TW202024322A

TW202024322A - 腸管神經前驅細胞的製造方法

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Publication number: TW202024322A
Application number: TW108129822A
Authority: TW
Inventors: 池谷真; 豊岡彌生; 上谷大介; 山下輝芳; 武和巳
Original assignee: 國立大學法人京都大學; 日商武田藥品工業股份有限公司
Priority date: 2018-08-22
Filing date: 2019-08-21
Publication date: 2020-07-01
Also published as: CA3110026A1; SG11202101565XA; JPWO2020040166A1; CO2021002704A2; KR20210049779A; JP7341433B2; AU2019326179A1; US20210198624A1; MX2021002018A; CN112585262B; BR112021003092A2; AU2019326179A8; CN117551598A; EP3842525A1; EP3842525A4; IL280621A; EA202190582A1; CN112585262A; WO2020040166A1

Abstract

作為用於使腸管神經前驅細胞在維持有成為腸管神經細胞與膠細胞的分化能力的狀態培養而使其增殖的技術，本發明提供腸管神經前驅細胞的製造方法，其包含(1)提供腸管神經前驅細胞的步驟、及(2)於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的培養基中培養腸管神經前驅細胞的步驟。

Description

腸管神經前驅細胞的製造方法

本發明係有關於腸管神經前驅細胞的製造方法與擴大培養方法以及使用於該等方法之培養基。

神經嵴細胞(Neural Crest Cell；NCC)係於早期發育中由神經板形成神經管之際，由神經外胚葉和表皮外胚葉之間發育的細胞。腸管神經前驅細胞(Enteric Neural Precursor；ENP)係由該NCC發育，且分化成為腸管神經細胞譜系的細胞。ENP具有成為腸管神經細胞與膠細胞的分化能力。

作為起因於先天性的腸管神經節細胞的缺損的疾病，有呈現消化管運動的抑制的赫氏(Hirschsprung)病。近年，有報告基礎性嘗試，其目標為將自患者採取並於活體外增殖的ENP藉由自體移植而治療赫氏病(非專利文獻1)。

為了包含ENP的細胞醫藥的製造，正研究由人工誘導多潛能幹細胞(inducible Pluripotent Stem Cell；iPSC)等多潛能幹細胞誘導NCC，進一步由NCC誘導ENP。

例如，非專利文獻2中，記載由人多潛能幹細胞製作腸管神經系前驅細胞(enteric nervous system progenitor)。非專利文獻2中，不僅未揭示 PHOX2B陽性的腸管神經前驅細胞，並且，亦未記載關於神經節蛋白1(Neuregulin-1；NRG1)。

再者，非專利文獻3中，記載藉由以包含TGFβ抑制劑、GSK3β抑制劑與NRG1的培養基培養人iPSC，來製作許旺前驅細胞(Schwann cell precursor)。非專利文獻3所記載的方法不使用維生素A酸，所得之許旺前驅細胞係與ENP為不同的細胞(例如，ENP之PHOX2B表現為陽性，但同文獻所記載的許旺前驅細胞為陰性)。

[先行技術文獻] [非專利文獻]

[非專利文獻1]"Postnatal human enteric neuronal progenitors can migrate, differentiate, and proliferate in embryonic and postnatal aganglionic gut environments", Pediatric Research, 2017, 81, 5, 838-846.

[非專利文獻2]"Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease", Nature, 2016, 531, 105-109.

[非專利文獻3]"Schwann Cell Precursors from Human Pluripotent Stem Cells as a Potential Therapeutic Target for Myelin Repair", Stem Cell Reports, 2017, 8, 1714-1726.

為了實現使用ENP之細胞治療等，冀求可大量地供給ENP的技術。如上所述，雖然已報導由人多潛能幹細胞誘導腸管神經系前驅細胞(enteric nervous system progenitor)的方法(非專利文獻2)，但用於使經誘導的ENP增殖而擴大培養的手法至今仍未開發。

本發明係以提供用以使ENP在維持有成為腸管神經細胞與膠細胞的分化能力(多能性(multipotency))之狀態增殖的技術為主要目的。

為了解決上述課題，本發明提供以下的[1]至[27]。

[1]一種腸管神經前驅細胞之製造方法，包含下列步驟：

(A1)提供腸管神經前驅細胞的步驟；以及

(A2)於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的培養基中培養腸管神經前驅細胞的步驟。

[2]如[1]的製造方法，其中，前述培養基更包含TGFβ抑制劑與GSK3β抑制劑。

[3]如[1]或[2]的製造方法，其中，前述培養基更包含維生素A酸及/或其衍生物。

[4]如[1]至[3]中任一項的製造方法，其中，前述培養基更包含GDNF。

[5]如[1]至[4]中任一項的製造方法，其中，前述培養基更包含基質膠(Matrigel)。

[6]如[1]至[5]中任一項的製造方法，其中，前述ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑係NRG1。

[7]一種腸管神經前驅細胞，係藉由[1]至[6]中任一項的製造方法所獲得者。

[8]一種凍結存株，包含[7]的腸管神經前驅細胞。

[9]一種細胞醫藥，包含[7]的腸管神經前驅細胞。

[10]一種腸管神經前驅細胞的製造方法，包含下列步驟：

(B1)提供神經嵴細胞的步驟；以及

(B2)於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑、以及維生素A酸及/或其衍生物的培養基中培養神經嵴細胞的步驟。

[11]如[10]的製造方法，其中，前述神經嵴細胞係迷走神經嵴細胞。

[12]如[11]的製造方法，其中，前述迷走神經嵴細胞係SOX10陽性、HOXB5陽性、HOXB9陰性且PHOX2B陰性，

前述腸管神經前驅細胞係SOX10陽性且PHOX2B陽性。

[12a]如[10]至[12]的製造方法，其中，前述培養基更包含TGFβ抑制劑及/或GSK3β抑制劑。

[12b]如[10]至[12a]中任一項的製造方法，其中，前述培養基更包含維生素A酸及/或其衍生物。

[12c]如[10]至[12b]中任一項的製造方法，其中，前述培養基更包含GDNF。

[12d]如[10]至[12c]中任一項的製造方法，其中，前述培養基更包含基質膠。

[12e]如[10]至[12d]中任一項的製造方法，其中，前述ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑係NRG1。

[12f]一種腸管神經前驅細胞，係藉由[10]至[12e]中任一項的製造方法所獲得。

[13]一種腸管神經前驅細胞培養基，包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑。

[14]如[13]的培養基，更包含TGFβ抑制劑及/或GSK3β抑制劑。

[15]如[13]或[14]的培養基，更包含維生素A酸及/或其衍生物。

[16]如[13]至[15]中任一項的培養基，更包含GDNF。

[17]如[13]至[16]中任一項的培養基，更包含基質膠。

[18]如[13]至[17]中任一項的培養基，其中，前述ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑係NRG1。

[19]一種腸管神經前驅細胞的擴大培養方法，包含下列步驟：

(C1)提供腸管神經前驅細胞的步驟；以及

(C2)於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的培養基中培養腸管神經前驅細胞的步驟。

[20]一種腸管的類器官的製造方法，包含共培養腸管神經前驅細胞與後腸細胞的步驟。

[21]一種人工腸管的製造方法，包含共培養腸管神經前驅細胞與後腸細胞而獲得腸管的類器官的步驟；以及將前述腸管的類器官移植至活體內並使人工腸管形成的步驟。

[21a]一種人工腸管的製造方法，包含共培養腸管神經前驅細胞與後腸細胞而獲得腸管的類器官的步驟；以及將前述腸管的類器官移植至人類以外的哺乳動物的活體內並使人工腸管形成的步驟。

[22]如[20]至[21a]記載的製造方法，其中，前述腸管神經前驅細胞係藉由[1]至[6]中任一項記載的製造方法所獲得的腸管神經前驅細胞。

[23]一種腸管的類器官，係藉由[20]或[22]的製造方法所獲得。

[24]一種人工腸管，係藉由[21]至[22]中任一項的製造方法所獲得。

[25]一種腸管神經前驅細胞培養基用添加劑，包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑。

[26]一種ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑之用途，係用於腸管神經前驅細胞的擴大培養。

[27]如[25]的添加劑或[26]的用途，其中，前述ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑係NRG1。

本發明中，「神經嵴細胞(Neural Crest Cell：NCC)」意指於發育初期中，當由神經板形成神經管之際，由神經外胚葉與表皮外胚葉之間所產生的細胞，且具有分化成為神經細胞、膠細胞、間葉系間質細胞、骨細胞、軟骨細胞、角膜細胞與色素細胞等多種類的細胞的多能性(multipotency)與自我增殖能力。NCC為SOX10陽性。

「頭部神經嵴細胞(Cranial NCC)」意指於發育期中，由比聽囊更靠近頭部側所產生，且會分化為顏面的骨、軟骨與神經等之細胞集團。頭部神經嵴細胞係神經嵴細胞標記之SOX10陽性，HOXB基因群(HOXB1-10)為陰性的細胞。

「迷走神經嵴細胞(Vagal NCC)」意指於發育期中，由相當於第1至第7體節的部位所產生，且會分化為腸管神經系等之細胞集團。迷走神經嵴細胞係神經嵴細胞標記之SOX10陽性、HOXB5陽性、HOXB9陰性、且PHOX2B陰性。較佳係SOX10陽性、HOXB1-7陽性、HOXB9陰性、HOXB10陰性、且PHOX2B陰性。

「體幹神經嵴細胞(Trunk NCC)」意指於發育期中，由相當於第8體節至尾側的部位所產生，且會分化為自律神經系、感覺神經、色素細胞與腎上腺髓質的嗜鉻細胞等之細胞集團。體幹神經嵴細胞係神經嵴細胞標記之SOX10陽性、HOXB1-9陽性、HOXB10陰性且PHOX2B陰性。

「薦骨神經嵴細胞(Sacral NCC)」意指於發育期中，由相當於最尾側的部位所產生，且會分化為大腸的一部份的腸管神經系等之細胞集團。薦骨神經嵴細胞係神經嵴細胞標記之SOX10陽性、HOXB1-10陽性且PHOX2B陰性。

「腸管神經前驅細胞(Enteric Neural Precursor；ENP)」意指由迷走神經嵴細胞與薦骨神經嵴細胞分化，神經嵴細胞與膠細胞標記之SOX10陽性且PHOX2B陽性的細胞。ENP係具有成為PHOX2B陽性且SOX10陰性的腸管神經細胞，與S100β陽性、PLP1陽性且SOX10陽性的膠細胞的分化能力。

「腸管神經細胞」係源自腸管神經前驅細胞，PHOX2B陽性且SOX10陰性。

「膠細胞」係S100β陽性、PLP1陽性且SOX10陽性，或GFAP陽性。本說明書中，有將膠細胞特別稱為「腸管膠細胞」的情況。腸管膠細胞，例如，可藉由使腸管神經前驅細胞分化成為膠細胞而獲得。

「腸管神經前驅細胞培養基」係使用於ENP的製造及/或ENP的擴大培養用的培養基。ENP的製造可包含由iPS細胞、ES細胞與NCC等幹細胞分化成為ENP。

「腸管的類器官」意指於活體外所製作的組織構造體，且為具有人類等哺乳動物的腸所具有的複數功能(例如，蠕動運動功能、黏液分泌功能、物質吸收功能等)或具有類似於該等功能之1種以上的組織構造體。腸管的類器官係藉由包含例如選自後腸細胞、前腸細胞等構成腸管的各種細胞的來源原始細胞，與後腸細胞、前腸細胞、腸管神經細胞、腸管神經前驅細胞、腸幹細胞(LGR5陽性)、Paneth細胞(LYZ陽性)、杯狀細胞(Mucin陽性)與分泌細胞等構成腸管的各種細胞以及該等細胞的來源原始細胞之至少一種細胞的細胞集團所構成。

「人工腸管」意指將腸管的類器官移植至人類或人類以外的哺乳動物的活體內並使其成熟化所獲得的組織構造體，且為具有人類等哺乳動物的腸所具有的複數功能(例如，蠕動運動功能、黏液分泌功能、物質吸收功能等)或具有類似於該等功能之1種以上的組織構造體。人工腸管係藉由例如將腸管的類器官移植至小鼠等哺乳動物的體內(例如，腹腔內)，並使其歷經規定期間而製作。人工腸管包含細胞集團，該細胞集團包含例如選自後腸細胞、前腸細胞等構成腸管的各種細胞的來源原始細胞，與後腸細胞、前腸細胞、腸管神經細胞、腸管神經前驅細胞、腸幹細胞(LGR5陽性)、Paneth細胞(LYZ陽性)、杯狀細胞(Mucin陽性)與分泌細胞等構成腸管的各種細胞以及該等細胞的來源原始細胞之至少一種的細胞。進一步地，人工腸管例如為亦可包含肌肉細胞與起搏細胞等者，此時神經細胞係配置於肌肉細胞間。

「後腸細胞」係於發育過程中由內胚葉分化的細胞，以CDX2陽性為特徵。後腸細胞塊，除了後腸細胞之外，亦可包含上皮細胞(E-鈣黏蛋白(cadherin)陽性)與間葉系細胞(波形蛋白(Vimentin)陽性)。

「胚體內胚葉」係於發育過程中由前方原條(primitive streak)分化的細胞，以SOX17陽性且FOXA2陽性為特徵。

「ERBB3」係由ERBB3基因所編碼的酪胺酸激酶受體，且為EGF受體家族之一。亦稱為HER3(人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor)3)。ERBB3係與ERBB2形成異二聚體，並活化關於細胞的增殖或分化之訊息傳遞途徑。已知ERBB3表現在腸管神經前驅細胞。雖已知ERBB3存在剪接變異體，但本發明中的ERBB3包含該等變異體而不特別限定。

「ERBB3促效劑」若為具有會與ERBB3結合而活化其下游的訊息傳遞途徑的能力(ERBB3促效劑活性)的物質即可，可為蛋白質、肽、核酸與低分子化合物以及此等的衍生物等。ERBB3促效劑，例如有NRG1、NRG2與NRG6等蛋白質。NRG1、NRG2與NRG6等蛋白質可為全長蛋白質，亦可為具有ERBB3促效劑活性之其片段。

「ERBB4」係ERBB4基因所編碼的酪胺酸激酶受體，且為EGF受體家族之一。亦稱為HER4(人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor)4)。ERBB4係與ERBB2形成異二聚體，並活化關於細胞的增殖或分化之訊息傳遞途徑。雖已知ERBB4存在各種的剪接變異體，但本發明中的ERBB4包含該等變異體而不特別限定。

「ERBB4促效劑」若為具有會與ERBB4結合而活化其下游的訊息傳遞途徑的能力(ERBB4促效劑活性)的物質即可，可為蛋白質、肽、核酸與低分子化合物以及此等的衍生物等。ERBB4促效劑，例如有NRG1、NRG2、NRG3、NRG4、NRG5、BTC、EPR與HBEGF等蛋白質。NRG1-5、BTC、EPR與HBEGF等蛋白質可為全長蛋白質，亦可為具有ERBB4促效劑活性之其片段。

「神經調節素1(Neuregulin-1；NRG1)」係由NRG1基因所編碼的類EGF增殖因子。亦稱為神經生長素(Heregulin)。已知會與ERBB3及ERBB4結合，並活化其下游的訊息傳遞途徑。

「源自膠細胞的神經營養因子(Glial cell line Derived Neurotrophic Factor；GDNF)」係由GDNF基因所編碼的因子，且作用為GFRα1與RET的促效劑。已知關聯於神經細胞與膠細胞的保護或腸管神經前驅細胞的增殖。

「基質膠(Matrigel)」係由包含豐富的細胞外基質蛋白質的Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤所萃取之可溶性基底膜調製品，主成分為層連結蛋白、膠原蛋白IV、硫酸類肝素蛋白多糖、以及巢蛋白(entactin/nidogen)1與2，亦為於該等中包含TGFβ、上皮細胞增殖因子(EGF)、類胰島素生長因子(IGF)、纖維母細胞增殖因子(FGF)、組織纖維蛋白溶酶原活化因子3與4、於Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)腫瘤自然產生的其他增殖因子者。

「培養」係指將細胞維持於體外環境中，使其增殖(使其成長)，及/或使其分化。「進行培養」意指於將細胞維持於組織外或體外，例如細胞培養皿或燒瓶中，使其增殖(使其成長)，及/或使其分化。

「擴大培養」意指以使所期望的細胞集團增殖，而使細胞數增加為目的進行培養。細胞數的增加，若為可達成經由細胞的增殖所造成的增數超過經由死亡所造成的減數者即可，不必為細胞集團的所有細胞皆增殖。細胞數的增加，相比於擴大培養開始前，可為1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍以上。

「維持培養」意指一邊維持所期望的細胞集團之數目一邊培養。細胞數的維持可為細胞不增殖而藉由生存達成者，亦可為因細胞的增殖所造成的增數與因死亡所造成的減數拮抗而達成者。細胞數的維持，不必使細胞數維持完全相同，若按照本發明的目的使細胞數維持實質相同即可。

「細胞集團」意指同種類或不同種類的2種以上細胞。「細胞集團(population)」亦意指同種類或不同種類的細胞的塊體(mass)。

「貼附培養」意指使細胞附著於容器的狀態，例如於適當培養基的存在下以使細胞為附著於滅菌塑膠(或經被覆塑膠)的細胞培養皿或燒瓶的狀態，進行培養。

「懸浮培養」意指細胞不附著於容器而以使其分散於適當培養基的狀態進行培養。

「多潛能(pluripotency)」意指可分化為具有各種不同形態或功能的組織或細胞，亦可分化為3胚葉的任意系統的細胞的能力。「多潛能(pluripotency)」就所謂不可分化為胚盤，因此無形成個體的能力的點而言，與可分化為包含胚盤在內之活體的所有組織的「全能性(totipotency)」予以區別。

「多能性(multipotency)」意指可分化成為複數種的限定數的系統的細胞的能力。例如，間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞雖為多能(multipotent)但非為多潛能(pluripotent)。ENP具有分化成為神經細胞與膠細胞的多能性(multipotency)。

「標記」為「標記蛋白質」或「標記基因」，且意指於規定的細胞型中，特異性地表現於細胞表面、細胞質內及/或核內等的蛋白質或其基因。標記為陽性選擇標記或陰性選擇標記。較佳係標記為細胞表面標記，尤其若藉由細胞表面陽性選擇標記，則可實施生存細胞的濃縮、單離、及/或檢測。

標記蛋白質的檢測可利用例如使用對該標記蛋白質有特異性的抗體的免疫學分析，例如ELISA、免疫染色、流體細胞術等來進行。就對標記蛋白質有特異性的抗體而言，可使用會結合於該標記蛋白質中的特定胺基酸序列或已在標記蛋白質結合的特定糖鏈等的抗體。再者，在表現於細胞內但不呈現於細胞表面的標記蛋白質(例如轉錄因子或其次單元等)的情況，可藉由使該標記蛋白質與報導子蛋白質同時表現，並檢測該報導子蛋白質而檢測作為對象的標記蛋白質(例如，非專利文獻4)。該方法較佳可使用於無法確認到適當的細胞表面標記的情況。標記基因的檢測，可利用所屬技術領域習知的核酸擴增方法及/或核酸檢測方法，例如RT-PCR、微陣列、生物晶片與RNAseq等來進行。

「表現(expression)」定義為經由細胞內的啟動子所驅動的特定核苷酸序列的轉錄及/或轉譯。

「陽性(positive)」或「進行表現」意指蛋白質或基因係以可經由所屬技術領域習知的手法而檢測出的量表現。蛋白質的檢測，可利用使用抗體的免疫學分析，例如ELISA、免疫染色、流體細胞術來進行。再者，在表現於細胞內但不呈現於細胞表面的蛋白質(例如轉錄因子或其次單元等)的情況，可藉由使該蛋白質與報導子蛋白質同時表現，並檢測該報導子蛋白質而檢測作為對象的蛋白質。基因的檢測可利用例如RT-PCR、微陣列、生物晶片及RNAseq等核酸擴增方法及/或核酸檢測方法來進行。

「陰性(negative)」或「不表現」意指蛋白質或基因的表現量未達經由如上述之習知手法中的全部或任一手法所進行之檢測的下限值。蛋白質或基因的表現的檢測下限值，可因各手法而不同。

確認到「SOX10」係表現於全部的神經嵴細胞、腸管神經前驅細胞與源自此等的膠細胞。另一方面，SOX10不表現於腸管神經細胞。

「HOXB5」係表現於迷走神經嵴細胞、體幹神經嵴細胞與薦骨神經嵴細胞，已知於腸管神經細胞的正常發育為必要的。另一方面，HOXB5不表現於頭部神經嵴細胞。

「HOXB9」係表現於體幹神經嵴細胞與薦骨神經嵴細胞。另一方面，HOXB9不表現於頭部神經嵴細胞與迷走神經嵴細胞。

確認到「PHOX2B」係表現於腸管神經前驅細胞與源自其之腸管神經細胞。

「GFAP(膠質纖維酸性蛋白質(Glial fibrillary acidic protein))」係表現於膠細胞。另一方面，GFAP不表現於腸管神經前驅細胞與腸管神經細胞。

「包含(comprise(s)或comprising)~」意指包含接續在該語句之後的要件但不限定為該等。因此，表示包含接續在該語句之後的要件，但不表示其他任意要件的排除。

「約」或「大約」顯示相對於基準值以各自正或負30%、25%、20%、15%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%為止變動的值。較佳係「約」或「大約」之用語顯示相對於基準值為各自正或負15%、10%、5%、或1%的範圍。

藉由本發明，可提供用於使ENP在維持有成為腸管神經細胞與膠細胞的分化能力的狀態增殖的技術。

第1圖為顯示本發明之第二實施態樣之ENP的製造方法的步驟的一例的圖。

第2圖為顯示自人類iPSC所分化之迷走神經嵴細胞的基因表現趨勢的圖。(A)顯示HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB7與HOXB9的表現量，(B)顯示SOX10與EDNRB的表現量。縱軸係由將以在頭部神經嵴細胞的表現量作為1所得的比以log2表示的值來顯示表現量(Fold change)。

第3圖為顯示以腸管神經前驅細胞培養基繼代培養迷走神經嵴細胞時的總細胞數(accumulated cell number)的經時變化的圖。

第4圖為顯示以腸管神經前驅細胞培養基培養迷走神經嵴細胞所獲得之細胞的流體細胞術解析結果的圖。(A)顯示培養第11日的迷走神經嵴細胞中之SOX10-tdTomato與PHOX2B-emGFP的表現，(B)顯示繼代次數(1至6次)的腸管神經前驅細胞中之SOX10-tdTomato與PHOX2B-emGFP的表現。

第5圖為顯示以腸管神經前驅細胞培養基或由該培養基去除NRG1或GDNF而成的培養基培養迷走神經嵴細胞所獲得之細胞的螢光影像及由流體細胞術所得的SOX10-tdTomato與PHOX2B-emGFP的表現解析結果的圖。螢光影像中，紅色表示SOX10-tdTomato的螢光，綠色表示PHOX2B-emGFP的螢光。

第6圖為顯示以腸管神經前驅細胞培養基培養迷走神經嵴細胞所獲得的細胞的基因表現趨勢的圖。EDNRB與RET各自表示「內皮素受體類型B(endothelin receptor type B)」與「ret原致癌基因(ret proto-oncogene)」。

第7圖為以腸管神經誘導培養基培養腸管神經前驅細胞所獲得的細胞的螢光免疫染色圖像。螢光免疫染色圖中，綠色表示PHOX2B-emGFP的螢光，紫色表示ChAT、nNOS、GABA或5-HT的表現。

第8圖為由腸管的類器官所形成的人工腸管的螢光免疫染色圖像，且顯示源自PHOX2B-emGFP與SOX10-tdTomato陽性的腸管神經前驅細胞的細胞。上段右圖像為上段左圖像的部分擴大，下段右圖像為下段左圖像的部分擴大。螢光免疫染色圖像中，紅色表示SOX10-tdTomato的螢光，綠色表示PHOX2B-emGFP的螢光，藍色表示核。

第9圖為由腸管的類器官所形成的人工腸管的螢光免疫染色圖像，且顯示源自腸管神經前驅細胞的S100β陽性(A)、GFAP陽性(B)或TUBB3(C)陽性的神經細胞或膠細胞。螢光免疫染色圖像中，紅色表示SOX10-tdTomato的螢光，綠色表示PHOX2B-emGFP的螢光，黃色表示S100β、GFAP或TUBB3的表現，藍色表示核。

第10圖為顯示量測由腸管的類器官所形成的人工腸管之對於電刺激之收縮鬆弛反應的結果的圖。

第11圖為顯示量測由腸管的類器官所形成的人工腸管之對於電刺激之收縮鬆弛反應的結果的圖。

第12圖為顯示量測由腸管的類器官所形成的人工腸管之對於電刺激之收縮鬆弛反應的結果的圖。

第13圖顯示評估擴大培養後之經凍結融解的腸管神經前驅細胞的增殖能力與分化能力的結果。(A)表示擴大培養時的細胞數的經時變化(左圖)，與於全細胞中所佔有的腸管神經前驅細胞之比例的經時變化(右圖)。(B)表示腸管神經前驅細胞(ENP，左圖)以及由其所分化的腸管神經細胞(ENS，右圖)中，PHOX2B與SOX10的表現經由流體細胞術解析的結果。(C)表示由腸管神經前驅細胞所分化的腸管神經細胞與膠細胞的螢光免疫染色圖像。螢光免疫染色圖像中，綠色表示 PHOX2B-emGFP的螢光或GFAP的表現，紫色表示外周蛋白(Peripherin)、ChAT、nNOS、GABA、TH或SST的表現。

第14圖為由擴大培養後的腸管神經前驅細胞所分化的膠細胞的螢光免疫染色圖像。

第15圖為擴大培養後的腸管神經前驅細胞移植至小鼠盲腸壁並經過1週後的移植部位的螢光免疫染色圖像。螢光免疫染色圖像中，藍色表示核，綠色表示PHOX2B-emGFP的螢光，紅色表示SOX10-tdTomato的螢光，紫色表示TUBB3的表現。(b)為(a)的部分擴大。

以下，說明用於實施本發明的較佳態樣。又，以下說明的實施態樣，係顯示本發明的代表性實施態樣的一例者，不因該等而使本發明的範圍被狹義解釋。

本發明者們發現，藉由於ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的存在下培養腸管神經前驅細胞(ENP)，可使ENP在維持有成為腸管神經細胞與膠細胞的分化能力的狀態增殖。

根據該發現，作為第一實施態樣者，本發明提供包含下列步驟(A1)與步驟(A2)的ENP的製造方法。

(A1)提供ENP的步驟；以及

(A2)於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的培養基中培養ENP的步驟。

步驟(A2)中，ENP係進行增殖者，此觀點中關於第一實施態樣的ENP的製造方法係與ENP的擴大培養方法為同義。

本發明的ENP的製造方法中，ENP亦可為由神經嵴細胞(NCC)分化、增殖者。此觀點中，作為第二實施態樣者，本發明提供包含下列步驟(B1)與步驟(B2)的ENP的製造方法。

(B1)提供NCC的步驟；以及

(B2)於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑、以及維生素A酸及/或其衍生物的培養基中培養NCC的步驟。

作為第三實施態樣者，本發明提供包含下列步驟(C1)與步驟(C2)的ENP的擴大培養方法。

(C1)提供ENP的步驟；以及

(C2)於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的培養基中培養ENP的步驟。

以下，依序說明第一實施態樣的ENP的製造方法的步驟(A1)與(A2)、第二實施態樣的ENP的製造方法的步驟(B1)與(B2)、以及第三實施態樣的ENP的擴大培養方法的步驟(C1)與(C2)。

[第一實施態樣的製造方法(伴隨ENP的增殖步驟的方法)]

[第一實施態樣步驟(A1)：提供腸管神經前驅細胞的步驟]

本步驟中，提供ENP。本步驟至少可提供ENP即可，亦可提供單一的ENP細胞、ENP的細胞集團或包含ENP的細胞集團。

本步驟中所提供的ENP，可為商業上取得的ENP，亦可為自活體所分離的ENP，甚至可為藉由後文所述方法而由NCC等誘導的ENP。商業上取得的ENP，可為在培養狀態的ENP，亦可為在凍結狀態的ENP。再者，即使在ENP為由NCC等所誘導的ENP的情況，可為在培養狀態的ENP，亦可為在凍結狀態的ENP。

就自活體分離ENP的方法而言，例如已知將腸管組織切出成為1mm見方，並施以酵素處理(分散酶(dispase)與膠原蛋白酶XI型，37℃，90分鐘)後，將所獲得的細胞於包含EGF與FGF的培養基培養，分離ENP作為凝集細胞的方法等。分離時，組合藉由抗CD271抗體而進行的細胞分選，亦可提高ENP的純度。

[第一實施態樣步驟(A2)：培養腸管神經前驅細胞的步驟]

本步驟中，於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的培養基中培養ENP。

ERBB3促效劑，若為具有會與ERBB3結合而使其下游的訊息傳遞途徑活化的能力(ERBB3促效劑活性)的物質即可，可為蛋白質、胜肽、核酸與低分子化合物及此等的衍生物等。ERBB3促效劑，例如有NRG1、NRG2與NRG6等蛋白質。NRG1、NRG2與NRG6等蛋白質，可為全長蛋白質，亦可為具有ERBB3促效劑活性的其片段。

ERBB4促效劑，若為具有會與ERBB4結合而使其下游的訊息傳遞途徑活化的能力(ERBB4促效劑活性)的物質即可，可為蛋白質、胜肽、核酸與低分子化合物以及此等的衍生物等。ERBB4促效劑，例如有NRG1、NRG2、NRG3、NRG4、NRG5、BTC、EPR與HBEGF等蛋白質。NRG1-5、BTC、EPR與HBEGF等蛋白質，可為全長蛋白質，亦可為具有ERBB4促效劑活性的其片段。

NRG1、NRG2、NRG3、NRG4、NRG5、NRG6、BTC、EPR與HBEGF等蛋白質，根據欲培養對象的細胞的來源種，而適當使用源自人類的蛋白質，或例如源自猴、豬、牛、山羊、羊、小鼠、大鼠等人類以外的哺乳動物的蛋白質。

該等蛋白質可使用通常的分子生物學手法調製作為重組蛋白質，或可作為市售的試劑而取得。

ERBB3促效劑與ERBB4促效劑，較佳為NRG1或具有ERBB3促效劑活性或ERBB4促效劑活性的NRG1片段。

人類NRG1的全長胺基酸序列示於序列編號1(NCBI登錄編號：NP_039250)。

就具有ERBB3促效劑活性或ERBB4促效劑活性的NRG1片段而言，可列舉由序列編號1的胺基酸序列產生之例如胺基酸數10至300、20至150、或30至100的片段。

NRG1的片段，例如可為包含對ERBB3或ERBB4的結合域(類-EGF域)的片段。結合域為序列編號1中胺基酸編號190至220。

NRG1與其片段，可使用通常的分子生物學手法調製作為重組蛋白質，或可作為市售的試劑而取得。包含對ERBB3或ERBB4的結合域(類-EGF域)的NRG1片段可為商業上取得(例如，重組人類神經調節蛋白(Heregulin)β-1，目錄編號：100-03,PEPROTECH)。

NRG1或其片段亦可為由序列編號1記載的胺基酸序列或其部分序列中1個或數個的胺基酸經缺失、置換、插入或加成的改變胺基酸序列而成，且具有ERBB3促效劑活性或ERBB4促效劑活性者。

本文中，數個意指20個以下，較佳為10個以下，更佳為5個以下，再佳為3個以下，最佳為2個。

就改變胺基酸序列而言，可為相對於序列編號1的胺基酸序列而言具有80%以上，較佳為85%以上，更佳為90%以上，再佳為95%以上，最佳為98%以上的同一性的胺基酸序列。胺基酸序列的同一性，可經由廣泛使用的解析工具計算，例如可利用全美生物技術資訊中心(NCBI)提供的BLAST。

再者，NRG1或其片段，以可保持ERBB3促效劑活性或ERBB4促效劑活性為限，亦可為與其他蛋白質的融合蛋白質或經結合其他分子的修飾蛋白質。

關於蛋白質片段等的ERBB3促效劑活性或ERBB4促效劑活性的評估，可使用市售的套組來進行。例如，使用PathHunter(註冊商標)ERBB2-ERBB3 Functional Assay或PathHunter(註冊商標)ERBB4 Functional Assay(任一者皆為DiscoverX公司)，將套組所含有的細胞株於各種濃度的促效劑候選物質存在下培養後測定β-半乳糖苷酶活性。β-半乳糖苷酶活性顯示高值的候選物質係具有促效劑活性。

本步驟之培養基中的ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的濃度，根據所添加的ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的種類而適當調整，例如可為1至1000ng/mL，較佳為50至200ng/mL。

在使用NRG1作為ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的情況，其在培養基中的濃度，例如可為1至1000ng/mL，較佳為50至200ng/mL，特佳為約100ng/mL。

培養基亦可包含TGFβ抑制劑與GSK3β抑制劑。

「TGFβ抑制劑」為對於TGFβ(轉形增殖因子β)具有阻礙活性的物質。TGFβ為結合於2種類的絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶型受體的細胞激素，藉由以Smad(R-Smad)的活化為主之訊息傳遞而調控細胞增殖、細胞分化、細胞死亡等。就具有 TGFβ阻礙活性的物質而言，可列舉會阻礙TGFβ與其受體結合的物質、或會阻礙TGFβ結合於受體後的下游訊息的物質。就該下游訊息而言，例示經由TGFβII型受體而進行的TGFβI型受體的磷酸化、經由磷酸化TGFβI型受體而進行的Smad的磷酸化等。本發明中所使用的「TGFβ抑制劑」若具有TGFβ阻礙活性則無特別限定。

就TGFβ抑制劑而言，可列舉SB431542(4-[4-(1,3-苯并二氧雜環戊-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲醯胺)、A83-01(4-[4-(1,3-苯并二氧雜環戊-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲醯胺)、LDN193189(4-[6-[4-(1-哌嗪基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]-喹啉)、GW788388(4-[4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]-2-吡啶基]-N-(四氫-2H-哌喃-4-基)-苯甲醯胺)、SM16(4-[4-(1,3-苯并二氧雜環戊-5-基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-雙環[2.2.2]辛烷-1-羧醯胺)、IN-1130(3-[[5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-(6-喹噁啉基)-1H-咪唑-2-基]甲基]-苯甲醯胺)、GW6604(2-苯基-4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶)與SB505124(2-[4-(1,3-苯并二氧雜環戊-5-基)-2-(1,1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基-吡啶)等。此等亦可組合2種以上而使用。

本步驟之培養基中的TGFβ抑制劑的濃度，根據所添加的TGFβ抑制劑的種類而適當調整，例如可為0.1至50μM，較佳為1至20μM。

在使用SB431542(4-[4-(1,3-苯并二氧雜環戊-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲醯胺)作為TGFβ抑制劑的情況，其在培養基中的濃度，例如可為1至100μM，較佳為5至20μM，特佳為約10μM。

「GSK3β抑制劑」為對於GSK3β(肝醣合成酶激酶3β)具有阻礙活性的物質。GSK3(肝醣合成酶激酶3)為絲胺酸/蘇胺酸蛋白質激酶的一種，參與和肝醣的產生或細胞凋亡、幹細胞的維持等相關的多數的訊息傳遞途徑。GSK3存在有α及β的2種同功型。本發明中所使用的「GSK3β抑制劑」若具有GSK3β阻礙活性則無特別限定，亦可為兼具有GSK3β阻礙活性與GSK3α阻礙活性的物質。

就GSK3β抑制劑而言，可列舉CHIR98014(N⁶-[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]-3-硝基-2,6-吡啶二胺)、CHIR99021(6-{2-[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)嘧啶-2-基胺基]乙基胺基}菸鹼甲腈)、CP21R7(3-(3-胺基苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、LY2090314(3-[9-氟-1,2,3,4-四氫-2-(1-哌啶基羰基)吡咯并[3,2,1-jk][1,4]苯并二氮呯-7-基]-4-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基-1h-吡咯-2,5-二酮)、TDZD-8(4-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑啶-3,5-二酮)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、TWS-119(3-[[6-(3-胺基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]氧基酚二三氟乙酸鹽)、肯帕羅酮(Kenpaullone)、1-氮雜肯帕羅酮(Azakenpaullone)、SB415286(3-[(3-氯-4-羥基苯基)-胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)與AR-AO144-18(1-[(4-甲氧基苯基)甲基]-3-(5-硝基-1,3-噻唑-2-基)脲)、CT99021、CT20026、BIO((2'Z,3'E)-6-溴靛玉紅-3'-肟)、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-環戊二烯基釕複合體、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、鋰等。此等亦可組合2種以上而使用。

GSK3β抑制劑不限定為此等者，對於GSK3β的mRNA的反義寡核苷酸或siRNA、會結合於GSK3β的抗體、顯性負向GSK3β變異體等亦可使用來作為GSK3β抑制劑，此等可商業上取得或可根據習知的方法合成。

本步驟之培養基中的GSK3β抑制劑的濃度，根據所添加的GSK3β抑制劑的種類而適當調整，例如可為0.1至10μM，較佳為0.5至2μM。

在使用CHIR99021作為GSK3β抑制劑的情況，其在培養基中的濃度，例如可為0.1至10μM，較佳為0.5至2μM，特佳為約1μM。

本步驟之培養基亦可進一步包含維生素A酸(RA)及/或其衍生物(以下，亦簡稱為「RA等」)、源自膠細胞的神經營養因子(GDNF)、及基質膠之任一種以上。

就維生素A酸(RA)的衍生物而言，可使用視黃醇、視黃醛、維甲酸、異維甲酸、鋁視黃酸(alitretinoin)、阿維A酯(Etretinate)、阿維A酸(Acitretin)、他扎羅汀(Tazarotene)、貝沙羅汀(Bexarotene)、阿達帕林(Adapalene)。此等亦可組合2種以上而使用。

本步驟之培養基中的RA等的濃度，根據所添加的RA等的種類而適當調整，例如可為0.001至50μM，較佳為0.1至10μM。

在使用RA作為RA等的情況，其在培養基中的濃度，例如可為0.001至50μM，較佳為0.1至10μM，特佳為約1μM。

本步驟之培養基中的GDNF的濃度，例如可為1至1000ng/mL，較佳為50至200ng/mL。

本步驟之培養基中的基質膠的濃度，例如為0.2至20%(v/v)，較佳為1至4%(v/v)，特佳為約2%(v/v)。

基礎培養基，雖無特別限定，但較適合使用例如StemFit AK03(味之素Health Supply)的A液與B液經混合者、TeSR1培養基以及化學定義培養基(CDM)培養基。此外，亦可使用BME培養基、BGJb培養基、CMRL 1066培養基、Glasgow MEM培養基、改良的MEM(IMEM)培養基、改良的MDM(IMDM)培養基、Medium 199培養基、Eagle MEM培養基、αMEM培養基、DMEM培養基(高葡萄糖、低葡萄糖)、DMEM/F12培養基、Ham培養基、RPMI 1640培養基、Fischer's培養基、及此等的混合培養基等。

就CDM培養基而言，雖無特別限定，但例如可使用由Iscove’s modified Dulbecco’s medium(GE Healthcare公司製)所調製的培養基。

基礎培養基中，可添加去鐵轉鐵蛋白(apotransferrin)、單硫甘油、牛血清白蛋白(BSA)、胰島素及/或抗生素等通常的細胞培養中所使用的物質。

藉由於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑，較佳為更包含TGFβ抑制劑、GSK3β抑制劑、RA等、GDNF及基質膠之任一種以上的培養基中培養ENP，可使ENP在維持有多能性(multipotency)的狀態培養、使其增殖。

本步驟的培養期間，若為ENP增殖而達到目標細胞數的期間即可，雖無特別限定，但例如可為7日以上、10日以上、14日以上、20日以上、25日以上、30日以上、40日以上、50日以上、60日以上、70日以上、80日以上、90日以上、7至100日、100日以上。

該期間的細胞增殖速度，以細胞加倍的時間為約75小時之非常高的速度達成。

本步驟較佳雖為經由貼附培養，但亦可為懸浮培養。

貼附培養中，可使用培養皿、燒瓶、微孔盤與OptiCell(製品名、Nunc)等細胞培養片等培養容器。

貼附培養中使用的容器，可施用為了提升與細胞的貼附性(親水性)的表面處理，或亦可經由膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連結蛋白、纖連蛋白、基質膠、玻連蛋白等細胞貼附用基質而將其被覆，但以使用未進行該等表面處理或被覆的容器為更佳。

懸浮培養中，將細胞分散於培養基中，並經由攪拌或震盪而使培養基成分與培養基內氧濃度均勻化的同時形成細胞凝集塊。適合的攪拌速度，根據細胞密度與培養容器的大小而適當設定，但過度的攪拌或振盪對細胞賦予物理性應力，阻礙細胞凝集塊形成。因此，以培養基成分與培養基內氧濃度可均勻化，且不阻礙細胞凝集塊形成的方式調控攪拌或振盪速度。亦可不攪拌或振盪而靜置進行懸浮培養。

懸浮培養中，較佳使用Prime surface(製品名，住友Bakelite股份有限公司)等低貼附被覆的容器。

培養溫度，雖無特別限定，但可於30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中的二氧化碳濃度例如可為5%左右。

[第二實施態樣的製造方法(NCC之成為ENP的分化與伴隨ENP的增殖的方法)]

[第二實施態樣步驟(B1)：提供神經嵴細胞的步驟]

本步驟中，提供NCC。本步驟若至少提供NCC即可，亦可提供單一的NCC細胞、NCC的細胞集團或包含NCC的細胞集團。

本步驟中所提供的NCC，可為商業上取得的NCC，亦可為自活體分離的NCC，甚至可為由幹細胞(stem cell)等所分化的NCC。商業上取得的NCC，可為在培養狀態的NCC，亦可為在凍結狀態的NCC。再者，在NCC為由幹細胞等所分化的NCC的情況，可為在培養狀態的NCC，亦可為在凍結狀態的NCC。

就市售的NCC而言，例如可列舉人類毛包外毛根鞘細胞(Cosmo‧Bio公司製)、O9-1小鼠顱神經嵴細胞株(Millipore公司製)等。

再者，已報導NCC係存在於受精後30日前後的人類胚胎的神經管、胎生第9日前後的小鼠胚胎的神經管、人類、豬與囓齒類的成體的皮膚等(Betters et al.,Developmental biology,2010,344(2)：578-592、Jiang et al.,Development,2000,127(8)：1607-1616、Dupin et al.,Developmental biology,2012,366(1)：83-95、Nagoshi et al.,Cell Stem Cell 2,April 2008,392-403)。使用習知方法(例如，Motohashi et al.,Biology open,2016,5：311-322、Pfaltzgraffet al.,Journal of Visualized Experiments,2012,64：4134)採取的NCC，亦可供給於本步驟。

用於分化成為NCC的幹細胞，例如可列舉多潛能幹細胞(pluripotent stem cell)。本發明中可使用的「多潛能幹細胞(pluripotent stem cell)」係指可分化成為具有活體的各種不同形態或功能的組織或細胞，且具有亦可分化成為3胚葉(內胚葉、中胚葉、外胚葉)的任意系統的細胞的能力的幹細胞。其雖無特別限定，但例如可列舉胚性幹細胞(ESC)、源自經由核移植所獲得之純系胚胎的胚性幹細胞、精子幹細胞、胚性生殖細胞、人工多潛能幹細胞(本明細書中，亦稱為「iPSC」)等。再者，本發明中可使用的「多能幹細胞(multipotent stem cell)」係指具有可分化成為複數種的限定數的系統的細胞的能力的幹細胞。本發明中可使用的「多能幹細胞(multipotent stem cell)」，例如可列舉齒髓幹細胞、源自口腔黏膜的幹細胞、毛包幹細胞、源自培養纖維母細胞或骨髓幹細胞的體性幹細胞等。較佳的多潛能幹細胞(pluripotent stem cell)為ESC與iPSC。

「ESC」若為小鼠ESC，則可利用inGenious targeting laboratory公司、理研(理化學研究所)等所建立的各種小鼠ESC細胞株，若為人類ESC，則可利用威斯康辛大學、NIH、理研、京都大學、國立成育醫療研究中心與Cellartis公司等所建立的各種人類ESC細胞株。例如，就人類ESC細胞株而言，可利用 ESI Bio公司所分讓的CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等，WiCell Research所分讓的H1株、H9株等，理研所分讓的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。

「人工多潛能幹細胞」係指經由於哺乳動物體細胞或未分化幹細胞中導入特定因子(核初期化因子)並重編程所獲得的細胞。目前，有各種各樣的「人工多潛能幹細胞」，根據山中先生等人，經由於小鼠纖維母細胞中導入Oct3/4‧Sox2‧Klf4‧c-Myc的4因子所建立的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126：663-676)以外，亦可使用於人類纖維母細胞中導入同樣的4因子所建立的源自人類細胞的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131：861-872.)，上述4因子導入後以Nanog的表現作為指標進行選別所建立的Nanog-iPSC(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)，以不含c-Myc的方法所製作的iPSC(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)，以無病毒法導入6因子所建立的iPSC(Okita K et al.Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12,Okita K et al.Stem Cells.31(3)：458-66.)等。再者，亦可使用由Thomson等人所製作的導入OCT3/4‧SOX2‧NANOG‧LIN28的4因子所建立的人工多潛能幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318：1917-1920.)，由Daley等人所製作的人工多潛能幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451：141-146)、由櫻田等人所製作的人工多潛能幹細胞(日本特開2008-307007號)等。

此外，亦可使用已公開的所有文獻(例如，Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646- 650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)，或專利(例如，日本特開2008-307007號、日本特開2008-283972號、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)所記載的所屬技術領域習知的人工多潛能幹細胞之任一者。

就人工多潛能幹細胞株而言，可利用NIH、理研、京都大學等所建立的各種iPSC細胞株。例如，若為人類iPSC細胞株，則可列舉理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株等，京都大學的253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A1株、1231A3株等，較佳為1231A1株、1231A3株，更佳為1231A3株。

由幹細胞成為NCC的分化，可根據文獻習知(例如，非專利文獻2)的方法進行。由人類iPSC分化成為NCC的情況的步驟之一例示於第1圖。首先，將iPSC接種於培養皿等進行貼附培養後，以包含TGFβ抑制劑與GSK3β抑制劑的培養基進行貼附培養(第1圖，步驟i)，之後以進一步地加了RA及/或其衍生物的培養基進行貼附培養而使其分化成為NCC(步驟ii)。

本步驟之培養基中的GSK3β抑制劑的濃度，根據所添加的GSK3β抑制劑的種類而適當調整，例如為0.1至10μM，較佳為0.5至2μM。

幹細胞可因應於步驟ii中之RA等的在培養基中的濃度，而分化為頭部神經嵴細胞(Cranial NCC)、迷走神經嵴細胞(Vagal NCC)、體幹神經嵴細胞(Trunk NCC)、薦骨神經嵴細胞(Sacral NCC)之任一者。

例如，在由人類iPSC分化成為頭部神經嵴細胞的情況，不添加RA等。

在由人類iPSC分化成為迷走神經嵴細胞或體幹神經嵴細胞的情況之RA等的在培養基中的濃度，例如為0.001至50μM，較佳為0.1至10μM。

惟，RA等的在培養基中的濃度，係根據所添加的RA等的種類而適當調整者。

後段的步驟(B2)中，為了獲得具有會成為腸管神經細胞與膠細胞的高的分化能力之ENP，較佳係分化成為迷走神經嵴細胞(Vagal NCC)。

於包含TGFβ抑制劑與GSK3β抑制劑的培養基的培養期間(第1圖，步驟i)，例如可為0至12日，特別可為約6日。

於進一步地加了RA等的培養基的培養期間(步驟ii)，例如可為1至12日，特別可為約5日。

基礎培養基可使用上述者。

貼附培養，可使用上述的培養容器。

培養容器較佳係進行為了提升與細胞的貼附性(親水性)的表面處理，或以膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連結蛋白、纖連蛋白、基質膠、玻連蛋白等細胞接貼附用基質被覆。

培養溫度，雖無特別限定，但於30至40℃(例如，37℃)進行。再者，培養容器中的二氧化碳濃度例如約5%。

[第二實施態樣步驟(B2)：培養神經嵴細胞的步驟]

本步驟中，於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑、以及維生素A酸及/或其衍生物的培養基中培養NCC(第1圖，步驟iii)。此處所使用的NCC，較佳為迷走神經嵴細胞(Vagal NCC)。

所使用的ERBB3促效劑、ERBB4促效劑與RA等，以及此等之在培養基中的濃度，可為與步驟(A2)相同。

培養基，亦可進一步地包含TGFβ抑制劑及/或GSK3β抑制劑。

所使用的TGFβ抑制劑與GSK3β抑制劑、以及此等之在培養基中的濃度，可為與步驟(A2)相同。

培養基，亦可進一步地包含GDNF與基質膠之任一種以上。

GDNF與基質膠的在培養基中的濃度、以及所使用的基礎培養基，亦可為與步驟(A2)相同。

本步驟較佳係與步驟(A2)同樣地經由貼附培養，但亦可經由懸浮培養。

經由於包含ERBB3促效劑與ERBB4促效劑與RA等，較佳為進一步地包含TGFβ抑制劑、GSK3β抑制劑、GDNF與基質膠之任一種以上的培養基中培養ENP，可使ENP在維持有多能性(multipotency)的狀態增殖。

本步驟的培養期間，若為ENP增殖而達到目標細胞數的期間即可，雖無特別限定，但例如可為7日以上、10日以上、14日以上、20日以上、 25日以上、30日以上、40日以上、50日以上、60日以上、70日以上、80日以上、90日以上、7至100日、100日以上。

[第三實施態樣之擴大培養方法]

[第三實施態樣步驟(C1)：提供腸管神經前驅細胞的步驟]

本步驟中，提供ENP。

本步驟中所提供的ENP，可與步驟(A1)相同。

[第三實施態樣步驟(C2)：培養腸管神經前驅細胞的步驟]

所使用的ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑、以及此等之在培養基中的濃度，可與步驟(A2)相同。

培養基，亦可進一步地包含TGFβ抑制劑與GSK3β抑制劑。

所使用的TGFβ抑制劑與GSK3β抑制劑、以及此等之在培養基中的濃度，可與步驟(A2)相同。

培養基，亦可進一步地包含RA等、源自膠細胞的神經營養因子(GDNF)、與基質膠之任一種以上。

所使用的RA等、以及此等之添加濃度，可與步驟(A2)相同。

GDNF與基質膠的在培養基中的濃度、以及所使用的基礎培養基，亦可與步驟(A2)相同。

經由於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑以及RA等，較佳為進一步地包含TGFβ抑制劑、GSK3β抑制劑、GDNF與基質膠之任一種以上的培養基中培養ENP，可使ENP在維持有多能性(multipotency)的狀態培養，使其增殖。

[腸管神經前驅細胞培養基]

本發明亦提供上述ENP的製造方法或擴大培養方法中所使用的ENP培養基。培養基的較佳組成係如上述。ENP的製造，可包含由iPSC、ESC與NCC等幹細胞分化成為ENP。

本發明的一態樣中，腸管神經前驅細胞培養基係包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑。本發明的另外的態樣中，腸管神經前驅細胞培養基，除了ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑之外，亦可包含TGFβ抑制劑及/或GSK3β抑制劑，較佳包含TGFβ抑制劑與GSK3β抑制劑。本發明的另外的態樣中，腸管神經前驅細胞培養基，除了ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑之外，亦可包含GDNF。本發明的另外的態樣中，腸管神經前驅細胞培養基，除了ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑之外，亦可包含基質膠。本發明的另外的態樣中，腸管神經前驅細胞培養基，除了ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑之外，亦可包含GDNF與基質膠。本發明的另外的態樣中，腸管神經前驅細胞培養基，除了ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑之外，亦可包含TGFβ抑制劑、GSK3β抑制劑、GDNF與基質膠。此等腸管神經前驅細胞培養基亦可進一步地包含RA等。腸管神經前驅細胞培養基中的ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑、TGFβ抑制劑、GSK3β抑制劑、GDNF、基質膠與RA等的濃度各自可與步驟(A2)相同。

其它的一面向中，本發明亦提供包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的ENP培養基添加劑、與ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的用於ENP擴大培養的用途。

[腸管神經前驅細胞]

根據本發明之ENP的製造方法或擴大培養方法，可大量地獲得維持有成為腸管神經細胞與膠細胞的分化能力(多能性(multipotency))的ENP。

「維持有多能性(multipotency)的ENP」，可藉由複數方法評估。該方法雖無特別限定，但例如可列舉使評估對象之ENP分化成為腸管神經細胞與膠細胞的方法。若評估對象之ENP實際上可分化為腸管神經細胞與膠細胞，則可判斷評估對象之ENP為「維持有多能性(multipotency)的ENP」。

其他的方法，例如可列舉測定標記蛋白質或基因的表現的方法。評估對象之ENP中，若表現屬於轉錄因子之SOX10與PHOX2B，則可判斷評估對象之ENP為「維持有多能性(multipotency)的ENP」。

SOX10與PHOX2B的檢測，可利用使用對該標記蛋白質有特異性的抗體的免疫學分析，例如ELISA、免疫染色、流體細胞術等來進行。標記基因的檢測，可利用所屬技術領域中習知的核酸擴增方法及/或核酸檢測方法，例如RT-PCR、微陣列、生物晶片等來進行。再者，若為在SOX10與PHOX2B基因的下游經插入會編碼報導子蛋白質(例如，Nano-Lantern(Saito K.et al.,"Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging."Nat.Commun.,2012；3：1262.))的鹼基序列的細胞，且為於SOX10等的啟動子的調控下表現報導子蛋白質或其與SOX10等的融合蛋白質的細胞，則亦可使用檢測該報導子蛋白質(例如，測定螢光強度)的方法。

[細胞醫藥、凍結存株]

以本發明之製造方法或擴大培養方法所獲得之ENP，可應用作為起因於腸管神經細胞的缺損或異常的疾病的預防或治療用的細胞醫藥。如此疾病，例如可列舉赫氏(Hirschsprung)病、食道弛緩不能、胃運動功能不全、先天性肥厚性幽門狹窄症、慢性特發性偽性腸閉塞症、神經因性便秘或南美錐蟲病等。

細胞醫藥所含有的ENP，例如可為將培養中的細胞經剝離、回收而得的細胞，亦可為凍結保存液中經凍結的細胞。使用將擴大培養所獲得的同批細胞分成小份並凍結保存者時，由可安定且獲得同樣作用效果的觀點、操作性優異的觀點等而言為較佳。

細胞醫藥可因應用途或形態，依照常法，而含有藥學上容許的載體或添加物等其他成分。就載體或添加物而言，例如可列舉等張化劑、增黏劑、糖類、糖醇類、防腐劑(保存劑)、殺菌劑或抗菌劑、pH調節劑、安定化劑、螯合劑、油性基劑、凝膠基劑、界面活性劑、懸浮化劑、流動化劑、分散劑、緩衝劑、抗氧化劑等。

藉由細胞醫藥，包含對患者投予該細胞醫藥的治療有效量，提供上述疾病的治療方法。

治療有效量，係在對患者投予ENP的情況，與不投予的對照互相比較時，對於上述疾病可獲得治療效果的ENP的量。就具體的治療有效量而言，可根據ENP的投予形態、投予方法、使用目的與患者的年齡、體重、症狀等而適當設定。人類(例如成人)的每1次治療的有效量，例如為200,000至1,00,000,000個/kg體重。此等細胞可分散為單一細胞的狀態，亦可成為複數的細胞集合所成的細胞塊(sphere)，亦可為混合此等而成者。

就細胞醫藥的投予方法而言，例如可列舉腹腔內注射、皮下注射、淋巴節內注射、靜脈內注射、胸腔內注射、經由開腹而對消化器官局部(例如，食道、胃、十二指腸、小腸、空腸、迴腸、結腸、直腸)的直接注射、以及直腸腔內投予等。

本發明亦提供包含由上述的製造方法或擴大培養方法所獲得之ENP的凍結存株。

凍結存株可藉由將所獲得的ENP經由離心分離自培養基分離，懸浮於凍結保存液中並凍結而製造。凍結保存液，若使用以往細胞的凍結保存中所用的試劑即可。例如，Cryostem Freezing Medium(商品名)與Stemcell Banker GMP Grade(日本全藥工業股份有限公司)等已市售。

凍結存株可利用來作為用以使ENP分化而獲得腸管神經細胞與膠細胞的原始材料。再者，凍結存株，可利用於將ENP作為構成要素的組織模型的製作用。

[腸管神經前驅細胞成為腸管神經細胞或膠細胞的誘導]

所獲得的ENP與其經由文獻習知的手法分化所得的神經細胞與膠細胞，可有用於作為再生醫療用的細胞製劑，或者亦可適合地利用於各種篩選系統的構築。

ENP成為腸管神經細胞的誘導，例如可參照非專利文獻2。再者，ENP成為膠細胞的誘導，可應用以往習知的手法(例如"A novel bidirectional interaction between endothelin-3 and retinoic acid in rat enteric nervous system precursors",Gisser,J.M.et al.,PLosOne 2013)。

[腸管的類器官、人工腸管的製造方法]

本發明之腸管的類器官的製造方法，包含共培養ENP與後腸細胞的步驟。

ENP可為經由上述的ENP的製造方法或擴大培養方法所獲得者。

後腸細胞，可根據以往習知的手法而自幹細胞分化。例如，有經由將人類人工多潛能幹細胞以包含活化素(Activin)A、BMP4與bFGF的培養基培養，獲得胚體內胚葉，將胚體內胚葉以包含FGF4與GSK3β抑制劑的培養基培養而獲得後腸細胞的手法。

胚體內胚葉誘導時及後腸細胞誘導時的基礎培養基亦可使用上述之基礎培養基。

胚體內胚葉誘導時之活化素A的在培養基中的濃度，例如可為10至1000ng/mL，較佳為50至500ng/mL，更佳為約100ng/mL。再者，BMP4的在培養基中的濃度，例如可為1至100ng/mL，較佳為5至50ng/mL，更佳為約10ng/mL。bFGF的在培養基中的濃度，例如可為1至200ng/mL，較佳為5至100ng/mL，更佳為約20ng/mL。培養期間，例如可為1至10日，較佳為2至6日，更佳為約4日。

後腸細胞誘導時之FGF4的在培養基中的濃度，例如可為10至1000ng/mL，較佳為50至500ng/mL，更佳為約100ng/mL。關於GSK3β抑制劑的在培養基中的濃度，例如在使用CHIR99021的情況，例如可為1至30μM，較佳為4至10μM，更佳為約6μM。培養期間，例如可為4至12日，較佳為6至10日，更佳為約8日。

ENP與後腸細胞的共培養，可適當改變並應用以往習知的經由NCC與後腸細胞的共培養所進行的腸管的類器官的製造手法。

例如，有將已懸浮於基質膠溶液中之後腸細胞及ENP播種於培養盤並使其膠化，添加包含R-Spondin-1、Noggin、Wnt3a、EGF、前列腺素-E2與ROCK抑制劑的培養基並進行培養的手法。經由共培養所獲得的腸管的類器官，根據需要，亦可再懸浮於基質膠溶液並再應用同樣的手法而使其成熟化。

再者，例如，亦有將後腸細胞經懸浮於基質膠溶液後播種於培養盤並使其膠化，添加包含R-Spondin-1、Noggin、Wnt3a、EGF、前列腺素-E2與ROCK抑制劑的培養基並進行培養而獲得腸管的類器官後，將腸管的類器官暫時分散並與ENP的細胞懸浮液混合，將離心分離混合液所得的細胞小粒以包含R-Spondin-1、Noggin、Wnt3a、EGF、前列腺素-E2與ROCK抑制劑的培養基培養的手法。此情況中，經由共培養所獲得的腸管的類器官，亦可根據需要而使其成熟化。

ENP與後腸細胞的共培養時的基礎培養基亦可使用上述之基礎培養基。

R-Spondin-1的在培養基中的濃度，例如可為100至10,000ng/mL，較佳為500至5000ng/mL，更佳為約1000ng/mL。

Noggin的在培養基中的濃度，例如可為10至1000ng/mL，較佳為50至500ng/mL，更佳為約100ng/mL。

Wnt3a的在培養基中的濃度，例如可為10至1000ng/mL，較佳為50至500ng/mL，更佳為約100ng/mL。

EGF的在培養基中的濃度，例如可為10至1000ng/mL，較佳為50至500ng/mL，更佳為約100ng/mL。

前列腺素-E2的在培養基中的濃度，例如可為0.5至10μM，較佳為1至5μM，更佳為約2.5μM。

關於ROCK抑制劑，例如在使用Y27632的情況，可為1至100μM，較佳為5至50μM，更佳為約10μM。

培養期間，例如可為15至40日，較佳為20至30日，更佳為24至25日。

本發明之人工腸管的製造方法包含將上述所得的腸管的類器官移植至活體內而使其形成人工腸管的步驟。

對活體內的移植，雖無特別限定，但例如可經由使將腸管的類器官的分散液離心分離所得的細胞小粒貼附於適當的支架材料(scaffold)，並留置於腸管膜脂肪上而進行。支架材料，可利用各種市售者，例如可使用NEOVEIL Sheet(GUNZE)或聚-L-乳交酯(DURECT)。

就移植目標動物而言，可為小鼠、大鼠、兔、犬、豬、牛、馬及猴等非人類哺乳動物或人類動物，較佳為可選擇非人類哺乳動物。再者，較佳可使用免疫不全的動物。

移植後的腸管的類器官，於活體內分化、成熟、形成人工腸管。用於分化及成熟的必要期間，可能會根據移植的細胞數或使用的支架材料、移植目標動物及部位而不同，但例如為5週以上，較佳為10週以上，更佳為約13至20週。

所獲得的人工腸管，包含源自ENP的神經細胞與膠細胞，且可回應電刺激而顯示收縮鬆弛反應。

再者，該神經細胞具有於人工腸管內產生乙醯膽鹼與腎上腺素而使肌肉收縮且產生一氧化氮而使肌肉鬆弛、回應電刺激而使肌肉鬆弛的功能。

[實施例]

[試驗例1：人類iPSC的維持培養]

人類iPSC係使用1231A3株(參照Scientific Reports,2014,4,3594)。

iPSC的維持培養，使用被覆有iMattix 511 Silk(Nippi股份有限公司)的培養盤，不使用餵養細胞而進行。培養係於37℃、5%CO₂下進行。維持培養時的培養基係使用StemFit AK03N(味之素Health Supply股份有限公司)之A液、B液與C液經混合而成者。

每日進行培養基交換，繼代每隔6至7日進行。繼代係藉由使用已經利用添加有0.5mM EDTA的磷酸緩衝液(以下記載為「PBS」)而進行過2倍稀釋的TrypLE Select CTS(Life Technologies)將iPSC進行單細胞化而自培養盤剝離後，將經剝離的iPSC播種於經iMatrix 511 Silk被覆的新培養盤上而進行。播種時的培養基係使用添加有10μM的Y27632(富士軟片和光純藥股份有限公司)之StemFit AK03N的A液、B液與C液經混合而成者。

[試驗例2：SOX10：：tdTomato-PHOX2B：：emGFP報導子人類iPSC株的建立]

於經單細胞化之上述人類iPSC中，使用Neon Transfection system(Life Technologies)而共導入SpCas9 D10A切口酶(nickase)表現質體、SOX10 sgRNA 表現質體、SOX10-F2A-tdTomato供者質體、嘌呤黴素耐性基因表現質體(富士軟片和光純藥股份有限公司)。

將所得細胞在經由嘌呤黴素處理所進行的藥劑選拔後，挑取菌落，擴大培養。所得菌落中，經由PCR確認目的序列經插入者作為SOX10：：tdTomato株。

進一步地，於經單細胞化的人類iPSC(SOX10：：tdTomato株)中，使用Neon Transfection system(Life Technologies公司)而共導入SpCas9 D10A切口酶蛋白質、PHOX2B gRNA(IDT)、PHOX2B-F2A-emGFP供者質體、嘌呤黴素耐性基因表現質體(富士軟片和光純藥股份有限公司)。

所得細胞在經由嘌呤黴素處理所進行的藥劑選拔後，挑取菌落，擴大培養。所得菌落中，經由PCR確認目的序列經插入者作為SOX10：：tdTomato-PHOX2B：：emGFP株。

[試驗例3：由人類iPSC成為迷走神經嵴細胞的分化]

(1)iPSC的前培養

將以試驗例1記載的方法維持培養的人類iPSC(SOX10：：tdTomato-PHOX2B：：emGFP株)，於經iMatrix 511 Silk被覆的6孔培養盤或10cm培養皿各以2至4×10⁴或2.4至4.9×10⁵個/孔或培養皿的密度播種，於37℃、5%CO₂下培養3至4日(前培養)。播種時的培養液係使用添加有10μM的Y27632(富士軟片和光純藥股份有限公司)之StemFit AK03N的A液、B液與C液經混合而成者。

(2)由iPSC成為迷走神經嵴細胞的分化

前培養後，將培養基交換為包含10μM SB431542(富士軟片和光純藥股份有限公司)與1μM CHIR99021(Axon MedChem)的培養基(培養第0日)，於37℃、5 %CO₂下培養6日。之後，進一步地交換為包含1μM維生素A酸(富士軟片和光純藥股份有限公司)的培養基，於37℃、5%CO₂下培養5日(合計11日)。此時，作為上述培養基而使用StemFit AK03N之A液與B液經混合而成者。又，此等培養期間中，每日進行培養基交換。

培養第11日，獲得迷走神經嵴細胞。

再者，除了不添加維生素A酸以外，以相同條件進行iPSC的培養，誘導頭部神經嵴細胞。

為了調查迷走神經嵴細胞的分化標記的表現，回收培養第11日的細胞，使用RNeasy(Qiagen)而精製總RNA部分。使用Prime Script RT reagent kit(TAKARA Bio)而合成cDNA後，實施定量RT-PCR，測定屬於迷走神經嵴細胞標記之SOX10與內皮素受體類型B(EDNRB)以及會規定前後軸的位置資訊的HOX基因群中HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB7與HOXB9基因表現量。基因表現量，係以相對於內在性對照的GAPDH表現量而言之比之方式求得。

各基因的表現量示於第2圖。圖中，縱軸表示倍數變化(將在頭部神經嵴細胞中的表現量作為1所得的比以log2表示的值)。由表現SOX10、EDNRB、HOXB2、HOXB3、HOXB4、HOXB5與HOXB7，且不表現HOXB9，可確認成為迷走神經嵴細胞的分化。

[試驗例4：由迷走神經嵴細胞成為腸管神經前驅細胞的分化與擴大培養]

將以試驗例3的方法所獲得之培養第11日的細胞(迷走神經嵴細胞)，經由酵素處理而分散後回收。酵素處理係如以下的方式實施。

抽吸去除培養基並置換為PBS後，將細胞以細胞刮刀剝離。經剝離的細胞塊於Accutase(Innovative Cell Technologies)中經由移液(pipetting)而使其分散。之後，加入MACS Buffer(Miltenyi Biotec)，通過40μm的細胞濾器而進行單細胞化。所得細胞懸浮液係以300×g、離心3分鐘後去除上清，懸浮於腸管神經前驅細胞培養基。腸管神經前驅細胞培養基係使用：於StemFit AK03N之A液與B液經混合而成者中包含10μM SB431542(富士軟片和光純藥股份有限公司)、1μM CHIR99021(Axon MedChem)、1μM維生素A酸(富士軟片和光純藥股份有限公司)、100ng/mL神經調節蛋白(Neuregulin)1(NRG1)(Pepro Tech)與50mg/mL源自膠細胞的神經營養因子(GDNF)(富士軟片和光純藥股份有限公司)者。進行貼附培養的情況，於細胞懸浮液中以成為2%的方式添加基質膠(Corning)，並以多孔培養盤(Corning)培養。進行懸浮培養的情況，使用施有細胞低貼附處理的多孔培養盤(Corning)。培養之任一者皆於37℃、5%CO₂下實施。

貼附培養時的繼代方法示於下。

抽吸去除培養基並置換為PBS後，抽吸去除PBS，加入TrypLE Select CTS(Life Technologies)，於37℃靜置10分鐘。之後，抽吸去除TrypLE Select CTS，加入腸管神經前驅細胞培養基，經由移液而使細胞分散。

將分散後的細胞以2至10×10⁴個/cm²的密度播種。細胞播種後，以成為2%(w/v)的方式添加基質膠。

所得細胞於1至2週實施1次繼代。每次繼代係以自動細胞計數器來計數總細胞數、活細胞數與死細胞數。由繼代時播種的活細胞數與下次繼代時所得活細胞數來算出總細胞數(accumulated cell number)。

總細胞數(accumulated cell number)的經時變化示於第3圖。細胞至少可進行7次繼代，顯示為線性的細胞增殖。

[試驗例5：腸管神經前驅細胞的流體細胞術解析]

將試驗例4所培養的細胞中的SOX10-tdTomato與PHOX2B-emGFP的表現，使用流體細胞術，在每次的繼代進行解析。

繼代時將所得細胞分散液於300×g、離心3分鐘，去除上清後，將細胞懸浮於包含DAPI與1%牛血清白蛋白的HBSS，並供給於經由FACS Aria Fusion(日本Becton,Dickinson)而進行的解析。

SOX10-tdTomato與PHOX2B-emGFP的表現解析結果示於第4圖。圖中，P1至P6意指繼代次數(1至6次)。每次經過繼代，共表現SOX1-tdTomato與PHOX2B-emGFP的腸管神經前驅細胞的佔有比例上升。5次繼代以後之腸管神經前驅細胞的佔有比例成為80%以上。

[試驗例6：關於腸管神經前驅細胞培養基的組成的檢討]

除了於腸管神經前驅細胞培養基中不添加NRG1及/或GDNF以外，其餘以與試驗例4相同條件於腸管神經前驅細胞培養基培養迷走神經嵴細胞，以螢光顯微鏡(BZ-X700，Keyence)觀察。再者，以與試驗例5同樣的方法實施流體細胞術解析。

細胞的螢光圖像與SOX10-tdTomato及PHOX2B-emGFP的表現解析結果示於第5圖。不包含NRG1的條件中，細胞增殖非常緩慢，無法獲得用以實施流體細胞術所需的細胞數。不包含GDNF的條件中，雖然獲得共表現SOX10-tdTomato與PHOX2B-emGFP的腸管神經前驅細胞，但與包含GDNF的條件相比，細胞的增殖緩慢。

[試驗例7：腸管神經前驅細胞的基因表現解析]

由試驗例4中之繼代時所得的細胞萃取出總RNA，確認屬於腸管神經前驅細胞的標記之SOX10、PHOX2B、HOXB5、EDNRB與ret原致癌基因(RET)的基因表現。基因表現解析係與前述方法同樣地實施。

結果示於第6圖。圖中，縱軸表示表現程度(相對於內在性對照的GAPDH表現量而言的比)或倍數變化(將在iPSC中的表現量作為1時所得的比以log2表示的值)。以腸管神經前驅細胞培養基培養的細胞，即使經過繼代也表現SOX10、PHOX2B、HOXB5、EDNRB與RET。

[試驗例8：腸管神經前驅細胞成為腸管神經系的分化]

將與試驗例4同樣的方式所獲得的腸管神經前驅細胞以腸管神經分化用培養基培養，進行成為腸管神經的分化。腸管神經分化用培養基係使用：於Neurobasal Medium(Life Technologies)中添加有B27(Life Technologies)、N2 Supplement(富士軟片和光純藥股份有限公司)、L-麩醯胺(富士軟片和光純藥股份有限公司)、青黴素/鏈黴素(Life Technologies)、100μM抗壞血酸(富士軟片和光純藥股份有限公司)與25ng/mL GDNF者。

於培養第40日添加4%PFA並於室溫進行固定，供給至用於評估成為各種的腸管神經亞型的分化能力的螢光免疫染色。依序與作為1次抗體的抗膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)抗體(ab224267，Abcam)、抗神經型一氧化氮合成酶(nNOS)抗體(ab76067，Abcam)、抗γ-胺基丁酸(GABA)抗體(A2052，Sigma)或抗5-羥基色胺(5-HT)抗體(S5545，Sigma)反應，進一步地與作為2次抗體之與1次抗體的免疫動物匹配的Alexa647標識2次抗體反應後，以螢光顯微鏡觀察。

螢光免疫染色圖像示於第7圖。確認ChAT、nNOS、GABA與5-HT陽性的神經，顯示分別屬於膽鹼性神經元、抑制性神經元、GABA性神經元與血清素性神經元。由此，顯示以本培養方法所得的腸管神經前驅細胞係保持有成為各種的腸管神經亞型的分化能力。

[試驗例9：人類iPSC的維持培養]

人類iPSC係使用253G1株(參照Nature Biotechnology,2008,26,(1)：101-106)。

iPSC的維持培養，係使用被覆有玻連蛋白(TN-N)截短型重組人類蛋白質(Thermo Fisher公司製)的培養盤，不使用餵養細胞而進行。培養係於37℃、5% CO₂下進行。

維持培養時的培養基係使用Essential 8 Flex Medium Kit(Thermo Fisher)的Basal Medium與Supplement經混合而成者。每日進行培養基交換，繼代每隔6至7日進行。

繼代係藉由使用添加有0.5mM EDTA的PBS將iPSC單細胞化並由培養盤剝離後，將經剝離的iPSC播種於被覆有玻連蛋白(TN-N)截短型重組人類蛋白質的新培養盤上而進行。

播種時的培養基係於Essential 8 Flex Medium kit之Basal Medium與Supplement經混合而成者中添加10μM Y27632(富士軟片和光純藥股份有限公司)並使用。

[試驗例10：LGR5：：emGFP報導子人類iPSC株的建立]

試驗例9的人類iPSC經單細胞化後，使用NEPA21(NEPA GENE)而共導入SpCas9表現質體、LGR5 sgRNA表現質體、LGR5：：emGFP供者質體(於LGR5的N末端可敲入「嵌合內含子+emGFP+SV40polyA」構築體)。

將所得細胞在經由嘌呤黴素處理所進行的藥劑選拔後，挑取菌落，擴大培養。所得菌落中，將經由PCR確認了目的序列插入為單一對偶性者作為LGR5：：emGFP株。

[試驗例11：由人類iPSC成為腸管的類器官的分化]

(1)iPSC的前培養

將試驗例10的LGR5：：emGFP株於被覆有基質膠(Corning)的12孔培養盤中分別以4×10⁵個/孔的密度播種，於37℃、5%CO₂下培養2日(前培養)。播種時的培養液，係於Essential 8 Flex Medium Kit之Basal Medium與Supplement經混合而成者中添加10μM Y27632並使用。

(2)由人類iPSC成為胚體內胚葉的分化

前培養後，將培養基交換為包含100ng/mL活化素A(PeproTech)、10ng/mL BMP4(R&D Systems)、20ng/mL bFGF(富士軟片和光純藥股份有限公司)的培養基(培養第0日)，於37℃、5%CO₂下培養4日。作為上述培養基而使用已於RPMI 1640(Thermo Fisher)中混合有B-27 Supplement去胰島素(Thermo Fisher)與青黴素-鏈黴素(Thermo Fisher)者。培養期間中，每日進行培養基交換。

為了確認成為胚胎內胚葉的分化，回收培養4日後的細胞，經由定量RT-PCR確認到表現屬於胚胎內胚葉標記之SOX17與FOXA2。

(3)由胚體內胚葉成為後腸的分化

胚體內胚葉分化後，將培養基交換為包含100ng/mL FGF4(PeproTech)與6μM CHIR99021(Axon MedChem)的培養基(培養第4日)，於37℃、5%CO₂下培養4日(合計8日)。上述培養基係使用：於RPMI 1640(Thermo Fisher)中混合有B-27 Supplement去除維生素A(Thermo Fisher)與青黴素-鏈黴素(Thermo Fisher)者。培養第4日係交換培養基的全量。培養第5日至第7日係交換培養基的半量。為了確認成為後腸的分化，回收培養8日後的細胞，經由定量RT-PCR確認到表現屬於後腸標記之CDX2。

(4)腸管的類器官的分化1

將於孔內所形成的後腸細胞塊與培養上清一起回收。於包含後腸細胞塊的溶液中，添加試驗例4所製作的包含腸管神經前驅細胞的細胞懸浮液，離心後去除培養上清。將已再懸浮於基質膠溶液的後腸細胞塊與腸管神經前驅細胞，以50μL/孔播種於24孔培養盤上，於37℃、5%CO₂下培養30分鐘並使基質膠進行膠化。於經膠化的基質膠上添加包含1000ng/mL R-Spondin-1(富士軟片和光純藥股份有限公司)、100ng/mL Noggin(PeproTech)、100ng/mL Wnt3a(R&D Systems)、100ng/mL EGF、2.5μM前列腺素-E2的培養基，於37℃、5%CO₂下培養。上述培養基係使用：於Advanced DMEM/F-12(Thermo Fisher)中混合有B-27 Supplement去除維生素A(Thermo Fisher)、N-2 Supplement(Thermo Fisher)、10μM Y27632、10mM HEPES(Thermo Fisher)、青黴素-鏈黴素(Thermo Fisher)者。

培養約2週後，於包含由後腸細胞塊與腸管神經前驅細胞所分化的腸管的類器官的基質膠中添加4℃的D-PBS(-)(富士軟片和光純藥股份有限公司)，使基質膠溶解。離心而去除培養上清。將已再懸浮於基質膠溶液的腸管的類器官，以50μL/孔播種於24孔培養盤上，於37℃、5%CO₂下培養30分鐘並使基質膠進行膠化。於經膠化的基質膠上添加包含1000ng/mL R-Spondin-1、100ng/mL Noggin、100ng/mL Wnt3a、100ng/mLEGF、2.5μM前列腺素-E2、Y27632的培養基，於37℃、5%CO₂下培養(腸管的類器官培養期間合計24至25日)。

(5)腸管的類器官的分化2

將於孔內所形成的後腸細胞塊與培養上清一起回收。離心而去除培養上清。將已再懸浮於基質膠溶液的細胞塊，以50μL/孔播種於24孔培養盤上，於37℃、5%CO₂下培養30分鐘並使基質膠進行膠化。於經膠化的基質膠上添加包含1000ng/mL R-Sponding-1、100ng/mL Noggin、100ng/mL Wnt3a、100ng/mL EGF、2.5μM前列腺素-E2的培養基，於37℃、5%CO₂下培養。上述培養基係使用：於Advanced DMEM/F-12(Thermo Fisher)中混合有B-27 Supplement去除維生素A(Thermo Fisher)、N-2 Supplement(Thermo Fisher)、10μM Y27632、10mM HEPES(Thermo Fisher)、青黴素-鏈黴素(Thermo Fisher)者。

培養約2週後，於包含由後腸細胞塊分化的腸管的類器官的基質膠中添加4℃的D-PBS(-)，使基質膠溶解。於包含腸管的類器官的溶液中，添加試驗例4所製作的包含腸管神經前驅細胞的細胞懸浮液，離心而去除培養上清。於上清除去後的細胞小粒中，添加包含1000ng/mL R-Spondin-1、100ng/mL Noggin、100ng/mL Wnt3a、100ng/mL EGF、2.5μM前列腺素-E2、10μM Y27632的培養基，於37℃、5%CO₂下培養2日。培養後將已再懸浮於基質膠溶液的腸管的類器官，以50μL/孔添加於24孔培養盤上，於37℃、5%CO₂下培養30分鐘並使基質膠進行膠化。於經膠化的基質膠上添加包含1000ng/mL R-Spondin-1、100ng/mL Noggin、100ng/mL Wnt3a、100ng/mL EGF、2.5μM前列腺素-E2、Y27632的培養基，於37℃、5%CO₂下培養(腸管的類器官培養期間合計24至25日)。

[試驗例12：由腸管的類器官的人工腸管的活體內形成]

(1)腸管的類器官之對小鼠的移植

將試驗例11所得之包含腸管的類器官的基質膠，添加4℃的D-PBS(-)而使其溶解。將包含腸管的類器官的溶液離心而去除培養上清。於上清去除後的細胞小粒中添加膠原蛋白I(Corning)。於使用NEOVEIL Sheet(GUNZE)與聚-L-乳交酯(DURECT)所製作的支架，添加包含細胞小粒與膠原蛋白I的溶液，使細胞小粒貼附於支架。

6週齡的免疫不全小鼠(雄性NOG小鼠，實驗動物中央研究所)在經由異氟醚所進行之麻醉下開腹。將細胞小粒經貼附的支架留置於腸管膜脂肪上，縫合。移植後飼育小鼠13週。

(2)經移植的腸管的類器官的採取

將小鼠在經由異氟醚所進行之麻醉下開腹。由腸管膜脂肪分離而採取已於腸管膜脂肪上形成的人工腸管。

(3)人工腸管的組織學解析

將所採取的人工腸管經由4%多聚甲醛/磷酸緩衝液(富士軟片和光純藥股份有限公司)而固定，供給於螢光免疫染色。依序與作為1次抗體的抗TUBB3抗體(Abcam)、抗S100β抗體(Abcam)、抗GFAP抗體(Abcam)反應，進一步地與作為2次抗體之與1次抗體的免疫動物匹配的螢光標識2次抗體反應後，以螢光顯微鏡觀察。

螢光免疫染色圖像示於第8圖及第9圖。如第8圖所示，存在PHOX2B-emGFP與SOX10-tdTomato為陽性之源自腸管神經前驅細胞的細胞(神經細胞與膠細胞)。再者，如第9圖所示，可看到與PHOX2B-emGFP或SOX10-tdTomato 陽性圖像一致或接近的S100β(A)、GFAP(B)或TUBB3(C)的陽性圖像，而確認源自腸管神經前驅細胞的細胞係分化為神經細胞與膠細胞。實施例4所獲得之腸管神經前驅細胞，顯示具有分化為腸管神經細胞並構成人工腸管的能力。

(4)人工腸管的運動功能解析

將所採取的人工腸管切成長條狀的組織片，於器官浴分析裝置(Panlab)的腔室內吊起其一端。另一端連接至壓力轉換器(Bio Research Center公司製)，以可定量偵測組織片的收縮鬆弛反應的方式進行。腔室內填充克氏(Krebs)溶液(NaCl：120.7mM、KCl：5.9mM、NaHCO₃：15.5mM、NaH₂PO₄：1.2mM、MgCl₂：1.2mM、CaCl₂：2.5mM、Glucose：11.5mM)，於溶液中暴露於95%O₂。電刺激於腔室內的組織片，計測收縮鬆弛反應。

結果示於第10圖至第12圖。回應電刺激，確認有收縮鬆弛反應(參照第10圖)。經由添加屬於蕈毒鹼性乙醯膽鹼受體抑制劑之阿托品硫酸鹽單水合物(富士軟片和光純藥股份有限公司)1μM、屬於α腎上腺素作動性效果阻斷劑之苯氧基苯甲胺鹽酸鹽(東京化成工業股份有限公司)10μM、或屬於β腎上腺素受體效果阻斷劑之普奈洛爾(Propranolol)鹽酸鹽(富士軟片和光純藥股份有限公司)10μM，而部分解除收縮應答(參照第11圖)。由此表示，實施例4所獲得的腸管神經前驅細胞係形成有會於人工腸管內產生乙醯膽鹼與腎上腺素而使肌肉收縮之神經。

另一方面，依賴於電刺激的鬆弛反應殘存。經由添加屬於一氧化氮合成酵素的抑制劑之NG-硝基-L-精胺酸甲基酯鹽酸鹽，鬆弛應答消失(參照第11圖)。由此表示，實施例4所獲得的腸管神經前驅細胞係形成有會於人工腸管內產生一氧化氮而使肌肉鬆弛之神經。

進一步地，經由1μM阿托品硫酸鹽單水合物、10μM苯氧基苯甲胺鹽酸鹽或10μM普奈洛爾鹽酸鹽的添加所造成的收縮應答的解除，係藉由3μM河純毒素(富士軟片和光純藥股份有限公司)添加而消失。由此亦表示，腸管神經前驅細胞所分化的神經細胞，係具有回應電刺激而使肌肉鬆弛的功能。

[試驗例13：經擴大培養的腸管神經前驅細胞的凍結存株製作，與該凍結存株融解後的特性評估]

使用與試驗例4同樣方式所獲得的腸管神經前驅細胞來製作凍結存株。再者，進行凍結存株融解後的腸管神經前驅細胞的增殖能力與分化能力的確認。

將分化第76日的腸管神經前驅細胞的細胞分散液於300×g，離心3分鐘，去除上清後，於Stemcell Banker GMP Grade(日本全藥工業股份有限公司)以20萬個/200μL的濃度懸浮細胞，於-80℃凍結保存。

將凍結存株於37℃融解。於腸管神經前驅細胞培養基懸浮細胞後，於300×g，離心3分鐘，去除上清後，再懸浮於腸管神經前驅細胞培養基。以試驗例4記載的方法進行培養。再者，以試驗例4及5記載的方法實施繼代及流體細胞術解析。進一步地，根據試驗例8及14記載的方法確認成為腸管神經細胞及膠細胞的分化能力。

結果示於第13圖。(A)顯示擴大培養時的細胞數的經時變化，以及擴大培養時於全細胞中佔有的腸管神經前驅細胞的比例的經時變化。(B)顯示腸管神經前驅細胞(ENP)與由其所分化的腸管神經細胞(ENS)中之PHOX2B與SOX10的表現經由流體細胞術解析的結果。(C)顯示由腸管神經前驅細胞所分化的腸管神經細胞與膠細胞的螢光免疫染色圖像。確認了凍結融解後的腸管神經前驅細胞維持優異的增殖能力。再者，確認了凍結融解後的腸管神經前驅細胞保持有成為腸管神經細胞(PHOX2B與外周蛋白陽性而SOX10陰性)與膠細胞(GFAP陽性)的分化能力。腸管神經細胞中，亦包含表現nNOS(神經型一氧化氮合成酶)、TH(酪胺酸羥化酶)、ChAT(膽鹼乙醯轉移酶)、GABA(γ胺基丁酸)或SST(體抑素)之各種的亞型。

[試驗例14：腸管神經前驅細胞成為膠細胞的分化]

使用與試驗例4同樣方式所獲得的腸管神經前驅細胞，進行成為膠細胞的分化。

膠細胞分化用培養基係使用：於Astrocyte maturation kit(Stem Cell Technologies)中添加有青黴素-鏈黴素(Life Technologies)者。

將培養第46日的細胞經由多聚甲醛/磷酸緩衝液而固定，供給至螢光免疫染色。依序與作為1次抗體的抗GFAP抗體(CST#3670，Cell Signaling)反應，進一步地與作為2次抗體之與1次抗體的免疫動物匹配的螢光標識2次抗體反應後，以螢光顯微鏡觀察。

螢光免疫染色圖像示於第14圖。確認GFAP陽性膠細胞。因此，顯示以本培養方法所獲得的腸管神經前驅細胞保持成為膠細胞的分化能力。

[試驗例15：腸管神經前驅細胞的在免疫不全小鼠腸管之存活性確認]

使用與試驗例4同樣方式所獲得的腸管神經前驅細胞，進行在免疫不全小鼠腸管之存活性確認。

(1)移植用腸管神經前驅細胞的細胞塊的調製

將腸管神經前驅細胞懸浮於腸管神經前驅細胞培養基，於球體培養盤(RB500 400 NA 24，Kuraray)以320,000個/孔播種，培養3日而構築細胞塊(sphere)。

(2)腸管神經前驅細胞之對小鼠的移植

回收所獲得的細胞塊(sphere)，於麻醉下使用注射針(口徑30 gauge)以580 sphere/部位/隻移植至經開腹的免疫不全小鼠(NOD.CB17-Prkdc<scid>/J，雄性，6週齡，日本Charles River股份有限公司)的盲腸壁。移植時的媒劑使用基質膠與腸管神經前驅細胞培養基以1：1(v/v)混合而成者。1週後，使動物安樂死，採取移植部位周圍，以4%多聚甲醛/磷酸緩衝液固定。

(3)移植後樣本的組織學解析

將經固定的樣本供給至螢光免疫染色。依序與作為1次抗體的抗TUBB3抗體(Abcam)反應，進一步地與作為2次抗體之與1次抗體的免疫動物匹配的螢光標識2次抗體反應後，以螢光顯微鏡觀察。

螢光免疫染色圖像示於第15圖。於由小鼠腸管的黏膜下層至相當於肌肉層的部位中存在PHOX2B-emGFP與SOX10-tdTomato為陽性的源自腸管神經前驅細胞的細胞(咸信其正分化為神經細胞與膠細胞的細胞)(a及b)，確認了腸管神經前驅細胞於小鼠腸管的存活。再者，可看到與PHOX2B-emGFP或SOX10-tdTomato陽性圖像一致或接近的TUBB3陽性圖像(c)，而確認源自腸管神經前驅細胞的細胞正分化為神經細胞。

[序列表]

序列編號1：人類NRG1的全長胺基酸序列

<110> 國立大學法人京都大學日商武田藥品工業股份有限公司

<120> 腸管神經前驅細胞的製造方法

<130> PT38-5033TW

<150> JP2018-155395

<151> 2018-08-22

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 645

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Claims

一種腸管神經前驅細胞的製造方法，包含下列步驟：

(A1)提供腸管神經前驅細胞的步驟；以及

(A2)於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的培養基中培養腸管神經前驅細胞的步驟。
如申請專利範圍第1項所述之製造方法，其中，該培養基更包含TGFβ抑制劑與GSK3β抑制劑。
如申請專利範圍第1或2項所述之製造方法，其中，該培養基更包含維生素A酸及/或其衍生物。
如申請專利範圍第1至3項中任一項所述之製造方法，其中，該培養基更包含GDNF。
如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之製造方法，其中，該培養基更包含基質膠。
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之製造方法，其中，該ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑為NRG1。
一種腸管神經前驅細胞，係由申請專利範圍第1至6項中任一項所述之製造方法所獲得者。
一種凍結存株，係包含申請專利範圍第7項所述之腸管神經前驅細胞。
一種細胞醫藥，係包含申請專利範圍第7項所述之腸管神經前驅細胞。
一種腸管神經前驅細胞的製造方法，包含下列步驟：

(B1)提供神經嵴細胞的步驟；以及

(B2)於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑、以及維生素A酸及/或其衍生物的培養基中培養神經嵴細胞的步驟。
如申請專利範圍第10項所述之製造方法，其中，該神經嵴細胞為迷走神經嵴細胞。
如申請專利範圍第11項所述之製造方法，其中，該迷走神經嵴細胞為SOX10陽性、HOXB5陽性、HOXB9陰性且PHOX2B陰性，該腸管神經前驅細胞為SOX10陽性且PHOX2B陽性。
一種腸管神經前驅細胞培養基，包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑。
如申請專利範圍第13項所述之腸管神經前驅細胞培養基，其更包含TGFβ抑制劑及/或GSK3β抑制劑。
如申請專利範圍第13或14項所述之腸管神經前驅細胞培養基，其更包含維生素A酸及/或其衍生物。
如申請專利範圍第13至15項中任一項所述之腸管神經前驅細胞培養基，其更包含GDNF。
如申請專利範圍第13至16項中任一項所述之腸管神經前驅細胞培養基，其更包含基質膠。
如申請專利範圍第13至17項中任一項所述之腸管神經前驅細胞培養基，其中，該ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑為NRG1。
一種腸管神經前驅細胞的擴大培養方法，包含下列步驟：

(C1)提供腸管神經前驅細胞的步驟；以及

(C2)於包含ERBB3促效劑及/或ERBB4促效劑的培養基中培養腸管神經前驅細胞的步驟。
一種腸管的類器官的製造方法，包含共培養腸管神經前驅細胞與後腸細胞的步驟。
一種人工腸管的製造方法，包含藉由共培養腸管神經前驅細胞與後腸細胞而獲得腸管的類器官的步驟；以及

將前述腸管的類器官移植至活體內並使人工腸管形成的步驟。
如申請專利範圍第20或21項所述之製造方法，其中，該腸管神經前驅細胞係藉由申請專利範圍第1至6項中任一項所述之製造方法所獲得之腸管神經前驅細胞。