酶B受質之胺基酸序列與作為MMP受質之胺基酸序列之組合。在一些實施例中，可裂解連接子包含胺基酸序列LEAD (SEQ ID NO: 146)與胺基酸序列PAGL (SEQ ID NO: 162)之組合。
在一些實施例中，可裂解連接子包含作為間質蛋白酶受質之胺基酸序列與作為MMP受質之胺基酸序列之組合。在一些實施例中，可裂解連接子包含胺基酸序列RQAR (SEQ ID NO: 158)與胺基酸序列PAGL (SEQ ID NO: 162)之組合。
在一些實施例中，可裂解連接子包含作為顆粒酶B受質之胺基酸序列、作為間質蛋白酶受質之胺基酸序列與作為MMP受質之胺基酸序列之組合。在一些實施例中，可裂解連接子包含作為顆粒酶B受質之胺基酸序列與作為MMP受質之胺基酸序列之組合。在一些實施例中，可裂解連接子包含胺基酸序列LEAD (SEQ ID NO: 146)、胺基酸序列RQAR (SEQ ID NO: 158)與胺基酸序列PAGL (SEQ ID NO: 162)之組合。
可裂解連接子可包括任何已知連接子。可裂解連接子之實例描述於Be'liveau等人(2009) FEBS Journal, 276；美國公開申請案第US20160194399號；第US20150079088號；第US20170204139號；第US20160289324號；第US20160122425號；第US20150087810號；第US20170081397號；美國專利第US9644016號。
在一些實施例中，可裂解連接子包含選自由以下組成之群之胺基酸序列：TGLEADGSPAGLGRQARVG (SEQ ID NO: 163)；TGLEADGSRQARVGPAGLG (SEQ ID NO: 164)；TGSPAGLEADGSRQARVGS (SEQ ID NO: 165)；TGPAGLGLEADGSRQARVG (SEQ ID NO: 166)；TGRQARVGLEADGSPAGLG (SEQ ID NO: 167)；TGSRQARVGPAGLEADGS (SEQ ID NO: 168)；及TGPAGLGSRQARVGLEADGS (SEQ ID NO: 169)；GPAGLGLEPDGSRQARVG (SEQ ID NO: 170)；GGSGGGGIEPDIGGSGGS (SEQ ID NO: 171)；GGSGGGGLEADTGGSGGS (SEQ ID NO: 172)；GSIEPDIGS (SEQ ID NO: 173)；GSLEADTGS (SEQ ID NO: 174)；GGSGGGGIEPDGGGSGGS (SEQ ID NO: 175)；GGSGGGGIEPDVGGSGGS (SEQ ID NO: 176)；GGSGGGGIEPDSGGSGGS (SEQ ID NO: 177)；GGSGGGGIEPDTGGSGGS (SEQ ID NO: 178)；GGGSLEPDGSGS (SEQ ID NO: 179)；及GPAGLGLEADGSRQARVG (SEQ ID NO: 180)、GGEGGGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 181)；GSSAGSEAGGSGQAGVGS (SEQ ID NO: 182)；GGSGGGGLEAEGSGGGGS (SEQ ID NO: 183)；GGSGGGGIEPDPGGSGGS(SEQ ID NO: 184)；TGGSGGGGIEPDIGGSGGS (SEQ ID NO: 185)。e. 共刺激結合域
本發明之多特異性多肽構築體包括結合共刺激受體的一或多個共刺激受體結合區(CRBR)。在一些實施例中，所提供多特異性多肽構築體之一或多個CRBR結合T細胞上所表現的共刺激受體。在一些實施例中，共刺激受體在活化T細胞之表面上受到上調、誘導或表現。在一些態樣中，CRBR結合共刺激受體且刺激共刺激受體。在一些實施例中，共刺激受體對多特異性多肽CRBR之促效性結合誘導T細胞之下游信號傳導，以在CD3接合之後強化或增強T細胞活化或功能。在一些實施例中，CRBR或CRBRs中之每一者獨立地為抗體或抗原結合片段、共刺激受體之天然同源結合搭配物、抗運載蛋白(經工程改造之脂質運載蛋白)、錨蛋白重複蛋白(Darpin)、菲諾體(Fynomer)、生替林(Centyrin)(經工程改造之纖維結合蛋白III域)、胱胺酸結點域、阿菲林(Affilin)、親和抗體或經工程改造之CH3域。
在一些實施例中，CRBR或CRBRs (諸如第一CRBR及第二CRBR)中之每一者獨立地包括抗體或其抗原結合片段之一或多個複本。在一些實施例中，CRBR或CRBRs (諸如第一抗原結合域及第二CRBR)中之每一者獨立地包括選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段的一或多個複本：Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。
在一些實施例中，CRBR或CRBRs (諸如第一CRBR及第二CRBR)中之每一者獨立地為單鏈抗體。在一些實例中，單鏈為scFv、scAb、單域重鏈抗體或單域輕鏈抗體。在一些實施例中，CRBR或CRBRs (諸如第一CRBR及第二CRBR)中之每一者獨立地為單鏈抗體。在一些實例中，單鏈為scFv、scAb、單域重鏈抗體或單域輕鏈抗體。
在一些實施例中，CRBR或CRBRs (諸如第一CRBR及第二CRBR)中之每一者獨立地包括一或多個單域抗體(sdAb)片段，例如VH H、VNAR 、經工程改造之VH 或VK 域。VH H可由天然駱駝科單獨重鏈抗體產生，由產生單獨重鏈抗體之經基因修飾之嚙齒動物產生，或初始/合成駱駝科或人類化駱駝科單域抗體文庫產生。VNAR 可由軟骨魚單獨重鏈抗體產生。已執行各種方法以利用習知的雜二聚體VH 及VK 域產生單體sdAb，包括界面工程改造及選擇特定生殖系家族。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體之CRBR或CRBRs (諸如第一CRBR及/或第二CRBR)中之每一者獨立地含有結合共刺激受體的至少一個sdAb或scFv。在一些實施例中，結合共刺激受體的至少一個scFv或sdAb定位於相對於Fc區的胺基端及/或相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區的羧基端。在一些實施例中，多特異性多肽構築體僅含有一個結合至共刺激受體、可定位於相對於Fc區之胺基端及/或相對於CD3結合區之羧基端的scFv或sdAb。在一些實施例中，多特異性多肽構築體含有結合至共刺激受體、定位於相對於Fc區之胺基端及/或相對於CD3結合區之羧基端的兩個scFv或sdAb。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體係由兩種多肽形成或包括兩種多肽，包括第一多肽，該第一多肽包含雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VH域，及結合至共刺激受體的scFv或sdAb；及第二多肽，該第二多肽包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VL域及視情況存在之結合至共刺激受體之另一相同或不同scFv或sdAb。結合共刺激受體的scFv或sdAb可定位於相對於雜二聚體Fc之Fc多肽的胺基端及/或相對於CD3結合區之VH或VL鏈的羧基端。多特異性多肽構築體之第一及/或第二多肽中的至少一者亦包括結合TAA或其鏈的抗原結合域，如章節II.4中所述。在一些實施例中，結合TAA的抗原結合域為scFv或sdAb且作為多特異性多肽構築體之第一及/或第二多肽的一部分包括在內。在一些實施例中，結合TAA的抗原結合域為Fab，且多特異性多肽構築體另外由第三多肽形成，其中至少第一與第二多肽包括結合TAA之Fab鏈(例如Fab之VH-CH1或VL-CL)且第三多肽含有結合TAA之Fab之另一鏈(例如Fab之另一VH-CH1或VL-CL)。
在一些實施例中，CRBR或CRBRs (諸如第一CRBR及/或第二CRBR)中之每一者獨立地含有超過一個鏈。在一些實施例中，多特異性多肽構築體之CRBR或CRBRs (諸如第一CRBR及/或第二CRBR)中之每一者獨立地含有組裝為FAB的VH及VL序列。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體之抗原結合域或各抗原結合域(諸如第一抗原結合域及/或第二抗原結合域)獨立地含有結合共刺激受體之Fab抗體的VH-CH1 (Fd)及VL-CL。在一些實施例中，含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL的Fab抗體定位於相對於Fc區的胺基端及/或相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區的羧基端。在一些實施例中，多特異性多肽構築體僅含有一個結合至共刺激受體、含有VH-CH1 (Fd)或VL-CL的Fab抗體，該Fab抗體可定位於相對於Fc區的胺基端及/或相對於CD3結合區的羧基端。在一些實施例中，多特異性多肽構築體含有結合至共刺激受體、各含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL的兩個Fab抗體片段，其中一者定位於相對於Fc區的胺基端且另一者定位於相對於CD3結合區的羧基端。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體係由三種或更多種多肽形成或包括三種或更多種多肽，包括第一多肽，該第一多肽包含雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子及結合至共刺激受體之Fab抗體片段的VH-CH1 (Fd)或VL-CL；第二多肽，該第二多肽包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子及視情況存在之結合至共刺激受體之Fab抗體片段的相同VH-CH1 (Fd)或VL-CL；及第三多肽，該第三多肽包含結合至共刺激受體之Fab抗體片段的VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者。多特異性多肽構築體之第一、第二及/或第三多肽亦可包括DLL3 VHH域，諸如所述任一者。
在一些實施例中，CRBR或CRBRs中之每一者獨立地為或包括共刺激受體之天然(原生)同源結合搭配物(例如天然配位體)，或對共刺激受體展現結合活性的其變異體。
在一些實施例中，所提供多特異性多肽構築體之一或多個CRBR結合T細胞上所表現的共刺激受體。在一些實施例中，超過一個CRBR結合至共刺激受體且CRBRs (諸如第一CRBR及第二CRBR)中之每一者結合相同共刺激受體。在一些實施例中，CRBRs (諸如第一CRBR及CRBRs)中之每一者結合不同共刺激受體。在一些實施例中，CRBRs (諸如第一CRBR及第二CRBR)中之每一者結合相同共刺激受體上之不同抗原決定基。在一些實施例中，CRBRs (諸如第一抗原-CRBR及CRBR)中之每一者結合相同共刺激受體上之相同抗原決定基。
在一些實施例中，CRBR或結合共刺激受體之CRBRs中之每一者獨立地對共刺激受體產生單價、二價、三價或四價結合。
在一些實施例中，共刺激受體表現於T細胞上，諸如獲自個體的初始T細胞。在一些實施例中，共刺激受體表現於人類T細胞上，諸如獲自人類個體的初始人類T細胞。
在一些實施例中，共刺激受體為腫瘤壞死因子(TNF)受體家族成員。在一些實施例中，共刺激受體為免疫球蛋白超家族(IgSF)成員。在一些實施例中，共刺激受體為B7受體家族成員。
在一些實施例中，共刺激受體選自由以下組成之群：41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化因子及CAML相互作用因子(TACI)，及NKG2D。在一些實施例中，共刺激受體係選自41BB、OX40、GITR、ICOS或CD28。在一些實施例中，共刺激受體係選自41BB、OX40或GITR。
在一些實施例中，共刺激受體為41BB。在一些實施例中，共刺激受體為OX40。在一些實施例中，共刺激受體為GITR。在一些實施例中，共刺激受體為ICOS。在一些實施例中，共刺激受體為CD28。
在一些實施例中，多特異性多肽之CRBR為或包含針對共刺激受體的促效性結合分子。CRBR可以結合至共刺激受體且起始、誘導或刺激與受體天然配位體所起始、誘導或刺激相似或相同的反應或活性。在一些態樣中，CRBR對共刺激受體的結合誘導或刺激的下游信號為受體天然配位體所起始、誘導或刺激之信號的大於5%、大於10%、大於20%、大於30%、大於40%、大於50%、大於60%、大於70%、大於80%、大於90%或大於100%。
在一些實施例中，一或多個CRBR為結合至共刺激受體41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)的抗體或其片段。在一些實施例中，一或多個CRBR為結合至共刺激受體41BB、OX40、GITR、ICOS或CD28的抗體或其片段。在一些實施例中，一或多個CRBR為結合至共刺激受體41BB、OX40或GITR的抗體或其片段。用於結合41BB、OX40及GITR的例示性多肽分別描述於PCT公開案第WO2017123650號、第WO2017123673號及第WO2017015623號中。在一些實施例中，一或多個CRBR為結合共刺激受體的單域抗體(sdAb)，諸如PCT公開案第WO2017123650號、第WO2017123673號及第WO2017015623號所述的彼等物。
在一些實例中，共刺激受體結合區(CRBR)結合或包含41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化因子及CAML相互作用因子(TACI)、NKG2D之天然同源結合搭配物。在一些實施例中，天然同源結合搭配物係選自41BB配位體(41BBL)、OX40L (CD252)、CD70、GITR配位體/TNFSF18、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、ICOS配位體(ICOSL)、CD154 (CD40L)、B細胞活化因子(BAFF)、A增殖誘導配位體(APRIL)、NKG2D配位體，或其功能片段。
在一些實施例中，共刺激受體結合區(CRBR)為結合41BB的抗體或抗原結合片段。在特定實例中，結合4-1BB的CRBR為單域抗體。在一些實施例中，sdAb含有CDR1 GFSFSINAMG (SEQ ID NO: 457中所示)、CDR2 AIESGRNTV (SEQ ID NO: 458中所示)及CDR3 LKGNRVVSPSVAY (SEQ ID NO: 459中所示)。靶向41BB之sdAb之實例描述於PCT公開案第WO2017123650號中。
CRBRs之例示性序列闡述於表 4 中。
在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地結合共刺激受體41BB。在一些實例中，CRBR為或含有特異性針對或結合41BB的抗體或抗原結合片段，諸如含有VH及VL的sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地為41BB之天然配位體或為其功能結合片段。例示性結合41BB的CRBR闡述於SEQ ID NO: 186-210及470中之任一者中。在一些實施例中，結合41BB之CRBR為含有胞外域之41BB配位體(41BBL)的功能片段或其截短部分，諸如對應於UniProt第P41273號之胺基酸50-254，例如SEQ ID NO: 186中所示，或SEQ ID NO: 202-209中之任一者中所示的截短部分或其片段。在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地為SEQ ID NO: 193-201中之任一者中所示的抗運載蛋白。在一些實施例中，sdAb (諸如VHH)含有分別具有SEQ ID NO: 457、458及459中所示之序列的CDR1、CDR2及CDR3。結合41BB之CRBR (諸如sdAb)可包括SEQ ID NO: 210中所示之序列。結合41BB之CRBR (諸如sdAb)可包括SEQ ID NO: 470中所示之序列。在一些實施例中，4-1BB結合域含有具有VH及VL之抗原結合抗體片段，諸如其中VH與VL被連接子分隔的單鏈片段，例如scFv。在一些實施例中，結合41BB之CRBR含有SEQ ID NO: 187、189及191中之任一者中所示的VH，及SEQ ID NO: 188、190或192中之任一者中所示的VL。所提供多特異性多肽構築體中的CRBRs或各CRBR獨立地可與前述SEQ ID Nos中之任一者具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合41BB。
在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地結合共刺激受體OX40。在一些實例中，CRBR為或含有特異性針對或結合OX40之抗體或抗原結合片段，諸如含有VH及VL之sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地為OX40之天然配位體或為其功能結合片段。此類結合OX40之例示性CRBRs闡述於SEQ ID NO: 211-220中之任一者中。在一些實施例中，結合OX40之CRBR含有SEQ ID NO: 216及218中之任一者中所示的VH，及SEQ ID NO: 217及219中之任一者中所示的VL。所提供多特異性多肽構築體中的CRBRs或各CRBR獨立地可與前述SEQ ID Nos中之任一者具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合OX40。
在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地結合共刺激受體GITR。在一些實例中，CRBR為或含有特異性針對或結合GITR的抗體或抗原結合片段，諸如含有VH及VL的sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地為GITR之天然配位體或為其功能結合片段。此類結合GITR之例示性CRBRs闡述於SEQ ID NO: 221-230中之任一者中。在一些實施例中，結合GITR之CRBR含有SEQ ID NO: 222、224、226及228中之任一者中所示的VH及SEQ ID NO: 223、225、227及229中之任一者中所示的VL。所提供多特異性多肽構築體中的CRBRs或各CRBR獨立地可與前述SEQ ID Nos中之任一者具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合GITR。
在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地結合共刺激受體CD27。在一些實例中，CRBR為或含有特異性針對至結合CD27的抗體或抗原結合片段，諸如含有VH及VL的sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地為CD27之天然配位體或為其功能結合片段。此類結合CD27之例示性CRBRs闡述於SEQ ID NO: 231中之任一者中。在一些實施例中，結合CD27之CRBR含有SEQ ID NO: 232中所示之VH及SEQ ID NO: 233中所示之VL。所提供多特異性多肽構築體中的CRBRs或各CRBR獨立地可與前述SEQ ID Nos中之任一者具有至少85%、85%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合CD27。
在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地結合共刺激受體ICOS。在一些實例中，CRBR為或含有特異性針對或結合ICOS的抗體或抗原結合片段，諸如含有VH及VL之sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地為ICOS之天然配位體或為其功能結合片段。結合ICOS之例示性CRBR序列闡述於SEQ ID NO: 234中。
在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地結合共刺激受體CD28。在一些實例中，CRBR為或含有特異性針對或結合CD28的抗體或抗原結合片段，諸如含有VH及VL之sdAb或片段(例如scFv)。在一些實施例中，至少一個CRBR或各CRBR獨立地為CD28之天然配位體或為其功能結合片段。結合CD28之例示性CRBR序列闡述於SEQ ID NO: 235中。
表4 ： 例示性CRBR 序列
CRBR 形式 參考文獻 SEQ ID NO
結合41BB 之CRBR 序列
41BBL 天然配位體 UniProt寄存編號P41273 186
PF-05082566 VH US 2012/0237498  (SEQ ID NO: 43) 187
VL US 2012/0237498  (SEQ ID NO: 45) 188
BMS663513 VH WO 2005/035584  (SEQ ID NO: 9) 189
VL WO 2005/035584  (SEQ ID NO: 6) 190
MSB7 VH US 2017/0226215 (SEQ ID NO: 138) 191
VL US 2017/0226215 (SEQ ID NO: 28) 192
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 12) 193
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 13) 194
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 14) 195
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 15) 196
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 16) 197
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 17) 198
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 18) 199
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 SEQ ID NO: 19) 200
41BB抗運載蛋白 抗運載蛋白 WO 2016/177762 (SEQ ID NO: 20) 201
人類41BBL之71-254 41BB配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 3) 202
人類41BBL之85-254 41BB配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 4) 203
人類41BBL之80-254 41BB配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 5) 204
人類41BBL之52-254 41BB配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 6) 205
人類41BBL之71-248 41BB配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 7) 206
人類41BBL之85-248 41BB配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 8) 207
人類41BBL之80-248 41BB配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 9) 208
人類41BBL之52-248 41BB配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 10) 209
41BB sdAb sdAb US 2017/0198050 210
41BB sdAb sdAb    470
結合OX40 之CRBR 序列
OX40配位體 天然配位體 UniProt寄存編號P23510 211
OX40配位體 天然配位體 US 7,959,925 (SEQ ID NO: 2) 212
人類OX40L: 51-183 天然配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 11) 213
人類Ox40L: 51-183 N90D 天然配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 12) 214
人類OX40L: 52-183 天然配位體 WO 2017/167672 (SEQ ID NO: 13) 215
1A07 VH US 2015/0307617 (SEQ ID NO: 56) 216
VL US 2015/0307617 (SEQ ID NO: 59) 217
1949 VH WO 2016/179517 (SEQ ID NO: 16) 218
VL WO 2016/179517 219
1D10v1 sdAb US 9,006,399 220
結合GITR 之CRBR 序列
GITR配位體 天然配位體 UniProt編號Q9UNG2 221
36E5 VH US 2014/0348841 (SEQ ID NO: 104) 222
VL US 2014/0348841 (SEQ ID NO: 105) 223
TRX-518 VH US 2013/0183321 (SEQ ID NO: 54) 224
VL US 2013/0183321 (SEQ ID NO: 44) 225
5H7v2 VH US 2015/0064204 (SEQ ID NO: 282) 226
VL US 2015/0064204 (SEQ ID NO: 134) 227
41G5v2 VH US 2015/0064204 (SEQ ID NO: 312) 228
VL US 2015/0064204 (SEQ ID NO: 124) 229
C06v3 sdAb US 2017/0022284   (SEQ ID NO: 59) 230
結合CD27 之CRBR 序列
CD70-ECD 天然配位體 UniProt編號P32970 231
1F5 VH US 2011/0274685 232
VL US 2011/0274685 233
結合CD28 之CRBR 序列
CD28 sdAb sdAb    235
結合ICOS 之CRBR 序列
ICOS sdAb sdAb    234
在一些實施例中，一或多個CRBR直接地或間接地經由連接子連接至Fc區及/或CD3結合區。在一些實施例中，連接係經由連接子達成。在一些實施例中，連接子為連接肽(LP)，其可包括如本文所述之任何柔性或剛性連接子，但連接CRBR或區域的肽通常不為可裂解連接子。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體包含CRBR與Fc區之間的連接肽(LP)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體包含CD3結合區與CRBR之間的連接肽(LP)。f . 抑制性受體結合區 ( IRBR )
本發明之多特異性多肽構築體包括結合抑制性受體的一或多個抑制受體結合區(IRBR)。在一些實施例中，所提供多特異性多肽構築體中的一或多個IRBR結合T細胞上所表現的抑制性受體。在一些實施例中，抑制性受體在活化T細胞之表面上受到上調、誘導或表現。在一些態樣中，IRBR阻斷抑制性受體與其配位體之間的相互作用，藉此減少、抑制或降低IRBR所結合之細胞(例如T細胞)中的抑制信號。在一些實施例中，IRBR或IRBRs中之每一者獨立地為抗體或抗原結合片段、抑制性受體之天然同源結合搭配物、抗運載蛋白(經工程改造之脂質運載蛋白)、錨蛋白重複蛋白、菲諾體、生替林(經工程改造之纖維結合蛋白III域)、胱胺酸結點域、阿菲林、親和抗體或經工程改造之CH3域。
在一些實施例中，IRBR或IRBRs (諸如第一IRBR及第二IRBR)中之每一者獨立地包括抗體或其抗原結合片段之一或多個複本。在一些實施例中，IRBR或IRBRs (諸如第一IRBR及第二IRBR)中之每一者獨立地包括選自由以下組成之群之抗體或其抗原結合片段的一或多個複本：Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體，及單域輕鏈抗體。
在一些實施例中，IRBR或IRBRs (諸如第一IRBR及第二IRBR)中之每一者獨立地為單鏈抗體。在一些實例中，單鏈為scFv、scAb、單域重鏈抗體或單域輕鏈抗體。
在一些實施例中，IRBR或IRBRs (諸如第一IRBR及第二IRBR)中之每一者獨立地包括一或多個單域抗體(sdAb)片段，例如VHH、VNAR、經工程改造之VH或VK域。VHH可由天然駱駝科單獨重鏈抗體產生，由產生單獨重鏈抗體之經基因修飾之嚙齒動物產生，或初始/合成駱駝科或人類化駱駝科單域抗體文庫產生。VNAR可由軟骨魚單獨重鏈抗體產生。已執行各種方法以利用習知的雜二聚體VH及VK域產生單體sdAb，包括界面工程改造及選擇特定生殖系家族。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體中的IRBR或IRBRs (諸如第一IRBR及/或第二IRBR)中之每一者獨立地含有至少一個結合抑制性受體的sdAb或scFv。在一些實施例中，至少一個結合抑制性受體的scFv或sdAb定位於相對於Fc區的胺基端及/或相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區的羧基端。在一些實施例中，多特異性多肽構築體僅含有一個結合至抑制性受體的scFv或sdAb，其可定位於相對於Fc區的胺基端及/或相對於CD3結合區的羧基端。在一些實施例中，多特異性多肽構築體含有結合至抑制性受體、定位於相對於Fc區之胺基端及/或相對於CD3結合區之羧基端的兩個scFv或sdAb。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體由兩種多肽形成或包括兩種多肽，包括第一多肽，該第一多肽包含雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VH域，及結合至抑制性受體的scFv或sdAb；及第二多肽，該第二多肽包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VL域，及視情況存在之結合至抑制性受體的另一相同或不同scFv或sdAb。結合抑制性受體的scFv或sdAb可定位於相對於雜二聚體Fc之Fc多肽的胺基端及/或相對於CD3結合區之VH或VL鏈的羧基端。多特異性多肽構築體之第一及/或第二多肽中的至少一者亦包括結合TAA或其鏈的抗原結合域，如章節II.4中所述。在一些實施例中，結合TAA的抗原結合域為scFv或sdAb且作為多特異性多肽構築體之第一及/或第二多肽的一部分包括在內。在一些實施例中，結合TAA的抗原結合域為Fab，且多特異性多肽構築體另外由第三多肽形成，其中至少第一與第二多肽包括結合TAA之Fab鏈(例如Fab之VH-CH1或VL-CL)且第三多肽含有結合TAA之Fab之另一鏈(例如Fab之另一VH-CH1或VL-CL)。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體由兩種多肽形成或包括兩種多肽，包括第一多肽，該第一多肽依序包含：特異性針對TAA的第一抗原結合域、雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VH域，及特異性針對TAA的第二抗原結合域；以及第二多肽，該第二多肽含有IRBR且依序包含：雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VL域，其中IRBR定位於Fc區的胺基端及/或CD3結合區的C端。在一些實施例中，IRBR定位於第二多肽上之CD3結合區的羧基端。在一些實施例中，IRBR定位於第二多肽上之Fc區的胺基端。在一些實施例中，IRBR定位於Fc區的胺基端及CD3結合區的C端。在一些實施例中，特異性針對TAA的第一與第二抗原結合域相同。在一些實施例中，特異性針對TAA的第一與第二抗原結合域不同。在一些實施例中，第一抗原結合域及第二抗原結合域結合不同TAA。在一些實施例中，第一抗原結合域及第二抗原結合域結合相同TAA之不同或不重疊抗原決定基且/或競爭結合至相同TAA。
在一些實施例中，IRBR或IRBRs (諸如第一IRBR及/或第二IRBR)中之每一者獨立地含有超過一個鏈。在一些實施例中，多特異性多肽構築體中之IRBR或IRBRs (諸如第一IRBR及/或第二IRBR)中之每一者獨立地含有組裝為FAB的VH及VL序列。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體中的抗原結合域或抗原結合域(諸如第一抗原結合域及/或第二抗原結合域)中之每一者獨立地含有結合抑制性受體之Fab抗體的VH-CH1 (Fd)及VL-CL。在一些實施例中，含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL的Fab抗體定位於相對於Fc區的胺基端及/或相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區的羧基端。在一些實施例中，多特異性多肽構築體僅含有一個結合至抑制性受體、含有VH-CH1 (Fd)或VL-CL的Fab抗體，該Fab抗體可定位於相對於Fc區的胺基端及/或相對於CD3結合區的羧基端。在一些實施例中，多特異性多肽構築體含有結合至抑制性受體、各含有VH-CH1 (Fd)及VL-CL的兩個Fab抗體片段，其中一者定位於相對於Fc區的胺基端且另一者定位於相對於CD3結合區的羧基端。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體係由三種或更多種多肽形成或包括三種或更多種多肽，包括第一多肽，該第一多肽包含雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子，及結合至抑制性受體之Fab抗體片段的VH-CH1 (Fd)或VL-CL；第二多肽，該第二多肽包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子及視情況存在之結合至抑制性受體之Fab抗體片段的相同VH-CH1 (Fd)或VL-CL；及第三多肽，該第三多肽包含結合至抑制性受體之Fab抗體片段的VH-CH1 (Fd)或VL-CL中之另一者。多特異性多肽構築體中的第一、第二及/或第三多肽亦可包括結合TAA的抗原結合域或其鏈，如章節II.4中所述。在一些實施例中，結合TAA的抗原結合域為scFv或sdAb且作為多特異性多肽構築體之第一及/或第二多肽的一部分包括在內。在一些實施例中，結合TAA的抗原結合域為Fab，且多特異性多肽構築體另外由第四多肽形成，其中至少第一與第二多肽包括結合TAA之Fab的鏈(例如Fab之VH-CH1或VL-CL)且第四多肽含有結合TAA之Fab的另一鏈(例如Fab之另一VH-CH1或VL-CL)。
在一些實施例中，IRBR或IRBRs中之每一者獨立地為或包括抑制性受體之天然(原生)同源結合搭配物(例如天然配位體)，或對抑制性受體展現結合活性的其變異體。
在一些實施例中，所提供多特異性多肽構築體中的一或多個IRBR結合T細胞上所表現的抑制性受體。在一些實施例中，存在超過一個結合至抑制性受體的IRBR且IRBRs (諸如第一IRBR及第二IRBR)中之每一者結合相同共刺激受體。在一些實施例中，IRBRs (諸如第一IRBR及第二IRBR)中之每一者結合不同抑制性受體。在一些實施例中，IRBRs (諸如第一IRBR及第二IRBR)中之每一者結合相同抑制性受體上之不同抗原決定基。在一些實施例中，IRBRs (諸如第一IRBR及第二IRBR)中之每一者結合相同抑制性受體上的相同抗原決定基。
在一些實施例中，結合抑制性受體的IRBR或IRBRs中之每一者獨立地對抑制性受體產生單價、二價、三價或四價結合。
在一些實施例中，抑制性受體表現於T細胞上，諸如個體之初始T細胞上。在一些實施例中，抑制性受體表現於人類T細胞上，諸如人類個體之初始人類T細胞。
在一些實施例中，抑制性受體為腫瘤壞死因子(TNF)受體家族成員。在一些實施例中，抑制性受體為免疫球蛋白超家族(IgSF)成員。
在一些實施例中，抑制性受體為程式化細胞死亡蛋白1 (PD-1)、細胞毒性T淋巴球相關蛋白4 (CTLA-4)、具有Ig及ITIM域的T細胞免疫受體(TIGIT)、T細胞活化之免疫球蛋白抑制因子V域(VISTA)、含有T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域之分子-3 (TIM3)，或淋巴球活化基因3 (LAG3)。在一些實施例中，一或多個IRBR為結合至抑制性受體PD-1、CTLA-4、TIGIT、VISTA、TIM3或LAG3的抗體或其片段。在特定實施例中，抗體或抗原結合片段為人類化的或為人類抗體或抗原結合片段。
在一些實例中，抑制性受體結合區(IRBR)結合或包含PD-1、CTLA-4、TIGIT、VISTA或TIM3之天然同源結合搭配物。在一些實施例中，天然同源結合搭配物係選自PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、CD155、CD112或VSIG-3/IGSF11，或其功能片段。
在一些實例中，IRBR含有抗體片段，諸如scFv，該抗體片段含有結合抑制性受體(諸如PD-1、CTLA-4、TIGIT、VISTA或TIM3)之抗體的可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)。在一些實例中，IRBR含有特異性結合抑制性受體(諸如PD-1、CTLA-4、TIGIT、VISTA或TIM3)的單域抗體或VHH域，參見例如PCT公開案第WO2018068695號或第WO2018068201號中所述。
在一些實施例中，抑制性受體為PD-1。在一些實施例中，一或多個IRBR為結合至PD-1的抗體片段。
在一些實施例中，IRBR為或含有結合PD-1的VHH域，該VHH域包含VHH胺基酸序列中所含之CDR1、CDR2及CDR3，該VHH胺基酸序列選自SEQ ID NO: 417-433、439、489-506中之任一者，或與選自SEQ ID NO: 417-433、439、489-506中之任一者的VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合PD-1的胺基酸序列。
在一些實施例中，IRBR為或含有VHH域，該VHH域含有SEQ ID NO: 439或與SEQ ID NO: 439中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3且結合PD-1。在一些實施例中，IRBR為或含有VHH域，該VHH域具有SEQ ID NO: 439中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 439中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合PD-1的胺基酸序列。在一些實施例中，IRBR為或含有VHH域，該VHH域為SEQ ID NO: 439中所示之胺基酸序列的人類化變異體。
在一些實施例中，結合PD-1的IRBR具有VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO: 434、435或436中之任一者中所示之CDR1、SEQ ID NO: 437中所示之CDR2及SEQ ID NO: 438中所示之CDR3。
在一些實施例中，結合PD-1的IRBR具有VHH域，該VHH域含有SEQ ID NO: 435、437及438中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，結合PD-1的IRBR具有VHH域，該VHH域含有SEQ ID NO: 434、437及438中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，結合PD-1的IRBR具有VHH域，該VHH域含有SEQ ID NO: 436、437及438中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。
在一些態樣中，IRBR為或含有VHH域，該VHH域含有VHH胺基酸序列中所含之CDR1、CDR2及CDR3，該VHH胺基酸序列選自SEQ ID NO: 417-433中之任一者或與選自SEQ ID NO: 417-433中之任一者之VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合PD-1的胺基酸序列。
在一些情況下，IRBR含有作為人類化變異體的VHH域，其具有SEQ ID NO: 417-433中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 417-433中之任一者之VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合PD-1的胺基酸序列。在一些實施例中，IRBR為或含有VHH域序列，其為具有SEQ ID NO: 417-433中之任一者中所示之胺基酸序列的人類化VHH域。
在一些實施例中，IRBR為或含有VHH域，該VHH域含有SEQ ID NO: 489或與SEQ ID NO: 489中所示之所選VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列中所示之VHH域中所含的CDR1、CDR2、CDR3且結合PD-1。在一些實施例中，IRBR為或含有VHH域，該VHH域具有SEQ ID NO: 489中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 489中所示之所選胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合PD-1的胺基酸序列。在一些實施例中，IRBR為或含有VHH域，該VHH域為SEQ ID NO: 489中所示之胺基酸序列的人類化變異體。
在一些實施例中，結合PD-1的IRBR具有VHH域，該VHH域包含SEQ ID NO: 434、435或436中之任一者中所示之CDR1、SEQ ID NO: 437中所示之CDR2及SEQ ID NO: 438中所示之CDR3。
在一些實施例中，結合PD-1的IRBR具有VHH域，該VHH域含有SEQ ID NO: 435、437及438中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，結合PD-1的IRBR具有VHH域，該VHH域含有SEQ ID NO: 434、437及438中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。在一些實施例中，結合PD-1的IRBR具有VHH域，該VHH域含有SEQ ID NO: 436、437及438中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3。
在一些態樣中，IRBR為或含有VHH域，該VHH域含有VHH胺基酸序列中所含之CDR1、CDR2及CDR3，該VHH胺基酸序列選自SEQ ID NO: 490-506中之任一者，或與選自SEQ ID NO: 490-506中之任一者之VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合PD-1的胺基酸序列。
在一些情況下，IRBR含有作為人類化變異體的VHH域，其具有SEQ ID NO: 490-506中之任一者中所示之胺基酸序列或與選自SEQ ID NO: 490-506中之任一者之VHH區胺基酸具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且結合PD-1的胺基酸序列。在一些實施例中，IRBR為或含有VHH域序列，其為具有SEQ ID NO: 490-506中之任一者中所示之胺基酸序列的人類化VHH域。
在一些實施例中，一或多個IRBR直接地或間接地經由連接子連接至Fc區及/或CD3結合區。在一些實施例中，連接係經由連接子達成。在一些實施例中，連接子為連接肽(LP)，其可包括如諸如章節II.3所述之任何柔性或剛性連接子，但連接IRBR或區域的肽通常不為可裂解連接子。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體包含IRBR與Fc區之間的連接肽(LP)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體包含CD3結合區與IRBR之間的連接肽(LP)。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體包含超過一個IRBR。在一些實施例中，多特異性多肽構築體包含第一IRBR與Fc區之間的第一連接肽(LP1)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體包含CD3結合區與第二IRBR之間的第二連接肽(LP2)。在一些實施例中，多特異性多肽構築體包含第一IRBR與Fc區之間的第一連接肽(LP1)及CD3結合區與第二CRBR之間的第二連接肽(LP2)。在一些態樣中，多特異性多肽構築體自N端至C端具有如下結構排列：IRBR及/或抗原結合域-LP1-Fc區-連接子-CD3結合區-LP2-IRBR及/或抗原結合域。在一些實施例中，兩種連接肽彼此不相同。
在一些實施例中，LP (例如LP1或LP2)獨立地為具有約1至20個胺基酸長度的肽。在一些實施例中，LP1或LP2獨立地為肽，該肽為或包含SEQ ID NO: 1-4、125-127、129中所示之任何Gly-Ser連接子或GGS。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體含有CRBR與IRBR。在一些實施例中，CRBR或IRBR之一定位於相對於Fc區的胺基端且CRBR或IRBR中之另一者定位於相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區的羧基端。在一些實施例中，CRBR及IRBR存在於雜二聚體多特異性多肽構築體之不同多肽上，其中至少一種多肽亦含有至少一個特異性針對TAA的抗原結合域。在一些實施例中，CRBR及IRBR存在於雜二聚體多特異性多肽構築體之同一多肽(第一多肽)上且特異性針對TAA之至少一個抗原結合域位於雜二聚體多特異性多肽構築體之另一(或第二)多肽上。
在一些實施例中，多特異性多肽構築體係由兩種多肽形成或包括兩種多肽。在一些態樣中，第一多肽依序包含：特異性針對TAA的第一抗原結合域、雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VH域，及特異性針對TAA的第二抗原結合域；且第二多肽依序包含：IRBR或CRBR之一、雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段(例如Fv)之VL域，及IRBR或CRBR中之另一者。在一些實施例中，IRBR定位於第二多肽之CD3結合區的羧基端且CRBR定位於第二多肽之Fc區的胺基端。在一些實施例中，IRBR定位於第二多肽之Fc區的胺基端且CRBR定位於第二多肽之CD3結合區的羧基端。在一些實施例中，特異性針對TAA的第一與第二抗原結合域相同。在一些實施例中，特異性針對TAA的第一與第二抗原結合域不同。在一些實施例中，第一抗原結合域及第二抗原結合域結合不同TAA。在一些實施例中，第一抗原結合域及第二抗原結合域結合相同TAA之不同或不重疊抗原決定基且/或競爭結合至相同TAA。 3 . NK 募集
在一些實施例中，DLL3結合多肽為雙特異性構築體，其為或包含本文所提供之至少一個DLL3 VHH域及至少一種其他結合分子，該其他結合分子能夠結合至自然殺手(NK)細胞及/或募集NK細胞上所表現的表面分子。在特定態樣中，多特異性構築體對DLL3及NK細胞表面分子具有雙特異性。在一些實施例中，表面分子為CD16 (FcγRIII)。特定言之，所提供的雙特異性DLL3結合多肽能夠特異性結合人類NK細胞上所表現的NK活化受體，諸如人類CD16a。
CD16 (對已知涉及抗體依賴性細胞毒性(ADCC)之一些IgG之Fc部分的低親和力受體)為經充分表徵的膜受體，其負責觸發NK細胞對目標細胞的溶解(Mandelboim等人, 1999, PNAS 96:5640-5644)。一般而言，大部分(約90%)人類NK細胞以低密度(CD56dim)表現CD56且以高水準表現FcγRIII (CD16)(Cooper等人, 2001, Trends免疫學. 22:633-640)。人類FcγRIII以兩種同功異型物存在：CD16a (FcγRIIIA)及CD16b (FcγRIIIB)，其與其細胞外免疫球蛋白結合區共有96%序列一致性(van de Winkel及Capel, 1993, Immunol. Today 14(5):215-221)。在特定實施例中，其他結合分子能夠特異性結合CD16a。
CD16a作為跨膜受體表現於巨噬細胞、肥大細胞及NK細胞上。在NK細胞上，CD16a的α鏈與含有基於免疫受體酪胺酸之活化模體(ITAM)的FcεRI γ鏈及/或T細胞受體(TCR)/CD3ζ鏈結合以介導信號傳導(Wirthmueller等人, 1992, J. Exp. Med. 175:1381-1390)。已在NK細胞中觀測到CD16a與γ及ζ鏈之均二聚體及雜二聚體之不同組合的相互作用，表明能夠經由不同信號傳導路徑、經由CD16a複合物之變化形式介導NK細胞中的信號傳導(Anderson等人, 1990, PNAS 87(6):2274-2278；Ackerly等人, 1992, Int. J. Cancer增刊7:11-14)。表現FcγR的效應細胞已展示與經由ADCC摧毀腫瘤細胞有關。舉例而言，CD16a與諸如能夠特異性結合CD16a之促效結合分子的接合可以引起表現CD16a之NK細胞活化，藉此誘發生物反應，特定而言，信號傳導反應。在一些情況下，結合分子能夠藉助於其對此類細胞的結合、以類似於抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的方式觸發細胞殺死。
在特定實例中，DLL3結合多肽包括可以特異性結合至DLL3及CD16a的雙特異性分子，其可以使NK細胞靶向攜帶此類抗原的細胞，使得攜帶抗原的細胞可以經由NK細胞介導的細胞殺死加以根除。舉例而言，特異性結合腫瘤細胞上所表現之DLL3的結合分子可以使NK細胞靶向腫瘤細胞。在一些情況下，結合分子結合至CD16a而引起的NK細胞活化可使得腫瘤細胞被殺死。
在一些實施例中，特異性針對活化NK細胞受體(諸如CD16a)的其他結合域為選自以下之抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2 片段、Fv片段、scFv、經二硫鍵穩定之Fv片段(dsFv)、scAb、dAb、單域重鏈抗體(VHH)，或單域輕鏈抗體。在一些實施例中，其他結合域就結合活化T NK細胞受體(諸如CD16a)而言為單價的。
在一些情況下，其他結合域識別CD16a。在一些實施例中，抗CD16a結合域包括抗CD16a Fab片段、抗CD16a F(ab')2 片段、抗CD16a Fv片段、抗CD16a scFv、抗CD16a dsFv、抗CD16a scAb、抗CD16a dAb、抗CD16a單域重鏈抗體(VHH)及抗CD16a單域輕鏈抗體之一或多個複本。在一些實施例中，抗CD16a結合域就結合CD16a而言為單價的。在一些實施例中，BH73結合多肽為結合BH73且促效CD16a活性之雙特異性構築體。
特異性針對CD16a之抗體及其抗原結合片段已為人所知且包括例如NM3E2 (McCall等人(1999) Mol. Immunol., 36:433-045。其他抗CD16a抗體亦可以用於本文所提供之構築體中，包括已公開之美國專利申請案第US10160280795號；美國專利第9,701,750號；Behar等人(2008) Protein Eng Des Sel.21:1-10；Arndt等人, (1999) Blood 94:2562-2568中所述的任一者。在特定實例中，抗CD16a為抗CD16a scFv。在一些實施例中，抗CD16a為TandAb分子中所包括的抗CD16a抗體(參見例如Reush等人(2014) Mabs, 6:727-738)。在一些態樣中，抗CD16a為抗CD16a或抗原結合片段，諸如scFv，如美國專利第9,035,026號所述。
所提供之雙特異性構築體可格式化呈多種形式中之任一者，其含有至少一個DLL3 VHH域及特異性針對活化NK細胞受體的至少一種其他域，諸如CD16a結合域。
在一個實施例中，雙特異性構築體為雙特異性單域抗體連接Fab (S-Fab)，其含有直接地或間接地連接至特異性針對NK細胞活化受體(例如CD16a)之Fab抗原結合片段(諸如抗CD16a Fab)的至少一個所述DLL3 VHH域。在一些實施例中，DLL3 VHH域連接至抗C16a Fab之VH或VL鏈之C端。在一些實施例中，S-Fab可進一步加以修飾，諸如藉由與聚乙二醇(PEG)、N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺(HPMA)共聚物、蛋白質(諸如白蛋白)、聚麩胺酸結合或血漿半衰期延長(Pan等人, (2018) International Jounral of Nanomedicine, 2018:3189-3201)。
在另一個實施例中，雙特異性構築體為scFv-單域抗體，其中構築體含有直接地或間接地連接至scFv的至少一個所述DLL3 VHH，該scFv含有特異性針對NK細胞活化受體(例如CD16a)之抗原結合域的VH及VL。針對NK細胞活化受體的scFv (例如抗CD16a scFv)可含有所述VH及VL序列中之任一者。在一些實施例中，VHH域及scFv藉由連接子(諸如肽連接子)連接。在一些實施例中，肽連接子可為如本文所述的肽連接子。在一些實施例中，VHH域及scFv各自連接至Fc區，諸如Fc區之N端，視情況經由鉸鏈區或連接子(例如肽連接子)連接。Fc區可為本文所述的任一者，諸如人類Fc區或其變異體，例如人類IgG1 Fc區或其變異體。在特定實施例中，Fc區係由變異型Fc域(例如變異型人類IgG1域)形成，該等Fc域發生突變或經修飾以促進雜二聚化，其中不同多肽可二聚而產生雜二聚體。
在另一實施例中，特異性針對NK細胞活化受體(例如CD16a)的抗原結合域為單域抗體，諸如特異性結合至CD16a的VHH域。單域抗體(包括結合至CD16a的VHH域)已為人所知，參見例如已公開的美國專利申請案第US20160280795號。在此類態樣中，本文提供之雙特異性構築體可包括至少一個DLL3 VHH域及至少一個CD16a VHH域。為將構築體格式化，在一些情況下，各VHH域連接至Fc區，諸如Fc區之N端，視情況經由鉸鏈區或連接子(例如肽連接子)連接。Fc區可為本文所述的任一者，諸如人類Fc區或其變異體，例如人類IgG1 Fc區或其變異體。在特定實施例中，Fc區係由變異型Fc域(例如變異型人類IgG1域)形成，該等Fc域發生突變或經修飾以促進雜二聚化，其中不同多肽可二聚而產生雜二聚體。
在上述實施例中，為了促進雜二聚而對Fc區進行的例示性修飾已為人所知，包括如下文所述的任一者，例如表3。在一些實施例中，雜二聚體Fc中之一種Fc多肽包含SEQ ID NO: 103、107、115、117、440或446中之任一者中所示的胺基酸序列，且雜二聚體Fc中之另一種Fc多肽含有SEQ ID NO: 104、108、111、113、119、121、441、444或448中之任一者中所示的胺基酸序列。在一些實施例中，雜二聚體Fc中之一種Fc多肽包含SEQ ID NO: 105、109、116、118、442或447中之任一者中所示的胺基酸序列，且雜二聚體Fc中之另一種Fc多肽包含SEQ ID NO: 106、110、112、114、120、122、443、445或449中之任一者中所示的胺基酸序列。 4. 細胞介素融合體及 / 或細胞介素受體目標
在一些實施例中，DLL3結合多肽為多特異性多肽構築體，其為細胞介素-抗體融合蛋白(亦稱為DLL3 VHH-細胞介素融合體)。在一些態樣中，本文所提供之至少一個DLL3 VHH域直接地或間接地連接至至少一種細胞介素，諸如干擾素。在特定實施例中，細胞介素為能夠展現抗增殖活性、細胞凋亡活性及/或抗病毒活性的干擾素。在一些實施例中，本文所提供之DLL3 VHH-細胞介素融合體中的干擾素能夠結合至由IFNAR1及/或2構成的受體。可使用多種分析中之任一者評估此類融合蛋白結合IFNAR1及/或2、減少或降低癌細胞之生長速率及/或增殖速率、減小腫瘤尺寸、消除腫瘤或誘導癌細胞死亡(例如經由細胞凋亡)的作用。此類分析包括使用已知表現DLL3之各種癌細胞株進行的活體外分析或使用動物腫瘤模型進行的活體內分析。
在一些實施例中，干擾素為第I型干擾素，諸如人類第I型干擾素或其變異體。在一些態樣中，人類第I型干擾素為變異體，其為截短的人類第I型干擾素或人類突變型第I型干擾素。在一些實施例中，第I型干擾素或其變異體為野生型人類IFN-α(IFN-α；α2及天然較高親和力變異體，諸如α14)、干擾素β(IFN-β)以及其突變體及/或截短形式。在一些實施例中，干擾素為第II型干擾素，諸如人類第II型干擾素或其變異體。在一些態樣中，人類第II型干擾素為變異體，其為截短的人類第II型干擾素或人類突變型第II型干擾素。在一些實施例中，第II型干擾素或其變異體為野生型人類干擾素γ(IFN-γ)以及其突變體及/或截短形式。在一些實施例中，所提供的細胞介素-抗體融合蛋白可用於抑制表現或過度表現DLL3之目標細胞(例如癌細胞)的生長及/或增殖。
在一些實施例中，DLL3 VHH-細胞介素融合蛋白的形式類似於如以下文獻中所述的任一者：國際PCT公開申請案第WO2014194100號、美國專利第9,803,021號；Valedkarimi等人(2017) Biomed Pharmacother., 95:731-742；或Young等人(2014) Semin Oncol., 41:623-636。
在特定實施例中，干擾素(例如第I型干擾素，諸如人類第I型干擾素(例如IFN-α、IFN-β或IFN-γ))為具有原生或野生型干擾素之內源結合親和力及/或活性的干擾素，該內源結合親和力及/或活性較佳處於原生野生型干擾素(其分離形式)之至少60%或至少或至少約80%的水準，諸如至少90%、95%、98%、99%、100%或大於原生野生型干擾素的水準。
干擾素及干擾素突變體為一組熟知且經充分表徵的細胞介素(參見例如WO 2002/095067；WO 2002/079249；WO 2002/101048；WO 2002/095067；WO 2002/083733；WO 2002/086156；WO 2002/083733；WO 2003/000896；WO 2002/101048；WO 2002/079249；WO 2003/000896；WO 2004/022593；WO2004/022747；WO 2003/023032；WO 2004/022593以及Kim等人(2003) Cancer Lett. 189(2): 183-188；Hussain等人(2000) J. Interferon Cytokine Res. 20(9): 763-768；Hussain等人(1998) J. Interferon Cytokine Res. 18(7): 469-477；Nyman等人(1988) Biochem. J. 329 (Pt 2): 295-302；Golovleva等人(1997) J. Interferon Cytokine Res. 17(10): 637-645；Hussain等人(1997) J. Interferon Cytokine Res. 17(9): 559-566；Golovleva等人(1997) Hum. Hered. 47(4): 185-188；Kita等人(1991) J. Interferon Cytokine Res. 17(3): 135-140；Golovleva等人(1996) Am. J. Hum. Genet. 59(3): 570-578；Hussain等人(1996) J. Interferon Cytokine Res. 16(7): 523-529；Linge等人(1995) Biochim Biophys Acta。此類之任一者可以用於所提供的細胞介素-抗體融合蛋白。
在一些實施例中，干擾素為人類第I型干擾素。人類干擾素基因/蛋白質家族之對偶基因已為人所知，參見例如Pestka (10983) Arch Biochem Biophys., 221:1-37；Diaz等人(1994) Genomics, 22:540-52；Pestka (1986) Meth. Enzymol, 199: 3-4；及Krause等人(2000) J. Biol. Chem., 275:22995-3004。
在一些實施例中，干擾素為全長IFN-α(例如人類IFN-α)、全長IFN-β(例如人類IFN-β)或全長IFN-γ(例如人類IFN-γ)。在一些實施例中，干擾素為具有生物活性的截短IFN-α(例如人類IFN-α)、具有生物活性的截短IFN-β(例如人類IFN-β)或具有生物活性的截短IFN-γ(例如人類IFN-γ)。在一些實施例中，具有生物活性的截短干擾素含有在N端及/或C端截短的野生型或原生干擾素之連續胺基酸序列，且長度為原生或野生型干擾素長度的至少或至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或更多。可以使用多種標準分析中之任一者評估干擾素生物活性。舉例而言，可藉由量測針對特定測試病毒之抗病毒活性來分析IFN-α活性。用於分析IFN-α活性的套組可市購(參見例如Neutekbio, Ireland的ILITE™ alphabeta套組)。在一些態樣中，IFN-α為IFN-a2a (例如Acc.第CAA23805號)、IFN-a-c (Acc.第P01566號)、IFN-a-d (Acc.第AAB59403號)；IFNa-5 (Acc.第CAA26702號)；IFNa-6 (Acc.第AA26704號)；IFNa-4 (Acc.第NP_066546號)；IFNa-4b (Acc.第CAA26701號)；IFNa -I (Acc.第AAA52725號)；IFNa-J (Acc.第CAA23792號)；IFNa-H (Acc.第CAA23794號)；IFNa-F (Acc.第AAA52718號)；IFNa-7 (Acc.第CAA26903號)，或為其生物學活性片段。在一些態樣中，IFN-β為Acc.第AAC41702號中所示之IFN-β或為其生物學活性片段。在一些態樣中，IFN-γ為Acc.第P01579號中所示之IFN-γ或為其生物學活性片段。
在一些實施例中，預期所提供之DLL3 VHH-細胞介素融合體含有變異型或突變型干擾素α2 (IFNa2)。某些突變體包括位置57之His及/或位置58之E及/或位置61之Q的突變。在某些實施例中，突變體包括突變H57Y及/或E58N及/或Q61S。在某些實施例中，突變體包括突變的IFNa2，其具有突變H57Y、E58N及Q61S (YNS)(參見例如Kalie等人(2007) J. Biol. Chem., 282: 11602-11611)。在其他實施例中，突變體包括位置57之His及/或位置58之E及/或位置61之Q向A (丙胺酸)的突變。在某些實施例中，突變體包括突變的IFNa2，其具有突變H57A、E58A及Q61A (HEQ)(參見例如Jaitin等人(2006) Mo/.Cellular Biol, 26(5): 1888-1897)。在某些實施例中，突變型干擾素包含位置57之His向A、Y或M的突變，及/或位置58之E向A或N或D或L的突變，及/或位置61之Q向A或S或L或D的突變。在某些實施例中，突變體包括干擾素α8 (IFN-a8)突變體，諸如胺基酸置換對應於以下的變異體：R145置換為V、I或L及/或A146置換為N或S及/或M149置換為Y，例如R145V/A146N/M149Y)、R145I/A146S/M149Y或R145L/A146S/M149Y(參見例如Yamamoto等人,. (2009) J. Interferon & cytokine Res, 29: 161-170。
在一些實施例中，所提供的DLL3 VHH-細胞介素融合體含有突變型或變異型IFN-β，其在胺基酸17含有取代天然存在之半胱胺酸的絲胺酸(參見例如Hawkins等人(1985) Cancer Res., 45, 5914-5920)。
在一些實施例中，所提供的DLL3 VHH-細胞介素融合體含有截短的干擾素。在一個實施例中，截短的干擾素包括缺失至多為前15個胺基端胺基酸殘基及/或缺失至多為最後10-13個羧基端胺基酸殘基的人類IFN-α，其已展示保持原生或野生型人類IFN-α之活性(參見例如Ackerman (1984) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 81: 1045-1047)。在一些實施例中，截短的人類IFN-α有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13個羧基端胺基酸殘基缺失及/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基端胺基酸殘基缺失。
在一些實施例中，所提供的DLL3 VHH-細胞介素融合體含有截短的干擾素，諸如已公開之美國專利申請案第US2009/0025106號中所述。在一些實施例中，所提供的DLL3 VHH-細胞介素融合體含有截短的IFN-γ，該截短的IFN-γ含有N端及/或C端缺失，諸如Lundell等人(1991) Protein Neg., 4:335-341；Pan等人(1987, Eur. J. Biochem., 166:145-149)；WO所述。
在一些實施例中，干擾素(例如人類干擾素)為突變型干擾素，該突變型干擾素相較於未修飾(典型地為野生型)之蛋白質對蛋白分解具有抗性，參見例如美國專利第7,998,469號；美國專利第8,052,964號；美國專利第4,832,959號；美國專利第6,120,762號；WO1992/008737；及EP219781。
在所提供之DLL3 VHH-細胞介素融合蛋白的態樣中，抗體與細胞介素(例如干擾素)直接連接或經由連接子(諸如肽連接子)間接連接。可以連接至VHH域之N端或C端，只要該連接不干擾抗體對DLL3的結合。可以使用本文所述的任何連接子，例如肽連接子。在一些實施例中，連接子為包含選自由以下組成之群之胺基酸序列的GS連接子：GGSGGS，亦即(GGS)2 (SEQ ID NO: 1)；GGSGGSGGS，亦即(GGS)3 (SEQ ID NO: 2)；GGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)4 (SEQ ID NO: 3)；及GGSGGSGGSGGSGGS，亦即(GGS)5 (SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，連接子為包含甘胺酸殘基的柔性連接子，作為非限制性實例，諸如GG、GGG、GGGG (SEQ ID NO: 5)、GGGGG (SEQ ID NO: 6)及GGGGGG (SEQ ID NO: 7)。在一些實施例中，融合蛋白可包括GS連接子與甘胺酸連接子之組合。D . 嵌合受體及經工程改造之細胞
本文提供具有胞外域的嵌合抗原受體(CAR)，該胞外域包含本文所提供之一或多個DLL3 VHH域，諸如本文所提供之任一DLL3 VHH域序列。本文提供的CAR構築體包括胞外域，該胞外域含有一或多個DLL3 VHH、跨膜域及胞內信號傳導區。形成CAR之抗原結合單元的一或多個DLL3 VHH域以足夠親和力「結合」或「能夠結合」(亦即靶向)DLL3，使得CAR適用於療法中靶向表現DLL3的細胞或組織。
CAR為合成受體，其典型地含有與單一融合分子中之一或多個信號傳導域結合且表現於細胞(諸如T細胞)表面上的細胞外靶向/結合部分。因此，CAR將抗原特異性與T細胞活化特性組合於單一融合分子中。第一代CAR典型地包括CD3ζ或Fc l受體γ鏈之細胞質區作為其信號傳導域。已在對卵巢癌、腎癌、淋巴瘤及神經母細胞瘤患者之I期臨床研究中測試第一代CAR，其在該等患者中已誘發適度反應(評述於Sadelain等人,Curr Opin Immunol,21(2):215-223, 2009中)。第二代CAR含有共刺激分子之信號傳導域(諸如CD28及CD3ζ)，其提供雙重信號傳導來引導組合之活化與共刺激信號。第三代CAR更為複雜，其具有三個或更多個信號傳導域(評述於Sadelain等人, Cancer Discovery (3) 388-398, 2013及Dotti等人, Immuno. Rev, 257 (1), 1-36, 2014)。
在一些實施例中，所提供的CAR含有至少一個抗原結合域，該抗原結合域包含靶向或能夠特異性結合DLL3的DLL3 VHH域。在一些實施例中，CAR含有靶向一或多種抗原的至少兩個抗原結合域(其中至少一者包含DLL3 VHH域)。在一個實施例中，CAR之抗原結合域包含特異性針對DLL3的兩個或至少兩個DLL3 VHH域，從而提供二價結合分子。在一個實施例中，抗原結合域包含特異性針對DLL3、但結合至該抗原上之不同抗原決定基的兩個或至少兩個DLL3 VHH域。在此類情況下，抗原結合域包含結合至DLL3之第一抗原決定基的第一DLL3 VHH域及結合至DLL3之第二抗原決定基的第二VHH域。抗原決定基可為重疊抗原決定基。因此，在一些實施例中，抗原結合域為雙互補位抗原結合域且CAR為雙互補位CAR。在又另一個實施例中，抗原結合域包含特異性針對DLL3且結合至DLL3上之相同抗原決定基的兩個DLL3 VHH域。
本文提供之CAR的跨膜域為一種結構域，其典型地穿越質膜或能夠穿越或跨越質膜且直接地或間接地(例如經由間隔子，諸如免疫球蛋白鉸鏈序列)連接至細胞外抗原結合域及含有胞內信號傳導域的內質網部分。在一個實施例中，CAR之跨膜域為跨膜蛋白(例如第I型跨膜蛋白)之跨膜區、人工疏水性序列或其組合。在一個實施例中，跨膜域包含CD3ζ域或CD28跨膜域。其他跨膜域對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的，且可結合本文提供之CAR之實施例使用。
本文提供之CAR之胞內信號傳導區含有一或多個胞內信號傳導域，在CAR之抗原結合域接合後，諸如在結合抗原後，該等胞內信號傳導域將信號傳遞至T細胞。在一些實施例中，胞內區域含有胞內信號傳導域，該胞內信號傳導域為或含有ITAM信號傳導域。例示性胞內信號傳導域包括例如衍生自以下的信號傳導域：T細胞受體複合物之ζ鏈或其任一同源物(例如η鏈、FcsRIy及β鏈、MB 1 (Iga)鏈、B29 (Ig)鏈等)、人類CD3ζ鏈、CD3多肽(Δ、δ及ε)、syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP 70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)及涉及T細胞轉導的其他分子，諸如CD2、CD5、OX40及CD28。在特定實施例中，胞內信號傳導區含有衍生自人類CD3ξ鏈的胞內信號傳導域。
在一些實施例中，胞內域包含CD3-ζ信號傳導域。在一些實施例中，CD3-ζ信號傳導域包含SEQ ID NO: 236中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 236展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大序列一致性且保持T細胞信號傳導活性之胺基酸序列。
在一些實施例中，CAR之胞內信號傳導區可以進一步含有衍生自共刺激分子的胞內信號傳導域。在此類實例中，在抗原特異性接合後，此類信號傳導域可以增強CAR-T細胞活性，諸如經由增強記憶細胞之增殖、存活及/或發育來增強CAR-T細胞活性，例如相較於僅含有含ITAM之信號傳導域(例如CD3ξ)的CAR。在一些實施例中，共刺激域為功能信號傳導域，其獲自選自以下的蛋白質：CD28、CD137 (4-IBB)、CD134 (OX40)、DapIO、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1 (CD1 la/CD18)、Lck、TNFR-I、TNFR-II、Fas、CD30、CD40或其組合。在特定實施例中，共刺激信號傳導域衍生自或獲自人類蛋白質。在一些態樣中，共刺激信號傳導域衍生自或獲自人類CD28或人類CD137 (4-IBB)。
在一些實施例中，共刺激信號傳導域衍生自CD28或4-1BB且包含SEQ ID NO: 237-240中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 237-240展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更多序列一致性且保持T細胞共刺激信號傳導活性的胺基酸序列。
在特定實施例中，CAR進一步包含連接細胞外抗原結合域與跨膜域的鉸鏈或間隔區。此鉸鏈或間隔區可用於達成所得CAR之不同長度及柔性。可使用之鉸鏈或間隔區之實例包括(但不限於)抗體之Fc片段或其片段或衍生物、抗體之鉸鏈區或其片段或衍生物、抗體之CH 2區、抗體之CH 3區、人工間隔序列(例如肽序列)或其組合。其他鉸鏈或間隔區對於熟習此項技術者而言將為顯而易見的且可使用。在一實施例中，鉸鏈為lgG4鉸鏈或CD8A鉸鏈。
在一些實施例中，間隔子及跨膜域為衍生自CD8的鉸鏈及跨膜域，諸如具有SEQ ID NO: 241-243中所示之例示性序列或與SEQ ID NO: 241-243展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多序列一致性的胺基酸序列。
本文亦提供一種分離之核酸構築體，其包含至少一種編碼如本文所提供之CAR之核酸。在一些態樣中，構築體為用於在細胞中表現CAR之表現載體。表現載體可為病毒載體。病毒載體技術在此項技術中已熟知且描述於例如Sambrook等人(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 2013)。已開發出用於將基因轉移至哺乳動物細胞中的多種基於病毒之系統。舉例而言，使用逆轉錄病毒，諸如腺病毒載體。在一個實施例中，使用慢病毒載體。
在另一態樣中，亦提供包含一或多種如上所述之核酸構築體的經分離細胞或細胞群。亦提供一種已經基因修飾以表現本文所提供之CAR的經分離細胞或細胞群。因此，本文提供經基因工程改造之細胞，其包含本文所提供之CAR，諸如穩定表現本文所提供之CAR。在一個實施例中，細胞係選自由以下組成之群：T細胞、自然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、調節性T細胞、造血幹細胞及/或多能胚胎/誘導幹細胞。在一些情況下，細胞為T細胞，諸如CD4及/或CD8 T細胞。在一些實施例中，細胞為個體自體細胞。舉例而言，在一些實施例中，可自患者分離出T細胞(亦稱為初始T細胞)，以便用CAR核酸構築體進行工程改造，例如轉染或轉導。
在一個例示性實例中，初始T細胞可以離體純化(CD4細胞或CD8細胞或兩者)且用TCR/CD28促效劑(諸如抗CD3/抗CD28塗佈的珠粒)刺激。2或3天活化過程後，編碼CAR之重組表現載體可經由標準慢病毒或逆轉錄病毒轉導方案或質體電穿孔策略穩定引入初始T細胞中。可以監測細胞的CAR表現，例如藉由流動式細胞測量術、使用抗抗原決定基標籤或與原生親本分子交叉反應的抗體來監測。表現CAR之T細胞可視應用而定，經由用抗抗原決定基標籤抗體分選來富集或針對高或低表現而富集。
可以藉由多種方式分析CAR工程化T細胞的適當功能。在一些情況下，可以利用活體外細胞毒性、增殖或細胞介素分析(例如IFN-γ表現)來評估經工程改造之T細胞之功能。例示性標準終點為腫瘤株系之溶解百分比、經工程改造之T細胞之增殖，或培養上清液中之IFN-γ蛋白質表現。在一些情況下，可以評估在刺激CAR (例如經由抗原)後刺激T細胞活化的能力，諸如藉由監測活化標記物(諸如CD69、CD44或CD62L)之表現、增殖及/或細胞介素產生來評估。
本文亦提供用於預防及/或治療個體之疾病或病狀(諸如癌症)的方法，包括向個體投與包含本文提供之CAR的經工程改造之細胞。一般而言，個體之疾病或病狀需要以醫藥學活性量之細胞及/或本發明醫藥組合物治療。IV. 多肽表現及產生
提供包含聚核苷酸的核酸分子，該等聚核苷酸編碼所提供之sdAb及DLL3結合多肽中之任一者。在一些實施例中，所提供之核酸序列且特定言之DNA序列編碼如本文所提供之融合蛋白。在任一前述實施例中，核酸分子亦可編碼導引DLL3結合多肽分泌的前導序列，該前導序列典型地以其不存在於所分泌之多肽中的方式裂解。前導序列可為原生重鏈(或VHH)前導序列，或可為另一種異源前導序列。
核酸分子可使用此項技術中習知之重組DNA技術構築。在一些實施例中，核酸分子為適於在所選宿主細胞中表現的表現載體。
提供包含核酸的載體，該等核酸編碼本文所述之DLL3結合多肽。此類載體包括(但不限於) DNA載體、噬菌體載體、病毒載體、逆轉錄病毒載體等。在一些實施例中，選擇使多肽在所需細胞類型(諸如CHO或CHO衍生細胞)中或在NSO細胞中之表現最佳化的載體。例示性此類載體描述於例如Running Deer等人,Biotechnol. Prog . 20:880-889 (2004)。
特定言之，使用編碼所需DLL3結合多肽(諸如融合蛋白)之DNA載體可以有助於製備本文所述之DLL3結合多肽的方法及獲得顯著數量。可以將DNA序列插入適當表達載體中，亦即含有轉錄及轉譯所插入之蛋白編碼序列必要之元件的載體。可以利用多種宿主-載體系統表現蛋白編碼序列。此等系統包括感染病毒(例如痘瘡病毒、腺病毒等)的哺乳動物細胞系統；感染病毒(例如桿狀病毒)的昆蟲細胞系統；含有酵母載體的微生物，諸如酵母，或經細菌噬菌體DNA、質體DNA或黏質體DNA轉型的細菌。視所用宿主-載體系統而定，可使用多種適合的轉錄及轉譯元件中之任一者。
本發明亦提供藉由在引起多肽表現之條件下培養細胞來產生DLL3結合多肽的方法，其中細胞包含編碼本文所述之DLL3結合多肽的經分離之核酸分子，及/或包括此等經分離之核酸序列的載體。
在一些實施例中，DLL3結合多肽可表現於原核細胞中，諸如細菌細胞；或表現於真核細胞中，諸如真菌細胞(諸如酵母)、植物細胞、昆蟲細胞及哺乳動物細胞。此類表現可例如根據此項技術中已知之程序來進行。可用於表現多肽的例示性真核細胞包括(但不限於) COS細胞，包括COS 7細胞；293細胞，包括293-6E細胞；CHO細胞，包括CHO-S、DG44. Lec13 CHO細胞，及FUT8 CHO細胞；PER. C6® 細胞(Crucell)；及NSO細胞。在一些實施例中，DLL3結合多肽可表現於酵母中。參見例如美國公開案第US 2006/0270045 A1號。在一些實施例中，特定的真核宿主細胞係基於其對多肽產生所需轉譯後修飾的能力來選擇。舉例而言，在一些實施例中，CHO細胞產生多肽，該等多肽的唾液酸化程度高於293細胞中所產生之相同多肽。
向所需宿主細胞中引入一或多種核酸(諸如載體)可藉由任何方法來實現，包括(但不限於)磷酸鈣轉染、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、陽離子脂質介導之轉染、電穿孔、轉導、感染等。非限制性例示性方法描述於例如Sambrook等人, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第3版, Cold Spring Harbor Press (2001)中。核酸可根據任何適合方法短暫或穩定轉染於所要宿主細胞中。
亦提供包含本文所述之任何核酸或載體之宿主細胞。在一些實施例中，提供表現本文所述之DLL3結合多肽的宿主細胞。可藉由任何適合方法來純化宿主細胞中表現之DLL3結合多肽。此類方法包括(但不限於)使用親和基質或疏水性相互作用層析。適合的親和性配位體包括ROR1 ECD及結合Fc區之藥劑。舉例而言，蛋白質A、蛋白質G、蛋白質A/G或抗體親和管柱可用於結合Fc區及純化包含Fc區之DLL3結合多肽。疏水相互作用層析，例如丁基或苯基管柱，亦可適用於純化一些多肽，諸如抗體。離子交換層析(例如陰離子交換層析及/或陽離子交換層析)亦適用於純化一些多肽，諸如抗體。混合模式層析(例如逆相/陰離子交換、逆相/陽離子交換、親水相互作用/陰離子交換、親水相互作用/陽離子交換等)亦可適用於純化一些多肽，諸如抗體。此項技術中已知多種用於純化多肽之方法。
在一些實施例中，在無細胞系統中產生DLL3結合多肽。非限制性例示性無細胞系統描述於例如Sitaraman等人,Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009)；Spirin,Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004)；Endo等人,Biotechnol. Adv . 21: 695-713 (2003)。
在一些實施例中，提供藉由上述方法製備之DLL3結合多肽。在一些實施例中，在宿主細胞中製備DLL3結合多肽。在一些實施例中，在無細胞系統中製備DLL3結合多肽。在一些實施例中，DLL3結合多肽經純化。在一些實施例中，提供包含DLL3結合多肽的細胞培養基。
在一些實施例中，提供包含藉由上述方法製備之抗體之組合物。在一些實施例中，組合物包含宿主細胞中所製備的DLL3結合多肽。在一些實施例中，組合物包含無細胞系統中所製備的DLL3結合多肽。在一些實施例中，組合物包含經純化的DLL3結合多肽。V . 醫藥組合物及調配物
本文提供含有本文所提供之任一種DLL3結合多肽或表現其之工程化細胞的醫藥組合物。在一些實施例中，適於投藥的醫藥組合物中可以併入DLL3結合多肽，諸如本發明之融合蛋白(在本文中亦稱為「活性化合物」)及其衍生物、片段、類似物及同源物。在一些實施例中，適於投藥的醫藥組合物中可以併入表現嵌合受體(諸如嵌合抗原受體)的工程化細胞，該嵌合受體含有本文提供的DLL3結合多肽。
此類組合物典型地含有醫藥學上可接受之載劑。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之載劑」意欲包括與醫藥投與相容之任何及所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等張性及吸收延遲劑，及其類似物。適合載劑描述於該領域中之標準參考教科書Remington's Pharmaceutical Sciences最新版，其以引用之方式併入本文中。此類載劑或稀釋劑之適合實例包括(但不限於)水、生理鹽水、林格氏溶液(ringer's solutions)、右旋糖溶液及5%人類血清白蛋白。亦可使用脂質體及非水性媒劑，諸如不揮發性油。此類介質及藥劑用於醫藥活性物質之用途在此項技術中已熟知。除非任何習知介質或藥劑與活性成分不相容，否則預期在組合物中使用其。組合物中亦可併入補充活性化合物。
本發明之醫藥組合物經調配與其預定投藥途徑相容。投藥途徑之實例包括非經腸，例如靜脈內、皮內、皮下、瘤內、經口(例如吸入)、經皮(亦即，體表)、經黏膜及直腸投藥。用於非經腸、皮內或皮下施用之溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調節劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼(諸如鹽酸或氫氧化鈉)調節pH。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成的安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。
適於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(具水溶性)或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投藥而言，適合載劑包括生理鹽水、抑菌水、CREMOPHOR ELTM (BASF, Parsippany, N.J.)或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物必須為無菌的且就易注射而言應為液體。其在製造及儲存條件下必須穩定，且必須保藏以防諸如細菌及真菌之微生物之污染作用。載劑可為溶劑或分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(諸如丙三醇、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物。可維持適當流動性，例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。防止微生物作用可以藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，組合物中較佳將包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)、氯化鈉。可藉由在組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來達成可注射組合物之吸收延長。
無菌可注射溶液可藉由將所需量之活性化合物與以上所列成分之一或組合(需要時)併入適當溶劑中、隨後過濾滅菌來製備。一般而言，分散液係藉由將活性化合物併入含有基本分散介質及選自以上所列者之所需其他成分的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉末的情況下，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥，其利用預先無菌過濾的溶液產生活性成分加上任何其他所需成分的粉末。
口服組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用載劑。其可圍封於明膠膠囊中或壓縮成錠劑。出於經口治療投藥之目的，活性化合物可與賦形劑一起併入且以錠劑、糖衣錠或膠囊之形式使用。亦可使用適用作漱口劑之流體載劑製備口服組合物，其中流體載劑中之化合物經口施用且漱口且吐掉或吞服。可包括醫藥學相容性黏合劑及/或佐劑物質作為組合物之一部分。錠劑、丸劑、膠囊、糖衣錠及其類似物可含有以下成分或具有類似性質之化合物中之任一者：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、澱粉羥基乙酸鈉(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂或斯特羅特斯(Sterotes)；助滑劑，諸如膠狀二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或橙調味劑。
對於藉由吸入投藥而言，化合物可以氣溶膠噴霧形式自含有適合推進劑(例如氣體，諸如二氧化碳)之加壓容器或分配器或霧化器遞送。
全身性投藥亦可藉由經黏膜或經皮方式。對於經黏膜或經皮投藥而言，在調配物中使用適於滲透障壁的滲透劑。此類滲透劑在此項技術中通常已知，且對於經黏膜投與而言，包括例如洗滌劑、膽鹽及梭鏈孢酸衍生物。經黏膜投藥可經由使用鼻噴霧劑或栓劑而完成。對於經皮投藥而言，將活性化合物調配成軟膏、油膏、凝膠或乳膏，如此項技術中通常所知。
化合物亦可以栓劑(例如使用習知栓劑基質，諸如可可脂及其他甘油酯)或保留灌腸劑形式製備用於直腸遞送。
在一個實施例中，用防止化合物自體內快速消除之載劑製備活性化合物，諸如控釋型調配物，包括植入物及微囊封遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用於製備此類調配物之方法為熟習此項技術者顯而易見的。材料在商業上亦可獲自Alza Corporation及Nova Pharmaceuticals, Inc.。亦可使用脂質體懸浮液作為醫藥學上可接受之載劑。此等物可根據熟習此項技術者已知之方法製備，例如如美國專利第4,522,811號中所述。
就易投藥及劑量均一性而言，將口服或非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用，單位劑型係指作為單位劑量適用於待治療個體的實體不連續單元；各單元均含有經計算可產生所需治療效果的預定量之活性化合物與所需醫藥載劑。本發明之單位劑型之規格取決於且直接依賴於活性化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療作用，及用於治療個體之此類活性化合物之混配技術中的固有限制。
醫藥組合物可連同投藥說明書一起包括於套組、容器、包裝或分配器中。此等醫藥組合物可與使用說明書一起包括於診斷套組中。
醫藥組合物係以有效治療或預防特定適應症之量投與。治療有效量典型地依賴於所治療個體之體重、其體能或健康狀況、所治療病狀之廣泛程度或所治療個體之年齡。在一些實施例中，醫藥組合物可以每劑量每公斤體重約50μg至每公斤體重約50 mg範圍內的量投與。在一些實施例中，醫藥組合物可以每劑量每公斤體重約100μg至每公斤體重約50 mg範圍內的量投與。在一些實施例中，醫藥組合物可以每劑量每公斤體重約100μg至每公斤體重約20 mg範圍內的量投與。在一些實施例中，醫藥組合物可以每劑量每公斤體重約0.5 mg至每公斤體重約20 mg範圍內的量投與。
在一些實施例中，醫藥組合物可以每劑量約10 mg至約1,000 mg範圍內的量投與。在一些實施例中，醫藥組合物可以每劑量約20 mg至約500 mg範圍內的量投與。在一些實施例中，醫藥組合物可以每劑量約20 mg至約300 mg範圍內的量投與。在一些實施例中，醫藥組合物可以每劑量約20 mg至約200 mg範圍內的量投與。
醫藥組合物可按需要投與個體。在一些實施例中，有效劑量之醫藥組合物投與個體一或多次。在各種實施例中，一月一次、小於一月一次(諸如每兩個月一次、每三個月一次或每六個月一次)向個體投與有效劑量之醫藥組合物。在其他實施例中，大於一月一次投與有效劑量之醫藥組合物，諸如每兩週一次、每週一次、每週兩次、每週三次、每天一次或每天多次。有效劑量之醫藥組合物投與個體至少一次。在一些實施例中，有效劑量之醫藥組合物可投與多次，包括至少一個月、至少六個月或至少一年之時段。在一些實施例中，醫藥組合物依需要投與個體以緩解病狀的一或多種症狀。VI. 治療方法及用途
本文所述之DLL3結合多肽或表現其之工程化細胞適用於多種治療、診斷及預防適應症。舉例而言，DLL3結合多肽或工程化細胞適用於治療個體之多種疾病及病症。此類方法及用途包括治療方法及用途，例如涉及向患有疾病、病狀或病症(諸如腫瘤或癌症)之個體投與分子或工程化細胞或含有其之組合物。在一些實施例中，分子或工程化細胞以實現疾病或病症治療之有效量投與。用途包括含有DLL3結合多肽之分子或工程化細胞用於此類方法及治療的用途及用於製備藥劑以便執行此類治療方法的用途。在一些實施例中，該等方法係藉由向患有或懷疑患有疾病或病狀之個體投與DLL3結合多肽或工程化細胞或包含其之組合物來進行。在一些實施例中，該等方法藉此治療個體的疾病或病狀或病症。
在一個實施例中，本發明之DLL3結合多肽或工程化細胞可以用作治療劑。此類藥劑通常用於診斷、預後、監測、治療、緩解及/或預防個體之疾病或病變。治療方案係藉由使用標準方法鑑別個體(例如人類患者或罹患病症(或處於產生病症之風險中)的其他哺乳動物)來進行。在一些情況下，選擇已知、懷疑或已鑑別出患有表現DLL3之腫瘤的個體。向個體投與DLL3結合多肽或工程化細胞。DLL3結合多肽或工程化細胞投與個體且通常因其與目標結合而發揮作用。
在一些實施例中，所提供的DLL3多肽多特異性多肽構築體或工程化細胞當投與個體時能夠調節(例如增強)免疫反應，諸如根據CD3的接合及/或細胞中的CD3信號。在一些實施例中，本文提供一種調節個體之免疫反應的方法，其藉由投與治療有效量之所提供多特異性構築體或工程化細胞或其醫藥組合物。在一些實施例中，調節免疫反應之方法增加或增強個體之免疫反應。舉例而言，增加或增強的反應可為細胞介導之免疫力的增加。在一些實例中，該方法增加T細胞活性，諸如溶胞性T細胞(CTL)活性。在一些實施例中，經調節(例如增加)的免疫反應係針對腫瘤或癌症。
在一些實施例中，DLL3結合多肽(諸如DLL3-Fc融合蛋白或含有Fc區的多特異性構築體)的投與可以經由FcγRs的接合(經由多特異性多肽構築體的Fc區接合)活化先天免疫細胞。此類多特異性多肽構築體的投與可以促效、刺激、活化及/或增強先天免疫細胞效應功能，包括ADCC、細胞介素釋放、去顆粒及/或ADCP。在限制性多特異性多肽構築體的情況下，此類多特異性多肽構築體的投與在連接第一與第二組分的連接子被蛋白酶裂解之後且/或結合目標細胞(例如腫瘤細胞)上之DLL3之後，可以活化T細胞，藉此允許抗CD3結合部分結合T細胞上之CD3ε。在一些情況下，多特異性多肽構築體的投與可以促效、刺激、活化且/或增強CD3介導的T細胞活化、細胞毒性、細胞介素釋放及/或增殖。
在一些實施例中，所提供的方法藉由投與治療有效量之所提供DLL3結合多肽或工程化細胞或其醫藥組合物中的任一者而用於治療個體之疾病或病狀。在一些實施例中，疾病或病狀為腫瘤或癌症。一般而言，疾病或病症之緩解或治療涉及與疾病或病症相關之一或多種症狀或醫學問題的減輕。舉例而言，在癌症的情況下，治療有效量之藥物可實現以下一者或組合：減少癌細胞數目；減小腫瘤尺寸；抑制(亦即在一定程度上減少及/或阻止)癌細胞浸潤至周邊器官中；抑制腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；及/或在一定程度上緩解與癌症相關的一或多種症狀。在一些實施例中，本發明之組合物可以用於預防個體(例如人類或其他哺乳動物，諸如非人類靈長類動物、伴侶動物(例如貓、犬、馬)、家畜、研究動物或動物園動物)之疾病或病症的發作或復發。術語個體及患者在本文中可互換使用。
在一些實施例中，DLL3結合多肽或工程化細胞或其醫藥組合物可用於抑制哺乳動物癌細胞(諸如人類癌細胞)生長。一種治療癌症之方法可包括向患有癌症之個體投與有效量的本文所述之醫藥組合物中之任一者。可投與有效量的醫藥組合物以抑制、中斷或逆轉癌症進展。人類癌細胞可以活體內或離體治療。在人類患者之離體治療時，在身體外部處理含有癌細胞的組織或體液，且接著將該組織或體液再引回至患者體內。在一些實施例中，藉由向患者投與治療組合物來活體內治療人類患者之癌症。
疾病之非限制實例包括：所有類型的癌症(乳房、肺、結腸直腸、前列腺、黑色素瘤、頭頸部、胰臟等)、類風濕性關節炎、克羅恩氏病、SLE、心血管損傷、局部缺血等。舉例而言，適應症包括白血病，包括T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、淋巴母細胞性疾病(包括多發性骨髓瘤)，及實體腫瘤(包括肺、結腸直腸、前列腺、胰臟及乳房，包括三陰性乳癌)。舉例而言，適應症包括骨骼疾病或癌症轉移(不論原發腫瘤起源)；乳癌，作為非限制性實例包括ER/PR+乳癌、Her2+乳癌、三陰性乳癌；結腸直腸癌；子宮內膜癌；胃癌；神經膠母細胞瘤；頭頸癌，諸如食道癌；肺癌，作為非限制性實例諸如非小細胞肺癌；多發性骨髓瘤卵巢癌；胰臟癌；前列腺癌；肉瘤，諸如骨肉瘤；腎癌，作為非限制性實例諸如腎細胞癌；及/或皮膚癌，作為非限制性實例諸如鱗狀細胞癌、基底細胞癌或黑色素瘤。在一些實施例中，癌症為鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症為皮膚鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症為食道鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症為頭頸部鱗狀細胞癌。在一些實施例中，癌症為肺鱗狀細胞癌。
在一些實施例中，DLL3結合多肽或工程化細胞或其醫藥組合物適用於治療、減緩症狀、改善及/或延遲癌症或其他贅生性病狀之進展。在一些實施例中，癌症為膀胱癌、乳癌、子宮/子宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、食道癌、胃腸癌、胰臟癌、結腸直腸癌、結腸癌、腎癌、頭頸癌、肺癌、胃癌、生殖細胞癌、骨癌、肝癌、甲狀腺癌、皮膚癌、中樞神經系統之贅瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、肉瘤及病毒相關癌症。在某些實施例中，癌症為轉移性癌症、難治性癌症或復發性癌症。
在一些實施例中，本發明之DLL3結合多肽(諸如融合蛋白或多特異性多肽構築體)的治療有效量通常指為達成治療目標而需要的量。典型地，待投與之本發明之組合物之精確量可由醫師考慮患者(個體)之年齡、體重、腫瘤尺寸、感染或轉移程度及病狀的個別差異來決定。
在一些實施例中，作為非限制性實例，治療有效劑量可為每公斤體重約0.01µg至每公斤體重約10 mg。在一些實施例中，作為非限制性實例，治療有效劑量可為每公斤體重約0.01 mg至每公斤體重約5-10 mg。常用給藥頻率可在例如每天兩次至一週一次之範圍內。
在一些實施例中，投與治療量之本發明工程化細胞組合物。通常可以規定，包含如本文所述之工程化細胞(例如T細胞)的醫藥組合物可以每公斤體重104 至109 個細胞(諸如每公斤體重105 至106 個細胞(包括彼等範圍內之所有整數值))之劑量投與。工程化細胞組合物(諸如T細胞組合物)亦可以此等劑量投與多次。細胞可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參見例如Rosenberg等人, New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988)。熟習醫學技術者可藉由監測患者之疾病病徵且相應地調整療法而容易確定特定患者之最佳劑量及治療方案。
治療有效性係結合用於診斷或治療特定病症之任何已知方法測定。用於篩選具有所需特異性之DLL3結合多肽或含有其之工程化細胞的方法包括(但不限於)酶聯免疫吸附分析(ELISA)及此項技術中已知的其他免疫介導技術。已知多種方式用於確定所提供之DLL3結合多肽或工程化細胞的投與是否充分地調節免疫活性，此調節係藉由消除、隔離或不活化介導或能夠介導非所需免疫反應之免疫細胞；誘導、產生或開啟介導或能夠介導保護性免疫反應之免疫細胞；改變免疫細胞之生理或功能特性；或此等效應之組合。免疫活性調節之量測實例包括(但不限於)檢查免疫細胞群之存在或不存在(利用流動式細胞測量術、免疫組織化學、組織學、電子顯微法、聚合酶鏈反應(PCR))；量測免疫細胞之功能能力，包括回應於信號增殖或分裂的能力或抗性(諸如利用T細胞增殖分析及肽掃描分析，其基於抗CD3抗體、抗T細胞受體抗體、抗CD28抗體、鈣離子載體、PMA (佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)、負載有肽或蛋白質抗原之抗原呈遞細胞刺激之後的3H-胸苷併入；B細胞增殖分析)；量測殺死或溶解其他細胞的能力(諸如細胞毒性T細胞分析)；量測細胞介素、趨化因子、細胞表面分子、抗體及細胞之其他產物(例如藉由流動式細胞測量術、酶聯免疫吸附分析、西方墨點分析、蛋白質微陣列分析、免疫沈澱分析)；量測免疫細胞活化之生物化學標記或免疫細胞內之信號傳導路徑(例如對酪胺酸、絲胺酸或蘇胺酸磷酸化、多肽裂解及蛋白質複合物形成或解離進行的西方墨點及免疫沈澱分析；蛋白質陣列分析；利用DNA陣列或差減雜交達成的DNA轉錄特徵)；量測藉由細胞凋亡、壞死或其他機制達成的細胞死亡(例如磷脂結合蛋白V染色、TUNEL分析、量測DNA梯度變化的凝膠電泳、組織學；螢光凋亡蛋白酶分析、凋亡蛋白酶受質之西方墨點分析)；量測免疫細胞所產生的基因、蛋白質及其他分子(例如北方墨點分析、聚合酶鏈反應、DNA微陣列、蛋白質微陣列、2維凝膠電泳、西方墨點分析、酶聯免疫吸附分析、流動式細胞測量術)；及量測臨床症狀或結果，諸如涉及自身蛋白質或自身多肽之自身免疫、神經退化及其他疾病的改善(臨床分數、對使用其他療法的需求、功能狀態、成像研究)，例如藉由量測復發速率或疾病嚴重程度。
所提供之DLL3結合多肽亦適用於多種診斷及預防調配物。在一個實施例中，將DLL3結合多肽投與處於產生一或多種前述病症之風險中的患者。患者或器官對該等病症中之一或多者之傾向性可使用基因型、血清學或生物化學標記物測定。
在本發明之另一個實施例中，將DLL3結合多肽或工程化細胞投與診斷患有臨床適應症與一或多種前述病症的人類個體。診斷後，投與此類治療劑以緩和或逆轉臨床適應症之影響。組合療法
本發明之DLL3結合多肽或工程化細胞可以單獨或與其他治療模式(諸如其他抗癌劑)組合投與。其可在其他治療模式之前、實質上同時或之後(亦即，同時或依序)來提供。在一些實施例中，本文所述之治療方法可以進一步包括投與：輻射療法、化學療法、疫苗接種、靶向腫瘤療法CAR-T療法、溶瘤病毒療法、癌症免疫療法、細胞介素療法、手術切除、染色體修飾、部分切除術、冷凍療法、針對腫瘤目標的反義藥劑、針對腫瘤目標的siRNA藥劑、針對腫瘤目標的微RNA藥劑或抗癌/腫瘤藥劑，或生物製劑，諸如抗體、細胞介素或受體胞外域-Fc融合體。
在一些實施例中，本文提供之DLL3結合多肽與一或多種化學治療劑、CAR-T (嵌合抗原受體T細胞)療法、溶瘤病毒療法、細胞介素療法及/或靶向其他檢查點分子之藥劑(諸如PD1、PD-L1、LAG3、TIM3、VISTA、gpNMB、B7H4、HHLA2、CD73、CTLA4、TIGIT等)同時給與。
在一些實施例中，本發明之DLL3結合多肽或工程化細胞與其他抗腫瘤劑組合使用，諸如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib)(TARCEVA® )、血小板源生長因子抑制劑(例如GLEEVEC® (甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)))、COX-2抑制劑(例如塞內昔布(celecoxib))、干擾素、CTLA4抑制劑(例如抗CTLA抗體伊匹單抗(ipilimumab)(YERVOY®))、PD-1抑制劑(例如抗PD1抗體BMS-936558)、PDL1抑制劑(例如抗PDL1抗體MPDL3280A)、PDL2抑制劑(例如抗PDL2抗體)、細胞介素、結合至以下目標中之一或多者的拮抗劑(例如中和抗體)：ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA、PD-1、PDL1、PDL2、CTLA4或VEGF受體、TRAIL/Apo2，及其他生物活性及有機化學藥劑等。
在一些實施例中，本文提供的DLL3結合多肽或工程化細胞與PD-1/PD-L1療法同時給與。PD-1/PD-L1療法之實例包括納武單抗(nivolumab)(BMS)；皮立珠單抗(pidilizumab)(CureTech，CT-011)、派立珠單抗(pembrolizumab)(Merck)；德瓦魯單抗(durvalumab)(Medimmune/AstraZeneca)；阿特珠單抗(atezolizumab)(Genentech/Roche)；艾維路單抗(avelumab)(Pfizer)；AMP-224 (Amplimmune)；BMS-936559；AMP-514 (Amplimmune)；MDX-1105 (Merck)；TSR-042 (Tesaro/AnaptysBio，ANB-011)；STI-A1010 (Sorrento Therapeutics)；STI-A1110 (Sorrento Therapeutics)；以及針對程式化死亡-1 (PD-1)或程式化死亡配位體1 (PD-L1)之其他藥劑。
在一些實施例中，本發明之DLL3結合多肽或工程化細胞可與化學治療劑組合使用。化學治療劑之實例包括(但不限於)烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及CYTOXAN® 環磷醯胺；磺酸烷酯，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；伸乙亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基蜜胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三甲密胺；多聚乙醯(acetogenins)(具體言之，布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物拓朴替康(topotecan))；苔蘚抑素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065 (包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；念珠藻環肽(cryptophycin)(特定言之，念珠藻環肽1及念珠藻環肽8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；沙考地汀(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖(melphalan)、新恩比興(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，具體言之，卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1 (參見例如Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994))；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycini)、放線菌素D、道諾黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN® 小紅莓(doxorubicin)(包括嗎啉基-小紅莓、氰基嗎啉基-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓及去氧小紅莓)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、潑非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他汀(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤(methotrexate)及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯(testolactone)；抗腎上腺藥物，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；乙醯葡醛酯(aceglatone)；醛磷醯胺醣苷(aldophosphamide glycoside)；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗利散(elformthine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；磨菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素(maytansinoid)，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidamol)；硝拉維林(nitracrine)；噴司他汀(pentostatin)；凡那明(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK® 多糖複合物(JHS Natural Products, Eugene, OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢黴烯(具體言之，T-2毒素、黏液黴素A (verracurin A)、桿孢菌素A (roridin A)及胺癸叮(anguidine))；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；甲托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派(thiotepa)；類紫杉醇，例如TAXOL® 太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE® 不含十六醇聚氧乙烯醚(Cremophor)、經白蛋白工程改造之太平洋紫杉醇奈米粒子調配物(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)，及TAXOTERE® 多西他賽(doxetaxel)(Rhône-Poulenc Rorer, Antony, France)；苯丁酸氮芥；GEMZAR® 吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲胺喋呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)及卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新鹼(vincristine)；NAVELBINE® 長春瑞賓(vinorelbine)；諾凡特龍(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；柔紅黴素(daunomycin)；胺基喋呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(開普拓(Camptosar)，CPT-11)(包括伊立替康聯合5-FU及甲醯四氫葉酸之治療方案)；拓樸異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；康柏斯達汀(combretastatin)；甲醯四氫葉酸(VL)；奧沙利鉑(oxaliplatin)，包括奧沙利鉑治療方案(FOLFOX)；減少細胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib)(TARCEVA® ))及VEGF-A；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
其他非限制性例示性化學治療劑包括用於調控或抑制激素對癌症之作用的抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX® 他莫昔芬)、拉洛昔芬(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON® 托瑞米芬(toremifene)；抑制芳香酶的芳香酶抑制劑，其調控腎上腺中的雌激素產生，諸如4(5)-咪唑、胺魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE® 乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、AROMASIN® 依西美坦(exemestane)、福美斯坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、RIVISOR® 伏羅唑(vorozole)、FEMARA® 來曲唑(letrozole)及ARIMIDEX® 阿那曲唑(anastrozole)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙立德(leuprolide)及戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧雜環戊烷核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特定言之，抑制涉及異常細胞增殖之信號傳導路徑中之基因表現的彼等物，諸如PKC-α、Ralf及H-Ras；核糖核酸酶，諸如VEGF表現抑制劑(例如ANGIOZYME® 核糖核酸酶)及HER2表現抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN® 疫苗、LEUVECTIN® 疫苗及VAXID® 疫苗；PROLEUKIN® (阿地介白素(aldesleukin)) rIL-2；LURTOTECAN® 拓樸異構酶1抑制劑；ABARELIX® GnRH促效劑；及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
在一些實施例中，DLL3結合多肽與其他藥劑調配成單一治療組合物，且DLL3結合多肽與其他藥劑同時投與。或者，DLL3結合多肽或工程化細胞與另一種藥劑彼此分開，例如各自調配成單獨的治療組合物，且DLL3結合多肽或工程化細胞與另一種藥劑同時投與，或DLL3結合多肽或工程化細胞與另一種藥劑在治療方案期間的不同時間投與。舉例而言，DLL3結合多肽或工程化細胞係在另一種藥劑投與之前投與，DLL3結合多肽或工程化細胞係在另一種藥劑投與之後投與，或DLL3結合多肽或工程化細胞與另一種藥劑係以交替方式投與。DLL3結合多肽與另一種藥劑可以單次劑量或以多次劑量投與。
在一些實施例中，DLL3結合多肽或工程化細胞與其他藥劑同時投與。舉例而言，DLL3結合多肽與其他藥劑可以調配成單一組合物或以兩種或更多種單獨組合物投與。在一些實施例中，DLL3結合多肽或工程化細胞與其他藥劑依序投與，或DLL3結合多肽或工程化細胞與其他藥劑在治療方案期間的不同時間投與。 VII.  例示性實施例
所提供之實施例為： 1.     一種DLL3結合多肽構築體，其包含特異性結合DLL3之至少一個僅有重鏈之可變域(DLL3 VHH域)及結合至非DLL3之目標的一或多個額外結合域。 2.如實施例1之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含：互補決定區1 (CDR1)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335及456；互補決定區2 (CDR2)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、384、410及411；以及互補決定區3 (CDR3)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、395及412-415；且結合DLL3。 3.一種DLL3結合多肽構築體，其包含至少一個特異性結合DLL3之僅重鏈之可變域(DLL3 VHH域)，該可變域包含：互補決定區1 (CDR1)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335及456；互補決定區2 (CDR2)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、384、410及411；以及互補決定區3 (CDR3)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、395及412-415；且結合DLL3。 4.     如實施例1至3中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該DLL3為人類DLL3。 5.     如實施例1至4中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域為人類化的。 6.     如實施例1、2、4至5中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該等一或多個額外結合域結合至免疫細胞上之活化受體。 7.     如實施例6之DLL3結合多肽構築體，其中該免疫細胞為T細胞。 8.     如實施例6或實施例7之DLL3結合多肽構築體，其中該活化受體為CD3 (CD3ε)。 9.     如實施例8之DLL3結合多肽構築體，其對DLL3及CD3具有雙特異性。 10.   如實施例9之DLL3結合多肽構築體，其中該免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。 11.    如實施例6或實施例10之DLL3結合多肽構築體，其中該活化受體為CD16 (CD16a)。 12.   如實施例11之DLL3結合多肽構築體，其對DLL3及CD16a具有雙特異性。 13.   如實施例1、2、4至5中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多個額外結合域結合至細胞介素受體。 14.   如實施例1、2及4至13中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多個額外結合域包含抗體或其抗原結合片段。 15.   如實施例1、2及4至14中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多個額外結合域為單價的。 16.   如實施例14或實施例15之DLL3結合多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段為Fv、經二硫鍵穩定之Fv (dsFv)、scFv、Fab、單域抗體(sdAb)、VNAR或VHH。 17.   如實施例13之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多個額外結合域為細胞介素或能夠結合至該細胞介素受體的其經截短之片段或變異體。 18.   如實施例17之DLL3結合多肽構築體，其中該細胞介素為干擾素，或為干擾素之截短片段或變異體。 19.   如實施例18之DLL3結合多肽構築體，其中該干擾素為第I型干擾素或第II型干擾素；為第I型干擾素之經截短之片段或變異體；或第II型干擾素之經截短之片段或變異體。 20.   如實施例19之DLL3結合多肽構築體，其中：該第I型干擾素為IFN-α或IFN-β或其經截短之片段或變異體；或該第II型干擾素為IFN-γ或其經截短之片段或變異體。 21.   如實施例1至20中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該多肽構築體包含免疫球蛋白Fc區。 22.   如實施例1、2及4至21中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該多肽構築體包含連接該至少一個VHH域之免疫球蛋白Fc區及該一或多個額外結合域。 23.   如實施例1至22中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其為二聚體。 24.   如實施例21至23中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區為均二聚體Fc區。 25.   如實施例21至24中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 8、10、11、12或13中之任一者中所示之胺基酸序列；或展現出與SEQ ID NO: 8、10、11、12或13中之任一者有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。 26.   如實施例21至24中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區為人類IgG1。 27.   如實施例26之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列；或展現出與SEQ ID NO: 8有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。 28.   如實施例21至23中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區為雜二聚體Fc區。 29.   如實施例21至28中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區展現效應功能。 30.   如實施例21至29中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區包含包括一或多種胺基酸修飾之多肽，該修飾降低效應功能及/或減少與選自Fcγ受體或C1q之效應分子的結合。 31.   如實施例30之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多種胺基酸修飾為Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者缺失。 32.   如實施例30或實施例31之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列；或展現出與SEQ ID NO: 9有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。 33.如實施例1至32中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-480-488及507-518中之任一者或與SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-480-488及507-518中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列中所示之VHH域序列，且結合DLL3。 34.如實施例1至33中任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 244、(ii) SEQ ID NO: 244之人類化變異體或(iii)與SEQ ID NO: 244展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性之胺基酸序列；且結合DLL3。 35.如實施例1至34中之任一實施例之DLL3結合多肽，其中至少一個DLL3 VHH域包含CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325及326組成之群的胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 336、337及338組成之群的胺基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO: 354中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。 36.如實施例1至35中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 319、336及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、337及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 321、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 322、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 323、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 324、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 325、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 326、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。 37.如實施例1至36中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 245 -257中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 38.如實施例1至37之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列且結合DLL3。 39.如實施例1至33中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 258、(ii) SEQ ID NO: 258之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 258展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 40.如實施例1至33及39中之任一實施例之DLL3結合多肽，其中至少一個DLL3 VHH域包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 327中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 339中所示之胺基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO: 355中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。 41.如實施例1至33、39及40中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 327、339及335中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 42.如實施例1至33及39至41中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 259-263中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 43.如實施例1至33及39至42之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列且結合DLL3。 44.如實施例1至33中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 264、(ii) SEQ ID NO: 264之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 264展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 45.如實施例1至33及44中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 328、329或456中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 340中所示之胺基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 46.如實施例1至33、44及45中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 328、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 329、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 456、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。 47.如實施例1至33及44至46中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 48.如實施例1至33及44至47之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列且結合DLL3。 49.如實施例1至33中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 275、(ii) SEQ ID NO: 275之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 275展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 50.如實施例1至33及49中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 341中所示之胺基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO: 357中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 51.如實施例1至33、49及50中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 52.如實施例1至33及49至51之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列且結合DLL3。 53.如實施例1至33中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 280、(ii) SEQ ID NO: 280之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 280展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 54.如實施例1至33及53中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 330中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 342中所示之胺基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO: 358中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 55.如實施例1至33、53及54中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281-286中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 56.如實施例1至33及53至55之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列且結合DLL3。 57.如實施例1至33中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 287、(ii) SEQ ID NO: 287之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 287中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 58.如實施例1至33及57中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 345、346及347組成之群的胺基酸序列；以及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 359、360及361組成之群的胺基酸序列，且結合DLL3。 59.如實施例1至33及57至58中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、345及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、346及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、347及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及361中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、347及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 60.如實施例1至33及57至59中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 61.如實施例1至33及57至60之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列且結合DLL3。 62.如實施例1至33中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 299、(ii) SEQ ID NO: 299之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 299展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 63如實施例1至33及62中之任一實施例之DLL3結合多肽，其中至少一個DLL3 VHH域包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 331中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群之胺基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 64.如實施例1至33及62至63中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 331、348及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 331、349及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 331、350及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。 65.如實施例1至33及62至64中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 300、302至305及480中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 66.如實施例1至33及62至65之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列且結合DLL3。 67.如實施例1至33中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 507、(ii) SEQ ID NO: 507之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 507中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 68.如實施例1至33及67中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 332中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；以及CDR3，其包含SEQ ID NO: 362中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 69.如實施例1至33及67至68中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 332、348及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 332、349及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 332、350及362中所示之CDR1、CDR2及CDR3。 70.如實施例1至33及67至69中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 508-514中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 71.如實施例1至33及67至70之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列且結合DLL3。 72.如實施例1至33中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 401、(ii) SEQ ID NO: 401之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 401展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 73.如實施例1至33及72中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 384、410及411組成之群的胺基酸序列；以及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 395、412、413、414及415組成之群的胺基酸序列，且結合DLL3。 74.如實施例1至33及72至73中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、384及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、410及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、411及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及412中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及413中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及414中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、384及415中所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 75.如實施例1至33及72至74中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 481-488中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 76.如實施例1至33及72至75之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列且結合DLL3。 77.如實施例1至33中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO:314、518、515、516或517；(ii) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517之人類化變異體；或(iii)與SEQ ID NO: 314、518、515、516或517展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 78.如實施例1至33及77中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 333、351及363中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、352及364中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；320、353及365中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、339及366中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或335、348及367中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DDL3。 79.如實施例1至33、77及78中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域闡述於SEQ ID NO: 314、518、515、516或517中且結合DLL3。 80.一種多特異性多肽構築體，其包含：(a)第一組分，該第一組分包含含有第一Fc多肽及第二Fc多肽的雜二聚體Fc區，及(b)第二組分，該第二組分包含含有重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)的抗CD3抗體或抗原結合片段，其中構成該抗CD3抗體或抗原結合片段的VH及VL連接至雜二聚體Fc之相對多肽；第一及第二組分藉由連接子偶合，其中雜二聚體Fc區定位於抗CD3抗體的N端；且其中第一及第二組分中之一或兩者包含至少一個含有特異性結合DLL3之VHH域(DLL3 VHH域)的抗原結合域。 81.如實施例80之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體至少包含：(i)第一多肽，該第一多肽包含雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子，及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域；以及(ii)第二多肽，該第二多肽包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子(視情況該連接子與存在於第一多肽中的連接子相同)，及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中之另一者，其中第一與第二多肽中之一或兩者包含至少一個DLL3 VHH域。 82.如實施例80或實施例81之多特異性多肽構築體，其中相較於均二聚體Fc區之多肽，視情況相較於SEQ ID NO: 8中所示之Fc多肽或其免疫活性片段，雜二聚體Fc區之第一及第二Fc多肽中之一或兩者包含至少一個誘導雜二聚化的修飾。 83.如實施例82之多特異性多肽構築體，其中雜二聚體Fc區之第一及第二Fc多肽各自獨立地包含至少一個胺基酸修飾。 84.如實施例83之多特異性多肽構築體，其中雜二聚體Fc區之第一及第二Fc多肽各自包含臼包杵修飾或包含增強多肽之靜電互補性的電荷突變。 85.如實施例84之多特異性多肽構築體，其中該胺基酸修飾為臼包杵修飾。 86.如實施例80至85中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中雜二聚體Fc區之第一Fc多肽包含選自Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val及其組合之修飾，且雜二聚體Fc區之第二Fc多肽包含修飾Thr366Trp。 87.如實施例86之多特異性多肽構築體，其中第一與第二Fc多肽進一步包含非半胱胺酸殘基向半胱胺酸殘基的修飾，其中第一Fc多肽之修飾存在於位置Ser354及Tyr349之一，且第二Fc多肽之修飾存在於位置Ser354及Tyr349中之另一者處。 88.如實施例80至84中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該胺基酸修飾為增強多肽之靜電互補性的電荷突變。 89.如實施例80至84及88中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中第一及/或第二Fc多肽或第一與第二Fc多肽各自包含互補位置處之修飾，其中該修飾為置換成具有與另一多肽之互補胺基酸相反之電荷的胺基酸。 90.如實施例60至69中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中雜二聚體Fc區之第一或第二Fc多肽之一進一步包含位於殘基Ile253之修飾。 91.如實施例90之多特異性多肽構築體，其中修飾為Ile253Arg。 92.如實施例80至91中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中雜二聚體Fc區之第一或第二Fc多肽之一進一步包含位於殘基His435之修飾。 93.如實施例92之多特異性多肽構築體，其中該修飾為His435Arg。 94.如實施例80至93中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該Fc區包含缺乏Lys447之多肽。 95.如實施例80至94中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該Fc區包含含有至少一個增強FcRn結合之修飾的多肽。 96.如實施例95之多特異性多肽構築體，其中該修飾位於選自由以下組成之群的位置：Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434及其組合。 97.如實施例96之多特異性多肽構築體，其中該修飾係選自由以下組成之群：Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S及其組合。 98.如實施例96之多特異性多肽構築體，其中該修飾處於位置Met252及位置Met428。 99.如實施例98之多特異性多肽構築體，其中該修飾為Met252Y及Met428L。 100.如實施例76之多特異性多肽構築體，其中該修飾為Met252Y及Met428V。 101.如實施例80至100中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中雜二聚體Fc區之第一Fc多肽包含SEQ ID NO: 103、107、115或117中之任一者中所示之胺基酸序列，且雜二聚體Fc區之第二Fc多肽包含SEQ ID NO: 104、108、111、113、119或121中之任一者中所示之胺基酸序列。 102.如實施例1至101中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該Fc區包含含有至少一個胺基酸修飾的多肽，該修飾減少效應功能且/或減少對選自Fcγ受體或C1q之效應分子的結合。 103.如實施例102之多特異性多肽構築體，其中該一或多個胺基酸修飾為Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者之缺失。 104.如實施例80至103中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中雜二聚體Fc區之第一Fc多肽包含SEQ ID NO: 105、109、116或118中之任一者中所示之胺基酸序列，且雜二聚體Fc區之第二Fc多肽包含SEQ ID NO: 106、110、112、114、120或122中之任一者中所示之胺基酸序列。 105.如實施例80至104中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段為單價的。 106.如實施例80至105中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段不是單鏈抗體，視情況不是單鏈可變片段(scFv)。 107.如實施例80至106中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段為Fv抗體片段。 108.如實施例107之多特異性多肽構築體，其中該Fv抗體片段包含經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。 109.如實施例80至108中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包含VH CDR1，其包含胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)；VH CDR2，其包含胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)；VH CDR3，其包含胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)；VL CDR1，其包含胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)；VL CDR2，其包含胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)；及VL CDR3，其包含胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)。 110.如實施例80至109中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包含：VH，其具有SEQ ID NO: 35-65中之任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 35-65中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列；及VL，其具有SEQ ID NO: 66-84及368中之任一者之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 66-84及368中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。 111.如實施例80至110中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及SEQ ID NO: 75之胺基酸序列。 112.如實施例80至110中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及SEQ ID NO: 368之胺基酸序列。 113.如實施例80至112中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域相對於多特異性多肽構築體之Fc區定位於胺基端且/或相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區定位於羧基端。 114.如實施例80至113中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體包含特異性結合DLL3的第一DLL3 VHH域及特異性結合DLL3的第二DLL3 VHH域。 115.如實施例114之多特異性多肽構築體，其中該第一或第二DLL3 VHH域相對於該多特異性構築體之Fc區定位於胺基端且該第一或第二DLL3 VHH域中之另一者相對於該多特異性構築體之CD3結合區定位於羧基端。 116.如實施例114或實施例115之多特異性多肽構築體，其中 該第一組分依N端至C端的次序包含結合DLL3的第一DLL3 VHH域、雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH域；且該第二多肽依N端至C端的次序包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與存在於第一組分中的連接子相同)，及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中之另一者。 117.如實施例114至116中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該第一與第二DLL3 VHH域是相同的。 118.如實施例114至116中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該第一與第二DLL3 VHH域是不同的。 119.如實施例118之多特異性多肽構築體，其中該第一與第二DLL3 VHH域結合DLL3之不同或不重疊抗原決定基且/或不競爭結合至DLL3。 120.如實施例119之多特異性多肽構築體，其中： 該第一VHH域包含251、264、267、268、287、299、507、314、517或455中之任一者中所示之胺基酸序列、其人類化變異體，或與251、264、267、268、287、299、507、314、517或455中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3；且該第二VHH域包含244、251、258、267、275、280、314、518、515、516、517、455中之任一者中所示之胺基酸序列，或與244、251、258、267、275、280、314、518、515、516、517、455中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 121.如實施例119或120之多特異性多肽構築體，其中： 該第一VHH域及第二VHH域包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 507；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 507；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 314；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 299；SEQ ID NO:518及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 268；SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 267；SEQ ID NO: 275及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 287；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 515及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 516及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 517及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO:251及SEQ ID NO:455；或SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 517。 122.如實施例80至121中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之VHH域序列：SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-488或507-518中之任一者，或與SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-488或507-518中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 123.如實施例80至122中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 244、(ii) SEQ ID NO: 244之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 244展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 124.如實施例80至123中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325及326組成之群的胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 336、337及338組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 354中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。 125.如實施例80至124中之任一實施例之多特異性構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 319、336及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、337及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 321、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 322、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 323、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 324、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 325、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 326、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 126.如實施例80至125中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 245-257中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 127.如實施例80至126中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 128.如實施例80至122中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 258、(ii) SEQ ID NO: 258之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 258展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 129.如實施例80至122及128中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 327中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 339中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 355中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 130.如實施例80至122、128及129中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 327、339及335中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 131.如實施例80至122及128至130中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 259-263中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 132.如實施例80至122及128至131中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 133.如實施例80至122中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 264、(ii) SEQ ID NO: 264之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 264展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 134.如實施例80至122及133中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二VHH域中之每一者獨立地包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 328、329或456中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 340中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 135.如實施例80至122、133及134中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 328、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 329、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 456、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 136.如實施例80至122及133至135中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 137.如實施例80至122及133至136中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 138.如實施例80至122中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO:275、(ii) SEQ ID NO: 275之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 275展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 139.如實施例80至122及138中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 341中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 357中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 140.如實施例80至122、138及139中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 141.如實施例80至122及138至140中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 142.如實施例80至122中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 280、(ii) SEQ ID NO: 280之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 280展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 143.如實施例80至122及142中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 330中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 342中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 358中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 144.如實施例80至122、142及143中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281-286中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%與序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 145.如實施例80至122及142至144中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 146.如實施例80至122中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 287、(ii) SEQ ID NO: 287之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 287展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 147.如實施例80至122及146中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 345、346及347組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 359、360及361組成之群的胺基酸序列，且結合DLL3。 148.如實施例80至122、146及147中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、345及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、346及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、347及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及361中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、347及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 149.如實施例80至122及146至148中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 150.如實施例80至122及146至149之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 151.如實施例80至122中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 299、(ii) SEQ ID NO: 299之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 299展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 152.如實施例80至122及151中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 331中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 153.如實施例80至122、151及152中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 331、348及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 331、349及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 331、350及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 154.如實施例80至122及151至153中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 155.如實施例80至122及151至154中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 156.如實施例80至122中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 507、(ii) SEQ ID NO: 507之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 507展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 157.如實施例80至122及156中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 332中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 362中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 158.如實施例80至122、156及157中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 332、348及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 332、349及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 332、350及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 159.如實施例80至122及156至158中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 508-514中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 160.如實施例80至122及156至159之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 161.如實施例80至122中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 401、(ii) SEQ ID NO: 401之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 401展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 162.如實施例80至122及161中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 384、410及411組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 395、412、413、414及415組成之群的胺基酸序列，且結合DLL3。 163.如實施例80至122、161及162中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、384及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、410及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、411及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及412中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及413中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及414中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、384及415中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 164.如實施例80至122及161至163中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 481-488中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 165.如實施例80至122及161至164之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 166.如實施例80至122中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517；(ii) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 314、518、515、516或517中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 167.如實施例80至122及166中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 333、351及363中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、352及364中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；320、353及365中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、339及366中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或335、348及367中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DDL3。 168.如實施例80至122、166及167中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地闡述於SEQ ID NO: 314、518、515、516或517中，且結合DLL3。 169.如實施例80至168中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該第一與第二組分中之一或兩者包含至少一個結合共刺激受體的共刺激受體結合區(CRBR)。 170.如實施例169之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)相對於該多特異性多肽構築體之Fc區定位於胺基端且/或相對於該多特異性多肽構築體之CD3結合區定位於羧基端。 171.如實施例169或實施例170之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體僅包含一個共刺激受體結合區(CRBR)。 172.如實施例169至171中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中： 該第一組分依N端至C端之次序包含結合DLL3之第一DLL3 VHH域；雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH域；且該第二組分包含CRBR且依N端至C端之次序包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽；連接子，該連接子視情況與存在於該第一組分中的連接子相同；抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中的另一者，其中該CRBR相對於Fc區定位於胺基端或相對於第二組分之抗CD3抗體或抗原結合片段定位於羧基端。 173.如實施例169至172中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)為或包含共刺激受體之原生同源結合搭配物的胞外域或其結合片段或其變異體，其對共刺激受體展現結合活性。 174.如實施例169至173中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)為選自由以下組成之群的抗體或其抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體及單域輕鏈抗體。 175.如實施例174之多特異性多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段為Fv、scFv、Fab、單域抗體(VHH域)、VNAR或VHH。 176.如實施例174或實施例175之多特異性多肽構築體，其中該抗體或抗原結合片段為VHH域。 177.如實施例176之多特異性多肽構築體，其中該VHH域為人類或人類化VHH域。 178.如實施例169至177中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)結合選自以下之共刺激受體：41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化因子及CAML相互作用因子(TACI)，及NKG2D。 179.如實施例169至178中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)結合選自以下之共刺激受體：41BB (CD137)、OX40 (CD134)，及糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)。 180.如實施例169至179中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)包含SEQ ID NO: 210中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 210中所示之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列，且結合4-1BB。 181.如實施例80至180中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該第一及第二組分中之一者或兩者包含至少一個結合抑制性受體之抑制性受體結合區(IRBR)。 182.如實施例181之多特異性多肽構築體，其中該至少一個抑制性受體結合區(IRBR)相對於該多特異性多肽構築體之Fc區定位於胺基端且/或相對於該多特異性多肽構築體之CD3結合區定位於羧基端。 183.如實施例181或實施例182之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體僅包含一個抑制性受體結合區(IRBR)。 184.如實施例181至183中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中： 該第一組分依N端至C端之次序包含結合DLL3之第一DLL3 VHH域；雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH域；且該第二組分包含IRBR且依N端至C端之次序包含雜二聚體Fc區之第二Fc多肽；連接子，該連接子視情況與存在於該第一組分中的連接子相同；及抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中的另一者，其中該IRBR相對於Fc區定位於胺基端或相對於第二組分之抗CD3抗體或抗原結合片段定位於羧基端。 185.如實施例181至184中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個IRBR為或包含抑制性受體之原生同源結合搭配物的胞外域或其結合片段或其變異體，其對抑制性受體展現結合活性。 186.如實施例181至185中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個IRBR為選自由以下組成之群的抗體或其抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體，及單域輕鏈抗體。 187.如實施例186之多特異性多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段為Fv、scFv、Fab、單域抗體(VHH域)、VNAR或VHH。 188.如實施例186或實施例187之多特異性多肽構築體，其中該抗體或抗原結合片段為VHH域。 189.如實施例188之多特異性多肽構築體，其中該VHH域為人類或人類化VHH域。 190.如實施例181至189中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個IRBR結合選自以下之抑制性受體：PD-1、CTLA-4、TIGIT、VISTA及TIM3。 191.如實施例181至189中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該至少一個IRBR結合PD-1。 192.如實施例181至191中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中： 該第一組分依N端至C端的次序包含：結合DLL3的第一DLL3 VHH域、雜二聚體Fc區之第一Fc多肽、連接子、抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH；且第二組分依N端至C端的次序包含：IRBR或CRBR之一；雜二聚體Fc區之第二Fc多肽；連接子，該連接子視情況與存在於第一組分中的連接子相同；抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中的另一者，及CRBR或IRBR中的另一者。 193.如實施例80至192中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該連接子為肽或多肽連接子，視情況其中該連接子具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸的長度。 194.如實施例80至193中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該連接子為不可裂解連接子。 195.如實施例194之多特異性多肽構築體，其中該不可裂解連接子包含GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO: 125)、GGGGGS (SEQ ID NO: 126)及其組合。 196.如實施例80至195中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該連接子為或包含序列GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 127)。 197.如實施例80至193中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該連接子為可裂解連接子。 198.如實施例197之多特異性多肽構築體，其中該可裂解連接子為充當蛋白酶之受質的多肽。 199.如實施例198之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係由免疫效應細胞、腫瘤或存在於腫瘤微環境中之細胞產生。 200.如實施例198或實施例199之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係由免疫效應細胞產生且該免疫效應細胞為活化T細胞、自然殺手(NK)細胞或NK T細胞。 201.如實施例198至200中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係選自間質蛋白酶、基質金屬蛋白酶(MMP)、顆粒酶B及其組合。 202.如實施例201之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶為顆粒酶B。 203.如實施例198至202中之任一實施例之多特異性多肽構築體，其中該可裂解連接子包含胺基酸序列GGSGGGGIEPD IGGSGGS (SEQ ID NO: 171)。 204.一種結合DLL3的經分離單域抗體，包含：互補決定區1 (CDR1)，其包含選自由SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335及456組成之群的胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包含選自由SEQ ID NO: 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、384、410及411組成之群的胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包含選自由SEQ ID NO: 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、395及412-415組成之群的胺基酸序列。 205.如實施例204之經分離單域抗體，其包含SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-480-488及507-518中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-480-488及507-518中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 206.如實施例204或實施例205之經分離單域抗體，其中該單域抗體包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 244、(ii) SEQ ID NO: 244之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 244展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 207.如實施例204至206中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325及326組成之群的胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 336、337及338組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 354中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 208.如實施例204至207中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 319、336及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、337及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 321、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 322、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 323、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 324、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 325、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 326、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 209.如實施例204至208中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 245-257中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 210.如實施例204至209中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 211.如實施例204或實施例205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 258、(ii)SEQ ID NO: 258之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 258展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 212.如實施例204、205及211中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 327中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 339中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 355中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 213.如實施例204、205、211及212中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 327、339及335中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 214.如實施例204、205及211至213中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 259-263中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 215.如實施例204、205及211至214中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 216.如實施例204或實施例205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 264、(ii)SEQ ID NO: 264之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 264展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 217.如實施例204、實施例205或實施例216之經分離單域抗體，其中該sdAb包含CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 328、329或456組成之群的胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 340中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 218.如實施例204、205及216至217中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 328、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 329、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 456、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 219.如實施例204、205及216至218中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 220.如實施例204、205及216-219中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該至少一個DLL3 sdAb包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 221.如實施例204或實施例205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 275、(ii)SEQ ID NO: 275之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 275展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 222.如實施例204、205或221之經分離單域抗體，其中該sdAb包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 341中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 357中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 223.如實施例204、205及221至222中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 224.如實施例204、205及221至223中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列。 225.如實施例204或實施例205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 280、(ii)SEQ ID NO: 280之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 280展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 226.如實施例204、205及225中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含CDR1，其包含SEQ ID NO: 330中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 342中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 358中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 227.如實施例204、205及225至226中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281-286中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 228.如實施例204、205及225至227中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 229.如實施例204或實施例205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 287、(ii)SEQ ID NO: 287之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 287展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 230.如實施例204、205及229中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 345、346及347組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 359、360及361組成之群的胺基酸序列，且結合DLL3。 231.如實施例204、205及229至230中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 320、345及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、346及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、347及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及361中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、347及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 232.如實施例204、205及229至231中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 233.如實施例204、205及229至232中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 234.如實施例204或實施例205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 299、(ii)SEQ ID NO: 299之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 299展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 235如實施例204、205及234中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 331中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 236.如實施例204、205及234至235中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 331、348及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 331、349及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 331、350及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 237.如實施例204、205及234至236中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 238.如實施例204、205及234至237中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 239.如實施例204或實施例205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 507、(ii)SEQ ID NO: 507之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 507展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 240.如實施例204、205及239中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 332中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 362中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 241.如實施例204、205及239至240中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 332、348及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 332、349及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 332、350及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 242.如實施例204、205及239至241中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 508-514中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 243.如實施例204、205及239至242中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 244.如實施例204或實施例205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 401、(ii) SEQ ID NO: 401之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 401展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 245.如實施例204、205及244中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 384、410及411組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 395、412、413、414及415組成之群的胺基酸序列，且結合DLL3。 246.如實施例204、205及244至245中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 320、384及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、410及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、411及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及412中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及413中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及414中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、384及415中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。 247.如實施例204、205及244至246中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 481-488中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 248.如實施例204、205及244至247中之任一實施例之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。 249.如實施例204或實施例205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517；(ii) SEQ ID NO:314、518、515、516或517之人類化變異體；或(iii)與SEQ ID NO: 314、518、515、516或517中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。 250.如實施例204、205及249中之任一實施例之經分離單域抗體，其中至少一個DLL3 sdAb包含SEQ ID NO: 333、351及363中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、352及364中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；320、353及365中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、339及366中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或335、348及367中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DDL3。 251.一種聚核苷酸，其編碼如實施例1至79中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體。 252.一種聚核苷酸，其編碼如實施例80至203中之任一實施例之多特異性多肽構築體。 253.一種聚核苷酸，包含：第一核酸序列，其編碼如實施例80至203中之任一實施例之多特異性構築體的第一多肽；及第二核酸序列，其編碼該多特異性構築體之第二多肽，其中該第一核酸序列及該第二核酸序列係藉由內部核糖體進入位點(IRES)或編碼自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽的核酸分隔。 254.如實施例253之聚核苷酸，其中該第一核酸序列及第二核酸序列可操作地連接至同一啟動子。 255.如實施例254之聚核苷酸，其中編碼自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽的核酸係選自T2A、P2A、E2A或F2A。 256.一種聚核苷酸，其編碼如實施例204至250中之任一實施例之單域抗體。 257.一種載體，其包含如實施例251至256中之任一實施例之聚核苷酸。 258.如實施例257之載體，其為表現載體。 259.如實施例257或實施例258之載體，其為病毒載體或真核載體，視情況其中該真核載體為哺乳動物載體。 260.一種細胞，其包含如實施例251至256中之任一實施例之一或多種聚核苷酸，或如實施例257至259中之任一實施例之一或多種載體。 261.如實施例260之細胞，其中該細胞為重組的或經分離的。 262.如實施例261之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。 263.一種產生多肽之方法，該方法包含將如實施例251至256中之任一實施例之一或多種聚核苷酸或如實施例257至259中之任一實施例之一或多種載體引入細胞中及在產生該多特異性多肽構築體的條件下培養該細胞。 264.如實施例263之方法，其進一步包含自該細胞分離或純化該多肽。 265.一種多肽，其藉由如實施例263或實施例264之方法產生。 266.一種工程化免疫細胞，其包含嵌合抗原受體，該嵌合抗原受體包含：胞外域，該胞外域包含如實施例204至250中之任一實施例的單域抗體；跨膜域；及胞內信號傳導域。 267.如實施例266之工程化免疫細胞，其中該細胞為淋巴球。 268.如實施例266或實施例267之工程化免疫細胞，其中該細胞為T細胞或自然殺手(NK)細胞。 269.如實施例266至268中之任一實施例之工程化免疫細胞，其中該胞內信號傳導域包含基於免疫受體酪胺酸的活化模體(ITAM)信號傳導域。 270.如實施例266至269中之任一實施例之工程化免疫細胞，其中該胞內信號傳導域為或包含CD3ζ信號傳導域，視情況為或包含人類CD3ζ信號傳導域。 271.如實施例269或實施例270之工程化免疫細胞，其中該胞內信號傳導域進一步包含共刺激分子之信號傳導域。 272.如實施例271之工程化免疫細胞，其中該共刺激分子為CD28、ICOS、41BB或OX40，視情況為人類CD28、人類ICOS、人類41BB或人類OX40。 273.一種醫藥組合物，其包含如實施例1至79中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體、如實施例80至203中之任一實施例之多特異性多肽構築體、如實施例204至250中之任一實施例之單域抗體，或如實施例266至272中之任一實施例之工程化免疫細胞。 274.如實施例273之醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之載劑。 275.如實施例273或實施例274之醫藥組合物，其為無菌的。 276.一種刺激或誘導個體之免疫反應的方法，該方法包含向有需要之個體投與如實施例1至79中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體、如實施例80至203中之任一實施例之多特異性多肽構築體、如實施例204至250中之任一實施例之單域抗體，或如實施例266至272中之任一實施例之工程化免疫細胞，或如實施例273至275之醫藥組合物。 277.如實施例276之方法，其中該免疫反應係針對腫瘤或癌症予以增強，視情況針對表現DLL3之腫瘤或癌症予以增強。 278.如實施例276或實施例277之方法，其中該方法治療該個體之疾病或病狀。 279.一種治療個體之疾病或病狀的方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之如實施例1至79中之任一實施例之DLL3結合多肽構築體、如實施例80至203中之任一實施例之多特異性多肽構築體、如實施例204至250中之任一實施例之單域抗體，或如實施例266至272中之任一實施例之工程化免疫細胞，或如實施例273至275之醫藥組合物。 280.如實施例278或實施例279之方法，其中該疾病或病狀為腫瘤或癌症。 281.如實施例276至277中之任一實施例之方法，其中該個體為人類。VIII. 實例
以下實例僅為說明之目的而包括在內且不意欲限制本發明之範疇。實例 1 ： 產生 DLL3 sdAb
靶向人類DLL3之單域抗體經由免疫接種駱馬及羊駝來產生。駱馬及羊駝免疫接種人類DLL3胞外域之重組形式(ECD；人類DLL3之胺基酸27-492，例如UniProt編號Q9NYJ7)，該重組形式如下所示(SEQ ID NO: 475)：
Figure 02_image015
產生特定抗DLL3抗體效價之後，自經免疫接種之動物的500 mL血液中分離出駱馬/羊駝周邊血液單核細胞(PBMC)，且使用Qiagen RNeasy Maxi套組分離總mRNA，且隨後使用Thermo Superscript IV逆轉錄酶及寡聚dT預致敏轉化為第一股cDNA。使用cDNA作為模板、經由PCR特異性地擴增單域抗體(sdAb；亦稱作VHH)序列，且以sdAb-Fc-AGA2融合蛋白形式選殖於酵母表面呈現載體中。Fc為人類IgG1 Fc (SEQ ID NO: 8中所示)或在一些情況下為效應功能降低的其變異體(Fc xELL；SEQ ID NO: 9)。
經由磁珠分離、使用DLL3 ECD之重組形式富集呈現此等sdAb之酵母文庫，隨後進行螢光活化細胞分選(FACS)。使分選的酵母析出，且挑選分離的群落置於96孔板中且使其在培養基中生長，表面呈現之sdAb-Fc表現轉變成分泌至培養基中。將96孔酵母分泌培養物的上清液施加至SHP-77細胞(DLL3陽性)或CCRF-CEM細胞(DLL3陰性)中，洗滌，用螢光團標記的抗人類Fc二級抗體處理，且藉由96孔流式細胞術分析。
將針對DLL3陽性細胞而非針對DLL3陰性細胞之結合子以sdAb-Fc形式選殖於哺乳動物表現載體中，藉由使用聚乙烯亞胺在HEK293自由式細胞(293F細胞)或CHO細胞中短暫轉染來表現。3至7天之後，收集分泌於上清液中的重組蛋白，藉由蛋白質A層析來純化，且根據280 nm吸光度定量。
經鑑別之例示性sdAb闡述於表E1A中。在一些情況下，sdAb可包括柔性連接子(例如GG)，用於連接至另一多肽，諸如Fc或另一sdAb。表 E1A ： DLL3 sdAb
純系名稱 CDR1 SEQ ID NO CDR2 SEQ ID NO CDR3 SEQ ID NO VHH SEQ ID NO
L10D9 GSILSINAMG 319 GFTGDGNTI 336 DVQLFSRDYEFY 354 244
L10E5 GFTLDDYTIG 327 CISSSGGSTY 339 YCPVVVGPELGYDY 355 258
L8E7 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 264
L3G3 GSIFSINAMG 320 GFTGDGMTK 341 DVFTDRDHVDWY 357 275
L5A7 GSDFSINAIG 330 GFTGDGVTT 342 DVKIGGDYEWF 358 280
L5A8 GSIFSINAMG 320 VVSSDGRTT 345 REWYSDSDWRDY 359 287
L6C5 EITFSDKTVG 331 VISNVDSTN 348 RDFENEY 356 299
L6F1 EIIFSDKTVG 332 VISNVDSTN 348 RDFESEY 362 306 507
3B4 GSDFSINAMG 333 GFTGDGNPI 351 DVKIGGDYEWY 363 314
6A1 GFSLDDYTIG 334 CISSSGGSTV 352 WCGVATMTEDLPFDY 364 315 518
5H8 GSIFSINAMG 320 GFTSEGSAK 353 DIFSDRDHVDWY 365 316 515
3B12 GFSLDDYTIG 334 CISSSGGSTY 339 YCPVTIADELGFDY 366 317 516
6B4 EITLSDKTVG 335 VISNVDSTN 348 RDFEAEY 367 318 517
3C5 GSIFSINAMG 320 GFTGDGSTK 384 DVQLLNSDYEFY 395 401
實例 2 ： sdAb 對 DLL3 表現細胞的結合 ( 藉由流式細胞術 )
評估經純化之sdAb-Fc對DLL3表現細胞的特異性及相對親和力。使用DLL3表現細胞株、肺癌細胞株(SHP-77)或經DLL3轉染之293FS細胞株(DLL3 293FS)，藉由流式細胞術評估DLL3-sdAb-Fc融合蛋白之結合。將滴定系列之融合蛋白與DLL3表現細胞株(大約2.5×104 至5×104 個細胞/孔)在FACS緩衝液(PBS 1% BSA，0.1% NaN3 pH 7.4)中、在96孔盤中、在4攝氏度下一起培育30分鐘。在FACS緩衝液中進行三次洗滌步驟之後，添加APC結合之抗人類Fcγ特異性二級抗體(Jackson ImmunoResearch)且在4攝氏度下培育30分鐘。在FACS緩衝液中再進行三次洗滌步驟之後，經由流式細胞術(IQue Intellicyte)偵測所結合的抗體。
圖 1 繪示以下例示性DLL3 sdAb的結合結果：亦即10D9 (SEQ ID NO: 244)、10E5 (SEQ ID NO: 258)、8E7 (SEQ ID NO: 264)、3G3 (SEQ ID NO: 275)、5A7 (SEQ ID NO: 280)、5A8 (SEQ ID NO: 287)、6C5 (SEQ ID NO: 299)、6F1 (SEQ ID NO: 507，諸如SEQ ID NO: 306)、3B4 (SEQ ID NO: 314)、5H8 (SEQ ID NO: 515，諸如SEQ ID NO: 316中所示)、3B12 (SEQ ID NO: 516，諸如SEQ ID NO: 317中所示)及6B4 (SEQ ID NO: 517，諸如SEQ ID NO: 318中所示)。
使用所產生之例示性sdAb、根據對DLL3的結合進行抗原決定基分組分析，以成對測試抗體阻斷另一抗體結合至抗原之抗原決定基。結果闡述於表 E1B 中：
表E1B：抗原決定基分組
10D9 BIN2
10E5 BIN2
8E7 BIN1
3G3 BIN2
5A7 BIN2
5A8 BIN1
6C5 BIN1
6F1 BIN1
3B4 BIN2
5H8 BIN2
3B12 BIN2
6B4 BIN1
實例 3 ： 駱駝科來源之 DLL3 sdAb 的 人類化
使用人類VH3-23生殖系作為支架，使駱駝科來源的例示性DLL3 sdAb L10D9 (SEQ ID NO: 244)、L10E5 (SEQ ID NO: 258)、L8E7 (SEQ ID NO: 264)、L3G3 (SEQ ID NO: 275)、L5A7 (SEQ ID NO: 280)、L5A8 (SEQ ID NO: 287)、L6C5 (SEQ ID NO: 299)及L6F1 (SEQ ID NO: 507)為人類化的。對溶解性、特異性、穩定性及/或親和性有貢獻的駱駝科殘基保持未修飾狀態。另外，所有人類化變異體均含有Leu11Glu (L11E)之修飾及Ser112Lys (S112K)及Ser113Pro (S113P)之羧基端修飾，因為已知此等修飾阻止或減少識別預先存在之ADA針對sdAb的識別(如US20160207981中所述)。
表E2闡述例示性DLL3 sdAb人類化變異體。在一些情況下，sdAb可包括柔性連接子(例如GG)，用於連接至另一多肽，諸如Fc或另一sdAb。 表E2 ：DLL3 sdAb 人類化 變異體
純系名稱 CDR1 SEQ ID NO CDR2 SEQ ID NO CDR3 SEQ ID NO VHH SEQ ID NO
10D9 人類化 變異體
hz10D9v1 GSILSINAMG 319 GFTGDGNTI 336 DVQLFSRDYEFY 354 245
hz10D9v2 GSILSINAMG 319 GFTGDGNTI 336 DVQLFSRDYEFY 354 246
hz10D9v3 GSILSINAMG 319 GFTGEGNTI 337 DVQLFSRDYEFY 354 247
hz10D9v4 GSILSINAMG 319 GFTGDTNTI 338 DVQLFSRDYEFY 354 248
hz10D9v5 GSILSINAMG 319 GFTGDTNTI 338 DVQLFSRDYEFY 354 249
hz10D9v6 GSILSINAMG 319 GFTGDTNTI 338 DVQLFSRDYEFY 354 250
hz10D9v7 GSIFSINAMG 320 GFTGDTNTI 338 DVQLFSRDYEFY 354 251
hz10D9v8 GFTFSINAMG 321 GFTGDTNTI 338 DVQLFSRDYEFY 354 252
hz10D9v9 GFTFSSYAMG 322 GFTGDTNTI 338 DVQLFSRDYEFY 354 253
hz10D9v10 GSIFSSNAMG 323 GFTGDTNTI 338 DVQLFSRDYEFY 354 254
hz10D9v11 GFIFSSYAMG 324 GFTGDTNTI 338 DVQLFSRDYEFY 354 255
hz10D9v12 GSIFSIYAMG 325 GFTGDTNTI 338 DVQLFSRDYEFY 354 256
hz10D9v13 GFIFSINAMG 326 GFTGDTNTI 338 DVQLFSRDYEFY 354 257
10E5 人類化 變異體
hz10E5v1 GFTLDDYTIG 327 CISSSGGSTY 339 YCPVVVGPELGYDY 355 259
hz10E5v2 GFTLDDYTIG 327 CISSSGGSTY 339 YCPVVVGPELGYDY 355 260
hz10E5v3 GFTLDDYTIG 327 CISSSGGSTY 339 YCPVVVGPELGYDY 355 261
hz10E5v4 GFTLDDYTIG 327 CISSSGGSTY 339 YCPVVVGPELGYDY 355 262
hz10E5v5 GFTLDDYTIG 327 CISSSGGSTY 339 YCPVVVGPELGYDY 355 263
8E7 人類化 變異體
hz8E7v1 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 265
hz8E7v2 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 266
hz8E7v3 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 267
hz8E7v4 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 268
hz8E7v5 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 416
hz8E7v6 EIIFSDKSVG 329 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 269
hz8E7v8 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 270
hz8E7v9 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 271
hz8E7v10 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 272
hz8E7v11 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 273
hz8E7v12 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 274
hz8E7v13 EIITSDKSMG 456 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 476
hz8E7v14 EIITSDKSVG 328 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 477
hz8E7v15 EIITSDKSMG 456 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 488
hz8E7v16 EIITSDKSMG 456 GISNVGSTN 340 RDFENEY 356 455
3G3 人類化 變異體
hz3G3v1 GSIFSINAMG 320 GFTGDGMTK 341 DVFTDRDHVDWY 357 276 479
hz3G3v2 GSIFSINAMG 320 GFTGDGMTK 341 DVFTDRDHVDWY 357 277
hz3G3v3 GSIFSINAMG 320 GFTGDGMTK 341 DVFTDRDHVDWY 357 278
hz3G3v4 GSIFSINAMG 320 GFTGDGMTK 341 DVFTDRDHVDWY 357 279
5A7 人類化 變異體
hz5A7v1 GSDFSINAIG 330 GFTGDGVTT 342 DVKIGGDYEWF 358 281
hz5A7v2 GSDFSINAIG 330 GFTGDTVTT 343 DVKIGGDYEWF 358 282
hz5A7v3 GSDFSINAIG 330 GFTGEGVTT 344 DVKIGGDYEWF 358 283
hz5A7v4 GSDFSINAIG 330 GFTGDGVTT 342 DVKIGGDYEWF 358 284
hz5A7v5 GSDFSINAIG 330 GFTGDGVTT 342 DVKIGGDYEWF 358 285
hz5A7v6 GSDFSINAIG 330 GFTGDGVTT 342 DVKIGGDYEWF 358 286
5A8 人類化 變異體
hz5A8v1 GSIFSINAMG 320 VVSSDGRTT 345 REWYSDSDWRDY 359 288
hz5A8v2 GSIFSINAMG 320 VVSSDGRTT 345 REWYSDSDWRDY 359 289
hz5A8v3 GSIFSINAMG 320 VVSSDGRTT 345 REWYSDSDWRDY 359 290
hz5A8v4 GSIFSINAMG 320 VVSSDGRTT 345 REWYSDSDWRDY 359 102
hz5A8v5 GSIFSINAMG 320 VVSSDGRTT 345 REWYSDSDWRDY 359 291
hz5A8v6 GSIFSINAMG 320 VVSSEGRTT 346 REWYSDSDWRDY 359 292
hz5A8v7 GSIFSINAMG 320 VVSSDARTT 347 REWYSDSDWRDY 359 293
hz5A8v8 GSIFSINAMG 320 VVSSDGRTT 345 REWYSDADWRDY 360 294
hz5A8v9 GSIFSINAMG 320 VVSSDGRTT 345 REWYSESDWRDY 361 295
hz5A8v10 GSIFSINAMG 320 VVSSDARTT 347 REWYSDADWRDY 360 296
hz5A8v11 GSIFSINAMG 320 VVSSDGRTT 345 REWYSDSDWRDY 359 297
hz5A8v12 GSIFSINAMG 320 VVSSDGRTT 345 REWYSDSDWRDY 359 298
6C5 人類化 變異體
hz6C5v1 EITFSDKTVG 331 VISNVDSTN 348 RDFENEY 356 300
hz6C5v2 EITFSDKTVG 331 VISNVDSTN 348 RDFENEY 356 301 480
hz6C5v3 EITFSDKTVG 331 VISNVDSTN 348 RDFENEY 356 302
hz6C5v4 EITFSDKTVG 331 VISNVDSTN 348 RDFENEY 356 303
hz6C5v5 EITFSDKTVG 331 VISNVESTN 349 RDFENEY 356 304
hz6C5v6 EITFSDKTVG 331 VISNVDATN 350 RDFENEY 356 305
6F1 人類化 變異體
hz6F1v1 EIIFSDKTVG 332 VISNVDSTN 348 RDFESEY 362 307 508
hz6F1v2 EIIFSDKTVG 332 VISNVDSTN 348 RDFESEY 362 308 509
hz6F1v3 EIIFSDKTVG 332 VISNVDSTN 348 RDFESEY 362 309 510
hz6F1v4 EIIFSDKTVG 332 VISNVDSTN 348 RDFESEY 362 310 511
hz6F1v5 EIIFSDKTVG 332 VISNVDSTN 348 RDFESEY 362 311 512
hz6F1v6 EIIFSDKTVG 332 VISNVESTN 349 RDFESEY 362 312 513
hz6F1v7 EIIFSDKTVG 332 VISNVDATN 350 RDFESEY 362 313 514
3C5 人類化 變異體
hz3C5v1 GSIFSINAMG 320 GFTGDGSTK 384 DVQLLNSDYEFY 395 402 481
hz3C5v2 GSIFSINAMG 320 GFTGDGSTK 384 DVQLLNSDYEFY 395 403 482
hz3C5v3 GSIFSINAMG 320 GFTGDTSTK 410 DVQLLNSDYEFY 395 404 483
hz3C5v4 GSIFSINAMG 320 GFTGEGSTK 411 DVQLLNSDYEFY 395 405 484
hz3C5v5 GSIFSINAMG 320 GFTGDGSTK 384 DVQLLSSDYEFY 412 406 485
hz3C5v6 GSIFSINAMG 320 GFTGDGSTK 384 DVQLLTSDYEFY 413 407 486
hz3C5v7 GSIFSINAMG 320 GFTGDGSTK 384 DVQLLQSDYEFY 414 408 487
hz3C5v8 GSIFSINAMG 320 GFTGDGSTK 384 DVQLLNTDYEFY 415 409 488
大體上如實例2中所述，測試DLL3 sdAb之人類化變異體結合DLL3表現細胞的能力，且與親代sdAb比較結合。此等研究中使用內源性表現DLL3的SHP-77細胞。結果展示於圖 2A-L 中，其證實人類化變異體之結合。在一些情況下，與親代sdAb相比，結合增強。實例 4 ： 產生靶向 DLL3 之 限制性 CD3 結合蛋白的方法
產生多特異性多肽構築體，其含有展現限制性CD3結合的經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv結合區、異二聚體Fc域，及上文所述相對於Fc區定位於胺基端且/或相對於CD3結合區定位於羧基端的一或多個DLL3 sdAb。產生呈多種組態之多特異性構築體，如圖 3A-3E 中所示。在一些情況下，多特異性多肽構築體含有至少一個共刺激受體結合區(CRBR)，該共刺激受體結合區相對於Fc區定位於胺基端且/或相對於CD3結合區定位於羧基端。例示性CRBR為靶向4-1BB共刺激受體的sdAb (例如含有SEQ ID NO: 457、458及459中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；例如SEQ ID NO: 210中所示)。
在例示性構築體中，產生至少編碼雜二聚體多特異性多肽構築體之第一多肽鏈及第二多肽鏈的聚核苷酸，且選殖於質體中以供表現。第一多肽鏈依N端至C端之次序通常包括Fc臼多肽(例如SEQ ID NO: 112或在一些情況下SEQ ID NO: 114中所示)；可裂解或不可裂解連接子，諸如含有蛋白酶之一或多個受質識別位點之連接子；及dsFv抗CD3抗體之可變輕鏈(VL)域(例如SEQ ID NO: 75中所示)。第二多肽鏈依N端至C端之次序通常包括Fc杵多肽(例如SEQ ID NO: 105或在一些情況下SEQ ID NO: 109中所示)；與第一多肽鏈相同之可裂解連接子或相同之不可裂解連接子；及dsFv抗CD3抗體之重鏈可變域(例如SEQ ID NO: 47中所示)。構築體係經由例示性不可裂解連接子GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 127)或含有顆粒酶B之受質識別位點的例示性可裂解連接子GGSGGGGIEPD IGGSGGS (SEQ ID NO: 171)產生。多肽鏈中之一或兩者另外編碼位於Fc域之胺基端及/或位於CD3結合區之羧基端的一或多個DLL3 sdAb，及/或位於Fc域之胺基端及/或位於CD3結合區之羧基端的共刺激受體結合域，其呈現多種組態。
使用聚乙烯亞胺以等莫耳比將編碼雜二聚體限制性CD3結合蛋白之各鏈的獨立質體短暫性轉染於哺乳動物細胞(HEK293或CHO)中。3至7天之後，收集分泌於上清液中之重組蛋白，且藉由蛋白質A層析來純化，隨後進行製備型尺寸排阻層析(SEC)或流過式疏水相互作用層析(HIC)。由於雜二聚體Fc之一條鏈在位置I253R或H435R設計有突變(通常為臼-Fc)，以使得其不結合蛋白質A，因此選擇性地純化雜二聚體蛋白質。利用SEC (使用Superdex-200樹脂的AKTA)或FT-HIC (使用丁基/苯基瓊脂糖凝膠的AKTA)的第二層析步驟移除非所需的交叉配對物種，其含有疏水性更強且為預期分子量兩倍之兩種雜二聚體Fc。
該方法有利於產生雜二聚體多特異性多肽構築體，其含有正確配對之雜二聚體Fc物種及如所述之經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv (例如如SEQ ID NO: 47中所示之具有突變G44C之抗CD3 VH及如SEQ ID NO: 75中所示之具有突變G100C之VL)。經純化之雜二聚體限制性CD3結合蛋白為穩定的且在4攝氏度下長期培育後未積聚交叉配對之物種或增加之蛋白質濃度。
表E3闡述所產生之例示性限制性多特異性構築體： 表E3：DLL3 VHH限制性多特異性構築體
構築體 鏈 N 端 sdAb ( 目標 ) Fc 連接子 CD3 結合域 C 端 sdAb ( 目標 )
      (SEQ ID NO)          (SEQ ID NO)
cx4720    1 10D9 (DLL3) (244) xELL-杵 (G5S)3 Con1 VH 8E7 (DLL3) (264)
2 - xELL-臼 (G5S)3 Con1 VL RH3v5 (41BB) (例如210)
cx3715    1 3B4 (DLL3) (314) hFc-杵 IEPDI Con1 VH 6B4 (DLL3) (517，例如318)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL RH3v5 (41BB) (例如210)
cx4422    1 10D9 (DLL3) (244) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 6F1 (DLL3) (507，例如306)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx3708    1 3B4 (DLL3) (314) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 6B4 (DLL3) (517，例如318)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx3985    1 3B4 (DLL3) (314) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 6F1 (DLL3) (507，例如306)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx3991    1 3B4 (DLL3) (314) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 6C5 (DLL3) (299)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx4888    1 hz10D9v7 (DLL3) (251) xELL-杵 (g5s)3 Con1 VH hz8E7v4 (DLL3) (268)
2 - xELL-臼 (g5s)3 Con1 VL RH3v5 (41BB) (例如210)
cx4890    1 10D9 (DLL3) (244) xELL-杵 (g5s)3 Con1 VH 8E7 (DLL3) (264)
2 - xELL-臼 (g5s)3 Con1 VL -
cx4887    1 hz10D9v7 (DLL3) (251) xELL-杵 (g5s)3 Con1 VH hz8E7v4 (DLL3) (268)
2 - xELL-臼 (g5s)3 Con1 VL -
cx4895    1 10D9 (DLL3) (244) xELL-杵 (g5s)3 Con1 VH 8E7 (DLL3) (264)
2 - xELL-臼 (g5s)3 Con1 VL RH3v5 (41BB) (例如210)
cx4899    1 hz8E7v3 (DLL3) (267) xELL-杵 (g5s)3 Con1 VH hz10D9v7 (DLL3) (251)
2 - xELL-臼 (g5S)3 Con1 VL -
cx4896    1 10D9v7 (DLL3) (251) xELL-杵 (g5s)3 Con1 VH hz8E7v3 (DLL3) (267)
2 - xELL-臼 (g5s)3 Con1 VL RH3v5 (41BB) (例如210)
cx4052    1 3G3 (DLL3) (275) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 6B4 (DLL3) (517，例如318)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx4087    1 3B4 (DLL3) (314) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 5A8 (DLL3) (287)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx4088    1 3B4 (DLL3) (314) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 8E7 (DLL3) (264)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx4059    1 5H8 (DLL3) (515，例如316) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 6B4 (DLL3) (517，例如318)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx4049    1 3B12 (DLL3) (516，例如317) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 6B4 (DLL3) (517，例如318)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx4050    1 6A1 (DLL3) (518，例如315) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 6B4 (DLL3) (517，例如318)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx4060    1 10D9 (DLL3) (244) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 6B4 (DLL3) (517，例如318)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx3711    1 6B4 (DLL3) (517，例如318) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 3B4 (DLL3) (314)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx4406    1 10D9 (DLL3) (244) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 8E7 (DLL3) (264)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx3707    1 6B4 (DLL3) (517，例如318) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 6B4 (DLL3) (517，例如318)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
cx3710    1 3B4 (DLL3) (314) hFc -杵 IEPDI Con1 VH 3B4 (DLL3) (314)
2 - hFc -臼 IEPDI Con1 VL -
實例 5 ： 對經分離之初始 T 細胞 相對於 DLL3 表現癌細胞之結合的比較
使用自健康人類供者白血球採集物分離之PBMC負向富集的T細胞，經由流式細胞術(SONY SA3800光譜分析儀)評估本發明之靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體(在本文中稱為cx4720、cx3715、cx4422、cx3708、cx4052、cx3985、cx4059、cx4087、cx4088、cx4895、cx3991、cx3711、cx4887、cx4896、cx4899、cx4406、cx3707、cx3710、cx4888及cx4890)對初始T細胞表面上之CD3的結合。評估靶向DLL3之代表性限制性CD3接合構築體對T細胞及DLL3表現細胞(SHP-77)的結合。利用特異性針對人類Fc之結合螢光團之二級抗體偵測所結合的cx4720、cx3715、cx4422、cx3708、cx4052、cx3985、cx4059、cx4087、cx4088、cx4895、cx3991、cx3711、cx4887、cx4896、cx4899、cx4406、cx3707、cx3710、cx4888及cx4890，且藉由流式細胞術量測結合。與二級抗體一起培育之細胞僅充當陰性對照。
如圖 4A 至 23A 中所示，發現靶向DLL3之例示性限制性CD3接合分子(cx4720、cx3715、cx4422、cx3708、cx4052、cx3985、cx4059、cx4087、cx4088、cx4895、cx3991、cx3711、cx4887、cx4896、cx4899、cx4406、cx3707、cx3710、cx4888及cx4890)結合表現DLL3之SHP-77細胞。然而，如圖 4B 至 23B 所示，相同構築體不能結合至分離的T細胞。
表E4彙總了例示性分子在此等研究中對DLL3或CD3之親和力，如流式細胞術所測定。表 E4 ：構築體結合親和力
構築體 # DLL3 親和力 CD3 親和力
cx4720 0.115 nM ＞ 200 nM
cx3715 0.044 nM ＞ 200 nM
cx4422 0.183 nM ＞ 200 nM
cx3708 0.138 nM ＞ 200 nM
cx3985 0.084 nM ＞ 200 nM
cx3991 0.155 nM ＞ 200 nM
cx4888 0.134 nM ＞ 200 nM
cx4890 0.062 nM ＞ 200 nM
cx4887 0.410 nM ＞ 200 nM
cx4895 0.065 nM ＞ 200 nM
cx4899 0.397 nM ＞ 200 nM
cx4896 0.339 nM ＞ 200 nM
cx4052 0.186 nM ＞ 200 nM
cx4087 0.597 nM ＞ 200 nM
cx4088 0.093 nM ＞ 200 nM
cx4059 0.134 nM ＞ 200 nM
cx4049 ND ND
cx4050 ND ND
cx4060 ND ND
cx3711 0.357 nM ＞ 200 nM
cx4406 0.320 nM ＞ 200 nM
cx3707 0.208 nM ＞ 200 nM
cx3710 0.315 nM ＞ 200 nM
實例 6 ： 使用報導體分析評估 DLL3 依賴性 CD3 報導體 T 細胞活化
此實例描述對靶向DLL3之多種代表性限制性CD3接合構築體(在本文中稱為cx3707、cx3710、cx3708、cx3711、cx4720、cx4422、cx3715、cx3985、cx3991、cx4894、cx4888、cx4890、cx4887、cx4895、cx4899、cx4052、cx4083、cx4087、cx4088、cx4059、cx4049、cx4050、cx4060及cx4896)活化CD3 NFAT報導體傑卡特細胞株之能力的評估，該傑卡特細胞株與表現DLL3之SHP-77細胞或DLL3陰性細胞株HEK-293自由式細胞共培養。此等分析用於證明儘管經由CD3結合域發生的T細胞結合在經分離之T細胞上受到限制或抑制(如實例5中所示)，但在本文所提供之靶向DLL3之限制性CD3接合構築體結合至同源抗原後，其能夠接合T細胞且介導T細胞活化。
靶向抗原之限制性CD3接合構築體在目標細胞及表現NFAT驅動性綠色螢光蛋白(GFP)之工程化傑卡特細胞之共培養物上滴定。CD3接合引起NFAT信號傳導且產生綠色螢光。利用黏附的目標細胞進行報導體分析時，接種目標細胞，允許在室溫下沈降以均一分佈，且在37℃下培育數小時以容許在添加報導體細胞及靶向抗原之限制性CD3接合構築體之前發生黏附(或部分黏附)。使用IncuCyte ZOOM系統對分析盤進行連續成像，且藉由量測總綠色目標整合強度來測定CD3報導體細胞活化。如圖 24A-24B 及25A-25D 中所示，所評估的靶向DLL3之限制性CD3接合構築體在含有DLL3陽性細胞(SHP-77)的培養物中誘導報導體活性(圖 24A 、25A 、25C )，但T細胞與DLL3陰性細胞株(293 FS)一起培養時，未觀測到可量測的報導體活性(圖 24B 、25B 、25D )。
圖 24A 描繪靶向DLL3上之兩個不同抗原決定基的結果，且與如下觀測結果一致：靶向DLL3之特定sdAB在限制性CD3接合構築體內的位置可能影響結合。cx3707含有靶向DLL3之sdAb 6B4之兩個複本。cx3710含有靶向DLL3之sdAb 3B4之兩個複本。因此，cx3707及cx3710在靶向DLL3方面呈二價且各自識別DLL3上的單一抗原決定基，儘管彼此的抗原決定基不同。cx3708及cx3711各自含有3B4之一個複本及6B4之一個複本且因此以二價雙抗原決定基靶向方式結合DLL3。cx3708具有定位於Fc N端的3B4及定位於CD3結合域C端的6B4。相反，cx3711具有定位於Fc N端的6B4及定位於CD3結合域C端的3B4。在活化T細胞的能力方面，能夠達成雙抗原決定基DLL3結合的構築體(cx3708及cx3711)優於僅能夠達成單抗原決定基DLL3結合的構築體(cx3707及cx3710)，如使用傑卡特CD3-NFAT-GFP報導體所證明。值得注意的是，特異性sdAb在內部的定位亦影響活性，原因在於cx3708在介導T細胞活化方面比cx3711實質上更佳。另外，發現含有靶向DLL3之sdAbs 10D9與8E7及其人類化變異體之組合的構築體介導強CD3信號傳導，如圖 25 中所示。實例 7 ：評估功能活性
此實例描述在人類初始T細胞活體外分析中評估及表徵所測試之靶向DLL3之限制性CD3接合構築體。 1.     T細胞介導之細胞毒性
目標細胞用CytoID紅進行螢光標記。利用黏附的目標細胞SHP-77或HEK-293FS進行細胞毒性分析時，接種目標細胞，允許在室溫下沈降以均一分佈，且在37℃下培育24小時以容許在添加其他分析組分之前發生黏附。自健康人類供者白血球採集物分離之PBMC負向富集初始T細胞，且以10:1至40:1 T細胞與目標細胞比率添加。添加綠色凋亡蛋白酶-3/7試劑，經歷細胞凋亡之細胞的核DNA經螢光標記。抗體在共培養物上滴定，且使用IncuCyte ZOOM系統對分析盤進行連續成像。藉由量測總紅色/綠色重疊目標面積來測定目標細胞死亡。
如圖 26A-26B 中所示，靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體cx4887、cx4896、cx3708、cx4899及cx4406強力誘導T細胞介導之針對抗原陽性細胞株(SHP-77)而非抗原陰性細胞株(HEK-293FS)的細胞毒性，此與強力誘導抗原依賴性T細胞活化的能力一致。此等觀測結果支持，本文中所提供之靶向抗原之限制性CD3形式展現分離之T細胞結合減少，同時維持強的DLL3依賴性T細胞細胞毒性誘導能力。值得注意的是，含有分別定位於N端及C端之靶向DLL3之sdAb人類化變異體hz10D9v7及hz8E7v3的cx4887誘發強的T細胞介導細胞毒性。 2.     T細胞活化
為了評估T細胞活化，收集來自T細胞介導細胞毒性分析的細胞，且用活/死細胞染色劑(live/dead stain)及螢光團結合之抗CD4、抗CD8及/或抗CD25抗體染色。使用SONY SA3800光譜分析儀分析細胞，且藉由量測CD25之表現量來測定CD4+或CD8+ T細胞活化。
圖 27A-27B 及圖 27C-27D 分別描繪CD4 T細胞及CD8 T細胞上之CD25表現的結果(T細胞與DLL3陽性(SHP-77)或DLL3陰性細胞株(HEK-293FS)在例示性構築體存在下培養之後)。如圖 27A-27D 中所示，靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體cx4887、cx4896、cx3708、cx4899及cx4406經由CD3結合來介導DLL3依賴性T細胞活化。因此，結果證明，本發明之靶向DLL3之限制性CD3接合構築體強力誘導CD4與CD8 T細胞之抗原依賴性活化，如根據增強的CD25表現所證明。 3.     T細胞產生細胞介素(ELISA)
藉由夾心ELISA (BioLegend，USA)分析來自T細胞介導細胞毒性分析的上清液中之IFNγ含量。遵循製造商說明書，且產生標準曲線，自該曲線內插得到上清液樣品之細胞介素濃度值。吸光度值低於偵測下限的樣品被指定細胞介素濃度等於最低標準濃度的一半。圖 28 表明靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體cx4887、cx4896、cx3708、cx4899及cx4406誘導T細胞以抗原依賴性方式產生IFNγ。實例 8 ： 經由限制性 CD3 結合產生其他構築體
實例8描述多特異性多肽構築體之產生及表現，該等多特異性多肽構築體含有展現限制性CD3結合的CD3結合區。產生呈多種組態的多特異性構築體，如圖 29A 及29B 中所示，其含有藉由連接子(例如不可裂解連接子)偶合至CD3結合區的免疫球蛋白之雜二聚體Fc區，及一或多個相對於多特異性多肽構築體之Fc區定位於胺基端及/或相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區定位於羧基端的結合腫瘤相關抗原(TAA)之抗原結合域。A. 構築體之設計及產生
產生至少編碼雜二聚體多特異性多肽構築體之第一多肽鏈及第二多肽鏈的聚核苷酸，且選殖於質體中以供表現。第一多肽鏈依N端至C端之次序通常包括第一Fc多肽(例如Fc臼多肽)；不可裂解連接子；及抗CD3抗體之輕鏈可變(VL)域。第二多肽鏈依N端至C端之次序通常包括第二Fc多肽(例如Fc杵多肽)；與第一多肽鏈相同之不可裂解連接子；及抗CD3抗體之重鏈可變(VH)域。抗CD3抗體包括經二硫鍵穩定之(dsFv)抗體(具有突變G44C之抗CD3 VH及具有突變G100C之VL)或含有非經二硫鍵穩定之Fv抗體，如表E5中所示。使用促進多肽鏈雜二聚化的多種例示性Fc多肽對，如表E5中所示。在多種組態中，多肽鏈中之一或兩者另外編碼Fc域胺基端及/或CD3結合區羧基端的一或多個TAA抗原結合域。類似構築體可以利用其他雜二聚體Fc組態產生，包括其他臼包杵組態，諸如所述的任一種組態；其他CD3結合區，包括其他抗CD3抗體，包括dsFv或其他單價片段；或亦可利用其他TAA抗原結合片段，諸如scFv、sdAb或Fab形式。
在所產生的構築體中，不可裂解連接子包括尺寸在3至18個胺基酸範圍的連接子。所產生之例示性分子中使用的不可裂解連接子實例為GGS, GGSGGS (SEQ ID NO: 1)、GGSGGSGGS (SEQ ID NO: 2)、GGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 3)、GGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 4)及GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 127)或GGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 129)。
所提供之多特異性多肽構築體中可以使用結合至TAA的任何抗原結合域。所產生的例示性蛋白質含有結合δ樣3 (DLL3)的抗原結合域。抗原結合域可以包括單鏈片段(例如sdAb或scFv)或兩個鏈抗原結合片段(Fab)。當TAA作為單鏈片段(例如sdAb或scFv)提供時，TAA抗原結合域藉由肽連接子(例如PGGGG (SEQ ID NO: 450))連接於Fc雜二聚體(例如臼及/或杵)之一個或兩個多肽鏈的N端，及/或藉由肽連接子(例如GGGG (SEQ ID NO: 5))連接於CD3結合區之一個或兩個域(例如VH及/或VL)的C端。可以使用其他類似肽連接子。
產生含有1、2或3個TAA抗原結合域(諸如分別提供單價、二價或三價結合)的多特異性多肽構築體。在經工程改造而具有超過一個靶向DLL3之sdAb TAA結合域的構築體中，TAA抗原結合域為不同的，使得所產生的多特異性多肽構築體對同一TAA的至少兩個不同抗原決定基(雙抗原決定基)展現特異性。
所產生的蛋白質為其中TAA抗原結合域以單域抗體(sdAb)形式構成的構築體。所產生的聚核苷酸編碼含有不可裂解連接子之例示性多特異性多肽構築體的多肽鏈。此等物包括靶向DLL-3之含sdAb構築體，該等構築體命名為cx5352、cx5800、cx5801及cx5499，如圖 29A 及29B 中所描繪。構築體經工程改造，其中二硫鍵連接使抗CD3抗體的VH及VL域穩定。值得注意的是，所產生的一些例示性構築體另外含有靶向4-1BB共刺激受體(例如cx5352、cx5800、cx5801)的sdAb (含有SEQ ID NO: 457、458及459中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；例如SEQ ID NO: 210中所示)。cx5499未經工程改造以含有靶向共刺激受體的sdAb。具有sdAb及Fab TAA域之例示性限制性CD3結合構築體的清單明示於下表E5中。
表E5 ： 例示性限制性CD3 接合構築體
構築體ID 鏈 N 端 sdAb (SEQ ID NO) Fc (SEQ ID NO) 連接子 (SEQ ID NO) CD3 結合域 (SEQ ID NO) C 端 sdAb (SEQ ID NO) 二硫鍵 穩定化
cx5352 1 DLL3 sdAb 1 (251) xELL-杵(105、109或442) GGGGGSGGGGGSGGGGGS (127) VH13 (47) DLL3 sdAb2 (455) 是
2 無 xELL-臼(112、114或445) GGGGGSGGGGGSGGGGGS (127) VL10 (75) 共刺激性受體sdAb
cx5800 1 DLL3 sdAb 1 (251) xELL-杵(SEQ ID NO: 105、109或442) GGGGGSGGGGGSGGGGGS (127) VH13 (S47) 無 是
2 無 xELL-臼(112、114或445) GGGGGSGGGGGSGGGGGS (127) VL10 (75) 共刺激性受體sdAb
cx5801 1 無 xELL-杵(105、109或442) GGGGGSGGGGGSGGGGGS (127) VH13 (47) DLL3 sdAb 2 (455) 是
2 無 xELL-臼(112、114或445) GGGGGSGGGGGSGGGGGS (127) VL10 (75) 共刺激性受體sdAb
cx5499 1 DLL3 sdAb1 (251) xELL-杵(105、109或442) GGGGGSGGGGGSGGGGGS (127) VH13 (47) DLL3 sdAb 2 (455) 是
2 無 xELL-臼(112、114或445) GGGGGSGGGGGSGGGGGS (127) VL10 (75) 無
B. 所 產生之構築體的表現及純化
使用聚乙烯亞胺以等莫耳比將編碼雜二聚體限制性CD3結合蛋白之各鏈的獨立質體短暫性轉染於哺乳動物細胞(HEK293或CHO)中。3至14天之後，收集分泌於上清液中之重組蛋白，且藉由蛋白質A層析來純化，隨後進行製備型尺寸排阻層析(SEC)或流過式疏水相互作用層析(HIC)。在一些情況下，在純化期間，雜二聚體蛋白質得以富集，原因在於雜二聚體Fc之一條鏈內在位置I253R或H435R設計有突變(例如臼-Fc)，使得其不結合蛋白質A，且因此，I253R或H435R之均二聚體不純化。利用SEC (使用Superdex-200樹脂的AKTA)或FT-HIC (使用丁基/苯基瓊脂糖的AKTA)的第二層析步驟移除非所需的交叉配對物種，其含有疏水性更強且為預期分子量兩倍之兩種雜二聚體Fc。
該方法有利於產生含有雜二聚體Fc與抗CD3 Fv之正確配對物種(例如經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv)的雜二聚體多特異性多肽構築體。經純化之雜二聚體限制性CD3結合蛋白為穩定的且在4℃下長期培育後未積聚交叉配對之物種或增加之蛋白質濃度。實例 9 ： 評估含有單一或多個抗原結合 DLL3 靶向域之 CD3 限制性多特異性構築體
此實例描述在人類初始T細胞活體外分析中評估及表徵所產生之靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體。
評估以抗DLL3 sdAb (例如cx5352、cx5800、cx5801及cx5499)作為抗原結合域形成之靶向DLL3之限制性CD3接合構築體的結合及活性(參見圖 29A-B 及表E5)。所有測試構築體含有經二硫鍵穩定之抗CD3 Fv (dsFv)，其含有藉由修飾與VL G100C配對之抗CD3 VH G44C而建立的鏈間二硫鍵。另外，靶向DLL-3之構築體經工程改造而含有位於CD3 dsFvC端的共刺激受體sdAb，但cx5499不含此共刺激受體sdAb域。A. 結合
藉由流式細胞術評估含有針對DLL3之抗原結合域之本發明的例示性多特異性多肽構築體對初始T細胞表面上之CD3及對DLL3表現細胞(SHP-77)的結合。如圖 30A 中所示，相較於單價形式cx5800及cx5801，靶向DLL3之二價限制性CD3接合構築體cx5352對DLL3陽性SHP-77細胞呈現更高的親和性結合。所測試的構築體無一者對DLL3陰性初始T細胞呈現結合，如圖 30B 中所描繪。此等結合分析係藉由流式細胞術進行，其中所結合的構築體係利用結合螢光團的抗人類IgG Fc二級抗體偵測。B. T 細胞 報導體活性
在報導體分析中，利用表現NFAT驅動型螢光素酶的傑卡特細胞評估T細胞活性。CD3之促效作用引起NFAT信號傳導且產生可以監測的螢光素酶。在含有針對DLL3抗原之抗原結合域的單價及二價構築體存在下，將NFAT驅動型螢光素酶CD3傑卡特報導體細胞與SHP-77 (DLL3陽性)目標細胞一起共培養(參見圖 29A )。特定言之，如圖 30C 中所示，例示性二價構築體cx5352在此分析中誘導的螢光素酶活性實質上大於例示性單價構築體cx5800及cx5801。C. 細胞毒性
評估靶向DLL3之CD3限制性結合構築體在cx5499存在下的細胞毒性，該構築體形成有兩個位於其胺基端及羧基端的不同sdAb結合域。目標細胞為表現DLL3之細胞株SHP-77。目標細胞以每孔1.0×104 個細胞接種，允許在室溫下沈降以便均一分佈，且在37攝氏度下培育數小時。自健康人類供者白血球採集物分離之PBMC負向富集初始T細胞，且以10:1 T細胞與目標細胞比率添加。添加綠色凋亡蛋白酶-3/7試劑，添加經歷細胞凋亡之細胞之螢光標記核DNA。在共培養物上滴定具有限制性CD3接合活性的多特異性構築體且使用IncuCyte ZOOM系統對分析盤連續成像。藉由量測總紅色/綠色重疊目標面積來測定目標細胞死亡。如圖 31A 中所示，cx5499強力誘導T細胞介導針對SHP-77細胞株之細胞毒性。D. T 細胞 調節
為進一步評估T細胞調節，藉由監測構築體調節T細胞活化標記物之能力來評估例示性多特異性CD3限制結合構築體。為了評估T細胞活化，收集來自上述T細胞細胞毒性分析之懸浮細胞，該等分析涉及將T細胞與DLL3陽性SHP-77細胞一起在cx5499存在下培養。用活/死細胞染色劑及結合螢光團之抗CD4、抗CD8、抗CD25及/或抗CD69抗體將細胞染色。使用SONY SA3800光譜分析儀分析細胞，且藉由量測CD25或CD69表現量或CD25陽性或CD69陽性百分比來測定CD4+或CD8+ T細胞活化。
圖 31B 及圖 31D 分別描繪CD4 T細胞及CD8 T細胞上之CD25表現的結果(在T細胞與DLL3陽性SHP-77細胞一起在靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體cx5499存在下培養之後)。圖 31C 及圖 31E 分別描繪CD4細胞及CD8 T細胞上之CD69表現的結果(在T細胞與DLL3陽性SHP-77細胞一起在靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體cx5499存在下培養之後)。結果表明cx5499經由CD3結合來介導劑量依賴性DLL3依賴性T細胞活化，如根據CD4+及CD8+ T細胞上之增強的CD25及CD69表現所證明。E. 概述
總之，此等結果證明，形成有抗DLL3 sdAb結合域及CRBR的限制性抗CD3構築體能夠結合至DLL3表現細胞株SHP-77且誘發抗原依賴性T細胞活化。此表明本文所述之限制性抗CD3構築體對目標抗原不具有特異性，但有效結合多種抗原以誘發針對目標表現細胞之T細胞細胞毒性及活化。實例 10 ： 含有 DLL3 靶向域之 CD3 限制性多特異性構築體中之共刺激受體結合區的作用
為了比較含有定位於CD3結合域C端之CRBR之DLL3靶向構築體與不含CRBR之構築體的活性，在多種分析中分別測試例示性構築體cx5352及cx5499以評估其對T細胞活性的影響(參見表E5)。A. T 細胞 報導體分析
評估含有共刺激受體結合域之限制性CD3接合構築體介導共刺激信號傳導路徑之特定促效作用的能力。使用傑卡特41BB NFκB螢光素酶報導體細胞測試不具有共刺激受體結合域(cx5499)或具有41BB結合域(cx5352)之靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體。將報導體細胞與DLL3陰性細胞株HEK-293或短暫表現截短型DLL3 (SEQ ID NO: 86之殘基276-618)之HEK-293細胞共培養。如圖 32 中所示，cx5352呈現DLL3依賴性41BB促效作用，其中僅在DLL3表現細胞存在下觀測到穩定的螢光素酶活性。在cx5499存在下觀測到低水準的DLL3依賴性NFkB活化，表明CD3信號傳導在此分析中可能引起一些NFkB活化。B. 細胞毒性活性
自三個不同健康人類供者白血球採集物分離之PBMC負向富集初始人類T細胞，且以10:1-40:1 T細胞與目標細胞比率添加。本文中，目標細胞用CytoID紅標記為紅色，同時用綠色螢光凋亡蛋白酶-3/7受質監測細胞凋亡；因此細胞凋亡的目標細胞為雙重標記有紅色及綠色之目標細胞。使用IncuCyte ZOOM系統對分析盤進行連續成像。藉由量測總紅色/綠色重疊目標面積來測定目標細胞死亡。
在例示性分析中，所測試之CD3接合構築體包括具有結合41BB之CRBR的雙重DLL3靶向sdAb (cx5352)。目標細胞為表現DLL3之SHP-77細胞或不表現DLL3之293FS細胞。如圖 33A 中所示，cx5352能夠誘發T細胞介導抗原特異性細胞毒性。在抗原不存在下未觀測到細胞毒性，如含有DLL3陰性細胞之共培養物中不存在紅色/綠色重疊目標面積所示(圖 33B )。此資料證明具有41BB結合域之靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體誘發T細胞介導抗原特異性細胞毒性的能力。
在類似分析中，自健康人類供者白血球採集物中分離出的人類初始PBMC係以10:1、5:1或1.25:1效應子:目標細胞比率(E:T)添加。將PBMC與表現DLL3之SHP-77目標細胞共培養且在濃度增加之含有靶向DLL3之sdAb、具有CRBR (cx5352)及不具有CRBR (cx5499)的例示性構築體存在下培育。如圖 34A-C 中所示，在所分析的所有三種E:T比率下，cx5352呈現增強的針對目標細胞之細胞毒性。C. T 細胞 細胞介素表現
藉由夾心ELISA (BioLegend, USA)分析來自T細胞介導細胞毒性分析之上清液中的IFNγ含量，該細胞毒性分析實質上如上文所述以SHP-77細胞作為目標細胞進行。遵循製造商說明書，且產生標準曲線，自該曲線內插得到上清液樣品之細胞介素濃度值。吸光度值低於偵測下限的樣品被指定細胞介素濃度等於最低標準濃度的一半。
如圖 35 中所示，相較於缺乏41BB結合域的類似構築體cx5499，併有41BB結合域的靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx5352使得T細胞產生IFNγ增強。實例 11 ： CD3 結合區 在含有抗原靶向域之 CD3 限制性多特異性構築體中之取向的比較 A. 構築體之設計及產生
如圖 36A-B 中所示產生多特異性多肽構築體，其含有藉由連接子(例如不可裂解連接子)偶合至CD3結合區的免疫球蛋白之雜二聚體Fc區；相對於CD3結合區定位於羧基端的作為CRBR之抗原結合域(例如sdAb)；及相對於多特異性多肽構築體之Fc區定位於胺基端及相對於多特異性多肽構築體之CD3結合區定位於羧基端的結合腫瘤相關抗原(TAA)之雙重抗原結合域。所產生的例示性構築體含有sdAb (含有SEQ ID NO: 457、458及459中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；例如SEQ ID NO: 210中所示)。
產生至少編碼雜二聚體多特異性多肽構築體之第一多肽鏈及第二多肽鏈的聚核苷酸，且選殖於質體中以供表現。第一多肽鏈依N端至C端之次序通常包括第一Fc多肽(例如Fc臼多肽)；不可裂解連接子；抗CD3抗體之輕鏈可變域(VL；圖 36B )或重鏈可變域(VH；圖 36A )；及作為CRBR之抗原結合域(例如sdAb)。第二多肽鏈依N端至C端之次序通常包括第一抗原結合域(例如sdAb #1)、第二Fc多肽(例如Fc杵多肽)；與第一多肽鏈相同之連接子；抗CD3抗體之重鏈可變域(VH)或輕鏈可變域(VL)中之另一者；及第二抗原結合域(例如sdAb #2)。抗CD3抗體包括經二硫鍵穩定之(dsFv)抗體(具有突變G44C之抗CD3 VH及具有突變G100C之VL)。
值得注意的是，如圖 36 中所示，CD3 Fv之抗CD3 VH及抗CD3 VL之取向相對於雜二聚體Fc區之Fc杵或Fc臼以不同方式定位。如圖 36A 中所示，產生如下構築體，其中雜二聚體構築體之第一多肽具有定位於Fc杵C端的CD3 Fv之VL及位於遠側N端及C端之抗原結合域，且雜二聚體構築體之第二多肽具有定位於Fc臼C端的CD3 Fv之VH及位於遠側C端之CRBR sdAb。相比之下，圖 36B 描繪一種例示性構築體，其中雜二聚體構築體之第一多肽具有定位於Fc杵C端的CD3 Fv之VL及位於遠側N端及C端之抗原結合域，且雜二聚體構築體之第二多肽具有定位於Fc臼C端的CD3 Fv之VH及位於遠側C端之CRBR sdAb。
構築體實質上如實例4中所述表現且純化。B. T 細胞 報導體活性
為了比較CD3接合，在抗原依賴性CD3報導體分析中藉由評估例示性構築體活化與目標抗原表現細胞共培養之CD3 NFAT報導體傑卡特細胞株的能力來測試該等構築體。藉由監測傑卡特報導體細胞中之綠色螢光或螢光素酶報導體信號來評估活化。
在表現目標抗原之A375細胞或不表現目標抗原之對照CCRF-CEM細胞與表現NFAT驅動性綠色螢光蛋白(GFP)之工程化傑卡特細胞的共培養物上滴定靶向抗原之限制性CD3接合構築體。CD3接合引起NFAT信號傳導且產生綠色螢光。利用黏附的目標細胞進行報導體分析時，接種目標細胞，允許在室溫下沈降以均一分佈，且在37℃下培育數小時以容許在添加報導體細胞及靶向抗原之限制性CD3接合構築體之前發生黏附。使用IncuCyte ZOOM系統對分析盤進行連續成像，且藉由量測總綠色目標整合強度來測定CD3報導體細胞活化。
如圖 37A 中所示，當在報導體T細胞共培養物中在表現抗原之目標細胞存在下培育時，靶向抗原之例示性限制性CD3接合構築體展現介導目標抗原特異性T細胞活化之能力。然而，在具有不表現目標抗原之細胞的共培養物中未觀測到報導體活性(圖 37B )。值得注意的是，相較於具有杵-VL；臼-VH形式之構築體，具有杵-VH；臼-VL形式之構築體呈現增強之T細胞活化。
在類似分析中，在表現目標抗原之A375細胞或不表現目標抗原之對照CCRF-CEM細胞與表現NFAT驅動性螢光素酶之工程化傑卡特細胞的共培養物上滴定靶向抗原之相同限制性CD3接合構築體。如圖 37C 中所示，當在報導體T細胞共培養物中在表現抗原之目標細胞存在下培育時，靶向抗原之例示性限制性CD3接合構築體展現介導目標抗原特異性T細胞活化之能力。同樣，在具有不表現目標抗原之細胞的共培養物中未觀測到報導體活性(圖 37D )。如同GFP報導體分析，相較於具有杵-VL；臼-VH形式之構築體，具有杵-VH；臼-VL形式之構築體呈現增強之T細胞活化。
此等結果與如下觀測結果一致：當CD3 Fv之各組分之取向使得VH及VL分別定位於Fc杵及Fc臼區域C端時，觀測到增強的CD3接合及活性。實例 12 ： 使用報導體分析評估 DLL3 依賴性 CD16 報導體 T 細胞活化
此實例描述對靶向DLL3之例示性sdAb (在本文中稱為cx7886、cx7887、cx3373及cx3425)活化與DLL3表現細胞(DLL3-CHO)共培養之NFAT報導體傑卡特細胞株之Fc效應功能的評估。傑卡特報導體細胞株經工程改造以經由NFAT驅動性螢光素酶報導基因穩定表現CD16a。在DLL3表現細胞(DLL3-CHO；約3×104 個細胞/孔)存在或不存在下接種報導體細胞(約6×104 個細胞/孔)。在細胞上滴定cx7886 (hz10D9v7-Fc)、cx7887 (hz8E7v16-Fc)、cx3373 (3B4-Fc)或cx3425 (6B4-Fc)且分析盤在37攝氏度下培育六小時，最終分析體積為75微升。使分析盤相對於室溫平衡，向樣品孔中添加75微升Bio-Glo，且分析盤在室溫下培育10分鐘。將100微升等分試樣轉移至白色96孔盤中，且使用Clariostar微定量盤式讀取器來量測螢光。圖 38A 描繪所有構築體以抗原依賴性方式活化CD16報導體細胞的能力，其中cx7886 (hz10D9v7-Fc)及cx7887 (hz8E7v16)誘導報導體細胞發生較大活化。如圖 38B 中所示，在DLL3表現細胞不存在下，未觀測到活化。
本發明不希望侷限於所揭示之特定實施例的範疇，該等實施例係為了例如說明本發明之各種態樣而提供。對所述組合物及方法的各種修改由說明書及本文中之教示將變得顯而易見。此類變化形式可在不背離本發明之真正範疇及精神的情況下實施且希望落入本發明之範疇內。 序列
# 序列 註解
1 GGSGGS (GGS)2連接子
2 GGSGGSGGS (GGS)3連接子
3 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接子
4 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接子
5 GGGG 甘胺酸連接子
6 GGGGG 甘胺酸連接子
7 GGGGGG 甘胺酸連接子
8 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGK 人類IgG1 Fc
9 PAPGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VKFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK Fc xELL
10 PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDISVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK 人類IgG2 Fc
11 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVQFKWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST FRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESSGQPEN NYNTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNIFSCSVMH EALHNRFTQK SLSLSPGK 人類IgG3 Fc
12 PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK 人類IgG4 Fc
13 PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLGK 人類IgG4 Fc
14 EPKSSDKTHTCPPC 經修飾之IgG1鉸鏈
15 DKTHTCPPC 截短之IgG1鉸鏈
16 ESKYGPPCPPC 經修飾之IgG4鉸鏈
17 GQGTLVTVKPGG 羧基端序列
18 GQGTLVTVEPGG 羧基端序列
19 QVQLVQSGGG VVQPGRSLRL SCKASGYTFT RYTMHWVRQA PGKGLEWIGYINPSRGYTNY NQKVKDRFTI SRDNSKNTAF LQMDSLRPED TGVYFCARYYDDHYCLDYWG QGTPVTVSS OKT3 VH
20 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVS YMNWYQQTPG KAPKRWIYDTSKLASGVPSR FSGSGSGTDY TFTISSLQPE DIATYYCQQW SSNPFTFGQGTKLQIT OKT3 VL
21 QVQLVQSGGG VVQPGRSLRL SCKASGYTFT RYTMHWVRQA PGKGLEWIGYINPSRGYTNY NQKVKDRFTI SRDNSKNTAF LQMDSLRPED TGVYFCARYYDDHYSLDYWG QGTPVTVSS OKT3人類化VH
22 DVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT RYTMHWVRQA PGQGLEWIGYINPSRGYTNY ADSVKGRFTI TTDKSTSTAY MELSSLRSED TATYYCARYYDDHYCLDYWG QGTTVTVSS OKT3人類化VH
23 QVQLVQSGAE LKKPGASVKV SCKASGYTFT RYTMHWVRQA PGQCLEWMGYINPSRGYTNY NQKFKDKATL TADKSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARYYDDHYSLDYWG QGTLVTVSS OKT3人類化VH
24 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCSASSSVS YMNWYQQKSG TSPKRWIYDTSKLASGVPAH FRGSGSGTSY SLTISGMEAE DAATYYCQQW SSNPFTFGSGTKLEIN OKT3人類化VL
25 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSVS YMNWYQQKPG KAPKRWIYDTSKVASGVPAR FSGSGSGTDY SLTINSLEAE DAATYYCQQW SSNPLTFGGGTKVEIK OKT3人類化VL
26 DIQLTQSPSI LSASVGDRVT ITCRASSSVS YMNWYQQKPG KAPKRWIYDTSKVASGVPYR FSGSGSGTEY TLTISSMQPE DFATYYCQQW SSNPLTFGCGTKVEIKRT OKT3人類化VL
27 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSA 抗CD3 Hv
28 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 Lv
29 TYAMN 抗CD3 VH CDR1
30 RIRSKYNNYATYYADSVKD 抗CD3 VH CDR2
31 HGNFGNSYVSWFAY 抗CD3 VH CDR3
32 RSSTGAVTTSNYAN 抗CD3 VL CDR1
33 GTNKRAP 抗CD3 VL CDR2
34 ALWYSNLWV 抗CD3 VL CDR3
35 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH1
36 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH2
37 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH3
38 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH4
39 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH5
40 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH6
41 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH7
42 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVS 抗CD3 VH8
43 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTTVTVSS 抗CD3 VH9
44 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSYFAYWGQGTTVTVSS 抗CD3 VH10
45 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH11
46 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVKP 抗CD3 VH12
47 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVKP 抗CD3 VH13
48 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGCGTLVTVKP 抗CD3 VH14
49 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH15
50 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH16
51 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH17
52 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH18
53 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH19
54 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH20
55 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH21
56 EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSSLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH22
57 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH23
58 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH24
59 EVKLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKSILYLQMNSLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH25
60 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVSRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH26
61 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKCLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH27
62 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNKYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNNLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYISYWAYWGQGTLVTVS 抗CD3 VH28
63 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTTVTVSS 抗CD3 VH29
64 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSYFAYWGQGTTVTVSS 抗CD3 VH30
65 EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSILYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH31
66 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL1
67 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLEIK 抗CD3 VL2
68 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL3
69 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL4
70 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL5
71 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL6
72 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL7
73 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL8
74 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLEIK 抗CD3 VL9
75 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLEIK 抗CD3 VL10
76 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQCFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGEGTKLEIK 抗CD3 VL11
77 QAVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL12
78 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLEIK 抗CD3 VL13
79 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWTPARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL14
80 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGGGTKLTVL 抗CD3 VL15
81 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESIYFCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL16
82 QAVVTQEPSFSVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQTPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSILGNKAALTITGAQADDESDYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL17
83 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQEKPGQAFRGLIGGTNKRAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL18
84 QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTSGNYPNWVQQKPGQAPRGLIGGTKFLAPGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCVLWYSNRWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL19
85 QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSNYHMGWFRQAPGKERELVAAISGSGGSTYYTDSVKGRFTISRNNAKNTMSLQMSNLKPEDTGVYYCTTPTEKGSSIDYWGQGTQVTVSSGRYPYDVPDY 抗CD3 VHH
86 MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREVATPLFPPLHTGRAGQRQHLLFPYPSSILSVK 典型DLL3序列(例如UniProt編號Q9NYJ7)
87 MVSPRMSGLLSQTVILALIFLPQTRPAGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYLLPPALGLLVAAGVAGAALLLVHVRRRGHSQDAGSRLLAGTPEPSVHALPDALNNLRTQEGSGDGPSSSVDWNRPEDVDPQGIYVISAPSIYAREA 非典型DLL3序列(例如UniProt編號Q9NYJ7-2)
88 GGSGGS (GGS)2連接子
89 GGSGGSGGS (GGS)3連接子
90 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接子
91 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接子
92 GGGG 甘胺酸連接子
93 GGGGG 甘胺酸連接子
94 GGGGGG 甘胺酸連接子
95 GGSGGS (GGS)2連接子
96 GGSGGSGGS (GGS)3連接子
97 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接子
98 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接子
99 GGGG 甘胺酸連接子
100 GGGGG 甘胺酸連接子
101 GGGGGG 甘胺酸連接子
102 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAVVSSDGRTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSDSDWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v4
103 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 杵Fc
104 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 臼Fc
105 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 杵Fc
106 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPT 臼Fc
107 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 杵Fc
108 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 臼Fc
109 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 杵Fc
110 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 臼Fc
111 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPT 臼Fc
112 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPT 臼Fc
113 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG 臼Fc
114 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPG 臼Fc
115 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPT 杵Fc
116 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPT 杵Fc
117 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG 杵Fc
118 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSPG 杵Fc
119 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPT 臼Fc
120 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPT 臼Fc
121 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG 臼Fc
122 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSPG 臼Fc
123 (GGGGS)n，其中n為1至5 連接子
124 (GGGGGS)n，其中n為1至4 連接子
125 GGGGS 連接子
126 GGGGGS 連接子
127 GGGGGSGGGGGSGGGGGS 連接子
128 GGGGSGGGGSGGGGS 連接子
129 GGSGGGGSGGGGSGGGGS 連接子
130 GlyxXaa-Glyy-Xaa-Glyz Xaa獨立地選自A、V、L、I、M、F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、K、R、H、D或E x、y及z各自為1-5範圍內之整數 連接子
131 Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly-Xaa-Gly-Gly-Gly Xaa獨立地選自A、V、L、I、M、F、W、P、G、S、T、C、Y、N、Q、K、R、H、D或E 連接子
132 (SSSSG)n n=1-9 連接子
133 GGGGG-C-GGGGG 連接子
134 (EAAAK)n n=2-20 連接子
135 AS-(AP)n-GT n=2-20 連接子
136 AS-(EAAAK)n-GT n=2-20 連接子
137 (GGGGA)n n=2-20 連接子
138 (PGGGS)n n=2-20 連接子
139 (AGGGS)n n=2-20 連接子
140 GGS-(EGKSSGSGSESKST)n-GGS n=2-20 連接子
141 SSSASASSA 連接子
142 GSPGSPG 連接子
143 ATTTGSSPGPT 連接子
144 X1 X2 X3 X4 X5 (P4 P3 P2 P1↓P1') X1= I、L、Y、M、F、V或A；(P4 = I、L、Y、M、F、V或A) X2 = A、G、S、V、E、D、Q、N或Y；(P3 = A、G、S、V、E、D、Q、N或Y) X3 = H、P、A、V、G、S或T；(P2 = H、P、A、V、G、S或T) X4 = D或E；(P1 = D或E) X5 = I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A (P1'= I、L、Y、M、F、V、T、S、G或A) 連接子共同序列
145 X1 E X3 D X5 (P4 P3 P2 P1↓P1') X1 = I或L; (P4 = I或L) (P3 = E) X3 = P或A; (P2 = P或A) X5 = I、V、T、S或G (P1'= I、V、T、S或G) 連接子共同序列
146 LEAD 顆粒酶B受質
147 LEPD 連接子
148 LEAE 連接子
149 IEPDI 連接子
150 LEPDG 連接子
151 LEADT 連接子
152 IEPDG 連接子
153 IEPDV 連接子
154 IEPDS 連接子
155 IEPDT 連接子
156 X1QARX5 (P1QAR↓(A/V)) X1 =任何胺基酸；(P1為任何胺基酸) X5 = A或V 連接子共同序列
157 RQARX5 (RQAR(A/V)) X5 = A或V 連接子
158 RQAR 間質蛋白酶受質
159 RQARV 連接子
160 X1X2 X3 X4 (P3 P2 P1↓P1') X1 = P、V或A；(P3 = P, V或A) X2 = Q或D；(P2 = Q或D) X3 = A或N；(P1 = A或N) X4 = L、I或M  (P1'= L, I或M) 連接子共同序列
161 PX2X3X4  (P3 P2 P1↓P1') (P3 = P) X2 = Q或D；(P2 = Q或D) X3 = A或N；(P1為A或N) X4 = L或I (P1'為L或I) 連接子共同序列
162 PAGL MMP受質
163 TGLEADGSPAGLGRQARVG 連接子
164 TGLEADGSRQARVGPAGLG 連接子
165 TGSPAGLEADGSRQARVGS 連接子
166 TGPAGLGLEADGSRQARVG 連接子
167 TGRQARVGLEADGSPAGLG 連接子
168 TGSRQARVGPAGLEADGS 連接子
169 TGPAGLGSRQARVGLEADGS 連接子
170 GPAGLGLEPDGSRQARVG 連接子
171 GGSGGGGIEPDIGGSGGS 連接子
172 GGSGGGGLEADTGGSGGS 連接子
173 GSIEPDIGS 連接子
174 GSLEADTGS 連接子
175 GGSGGGGIEPDGGGSGGS 連接子
176 GGSGGGGIEPDVGGSGGS 連接子
177 GGSGGGGIEPDSGGSGGS 連接子
178 GGSGGGGIEPDTGGSGGS 連接子
179 GGGSLEPDGSGS 連接子
180 GPAGLGLEADGSRQARVG 連接子
181 GGEGGGGSGGSGGGS 連接子
182 GSSAGSEAGGSGQAGVGS 連接子
183 GGSGGGGLEAEGSGGGGS 連接子
184 GGSGGGGIEPDPGGSGGS 連接子
185 TGGSGGGGIEPDIGGSGGS 連接子
186 ACPWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEANSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 41BBL
187 EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKIYPGDSYTNYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSS 41BB VH
188 SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVL 41BB VL
189 QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYYWSWIRQSPEKGLEWIGEINHGGYVTYNPSLESRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDYGPGNYDWYFDLWGRGTLVTVSS 41BB VH
190 EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPALTFGGGTKVEIK 41BB VL
191 QMQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFSGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWVNPMSGGTNYAQKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGMAMRLELDKWGQGTLVTVSS 41BB VH
192 SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSVVFGGGTQLTVL 41BB VL
193 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIKLREDKDPNKMMATIYELKEDKSYNVTGVTFDDKKCTYAISTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
194 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIRLREDKDPIKMMATIYELKEDKSYDVTMVKFDDKKCMYDIWTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
195 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIRLREDKDPNKMMATIYELKEDKSYDVTAVAFDDKKCTYDIWTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
196 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIKLREDKDPNKMMATIYELKEDKSYDVTAVAFDDKKCTYDIWTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
197 QDSTSDLIPA PPLSKVPLQQ NFQDNQFHGK WYVVGQAGNI KLREDSKMMA TIYELKEDKS YDVTGVSFDD KKCTYAIMTF VPGSQPGEFT LGKIKSFPGH TSSLVRVVST NYNQHAMVFF KFVFQNREEF YITLYGRTKE LTSELKENFI RFSKSLGLPE NHIVFPVPID QCIDG 41BB抗運載蛋白
198 QDSTSDLIPA PPLSKVPLQQ NFQDNQFHGK WYVVGQAGNI KLREDKDPVK MMATIYELKE DKSYDVTGVT FDDKKCRYDI STFVPGSQPG EFTFGKIKSF PGHTSSLVRV VSTNYNQHAM VFFKFVFQNR EEFYITLYGR TKELTSELKE NFIRFSKSLG LPENHIVFPV PIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
199 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIRLREDKDPHKMMATIYELKEDKSYDVTGVTFDDKKCTYAISTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
200 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIKLREDKDPNKMMATIYELKEDKSYDVTGVTFDDKKCTYAISTLVPGSQPGEFTFGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
201 QDSTSDLIPAPPLSKVPLQQNFQDNQFHGKWYVVGQAGNIRLREDKDPSKMMATIYELKEDKSYDVTAVTFDDKKCNYAISTFVPGSQPGEFTLGKIKSFPGHTSSLVRVVSTNYNQHAMVFFKFVFQNREEFYITLYGRTKELTSELKENFIRFSKSLGLPENHIVFPVPIDQCIDG 41BB抗運載蛋白
202 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 人類41BBL之71-254
203 LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 人類41BBL之85-254
204 DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 人類41BBL之80-254
205 PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGLPSPRSE 人類4-lBBL之52-254
206 REGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 人類41BBL之71-248
207 LDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 人類41BBL之85-248
208 DPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 人類41BBL之80-248
209 PWAVSGARASPGSAASPRLREGPELSPDDPAGLLDLRQGMFAQLVAQNVLLIDGPLSWYSDPGLAGVSLTGGLSYKEDTKELVVAKAGVYYVFFQLELRRVVAGEGSGSVSLALHLQPLRSAAGAAALALTVDLPPASSEARNSAFGFQGRLLHLSAGQRLGVHLHTEARARHAWQLTQGATVLGLFRVTPEIPAGL 人類41BBL之52-248
210 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFSFSINAMGWYRQAPGKRREFVAAIESGRNTVYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGLLKGNRVVSPSVAYWGQGTLVTVKP 41BB sdAb
211 QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL OX40配位體
212 QVSHRYPRFQ SIKVQFTEYK KEKGFILTSQ KEDEIMKVQN NSVIINCDGF YLISLKGYFS QEVNISLHYQ KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGEL ILIHQNPGEFCVL OX40配位體
213 QVSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL OX40配位體
214 QVSHRYPRIQ SIKVQFTEYK KEKGFILTSQ KEDEIMKVQN NSVIINCDGF YLISLKGYFS QEVNISLHYQ KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGEL ILIHQNPGEFCVL OX40配位體
215 VSHRYPRIQSIKVQFTEYKKEKGFILTSQKEDEIMKVQNNSVIINCDGFYLISLKGYFSQEVNISLHYQKDEEPLFQLKKVRSVNSLMVASLTYKDKVYLNVTTDNTSLDDFHVNGGELILIHQNPGEFCVL OX40配位體
216 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPDNGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQGTLVTVSS OX40 VH
217 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRT OX40 VL
218 EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSGSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANSYATAYAASVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTSGIYDSSGYDYWGQGTLVTVSS OX40 VH
219 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK OX40 VL
220 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTFSDAFMYWVRQAPGKGLEWVSSISNRGLKTAYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCSRDVDGDFRGQGTLVTVKP OX40 sdAb
221 QLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFIS GITR配位體
222 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVASISSGGTTYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVGGYYDSMDYWGQGTLVTVSS GITR VH
223 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASESVDNYGVSFMNWYQQKPGQAPRLLIYAASNQGSGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTKEVTWTFGQGTKVEIK GITR VL
224 QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIWWDDDKYYQPSLKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARTRRYFPFAYWGQGTLVTVSS GITR VH
225 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQNVGTNVAWYQQKPGQAPRLLIYSASYRYSGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNTDPLTFGGGTKVEIK GITR VL
226 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSGGYFWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGTTYYNPSLKSRVTISIDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDLFYYDTSGPRGFDPWGQGTLVTVSS GITR VH
227 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQTVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGSSTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDSSPWTFGQGTKVEIK GITR VL
228 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYPGSNKYYAESVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGELGRYYYYGMDVWGQGTTVTVSS GITR VH
229 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTVTCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKRLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNNYPWTFGQGTKVDIK GITR VL
230 EVQLLESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVFSIDAMGWYRQAPGKQRELVAVLSGISSAKYAASAPGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYADVSTGWGRDAHGYWGQGTLVTV GITR sdAb
231 MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP UniProt編號P32970；CD70-ECD殘基39-193 (加下劃線)
232 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSGNWGFFDYWGQGTLVTVSS CD70 VH
233 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPEKAPKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNTYPRTFGQGTKVEIK CD70 VL
234 QVQLQQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGSIFSINGMGWYRQAPGKERELVAGLTSGGSVTNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCRAEIFTRTGENYYGMDYWGKGTQVTVKP ICOS sdAb
235 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGRMFSNYAMGWFRQAPGKEREFVAAINYRRDAADYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCGFTYAGWASSRRDDYNYWGQGTLVTVKP CD28 sdAb
236 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR CD3ζ信號傳導域
237 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL 4-1BB衍生的共刺激域
238 SKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28衍生的共刺激域
239 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28衍生的共刺激域2
240 FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS CD28衍生的共刺激域3
241 KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEASRPAAGGAVHTRGLDFASDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC CD8衍生的鉸鏈及跨膜域
242 AKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT CD8衍生的鉸鏈及跨膜域
243 KPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT CD8鉸鏈及跨膜域
244 EVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSILSINAMGWYRQPPGKQREMVAGFTGDGNTIYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTQVTVKP L10D9
245 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSILSINAMGWYRQAPGKQREMVAGFTGDGNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v1
246 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSILSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v2
247 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSILSINAMGWYRQAPGKQREMVAGFTGEGNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v3
248 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSILSINAMGWYRQAPGKQREMVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v4
249 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSILSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v5
250 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSILSINAMGWYRQPPGKQRELVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v6
251 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v7
252 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v8
253 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v9
254 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSSNAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v10
255 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFIFSSYAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v11
256 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSIYAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v12
257 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTNTIYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLFSRDYEFYWGQGTLVTVKP hz10D9v13
258 EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYTIGWFRQFPGKEREGVSCISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVWLQMNDLKSEDTAIYYCATYCPVVVGPELGYDYWGQGTQVTVKP L10E5
259 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYTIGWFRQAPGKEREGVSCISSSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCATYCPVVVGPELGYDYWGQGTLVTVKP hz10E5v1
260 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYTIGWFRQAPGKEREGVSCISSSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTVWLQMSSLRAEDTAVYYCATYCPVVVGPELGYDYWGQGTLVTVKP hz10E5v2
261 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYTIGWFRQAPGKEREGVSCISSSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNDLRAEDTAVYYCATYCPVVVGPELGYDYWGQGTLVTVKP hz10E5v3
262 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYTIGWFRQAPGKEREGVSCISSSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCATYCPVVVGPELGYDYWGQGTLVTVKP hz10E5v4
263 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFTLDDYTIGWFRQFPGKEREGVSCISSSGGSTYYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCATYCPVVVGPELGYDYWGQGTLVTVKP hz10E5v5
264 EVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCGPSEIITSDKSVGWWRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMNSLKPEDTAVYYCYARDFENEYWGRGTQVTVKP L8E7
265 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIITSDKSVGWWRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v1
266 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIITSDKSVGWWRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v2
267 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSVGWWRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v3
268 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIITSDKSVGWWRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLFLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v4
269 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIIFSDKSVGWWRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v6
270 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSVGWYRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v8
271 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSVGWVRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v9
272 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSVGWWRQAPGKQRELVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v10
273 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSVGWFRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v11
274 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSVGWWRQAPGKGRELVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v12
275 QVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYREAPGKQRELVAGFTGDGMTKYAESVKGRFTFSRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTGVYYCAADVFTDRDHVDWYWGQGTQVTVKP L3G3
276 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGMTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVFTDRDHVDWYWGQGTLVTVKPGG hz3G3v1
277 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYREAPGKQRELVAGFTGDGMTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVFTDRDHVDWYWGQGTLVTVKP hz3G3v2
278 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGMTKYAESVKGRFTFSRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVFTDRDHVDWYWGQGTLVTVKP hz3G3v3
279 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGMTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTGVYYCAADVFTDRDHVDWYWGQGTLVTVKP hz3G3v4
280 EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGSDFSINAIGWYRQAPGKQRDMVAGFTGDGVTTYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADVKIGGDYEWFWGQGTQVTVKP L5A7
281 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSDFSINAIGWYRQAPGKQRDMVAGFTGDGVTTYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVKIGGDYEWFWGQGTLVTVKP hz5A7v1
282 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSDFSINAIGWYRQAPGKQRDMVAGFTGDTVTTYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVKIGGDYEWFWGQGTLVTVKP hz5A7v2
283 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSDFSINAIGWYRQAPGKQRDMVAGFTGEGVTTYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVKIGGDYEWFWGQGTLVTVKP hz5A7v3
284 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSDFSINAIGWYRQAPGKQRDLVAGFTGDGVTTYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVKIGGDYEWFWGQGTLVTVKP hz5A7v4
285 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSDFSINAIGWYRQAPGKQRDWVAGFTGDGVTTYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVKIGGDYEWFWGQGTLVTVKP hz5A7v5
286 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSDFSINAIGWYRQPPGKQRDMVAGFTGDGVTTYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVKIGGDYEWFWGQGTLVTVKP hz5A7v6
287 QVQLVQSGGGLVQAGESLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQVLGKQRELVAVVSSDGRTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVSLQMNSLKPEDTGVYYCGVREWYSDSDWRDYEGQGTQVTVKP L5A8
288 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAVVSSDGRTTVAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSDSDWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v1
289 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAVVSSDGRTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSDSDWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v2
290 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQVLGKQRELVAVVSSDGRTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSDSDWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v3
291 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAVVSSDGRTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTGVYYCGVREWYSDSDWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v5
292 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAVVSSEGRTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSDSDWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v6
293 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAVVSSDARTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSDSDWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v7
294 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAVVSSDGRTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSDADWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v8
295 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAVVSSDGRTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSESDWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v9
296 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAVVSSDARTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSDADWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v10
297 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQREWVAVVSSDGRTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSDSDWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v11
298 EVQLVESGGGEVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAVVSSDGRTTVAPSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGVREWYSDSDWRDYEGQGTLVTVKP hz5A8v12
299 QVQLQESGGGLVQTGGSLTLSCGASEITFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAHSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCHARDFENEYWGRGTQVTVKP L6C5
300 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEITFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCHARDFENEYWGQGTLVTVKP hz6C5v1
301 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEITFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCHARDFENEYWGQGTLVTVKPG hz6C5v2
302 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEITFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAHSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCHARDFENEYWGQGTLVTVKP hz6C5v3
303 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGASEITFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCHARDFENEYWGQGTLVTVKP hz6C5v4
304 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEITFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVESTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCHARDFENEYWGQGTLVTVKP hz6C5v5
305 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEITFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDATNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCHARDFENEYWGQGTLVTVKP hz6C5v6
306 QVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCGASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYARDFESEYWGRGTQVTVK L6F1
307 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVK hz6F1v1
308 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVK hz6F1v2
309 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVK hz6F1v3
310 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVK hz6F1v4
311 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGRGTQVTVK hz6F1v5
312 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVESTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVK hz6F1v6
313 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDATNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVK hz6F1v7
314 QVQLQQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSDFSINAMGWYRQGELVAGFTGDGNPIYADSVKGRFTISRGNAENTVSLQMNSLKPEDTAVYYCAADVKIGGDYEWYWGQGTQVTVKP 3B4
315 QVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGFSLDDYTIGWFRQAPGKEREGVSCISSSGGSTVHADSVKGRFTISRDNAKNTVWLQMNSLKPEDTAVYYCATWCGVATMTEDLPFDYWGQGTLVTVK 6A1
316 QVQLQESGGGLVQAGGSLTLSCAASGSIFSINAMGWYRQGDLVAGFTSEGSAKYADSVKGRFTISRDDAKNMVTLQMNSLKPEDTAVYYCAADIFSDRDHVDWYWGQGTLVTVK 5H8
317 QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLDDYTIGWFRQAPGKEREGVSCISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATYCPVTIADELGFDYWGQGTLVTVK 3B12
318 QVTLRESGGGLVQAGGSLRLSCGASEITLSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAHSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYARDFEAEYWGQGTLVTVK 6B4
319 GSILSINAMG CDR-H1 (L10D9, hz10D9v1,2,3,4,5,6)
320 GSIFSINAMG CDR-H1 (hz10D9v7, L3G3, hz3G3v1,2,3,4, L5A8, hz5A8v1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, DLL3-5H8-3245.seq, DLL3-3G12-3245.seq, DLL3-3C9-3245.seq, DLL3-3C5-3245.seq, DLL3-3F6-3245.seq, DLL3-3H12-3245.seq, 3C5, hz3C5v1,2,3,4,5,6,7,8)
321 GFTFSINAMG CDR-H1 (hz10D9v8)
322 GFTFSSYAMG CDR-H1 (hz10D9v9)
323 GSIFSSNAMG CDR-H1 (hz10D9v10)
324 GFIFSSYAMG CDR-H1 (hz10D9v11)
325 GSIFSIYAMG CDR-H1 (hz10D9v12)
326 GFIFSINAMG CDR-H1 (hz10D9v13)
327 GFTLDDYTIG CDR-H1 (L10E5, hz10E5v1,2,3,4,5)
328 EIITSDKSVG CDR-H1 (L8E7, hz8E7v1,2,3,4,5,8,9,10,11,12,14)
329 EIIFSDKSVG CDR-H1 (hz8E7v6)
330 GSDFSINAIG CDR-H1 (L5A7, hz5A7v1,2,3,4,5,6)
331 EITFSDKTVG CDR-H1 (L6C5, hz6C5v1,2,3,4,5,6)
332 EIIFSDKTVG CDR-H1 (L6F1, hz6F1v1,2,3,4,5,6,7)
333 GSDFSINAMG CDR-H1 (3B4)
334 GFSLDDYTIG CDR-H1 (DLL3-6A1-3245.seq, DLL3-3B12-3245.seq)
335 EITLSDKTVG CDR-H1 (DLL3-6B4-3245.seq)
336 GFTGDGNTI CDR-H2 (L10D9, hz10D9v1,2)
337 GFTGEGNTI CDR-H2 (hz10D9v3)
338 GFTGDTNTI CDR-H2 (hz10D9v4,5,6,7,8,9,10,11,12,13)
339 CISSSGGSTY CDR-H2 (L10E5, hz10E5v1,2,3,4,5, DLL3-3B12-3245.seq)
340 GISNVGSTN CDR-H2 (L8E7, hz8E7v1,2,3,4,5,6,8,9,10,11,12, 13, 14, 15, 16)
341 GFTGDGMTK CDR-H2 (L3G3, hz3G3v1,2,3,4, DLL3-3G12-3245.seq, DLL3-3H12-3245.seq)
342 GFTGDGVTT CDR-H2 (L5A7, hz5A7v1,4,5,6)
343 GFTGDTVTT CDR-H2 (hz5A7v2)
344 GFTGEGVTT CDR-H2 (hz5A7v3)
345 VVSSDGRTT CDR-H2 (L5A8, hz5A8v1,2,3,4,5,8,9,11,12, DLL3-3E7-3245.seq)
346 VVSSEGRTT CDR-H2 (hz5A8v6)
347 VVSSDARTT CDR-H2 (hz5A8v7,10)
348 VISNVDSTN CDR-H2 (L6C5, hz6C5v1,2,3,4, L6F1, hz6F1v1,2,3,4,5, DLL3-6B4-3245.seq)
349 VISNVESTN CDR-H2 (hz6C5v5, hz6F1v6)
350 VISNVDATN CDR-H2 (hz6C5v6,hz6F1v7 )
351 GFTGDGNPI CDR-H2 (3B4)
352 CISSSGGSTV CDR-H2 (DLL3-6A1-3245.seq)
353 GFTSEGSAK CDR-H2 (DLL3-5H8-3245.seq)
354 DVQLFSRDYEFY CDR-H3 (L10D9, hz10D9v1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13)
355 YCPVVVGPELGYDY CDR-H3 (L10E5, hz10E5v1,2,3,4,5)
356 RDFENEY CDR-H3 (L8E7, hz8E7v1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13, 14, 15, 16; L6C5, hz6C5v1,2,3,4,5,6)
357 DVFTDRDHVDWY CDR-H3 (L3G3, hz3G3v1,2,3,4, DLL3-3G12-3245.seq)
358 DVKIGGDYEWF CDR-H3 (L5A7, hz5A7v1,2,3,4,5,6)
359 REWYSDSDWRDY CDR-H3 (L5A8, hz5A8v1,2,3,4,5,6,7,11,12, DLL3-3E7-3245.seq)
360 REWYSDADWRDY CDR-H3 (hz5A8v8,10)
361 REWYSESDWRDY CDR-H3 (hz5A8v9)
362 RDFESEY CDR-H3 (L6F1, hz6F1v1,2,3,4,5,6,7)
363 DVKIGGDYEWY CDR-H3 (3B4)
364 WCGVATMTEDLPFDY CDR-H3 (DLL3-6A1-3245.seq)
365 DIFSDRDHVDWY CDR-H3 (DLL3-5H8-3245.seq)
366 YCPVTIADELGFDY CDR-H3 (DLL3-3B12-3245.seq)
367 RDFEAEY CDR-H3 (DLL3-6B4-3245.seq)
368 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAFRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLTVL 抗CD3 VL (CON)
369 GGSGGS (GGS)2連接子
370 GGSGGSGGS (GGS)3連接子
371 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接子
372 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接子
373 GGGG 甘胺酸連接子
374 GGGGG 甘胺酸連接子
375 GGGGGG 甘胺酸連接子
376 GGSGGS (GGS)2連接子
377 GGSGGSGGS (GGS)3連接子
378 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接子
379 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接子
380 GGGG 甘胺酸連接子
381 GGGGG 甘胺酸連接子
382 GGGGGG 甘胺酸連接子
383 GGGGGG 甘胺酸連接子
384 GFTGDGSTK CDR-H2 (3C5, hz3C5v1,2,5,6,7,8)
385 GGSGGS (GGS)2連接子
386 GGSGGSGGS (GGS)3連接子
387 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接子
388 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接子
389 GGGG 甘胺酸連接子
390 GGGGG 甘胺酸連接子
391 GGGGGG 甘胺酸連接子
392 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接子
393 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接子
394 GGGG 甘胺酸連接子
395 DVQLLNSDYEFY CDR-H3 (3C5, hz3C5v1,2,3,4)
396 GGSGGS (GGS)2連接子
397 GGSGGSGGS (GGS)3連接子
398 GGSGGSGGSGGS (GGS)4連接子
399 GGSGGSGGSGGSGGS (GGS)5連接子
400 GGGG 甘胺酸連接子
401 QVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQPPGKQRELVAGFTGDGSTKYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADVQLLNSDYEFYWGQGTQVTVKP 3C5
402 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLNSDYEFYWGQGTLVTVKPGG hz3C5v1
403 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQPPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLNSDYEFYWGQGTLVTVKPGG hz3C5v2
404 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLNSDYEFYWGQGTLVTVKPGG hz3C5v3
405 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGEGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLNSDYEFYWGQGTLVTVKPGG hz3C5v4
406 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLSSDYEFYWGQGTLVTVKPGG hz3C5v5
407 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLTSDYEFYWGQGTLVTVKPGG hz3C5v6
408 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLQSDYEFYWGQGTLVTVKPGG hz3C5v7
409 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLNTDYEFYWGQGTLVTVKPGG hz3C5v8
410 GFTGDTSTK CDR-H2 (hz3C5v3)
411 GFTGEGSTK CDR-H2 (hz3C5v4)
412 DVQLLSSDYEFY CDR-H3 (hz3C5v5)
413 DVQLLTSDYEFY CDR-H3 (hz3C5v6)
414 DVQLLQSDYEFY CDR-H3 (hz3C5v7)
415 DVQLLNTDYEFY CDR-H3 (hz3C5v8)
416 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSVGWWRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v5
417 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKGRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v1
418 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v2
419 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v3
420 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v4
421 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v5
422 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v6
423 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v7
424 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v8
425 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v9
426 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v10
427 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v11
428 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v12
429 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRELVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v13
430 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v14
431 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v15
432 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v16
433 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG hz18H10v17
434 GSMTGANTMG CDR1
435 GSVTGANTMG CDR1
436 GSITGANTMG CDR1
437 LIGNYVTH CDR2
438 YTDNLGTS CDR3
439 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCVASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYHYADSVKGRFTISRENAKNTVILQMNSLNPEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKPGG 18H10
440 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 杵Fc
441 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 臼Fc
442 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 杵Fc
443 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMRSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP 臼Fc
444 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSP 臼Fc
445 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSP 臼Fc
446 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSP 杵Fc
447 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNHYTQKSLSLSP 杵Fc
448 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSP 臼Fc
449 DKTHTCPPCPAPGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVVHEALHNRYTQKSLSLSP 臼Fc
450 PGGGG 連接子
451 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVL CD3-VL20
452 QAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWVQQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDEADYYCALWYSNHWVFGCGTKLTVL CD3-VL21
453 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSS CD3-VH32
454 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVARIRSKYNNYATYYADTVKGRFTISRDDAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTV CD3-VH34
455 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSMGWVRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v16
456 EIITSDKSMG CDR-H1 (L8E7, hz8E7v13, 15, 16)
457 GFSFSINAMG 41BB CDR1
458 AIESGRNTV 41BB CDR2
459 LKGNRVVSPSVAY 41BB CDR3
460 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKCLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSS CD3-VH33
461 GFTFNTYAMN 抗CD3 VH CDR1
462 RIRSKYNNYATY 抗CD3 VH CDR2
463 HGNFGDSYVSWFAY CD3-VH7, VH33 CDR3
464 ALWYSNHWV CD3-VL2, VL21 CDR3
465 VLWYSNRWV CD3-VL8 CDR3
466 GFTFSTYAMN CD3 VH33 CDR1
467 RIRSKYNNYATY CD3 VH33 CDR2
468 GSSTGAVTTSNYAN CD3 VL21 CDR1
469 GTNKRAP CD3 VL21 CDR2
470 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGFSFSINAMGWYRQAPGKRREFVAAIESGRNTVYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCGLLKGNRVVSPSVAYWGQGTLVTVKP 41BB sdAb
471 IEPDP 連接子
472 DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEEYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCDVSGFYPSDIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQGDVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Fc-Het-1
473 DKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREQMTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Fc-Het-2
474 GGS(GGS)n，其中n=0至10 連接子
475 AGVFELQIHSFGPGPGPGAPRSPCSARLPCRLFFRVCLKPGLSEEAAESPCALGAALSARGPVYTEQPGAPAPDLPLPDGLLQVPFRDAWPGTFSFIIETWREELGDQIGGPAWSLLARVAGRRRLAAGGPWARDIQRAGAWELRFSYRARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECEAPLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCTVPVSTSSCLSPRGPSSATTGCLVPGPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCEVSGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCEHDLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCRERADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCEFPVHPDGASALPAAPPGLRPGDPQRYL DLL3 ECD；人類DLL3之胺基酸27-492，UniProt編號Q9NYJ7
476 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSMGWWRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v13
477 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSVGWVRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v14
478 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGPSEIITSDKSMGWVRQAPGKQRNLVAGISNVGSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFENEYWGQGTLVTVKP hz8E7v15
479 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGMTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVFTDRDHVDWYWGQGTLVTVKP hz3G3v1
480 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEITFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCHARDFENEYWGQGTLVTVKP hz6C5v2
481 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLNSDYEFYWGQGTLVTVKP hz3C5v1
482 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQPPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLNSDYEFYWGQGTLVTVKP hz3C5v2
483 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDTSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLNSDYEFYWGQGTLVTVKP hz3C5v3
484 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGEGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLNSDYEFYWGQGTLVTVKP hz3C5v4
485 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLSSDYEFYWGQGTLVTVKP hz3C5v5
486 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLTSDYEFYWGQGTLVTVKP hz3C5v6
487 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLQSDYEFYWGQGTLVTVKP hz3C5v7
488 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSIFSINAMGWYRQAPGKQRELVAGFTGDGSTKYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCAADVQLLNTDYEFYWGQGTLVTVKP hz3C5v8
489 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCVASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYHYADSVKGRFTISRENAKNTVILQMNSLNPEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP 18H10
490 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKGRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v1
491 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v2
492 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v3
493 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v4
494 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v5
495 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v6
496 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v7
497 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v8
498 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v9
499 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v10
500 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVSLIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v11
501 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v12
502 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSMTGANTMGWYRQAPGKQRELVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v13
503 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSVTGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v14
504 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v15
505 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRENAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v16
506 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASGSITGANTMGWYRQAPGKQRDLVALIGNYVTHYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCYLYTDNLGTSWGQGTLVTVKP hz18H10v17
507 QVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCGASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYARDFESEYWGRGTQVTVKP L6F1
508 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVKP hz6F1v1
509 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVKP hz6F1v2
510 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAQSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVKP hz6F1v3
511 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCGASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVKP hz6F1v4
512 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGRGTQVTVKP hz6F1v5
513 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVESTNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVKP hz6F1v6
514 EVQLVESGGGEVQPGGSLRLSCAASEIIFSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDATNYAESVKGRFTISRDNAKNTVYLQMSSLRAEDTAVYYCYARDFESEYWGQGTLVTVKP hz6F1v7
515 QVQLQESGGGLVQAGGSLTLSCAASGSIFSINAMGWYRQGDLVAGFTSEGSAKYADSVKGRFTISRDDAKNMVTLQMNSLKPEDTAVYYCAADIFSDRDHVDWYWGQGTLVTVKP 5H8
516 QVQLQESGGGLVQSGGSLRLSCAASGFSLDDYTIGWFRQAPGKEREGVSCISSSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAENTVYLQMNSLKPEDTAVYYCATYCPVTIADELGFDYWGQGTLVTVKP 3B12
517 QVTLRESGGGLVQAGGSLRLSCGASEITLSDKTVGWYRQAPGKQRVLVAVISNVDSTNYAHSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCYARDFEAEYWGQGTLVTVKP 6B4
518 QVQLVQSGGGLVQAGGSLRLSCAASGFSLDDYTIGWFRQAPGKEREGVSCISSSGGSTVHADSVKGRFTISRDNAKNTVWLQMNSLKPEDTAVYYCATWCGVATMTEDLPFDYWGQGTLVTVKP 6A1
519 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH 312557
520 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKCLEWVSGISWNSGSIGYADSVKGFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSRGYGDYRLGGAYWGQGTLVTVSS 抗CD3 VH 312557 G44C
521 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPWTFGQGTKVEIK 抗CD3 VL 312557
522 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPWTFGCGTKVEIK 抗CD3 VL 312557Q100C
523 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVASGFTFDDYSMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGSKDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKYGSGYGKFYHYGLDVWGQGTTVTVSS CD3-VH-G
524 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVASGFTFDDYSMHWVRQAPGKCLEWVSGISWNSGSKDYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKYGSGYGKFYHYGLDVWGQGTTVTVSS CD3-VH-G
525 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK VK1 -39Jκ5
526 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGCGTRLEIK VK1 -39Jκ5Q100C
527 (ADAAP)n n=2-20 連接子
528 (ADAAP)n-G n=2-20 連接子
529 (GEPQG)n n=2-20 連接子
530 (GEPQG)n-G n=2-20 連接子
531 (AGGEP)n n=2-20 連接子
532 (AGGEP)n-G n=2-20 連接子
533 (AGSEP)n n=2-20 連接子
534 (AGSEP)n-G n=2-20 連接子
535 (GGGEQ)n n=2-20 連接子
536 (GGGEQ)n-G n=2-20 連接子
537 ADAAPADAAPG 連接子
538 GEPQGGEPQGG 連接子
539 AGGEPAGGEPG 連接子
540 AGSEPAGSEPG 連接子
541 GGGEQGGGEQG 連接子
圖 1 所示的圖描繪多種抗DLL3單域抗體(sdAb)結合細胞表面DLL3的能力。藉由流式細胞術，針對DLL3陽性細胞株SHP-77評估結合。本文中，DLL3 sdAbs 10D9、10E5、8E7、5A7、5A8、5H8、3G3、6C5、6F1、3B4、3B12或6B4可操作地連接至人類Fc。
圖 2A-L 所示的一系列圖描繪靶向DLL3之sdAb及其人類化變異體結合細胞表面DLL3的能力。藉由流式細胞術，針對DLL3陽性細胞株SHP-77或經編碼DLL3之載體短暫轉染之HEK-293自由式細胞評估結合。圖 2A 展示3G3及其人類化變異體對SHP-77的結合。圖 2B 展示5A7及其人類化變異體對SHP-77的結合。圖 2C 展示3C5及其人類化變異體對SHP-77的結合。圖 2D 展示6C5及其人類化變異體對SHP-77的結合。圖 2E-G 展示5A8及其人類化變異體對SHP-77 (圖 2E 及2F )及經DLL3轉染之293FS (FL)(圖 2G )的結合。圖 2H 展示10D9及其人類化變異體對SHP-77的結合。圖 2I 展示10E5及其人類化變異體對SHP-77的結合。圖 2J 及 2K 分別展示8E7及其人類化變異體對SHP-77及經DLL3轉染之293FS細胞的結合。圖 2L 展示6F1及其人類化變異體對SHP-77的結合。本文中，DLL3 sdAbs可操作地連接至人類Fc。
圖 3A-3E 描繪表示多種靶向DLL3之限制性CD3接合構築體的一系列示意圖。本發明之靶向DLL3之限制性CD3接合構築體的基本組分已限制CD3結合。抗原結合域定位於胺基端及/或羧基端。Fc區(諸如雜二聚體Fc區)定位於CD3結合區的N端。Fc緊鄰CD3結合區發生的此定位阻礙CD3結合。
圖 4A-4B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4720結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 4A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 4B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 5A-5B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx3715結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 5A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 5B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 6A -6B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4422結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 6A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 6B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 7A -7B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx3708結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 7A )且不結合至初始人類T細胞(圖 7B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 8A -8B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4052結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 8A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 8B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 9A-9B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx3985結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 9A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 9B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 10A -10B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4059結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 10A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 10B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 11A -11B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4087結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 11A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 11B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 12A -12B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4088結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 12A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 12B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 13A -13B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4895結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 13A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 13B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 14A -14B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx3991結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 14A )且不結合至初始人類T細胞(圖 14B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 15A -15B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx3711結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 15A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 15B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 16A -16B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4887結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 16A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 16B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 17A-17B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4896結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 17A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 17B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 18A-18B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4899結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 18A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 18B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 19A -19B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4406結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 19A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 19B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 20A -20B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx3707結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 20A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 20B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 21A-21B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx3710結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 21A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 21B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 22A -22B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4888結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 22A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 22B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 23A -23B 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx4890結合至DLL3陽性細胞SHP-77 (圖 23A )，而不結合至初始人類T細胞(圖 23B )。藉由流式細胞術使用抗人類IgG APC二級抗體來評估結合。除非另外指出，否則直方圖顯示各種構築體在200 nM下的標準化細胞計數相對於螢光。
圖 24A-24B 描繪的圖展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體誘發DLL3依賴性T細胞活化的能力。傑卡特(Jurkat) CD3 NFAT-GFP報導體細胞株用於監測T細胞活化。SHP-77細胞(圖 24A )及HEK-293自由式細胞(圖 24B )分別用作抗原陽性及陰性細胞株。
圖 25A -25D 描繪的圖展現靶向雙抗原決定基DLL3之限制性CD3接合構築體誘發DLL3依賴性T細胞活化的能力。傑卡特CD3 NFAT-GFP報導體細胞株用於監測T細胞活化。SHP-77細胞(圖22A 及22C )及HEK-293自由式細胞(圖 22B 及22D )分別用作抗原陽性及陰性細胞株。
圖 26A-26B 描繪的圖展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體介導針對DLL3陽性SHP-77細胞(圖 26A )及DLL3陰性HEK-293自由式細胞(圖 26B )之抗原特異性T細胞細胞毒性的能力。
圖 27A-27D 描繪的圖展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體介導針對DLL3陽性SHP-77細胞(圖 27A 及27C )及DLL3陰性HEK-293自由式細胞(圖 27B 及27D )之抗原特異性T細胞活化的能力。
圖 28 展現靶向DLL3之限制性CD3接合構築體以抗原依賴性方式誘發T細胞產生細胞介素的能力。使用ELISA方法監測細胞介素產生。
圖 29A 為由兩個多肽(鏈1及鏈2)構成之靶向DLL3之三種限制性CD3構築體的示意圖。鏈1含有雜二聚體Fc「臼」，其經由不可裂解連接子連接至在G100C經修飾的抗CD3 VL域，該VL域連接至靶向共刺激受體的sdAb。鏈2含有靶向DLL3之sdAb，該sdAb連接至互補雜二聚體Fc「杵」，該雜二聚體Fc「杵」經由如上所述的連接子連接至在G44C經修飾的抗CD3 VH域，該VH域連接至第二個靶向DLL3的sdAb (頂圖)；含有雜二聚體Fc「杵」，該雜二聚體Fc「杵」經由如上所述的連接子連接至在G44C經修飾的抗CD3 VH域，該VH域連接至靶向DLL3的sdAb (中圖)；或含有靶向DLL3的sdAb，該sdAb連接至互補雜二聚體Fc「杵」，該雜二聚體Fc「杵」經由如上所述的連接子連接至經G44C修飾的抗CD3 VH域(底圖)。所得構築體係以二價(頂圖)單價單價(中圖及底圖)方式與DLL3接合。本文中所示的所有構築體均含有靶向共刺激受體的sdAb。
圖 29B 為由兩個多肽(鏈1及鏈2)構成之靶向DLL3之限制性CD3構築體cx5499的示意圖。cx5499與圖29A (頂圖)中所示之cx5352相同，但在鏈1之C端上缺乏靶向共刺激受體的sdAb。共表現時，CD3結合域分別經由臼及杵上的VL:VH結合而正確地組裝。VH:VL相互作用藉由VH域中之經修飾之殘基G44C與VL域中之G100C之間的工程化二硫鍵穩定化。
圖 30A-30B 展現靶向DLL3之代表性單價(cx5800及cx5801)及二價(cx5352)限制性CD3接合構築體結合表現DLL3的細胞株SHP-77 (圖 30A )，而非分離的T細胞(圖 30B )。藉由流式細胞術評估結合。
圖 30C 描繪靶向DLL3之代表性限制性CD3接合構築體在DLL3陽性SHP-77細胞存在下促效CD3信號傳導的能力。DLL3陽性細胞與對DLL3呈二價及雙抗原決定基之構築體(cx5352)的接合誘導的T細胞活化比對DLL3呈單價的構築體(cx5800及cx5801)更強。使用傑卡特CD3 NFAT螢光素酶報導體細胞株評估CD3信號傳導。
圖 31A-31E 展現靶向DLL3之代表性限制性CD3接合構築體cx5499在DLL3陽性SHP-77細胞存在下誘發T細胞介導細胞毒性及T細胞活化的能力。圖 31A 展現靶向DLL3之代表性限制性CD3接合構築體在DLL3陽性SHP-77細胞存在下誘發T細胞介導細胞毒性的能力。圖 31B-31E 展現靶向DLL3之代表性限制性CD3接合構築體在DLL3陽性SHP-77細胞存在下誘發T細胞活化的能力，如根據以下所評估：CD4+ T細胞上的CD25表現(圖 31B )、CD4+ T細胞上的CD69表現(圖 31C )、CD8+ T細胞上的CD25表現(圖 31D )及CD8+ T細胞上的CD69表現(圖 31E )。
圖 32 展示具有41BB結合域之靶向DLL3之限制性CD3接合構築體cx5352介導41BB信號傳導的能力，但缺乏41BB結合域之相同構築體cx5499則不能。使用與親代HEK-293細胞或短暫表現截短型DLL3之HEK-293細胞共培養的傑卡特41BB NFkB螢光素酶報導體細胞監測DLL3依賴性41BB信號傳導，且活性以相對螢光素酶單位(RLU)展示。
圖 33A-B 描繪具有41BB結合域之靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體cx5352所驅動之針對DLL3陽性細胞株SHP-77 (圖 33A )或DLL3陰性細胞株HEK-293FS (圖 33B )之T細胞介導細胞毒性的效能。三種不同的T細胞供者用作此分析中的效應細胞來源。
圖 34A-C 展示具有41BB結合域之靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體cx5352與不具有41BB結合域之靶向DLL3之例示性限制性CD3接合構築體cx5499所驅動之T細胞介導細胞毒性的效能差異。本文中，對如下多種效應子(T細胞)與目標細胞(SHP-77)比率(效應子:目標細胞比率)進行比較：10:1 (圖 34A )、5:1 (圖 34B )或1.25:1 (圖 34C )。人類PBMC用作T細胞來源。
圖 35 展示經具有41BB結合域之靶向DLL3之代表性限制性CD3接合構築體cx5352與不具有41BB結合域之靶向DLL3之代表性限制性CD3接合構築體cx5499之滴定處理的T細胞在DLL3陽性細胞株SHP-77存在下之IFNγ產生情況的比較。
圖 36A-B 描繪不具有/具有共刺激受體結合區(CRBR)之靶向TAA的例示性限制性CD3接合體。構築體具有定位於雜二聚體之一條鏈之N端及C端的靶向抗原之sdAb、Fc杵，且具有定位於雜二聚體之相對鏈之C端的共刺激受體結合區(CRBR)、Fc臼，而且具有結合CD3之Fv的VH及VL，該VH及VL相對於彼此定位於相對側。
圖 37A-D 描繪圖 36A-B 中所述之例示性構築體的T細胞報導體分析結果。圖 37A 及37B 描繪當TAA陽性細胞株A375或TAA陰性細胞株CCRF-CEM分別與傑卡特CD3 NFAT-GFP報導體細胞共培養時，GFP報導體之平均螢光強度(MFI)。圖 37C 及37D 描繪當TAA陽性細胞株A375或TAA陰性細胞株CCRF-CEM分別與傑卡特CD3 NFAT螢光素酶報導體細胞共培養時，螢光素酶報導體之相對發光單位(RLU)。
圖 38A-B 描繪使用傑卡特報導體細胞株進行之T細胞報導體分析的結果，該傑卡特報導體細胞株經工程改造以利用NFAT驅動之螢光素酶報導基因穩定表現CD16a。圖 38A 描繪當表現DLL3之CHO細胞與報導體細胞共培養且經含有IgG1 Fc之靶向DLL3之構築體滴定處理時，螢光素酶報導體之相對發光單位(RLU)。圖 38B 描繪在DLL3表現細胞不存在下經含有IgG1 Fc之靶向DLL3之構築體滴定處理時，螢光素酶報導體之RLU。
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Claims (281)

  1. 一種DLL3結合多肽構築體，包含至少一個特異性結合DLL3之僅重鏈之可變域(DLL3 VHH域)及一或多個結合至除DLL3之外之目標的其他結合域。
  2. 如請求項1之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含：互補決定區1 (CDR1)，其包含選自由SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335及456組成之群的胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包含選自由SEQ ID NO: 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、384、410及411組成之群的胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包含選自由SEQ ID NO: 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、395及412-415組成之群的胺基酸序列，且結合DLL3。
  3. 一種DLL3結合多肽構築體，其包含至少一個特異性結合DLL3之僅重鏈之可變域(DLL3 VHH域)，該可變域包含：互補決定區1 (CDR1)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335及456；互補決定區2 (CDR2)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、384、410及411；以及互補決定區3 (CDR3)，其包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、395及412-415；且結合DLL3。
  4. 如請求項1至3中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該DLL3為人類DLL3。
  5. 如請求項1至4中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域為人類化的。
  6. 2、4及5中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合至免疫細胞上之活化受體。
  7. 如請求項6之DLL3結合多肽構築體，其中該免疫細胞為T細胞。
  8. 如請求項6或請求項7之DLL3結合多肽構築體，其中該活化受體為CD3 (CD3ε)。
  9. 如請求項8之DLL3結合多肽構築體，其對DLL3與CD3具有雙特異性。
  10. 如請求項9之DLL3結合多肽構築體，其中該免疫細胞為自然殺手(NK)細胞。
  11. 如請求項6或請求項10之DLL3結合多肽構築體，其中該活化受體為CD16 (CD16a)。
  12. 如請求項11之DLL3結合多肽構築體，其對DLL3與CD16a具有雙特異性。
  13. 2、4及5中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域結合至細胞介素受體。
  14. 2及4至13中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域包含抗體或其抗原結合片段。
  15. 2及4至14中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域為單價的。
  16. 如請求項14或請求項15之DLL3結合多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段為Fv、經二硫鍵穩定之Fv (dsFv)、scFv、Fab、單域抗體(sdAb)、VNAR或VHH。
  17. 如請求項13之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多個其他結合域為細胞介素或為其截短的片段或變異體，其能夠結合至該細胞介素受體。
  18. 如請求項17之DLL3結合多肽構築體，其中該細胞介素為干擾素，或干擾素之截短片段或變異體。
  19. 如請求項18之DLL3結合多肽構築體，其中該干擾素為第I型干擾素或第II型干擾素；為第I型干擾素之截短片段或變異體；或第II型干擾素之截短片段或變異體。
  20. 如請求項19之DLL3結合多肽構築體，其中： 該第I型干擾素為IFN-α或IFN-β或其截短片段或變異體；或 該第II型干擾素為IFN-γ或其截短片段或變異體。
  21. 如請求項1至20中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該多肽包含免疫球蛋白Fc區。
  22. 2及4至21中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該多肽構築體包含連接該至少一個VHH域及該一或多個其他結合域的免疫球蛋白Fc區。
  23. 如請求項1至22中任一項之DLL3結合多肽構築體，其為二聚體。
  24. 如請求項21至23中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區為均二聚體Fc區。
  25. 如請求項21至24中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 8、10、11、12或13中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 8、10、11、12或13中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
  26. 如請求項21至24中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區為人類IgG1。
  27. 如請求項26之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 8中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 8展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  28. 如請求項21至23中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區為雜二聚體Fc區。
  29. 如請求項21至28中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區展現效應功能。
  30. 如請求項21至29中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區包含的多肽包含一或多個胺基酸修飾，該一或多個胺基酸修飾使效應功能降低且/或減少對選自Fcγ受體或C1q之效應分子的結合。
  31. 如請求項30之DLL3結合多肽構築體，其中該一或多個胺基酸修飾為Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者的缺失。
  32. 如請求項30或請求項31之DLL3結合多肽構築體，其中該Fc區包含SEQ ID NO: 9中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 9展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。
  33. 如請求項1至32中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-480-488及507-518中之任一者中所示之VHH域序列，或與SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-480-488及507-518中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  34. 如請求項1至33中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 244、(ii) SEQ ID NO: 244之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 244展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  35. 如請求項1至34中任一項之DLL3結合多肽，其中該至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325及326組成之群的胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 336、337及338組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 354中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  36. 如請求項1至35中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 319、336及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、337及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 321、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 322、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 323、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 324、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 325、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 326、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。
  37. 如請求項1至36中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 245-257中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  38. 如請求項1至37之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  39. 如請求項1至33中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 258、(ii) SEQ ID NO: 258之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 258展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  40. 如請求項1至33及39中任一項之DLL3結合多肽，其中該至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 327中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 339中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 355中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  41. 如請求項1至33、39及40中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 327、339及335中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  42. 如請求項1至33及39至41中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 259-263中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  43. 如請求項1至33及39至42之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  44. 如請求項1至33中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 264、(ii) SEQ ID NO: 264之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 264展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  45. 如請求項1至33及44中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 328、329或456中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 340中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  46. 如請求項1至33、44及45中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 328、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 329、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 456、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  47. 如請求項1至33及44至46中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  48. 如請求項1至33及44至47之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  49. 如請求項1至33中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 275、(ii) SEQ ID NO: 275之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 275展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  50. 如請求項1至33及49中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 341中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 357中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  51. 如請求項1至33、49及50中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  52. 如請求項1至33及49至51之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  53. 如請求項1至33中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 280、(ii) SEQ ID NO: 280之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 280展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  54. 如請求項1至33及53中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 330中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 342中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 358中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  55. 如請求項1至33、53及54中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 281-286中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  56. 如請求項1至33及53至55之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  57. 如請求項1至33中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 287、(ii) SEQ ID NO: 287之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 287中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  58. 如請求項1至33及57中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 345、346及347組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 359、360及361組成之群的胺基酸序列，且結合DLL3。
  59. 如請求項1至33及57至58中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、345及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、346及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、347及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及361中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、347及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  60. 如請求項1至33及57至59中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  61. 如請求項1至33及57至60之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  62. 如請求項1至33中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 299、(ii) SEQ ID NO: 299之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 299展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  63. 如請求項1至33及62中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 331中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  64. 如請求項1至33及62至63中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 331、348及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 331、349及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 331、350及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  65. 如請求項1至33及62至64中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  66. 如請求項1至33及62至65之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  67. 如請求項1至33中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 507、(ii) SEQ ID NO: 507之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 507中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  68. 如請求項1至33及67中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 332中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 362中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  69. 如請求項1至33及67至68中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 332、348及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 332、349及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 332、350及362中所示之CDR1、CDR2及CDR3。
  70. 如請求項1至33及67至69中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 508-514中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  71. 如請求項1至33及67至70之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  72. 如請求項1至33中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 401、(ii) SEQ ID NO: 401之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 401展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  73. 如請求項1至33及72中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 384、410及411組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 395、412、413、414及415組成之群的胺基酸序列；且結合DLL3。
  74. 如請求項1至33及72至73中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、384及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、410及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、411及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及412中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及413中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及414中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、384及415中所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  75. 如請求項1至33及72至74中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 481-488中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  76. 如請求項1至33及72至75之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  77. 如請求項1至33中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517；(ii) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517之人類化變異體；或(iii)與SEQ ID NO: 314、518、515、516或517展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列；且結合DLL3。
  78. 如請求項1至33及77中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 333、351及363中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、352及364中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；320、353及365中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、339及366中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或335、348及367中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DDL3。
  79. 如請求項1至33、77及78中任一項之DLL3結合多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域闡述於SEQ ID NO: 314、518、515、516或517中，且結合DLL3。
  80. 一種多特異性多肽構築體，其包含：(a)第一組分，該第一組分包含含有第一Fc多肽及第二Fc多肽之雜二聚體Fc區；及(b)第二組分，該第二組分包含含有重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)之抗CD3抗體或抗原結合片段，其中： 構成該抗CD3抗體或抗原結合片段之該VH及VL連接至該雜二聚體Fc之相對多肽； 該第一組分與該第二組分藉由連接子偶合，其中該雜二聚體Fc區定位於該抗CD3抗體之N端；及 該第一及第二組分中之一或兩者包含至少一個抗原結合域，該抗原結合域包含特異性結合DLL3的VHH域(DLL3 VHH域)。
  81. 如請求項80之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體至少包含：(i)第一多肽，該第一多肽包含該雜二聚體Fc區之該第一Fc多肽、連接子、及該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域；及(ii)第二多肽，該第二多肽包含該雜二聚體Fc區之該第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與存在於該第一多肽中的連接子相同)，及該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中的另一者， 其中該第一與第二多肽中之一或兩者包含該至少一個DLL3 VHH域。
  82. 如請求項80或請求項81之多特異性多肽構築體，其中相較於均二聚體Fc區之多肽，視情況相較於SEQ ID NO: 8中所示之Fc多肽或其免疫活性片段，該雜二聚體Fc區之該第一及第二Fc多肽中之一或兩者包含至少一個誘導雜二聚化的修飾。
  83. 如請求項82之多特異性多肽構築體，其中該雜二聚體Fc區之該第一與第二Fc多肽中之每一者獨立地包含至少一個胺基酸修飾。
  84. 如請求項83之多特異性多肽構築體，其中該雜二聚體Fc區之該第一與第二Fc多肽中之每一者包含臼包杵修飾或包含增強該等多肽之靜電互補性的電荷突變。
  85. 如請求項84之多特異性多肽構築體，其中該胺基酸修飾為臼包杵修飾。
  86. 如請求項80至85中任一項之多特異性多肽構築體，其中該雜二聚體Fc區之該第一Fc多肽包含選自Thr366Ser、Leu368Ala、Tyr407Val及其組合之修飾，且該雜二聚體Fc區之該第二Fc多肽包含修飾Thr366Trp。
  87. 如請求項86之多特異性多肽構築體，其中該第一與第二Fc多肽進一步包含非半胱胺酸殘基修飾為半胱胺酸殘基，其中該第一Fc多肽之修飾存在於位置Ser354及Tyr349之一，且該第二Fc多肽之修飾存在於位置Ser354及Tyr349中之另一者處。
  88. 如請求項80至84中任一項之多特異性多肽構築體，其中該胺基酸修飾為增強該等多肽之靜電互補性的電荷突變。
  89. 如請求項80至84及88中任一項之多特異性多肽構築體，其中該第一及/或第二Fc多肽或該第一與第二Fc多肽中之每一者包含位於互補位置之修飾，其中該修飾為置換成具有與另一多肽之互補胺基酸相反之電荷的胺基酸。
  90. 如請求項60至69中任一項之多特異性多肽構築體，其中該雜二聚體Fc區之該第一或第二Fc多肽中的一者進一步包含位於殘基Ile253之修飾。
  91. 如請求項90之多特異性多肽構築體，其中該修飾為Ile253Arg。
  92. 如請求項80至91中任一項之多特異性多肽構築體，其中該雜二聚體Fc區之該第一或第二Fc多肽中的一者進一步包含位於殘基His435之修飾。
  93. 如請求項92之多特異性多肽構築體，其中該修飾為His435Arg。
  94. 如請求項80至93中任一項之多特異性多肽構築體，其中該Fc區包含缺乏Lys447之多肽。
  95. 如請求項80至94中任一項之多特異性多肽構築體，其中該Fc區包含含有至少一個增強FcRn結合之修飾的多肽。
  96. 如請求項95之多特異性多肽構築體，其中該修飾位於選自由以下組成之群的位置：Met252、Ser254、Thr256、Met428、Asn434及其組合。
  97. 如請求項96之多特異性多肽構築體，其中該修飾係選自由以下組成之群：Met252Y、Ser254T、Thr256E、Met428L、Met428V、Asn434S及其組合。
  98. 如請求項96之多特異性多肽構築體，其中該修飾處於位置Met252及位置Met428。
  99. 如請求項98之多特異性多肽構築體，其中該修飾為Met252Y及Met428L。
  100. 如請求項76之多特異性多肽構築體，其中該修飾為Met252Y及Met428V。
  101. 如請求項80至100中任一項之多特異性多肽構築體，其中該雜二聚體Fc區之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO: 103、107、115或117中之任一者中所示之胺基酸序列，且該雜二聚體Fc區之該第二Fc多肽包含SEQ ID NO: 104、108、111、113、119或121中之任一者中所示之胺基酸序列。
  102. 如請求項1至101中任一項之多特異性多肽構築體，其中該Fc區包含含有至少一個胺基酸修飾的多肽，該至少一個胺基酸修飾使效應功能降低且/或減少對選自Fcγ受體或C1q之效應分子的結合。
  103. 如請求項102之多特異性多肽構築體，其中該一或多個胺基酸修飾為Glu233、Leu234或Leu235中之一或多者的缺失。
  104. 如請求項80至103中任一項之多特異性多肽構築體，其中該雜二聚體Fc區之該第一Fc多肽包含SEQ ID NO: 105、109、116或118中之任一者中所示之胺基酸序列，且該雜二聚體Fc區之該第二Fc多肽包含SEQ ID NO: 106、110、112、114、120或122中之任一者中所示之胺基酸序列。
  105. 如請求項80至104中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段為單價的。
  106. 如請求項80至105中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段不是單鏈抗體，視情況不是單鏈可變片段(scFv)。
  107. 如請求項80至106中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段為Fv抗體片段。
  108. 如請求項107之多特異性多肽構築體，其中該Fv抗體片段包含經二硫鍵穩定之抗CD3結合Fv片段(dsFv)。
  109. 如請求項80至108中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包含：VH CDR1，其包含胺基酸序列TYAMN (SEQ ID NO: 29)；VH CDR2，其包含胺基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD (SEQ ID NO: 30)；VH CDR3，其包含胺基酸序列HGNFGNSYVSWFAY (SEQ ID NO: 31)；VL CDR1，其包含胺基酸序列RSSTGAVTTSNYAN (SEQ ID NO: 32)；VL CDR2，其包含胺基酸序列GTNKRAP (SEQ ID NO: 33)；及VL CDR3，其包含胺基酸序列ALWYSNLWV (SEQ ID NO: 34)。
  110. 如請求項80至109中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包含： VH，其具有SEQ ID NO: 35-65中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 35-65中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列；及 VL，其具有SEQ ID NO: 66-84及368中之任一者之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 66-84及368中之任一者展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列。
  111. 如請求項80至110中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及SEQ ID NO: 75之胺基酸序列。
  112. 如請求項80至110中任一項之多特異性多肽構築體，其中該抗CD3抗體或抗原結合片段包含SEQ ID NO: 47之胺基酸序列及SEQ ID NO: 368之胺基酸序列。
  113. 如請求項80至112中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域相對於該多特異性多肽構築體之該Fc區定位於胺基端且/或相對於該多特異性多肽構築體之該CD3結合區定位於羧基端。
  114. 如請求項80至113中任一項之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體包含特異性結合DLL3的第一DLL3 VHH域及特異性結合DLL3的第二DLL3 VHH域。
  115. 如請求項114之多特異性多肽構築體，其中該第一或第二DLL3 VHH域相對於該多特異性構築體之該Fc區定位於胺基端且該第一或第二DLL3 VHH域中之另一者相對於該多特異性構築體之該CD3結合區定位於羧基端。
  116. 如請求項114或請求項115之多特異性多肽構築體，其中 該第一組分依N端至C端的次序包含結合DLL3的第一DLL3 VHH域、該雜二聚體Fc區之該第一Fc多肽、連接子、該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH域；且 該第二多肽依N端至C端的次序包含該雜二聚體Fc區之該第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與存在於該第一組分中的連接子相同)，及該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中之另一者。
  117. 如請求項114至116中任一項之多特異性多肽構築體，其中該第一與第二DLL3 VHH域是相同的。
  118. 如請求項114至116中任一項之多特異性多肽構築體，其中該第一與第二DLL3 VHH域是不同的。
  119. 如請求項118之多特異性多肽構築體，其中該第一與第二DLL3 VHH域結合DLL3之不同或不重疊抗原決定基且/或不競爭結合至DLL3。
  120. 如請求項119之多特異性多肽構築體，其中： 該第一VHH域包含251、264、267、268、287、299、507、314、517或455中之任一者中所示之胺基酸序列、其人類化變異體，或與251、264、267、268、287、299、507、314、517或455中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3；且 該第二VHH域包含244、251、258、267、275、280、314、518、515、516、517、455中之任一者中所示之胺基酸序列，或其人類化變異體，或與244、251、258、267、275、280、314、518、515、516、517、455中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  121. 如請求項119或120之多特異性多肽構築體，其中： 該第一VHH域及第二VHH域包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 507；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 507；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 314；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 299；SEQ ID NO:518及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 268；SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 267；SEQ ID NO: 275及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 287；SEQ ID NO: 314及SEQ ID NO: 264；SEQ ID NO: 515及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 516及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO: 517及SEQ ID NO: 517；SEQ ID NO:251及SEQ ID NO:455；或SEQ ID NO: 244及SEQ ID NO: 517。
  122. 如請求項80至121中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之VHH域序列：SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-488或507-518中之任一者，或與SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-488或507-518中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列，且結合DLL3。
  123. 如請求項80至122中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列(i) SEQ ID NO: 244、(ii) SEQ ID NO: 244之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 244展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  124. 如請求項80至123中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含：CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325及326組成之群的胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 336、337及338組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 354中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  125. 如請求項80至124中任一項之多特異性構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 319、336及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、337及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 321、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 322、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 323、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 324、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 325、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 326、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。
  126. 如請求項80至125中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 245-257中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  127. 如請求項80至126中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  128. 如請求項80至122中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 258、(ii) SEQ ID NO: 258之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 258展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  129. 如請求項80至122及128中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 327中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 339中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 355中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  130. 如請求項80至122、128及129中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 327、339及335中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  131. 如請求項80至122及128至130中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 259-263中之每一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  132. 如請求項80至122及128至131之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  133. 如請求項80至122中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 264；(ii) SEQ ID NO: 264之人類化變異體；或(iii)與SEQ ID NO: 264展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列；且結合DLL3。
  134. 如請求項80至122及133中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二VHH域中之每一者獨立地包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 328、329或456中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 340中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  135. 如請求項80至122、133及134中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 328、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 329、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 456、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  136. 如請求項80至122及133至135中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  137. 如請求項80至122及133至136之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  138. 如請求項80至122中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 275、(ii) SEQ ID NO: 275之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 275展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  139. 如請求項80至122及138中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 341中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 357中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  140. 如請求項80至122、138及139中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  141. 如請求項80至122及138至140中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  142. 如請求項80至122中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 280、(ii) SEQ ID NO: 280之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 280展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  143. 如請求項80至122及142中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 330中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 342中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 358中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  144. 如請求項80至122、142及143中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 281-286中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列；且結合DLL3。
  145. 如請求項80至122及142至144中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  146. 如請求項80至122中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 287、(ii) SEQ ID NO: 287之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 287展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列；且結合DLL3。
  147. 如請求項80至122及146中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 345、346及347組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 359、360及361組成之群的胺基酸序列；且結合DLL3。
  148. 如請求項80至122、146及147中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、345及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、346及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、347及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及361中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、347及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。
  149. 如請求項80至122及146至148中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  150. 如請求項80至122及146至149之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  151. 如請求項80至122中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 299、(ii) SEQ ID NO: 299之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 299展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列；且結合DLL3。
  152. 如請求項80至122及151中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 331中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  153. 如請求項80至122、151及152中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 331、348及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 331、349及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 331、350及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。
  154. 如請求項80至122及151至153中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列；且結合DLL3。
  155. 如請求項80至122及151至154之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  156. 如請求項80至122中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 507、(ii) SEQ ID NO: 507之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 507展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列；且結合DLL3。
  157. 如請求項80至122及156中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 332中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 362中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  158. 如請求項80至122、156及157中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 332、348及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 332、349及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 332、350及362中所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。
  159. 如請求項80至122及156至158中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 508-514中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  160. 如請求項80至122及156至159之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  161. 如請求項80至122中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 401、(ii) SEQ ID NO: 401之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 401展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  162. 如請求項80至122及161中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 384、410及411組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 395、412、413、414及415組成之群的胺基酸序列；且結合DLL3。
  163. 如請求項80至122、161及162中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域包含SEQ ID NO: 320、384及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、410及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、411及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及412中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及413中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及414中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、384及415中所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  164. 如請求項80至122及161至163中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 481-488中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  165. 如請求項80至122及161至164之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  166. 如請求項80至122中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二VHH域中之每一者獨立地包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517；(ii) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517之人類化變異體；或(iii)與SEQ ID NO: 314、518、515、516或517中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列；且結合DLL3。
  167. 如請求項80至122及166中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地包含SEQ ID NO: 333、351及363中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、352及364中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；320、353及365中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、339及366中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或335、348及367中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DDL3。
  168. 如請求項80至122、166及167中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個DLL3 VHH域或該第一與第二DLL3 VHH域中之每一者獨立地闡述於SEQ ID NO: 314、518、515、516或517中，且結合DLL3。
  169. 如請求項80至168中任一項之多特異性多肽構築體，其中該第一與第二組分中之一或兩者包含至少一個結合共刺激受體的共刺激受體結合區(CRBR)。
  170. 如請求項169之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)相對於該多特異性多肽構築體之該Fc區定位於胺基端且/或相對於該多特異性多肽構築體之該CD3結合區定位於羧基端。
  171. 如請求項169或請求項170之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體僅包含一個共刺激受體結合區(CRBR)。
  172. 如請求項169至171中任一項之多特異性多肽構築體，其中： 該第一組分依N端至C端的次序包含結合DLL3的第一DLL3 VHH域、該雜二聚體Fc區之該第一Fc多肽、連接子、該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH域；且 該第二組分包含該CRBR且依N端至C端的次序包含該雜二聚體Fc區之該第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與存在於該第一組分中的連接子相同)、該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中的另一者，其中該CRBR相對於該Fc區定位於胺基端或相對於該第二組分之該抗CD3抗體或抗原結合片段定位於羧基端。
  173. 如請求項169至172中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)為或包含該共刺激受體之原生同源結合搭配物的胞外域或其結合片段，或其變異體，該變異體對該共刺激受體展現結合活性。
  174. 如請求項169至173中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)為選自由以下組成之群的抗體或其抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體，及單域輕鏈抗體。
  175. 如請求項174之多特異性多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段為Fv、scFv、Fab、單域抗體(VHH域)、VNAR或VHH。
  176. 如請求項174或請求項175之多特異性多肽構築體，其中該抗體或抗原結合片段為VHH域。
  177. 如請求項176之多特異性多肽構築體，其中該VHH域為人類或人類化VHH域。
  178. 如請求項169至177中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)結合選自以下之共刺激受體：41BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD27、糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)、CD28、ICOS、CD40、B細胞活化因子受體(BAFF-R)、B細胞成熟抗原(BCMA)、跨膜活化因子及CAML相互作用因子(TACI)，及NKG2D。
  179. 如請求項169至178中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)結合選自以下之共刺激受體：41BB (CD137)、OX40 (CD134)，及糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白(GITR)。
  180. 如請求項169至179中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個共刺激受體結合區(CRBR)包含SEQ ID NO: 210中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 210中所示之序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列，且結合4-1BB。
  181. 如請求項80至180中任一項之多特異性多肽構築體，其中該第一及第二組分中之一或兩者包含至少一個結合抑制性受體的抑制性受體結合區(IRBR)。
  182. 如請求項181之多特異性多肽構築體，其中該至少一個抑制性受體結合區(IRBR)相對於該多特異性多肽構築體之該Fc區定位於胺基端且/或相對於該多特異性多肽構築體之該CD3結合區定位於羧基端。
  183. 如請求項181或請求項182之多特異性多肽構築體，其中該多特異性多肽構築體僅包含一個抑制性受體結合區(IRBR)。
  184. 如請求項181至183中任一項之多特異性多肽構築體，其中： 該第一組分依N端至C端的次序包含結合DLL3的第一DLL3 VHH域、該雜二聚體Fc區之該第一Fc多肽、連接子、該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH域；且 該第二組分包含該IRBR且依N端至C端的次序包含該雜二聚體Fc區之該第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與存在於該第一組分中的連接子相同)，及該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中之另一者，其中該IRBR相對於該Fc區定位於胺基端或相對於該第二組分之該抗CD3抗體或抗原結合片段定位於羧基端。
  185. 如請求項181至184中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個IRBR為或包含該抑制性受體之原生同源結合搭配物的胞外域或其結合片段或其變異體，該變異體對該抑制性受體展現結合活性。
  186. 如請求項181至185中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個IRBR為選自由以下組成之群的抗體或其抗原結合片段：Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、scFv、scAb、dAb、單域重鏈抗體，及單域輕鏈抗體。
  187. 如請求項186之多特異性多肽構築體，其中該抗體或其抗原結合片段為Fv、scFv、Fab、單域抗體(VHH域)、VNAR或VHH。
  188. 如請求項186或請求項187之多特異性多肽構築體，其中該抗體或抗原結合片段為VHH域。
  189. 如請求項188之多特異性多肽構築體，其中該VHH域為人類或人類化VHH域。
  190. 如請求項181至189中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個IRBR結合選自以下之抑制性受體：PD-1、CTLA-4、TIGIT、VISTA及TIM3。
  191. 如請求項181至189中任一項之多特異性多肽構築體，其中該至少一個IRBR結合PD-1。
  192. 如請求項181至191中任一項之多特異性多肽構築體，其中： 該第一組分依N端至C端的次序包含結合DLL3的第一DLL3 VHH域、該雜二聚體Fc區之該第一Fc多肽、連接子、該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域，及結合DLL3的第二DLL3 VHH域；且 該第二組分依N端至C端的次序包含該IRBR或CRBR中之一者、該雜二聚體Fc區之該第二Fc多肽、連接子(該連接子視情況與存在於該第一組分中的連接子相同)、該抗CD3抗體或抗原結合片段之VH或VL域中之另一者；及該CRBR或IRBR中之另一者。
  193. 如請求項80至192中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接子為肽或多肽連接子，視情況其中該連接子具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸的長度。
  194. 如請求項80至193中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接子為不可裂解連接子。
  195. 如請求項194之多特異性多肽構築體，其中該不可裂解連接子包含GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO: 125)、GGGGGS (SEQ ID NO: 126)及其組合。
  196. 如請求項80至195中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接子為或包含序列GGGGGSGGGGGSGGGGGS (SEQ ID NO: 127)。
  197. 如請求項80至193中任一項之多特異性多肽構築體，其中該連接子為可裂解連接子。
  198. 如請求項197之多特異性多肽構築體，其中該可裂解連接子為充當蛋白酶之受質的多肽。
  199. 如請求項198之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係由免疫效應細胞、腫瘤或存在於腫瘤微環境中的細胞產生。
  200. 如請求項198或請求項199之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係由免疫效應細胞產生且該免疫效應細胞為活化T細胞、自然殺手(NK)細胞或NK T細胞。
  201. 如請求項198至200中任一項之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶係選自間質蛋白酶、基質金屬蛋白酶(MMP)、顆粒酶B及其組合。
  202. 如請求項201之多特異性多肽構築體，其中該蛋白酶為顆粒酶B。
  203. 如請求項198至202中任一項之多特異性多肽構築體，其中該可裂解連接子包含胺基酸序列GGSGGGGIEPD IGGSGGS (SEQ ID NO: 171)。
  204. 一種結合DLL3的經分離單域抗體，包含：互補決定區1 (CDR1)，其包含選自由SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335及456組成之群的胺基酸序列；互補決定區2 (CDR2)，其包含選自由SEQ ID NO: 336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、384、410及411組成之群的胺基酸序列；及互補決定區3 (CDR3)，其包含選自由SEQ ID NO: 354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、395及412-415組成之群的胺基酸序列。
  205. 如請求項204之經分離單域抗體，其包含SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-480-488及507-518中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 102、244-275、277-300、302-305、314、401、416、455、476-480-488及507-518中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  206. 如請求項204或請求項205之經分離單域抗體，其中該單域抗體包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 244、(ii) SEQ ID NO: 244之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 244展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  207. 如請求項204至206中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 319、320、321、322、323、324、325及326組成之群的胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 336、337及338組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 354中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  208. 如請求項204至207中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 319、336及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、337及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 319、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 321、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 322、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 323、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 324、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 325、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 326、338及354中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  209. 如請求項204至208中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 245-257中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  210. 如請求項204至209中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 245-257中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  211. 如請求項204或請求項205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 258、(ii) SEQ ID NO: 258之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 258展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  212. 如請求項204、205及211中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 327中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 339中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 355中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  213. 如請求項204、205、211及212中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 327、339及335中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  214. 如請求項204、205及211至213中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 259-263中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  215. 如請求項204、205及211至214中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 259-263中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  216. 如請求項204或請求項205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 264、(ii) SEQ ID NO: 264之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 264展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  217. 如請求項204、請求項205或請求項216之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含選自由SEQ ID NO: 328、329或456組成之群的胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 340中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  218. 如請求項204、205及216至217中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 328、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 329、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 456、340及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。
  219. 如請求項204、205及216至218中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  220. 如請求項204、205及216至219中任一項之經分離單域抗體，其中該至少一個DLL3 sdAb包含SEQ ID NO: 265-274、416、455或476-478中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  221. 如請求項204或請求項205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 275、(ii) SEQ ID NO: 275之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 275展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  222. 如請求項204、205或221之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 341中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 357中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  223. 如請求項204、205及221至222中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  224. 如請求項204、205及221至223中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 277-279及479中之任一者中所示之胺基酸序列。
  225. 如請求項204或請求項205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 280、(ii) SEQ ID NO: 280之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 280展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  226. 如請求項204、205及225中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 330中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含SEQ ID NO: 342中所示之胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 358中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  227. 如請求項204、205及225至226中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 281-286中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  228. 如請求項204、205及225至227中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 281-286中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  229. 如請求項204或請求項205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 287、(ii) SEQ ID NO: 287之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 287展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  230. 如請求項204、205及229中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 345、346及347組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 359、360及361組成之群的胺基酸序列；且結合DLL3。
  231. 如請求項204、205及229至230中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 320、345及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、346及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、347及359中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、345及361中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、347及360中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  232. 如請求項204、205及229至231中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 288-298或102之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  233. 如請求項204、205及229至232中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 288-298或102中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  234. 如請求項204或請求項205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 299、(ii) SEQ ID NO: 299之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 299展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  235. 如請求項204、205及234中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 331中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 356中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  236. 如請求項204、205及234至235中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 331、348及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 331、349及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 331、350及356中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。
  237. 如請求項204、205及234至236中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  238. 如請求項204、205及234至237中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 300、302-305及480中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  239. 如請求項204或請求項205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 507、(ii) SEQ ID NO: 507之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 507展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  240. 如請求項204、205及239中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 332中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 348、349及350組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含SEQ ID NO: 362中所示之胺基酸序列；且結合DLL3。
  241. 如請求項204、205及239至240中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 332、348及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 332、349及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 332、350及362中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；且結合DLL3。
  242. 如請求項204、205及239至241中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 508-514中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  243. 如請求項204、205及239至242中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 508-514中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  244. 如請求項204或請求項205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 401、(ii) SEQ ID NO: 401之人類化變異體，或(iii)與SEQ ID NO: 401展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  245. 如請求項204、205及244中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含：CDR1，其包含SEQ ID NO: 320中所示之胺基酸序列；CDR2，其包含選自由SEQ ID NO: 384、410及411組成之群的胺基酸序列；及CDR3，其包含選自由SEQ ID NO: 395、412、413、414及415組成之群的胺基酸序列；且結合DLL3。
  246. 如請求項204、205及244至245中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 320、384及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、410及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、411及395中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及412中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及413中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；SEQ ID NO: 320、384及414中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或SEQ ID NO: 320、384及415中所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DLL3。
  247. 如請求項204、205及244至246中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 481-488中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列，且結合DLL3。
  248. 如請求項204、205及244至247中任一項之經分離單域抗體，其中該sdAb包含SEQ ID NO: 481-488中之任一者中所示之胺基酸序列，且結合DLL3。
  249. 如請求項204或請求項205之經分離單域抗體，其中該sdAb包含以下中所示之序列：(i) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517；(ii) SEQ ID NO: 314、518、515、516或517之人類化變異體；或(iii)與SEQ ID NO: 314、518、515、516或517中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列；且結合DLL3。
  250. 如請求項204、205及249中任一項之經分離單域抗體，其中該至少一個DLL3 sdAb包含SEQ ID NO: 333、351及363中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、352及364中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；320、353及365中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；334、339及366中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3；或335、348及367中分別所示之CDR1、CDR2及CDR3，且結合DDL3。
  251. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項1至79中任一項之DLL3結合多肽構築體。
  252. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項80至203中任一項之多特異性多肽構築體。
  253. 一種聚核苷酸，包含：第一核酸序列，其編碼如請求項80至203中任一項之多特異性構築體的第一多肽；及第二核酸序列，其編碼該多特異性構築體之第二多肽，其中該第一與第二核酸序列係藉由內部核糖體進入位點(IRES)或編碼自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽的核酸分隔。
  254. 如請求項253之聚核苷酸，其中該第一核酸序列及第二核酸序列可操作地連接至同一啟動子。
  255. 如請求項254之聚核苷酸，其中編碼自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽的該核酸係選自T2A、P2A、E2A或F2A。
  256. 一種聚核苷酸，其編碼如請求項204至250中任一項之單域抗體。
  257. 一種載體，其包含如請求項251至256中任一項之聚核苷酸。
  258. 如請求項257之載體，其為表現載體。
  259. 如請求項257或請求項258之載體，其為病毒載體或真核載體，視情況其中該真核載體為哺乳動物載體。
  260. 一種細胞，其包含一或多種如請求項251至256中任一項之聚核苷酸或一或多種如請求項257至259中任一項之載體。
  261. 如請求項260之細胞，其中該細胞為重組的或經分離的。
  262. 如請求項261之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  263. 一種產生多肽之方法，該方法包含將一或多種如請求項251至256中任一項之聚核苷酸或一或多種如請求項257至259中任一項之載體引入細胞中以及在產生該多特異性多肽構築體的條件下培養該細胞。
  264. 如請求項263之方法，其進一步包含自該細胞分離或純化該多肽。
  265. 一種多肽，其藉由如請求項263或請求項264之方法產生。
  266. 一種包含嵌合抗原受體的工程化免疫細胞，該嵌合抗原受體包含： 胞外域，其包含如請求項204至250中任一項之單域抗體； 跨膜域；及 胞內信號傳導域。
  267. 如請求項266之工程化免疫細胞，其中該細胞為淋巴球。
  268. 如請求項266或請求項267之工程化免疫細胞，其中該細胞為T細胞或自然殺手(NK)細胞。
  269. 如請求項266至268中任一項之工程化免疫細胞，其中該胞內信號傳導域包含基於免疫受體酪胺酸的活化模體(ITAM)信號傳導域。
  270. 如請求項266至269中任一項之工程化免疫細胞，其中該胞內信號傳導域為或包含CD3ζ信號傳導域，視情況為或包含人類CD3ζ信號傳導域。
  271. 如請求項269或請求項270之工程化免疫細胞，其中該胞內信號傳導域進一步包含共刺激分子之信號傳導域。
  272. 如請求項271之工程化免疫細胞，其中該共刺激分子為CD28、ICOS、41BB或OX40，視情況為人類CD28、人類ICOS、人類41BB或人類OX40。
  273. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至79中任一項之DLL3結合多肽構築體、如請求項80至203中任一項之多特異性多肽構築體、如請求項204至250中任一項之單域抗體，或如請求項266至272中任一項之工程化免疫細胞。
  274. 如請求項273之醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之載劑。
  275. 如請求項273或請求項274之醫藥組合物，其為無菌的。
  276. 一種刺激或誘導個體之免疫反應的方法，該方法包含向有需要之個體投與如請求項1至79中任一項之DLL3結合多肽構築體、如請求項80至203中任一項之多特異性多肽構築體、如請求項204至250中任一項之單域抗體，或如請求項266至272中任一項之工程化免疫細胞，或如請求項273-275之醫藥組合物。
  277. 如請求項276之方法，其中該免疫反應係針對腫瘤或癌症予以增強，視情況針對表現DLL3之腫瘤或癌症予以增強。
  278. 如請求項276或請求項277之方法，其中該方法治療該個體之疾病或病狀。
  279. 一種治療個體之疾病或病狀的方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之如請求項1至79中任一項之DLL3結合多肽構築體、如請求項80至203中任一項之多特異性多肽構築體、如請求項204至250中任一項之單域抗體，或如請求項266至272中任一項之工程化免疫細胞，或如請求項273至275之醫藥組合物。
  280. 如請求項278或請求項279之方法，其中該疾病或病狀為腫瘤或癌症。
  281. 如請求項276至277中任一項之方法，其中該個體為人類。
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