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KR102368751B1 - 모양체 주연부 간세포의 제조 방법 - Google Patents

모양체 주연부 간세포의 제조 방법 Download PDF

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KR102368751B1
KR102368751B1 KR1020167022311A KR20167022311A KR102368751B1 KR 102368751 B1 KR102368751 B1 KR 102368751B1 KR 1020167022311 A KR1020167022311 A KR 1020167022311A KR 20167022311 A KR20167022311 A KR 20167022311A KR 102368751 B1 KR102368751 B1 KR 102368751B1
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아츠시 구와하라
요시키 사사이
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스미또모 가가꾸 가부시끼가이샤
고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소
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Abstract

본 발명은, 이하의 공정 (1) 혹은 공정 (2)의 어느 하나 또는 이들 모두의 공정을 포함하는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 간세포의 제조 방법을 제공한다: (1) 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포를 부유 배양해, 레티노스피어를 얻는 공정；및 (2) 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포로부터 단계 특이적 배성 항원-1 양성 세포를 분취하는 공정. 본 발명에 의해, 망막층 특이적 신경세포를 포함하는 망막 세포로의 분화능 및 자기 복제능을 갖는 모양체 주연부 간세포를 고순도로 효율적으로 제조하는 것이 가능해진다.

Description

모양체 주연부 간세포의 제조 방법{METHOD FOR MANUFACTURING CILIARY MARGIN STEM CELLS}
본 발명은, 모양체 주연부 간세포의 제조 방법 등에 관한 것이다.
망막 세포로의 분화능 및 자기 복제능을 갖는 조직 간세포는, 세포 이식 치료나 창약 스크리닝 등에 대한 응용이 기대되고 있다.
생체 망막의 모양체 주연부(Ciliary Marginal Zone, CMZ)는 망막 조직의 구조 형성이나 유지에 중요한 기능을 하고 있음이 알려져 있다(예를 들어, 비특허문헌 1 참조). 모양체 주연부에는, 광수용체 등의 망막 세포로의 분화능을 가지는, 망막의 조직 간세포(망막 간세포)가 존재한다(예를 들어, 비특허문헌 2 참조). 모양체 주연부의 유전자 마커로서 예를 들어 Rdh10 유전자(비특허문헌 3) 및 Otx1 유전자(비특허문헌 1)가 알려져 있다.
다능성 간세포를 부유 배양함으로써 형성될 수 있는 망막 조직을 포함하는 세포 응집체를, 더욱 특정의 조건으로 배양 하면, 모양체 주연부 유사 구조체 (ciliary marginal zone-like structure)를 포함하는 세포 응집체가 얻어진다(예를 들어, 특허문헌 1 참조). 이러한 "모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"에 있어서, 모양체 주연부 유사 구조체는 진행영역 (Progress zone)으로서 기능하고, 당해 모양체 주연부 유사 구조체에 근접하여, 층 구조를 가진 연속한 신경 망막이 고빈도로 형성될 수 있다. "진행영역"이란, 조직의 일부분에 국한해 존재하는 미분화 세포의 집합체이며, 발생이나 재생의 과정에 있어서 지속적으로 증식해 조직 전체의 성장에 기여하는 성질, 및 또는, 증식 인자등을 분비 함으로써 주변 조직의 성장에 기여하는 성질을 가지는 세포의 집합체이다.
선행 기술 문헌
특허문헌
특허문헌 1 : WO 2013/183774 A1
비특허문헌
비특허문헌 1 : DEVELOPMENTAL DYNAMICS, Volume:239, 페이지 2066-2077 (2010)
비특허문헌 2 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Volume:101, 페이지 15772-15777 (2004)
비특허문헌 3 : Development, Volume:136, 페이지 1823-1833 (2009)
망막 세포로의 분화능 및 자기 복제능을 갖는 조직 간세포를 고순도로 효율적으로 제조하기 위한 방법의 개발이 요망되고 있었다.
본 발명은, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체에 존재하고, 광수용체 등의 망막 세포로의 분화능 및 자기 복제능을 갖는 세포(이하, 모양체 주연부 간세포 또는 CMZ 간세포라고 기재하기도 함)를 제조하는 방법 등을 제공한다.
[1] 이하의 공정 (1) 혹은 공정 (2)의 어느 하나 또는 이들 양 공정을 포함하는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 간세포의 제조 방법(이하, 본 발명 간세포 제조 방법 1으로 기재하기도 함) ：
(1) 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포를 부유 배양해, 레티노스피어 (retinosphere)를 얻는 공정; 및
(2) 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포로부터 단계 특이적 배성 항원-1(이하, SSEA-1으로 기재하기도 함) 양성 세포를 분취하는 공정;
[2] 상기 공정 (1)을 실시하는 상기 [1]에 기재된 방법으로, "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포임 (이하, 본 발명 간세포 제조 방법 2로 기재하기도 함) ;
[3] 상기 공정 (2)를 실시하는 상기 [1]에 기재된 방법으로, "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포임(이하, 본 발명 간세포 제조 방법 3으로 기재하기도 함) ;
[4] 상기 공정 (1)에 계속해서 상기 공정 (2)를 실시하는 상기 [1]에 기재된 방법으로, 공정 (1)에 있어서의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포이며, 공정 (2)에 있어서의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"는, 상기 공정 (1)로 얻어진 레티노스피어를 분산시켜 얻어진 세포임(이하, 본 발명 간세포 제조 방법 4로 기재하기도 함) ;
[5] 상기 공정 (2)에 계속해서 상기 공정 (1)을 실시하는 상기 [1]에 기재된 방법으로, 공정 (2)에 있어서의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포이며, 공정 (1)에 있어서의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"는, 상기 공정 (2)로 분취된 세포를 분산시켜 얻어진 세포임(이하, 본 발명 간세포 제조 방법 5로 기재하기도 함) ;
[6] SSEA-1 양성 세포가, 추가로 Rax 양성인, 상기 [1], [3], [4] 및 [5] 중 어느 한 항에 기재된 방법;
[7] SSEA-1 양성 세포가, 색소 침착이 없는(non-pigmented) 세포인, 상기 [1], [3], [4], [5] 및 [6] 중 어느 한 항에 기재된 방법;
[8] 공정 (1)에 있어서의 부유 배양이, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질 및 EGF 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 각각 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 행해지는, 상기 [1], [2], [4] 및 [5] 중 어느 한 항에 기재된 방법;
[9] 상기 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지가 ROCK 저해제를 추가로 포함하는, 상기 [8]에 기재된 방법;
[10] 레티노스피어가, 색소 침착이 없는(non-pigmented) 레티노스피어인, 상기 [1], [2], [4], [5], [8] 및 [9] 중 어느 한 항에 기재된 방법;
[11] 상기 다능성 간세포가 영장류 다능성 간세포인, 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 한 항에 기재된 방법;
[12] 상기 다능성 간세포가 인간 다능성 간세포인, 상기 [1] 내지 [11] 중 어느 한 항에 기재된 방법;
[13] 상기 [1] 내지 [12] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 모양체 주연부 간세포를, Notch 시그널 저해 물질, 레티노이드 및 타우린으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질의 존재하에 배양하는 공정을 포함하는, 망막층 특이적 신경세포의 제조 방법;
[14] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포를 함유하여 이루어지는, 망막 조직의 장해에 따른 질환의 치료제;
[15] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포의 유효량을 이식을 필요로하는 대상에게 이식하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장해에 따른 질환의 치료 방법;
[16] 망막 조직의 장해에 따른 질환의 치료에 있어서의 사용을 위한 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포;
[17] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포를 포함하여 이루어지는, 독성 또는 약효 평가용 시약; 및
[18] 상기 [1] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포에 시험 물질을 접촉시켜, 그 물질의 그 세포에 대한 영향을 어세이하는 것을 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 약효 평가 방법.
본 발명에 의하면, 망막층 특이적 신경세포를 포함하는 망막 세포로의 분화능 및 자기 복제능을 갖는 모양체 주연부 간세포를 고순도로 효율적으로 제조하는 것이 가능해진다.
[도 1] 도 1은, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체(부유 배양 개시 후 35일째)의 위상차 상(A) 및 GFP 형광상(B)(Rax)이다.
[도 2] 도 2는, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체(부유 배양 개시 후 60일째)의 위상차 상(A) 및 GFP 형광상(B)(Rax)이다.
[도 3] 도 3은, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체(부유 배양 개시 후 63일째)의 동결 절편의 염색상이다. "A"가 Chx10 양성 세포의 면역 염색상, "B"가 Otx1 양성 세포의 면역 염색상, "C"가 Rdh10 양성 세포의 면역 염색상, "D"가 Crx 양성 세포의 면역 염색상, "E"가 TuJ1 양성 세포의 면역 염색상, "F"가 SSEA-1 양성 세포의 면역 염색상이다.
[도 4] 도 4는, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체(부유 배양 개시 후 90일째)로부터 분리된 신경 망막부 또는 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포의 형광 현미경상이다. "A"(Rax)가 신경 망막부(NR)의 GFP 형광상, "B"(SSEA1)가 신경 망막부(NR)의 항SSEA-1 항체를 사용한 형광 면역 염색상, "C"(Rax)가 모양체 주연부 유사 구조체(CMZ)의 GFP 형광상, "D"(SSEA1)가 모양체 주연부 유사 구조체(CMZ)의 항SSEA-1 항체를 사용한 형광 면역 염색상이다.
[도 5] 도 5는, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체(부유 배양 개시 후 90일째)로부터 분리된 망막 색소 표피 및 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포의 형광 현미경상이다. "A"(SSEA1)가 항SSEA-1 항체를 사용한 형광 면역 염색상, "B"(Rax)가 GFP 형광상, "C"(Bright field)가 명시야상이다.
[도 6] 도 6은, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체(부유 배양 개시 후 63일째)를 분산시켜, 얻어진 세포를 부유 배양함으로써 형성된 레티노스피어의 형광 현미경상이다. "A" 및 "C"(Rax)가 GFP 형광상, "B"(Chx10)가 항Chx10 항체를 사용한 형광 면역 염색상, "D"(SSEA1)가 항SSEA-1 항체를 사용한 형광 면역 염색상이다.
[도 7] 도 7은, 세포 응집체(부유 배양 개시 후 70일째)로부터 분리된 신경 망막부(NR) 또는 모양체 주연부 유사 구조체(CMZ)를 분산시켜, 얻어진 세포를 부유 배양함으로써 형성된 레티노스피어를 해석한 결과를 나타내는 도면이다. "A" 및 "B"은, 모양체 주연부 유사 구조체(CMZ)로부터 형성된 레티노스피어의 형광 현미경상이며, "A"(BF)가 명시야상, "B"(Rax)가 GFP 형광상이다. "C"에는 1차 레티노스피어의 형성수 (formation number), "E"에는 2차 레티노스피어의 형성수를 나타낸다. "D"에는 1차 레티노스피어의 직경 분포, "F"에는 2차 레티노스피어의 직경 분포를 나타낸다.
[도 8] 도 8의 "A"은, 세포 응집체(부유 배양 개시 후 60일째)로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜, 얻어진 세포 현탁액을 형광 표지된 SSEA-1 항체에서 면역 염색해, 셀 소터 (cell sorter)를 사용하여 FACS 해석한 결과를 나타내는 도면이다. 도 8의 "B"은 상기 세포 현탁액으로부터 분취된 Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포 획분("A"의 Q2에 나타나는 세포를 분취한 Fraction 1)을, 도 8의 "C"는 상기 세포 현탁액으로부터 분취된 Rax 양성 및 SSEA-1 음성의 세포 획분("A"의 Q4에 나타나는 세포를 분취한 Fraction 2)를, 각각 FACS 해석한 결과를 나타내는 도면이다.
[도 9] 도 9는, 세포 응집체(부유 배양 개시 후 60일째)로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜, 얻어진 세포 현탁액으로부터 Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포 획분(SSEA1+), 및, Rax 양성 및 SSEA-1 음성의 세포 획분(SSEA1-)을 분취하고, 분취된 세포 획분을 각각 부유 배양함으로써 형성된 레티노스피어를 해석한 결과를 나타내는 도면이다. "A" 및 "B"은, Rax 양성 및 SSEA1 양성의 세포 획분(SSEA1+)으로부터 형성된 레티노스피어의 형광 현미경상이며, "A"(BF)가 명시야상, "B"(Rax)가 GFP 형광상이다. "C"에는 레티노스피어의 형성수를 나타낸다. "D"에는 형성된 레티노스피어의 직경 분포를 나타낸다.
[도 10] 도 10은, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체(부유 배양 개시 후 90일째)로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜, 얻어진 세포를 부유 배양함으로써 형성된 레티노스피어로부터 분화시켜 얻어진 세포의 형광 현미경상이다. "A" 및 "B"은 1차 레티노스피어로부터 분화시킨 세포의 화상을, "C" 및 "D"은 2차 레티노스피어로부터 분화시킨 세포의 화상을 나타낸다. "A" 및 "C"(Rax)는 GFP 형광상, "B" 및 "D"(Crx)는 항Crx 항체를 사용한 형광 면역 염색상이다.
[도 11] 도 11은, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체(부유 배양 개시 후 60일째)로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜, 얻어진 세포를 부유 배양함으로써 형성된 2차 레티노스피어로부터 분화시켜 얻어진 세포의 형광 현미경상이다. "A"(Calretinin)는 항Calretinin 항체를 사용한 형광 면역 염색상, "B"(Rax)는 GFP 형광상, "C"(Pax6)는 항Pax6 항체를 사용한 형광 면역 염색상, "D"(TuJ1)는 항TuJ1 항체를 사용한 형광 면역 염색상이다.
[도 12] 도 12는, 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체(부유 배양 개시 후 54일째)로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체로부터 Rax 양성 및 SSEA1 양성 세포를 분취한 후 이것을 부유 배양해, 형성된 레티노스피어를 분화시켜 얻어진 세포의 형광 현미경상이다. "A"(Crx)는 항Crx 항체를 사용한 형광 면역 염색상, "B" 및 "F"(Rax)는 GFP 형광상, "C"(Pax6)는 항Pax6 항체를 사용한 형광 면역 염색상, "D"(TuJ1)는 항TuJ1 항체를 사용한 형광 면역 염색상, "E"(Calretinin)는 항Calretinin 항체를 사용한 형광 면역 염색상이다.
[도 13] 도 13은, 세포 응집체(부유 배양 개시 후 79일째)로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜, 얻어진 세포 현탁액으로부터 SSEA-1 양성 세포 획분 및 SSEA-1 음성 세포 획분을 분취하고, 분획전의 세포 현탁액, 그리고, 분취된 후의 SSEA-1 양성 세포 획분 및 SSEA-1 음성 세포 획분을 각각 부유 증식 배양함으로써 형성된 레티노스피어를 해석한 결과를 나타내는 도면이다. "A" 및 "B"은, SSEA-1 양성 세포 획분으로부터 형성된 레티노스피어의 형광 현미경상이며, "A"(BF)가 명시야상, "B"(Rax)가 GFP 형광상이다. "C"에는 레티노스피어의 형성수를 나타낸다. "소팅되지 않은 (unsorted)"은 분획전의 세포 현탁액으로부터 형성된 레티노스피어의 수, "SSEA1+"은 SSEA-1 양성 세포 획분으로부터 형성된 레티노스피어의 수, "SSEA1-"은 SSEA-1 음성 세포 획분으로부터 형성된 레티노스피어의 수를 각각 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서 "간세포"로서는, 예를 들어, 복수의 분화 계보의 세포로 분화할 수 있는 능력(다중능; pluripotency)과 다중능을 유지해 지속적으로 증식할 수 있는 능력(자기 복제능)을 갖는 세포이며, 조직이 상해를 받았을 때에 그 조직을 재생할 수 있는 세포를 들 수가 있다. 여기서 "간세포"는, 배성 간세포(ES세포) 혹은 조직 간세포(조직성간세포, 조직 특이적 간세포 또는 체성 간세포라고도 한다) 또는 인공 다능성 간세포(iPS 세포：induced pluripotent stem cell)일 수 있지만, 그것들로 한정되지 않는다. 간세포 유래의 조직 세포는, 조직 재생이 가능한 것으로로부터 알 수 있는 바와 같이, 생체에 가까운 정상적인 세포로 분화할 수 있는 것이 알려져 있다.
본 발명에 있어서의 "조직 간세포"로서는, 조직에 존재해, 그 조직을 구성하는 복수의 분화 계보의 세포로 분화할 수 있는 능력(다중능)과 자기 복제능을 갖는 세포를 들 수가 있다. "조직 간세포"는, 발생 과정이나, 세포사, 손상 조직의 재생에 있어서, 새로운 세포를 공급하는 역할을 가지는 것이 알려져 있다.
본 발명에 있어서의 "다능성 간세포"로서는, 예를 들어, 인비트로에 있어서 배양하는 것이 가능하고, 또한, 생체를 구성하는 모든 세포(3 배엽, 즉 외배엽, 중배엽 또는 내배엽 유래의 조직)으로 분화할 수 있는 능력(다능성)을 갖는 간세포를 들 수가 있다. 배성 간세포(ES세포)도 "다능성 간세포"에 포함된다. "다능성 간세포"는, 수정란, 클론배, 생식간세포, 조직 간세포로부터 얻어지는. 체세포에 여러종류의 유전자를 도입함으로써, 배성 간세포를 닮은 다능성을 인공적으로 갖게 한 세포(인공 다능성 간세포라고도 한다)도 "다능성 간세포"에 포함된다. 다능성 간세포는, 자체 공지된 방법으로 제작하는 것이 가능하다. 인공 다능성 간세포의 제작 방법으로서는, 예를 들어, Cell, 131(5) pp.861-872 (2007), Cell, 126(4) pp.663-676 (2006) 등에 기재되는 방법을 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 "배성 간세포(ES세포)"로서는, 예를 들어, 자기 복제능을 가지고, 다중능(특히, 다능성 "pluripotency")을 갖는 간세포이며, 초기배에 유래하는 다능성 간세포를 들 수가 있다. 배성 간세포는, 1981년에 처음으로 수립되어 1989년 이후 녹아웃 마우스 제작에도 응용되고 있다. 1998년에는 인간 배성 간세포가 수립 되어 있고, 재생 의학에도 이용되고 있다.
본 발명에 있어서의 "인공 다능성 간세포"로서는, 예를 들어, 섬유아세포 등의 분화한 세포를 Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc등의 여러종류의 유전자의 발현에 의해 직접 초기화해 다중능을 유도한 세포를 들 수가 있다. 2006년, 야마나카등에 의해 마우스 세포로 인공 다능성 간세포가 수립되었다(Takahashi K, Yamanaka S.Cell. 2006, 126(4), p663-676). 인공 다능성 간세포는, 2007년에 인간 섬유아세포에서도 수립되어 배성 간세포와 마찬가지로 다중능을 갖는다 (Cell, 131(5) pp.861-872 (2007); Science, 318(5858) pp.1917-1920 (2007); Nat. Biotechnol., 26(1) pp.101-106 (2008)).
다능성 간세포는, 소정의 기관으로부터 입수할 수 있고 시판품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배성 간세포인 KhES-1, KhES-2및 KhES-3은, 쿄토 대학 프런티어 메디칼 사이언스 연구소로부터 입수 가능하다. 마우스 배성 간세포인 EB5 세포는 독립 행정법인 이화학 연구소 (RIKEN) 로부터, D3주는 ATCC로부터, 각각 입수 가능하다.
다능성 간세포는, 자체 공지된 방법에 의해 유지 배양할 수 있다. 예를 들어, 인간간세포는, KnockoutTM Serum Replacement(KSR)를 사용하여 배양함으로써 유지할 수 있다. 예를 들어, 마우스간세포는, 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS), 백혈병 저지 인자(leukemia inhibitory factor, LIF)를 첨가해 무피더하에 배양함으로써 유지할 수 있다.
유전자 변형된 다능성 간세포는, 예를 들어, 상동 재조합 기술을 사용하는 것에 따라 제작할 수 있다. 변형되는 염색체상의 유전자로서는, 예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원의 유전자, 신경계 세포의 장해에 따른 질환 관련 유전자등을 들 수 있다. 염색체상의 표적 유전자의 변형은, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993); 바이오 매뉴얼 시리즈 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO (1995); 등에 기재된 방법을 사용하여 실시할 수가 있다.
구체적으로는, 예를 들어, 변형하는 표적 유전자(예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원의 유전자나 질환 관련 유전자등)의 게놈 유전자를 단리하고, 단리된 게놈 유전자를 사용하여 표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟팅 벡터를 제작한다. 제작된 타겟팅 벡터를 간세포에 도입해, 표적 유전자와 타겟팅 벡터의 사이에 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써, 염색체상의 유전자가 변형된 간세포를 제작할 수 있다.
표적 유전자의 게놈 유전자를 단리하는 방법으로서는, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)나 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons(1987-1997) 등에 기재된 공지된 방법을 들 수 있다. 게놈 DNA 도서관 스크리닝 시스템(Genome Systems제)이나 Universal GenomeWalker Kits(CLONTECH제)등을 사용하는 것에 따라, 표적 유전자의 게놈 유전자를 단리할 수도 있다.
표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟팅 벡터의 제작, 및 상동 재조합체의 효율적인 선별은, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993); 바이오 매뉴얼 시리즈 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO (1995); 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수가 있다. 타겟팅 벡터는, 치환형 또는 삽입형의 어느것도 사용할 수 있다. 선별 방법으로서는, 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 또는 폴리 A선택등의 방법을 사용할 수 있다.
선별한 세포주중에서 목적으로하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로서는, 게놈 DNA에 대한 서던 하이브리다이제이션법이나 PCR법 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 "응집체"로서는, 배지내에 분산하고 있던 세포가 집합해 형성한 덩어리를 들 수가 있고, 본 발명에 있어서의 "응집체"에는, 부유 배양 개시시에 분산하고 있던 세포가 형성한 응집체와 부유 배양 개시시에 이미 형성되고 있던 응집체가 포함된다.
"응집체를 형성시킨다"란, 세포를 집합시켜 세포의 덩어리를 형성시키는 것을 말한다. 간세포의 응집체를 형성시키려면, 분산한 간세포를 자연스럽게 응집시켜도 된다. 일정수의 분산한 간세포를 신속히 응집시킴으로써 질적으로 균일한 간세포의 응집체를 형성시켜도 된다. 예를 들어, 다능성 간세포를 신속히 집합시켜 다능성 간세포의 응집체를 형성시키면, 형성된 응집체로부터 분화 유도되는 세포에 있어서 표피유사 구조를 재현성 있게 형성시킬 수 있다.
응집체를 형성시키는 실험적인 조작으로서는, 예를 들어, 웰의 큰 부유 배양 디쉬에 세포를 파종해 자연스럽게 응집하는 것을 기다리는 방법, 웰의 작은 플레이트(96 구멍 플레이트)나 마이크로포아등을 사용하여 작은 스페이스에 세포를 가두는 방법, 작은 원심 튜브를 사용하여 단시간 원심함으로써 세포를 응집시키는 방법 등을 들 수 있다.
다능성 간세포의 응집체가 형성된 것이나, 응집체를 형성하는 각 세포에 있어서 표피유사 구조가 형성된 것은, 응집체의 사이즈 및 세포수, 거시적 형태, 조직 염색 해석에 의한 미시적 형태 및 그 균일성, 분화 마커 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 분화 효율의 응집체간의 재현성 등에 기초를 두어 판단하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서의 "조직"으로서는, 예를 들어, 형태나 성질이 상이한 복수 종류의 세포가 일정한 패턴으로 입체적으로 배치한 구조를 갖는 세포 집단의 구조체를 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 "망막 조직"으로서는, 예를 들어, 생체 망막에 있어서 각 망막층을 구성하는 광수용체 세포, 간체세포, 뿔꼴 세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포(또는 신경절 세포), 이들의 선구 세포 또는 망막 선구 세포등의 세포가, 적어도 복수 종류로, 층상에서 입체적으로 배열한 망막 조직등을 들 수가 있다. 각각의 세포가 어느 망막층을 구성하는 세포인가에 대해서는, 공지된 방법, 예를 들어, 분화 마커 및 미분화 마커의 발현 유무 혹은 그 정도 등에 의해 확인할 수 있다.
본 발명에 있어서의 "망막 조직"으로서는, 예를 들어, 망막으로의 분화에 적절한 조건 아래에서 다능성 간세포의 응집체를 부유 배양함으로써 당해 세포 응집체의 표면에 형성될 수 있는, 망막 선구 세포 또는 신경 망막 선구 세포를 포함하는 상피조직을 들 수도 있다.
본 발명에 있어서의 "망막층"으로서는, 망막을 구성하는 각층을 의미하여 구체적으로는, 망막 색소 표피층, 광수용체 층, 외부 경계막, 외과립 층, 외망상층, 내핵층, 내망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내경계막을 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 "망막층 특이적 신경세포"로서는, 망막층을 구성하는 세포로서 망막층에 특이적신경세포를 들 수가 있다. 구체적인 망막층 특이적 신경세포로서는, 광수용체 세포, 간체세포, 뿔꼴 세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포(또는 신경절 세포), 및 색소 표피 세포를 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 "망막 간세포(retinal stem cell)"로서는, 광수용체 세포, 간체세포, 뿔꼴 세포, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포(또는 신경절 세포), 및 색소 표피 세포의 어느 성숙 망막 세포로도 분화할 수 있는 능력과 자기 복제능을 갖는 세포를 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 "망막 선구 세포(retinal progenitor cell)"로서는, 신경 망막 및 망막 색소 표피를 구성하는 어느 성숙의 망막 세포로도 분화할 수 있는 선구 세포를 들 수가 있다.
"신경 망막 선구 세포(neural retinal progenitor)"로서는, 안배(optic cup)중층이 되는 운명의 세포로서, 신경 망막을 구성하는 어느 성숙 세포로도 분화할수 있는 선구 세포를 들 수가 있다.
망막 세포 마커로서는, 망막 선구 세포에서 발현하는 Rax 및 PAX6, 신경 망막 선구 세포에서 발현하는 Chx10, 시상하부 뉴런의 선구 세포에서는 발현하지만 망막 선구 세포에서는 발현하지 않는 Nkx2.1, 시상하부 신경 표피에서 발현하지만 망막에서는 발현하지 않는 Sox1, 광수용체 세포의 선구 세포에서 발현하는 Crx 등을 들 수 있다. 망막층 특이적 신경세포의 마커로서는, 쌍극세포에서 발현하는 Chx10 및 L7, 마디 세포에서 발현하는 TuJ1 및 Brn3, 아마크린 세포에서 발현하는 Calretinin, 수평 세포에서 발현하는 Calbindin, 광수용체 세포에서 발현하는 Rhodopsin 및 Recoverin, 색소 표피 세포에서 발현하는 RPE65 및 Mitf, 간체세포에서 발현하는 Nrl, 뿔꼴 세포에서 발현하는 Rxr-gamma 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 "모양체 주연부(ciliary marginal zone; CMZ)"로서는, 예를 들어, 생체 망막에 있어서 망막 조직(구체적으로는, 신경 망막)과 망막 색소 표피와의 경계 영역에 존재하는 조직이며, 또한, 망막의 조직 간세포(망막 간세포)를 포함하는 영역을 들 수가 있다. 모양체 주연부는, 모양체연(ciliary margin) 또는 망막연(retinal margin)이라고도 불리며 모양체 주연부, 모양체연 및 망막연은 동등의 조직이다. 모양체 주연부는, 망막 조직에 대한 망막 선구 세포나 분화 세포의 공급이나 망막 조직 구조의 유지등에 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다. 모양체 주연부의 마커 유전자로서는, 예를 들어, Rdh10 유전자(양성) 및 Otx1 유전자(양성)를 들 수가 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 "배지"는, 동물세포의 배양에 사용되는 배지를 기초 배지로서 조제하면 된다. 기초 배지로서는, 예를 들어, BME 배지, BGJb 배지, CMRL 1066배지, Glasgow MEM 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium 199배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, 햄 배지, F-12 배지, DMEM/F-12 배지, RPMI 1640배지, Fischer's 배지, 또는, 이들의 혼합 배지 등, 동물세포의 배양에 사용할 수 있는 배지를 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 "무혈청 배지"로서는, 예를 들어, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 배지를 들 수가 있다. 본 발명에서는, 정제된 혈액 유래 성분이나 동물 조직 유래 성분(예를 들어, 증식 인자)이 혼입하고 있는 배지도, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하지 않는 이상 무혈청 배지에 포함된다.
무혈청 배지는, 혈청 대체물을 함유하고 있어도 된다. 혈청 대체물로서는, 예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올 또는 3'티올 글리세롤, 혹은, 이들의 균등물등을 적절히 함유하는 것 등을 들 수가 있다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어, WO98/30679등에 기재되는 방법에 의해 조제하면 된다. 또 혈청 대체물로서는, 시판품을 이용해도 된다. 이러한 시판되는 혈청 대체물로서는, 예를 들어, KnockoutTM Serum Replacement(Invitrogen 사제：이하, KSR라고 기재하기도 함), Chemically Defined Lipid Concentrate(Gibco 사제), Glutamax(Gibco 사제)를 들 수가 있다.
부유 배양으로 사용되는 "무혈청 배지"는, 예를 들어, 지방산, 지방질, 아미노산(예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 증식 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기염류 등을 함유해도 된다.
조제의 번잡함을 회피하고자하는 관점에서는, 이러한 무혈청 배지로서 예를 들어, 시판되는 KSR를 적당량(예를 들어, 약 1% 내지 약 20%) 첨가한 무혈청 배지(GMEM 혹은 DMEM 배지에, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 0.1 mM 비필수 아미노산 Mix, 및 1 mM 피루브산 나트륨을 첨가한 배지; 또는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1혼합 액에 450μM 1-모노 티오 글리세롤을 첨가한 배지 등)을 바람직하게 들 수가 있다.
본 발명에 있어서의 "혈청 배지"로서는, 예를 들어, 무조정 또는 미정제의 혈청을 포함하는 배지를 들 수가 있다. 당해 배지는, 지방산, 지방질, 아미노산(예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 증식 인자, 사이토카인, 항산화제, 2-메르캅토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기염류 등을 함유해도 된다.
본 발명에 있어서 배지에 첨가되는 "혈청"으로서, 예를 들어, 우혈청, 송아지 혈청, 우태아 혈청, 말혈청, 망아지 혈청, 말태아 혈청, 토끼 혈청, 토끼 새끼 혈청, 토끼 태아 혈청, 인간 혈청등 포유 동물의 혈청등을 들 수가 있다.
본 발명에 있어서, "물질 X를 포함하는 배지"란, 외래성(exogeneous)의 물질 X가 첨가된 배지 또는 외래성의 물질 X를 포함하는 배지를 의미하고, "물질 X를 포함하지 않는 배지"란, 외래성의 물질 X가 첨가되어 있지 않은 배지 또는 외래성의 물질 X를 포함하지 않는 배지를 의미한다. 여기서, "외래성의 물질 X"란, 그 배지로 배양되는 세포 또는 조직에 있어 외래의 물질 X를 의미하고, 그 세포 또는 조직이 산생하는 내재성(endogenous)의 물질 X는 이것에 포함되지 않는다.
예를 들어, "FGF 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지"란, 외래성의 FGF 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가된 배지 또는 외래성의 FGF 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 배지이다. "FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하지 않는 배지"란, 외래성의 FGF 시그널 경로 저해 물질이 첨가되어 있지 않은 배지 또는 외래성의 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하지 않는 배지이다.
본 발명에 있어서의 "부유 배양"으로서는, 예를 들어, 세포 응집체를 배지내에 있어서, 세포 배양기에 대해 비(非)접착성의 조건 아래에서 행해지는 배양등을 들 수가 있다.
부유 배양에 사용되는 배양기로서는, 세포의 부유 배양이 가능한 것이면 특별히 한정되지 않는다. 이와 같은 배양기로서는, 예를 들어, 플라스크, 조직배양용 플라스크, 디쉬, 페트리디쉬, 조직배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 마이크로포아, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 롤러 보틀 등을 들 수가 있다. 바람직한 배양기로서는, 세포비접착성의 배양기를 들 수가 있다.
세포비접착성의 배양기로서는, 배양기의 표면이 세포와의 접착성을 향상시키는 목적으로 인공적으로 처리(예를 들어, 세포외 매트릭스 등에 의한 코팅 처리)되어 있지 않은 것 등을 사용하는 것이다. 세포비접착성의 배양기로서는, 배양기의 표면이 세포와의 접착성을 저하시키는 목적으로 인공적으로 처리(예를 들어, 초친수 처리)된 것 등을 사용해도 된다.
본 발명 간세포 제조 방법 1은, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 간세포의 제조 방법으로서, 이하의 공정 (1) 혹은 공정 (2)의 어느 하나 또는 이들 양 공정을 포함하는 것이다：
(1) 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포를 부유 배양해, 레티노스피어를 얻는 공정; 및
(2) 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포로부터 SSEA-1 양성 세포를 분취하는 공정.
본 발명에 있어서의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 간세포"는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체에 존재하고, 광수용체 세포등의 망막 세포로의 분화능 및 자기 복제능을 갖는 세포이다. 상기 모양체 주연부 간세포는, SSEA-1 양성이며, 나아가 Rax 유전자 양성, Chx10 유전자 양성, Rdh10 유전자 양성, Otx1 유전자 양성, Crx 유전자 음성, 및, β3-tubulin(TuJ1) 유전자 음성이다. 모양체 주연부 간세포는, 색소 침착이 없는(non-pigmented) 세포이다. 이러한 모양체 주연부 간세포는, 화학 물질등의 독성이나 약효의 평가에 사용하기 위한 시약이나, 세포 치료등을 목적으로한 시험이나 치료에 사용하기 위한 재료로서 유용하다.
SSEA-1(단계 특이적 배성 항원-1)은 세포에 발현하는 항원이며, CD15 또는 Lewis X (LeX)라고도 불린다. SSEA-1은, 세포 표면에 발현하고 있는 경우가 있다.
본 발명에 있어서의 "SSEA-1 양성 세포"란, SSEA-1의 발현이 검출되는 세포이다.
다능성 간세포로서는, 영장류 다능성 간세포를 들 수가 있고, 보다 구체적으로는, 인간 다능성 간세포를 들 수가 있다. 다능성 간세포로서는, 배성 간세포나 인공 다능성 간세포를 들 수 있다.
본 발명 간세포 제조 방법 1의 공정 (1) 및 공정 (2)에서 사용되는 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"는, 예를 들어 이하의 방법으로 조제할 수 있다： 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체의 제조 방법으로서, 망막 조직을 포함하는 세포 응집체이며, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20% 이상 100% 이하인 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기에 이를 때까지의 기간중에 한정해 배양한 후, 얻어진 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않는 세포 응집체"를, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 배양하는 공정을 포함하는 방법(이하, 본 세포 응집체 제조 방법 1으로 기재하기도 함).
상기의 본 세포 응집체 제조 방법 1에서 스타트 원료로서 사용되는 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"는, 당해 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20% 이상 100% 이하인 세포 응집체이다. 상기 "Chx10 양성 세포의 존재 비율"로서는, 바람직하게는 40% 이상을 들 수가 있고 보다 바람직하게는 60% 이상을 들 수가 있다.
상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"는, 예를 들어 다능성 간세포, 바람직하게는 인간 다능성 간세포로부터 조제할 수 있다.
상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"를 조제하는 방법으로서는, 구체적으로는, 예를 들어 하기 (A) 및 (B)의 공정을 포함하는 방법을 들 수가 있다：
(A) 다능성 간세포를 무혈청 배지내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 공정; 및
(B) 공정 (A)로 형성된 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 세포 응집체를 얻는 공정.
다능성 간세포를 무혈청 배지내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 공정 (A)에 대해 설명한다.
공정 (A)에 있어서 사용되는 무혈청 배지는, 상기 서술한 같은 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 시판되는 KSR등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지(예를 들어, IMDM와 F-12의 1：1의 혼합 액에 10% KSR, 450μM 1-모노 티오 글리세롤 및 1 x Chemically Defined Lipid Concentrate가 첨가된 배지)를 들 수가 있다. 무혈청 배지에 대한 KSR의 첨가량으로서는, 예를 들어 인간 ES세포의 경우에는, 통상 약 1% 내지 약 20% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
공정 (A)에 있어서의 배양 온도, CO2 농도등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
공정 (A)에 있어서의 다능성 간세포의 농도는, 다능성 간세포의 응집체를 보다 균일하게, 효율적으로 형성시키도록 적절히 설정할 수 있다. 예를 들어 96 구멍 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 인간 ES세포를 부유 배양하는 경우, 1 웰 당 약 1x103 내지 약 1x105 세포, 바람직하게는 약 3x103 내지 약 5x104 세포, 보다 바람직하게는 약 5x103 내지 약 3x104 세포, 가장 바람직하게는 약 1.2x104 세포가 되도록 조제한 액을 웰에 첨가해, 플레이트를 정치해 세포 응집체를 형성시킨다.
세포 응집체를 형성시키기 위해서 필요한 부유 배양의 시간은, 세포를 균일하게 응집시키도록, 사용하는 다능성 간세포에 의해 적절히 결정 가능하지만, 균일한 세포 응집체를 형성하기 위해서는 가능한 단시간인 것이 바람직하다. 예를 들어, 인간 ES세포의 경우에는, 바람직하게는 약 24시간 이내, 보다 바람직하게는 약 12시간 이내에 세포 응집체를 형성시킨다. 이 세포 응집체 형성까지의 시간은, 세포를 응집시키는 용구나, 원심 조건 등을 조정함으로써 적절히 조절하는 것이 가능하다.
공정 (A)로 형성된 세포 응집체를, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 세포 응집체를 얻는 공정 (B)에 대해 설명한다.
공정 (B)에 있어서 사용되는 배지는, 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가되지 않고 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지이고, 기저막 표품 (basal membrane preparation)을 첨가할 필요는 없다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지는, 상기 서술한 같은 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 시판되는 KSR등의 혈청 대체물을 적당량 첨가한 무혈청 배지(예를 들어, IMDM와 F-12의 1：1의 혼합 액에 10% KSR, 450μM 1-모노 티오 글리세롤 및 1 x Chemically Defined Lipid Concentrate가 첨가된 배지)를 들 수가 있다. 무혈청 배지에 대한 KSR의 첨가량으로서는, 예를 들어 인간 ES세포의 경우에는, 통상 약 1% 내지 약 20% 이며, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
공정 (B)에서 사용되는 무혈청 배지는, 공정 (A)로 사용한 무혈청 배지를 그대로 사용할 수도 있고, 새로운 무혈청 배지로 대체할 수도 있다. 공정 (A)로 사용한 무혈청 배지를 그대로 공정 (B)에 사용하는 경우, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지내에 첨가하면 된다.
소닉 헤지혹(이하, Shh라고 적는 일이 있다.) 시그널 전달 경로 작용 물질이란, Shh에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질이다. Shh 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, Hedgehog 패밀리에 속하는 단백(예를 들어, Shh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, Purmorphamine, 또는 SAG 등을 들 수 있다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이란, BMP에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 증강할 수 있는 물질이다. BMP 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어 BMP2, BMP4 혹은 BMP7등의 BMP 단백, GDF7등의 GDF 단백, 항BMP 수용체 항체, 또는, BMP 부분 펩티드 등을 들 수 있다. BMP2 단백, BMP4 단백 및 BMP7 단백은 예를 들어 RandD Systems로부터, GDF7 단백은 예를 들어 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.으로부터 입수 가능하다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 농도는, 다능성 간세포의 응집체를 형성하는 세포의 망막 세포로의 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 BMP4의 경우에는, 약 0.01 nM 내지 약 1μM, 바람직하게는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 보다 바람직하게는 약 1.5 nM의 농도가 되도록 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 공정 (A)의 부유 배양 개시부터 약 24시간 후 이후에 첨가되고 있으면 되고, 부유 배양 개시 후 몇일 이내(예를 들어, 15일 이내)에 배지에 첨가해도 된다. 바람직하게는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질은, 부유 배양 개시 후 1일째부터 15일째까지의 사이, 보다 바람직하게는 1일째부터 9일째까지의 사이, 추가로 바람직하게는 6일째에 배지에 첨가한다.
BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 배지에 첨가되어 다능성 간세포의 응집체를 형성하는 세포의 망막 세포로의 분화 유도가 개시된 후에는, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 배지에 첨가할 필요는 없고, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지를 사용하여 배지 교환을 실시하면 된다. 이로써, 배지에 소요되는 경비를 억제할 수가 있다. 망막 세포로의 분화 유도가 개시된 세포는, 예를 들어, 당해 세포에 있어서의 Rax 유전자의 발현을 검출함으로써 확인할 수 있다. GFP등의 형광 리포터 단백질 유전자가 Rax 유전자자리에 노크인된 다능성 간세포를 공정 (A)로 사용하여 형성된 세포 응집체를, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질의 존재하에 부유 배양해, 발현한 형광 리포터 단백질로부터 발광되는 형광을 검출함으로써, 망막 세포로의 분화 유도가 개시되었던 시기를 확인할 수도 있다. 공정 (B)의 실시양태의 하나로서 공정 (A)로 형성된 세포 응집체를, Rax 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도의 BMP 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함해 소닉 헤지혹 시그널 전달 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 부유 배양해, 망막 선구 세포를 포함하는 세포 응집체를 얻는 공정을 들 수가 있다.
공정 (B)에 있어서의 배양 온도, CO2 농도등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃다. 또 CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
망막 선구 세포를 포함하는 세포 응집체를 얻을 수 있는 것은, 예를 들어, 망막 선구 세포의 마커인 Rax 또는 PAX6를 발현하는 세포가 응집체에 포함되어 있는 것을 검출함으로써 확인할 수 있다. 상기의 (A) 및 (B)의 공정을 포함하는 방법에 의해 얻어지는 "망막 선구 세포를 포함하는 세포 응집체"를, 본 세포 응집체 제조 방법 1에 있어서, 스타트 원료인 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"로서 사용할 수 있다.
본 세포 응집체 제조 방법 1에서 스타트 원료로서 사용되는 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"는, 구체적으로는, 예를 들어 하기 (C), (D) 및 (E)의 공정을 포함하는 방법에 의해 조제할 수도 있다：
(C) 다능성 간세포를, Wnt 시그널 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지내에서 부유 배양함으로써 다능성 간세포의 응집체를 형성시키는 공정;
(D) 공정 (C)로 형성된 세포 응집체를, 기저막 표품을 포함하는 무혈청 배지내에서 부유 배양하는 공정; 및
(E) 공정 (D)로 배양된 세포 응집체를, 혈청 함유 배지내에서 부유 배양하는 공정.
공정 (C)에서 사용하는 Wnt 시그널 경로 저해 물질로서는, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. Wnt 시그널 경로 저해 물질로서는, 예를 들어, Dkk1, Cerberus 단백, Wnt 수용체 저해제, 가용형 Wnt 수용체, Wnt 항체, 카세인 키나아제 저해제, 도미넌트 네거티브 티브 Wnt 단백, CKI-7(N-(2-아미노에틸)-5-클로로-이소퀴놀린-8-술폰아미드), D4476(4-{4-(2, 3-디히드로벤조[1, 4] 디옥신-6-일)-5-피리딘-2-일-1 H-이미다졸-2-일}벤즈아미드), IWR-1-endo(IWR1e), IWP-2등을 들 수 있다. Wnt 시그널 경로 저해 물질의 농도는, 다능성 간세포의 응집체를 형성하는 농도이면 된다. 예를 들어 IWR1e등의 통상적인 Wnt 시그널 경로 저해 물질의 경우에는, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 10μM, 보다 바람직하게는 3μM 전후의 농도로 첨가한다.
Wnt 시그널 경로 저해 물질은, 부유 배양 개시전에 무혈청 배지에 첨가되고 있어도 되고, 또, 부유 배양 개시 후 몇 일 이내(예를 들어, 5일 이내)에 무혈청 배지에 첨가해도 된다. 바람직하게는, Wnt 시그널 경로 저해 물질은, 부유 배양 개시 후 5일 이내, 보다 바람직하게는 3일 이내, 가장 바람직하게는 부유 배양 개시와 동시에 무혈청 배지에 첨가한다. 또, Wnt 시그널 경로 저해 물질을 첨가한 상태로, 부유 배양 개시 후 18일째까지, 보다 바람직하게는 12일째까지 부유 배양한다.
공정 (C)에 있어서의 배양 온도, CO2 농도등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 전후이다. 또 CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 전후이다.
공정 (C)에 있어서의 다능성 간세포의 농도는, 다능성 간세포의 응집체를 보다 균일하게, 효율적으로 형성시키도록 당업자이면 적절히 설정할 수 있다. 세포 응집체 형성시의 다능성 간세포의 농도는, 간세포의 균일한 응집체를 형성 가능한 농도인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 96 구멍 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 인간 ES세포를 부유 배양하는 경우, 1 웰 당 약 1x103 세포 내지 약 5x104 세포, 바람직하게는 약 3x103 세포 내지 약 3x104 세포, 보다 바람직하게는 약 5x103 세포 내지 약 2x104 세포, 가장 바람직하게는 9x103 세포 전후가 되도록 조제한 액을 첨가해, 플레이트를 정치해 세포 응집체를 형성시킨다.
세포 응집체를 형성시키기 위해서 필요한 부유 배양의 시간은, 세포를 신속히 응집 시킬 수 있는 한, 사용하는 다능성 간세포에 의해 적절히 결정 가능하지만, 균일한 세포 응집체를 형성하기 위해서는 가능한 단시간인 것이 바람직하다. 예를 들어, 인간 ES세포의 경우에는, 바람직하게는 24시간 이내, 보다 바람직하게는 12시간 이내에 세포 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 이 세포 응집체 형성까지의 시간은, 세포를 응집시키는 용구나, 원심 조건 등을 조정하는 것으로 당업자이면 적절히 조절하는 것이 가능하다.
공정 (D)에서 사용하는 기저막 표품으로서는, 그 위에 기저막 형성능을 갖는 원하는 세포를 파종해 배양했을 경우에, 표피 세포와 유사한 세포 형태, 분화, 증식, 운동, 기능 발현등을 제어하는 기능을 갖는 같은 기저막 구성 성분을 포함하는 것을 말한다. 여기서, "기저막 구성 성분"이란, 동물의 조직에 있어서, 표피 세포층과 간질세포층등과의 사이에 존재하는 얇은 막상을 한 세포외 매트릭스 분자를 말한다. 기저막 표품은, 예를 들어 기저막을 개재하여 지지체상에 접착하고 있는 기저막 형성능을 갖는 세포를, 그 세포의 지방질 용해능을 갖는 용액이나 알칼리 용액등을 사용하여 제거하는 것으로 제조할 수 있다. 바람직한 기저막 표품으로서는, 기저막 성분으로서 시판되고 있는 상품(예를 들어 Matrigel™(Becton, Dickinson and Company제：이하, 마트리겔이라고 기재하기도 함))나, 기저막 성분으로서 공지된 세포외 매트릭스 분자(예를 들어 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 엔탁틴등)를 포함하는 것을 들 수 있다.
Matrigel™는, Engelbreth Holm Swarm (EHS) 마우스 육종 유래의 기저막 조제물이다. Matrigel™의 주성분은 IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 황산 프로테오글리칸, 엔탁틴이며, 이들에 추가해 TGF-β, 섬유아세포 증식 인자(FGF), 조직 프라스미노겐 활성화 인자, EHS 종양이 천연에 산생하는 증식 인자가 포함된다. Matrigel™의 "growth factor reduced (GFR) 제품"은, 통상적인 Matrigel™ 보다 증식 인자의 농도가 낮다. 본 발명에서는, GFR 제품의 사용이 바람직하다.
공정 (D)에 있어서의 부유 배양으로 무혈청 배지에 첨가되는 기저막 표품의 농도로서는, 신경 조직(예를 들어 망막 조직)의 표피 구조가 안정적으로 유지되는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 Matrigel™를 사용하는 경우에는, 바람직하게는 배양액의 1/20에서 1/200의 용량, 보다 바람직하게는 1/100 전후의 용적을 들 수가 있다. 기저막 표품은 간세포의 배양 개시시에 이미 배지에 첨가 되어 있어도 되고, 바람직하게는, 부유 배양 개시 후 5일 이내, 보다 바람직하게는 부유 배양 개시 후 2일 이내에 무혈청 배지에 첨가된다.
공정 (D)에서 사용되는 무혈청 배지는, 공정 (C)로 사용한 무혈청 배지를 그대로 사용할 수도 있고, 새로운 무혈청 배지로 대체할 수도 있다.
공정 (C)에서 사용한 무혈청 배지를 그대로 공정 (D)에 사용하는 경우, "기저막 표품"을 배지내에 첨가하면 된다.
공정 (D)에 있어서의 배양 온도, CO2 농도등의 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 전후이다. 또 CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 전후이다.
공정 (E)에서 사용되는 혈청 함유 배지는, 공정 (D) 배양에 사용한 무혈청 배지에 혈청을 직접 첨가한 것을 사용해도 되고, 새로운 혈청 함유 배지로 대체한 것을 사용해도 된다.
혈청의 첨가는, 부유 배양 개시 후 7일째 이후, 보다 바람직하게는 9일째 이후, 가장 바람직하게는 12일째에 실시한다. 혈청 농도에 대해서는, 약 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 3% 내지 약 20%, 보다 바람직하게는 10% 전후로 첨가한다.
공정 (E)에 있어서, 혈청에 추가해 Shh 시그널 경로 작용 물질을 첨가함으로써 망막 조직의 제조 효율을 상승시킬 수가 있다.
Shh 시그널 경로 작용 물질로서는, Shh에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. Shh 시그널 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, Hedgehog 패밀리에 속하는 단백(예를 들어, Shh), Shh 수용체, Shh 수용체 아고니스트, Purmorphamine, SAG 등을 들 수 있다.
공정 (E)에 사용되는 Shh 시그널 경로 작용 물질의 농도는, 예를 들어 SAG등의 통상적인 Shh 시그널 경로 작용 물질의 경우에는, 약 0.1 nM 내지 약 10μM, 바람직하게는 약 10 nM 내지 약 1μM, 보다 바람직하게는 100 nM 전후의 농도로 첨가한다.
이와 같이 하여 배양된 세포 응집체에 있어서, 망막 조직은, 세포 응집체의 표면을 덮도록 존재한다. 망막 조직은, 면역 염색법등에 의해 확인할 수 있다. 상기의 (C), (D) 및 (E)의 공정을 포함하는 방법에 의해 얻어지는 세포 응집체는, 본 세포 응집체 제조 방법 1에 있어서, 스타트 원료인 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"로서 사용할 수 있다.
상기의 (A) 및 (B)의 공정을 포함하는 방법, 또는, 상기의 (C), (D) 및 (E)의 공정을 포함하는 방법에 의해 얻어지는 세포 응집체가, 망막 조직을 포함하는 것은, 이하와 같이하여 확인할 수도 있다. 예를 들어, 상기 방법으로 얻어진 세포 응집체를, 혈청 함유 배지내에서 부유 배양한다. 부유 배양으로 사용되는 배양기로서는, 상기 서술한 것을 들 수 있다. 부유 배양에 있어서의 배양 온도, CO2 농도, O2 농도 등의 다른 배양 조건은 적절히 설정할 수 있다. 배양 온도는, 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 약 30℃ 내지 약 40℃다. CO2 농도는, 예를 들어 약 1% 내지 약 10% 이다. O2농도는, 예를 들어 약 20% 내지 약 70% 이다. 배양 시간은 특별히 한정되지 않지만, 통상 48시간 이상이며, 바람직하게는 7일간 이상이다.
부유 배양 종료후, 세포 응집체를 파라포름알데히드 용액등의 고정액을 사용하여 고정해, 동결 절편을 제작한다. 얻어진 동결 절편을 면역 염색해, 각각의 분화 계보의 망막 세포(광수용체, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포등)의 존재를 확인한다. 얻어진 동결 절편을 면역 염색해, 망막 조직의 층 구조가 형성되어 있음을 확인해도 된다. 망막 조직의 각 층이 상이한 망막 선구 세포(광수용체, 수평 세포, 쌍극세포, 아마크린 세포, 망막절 세포)로 이루어져 있으므로, 이들의 세포에 발현하고 있는 상기 서술한 마커에 대한 항체를 사용하여 면역 염색함으로써, 층 구조가 형성되어 있음을 확인할 수 있다.
상기와 같이해 조제된 세포 응집체에 포함되는 망막 조직에 있어서의 "Chx10 양성 세포의 존재 비율"은, 예를 들어, 이하와 같은 방법에 의해 조사할 수가 있다.
(1) 먼저, "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"의 동결 절편을 제작한다.
(2) 이어서, Rax 단백질의 면역 염색을 실시한다. Rax 유전자를 발현하는 세포로 GFP등의 형광 단백질이 발현하도록 변형된 유전자 재조합 세포를 사용한 경우에는, 상기 형광 단백질의 발현을, 형광 현미경등을 사용하여 관찰한다. 얻어진 면역 염색상 또는 형광 현미경상에 있어서, Rax 유전자를 발현하는 망막 조직 영역을 특정한다.
(3) Rax 유전자를 발현하는 망막 조직 영역이 특정된 동결 절편과 같은 절편 또는 인접하는 절편을 시료로서 DAPI등의 핵염색 시약을 사용하여 핵을 염색한다. 그리고, 상기로 특정된 Rax 유전자를 발현하는 망막 조직 영역안에 있어서, 염색된 핵의 수를 계측함으로써, 망막 조직 영역내의 세포수를 측정한다.
(4) Rax 유전자를 발현하는 망막 조직 영역이 특정된 동결 절편과 같은 절편 또는 인접하는 절편을 시료로서 Chx10 단백질의 면역 염색을 실시한다. 상기 특정된 망막 조직 영역에 있어서의 Chx10 양성 세포 수를 계측한다.
(5) 상기 (3) 및 (4)으로 계측된 각각의 핵의 수에 기초하여, Chx10 양성 세포중의 핵의 수를, 상기로 특정된 Rax 유전자를 발현하는 망막 조직 영역의 핵의 수로 나누는 것으로, "Chx10 양성 세포의 존재 비율"을 산출한다.
본 세포 응집체 제조 방법 1에 있어서, 먼저, 망막 조직을 포함하는 세포 응집체이며, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20% 이상 100% 이하인 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기에 이를 때까지의 기간중에 한정해, 배양한다.
여기서, 바람직한 배양으로서는, 부유 배양을 들 수가 있다.
무혈청 배지로서는, 기초 배지에 N2 또는 KSR가 첨가된 무혈청 배지를 들 수가 있고, 보다 구체적으로는, DMEM/F-12 배지에 N2 서플리먼트(N2, Invitrogen사)가 첨가된 무혈청 배지를 들 수가 있다. 혈청 함유 배지로서는, 기초 배지에 우태아 혈청이 첨가된 혈청 함유 배지를 들 수가 있다.
배양 온도, CO2 농도등의 배양 조건은 적절히 설정하면 된다. 배양 온도로서는, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃의 범위를 들 수가 있다. 바람직하게는, 예를 들어, 약 37℃ 전후를 들 수가 있다. 또, CO2 농도로서는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10%의 범위를 들 수가 있다. 바람직하게는, 예를 들어, 약 5% 전후를 들 수가 있다.
상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"를, 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 배양할 때, 그 배지에 포함할 수 있는 Wnt 시그널 경로 작용 물질로서는, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 구체적인 Wnt 시그널 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, Wnt 패밀리에 속하는 단백질(예를 들어, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt 수용체, Wnt 수용체 아고니스트, GSK3 β저해제(예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심(BIO), CHIR99021, Kenpaullone) 등을 들 수가 있다.
무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지에 포함되는 Wnt 시그널 경로 작용 물질의 농도로서는, CHIR99021등의 통상적인 Wnt 시그널 경로 작용 물질의 경우에는, 예를 들어, 약 0.1μM 내지 약 100μM의 범위를 들 수가 있다. 바람직하게는, 예를 들어, 약 1μM 내지 약 30μM의 범위를 들 수가 있다. 보다 바람직하게는, 예를 들어, 3μM 전후의 농도를 들 수가 있다.
상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"를, 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 배양할 때, 그 배지에 포함할 수 있는 FGF 시그널 경로 저해 물질로서는, FGF에 의해 매개되는 시그널 전달을 저해할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. FGF 시그널 경로 저해 물질로서는, 예를 들어, FGF 수용체, FGF 수용체 저해제(예를 들어, SU-5402, AZD4547, BGJ398), MAP 키나아제 cascade 저해 물질(예를 들어, MEK 저해제, MAPK 저해제, ERK 저해제), PI3 키나아제 저해제, Akt 저해제 등을 들 수 있다.
무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지에 포함되는 FGF 시그널 경로 저해 물질의 농도는, 다능성 간세포의 응집체를 형성하는 세포의 망막 세포로의 분화를 유도 가능한 농도이면 된다. 예를 들어 SU-5402의 경우, 약 0.1μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 5μM의 농도로 첨가한다.
본 세포 응집체 제조 방법 1에 있어서 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기에 이를 때까지의 기간중에 한정해, 배양"하는 것은, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기에 이를 때까지의 기간의 전부 또는 그 일부에 한정해 배양하는 것을 의미한다. 요컨대, 배양계내에 존재하는 상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"가, RPE65 유전자를 실질적으로 발현하지 않는 세포로 구성되고 있는 기간의 전부 또는 그 일부(임의인 기간)에 한해 배양하면 되고, 이와 같은 배양을 채용하는 것으로, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않는 세포 응집체를 얻을 수 있다. "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않는 세포 응집체"에는, "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 전혀 출현하고 있지 않는 세포 응집체" 및 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 실질적으로 출현하고 있지 않는 세포 응집체"가 포함된다. "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 실질적으로 출현하고 있지 않는 세포 응집체"로서는, 당해 세포 응집체에 포함되는 망막 조직에 있어서의 RPE65 양성 세포의 존재 비율이 약 1% 이하인 세포 응집체를 들 수가 있다.
이와 같은 특정인 기간을 설정하려면, 상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"를 시료로서 당해 시료중에 포함되는 RPE65 유전자의 발현 유무 또는 그 정도를, 통상적인 유전자 공학적 수법 또는 생화학적 수법을 사용하여 측정하면 된다. 구체적으로는 예를 들어, 상기 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"의 동결 절편을 RPE65 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역 염색하는 방법을 사용하여 RPE65 유전자의 발현 유무 또는 그 정도를 조사할 수가 있다.
"RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기에 이를 때까지의 기간"으로서는, 예를 들어, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서의 상기 세포 응집체의 배양 개시시보다 감소하고, 30%에서 0%의 범위내가 될 때까지의 기간을 들 수가 있다. "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않는 세포 응집체"로서는, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 30%에서 0%의 범위내인 세포 응집체를 들 수가 있다.
"RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기에 이를 때까지의 기간"의 일자 수는 Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질의 종류, 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지의 종류, 타배양 조건 등에 따라 변화하지만, 예를 들어, 14일간 이내를 들 수가 있다. 보다 구체적으로는, 무혈청 배지(예를 들어, 기초 배지에 N2가 첨가된 무혈청 배지)가 사용되는 경우, 상기 기간으로서 바람직하게는, 예를 들어, 10일간 이내를 들 수가 있고 보다 바람직하게는, 예를 들어, 3일간에서 6일간을 들 수가 있다. 혈청 함유 배지(예를 들어, 기초 배지에 우태아 혈청이 첨가된 혈청 함유 배지)가 사용되는 경우, 상기 기간으로서 바람직하게는, 예를 들어, 12일간 이내를 들 수가 있고 보다 바람직하게는, 예를 들어, 6일간에서 9일간을 들 수가 있다.
이어서, 상기 서술한 바와 같이해 배양해 얻어진 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않는 세포 응집체"를, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 배양한다.
여기서, 바람직한 배양으로서는, 예를 들어, 부유 배양을 들 수가 있다.
무혈청 배지로서는, 기초 배지에 N2 또는 KSR가 첨가된 배지를 들 수가 있다. 혈청 함유 배지로서는, 기초 배지에 우태아 혈청이 첨가된 배지를 들 수가 있고 보다 구체적으로는, DMEM/F-12 배지에 우태아 혈청이 첨가된 혈청 함유 배지를 들 수가 있다.
상기 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지에, 이미 알려진 증식 인자, 증식을 촉진하는 첨가제나 화학 물질등을 첨가해도 된다. 이미 알려진 증식 인자로서는, EGF, FGF, IGF, 인슐린 등을 들 수가 있다. 증식을 촉진하는 첨가제로서 N2 서플리먼트(N2, Invitrogen사), B27 서플리먼트(Invitrogen사), KSR등을 들 수가 있다. 증식을 촉진하는 화학 물질로서는, 레티노이드류(예를 들어, 레티노인산), 타우린을 들 수가 있다.
바람직한 배양 시간으로서는, 예를 들어, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서의 상기 세포 응집체의 배양 개시시보다 증가해, 30% 이상이 될 때까지 실시하는 배양 시간을 들 수가 있다.
배양 온도, CO2 농도등의 배양 조건은 적절히 설정하면 된다. 배양 온도로서는, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃의 범위를 들 수가 있다. 바람직하게는, 예를 들어, 약 37℃ 전후를 들 수가 있다. 또, CO2 농도로서는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10%의 범위를 들 수가 있고, 바람직하게는, 예를 들어, 약 5% 전후를 들 수가 있다.
"모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"를 얻어지기까지의 상기의 배양 날짜는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지의 종류, 기타 배양 조건 등에 따라 변화하지만, 예를 들어, 100일간 이내를 들 수가 있다. 상기 배양 날짜로서 바람직하게는, 예를 들어, 20일간에서 70일간을 들 수가 있고 보다 바람직하게는, 예를 들어, 30일간에서 60일간을 들 수가 있다.
상기 서술한 바와 같이해 조제된 "모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"에 있어서는, 모양체 주연부 유사 구조체에 각각 인접해, 망막 색소 표피와 망막 조직(구체적으로는, 신경 망막)이 동일한 세포 응집체 내에 존재하고 있다. 당해 구조에 대해서는 현미경 관찰등으로 확인하는 것이 가능하다. 구체적으로는 예를 들어, Rax 유전자자리에 GFP 유전자가 노크인된 다능성 간세포(RAX::GFP 노크인 세포)로부터 제작한 세포 응집체의 경우, 형광 실체 현미경(예를 들어, Olympus 사제 SZX16)을 이용하면, RAX::GFP 강양성 부분인 신경 망막, 투과광에서 색소화가 관찰되는 상피조직인 망막 색소 표피, 및, 신경 망막과 망막 색소 표피의 경계 영역에 위치하는 특징적인 구조를 갖는 모양체 주연부 유사 구조체의 존재를 확인할 수 있다.
상기 서술한 바와 같이해 조제된 "모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"에 있어서는, 모양체 주연부 유사 구조체가, 2개의 신경 망막 조직의 사이의 영역에 형성된다, 즉, 신경 망막 조직과 모양체 주연부 유사 구조체와 추가의 신경 망막 조직이 연속한 조직이 형성되는 일도 있다. 이 경우, 모양체 주연부 유사 구조체의 부분이 인접하는 신경 망막 조직에 비해 얇다고하는 특징으로부터, 현미경 관찰등으로 모양체 주연부 유사 구조체의 존재를 확인하는 것이 가능하다.
본 발명 간세포 제조 방법 1의 공정 (1) 및 공정 (2)에서 사용되는 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"는, 예를 들어 특허문헌 1에 기재된 이하의 방법(이하, 본 세포 응집체 제조 방법 2로 기재하기도 함)에 의해 조제할 수도 있다： 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체의 제조 방법으로서, 망막 조직을 포함하는 세포 응집체이며, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20% 이상인 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기에 이를 때까지의 기간중에 한정해, 배양한 후, 얻어진 "RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않는 세포 응집체"를, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 배양하는 공정을 포함하는 방법.
상기의 본 세포 응집체 제조 방법 2의 스타트 원료로서 사용되는 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"는, 당해 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20% 이상인 세포 응집체이다. 상기 "Chx10 양성 세포의 존재 비율"로서는, 바람직하게는 40% 이상을 들 수가 있고 보다 바람직하게는 60% 이상을 들 수가 있다. 이러한 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체"의 조제 방법으로서는, 본 세포 응집체 제조 방법 1의 스타트 원료의 조제 방법으로서 전술한, (A) 및 (B)의 공정을 포함하는 방법, 또는 (C), (D) 및 (E)의 공정을 포함하는 방법을 들 수가 있다.
본 발명 간세포 제조 방법 1의 공정 (1)에 있어서는, 상기와 같이해 조제된 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"로부터 얻어진 세포를 부유 배양해, 레티노스피어를 얻는다.
"다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"로부터 얻어진 세포로서는, 상기의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"를 분산시켜 얻어진 세포, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분취된 세포를 분산시켜 얻어진 세포를 들 수가 있다. 이러한 세포를 증식 인자등의 존재하에서 저밀도로 부유 배양 하면, 1 개 세포, 또는, 약 2 내지 10 개 세포 정도의 소수의 세포에 유래하는 구상의 세포 응집체, 즉 레티노스피어가 형성된다.
"다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"로부터, 모양체 주연부 유사 구조체를 분리하는 방법으로서는, 예를 들어, 현미경하에서 미세 핀셋이나 메스등을 사용하여 자르는 방법을 들 수가 있다. "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"에 포함되는 모양체 주연부 유사 구조체의 존재는, 예를 들어 상기 서술한 방법에 의해 확인할 수 있다. "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"로부터 모양체 주연부 유사 구조체를 잘라 사용하는 것에 따라, 부유 배양 개시시의 세포에 있어서의 모양체 주연부 간세포의 함량을 높일 수가 있다.
"다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"로부터 세포를 분취하는 방법으로서는, 후술 되는 공정 (2)에서 행해지는 SSEA-1 양성 세포의 분취방법을 들 수가 있다.
세포 응집체, 모양체 주연부 유사 구조체 또는 세포를 분산시키는 방법으로서는, 예를 들어, 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리, 세포 보호제 첨가 처리를 들 수 있다. 이들의 처리를 조합하여도 된다. 바람직하게는, 세포 분산액 처리를 실시하고, 이어서 기계적 분산 처리를 하면 된다.
기계적 분산 처리 방법으로서는, 피펫팅 처리를 들 수 있다.
세포 분산액 처리에 사용되는 세포 분산액으로서는, 트립신, 콜라게나제, 히알유로니다제, 엘라스타제, 프로나제 또는 파파인 등의 효소류와 에틸렌디아민 4아세트산 등의 킬레이트제를 포함하는 용액을 들 수가 있다. 바람직하게는, 트립신, 파파인 또는 콜라게나제, 보다 바람직하게는, 파파인이 사용된다. 파파인을 포함하는 시판되는 세포 분산액을 사용할 수도 있다.
세포 보호제 첨가 처리에 사용되는 세포 보호제로서는, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질, EGF 시그널 전달 경로 작용 물질, 헤파린, ROCK 경로 저해 물질, 혈청, 또는 혈청 대체물을 들 수가 있다.
예를 들어, 세포 응집체, 모양체 주연부 유사 구조체 또는 세포를, 파파인을 포함하는 세포 분산액으로 처리해, 추가로 피펫팅에 의해 분산시킨다.
상기와 같이해 분산된 세포의 부유 배양에 사용되는 배지로서는, 신경세포 배양용 첨가물 및 증식 인자를 가한 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지를 들 수가 있다. 바람직하게는, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질 및 EGF 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지를 들 수가 있다.
상기의 배지에 ROCK 경로 저해 물질을 더하면, 레티노스피어의 형성 효율을 높일 수가 있다.
상기의 배지에, 헤파린을 더해도 좋다. 헤파린은, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질 및 EGF 시그널 전달 경로 작용 물질의 효과를 높이는 것이 알려져 있다.
상기의 부유 배양에 사용되는 FGF 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, FGF1, FGF2, FGF4, FGF10를 들 수가 있다. FGF 시그널 전달 경로 작용 물질로서 FGF2(bFGF)를 사용하는 경우의 농도로서는, 예를 들어, 약 1 ng/ml 내지 약 200 ng/ml의 범위, 바람직하게는, 약 5 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 범위, 보다 바람직하게는, 약 10 ng/ml 내지 약 50 ng/ml의 범위를 들 수가 있다.
EGF 시그널 전달 경로 작용 물질로서는, 예를 들어, EGF, TGF-alpha, HB-EGF를 들 수가 있다. EGF 시그널 전달 경로 작용 물질로서 EGF를 사용하는 경우의 농도로서는, 예를 들어, 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml의 범위, 바람직하게는, 약 5 ng/ml 내지 약 50 ng/ml의 범위, 보다 바람직하게는, 약 10 ng/ml 내지 약 40 ng/ml의 범위를 들 수가 있다.
ROCK 경로 저해 물질이란, Rho 키나아제에 의해 매개되는 시그널을 저해할 수 있는 물질이다. ROCK 경로 저해 물질로서는, 예를 들어, Y-27632, Fasudil를 들 수 있다. ROCK 경로 저해 물질은, 예를 들어 Y-27632의 경우, 약 0.01μM 내지 약 100μM, 바람직하게는 약 1μM 내지 약 30μM, 보다 바람직하게는 약 10μM의 농도가 되도록 첨가한다.
공정 (1)의 부유 배양에 있어서의 파종 세포 수에 관해서는, 예를 들어 약 1x102 세포/ml 내지 약 1x106 세포/ml의 범위, 바람직하게는, 약 1x103 세포/ml 내지 약 5x105 세포/ml의 범위, 보다 바람직하게는 약 5x103 세포/ml 내지 약 1x105 세포/ml의 범위를 들 수가 있다.
상기의 부유 배양에 사용되는 배양 기재로서는, 평평한 바닥의 저접착성 배양 기재가 바람직하다.
이와 같이 하여 형성된 레티노스피어에는, 자기 복제한 모양체 주연부 간세포가 포함된다. 부유 배양 개시시의 세포에 간세포가 많이 포함되어 있으면, 형성되는 레티노스피어의 수가 많아진다. 부유 배양 개시시의 세포에 포함되는 간세포의 자기 복제능이 높으면, 형성되는 레티노스피어의 사이즈(예를 들어, 직경)가 커진다. 형성된 레티노스피어는, 적절한 인자를 작용시키면 망막층 특이적 신경세포로 분화 시킬 수 있다.
본 발명 간세포 제조 방법 1의 공정 (2)에 있어서는, 상기 서술한 바와 같이해 조제된 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"로부터 얻어진 세포로부터 SSEA-1 양성 세포를 분취한다.
"다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"로부터 얻어진 세포로서는, 상기의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"를 분산시켜 얻어진 세포, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포, 또는, 상기 세포 응집체 혹은 모양체 주연부 유사 구조체로부터 형성된 레티노스피어를 분산시켜 얻어진 세포를 들 수가 있다. 이러한 세포로부터 SSEA-1 양성 세포를 분취한다.
"다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체"로부터 모양체 주연부 유사 구조체를 분리하는 방법은, 상기 서술된 공정 (1)을 위해서 실시되는 방법과 유사할 수 있다.
상기 세포 응집체 또는 모양체 주연부 유사 구조체로부터 레티노스피어를 형성시키는 방법으로서는, 공정 (1)에 관해서 상기 서술된 세포의 부유 배양에 의한 방법을 들 수가 있다.
세포 응집체, 모양체 주연부 유사 구조체 또는 레티노스피어를 분산시키는 방법으로서는, 공정 (1)에 관해서 상기 서술된 바와 같은 분산 처리를 들 수가 있다.
SSEA-1 양성 세포를 분취하는 방법으로서는, 플로우 사이토미터를 사용하는 방법 또는 자력을 사용하는 방법을 들 수가 있다. 플로우 사이토미터를 사용하는 방법으로서는, 예를 들어, SSEA-1 양성 세포를, 형광 표지된 항SSEA-1 항체를 사용하여 표지하고, 플로우 사이토미터로 선별해 분취하는 방법을 들 수가 있다. 자력을 사용한 방법으로서는, 예를 들어, SSEA-1 양성 세포를, 자력을 띤 항SSEA-1 항체를 사용하여 표지하고, 자기 세포 분리 장치(MACS)에서 선별해 분취하는 방법을 들 수가 있다.
항SSEA-1 항체로서는, SSEA-1 항원을 인식하는 항체이면 어떠한 항체도 사용할 수 있다. Chemicon사의 항SSEA-1 항체, BD사의 항SSEA-1 항체, Miltenyi Biotec 사의 항SSEA-1 항체등의 시판되는 항SSEA-1 항체를 이용할 수도 있다.
SSEA-1 양성 세포를 분취할 때에는, SSEA-1 양성인 것에 추가해, Rax 양성인 것, 또는, 색소화하지 않은 것도 지표로해 분취하여도 된다.
이와 같이 하여 분취된 SSEA-1 양성 세포 획분에는, 모양체 주연부 간세포가 포함된다. 분취된 SSEA-1 양성 세포 획분은, 적절한 인자를 작용시키면 망막층 특이적 신경세포로 분화 시킬 수 있다.
본 발명 간세포 제조 방법 2에 있어서는, 본 발명 간세포 제조 방법 1의 공정 (1)을 실시한다. 본 발명 간세포 제조 방법 2에 있어서, "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"로서는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체를 분산시켜 얻어진 세포, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포가 사용된다.
즉, 본 발명 간세포 제조 방법 2는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포를 부유 배양해, 레티노스피어를 얻는 공정을 실시함을 포함하는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 간세포의 제조 방법이다.
본 발명 간세포 제조 방법 3에 있어서는, 본 발명 간세포 제조 방법 1의 공정 (2)를 실시한다. 본 발명 간세포 제조 방법 3에 있어서, "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"로서는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체를 분산시켜 얻어진 세포, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포가 사용된다.
즉, 본 발명 간세포 제조 방법 3은, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포로부터 SSEA-1 양성 세포를 분취하는 공정을 실시함을 포함하는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 간세포의 제조 방법이다.
본 발명 간세포 제조 방법 4에 있어서는, 본 발명 간세포 제조 방법 1의 공정 (1)에 계속해서 공정 (2)를 실시한다. 상기 공정 (1)에 있어서의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"로서는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체를 분산시켜 얻어진 세포, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포가 사용된다. 상기 공정 (2)에 있어서의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"로서는, 상기 공정 (1)로 얻어진 레티노스피어를 분산시켜 얻어진 세포가 사용된다.
즉, 본 발명 간세포 제조 방법 4는,
(1) 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포를 부유 배양해, 레티노스피어를 얻는 공정; 및
(2) 상기 공정 (1)로 얻어진 레티노스피어를 분산시켜 얻어진 세포로부터 SSEA-1 양성 세포를 분취하는 공정을 실시함을 포함하는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 간세포의 제조 방법이다.
본 발명 간세포 제조 방법 5에 있어서는, 본 발명 간세포 제조 방법 1의 공정 (2)에 계속해서 공정 (1)을 실시한다. 상기 공정 (2)에 있어서의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"로서는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체를 분산시켜 얻어진 세포, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포가 사용된다. 상기 공정 (1)에 있어서의 "다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 얻어진 세포"로서는, 상기 공정 (2)로 분취된 세포로부터 분산된 세포가 사용된다.
즉, 본 발명 간세포 제조 방법 5는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체, 또는, 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포로부터 SSEA-1 양성 세포를 분취하는 공정, 및 상기 공정으로 분취된 세포로부터 분산된 세포를 부유 배양해, 레티노스피어를 얻는 공정을 실시함을 포함하는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 간세포의 제조 방법이다.
본 발명 간세포 제조 방법 1 내지 5의 어느 하나(이하, 본 발명 간세포 제조 방법이라고 기재하기도 함)에 의해 얻어진 레티노스피어 또는 SSEA-1 양성 세포 획분은, 모양체 주연부 간세포를 높은 비율로 포함하는 세포군으로서 사용할 수 있다.
본 발명 간세포 제조 방법에 의해 얻어진 모양체 주연부 간세포를, Notch 시그널 저해 물질, 레티노이드 및 타우린으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질의 존재하에 배양함으로써, 망막층 특이적 신경세포를 제조할 수 있다.
모양체 주연부 간세포로서는, 본 발명 간세포 제조 방법에 의해 얻어진 레티노스피어에 포함되는 모양체 주연부 간세포, 및, 본 발명 간세포 제조 방법에 의해 얻어진 SSEA-1 양성 세포 획분에 포함되는 모양체 주연부 간세포를 들 수 있다.
예를 들어, 상기 레티노스피어 또는 상기 SSEA-1 양성 세포 획분을 신경 분화에 적절한 조건에서 배양한다. 상기 레티노스피어 또는 상기 SSEA-1 양성 세포 획분을 분산시켜 얻어진 세포를 유사하게 배양해도 된다.
이러한 배양에 사용되는 배지로서는, Notch 시그널 저해 물질, 레티노이드 및 타우린으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지를 들 수가 있다. 예를 들어, 상기 레티노스피어, 상기 SSEA-1 양성 세포 획분, 또는 이들을 분산시켜 얻어진 세포를, FGF 시그널 전달 경로 작용 물질 및 EGF 시그널 전달 경로 작용 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 일정 기간 배양한 후, Notch 시그널 저해 물질, 레티노이드 및 타우린으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 포함하는 혈청 함유 배지 또는 무혈청 배지내에서 배양해도 된다. 이들의 배지에는, B27 서플리먼트(Invitrogen사) 등의 첨가제가 적절히 첨가 되어 있어도 된다.
여기서 "Notch 시그널 저해 물질"로서는, Notch 시그널의 활성을 저해하는 물질이면 되고, 예를 들어, γ-세크레타제 저해 물질, Notch 수용체 저해 물질, Dll 저해 물질, 및, Hes 저해 물질을 들 수 있다. 상기γ-세크레타제 저해 물질로서는, DAPT(N-[N-(3, 5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸에스테르)를 들 수 있다. Notch 시그널 저해 물질로서 DAPT를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 약 0.01μM 내지 약 100μM의 농도가 되도록 첨가한다.
모양체 주연부 간세포의 배양에 사용되는 배양 기재로서는, 예를 들어, 부유 배양 용기재, 및, 접착 배양 용기재를 들 수 있다. 접착 배양할 때의 배양접시의 코팅재로서는, 폴리-D-리신, 폴리-L-리신, 폴리오르니틴, 라미닌, 엔탁틴, 마트리겔, 또는, 젤라틴을 들 수 있다.
모양체 주연부 간세포는, 예를 들어, 37℃, CO2 농도가 5%, 산소 농도가 20%에서 40%에서 배양된다.
상기의 배양에 의해 얻어진 세포가 망막층 특이적 신경세포를 포함하는가의 여부는, 예를 들어, 세포 마커의 발현을 조사하는 것으로 확인할 수 있다.
본 발명은, 본 발명 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포의 독성이나 약효의 평가용 시약으로서의 용도나, 본 발명의 제조 방법에 의해 제조되는 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포의 이식용 생체 재료로서의 용도 등도 포함한다.
본 발명 방법에 의해 제조된 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포는, 망막 세포의 장해에 따른 질환의 치료약의 스크리닝, 질환 연구 재료, 창약 재료로서 이용 가능하다. 본 발명 방법에 의해 제조된 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포는, 화학 물질등의 독성이나 약효의 평가에 있어서, 광 독성, 신경 독성등의 독성 연구, 독성 시험등에 활용 가능하다. 예를 들어, 본 발명 방법에 의해 제조된 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포에 시험 물질을 접촉시켜, 그 물질이 그 세포에 미치는 영향을 어세이함으로써, 그 물질의 독성 또는 약효를 평가한다.
본 발명 방법에 의해 제조된 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포는, 세포 손상 상태에 있어서, 장해를 받은 조직 자체를 보충하는(예를 들어, 이식 수술에 사용하는) 등에 사용하는 이식용 생체 재료로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명 방법에 의해 제조된, 유효량의 모양체 주연부 간세포 또는 망막층 특이적 신경세포를, 이식을 필요로하는 대상으로 이식함으로써, 망막 조직의 장해에 따른 질환을 치료한다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1：다능성 간세포로부터의 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체의 제조
RAX::GFP 노크인 인간 ES세포(KhES-1 유래; Nakno 등, Cell Stem Cell, 2012, 10(6), 771-785)을 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2006, 103(25), 9554-9559" 및 "Nat. Biotech., 2007, 25, 681-686"에 기재된 방법으로 준해 배양했다. 배지에는 DMEM/F-12 배지(Sigma)에 20% KSR(KnockoutTM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 1 x 비필수 아미노산, 8 ng/ml bFGF를 첨가한 배지를 사용한다.
배양된 상기 ES세포를, TrypLE Express(Invitrogen)를 사용하여 단일 분산시켰다. 단일 분산된 ES세포를 비세포 접착성의 96 구멍 배양 플레이트(SUMILON spheroid plate, 스미토모 베이크라이트사)의 1 웰 당 1.2x104 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지에 부유시켜, 응집체를 신속하게 형성시킨 후, 37℃, 5% CO2로 배양했다. 그 때의 무혈청 배지에는, F-12 배지와 IMDM 배지의 1：1 혼합액에 10% KSR, 450μM 1-모노 티오 글리세롤, 1 x Chemically Defined Lipid Concentrate, 20μM Y27632를 첨가한 무혈청 배지를 사용한다. 부유 배양 개시 후 6일째에 종농도 1.5 nM의 BMP4를 첨가해 부유 배양을 계속했다. 웰내의 배양액의 반량을 3일 간격으로, BMP 시그널 전달 경로 작용 물질이 첨가되어 있지 않은 상기 배지와 교환했다.
이와 같이 하여 조제된 부유 배양 개시 후 18일째의 망막 조직을 포함하는 세포 응집체를, 3μM CHIR99021(Wnt 시그널 경로 작용 물질) 및 5μM SU5402(FGF 시그널 경로 저해 물질)를 포함하는 무혈청 배지로 6일간, 즉 부유 배양 개시 후 24일째까지 배양했다. 그 때에 이용된 무혈청 배지는, DMEM/F-12 배지에 1% N2 서플리먼트(Invitrogen)가 첨가된 무혈청 배지이다.
얻어진 부유 배양 개시 후 24일째의 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, 1% N2 서플리먼트, 0.5μM 레티노인산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)로, 40% O2 조건 아래에서 추가로 11일간, 즉 부유 배양 개시 후 35일째까지 부유 배양해, 얻어진 세포 응집체를 형광 현미경으로 관찰했다. 당해 세포 응집체(부유 배양 개시 후 35일째)의 위상차 상(A) 및 GFP 형광상(B)을 도 1에 나타낸다. 당해 세포 응집체에는, Rax 유전자 발현 양성의 신경 망막과 색소 침착한 망막 색소 표피가 형성되어 그 경계부에 모양체 주연부 유사 구조체(도면 중 화살표)가 형성되었음을 발견하였다.
실시예 2：다능성 간세포로부터의 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체의 제조
실시예 1에 기재된 방법에 의해 조제된 단일 분산된 RAX::GFP 노크인 인간 ES세포를, 비세포 접착성의 96 구멍 배양 플레이트 (SUMILON spheroid plate, SUMITOMO BAKELITE CO., LTD.)의 1 웰 당 9x103 세포가 되도록 100μl의 무혈청 배지에 부유시켜, 37℃, 5% CO2로 부유 배양했다. 그 때에 이용된 무혈청 배지는, G-MEM 배지에 20% KSR, 0.1 mM 2-메르캅토에탄올, 1 mM 피루브산, 20μM Y27632 및 3μM IWR1e(Wnt 시그널 경로 저해 물질)가 첨가된 무혈청 배지이다. 부유 배양 중, 부유 배양 개시 후 2일째부터 용적 당 1/100량의 GFR Matrigel™(BD Biosciences)를 첨가했다. 부유 배양 개시 후 12일째에 용적 당 1/10량의 우태아 혈청 및 100 nM SAG(Shh 시그널 경로 작용 물질)를 첨가해, 부유 배양 개시 후 18일째까지 부유 배양했다.
부유 배양 개시 후 18일째의 망막 조직을 포함하는 세포 응집체를, 3μM CHIR99021(Wnt 시그널 경로 작용 물질)를 포함하는 무혈청 배지로 2일간, 즉 부유 배양 개시 후 20일째까지 부유 배양했다. 그 때에 이용된 무혈청 배지는, DMEM/F-12 배지에 1% N2 서플리먼트(Invitrogen)가 첨가된 무혈청 배지이다.
부유 배양 개시 후 20일째의 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질을 포함하지 않는 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, 1% N2 서플리먼트, 0.5μM 레티노인산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)로, 40% O2 조건 아래에서 추가로 40일간, 즉 부유 배양 개시 후 60일째까지 부유 배양해, 얻어진 세포 응집체를 형광 현미경으로 관찰했다. 당해 세포 응집체(부유 배양 개시 후 60일째)의 위상차 상(A) 및 GFP 형광상(B)을 도 2에 나타낸다. 당해 세포 응집체에는, Rax 유전자 발현 양성의 신경 망막과 색소 침착한 망막 색소 표피가 형성되어 그 경계부에 모양체 주연부 유사 구조체(도면 중 화살표)가 형성되었음을 발견하였다.
실시예 3：다능성 간세포로부터의 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체의 제조 및 마커 발현의 해석
실시예 1에 기재된 방법에 의해 조제된 부유 배양 개시 후 24일째의 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, 1% N2 서플리먼트, 0.5μM 레티노인산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)로, 40% O2 조건 아래에서 추가로 39일간, 즉 부유 배양 개시 후 63일째까지 부유 배양했다. 얻어진 부유 배양 개시 후 63일째의 세포 응집체를 4% 파라포름알데히드로 고정해, 동결 절편을 조제했다. 조제된 동결 절편에 대해, 신경 망막 선구 세포 마커의 하나인 Chx10(도 3 A), 모양체 주연부의 마커의 하나인 Otx1(도 3 B), 모양체 주연부의 마커의 하나인 Rdh10(도 3 C), 광수용체 세포 마커의 하나인 Crx(도 3 D), 또는, 신경절 세포를 포함하는 신경세포의 마커의 하나인 TuJ1(도 3 E)의 면역 염색을 실시했다. 당해 세포 응집체에는, Chx10 양성(도 3 A), Otx1 양성(도 3 B) 및 Rdh10 양성(도 3 C)의 모양체 주연부 유사 구조체(도면 중 화살표)가 형성되었음을 발견하였다. 당해 모양체 주연부 유사 구조체(도면 중 화살표)는, Crx 음성(도 3 D) 및 TuJ1 음성(도 3 E)이었다.
부유 배양 개시 후 63일째의 세포 응집체로부터 조제된 상기 동결 절편에 대해, SSEA-1의 면역 염색을 실시했다. 상기 세포 응집체 중에서, 모양체 주연부 유사 구조체에 국한해 SSEA-1이 발현하고 있는 것을 발견하였다(도 3 F). 당해 SSEA-1 양성 세포에 있어서 색소 침착은 인정되지 않았다.
이상의 결과로부터, 부유 배양 개시 후 63일째의 상기 세포 응집체에 포함되는 모양체 주연부 유사 구조체에는, Chx10 양성, Otx1 양성, Rdh10 양성, Crx 음성, TuJ1 음성 및 SSEA-1 양성이며, 색소 침착이 없는 세포가 존재하는 것을 알 수 있었다.
실시예 4：모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터의 모양체 주연부 유사 구조체의 분리
실시예 1에 기재된 방법에 의해 조제된 부유 배양 개시 후 24일째의 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, 1% N2 서플리먼트, 0.5μM 레티노인산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)로, 40% O2 조건 아래에서 추가로 66일간, 즉 부유 배양 개시 후 90일째까지 부유 배양했다. 얻어진 부유 배양 개시 후 90일째의 세포 응집체로부터, Rax 양성의 신경 망막부, 및, 신경 망막과 망막 색소 표피의 경계부에 존재하는 모양체 주연부 유사 구조체를 따로 따로, 형광 실체 현미경에 의한 관찰하에, 메스와 핀셋을 사용하여 잘랐다.
얻어진 신경 망막부 및 모양체 주연부 유사 구조체를 각각, 파파인을 포함하는 분산액(신경세포 분산액, 스미토모 베이크라이트)을 사용하여 분산시켜 세포 현탁액을 조제했다. 각각의 세포 현탁액을, 세포가 생존한 상태로, 형광 표지된 항SSEA-1 항체(Anti-SSEA1, Cy3 conjugated; Chemicon)로 면역 염색해, 형광 현미경으로 관찰했다. 발현한 GFP의 형광을 Rax 유전자 발현의 지표로하고, 상기 항SSEA-1 항체의 Cy3의 형광을 SSEA-1 발현의 지표로 했다. 결과를 도 4에 나타낸다. 신경 망막부로부터 조제된 상기 세포 현탁액에서는, Rax 양성 및 SSEA-1 음성의 세포의 비율이 대략 80%, Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포의 비율은 대략 10%, Rax 음성 세포가 대략 10%인(도 4 A, B) 것에 대해, 모양체 주연부 유사 구조체로부터 조제된 상기 세포 현탁액에서는, Rax 양성 및 SSEA-1 음성의 세포의 비율이 대략 30%, Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포의 비율은 대략 50%, Rax 음성 세포가 대략 20%였다(도 4 C, D). 양체 주연부 유사 구조체를 세포 응집체로부터 자르는 조작에 의해, 상기 세포 응집체에 포함되는 Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포를 정제할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 5：모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체에 포함되는 Rax 양성 및 SSEA-1 양성 세포에 있어서의 색소 침착의 해석
실시예 4에 기재된 방법에 의해 조제된 부유 배양 개시 후 90일째의 세포 응집체로부터, 실시예 4와 동일한 방법으로, 망막 색소 표피와 모양체 주연부 유사 구조체를 함께, 형광 실체 현미경에 의한 관찰하에 메스와 핀셋을 사용하여 잘랐다.
얻어진 망막 색소 표피 및 모양체 주연부 유사 구조체를, 실시예 4와 동일한 방법으로 파파인을 포함하는 분산액을 사용하여 분산시켜 세포 현탁액을 조제했다. 얻어진 세포 현탁액을, 세포가 생존한 상태로, 형광 표지된 항SSEA-1 항체(Anti-SSEA1, Cy3 conjugated; Chemicon)에서 면역 염색해, 형광 현미경으로 관찰했다. 결과를 도 5에 나타낸다. SSEA-1 양성(도 5 A, 화살표) 또한 Rax 양성의 세포(도 5 B, 화살표)에서, 색소 침착은 관찰되지 않았다(도 5 C, 화살표).
실시예 6：모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터의 레티노스피어 형성
실시예 1에 기재된 방법에 의해 조제된 부유 배양 개시 후 24일째의 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, 1% N2 서플리먼트, 0.5μM 레티노인산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)로, 40% O2 조건 아래에서 추가로 39일간, 즉 부유 배양 개시 후 63일째까지 부유 배양했다. 얻어진 부유 배양 개시 후 63일째의 세포 응집체를, 실시예 4와 동일한 방법에 의해 파파인을 포함하는 분산액을 사용하여 분산시켜 세포 현탁액을 조제했다. 얻어진 세포 현탁액에 포함되는 세포를, DMEM/F-12 배지에, bFGF(20 ng/ml), EGF(20 ng/ml), 헤파린(5μg/ml), B27(50배 희석)가 첨가된 무혈청 배지에서, 1x105 세포/ml의 세포 밀도로 10일간 부유 배양했다. 그 결과, 구상의 세포 응집체(레티노스피어)가 형성되었다. 부유 배양 개시 후 63일째의 상기 세포 응집체에는, 증식능을 갖는 세포가 포함되는 것을 발견하였다.
얻어진 레티노스피어를 4% 파라포름알데히드로 고정해, Rax 유전자의 발현을 GFP의 발현을 지표로서 조사하고, Chx10 및 SSEA-1의 발현을 면역 염색으로 조사했다. 결과를 도 6에 나타낸다. 상기 레티노스피어를 형성하는 세포의 90% 정도가 Rax 양성(도 6 A) 또한 Chx10 양성(도 6 B)의 세포, 즉 망막 선구 세포 마커 및 신경 망막 선구 세포 마커를 발현하는 세포인 것을 알 수 있었다. 상기 레티노스피어는, Rax 양성(도 6 C) 또한 SSEA-1 양성(도 6 D)의 세포를 40% 정도 포함하고 있었다.
상기의 배양 예에 있어서, 상기 세포 현탁액에 포함되는 1 내지 10 개 세포 정도의 세포를 출발 재료로하여, 50에서 500 개 세포 정도의 세포를 포함하는 레티노스피어가 형성된다. 따라서, 상기 세포 현탁액에 포함되는 1 내지 10 개 세포 정도의 세포로부터, 대략 20에서 200 개 세포 정도의 Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포가 형성된 것이다. 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 상기 세포 응집체로부터 얻어진 세포를 부유 배양함으로써, Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포를 효율적으로 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 7：모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체로부터의 레티노스피어 형성
실시예 1에 기재된 방법에 의해 조제된 부유 배양 개시 후 24일째의 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, 1% N2 서플리먼트, 0.5μM 레티노인산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)로, 40% O2 조건 아래에서 추가로 46일간, 즉 부유 배양 개시 후 70일째까지 부유 배양했다. 얻어진 부유 배양 개시 후 70일째의 세포 응집체로부터, 형광 실체 현미경에 의한 관찰하에, 메스와 핀셋을 사용하여, 신경 망막부 및 모양체 주연부 유사 구조체를 따로 따로 잘랐다.
얻어진 신경 망막부 및 모양체 주연부 유사 구조체를 각각, 실시예 4와 동일한 방법에 의해 파파인을 포함하는 분산액을 사용하여 분산해 세포 현탁액을 조제했다. 각각의 세포 현탁액에 포함되는 세포를, DMEM/F-12 배지에, bFGF(20 ng/ml), EGF(20 ng/ml), 헤파린(5μg/ml), B27(50배 희석)가 첨가된 무혈청 배지에서, 저접착 처리된 평평한 바닥의 96 웰 디쉬(Nunc 사제) 1 웰 당 1000 세포씩(5x103 세포/ml) 파종해, 37℃로 10일간 부유 배양해, 레티노스피어를 형성시켰다. 형성된 레티노스피어는 Rax 양성(도 7 B)으로, 색소 침착이 없는(도 7 A) 것을 발견하였다. 형성된 레티노스피어(1차 레티노스피어)의 수와 사이즈(직경)를 도 7 C 및 D에 나타낸다. 상기 신경 망막부 및 모양체 주연부 유사 구조체는, 자기 복제능을 갖는 세포를 포함하는 것을 발견하였다. 신경 망막부로부터 얻어진 세포(NR)에 비해, 모양체 주연부 유사 구조체로부터 얻어진 세포(CMZ)가, 레티노스피어의 형성 효율이 높았다(도 7 C). 신경 망막부로부터 얻어진 세포(NR)에 비해, 모양체 주연부 유사 구조체로부터 얻어진 세포(CMZ)가, 형성된 레티노스피어의 사이즈가 큰 것을 발견하였다(도 7 D). 모양체 주연부 유사 구조체로부터 형성된 상기 레티노스피어는, Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포를 포함하고 있었다. 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체로부터 얻어진 세포를 부유 배양함으로써, Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포를 효율적으로 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다.
신경 망막부를 분산시켜 얻어진 세포로부터 형성된 상기 레티노스피어, 및, 모양체 주연부 유사 구조체를 분산시켜 얻어진 세포로부터 형성된 상기 레티노스피어로부터 각각 세포 현탁액을 조제해, 실시예 6에 기재된 방법으로 배양함으로써, 2차 레티노스피어를 형성시켰다. 형성된 레티노스피어의 수와 사이즈(직경)를 도 7 E 및 F에 나타낸다. 상기 1차 레티노스피어에는, 자기 복제능을 갖는 세포를 포함하는 것을 발견하였다. 신경 망막부 유래의 세포(NR)에 비해, 모양체 주연부 유사 구조체 유래의 세포(CMZ)가, 2차 레티노스피어의 형성 효율이 높았다(도 7 E). 신경 망막부로부터 얻어진 세포(NR)에 비해, 모양체 주연부 유사 구조체로부터 얻어진 세포(CMZ)가, 형성된 2차 레티노스피어의 사이즈가 큰 것을 발견하였다(도 7 F). 모양체 주연부 유사 구조체 유래의 세포로부터 형성된 상기2차 레티노스피어는 Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포를 포함하고 있었다. 상기와 같이 레티노스피어 형성 배양을 반복하는 것으로, Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포를 확대 배양할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 8：모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체로부터의 SSEA-1 양성 세포의 분취
실시예 1에 기재된 방법에 의해 조제된 부유 배양 개시 후 24일째의 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, 1% N2 서플리먼트, 0.5μM 레티노인산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)로, 40% O2 조건 아래에서 추가로 36일간, 즉 부유 배양 개시 후 60일째까지 부유 배양했다. 얻어진 부유 배양 개시 후 60일째의 세포 응집체로부터 모양체 주연부 유사 구조체를 잘라, 실시예 4와 동일한 방법에 의해 파파인을 포함하는 분산액을 사용하여 분산시켜 세포 현탁액을 조제했다. 얻어진 세포 현탁액을, 세포가 생존한 상태로, 형광 표지된 항SSEA-1 항체(SSEA1-APC, BD사제)에서 면역 염색해, 셀 소터(ARIA2, BD사제)를 사용하여 FACS 해석했다. 결과를 도 8에 나타낸다. 상기 세포 현탁액에 포함되는 세포중 약 50%가, Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포인 것을 알 수 있었다(도 8 A). 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 상기 세포 응집체로부터, 상기 모양체 주연부 유사 구조체를 자르는 것으로, 순도 50% 정도의 Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포를 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다.
셀 소터(ARIA2, BD사제)를 사용하여 상기 세포 현탁액으로부터, Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포(도 8 A의 Q2)와 Rax 음성이고 SSEA-1 양성의 세포(도 8 A의 Q4)를 분획할 수 있었다. Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포 획분(Fraction 1) 및 Rax 음성이고 SSEA-1 양성의 세포 획분(Fraction 2)를 분취하고 FACS에 의해 해석했다. Fraction 1에 포함되는 세포중 87%가 Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포이며(도 8 B), Fraction 2에 포함되는 세포 가운데, 82%가 Rax 양성 및 SSEA-1 음성의 세포인(도 8 C) 것을 발견하였다. 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 상기 모양체 주연부 유사 구조체를 분취한 후 이것을 분산시켜, 얻어진 세포 현탁액으로부터 SSEA-1 양성 세포를 분취함으로써, 순도 87% 정도의 Rax 양성 및 SSEA-1 양성세포를 제조가능함이 밝혀졌다.
실시예 9：모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체로부터의 SSEA-1 양성 세포의 분취와 분취된 세포로부터의 레티노스피어 형성
실시예 8에 기재된 방법으로 셀 소터에서 분취한, Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포 획분과 Rax 양성 및 SSEA-1 음성의 세포 획분을 각각, 실시예 7에 기재된 방법으로 배양함으로써, 레티노스피어를 형성시켰다. 형성된 레티노스피어는, Rax 양성이며(도 9 B), 색소 침착은 없었다(도 9 A). 형성된 레티노스피어의 수와 사이즈(직경)를 도 9 C 및 D에 나타낸다. Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포 획분으로부터는, Rax 양성 및 SSEA-1 음성의 세포 획분과 비교해, 고효율로 레티노스피어가 형성되는 것을 알 수 있었다(도 9 C). Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포로부터는, Rax 양성 및 SSEA-1 음성의 세포와 비교해, 형성된 레티노스피어의 사이즈가 큰 것을 발견하였다(도 9 D). 나아가 Rax 양성 및 SSEA-1 양성 세포로부터 형성된 레티노스피어에는, Rax 양성 및 SSEA-1 양성 세포가 80% 이상 포함되어 있는 것이 확인되었다. 상기 방법에 의해 제조된 Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포에는, Rax 양성 및 SSEA-1 음성의 세포와 비교해, 자기 복제능을 갖는 세포가 보다 많이 포함되는 것, 당해 Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포는 레티노스피어 형성 배양에 의해 확대 배양할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 10：ROCK 저해제 첨가에 의한 레티노스피어 제조 효율의 향상
실시예 1에 기재된 방법에 의해 조제된 부유 배양 개시 후 24일째의 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, 1% N2 서플리먼트, 0.5μM 레티노인산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)로, 40% O2 조건 아래에서 추가로 39일간, 즉 부유 배양 개시 후 63일째까지 부유 배양했다. 얻어진 부유 배양 개시 후 63일째의 세포 응집체를, 실시예 4와 동일한 방법에 의해 파파인을 포함하는 분산액을 사용하여 분산시켜 세포 현탁액을 조제했다. 얻어진 세포 현탁액에 포함되는 세포를, DMEM/F-12 배지에, bFGF(20 ng/ml), EGF(20 ng/ml), 헤파린(5μg/ml), B27(50배 희석)가 첨가된 무혈청 배지로, 10μM Y-27632(ROCK 저해제) 존재하 또는 비존재하에서, 1x105 세포/ml의 세포 밀도로 10일간 부유 배양했다. 그 결과, 구상의 세포 응집체(레티노스피어)가 형성된다. 이 때, Y-27632 비존재하에서는 레티노스피어가 1300개 형성된 것에 대해, Y-27632 존재하에서는 레티노스피어가 1976개 형성되었다. 즉, ROCK 저해제 첨가에 의해, 레티노스피어의 형성 효율이 상승하는 것을 알 수 있었다.
실시예 11：레티노스피어로부터의 광수용체 세포의 제조
실시예 4에 기재된 방법으로 조제된 모양체 주연부 유사 구조체로부터, 실시예 7에 기재된 방법으로 1차 레티노스피어 및 2차 레티노스피어를 형성시켰다. 얻어진 1차 레티노스피어 및 2차 레티노스피어를 각각, 폴리-D-리신 및 라미닌으로 코트한 세포 배양 디쉬상에 파종해, 무혈청 배지(DMEM/F-12 배지에, bFGF(20 ng/ml), EGF(20 ng/ml), B27(50배 희석)가 첨가된 배지)에서 4일간 배양한 후, 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, B27, 0.5μM 레티노인산, 100μM 타우린 및 10μM DAPT가 첨가된 배지)에서, 40% O2, 5% CO2, 37℃의 조건으로, 10일간 배양했다. 얻어진 세포를, 파라포름알데히드로 고정해, Rax 유전자의 발현을 나타낸다. GFP 형광상과 광수용체 세포 마커의 하나인 Crx에 대한 항체를 사용한 면역 염색상을 관찰했다. 결과를 도 10에 나타낸다. 상기 1차 레티노스피어 및 2차 레티노스피어 각각으로부터, Rax 양성(도 10 A 및 C) 또한 Crx 양성(도 10 B 및 D)의 광수용체로 분화할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 12：레티노스피어로부터의 아마크린 세포, 신경절 세포의 제조
실시예 4에 기재된 방법으로 조제된 모양체 주연부 유사 구조체로부터, 실시예 7에 기재된 방법으로 1차 레티노스피어 및 2차 레티노스피어를 형성시켰다. 얻어진 2차 레티노스피어를 각각, 폴리-D-리신 및 라미닌으로 코팅한 세포 배양 디쉬에 파종해, 무혈청 배지(DMEM/F-12 배지에, bFGF(20 ng/ml), EGF(20 ng/ml), B27(50배 희석)가 첨가된 배지)에서 2일간 배양한 후, 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, B27, 0.5μM 레티노인산, 100μM 타우린 및 10μM DAPT가 첨가된 배지)에서, 40% O2, 5% CO2, 37℃의 조건으로, 10일간 배양했다. 얻어진 세포를, 파라포름알데히드로 고정하고, Rax 유전자의 발현을 나타내는 GFP 형광상(도 11 B), 아마크린 세포 마커의 하나인 Calretinin에 대한 항체를 사용한 면역 염색상(도 11 A), 신경절 세포에 대해 공양성 마커인 Pax6 및 TuJ1에 대한 항체를 각각 사용한 면역 염색상(도 11 C 및 D)을 관찰했다. 결과를 도 11에 나타낸다. 상기 2차 레티노스피어로부터, Calretinin 양성의 아마크린 세포(도 11 A, B), 및, Pax6 및 TuJ1 양성의 신경절 세포(도 11 C, D)가 분화할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 13：SSEA1 양성 세포로부터 형성된 레티노스피어로부터의, 광수용체 세포, 아마크린 세포, 및, 신경절 세포의 제조
실시예 4에 기재된 방법으로 조제된 모양체 주연부 유사 구조체로부터, 실시예 8에 기재된 방법으로 셀 소터에서 분취한 Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포 획분을, 실시예 7에 기재된 방법으로 배양함으로써, 레티노스피어를 형성시켰다. 얻어진 레티노스피어를 각각, 폴리-D-리신 및 라미닌으로 코팅한 세포 배양 디쉬에 파종해, 무혈청 배지(DMEM/F-12 배지에, bFGF(20 ng/ml), EGF(20 ng/ml), B27(50배 희석)가 첨가된 배지)에서 2일간 배양한 후, 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, B27, 0.5μM 레티노인산, 100μM 타우린 및 10μM DAPT가 첨가된 배지)에서, 40% O2, 5% CO2, 37℃의 조건으로, 10일간 배양했다. 얻어진 세포를, 파라포름알데히드로 고정하고, Rax 유전자의 발현을 나타내는 GFP 형광상(도 12 B, F), 광수용체 세포 마커의 하나인 Crx(도 12 A), 아마크린 세포 마커의 하나인 Calretinin(도 12 E), 신경절 세포에 공양성 마커인 Pax6 및 TuJ1(도 12 C, D)에 대한 항체를 각각 사용한 면역 염색상을 관찰했다. 결과를 도 12에 나타낸다. 상기 레티노스피어로부터, Rax 양성 및 Crx 양성의 광수용체 세포(도 12 A, B, 화살표), Calretinin 양성의 아마크린 세포(도 12 E, F, 화살표), 및 Pax6 및 TuJ1 양성의 신경절 세포(도 12 C, D, 화살표)가 분화할 수 있는 것을 알 수 있었다.
실시예 14：모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체로부터의 SSEA-1 양성 세포의 분취와 분취된 세포로부터의 레티노스피어 형성
실시예 1에 기재된 방법에 의해 조제된 부유 배양 개시 후 24일째의 세포 응집체를, Wnt 시그널 경로 작용 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하지 않는 혈청 함유 배지(DMEM/F-12 배지에, 10% 우태아 혈청, 1% N2 서플리먼트, 0.5μM 레티노인산 및 100μM 타우린이 첨가된 배지)로, 40% O2 조건 아래에서 추가로 55일간, 즉 부유 배양 개시 후 79일째까지 부유 배양했다. 얻어진 부유 배양 개시 후 79일째의 세포 응집체로부터 모양체 주연부 유사 구조체를 잘라, 실시예 4와 동일한 방법에 의해 파파인을 포함하는 분산액을 사용하여 분산시켜 세포 현탁액을 조제했다. 얻어진 세포 현탁액(소팅되지 않은 획분)을, 세포가 생존한 상태로, 자기 비즈 표지된 항SSEA-1 항체(Miltenyi Biotec 사제)에서 면역 염색해, 자기 세포 분리 장치(MACS, Miltenyi Biotec 사제)를 사용하여, SSEA-1 양성 세포 획분과 SSEA-1 음성 세포 획분을 분취 했다.
얻어진 SSEA-1 양성 세포 획분과 SSEA-1 음성 세포 획분을, 실시예 8에 기재된 방법에 의해 각각 FACS 해석했는데, SSEA-1 양성 세포 획분에 포함되는 세포중 64%가 SSEA-1 양성 세포이며, SSEA-1 음성 세포 획분에 포함되는 세포중 5%가 SSEA-1 양성 세포인 것을 알 수 있었다. 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체로부터 상기 모양체 주연부 유사 구조체를 분취한 후 이것을 분산시켜, 얻어진 세포 현탁액으로부터 SSEA-1 양성 세포 획분을 분취함으로써, 순도 64% 정도의 SSEA-1 양성의 세포를 제조할 수 있는 것을 알 수 있었다.
상기 소팅되지 않은 획분, SSEA-1 양성 세포 획분, 및, SSEA-1 음성 세포 획분을, 실시예 7에 기재된 방법으로 배양함으로써, 레티노스피어를 형성시켰다. 형성된 레티노스피어는, Rax 양성이며(도 13 B), 색소 침착은 없었다(도 13 A). 형성된 레티노스피어의 수를 도 13 C에 나타낸다. 소팅되지 않은 획분으로부터 형성된 레티노스피어의 수(도 13 C, "소팅되지 않은")와 비교해, SSEA-1 음성 세포 획분으로부터 형성된 레티노스피어의 수(도 13 C, "SSEA1-")가 적고, SSEA-1 양성 세포 획분으로부터 형성된 레티노스피어의 수(도 13 C, "SSEA1+")가 많은 것을 발견하였다. SSEA-1 양성 세포 획분으로부터 형성된 레티노스피어는, SSEA-1 음성 세포 획분으로부터 형성된 레티노스피어와 비교해, 사이즈가 큰 것을 발견하였다. SSEA-1 양성 세포 획분으로부터 형성된 레티노스피어에는, Rax 양성 및 SSEA-1 양성의 세포가 80% 이상 포함되어 있는 것이 확인되었다.
상기 방법에 의해 제조된 SSEA-1 양성 세포 획분에는, SSEA-1 음성 세포 획분과 비교해, 자기 복제능을 갖는 세포가 보다 많은 수로 포함되는 것을 알 수 있었다.
본 출원은, 2014년 1월 17 일자로 일본에 출원된 일본 특허출원 2014-006464을 기초로 하고 있고, 그 내용은 모두 본 명세서에 포함 된다.
산업상의 이용 가능성
본 발명에 의하면, 망막 세포로의 분화능 및 자기 복제능을 갖는 조직 간세포를 고순도로 효율적으로 제조 가능하다.

Claims (20)

  1. 하기 공정 (I) 또는 (II) 이후, 하기 공정 (1) 을 포함하는, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 간세포의 제조 방법：
    (I) 망막 조직을 포함하는 세포 응집체로서, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20% 이상 100% 이하인 세포 응집체를, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질 및 FGF 시그널 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지 내에서, 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 배양 개시시보다 감소된 세포 응집체를 얻기 위해, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기에 이를 때까지의 기간중에 한정하여 또는 망막 조직에 있어서의 RPE65 양성 세포의 존재 비율이 1% 이하일 때까지, 배양한 후, 얻어진, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않거나 망막 조직에 있어서의 RPE65 양성 세포의 존재 비율이 1% 이하인 세포 응집체를, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지 내에서 배양하여, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체를 얻는 공정;
    (II) 망막 조직을 포함하는 세포 응집체로서, 상기 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 20% 이상인 세포 응집체를, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지 내에서, 망막 조직에 있어서의 Chx10 양성 세포의 존재 비율이 배양 개시시보다 감소된 세포 응집체를 얻기 위해, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하기에 이를 때까지의 기간중에 한정하여 또는 망막 조직에 있어서의 RPE65 양성 세포의 존재 비율이 1% 이하일 때까지, 배양한 후, 얻어진, RPE65 유전자를 발현하는 세포가 출현하고 있지 않거나 망막 조직에 있어서의 RPE65 양성 세포의 존재 비율이 1% 이하인 세포 응집체를, Wnt에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지 내에서 배양하여, 다능성 간세포로부터 분화 유도된 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체를 얻는 공정;
    (1) (a) 공정 (I) 또는 (II)에서 얻어진 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체, (b) 공정 (I) 또는 (II)에서 얻어진 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체, 또는 (c) 공정 (I) 또는 (II)에서 얻어진 상기 세포 응집체로부터 분취된 세포
    를 분산시킨 후, 얻어진 분산된 세포를 부유 배양하여, 모양체 주연부 간세포를 포함하는 레티노스피어를 얻는 공정;
    상기 레티노스피어는 Rax 양성 및 단계 특이적 배성 항원-1 양성 세포를 40% 이상 포함하고, 색소 침착이 없다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 공정 (1)을 실시한 후 하기 공정 (2)를 실시하는, 방법:
    (2) 공정 (1) 에서 얻어진 레티노스피어를 분산시켜 얻어진 분산된 세포로부터 단계 특이적 배성 항원-1 양성 세포를 분취하여, 단계 특이적 배성 항원-1 양성 세포군을 얻는 공정.
  3. 제 1 항에 있어서, 공정 (I) 또는 (II) 이후, 공정 (1) 이전에, 하기 공정 (2)를 실시하는 방법으로서, 공정 (1) 에서 부유 배양된 분산된 세포는 공정 (2) 에서 분취된 세포를 분산시켜 얻어진 세포인, 방법:
    (2) 공정 (I) 또는 (II)에서 얻어진 모양체 주연부 유사 구조체를 포함하는 세포 응집체, 또는 공정 (I) 또는 (II)에서 얻어진 상기 세포 응집체로부터 분리된 모양체 주연부 유사 구조체, 를 분산시켜 얻어진 분산된 세포로부터 단계 특이적 배성 항원-1 양성 세포를 분취하여, 단계 특이적 배성 항원-1 양성 세포군을 얻는 공정.
  4. 제 2 항에 있어서, 단계 특이적 배성 항원-1 양성 세포가 추가로 Rax 양성인, 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 단계 특이적 배성 항원-1 양성 세포가 색소 침착이 되지 않은, 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 단계 특이적 배성 항원-1 양성 세포가 추가로 Rax 양성인, 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 단계 특이적 배성 항원-1 양성 세포가 색소 침착이 되지 않은, 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 공정 (1)에 있어서의 부유 배양이, FGF에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질 및 EGF에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질을 각각 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지내에서 실시되는, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, FGF에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질은 FGF1, FGF2, FGF4 및 FGF10 으로 이루어지는 군으로부터 선택되고, EGF에 의해 매개되는 시그널 전달을 증강할 수 있는 물질은 EGF, TGF-알파 및 HB-EGF로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 무혈청 배지 또는 혈청 함유 배지가 ROCK 저해제를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, ROCK 저해제는 Y-27632 및 Fasudil로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
  12. 삭제
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 다능성 간세포가 영장류 다능성 간세포인, 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 다능성 간세포가 인간 다능성 간세포인, 방법.
  15. (i) 제 1 항에 기재된 방법에 의해 모양체 주연부 간세포를 제조하는 것, 및 (ii) (i) 에 의해 얻어진 모양체 주연부 간세포를, Notch 시그널 저해 물질, 레티노이드 및 타우린으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 물질의 존재하에 배양하는 것을 포함하는, 망막층 특이적 신경세포의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, Notch 시그널 저해 물질은 γ-세크레타제 저해 물질, Notch 수용체 저해 물질, Dll 저해 물질, Hes 저해 물질, 및 DAPT(N-[N-(3, 5-디플루오로펜아세틸)-L-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸에스테르)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
  17. (i) 제 1 항 내지 제 11 항, 제 13 항 및 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 모양체 주연부 간세포를 제조하는 것, 및 (ii) (i) 에서 제조된 모양체 주연부 간세포의 유효량을 포함하는 이식용 생체 재료를 제조하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장해에 따른 질환을 치료하기 위한 약제의 제조 방법.
  18. (i) 제 1 항 내지 제 11 항, 제 13 항 및 제 14 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 모양체 주연부 간세포를 제조하는 것, 및 (ii) (i) 에서 제조된 모양체 주연부 간세포에 시험 물질을 접촉시켜, 그 물질의 그 세포에 대한 영향을 어세이하는 것을 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 약효 평가 방법.
  19. (i) 제 15 항 또는 제 16 항에 기재된 방법에 의해 망막층 특이적 신경세포를 제조하는 것, 및 (ii) (i) 에서 제조된 망막층 특이적 신경세포의 유효량을 함유하는 이식용 생체 재료를 제조하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장해에 따른 질환을 치료하기 위한 약제의 제조 방법.
  20. (i) 제 15 항 또는 제 16 항에 기재된 방법에 의해 망막층 특이적 신경세포를 제조하는 것, 및 (ii) (i) 에서 제조된 망막층 특이적 신경세포에 시험 물질을 접촉시켜, 그 물질의 그 세포에 대한 영향을 어세이하는 것을 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 약효 평가 방법.
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