TW202023590A - 包含細菌菌株之組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種包含細菌菌株之組合物，其用於刺激個體之免疫系統。
Description
本發明屬於包含自哺乳動物消化道分離之細菌菌株的組合物及此等組合物用於治療疾病、尤其在疾病治療中刺激免疫系統之用途的領域。
雖然認為人類腸道在子宮內係無菌的，但在出生後其立即暴露於大量的各種母體及環境微生物。此後，出現微生物定殖及演替之變動期，其受諸如分娩模式、環境、飲食及宿主基因型之因素影響，所有因素皆影響腸微生物區(microbiota)之組成，尤其是在生命早期期間。隨後，微生物區穩定化且變為成體樣[1]。人類腸微生物區含有超過500-1000個基本上屬於兩大細菌門擬桿菌門(Bacteroidetes)及厚壁菌門(Firmicutes)之不同演化型(phylotype)[2]。由人類腸之細菌定殖產生的成功共生關係產生多種代謝、結構、保護及其他有益功能。定殖腸部之增強代謝活性確保原本無法消化之飲食組分降解，同時釋放副產物，為宿主提供重要營養物來源。類似地，充分認識到腸微生物區之免疫學重要性，且在免疫系統減弱之無菌動物中予以例示，該免疫系統在引入共生細菌後在功能上復原[3-5]。
微生物區組成之顯著變化已在諸如發炎腸病(IBD)之胃腸病症中予以證明。舉例而言，在IBD患者中梭菌屬(Clostridium
) XIVa簇細菌之水準降低，而大腸桿菌(E. coli
)數目增加，此表明腸內共生體與病原性共生體(pathobiont)之平衡的變化[6-9]。有趣地，此微生物生態失調亦與效應T細胞群體之不平衡相關。
認識到某些細菌菌株對動物腸可能具有之潛在積極作用，已提出將各種菌株用於治療各種疾病(參見例如[10-13])。亦已提出將某些菌株(包括大部分乳桿菌屬(Lactobacillus
)及雙歧桿菌屬(Bifidobacterium
)菌株)用於例如藉助抗炎機制治療不直接與腸相關聯之各種發炎及自體免疫性疾病(綜述參見[14]及[15])。已提出某些鏈球菌(Streptococcus
)及範永氏球菌屬(Veillonella
)菌株以及較小程度之腸球菌屬(Enterococcus
)及乳桿菌屬(Lactobaccillus
)菌株具有免疫調節作用，對活體外不同細胞介素具有不同作用。然而，不同疾病與不同細菌菌株之間的關係以及特定細菌菌株對腸及在系統層面上以及對任何特定類型疾病之準確作用尚未充分表徵。
最近，已研究各種雙歧桿菌屬物種之抗炎性質，且若干人類試驗已證實雙歧桿菌之治療性質可成功地自實驗室轉移至臨床，尤其用於發炎及自體免疫性病症。舉例而言，長雙歧桿菌(B. longum
) CECT 7347及嬰兒雙歧桿菌(B. infantis
) NLS二者皆在乳糜瀉患者中引發保護作用[16、17])。研究亦已證實雙歧桿菌能夠調節腸道以外之疾病。由長雙歧桿菌BB536、嬰兒雙歧桿菌M-63及短雙歧桿菌M-16V構成之三菌株調配物減輕與兒童過敏性鼻炎及輕度間歇性氣喘相關之症狀[18]。此外，向患有潰瘍性結腸炎、牛皮癬及慢性疲勞症候群之患者投與長雙歧桿菌35624使所有三種病症中C-反應蛋白質之血漿含量降低[19]，表明此菌株可能能夠調節全身免疫。
已在例如[20]及[21]中提出來自短雙歧桿菌物種之生物體因代謝亞麻油酸而用於製備免疫刺激補充劑。然而，此等文獻中並無任何內容表明此等生物體在投與個體時可引發免疫刺激反應。
參考文獻[22]提示包含β-半乳寡糖A及B之營養組合物可引發免疫刺激作用。據稱包含彼等糖之組合物可另外包含各種其他包括短雙歧桿菌之組分，但並未提示短雙歧桿菌生物體有助於或增強β-半乳寡糖之任何免疫刺激性質。
[23]中提出了來自短雙歧桿菌物種之生物體之治療用途。然而，並未提示其中揭示之細菌菌株具有免疫刺激作用。
關於研究雙歧桿菌屬菌株對經口霍亂疫苗免疫原性之潛在作用的研究報導於[24]中。然而，該研究之結果尚無定論；該論文中報導測試菌株雖然耐受良好，但並未展現出明顯的疫苗接種後免疫刺激作用。
此項技術中需要治療疾病之新方法。亦需要表徵腸細菌之潛在作用，以便可研發出使用腸細菌之新療法。
本發明者已研發包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株之新組合物，其可用於刺激個體之免疫系統以及治療及預防個體之疾病。本發明者已鑒別短雙歧桿菌物種之菌株可有效地活化免疫系統。
因此，本發明提供包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株之組合物，其用於刺激個體之免疫系統。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於刺激免疫系統。
另外，本發明提供刺激免疫系統之方法，其包括向個體投與包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株之組合物。此外，本發明提供包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株的組合物用於製造用於刺激個體之免疫系統之藥物的用途。
在其他態樣中，本發明提供包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株之組合物，其用作疫苗佐劑。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用作疫苗佐劑。
在其他態樣中，本發明提供包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株之組合物，其用於治療、預防或延遲免疫衰老。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於治療、預防或延遲免疫衰老。
在其他態樣中，本發明提供包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株之組合物，其用於增強細胞療法，諸如CAR-T。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於增強細胞療法，諸如CAR-T。
本發明者亦已表徵尤其有效刺激免疫系統之短雙歧桿菌菌株且已鑒別出其效力可由其胞外多糖(EPS)介導。因此，本發明較佳地使用包含短雙歧桿菌物種之細菌菌株之組合物，其用於刺激個體之免疫系統，該細菌菌株包含完整EPS基因座及/或在其表面上表現EPS。
較佳地，用於本發明中之細菌係以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株。
在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其用於在疾病之治療或預防中增加IL-12p70、IL-12p70、IFNγ、IL-4及/或TNF-α之表現水準及/或活性，如在實例中所證實。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型的組合物，其用於在疾病之治療或預防中增加IL-12p70、IL-12p70、IFNγ、IL-4及/或TNF-α之表現水準及/或活性。
在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其用於在疾病之治療或預防中增加IL-12p70、IL-12p70、IFNγ、IL-4、TNF-α及/或TNF-17α之表現水準及/或活性，如在實例中所證實。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型的組合物，其用於在疾病之治療或預防中增加IL-12p70、IL-12p70、IFNγ、IL-4、TNF-α及/或IL-17α之表現水準及/或活性。
在較佳實施例中，本發明提供用於刺激TLR2之組合物。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於刺激TLR2。
在較佳實施例中，本發明提供用於刺激NFκB之組合物。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於刺激NFκB。
在較佳實施例中，本發明之細菌菌株表現支鏈澱粉酶，其在實例中顯示為由有效之短雙歧桿菌菌株高度表現且可能參與黏附。
在其他態樣中，本發明提供包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株的組合物，其用於製造用於治療或預防個體之細菌感染之藥物。實例證實短雙歧桿菌且尤其本發明之短雙歧桿菌菌株具有有效之抗微生物活性。另外，本發明提供治療或預防個體之細菌感染之方法，其包括投與短雙歧桿菌物種之細菌菌株之組合物。此外，本發明提供包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株的組合物用於製造用於治療或預防個體之細菌感染之藥物的用途。
在較佳實施例中，感染係胃腸感染。在較佳實施例中，感染係革蘭氏(Gram)陰性細菌感染。在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防胃腸大腸桿菌感染。在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防胃腸道沙門氏桿菌(S. enterica
)感染。在一些實施例中，本發明之組合物用於在細菌感染之治療中降低細菌活力。本發明之細菌可用於將病原細菌之水準恢復至無症狀水準或自個體中完全消除病原細菌，從而治療細菌感染，以及減輕與細菌水準升高相關之症狀。
預期與實例中測試之短雙歧桿菌菌株密切相關之菌株尤其有效刺激免疫系統。在較佳實施例中，本發明提供一種組合物，其中細菌菌株具有與SEQ ID NO:1至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA基因序列，或其中細菌菌株具有由SEQ ID NO:1表示之16s rRNA基因序列。
在某些實施例中，本發明之組合物用於經口投與。本發明之菌株之經口投與可有效刺激免疫系統。此外，經口投與對於患者及從業人員而言係方便的且允許遞送至腸部及/或部分或全部定殖腸部。
在某些實施例中，本發明之組合物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
在某些實施例中，本發明之組合物包含已凍乾之細菌菌株。本發明之組合物亦可包含短雙歧桿菌物種之凍乾細菌菌株。凍乾係用於製備允許遞送細菌之穩定組合物的有效且方便之技術。
在某些實施例中，本發明提供包含如上所述之組合物之食品。本發明亦提供包含如本文所述之短雙歧桿菌物種之細菌菌株之食品。
在某些實施例中，本發明提供包含如上所述之細菌菌株之疫苗組合物。本發明亦提供包含根據本發明之組合物之疫苗組合物。
另外，本發明提供治療或預防與免疫刺激降低相關之疾病或病狀的方法，其包括向有需要之患者投與包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株的組合物。
細菌菌株
本發明之組合物包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株。實例證實此等細菌菌株可用於刺激免疫系統。本發明之較佳細菌菌株係以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌。
以登錄號NCIMB 42380寄存之短雙歧桿菌細菌在實例中進行了測試，且在本文中亦稱為菌株751、MRX004或MRx0004。測試之MRX004菌株的部分16S rRNA序列提供於SEQ ID NO:1中。短雙歧桿菌菌株MRX004由GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)於2015年3月12日以識別編號(identification reference) 751寄存在國際寄存當局NCIMB Ltd. (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)且被指定登錄號NCIMB 42380。GT Biologics Ltd.隨後更其名為4D Pharma Research Limited。此等寄存物公佈於WO2016/203223中。
菌株NCIMB 42380之基因體序列提供於WO2016/203223之SEQ ID NO:2中。
亦預期與實例中測試之菌株密切相關之細菌菌株有效刺激免疫系統。在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與SEQ ID NO:1至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致之16s rRNA序列。較佳地，細菌菌株具有由SEQ ID NO:1表示之16s rRNA序列。最佳地，細菌菌株係以登錄號NCIMB 42380寄存之短雙歧桿菌菌株。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有與WO2016/203223之SEQ ID NO：2具有序列一致性之基因體。在較佳實施例中，用於本發明中之細菌菌株具有在WO2016/203223之SEQ ID NO:2之至少60% (例如至少65%、70%、75%、80%、85%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)內與WO2016/203223之SEQ ID NO:2具有至少90%序列一致性(例如至少92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性)的基因體。舉例而言，用於本發明中之細菌菌株可具有如下基因體：該基因體在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之70%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少90%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之80%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少90%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之90%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少90%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之100%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少90%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之70%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少95%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之80%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少95%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之90%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少95%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之100%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少95%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之70%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之80%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之90%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性，或在WO2016/203223之SEQ ID NO: 2之100%內與WO2016/203223之SEQ ID NO: 2具有至少98%序列一致性。
在較佳實施例中，本發明之組合物包含活細菌。在較佳實施例中，本發明之組合物包含呈活性狀態、較佳凍乾之活細菌。實例證實，活細菌之投與比熱殺死之細菌或上清液更有效。
在較佳實施例中，本發明之細菌活化TLR2，例如在如實例中所述之HEK-TLR2報告分析中。在其他實施例中，本發明之細菌不活化TLR4、TLR5或TLR9。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含活化TLR2之細菌，且用作疫苗佐劑。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含活化TLR2之細菌，且用於增強細胞療法。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含活化TLR2之細菌，且用於治療、預防或延遲免疫衰老。
在較佳實施例中，本發明之細菌活化NFκB，例如在如實例中所述之THP-1-NFκB報告分析中。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含活化NFκB之細菌，且用作疫苗佐劑。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含活化NFκB之細菌，且用於增強細胞療法。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含活化NFκB之細菌，且用於治療、預防或延遲免疫衰老。
在某些實施例中，本發明之細菌與對數後期相比在靜止期以更高水準表現一或多種選自由以下組成之群之基因：oppA 、支鏈澱粉酶、絲胺酸蛋白酶抑制劑
(serpin
)及tadA
，例如，當在液體培養中生長時，如實例中所示。實例證實此等基因可介導有用之治療作用。
在某些實施例中，本發明之細菌與靜止期相比在對數後期以更高水準表現一或多種選自由以下組成之群之基因：eftU
、烯醇酶
及pGTF
，例如，當在液體培養中生長時，如實例中所示。實例證實此等基因可介導有用之治療作用。
在某些實施例中，本發明之細菌與對數後期相比在與腸上皮細胞接觸後以更高水準表現一或多種選自由以下組成之群之基因：烯醇酶
、pGTF
、oppA 、絲胺酸蛋白酶抑制劑
及轉醛醇酶
，例如，當在液體培養中生長時，如實例中所示。實例證實此等基因可介導有用之治療作用。
在某些實施例中，本發明之細菌表現支鏈澱粉酶、NlpC/P60家族蛋白質、FtsI、轉醛醇酶、GAPDH、DnaK、GroEL及烯醇酶中之一或多種並將其分泌至培養上清液中。在某些實施例中，本發明之細菌表現表2中之蛋白質中之一或多種(諸如2種、
3種、
5種、
10種、
15種或全部)並將其分泌至培養上清液中。實例證實此等蛋白質可介導有用之治療作用。
在某些實施例中，本發明之細菌在其細胞表面上表現以下中之一或多種：支鏈澱粉酶、I型聚酮化合物合成酶、轉醛醇酶、GAPDH、DnaK、GroEL、烯醇酶及EfTu。在某些實施例中，本發明之細菌表現表3中之蛋白質中之一或多種(諸如2種、3種、5種、6種、8種或全部)並將其分泌至培養上清液中。實例證實此等蛋白質可介導有用之治療作用。
在某些實施例中，本發明之細菌表現支鏈澱粉酶。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含表現支鏈澱粉酶之細菌，且用作疫苗佐劑。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含表現支鏈澱粉酶之細菌，且用於增強細胞療法。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含表現支鏈澱粉酶之細菌，且用於治療、預防或延遲免疫衰老。
在較佳實施例中，本發明之細菌包含完整之EPS基因座。實例證實完整EPS基因座可能有助於增加治療效力。在此等實施例中，EPS基因座包含引發(priming)糖基轉移酶、一或多種額外糖基轉移酶、焦磷酸噻胺結合蛋白質、跨膜蛋白質、翻轉酶及鏈長決定子。在較佳實施例中，EPS基因座之大小超過30 Kb (包括側接假設蛋白質)。實例證實此一EPS基因座對於免疫刺激功能足夠。在較佳實施例中，EPS基因座之大小為25-60 Kb、30-50 Kb、30-40 Kb、30-35 Kb或30-32 Kb。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含具有完整EPS基因座之細菌，且用作疫苗佐劑。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含具有完整EPS基因座之細菌，且用於增強細胞療法。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含具有完整EPS基因座之細菌，且用於治療、預防或延遲免疫衰老。
在較佳實施例中，本發明之細菌具有EPS基因座，該EPS基因座與菌株MRX004之EPS基因座具有高水準之核苷酸一致性，諸如至少90%、92%、94%、96%、98%、99%或99.5%之核苷酸一致性，例如如實例中所確定。實例證實菌株MRX004之EPS基因座在遺傳上不同於其他短雙歧桿菌菌株，且可能有助於效力及治療效用。
在較佳實施例中，本發明之細菌在其表面上帶有EPS。實例證實EPS調節細胞表面上蛋白質之暴露。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含在表面上帶有EPS之細菌，且用作疫苗佐劑。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含在表面上帶有EPS之細菌，且用於增強細胞療法。在一較佳實施例中，本發明之組合物包含在表面上帶有EPS之細菌，且用於治療、預防或延遲免疫衰老。
較佳地，用於本發明中之細菌能夠使棉子糖發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時。實例表明，最有效之短雙歧桿菌菌株能夠使棉子糖發酵，且其參與EPS產生。在進一步較佳實施例中，用於本發明中之細菌能夠使以下中之一或多種(諸如2種、3種、4種、5種、6種或全部7種)發酵：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶及β-葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖、甘露糖及棉子糖，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時。在其他較佳實施例中，用於本發明中之細菌能夠使以下中之一或多種(諸如2種、3種、4種、5種、6種或全部7種)發酵：精胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、甘胺酸及組胺酸。可使用此項技術中已知之任何合適之分析來評估細菌使碳水化合物源或胺基酸發酵之能力。較佳地，使用Rapid ID 32A分析(較佳使用來自bioMérieux之Rapid ID 32A系統)。
較佳地，用於本發明中之細菌展現出β-葡萄糖苷酶之中間發酵或α-阿拉伯糖之中間發酵，或更佳β-葡萄糖苷酶之中間發酵及α-阿拉伯糖之中間發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時，及例如當經歷Rapid ID 32A分析時。實例證實短雙歧桿菌菌株MRX004及測試3二者皆具有有用之活性，且二者皆展現出β-葡萄糖苷酶及α-阿拉伯糖之中間發酵。在尤佳實施例中，用於本發明中之細菌展現出β-葡萄糖苷酶之中間發酵、α-阿拉伯糖之中間發酵及阿拉伯糖之陽性發酵。
較佳地，用於本發明中之細菌未展現出N-乙醯基-β-胺基葡萄糖苷酶之陽性發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時，及例如當經歷Rapid ID 32A分析時。細菌可能僅展現出N-乙醯基-β-胺基葡萄糖苷酶之中間發酵或不發酵。實例證實短雙歧桿菌菌株MRX004及測試2二者皆具有有用之活性，且二者皆未展現出N-乙醯基-β-胺基葡萄糖苷酶之陽性發酵。在尤佳實施例中，用於本發明中之細菌未展現出N-乙醯基-β-胺基葡萄糖苷酶之陽性發酵，且確實展現出阿拉伯糖之陽性發酵。
較佳地，用於本發明中之細菌展現出α-半乳糖苷酶之中間發酵或α-阿拉伯糖之中間發酵，或更佳α-半乳糖苷酶之中間發酵及α-阿拉伯糖之中間發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時，及例如當經歷Rapid ID 32A分析時。實例證實短雙歧桿菌菌株MRX004及測試8二者皆具有有用之活性，且二者皆展現出α-半乳糖苷酶及α-阿拉伯糖之中間發酵。在尤佳實施例中，用於本發明中之細菌展現出α-半乳糖苷酶之中間發酵及α-阿拉伯糖之中間發酵，以及阿拉伯糖之陽性發酵。
在替代實施例中，用於本發明中之細菌使絲胺酸芳基醯胺酶發酵，而不使白胺醯基甘胺酸芳基醯胺酶發酵，且不使丙胺酸芳基醯胺酶發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時，及例如當經歷Rapid ID 32A分析時。實例證實短雙歧桿菌菌株測試11及測試12二者皆具有有用之活性，且二者皆使絲胺酸芳基醯胺酶發酵，而不使白胺醯基甘胺酸芳基醯胺酶發酵，且不使丙胺酸芳基醯胺酶發酵。在尤佳實施例中，用於本發明中之細菌亦使阿拉伯糖發酵。
在替代實施例中，用於本發明中之細菌展現出絲胺酸芳基醯胺酶之中間發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時，及例如當經歷Rapid ID 32A分析時。實例證實短雙歧桿菌菌株測試3及測試7二者皆具有有效之抗微生物活性，且二者皆展現出絲胺酸芳基醯胺酶之中間發酵。在尤佳實施例中，用於本發明中之細菌亦使阿拉伯糖發酵。
可使用此項技術中已知之任何合適之分析來評估細菌使碳水化合物源或胺基酸發酵之能力。較佳地，使用Rapid ID 32A分析(較佳使用來自bioMérieux之Rapid ID 32A系統)。
較佳地，當經歷使用標準條件(諸如用於實例10中之標準條件)之脈衝場凝膠電泳時，用於本發明中之細菌產生圖24或圖25中針對MRX004所示之圖譜。
在替代性較佳實施例中，用於本發明中之細菌能夠使以下中之一或多種(諸如2種、3種、4種、5種、10種、15種、20種、25種或全部)發酵：阿米酮(amidon) (澱粉)、苦杏仁苷、熊果苷、纖維二糖、七葉苷、半乳糖、龍膽二糖、葡萄糖、糖原、果糖、岩藻糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、甘露糖醇、蜜二糖、松三糖、甲基α-D-葡萄吡喃糖苷、N-乙醯胺基葡萄糖、核糖、蔗糖(saccharose, sucrose)、柳苷、山梨糖醇、海藻糖、松二糖及木糖醇。在此等實施例中，可使用此項技術中已知之任何合適之分析來評估細菌使碳水化合物源發酵之能力。較佳地，使用來自bioMérieux之API 50 CH分析。
在某些實施例中，本發明之組合物包含一種短雙歧桿菌菌株，該菌株展現出對人類細胞之附著減少，尤其當在YCFA培養基中測試時，尤其在實例5的條件下。
在某些實施例中，本發明之組合物包含以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌之生物型。亦預期作為以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌之生物型的細菌菌株有效刺激免疫系統。生物型將具有與原始NCIMB 42380菌株相當之免疫調節活性。生物型為具有相同或極類似之生理及生物化學特性的密切相關菌株。
生物型將引發與實例中所示作用相當的對免疫系統之作用，其可藉由使用實例中所述之培養及投與方案來鑒別。特定而言，生物型將引發與NCIMB 42380相當的對T細胞及細胞介素之作用。
作為以登錄號NCIMB 42380寄存且適用於本發明中之細菌之生物型的菌株可藉由對以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌之其他核苷酸序列進行測序來鑒別。舉例而言，實質上全基因體可進行測序，且用於本發明中之生物型菌株可在其全基因體之至少80%內(例如在至少85%、90%、95%或99%內或在其全基因體內)具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性。舉例而言，在一些實施例中，生物型菌株在其基因體之至少98%內具有至少98%序列一致性，或在其基因體之99%內具有至少99%序列一致性。用於鑒別生物型菌株之其他合適序列可包括hsp60或重複序列，諸如BOX、ERIC、(GTG)5
或REP [25]。
生物型菌株可具有與以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌之對應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性的此等序列。在一些實施例中，生物型菌株可具有與以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌之對應序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%序列一致性的16S rRNA序列。在一些實施例中，生物型菌株可包含與SEQ ID NO：1至少99%一致(例如至少99.5%或至少99.9%一致)之16S rRNA序列。在一些實施例中，生物型菌株具有SEQ ID NO：1之16S rRNA序列。
或者，作為以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌之生物型且適用於本發明中的菌株可藉由使用登錄號NCIMB 42380寄存物以及限制片段分析及/或PCR分析，例如藉由使用螢光擴增片段長度多型性(fluorescent amplified fragment length polymorphism，FAFLP)及重複DNA元件(rep)-PCR指紋或蛋白質剖析(profiling)或部分16S或23s rDNA測序來鑒別。在較佳實施例中，此等技術可用於鑒別其他短雙岐桿菌菌株。
在某些實施例中，作為以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌之生物型且適用於本發明中之菌株係當藉由擴增核糖體DNA限制分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)分析時，例如當使用Sau3AI限制酶(關於例示例性方法及指導參見例如[26])時提供與以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌相同之模式的菌株。或者，將生物型菌株鑒別為具有與以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌相同之碳水化合物發酵模式的菌株。
可用於本發明之組合物及方法的其他短雙岐桿菌菌株(諸如以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌之生物型)可使用任何適當方法或策略(包括實例中所述之分析)鑒別。特定而言，具有與以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌類似之生長模式、代謝類型及/或表面抗原的細菌菌株可用於本發明中。
在某些實施例中，本發明之組合物包含以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌之衍生物。以登錄號NCIMB 42380寄存之菌株之衍生物可為子代菌株(後代)或自原始培養(次選殖)之菌株。本發明菌株之衍生物可例如在基因層面下修飾，而不消除生物活性。特定而言，本發明之衍生菌株有治療活性。衍生菌株將具有與原始NCIMB 42380菌株相當之免疫調節活性。衍生菌株將具有與原始NCIMB 42380菌株相當之微生物區調節活性。因此，衍生菌株將有效刺激免疫系統。
衍生菌株將引發與實例中所示作用相當的對癌症模型之作用，其可藉由使用實例中所述之培養及投與方案來鑒別。特定而言，衍生菌株將引發與以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌相當的對細胞介素及基因表現之作用。特定而言，衍生菌株將引發與以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌相當的對免疫刺激之作用。NCIMB 42380菌株之衍生物一般將為NCIMB 42380菌株之生物型。
細菌菌株亦可為具有與以登錄號NCIMB 42380寄存之菌株相同之安全性及治療功效特性之菌株，且本發明涵蓋此等細胞。因此，該組合物可包含短雙歧桿菌菌株，該短雙歧桿菌菌株並非以登錄號NCIMB 42380寄存之菌株，但具有與以登錄號NCIMB 42380寄存之菌株相同之安全性及治療功效特性。可例如藉由測試菌株對抗生素之抗性(例如區分對抗生素之固有抗性及可傳遞抗性)來確定菌株之安全性特徵。亦可藉由評價活體外菌株之病原性質(例如毒素產生水準)來確定菌株之安全性特性。其他安全性測試包括測試大鼠及小鼠模型中細菌菌株之急性或慢性毒性。可藉由使用相關模型在活體外及活體內對細菌菌株進行功能表征來確定菌株之治療功效。
在較佳實施例中，本發明組合物中之細菌菌株能存活且能夠部分或全部定殖腸部。
在一較佳實施例中，用於本發明中之細菌菌株既與一或多種於圖9中列示之短雙歧桿菌菌株相比，在YCFA中對人類腸上皮細胞、尤其Caco-2細胞之黏附性更低(諸如黏附性小於總培養物之1%，諸如較佳小於0.5%或小於0.3%)，且亦與一或多種於圖9中列示之短雙歧桿菌菌株相比，產生更多結合之表面胞外多糖。
在某些較佳實施例中，用於本發明中之細菌菌株能夠使多糖棉子糖發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時。
在某些實施例中，與雙歧桿菌、尤其短雙歧桿菌相比，用於本發明中之細菌菌株使α-葡萄糖苷酶及/或β-葡萄糖苷酶發酵之能力降低，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時。
在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株包含一或多種於WO2016/203223 (其以引用方式併入本文中)之表1中列示之基因，諸如5種、10種、20種、50種或所有於WO2016/203223之表1中之基因。在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株包含一或多種於WO2016/203223之表1中列示之以單底線突出顯示的基因，諸如預測ECF運輸蛋白之激勵模組(energizing module)之跨膜組分BL0694及/或預測ECF運輸蛋白之激勵模組之複製ATP酶組分BL0693。在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株包含一或多種於WO2016/203223之表1中列示之以雙底線且以粗體突出顯示的基因，諸如1種、2種、3種、4種或5種選自以下之基因：麥芽糊精葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、推定半乳糖苷酶、纖維素合成酶(形成UDP) (EC 2.4.1.12)、幾丁質酶(EC 3.2.1.14)及感受盒/GGDEF家族蛋白質。在某些實施例中，用於本發明中之細菌菌株包含一或多種於WO2016/203223之表1中列示之以斜體突出顯示的基因，諸如1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種或9種選自以下之基因：ω-3多不飽和脂肪酸合成酶次單元PfaA、I型聚酮合成酶、未知功能之推定糖基水解酶(DUF1680)、生物素ECF運輸蛋白之激勵模組之ATP酶組分BioM、運輸陽離子之ATP酶E1-E2家族、核糖ABC運輸系統通透酶蛋白質RbsC (TC 3.A.1.2.1)、核糖ABC運輸系統ATP結合蛋白質RbsA (TC 3.A.1.2.1)、3'-5'寡聚核糖核酸酶(orn)、與放線桿菌屬(Actinobacillus)蛋白質相關之膜蛋白質(1944168)。
在較佳實施例中，用於本發明中之細菌菌株包含一或多種(諸如5種、10種、15種、20種、25種、30種、40種、45種、50種或所有)選自以下之基因：2-琥珀醯基-5-烯醇丙酮醯基-6-羥基-3-環己烯-1-羧酸合成酶(EC 2.2.1.9)；3'-5'寡聚核糖核酸酶(orn)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；ECF運輸蛋白之通用激勵模組之ATP酶組分；Q核苷(queuosine)調控之ECF運輸蛋白之激勵模組的ATP酶組分STY3233；ATP依賴性DNA解旋酶recG (EC 3.6.1.-)；β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)；纖維素合成酶(形成UDP) (EC 2.4.1.12)；幾丁質酶(EC 3.2.1.14)；COG1309：轉錄調控子；D-丙胺醯基-D-丙胺酸羧肽酶(EC 3.4.16.4)；預測ECF運輸蛋白之激勵模組之複製ATP酶組分BL0693；果糖激酶(EC 2.7.1.4)；葡萄糖/甘露糖:H+同向運輸蛋白GlcP；糖基轉移酶(EC 2.4.1.-)；GMP合成酶[水解麩醯胺酸] (EC 6.3.5.2)；與靛玉苷(indigoidine)合成酶indA、PfkB家族激酶成簇之假設糖激酶；偏好肌苷-尿苷之核苷水解酶(EC 3.2.2.1)；LSU核糖體蛋白質L31p / LSU核糖體蛋白質L31p，不依賴於鋅；LSU核糖體蛋白質L33p / LSU核糖體蛋白質L33p，不依賴於鋅；麥芽糊精葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)；與放線桿菌屬蛋白質有關之膜蛋白質(1944168)；膜結合裂解性胞壁質轉糖苷酶D前驅物(EC 3.2.1.-)；甲基轉移酶(EC 2.1.1.-)；NADH依賴性丁醇去氫酶A (EC 1.1.1.-)；磷酸乙醇酸磷酸酶(EC 3.1.3.18)；磷酸核糖基鄰胺基苯甲酸異構酶(EC 5.3.1.24)；未知功能之假定糖基水解酶(DUF1680)；含鼠李糖之多糖易位通透酶；核糖激酶(EC 2.7.1.15)；核糖ABC運輸系統ATP結合蛋白質RbsA (TC 3.A.1.2.1)；核糖ABC運輸系統ATP結合蛋白質RbsA (TC 3.A.1.2.1)；核糖ABC運輸系統高親和性通透酶RbsD (TC 3.A.1.2.1)；核糖ABC運輸系統周質核糖結合蛋白質RbsB (TC 3.A.1.2.1)；核糖ABC運輸系統通透酶蛋白質RbsC (TC 3.A.1.2.1)；核糖ABC運輸系統通透酶蛋白質RbsC (TC 3.A.1.2.1)；山梨糖醇去氫酶(EC 1.1.1.14)；SSU核糖體蛋白質S14p (S29e) / SSU核糖體蛋白質S14p (S29e)，不依賴於鋅；Q核苷調控之ECF運輸蛋白之受質特異性組分STY3230；蔗糖-6-磷酸水解酶(EC 3.2.1.B3)；磷壁酸輸出ATP結合蛋白質TagH (EC 3.6.3.40)；預測ECF運輸蛋白之激勵模組之跨膜組分BL0694；Q核苷調控之ECF運輸蛋白之激勵模組的跨膜組分STY3231；與HrtAB運輸蛋白共定位之雙組分反應調控物；I型限制修飾系統DNA-甲基轉移酶次單元M (EC 2.1.1.72)；I型限制修飾系統限制性次單元R (EC 3.1.21.3)；I型限制修飾系統特異性次單元S (EC 3.1.21.3)；I型限制修飾系統特異性次單元S (EC 3.1.21.3)；I型限制修飾系統特異性次單元S (EC 3.1.21.3)；木糖醇去氫酶(EC 1.1.1.9)；及木糖ABC運輸蛋白周質木糖結合蛋白質XylF。在較佳實施例中，用於本發明中之細菌菌株包含一或多種(諸如5種、10種、15種、20種、25種、30種或35種或所有)於前一句中列示且未在WO2016/203223之表1中突出顯示之基因。 治療用途 刺激免疫系統
實例顯示本發明之組合物之投與可引起免疫刺激。由於本發明之組合物之投與顯示具有免疫刺激作用，因此本發明之組合物可用於治療疾病、尤其特徵在於免疫活化降低之疾病及可藉由增加免疫反應加以治療之疾病。在某些實施例中，本發明之組合物用於刺激免疫系統。在某些實施例中，本發明之組合物因刺激免疫系統而用於治療疾病。在某些實施例中，本發明之組合物用於促進免疫反應。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於任何此用途。
免疫缺乏係指患者之免疫系統受損或完全缺失之狀態。免疫缺乏疾病係特徵在於免疫活化降低之疾病之實例，且其中刺激患者之免疫系統以治療疾病將為有利的。在一些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防免疫缺乏疾病。
存在兩種類型之免疫缺乏疾病。原發性免疫缺乏疾病係由遺傳突變引起之遺傳性免疫病症，該等遺傳突變通常在出生時存在且在兒童期診斷。繼發性免疫缺乏疾病係由疾病或環境來源(諸如有毒化學品)引起之後天免疫性缺乏。在一些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防原發性免疫缺乏疾病或繼發性免疫缺乏疾病。
原發性免疫缺乏病症及實例包括X性聯無γ球蛋白血症(XLA)、慢性肉芽腫病(CGD)、常見可變性免疫缺乏(CVID)及重症聯合免疫缺乏(SCID) (亦稱為淋巴細胞缺乏或「氣泡中之男孩(boy in a bubble)」疾病)。繼發性免疫缺乏病症可由例如重度燒傷、化療、輻射、糖尿病、營養不良引起。繼發性免疫缺乏病症之實例包括AIDS，免疫系統之癌症，諸如白血病，免疫複合體性疾病，諸如病毒性肝炎多發性骨髓瘤[27]。干擾素-γ係經批準用於免疫缺乏疾病CGD之療法[28]。實例證實本發明之組合物可增加IFN-γ之產生，因此本發明之組合物可尤其有效地治療免疫缺乏疾病，包括原發性及繼發性免疫缺乏疾病。
在較佳實施例中，本發明之組合物因刺激TLR2而用於刺激免疫系統。在某些實施例中，本發明之組合物用於在疾病之治療中刺激TLR2。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療與TLR2活性降低相關之疾病，或用於治療鑒別為具有降低之TLR2活性之患者。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於任何此用途。
在某些實施例中，用本發明之組合物治療驅動Th1細胞反應。在某些實施例中，本發明之組合物用於在疾病之治療中驅動Th1細胞反應。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療與Th1細胞活性降低相關之疾病，或用於治療鑒別為具有降低之Th1細胞活性之患者。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於任何此用途。
在較佳實施例中，本發明之組合物因活化NFκB而用於刺激免疫系統。在某些實施例中，本發明之組合物用於在疾病之治療中刺激NFκB。在某些實施例中，本發明之組合物用於治療與NFκB活性降低相關之疾病，或用於治療鑒別為具有降低之NFκB活性之患者。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於任何此用途。
本發明之組合物可用於治療特徵在於活化CD8+
細胞之水準降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加CD8+
細胞之數目或水準而用於刺激免疫反應。在一個實施例中，本發明之組合物因增加CD8+
細胞之活性或水準而用於治療疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因活化CD8+
細胞而用於刺激免疫反應。
本發明之組合物可用於治療特徵在於B細胞之水準降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加B細胞之數目或水準而用於刺激免疫反應。在一個實施例中，本發明之組合物因增加B細胞之活性或水準而用於治療疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因活化B細胞而用於刺激免疫反應。
本發明之組合物可用於治療特徵在於活化CD8+
CD25+
細胞之水準降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加CD8+
CD25+
細胞之數目或水準而用於刺激免疫反應。在一個實施例中，本發明之組合物因增加CD8+
CD25+
細胞之活性或水準而用於治療疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因活化CD8+
CD25+
細胞而用於刺激免疫反應。
本發明之組合物可用於治療特徵在於B細胞之數目或百分比降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於B細胞之數目或百分比下降的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加細胞群體中B細胞之數目或百分比而用於治療或預防疾病，其中B細胞之數目或百分比增加引起免疫刺激。在一個實施例中，本發明之組合物因增加B細胞之數目或百分比而用於刺激免疫反應。
實例顯示本發明之組合物之投與可引起諸如促炎性細胞介素之促炎性分子之表現增加。在投與本發明之組合物後顯示表現水準增加之促炎性分子之實例包括IL-12p70、TNF-α、IL-4、IFNγ及IL-17α。由於本發明之組合物之投與顯示增加促炎性分子之表現，因此本發明之組合物可用於治療特徵在於諸如促炎性細胞介素之促炎性分子之表現降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於促炎性分子之表現及/或活性降低之疾病、尤其征在於促炎性細胞介素之表現及/或活性降低之疾病。在一特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-12p70、TNF-α、IL-4及/或IFNγ之表現及/或活性降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-12p70、TNF-α、IL-4及/或IFNγ之表現及/或活性而用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-12p70、TNF-α、IL-4及/或IFNγ之表現及/或活性而用於促進免疫反應。在一特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-17α IL-12p70、TNF-α、IL-4、IFNγ及/或IL-17α之表現及/或活性降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-12p70、TNF-α、IL-4 IFNγ及/或IL-17α之表現及/或活性而用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-12p70、TNF-α、IL-4 IFNγ及/或IL-17α之表現及/或活性而用於促進免疫反應。
實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起IL-1β之表現之增加。IL-1β係促炎性細胞介素[29]。IL-1β之產生及分泌由發炎體調控，發炎體係與炎性反應之活化相關的蛋白質複合物[30]。由於本發明之組合物之投與顯示增加IL-1β之表現，因此本發明之組合物可用於治療特徵在於IL-1β之表現降低的疾病。在一特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-1β之表現及/或活性降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-1β之表現及/或活性而用於治療或預防疾病。
實例顯示本發明之組合物之投與可引起腫瘤壞死因子α (TNF-α)之表現增加。TNF-α係一種促炎性細胞介素，已知其參與促進細胞死亡之各種信號傳導路徑。TNF-α藉由結合至其同源受體TNFR-1而起始細胞凋亡，此引起細胞凋亡路徑中切割事件之級聯[31]。TNF-α亦可經由RIP激酶依賴性機制引起壞死[32]。由於本發明之組合物之投與顯示增加TNF-α之表現，因此本發明之組合物可用於治療疾病、尤其用於治療或預防特徵在於TNF-α之表現降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療特徵在於TNF-α之表現降低之疾病。在一特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於TNF-α之表現及/或活性降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加TNF-α之表現及/或活性而可用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加TNF-α之表現及/或活性而用於促進免疫反應。
由於本發明之組合物之投與顯示增加IL-4之表現，因此本發明之組合物可用於治療疾病、尤其用於治療或預防特徵在於IL-4之表現降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療特徵在於IL-4之表現降低的疾病。在一特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-4之表現及/或活性降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-4之表現及/或活性而可用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-4之表現及/或活性而用於促進免疫反應。
由於本發明之組合物之投與顯示增加IL-17α之表現，因此本發明之組合物可用於治療疾病、尤其用於治療或預防特徵在於IL-17α之表現降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療特徵在於IL-17α之表現降低的疾病。在一特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-17α之表現及/或活性降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-17α之表現及/或活性而可用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-17α之表現及/或活性而用於促進免疫反應。
由於本發明之組合物之投與顯示增加IL-12p70之表現，因此本發明之組合物可用於治療疾病、尤其用於治療或預防特徵在於IL-12p70之表現降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療特徵在於IL-12p70之表現降低的疾病。在一特定實施例中，本發明之組合物用於治療或預防特徵在於IL-12p70之表現及/或活性降低的疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-12p70之表現及/或活性而可用於治療或預防疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-12p70之表現及/或活性而用於促進免疫反應。
在某些實施例中，欲藉由本發明之組合物治療之疾病不為癌症。
在某些實施例中，欲藉由本發明之組合物治療之疾病不由IL-17或Th17路徑介導。在某些實施例中，本發明之組合物增加IL-17及/或Th17路徑之表現或活性。
在本發明之較佳實施例中，投與本發明組合物之個體不正在服用亞麻油酸補充劑及/或無富含亞麻油酸之飲食。另外或可替代地，本發明之組合物不包含亞麻油酸。
在實施例中，本發明之組合物不包含β-半乳寡糖A及/或B。
需要免疫刺激之患者可能處於細菌感染風險之下。實例證實本發明之組合物具有抗微生物活性。因此，在某些實施例中，本發明之組合物用於刺激免疫系統及治療或預防細菌感染。在某些實施例中，本發明之組合物因刺激免疫系統及抑制細菌感染之生長而用於治療細菌感染。在某些實施例中，本發明之組合物用於促進針對病原細菌的免疫反應及抑制細菌生長。較佳地，細菌感染係胃腸道細菌感染。較佳地，細菌感染係革蘭氏陰性細菌感染。
實施例亦證實本發明之組合物促進T輔助細胞及細胞毒性T淋巴球之分化。因此，在某些實施例中，本發明之組合物用於刺激T-輔助細胞及/或細胞毒性T淋巴球。作為疫苗佐劑之用途
實例顯示本發明之組合物之投與刺激免疫系統且可引起腫瘤壞死因子α (TNF-α)之表現及TLR2之活化增加。已知TNF-α對疫苗反應而言係重要的。舉例而言，已證明TNF-α係老年群體之流感疫苗接種中之高效疫苗反應所需的[33]。類似地，TLR2係疫苗佐劑改良反應之重要靶標[34]。由於本發明之組合物之投與顯示增加TNF-α表現及TLR2活性，因此本發明之組合物可用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物因增加TNF-α之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物因增加TLR2之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物用作疫苗佐劑。在一個實施例中，本發明之組合物在流感療法中用作疫苗佐劑。在某些實施例中，本發明之組合物用於增強針對抗原之免疫反應。在某些實施例中，本發明提供一種組合物，其與抗原組合投與。在某些實施例中，本發明之組合物用於在即將接種疫苗時或在接種疫苗之後立即投與患者。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於作為疫苗佐劑之任何此用途。
實例證實本發明之細菌活化TLR2。TLR促效劑尤其在老年群體中作為一系列抗原類型內之疫苗佐劑處於研發中[35]。因此，本發明之組合物可用作疫苗佐劑，尤其用於投與可能有免疫系統活性降低之老年患者(例如，年齡超過40歲、50歲、60歲、70歲或80歲)之疫苗。TLR2信號傳導亦在年齡相關之先天免疫反應中起關鍵作用[36]。在某些實施例中，組合物用於增強先天免疫反應。儘管TLR2促效劑作為疫苗佐劑正處於研發中，但其皆來自已知病原體及/或係合成的。相比之下，本發明之組合物包含共生細菌。
實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起IL-1β之表現之增加。Li等人[37]證明佐劑氫氧化鋁活化IL-1β之分泌，且提出IL-1β可充當佐劑。由於本發明之組合物之投與顯示增加IL-1β表現，因此本發明之組合物可用作疫苗佐劑。
實例證實本發明之組合物可增加IFNγ水準並促進Th1細胞反應，此二者皆與針對抗原之抗體反應增加相關[38]。在某些實施例中，本發明之組合物用於促進針對抗原、尤其病原性或癌症抗原之抗體反應。此外，其係接受研究之瘧疾疫苗之志願者中經疫苗誘導之T細胞反應的IFN-γ量度[39]。在某些實施例中，本發明之組合物用於促進針對抗原、尤其病原性或癌症抗原之T細胞反應。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IFN-γ之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。在某些實施例中，組合物用於防止瘧疾。
實例亦顯示本發明之組合物之投與可引起IL-12p70之表現或水準之增加。此作用已與疫苗佐劑效率相關聯，且已提出將IL-12作為佐劑本身[40]，此表明本發明之組合物將作為佐劑有效。在一個實施例中，本發明之組合物因增加IL-12p70之水準及/或活性而用作疫苗佐劑。
在一些實施例中，當用作疫苗佐劑時，本發明之組合物將獨自投與以向分開投與患者之抗原提供佐劑作用。在某些實施例中，本發明之組合物係經口投與，而抗原係非經腸注射。
本發明之組合物可用於增強對任一有用抗原之免疫反應。用於本發明之例示性抗原包括：病毒抗原，諸如病毒表面蛋白質；細菌抗原，諸如蛋白質及/或糖抗原；真菌抗原；寄生蟲抗原；及腫瘤抗原。本發明尤其可用於針對以下之疫苗：流感病毒、HIV、鉤蟲、B型肝炎病毒、單純皰疹病毒、狂犬病、呼吸道融合細胞病毒、細胞巨大病毒、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus
)、披衣菌屬(chlamydia)、SARS冠狀病毒、水痘帶狀皰疹病毒、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae
)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis
)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis
)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis
)、艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus)、人類乳頭狀瘤病毒等。用於本發明之其他抗原包括糖蛋白及脂聚糖抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E (MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸基-Tn (STn)、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、威爾姆氏腫瘤基因(Wilms tumour gene)(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾伯斯坦-巴爾病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、β-澱粉狀蛋白、τ蛋白、PCSK9及成癮物質，例如菸鹼、灑精或鴉片劑。
用於本發明之較佳抗原包括病原體抗原及腫瘤抗原。抗原將引發對抗原特異之免疫反應，此將有效防止病原體感染或攻擊腫瘤。抗原可為例如肽或多糖。
本發明亦提供以下各者在製造用於提高患者之免疫反應之藥物中的用途：(i)抗原之水性製劑；及(ii)包含短雙歧桿菌物種之細菌菌株之組合物。較佳地，細菌菌株係以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型。
藉由此等方法及用途提高之免疫反應一般包括抗體反應，較佳保護性抗體反應。
在一些實施例中，短雙岐桿菌物種之細菌菌株經工程改造以呈遞抗原。在本發明之細菌菌株上呈遞抗原可最大化免疫刺激活性且進一步增強針對該抗原產生之保護性免疫反應。此外，以此方式製造及遞送包含抗原及本發明之細菌之治療劑可比抗原及包含細菌菌株之組合物中每一者分開製造及投與時更高效及有效。因此，在一些實施例中，本發明提供包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株之組合物，該細菌菌株在例如其細胞表面上呈遞抗原。在一些實施例中，包含呈遞抗原之細菌菌株的組合物用作疫苗抗原。在一些實施例中，抗原來源於HIV、鉤蟲、B型肝炎病毒、單純皰疹病毒、狂犬病、呼吸道融合細胞病毒、細胞巨大病毒、金黃色葡萄球菌、披衣菌屬、SARS冠狀病毒、水痘帶狀皰疹病毒、肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、結核分枝桿菌、炭疽芽孢桿菌、艾伯斯坦-巴爾病毒或人類乳頭狀瘤病毒。在一些實施例中，抗原為糖蛋白抗原、脂聚糖抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E (MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸基-Tn (STn)、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、威爾姆氏腫瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾伯斯坦-巴爾病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、β-澱粉狀蛋白、τ蛋白、PCSK9或成癮物質，諸如灑精或鴉片劑及諸如此類。
在一些實施例中，本發明之細菌表現一或多種抗原。一般地，抗原將係重組表現且對於本發明之細菌而言將為異源的。因此，本發明提供表現異源抗原之短雙岐桿菌物種之細菌菌株。抗原可為與細菌同源之一或多種多肽一起表現的融合多肽之一部分。在一些實施例中，細菌將抗原表現為非融合多肽。在一些實施例中，本發明提供包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株之細胞的組合物，其中該細胞表現異源抗原。在一些實施例中，組合物用作疫苗。在一些實施例中，本發明提供短雙岐桿菌物種之細菌菌株之細胞，其中該細胞表現異源抗原。在一些實施例中，細胞用作疫苗。
用於本發明之例示性抗原包括：病毒抗原，諸如病毒表面蛋白質；細菌抗原，諸如蛋白質及/或糖抗原；真菌抗原；寄生蟲抗原；及腫瘤抗原。用於在短雙岐桿菌物種之細菌菌株中表現之其他抗原包括糖蛋白及脂聚糖抗原、古細菌抗原、黑色素瘤抗原E (MAGE)、癌胚抗原(CEA)、MUC-1、HER2、唾液酸基-Tn (STn)、人類端粒酶逆轉錄酶(hTERT)、威爾姆氏腫瘤基因(WT1)、CA-125、前列腺特異性抗原(PSA)、艾伯斯坦-巴爾病毒抗原、新抗原、致癌蛋白、β-澱粉狀蛋白、τ蛋白、PCSK9及成癮物質，例如菸鹼、灑精、鴉片劑或其類似物。
本發明亦可用於增強對針對諸如阿茲海默氏病(Alzheimer’s Disease)及其他神經退化性病症之非傳染性疾病之疫苗的反應，在此情況下用於本發明之抗原可為β-澱粉狀蛋白或τ蛋白。非傳染性疾病之其他此等抗原包括PCSK9 (用於治療升高之膽固醇)。
本發明亦可用於增強對針對例如菸鹼、灑精或鴉片劑之成癮物質之疫苗的反應。
實例亦證實本發明之組合物具有抗微生物活性。因此，本發明之組合物可尤其有效地用於針對細菌感染、尤其革蘭氏陰性細菌感染之疫苗。本發明之組合物可發揮抗細菌感染之抗微生物作用，同時亦刺激免疫系統以應對感染。因此，在某些實施例中，本發明之組合物治療細菌感染及預防將來之細菌感染。細胞療法 嵌合抗原受體 T 細胞 (CAR-T) 療法
實例亦證明本發明之組合物之投與可引起TLR2之活化之增加。TLR2刺激增強CAR-T療法之功效[41]。因此，本發明之組合物可用於細胞療法、尤其CAR-T細胞療法中。在一個實施例中，本發明之組合物用於細胞療法中。在一個實施例中，本發明之組合物用於CAR-T細胞療法中。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療慢性淋巴球性白血病。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於任何此用途。
實例亦證明本發明之組合物之投與可引起NFκB之活化之增加。NFκB活化可提高CAR-T療法之效力[42]。因此，本發明之組合物可用於細胞療法、尤其CAR-T細胞療法中。
在某些實施例中，在CAR-T療法期間T細胞授受性轉移之前，將本發明之組合物投與患者。
在某些實施例中，在CAR-T療法期間T細胞授受性轉移之後，將本發明之組合物投與患者。
因此，本發明之組合物可用於細胞療法，尤其用於增強對細胞療法之反應。間質幹細胞 (MSC) 療法
已報導間質幹細胞(MSC)療法具有免疫刺激性質。當MSC用LPS處理時，其上調促炎性細胞介素IL-8，此引起B細胞增殖增加[43]。因此，由於本發明之組合物顯示增加B細胞增殖之表現，因此其可與MSC細胞療法組合使用。幹細胞移植療法
已報導，代替在幹細胞移植療法中使用未分化幹細胞，在移植前使幹細胞在某種程度上分化可能有益。舉例而言，Heng等人[44]報導幹細胞之心肌源性分化因具有較高植入效率、增強之肌細胞再生及增加之心臟功能恢復而可能有益。此外，研究已證明，用某些共生細菌菌株進行胃腸道定殖可改良同種異體造血細胞移植後之存活[45]。由於本發明之組合物之投與刺激細胞，因此本發明之組合物可用於幹細胞移植療法中之幹細胞分化。免疫衰老
Fulop等人[46]確定Treg細胞數目增加及B細胞數目降低與適應性免疫系統之衰老相關。因此，本發明之組合物可用於預防或延遲免疫衰老。在一個實施例中，本發明之組合物用於預防免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物用於延遲特徵在於Treg細胞數目增加之免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物用於延遲特徵在於B細胞數目降低之免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物用於延遲特徵在於Treg細胞數目增加及B細胞數目降低之免疫衰老。在一個實施例中，本發明之組合物因降低Treg細胞數目而用於延遲免疫衰老。在一個實施例中，本發明之組合物因增加B細胞數目而用於延遲免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物因降低Treg細胞數目及增加B細胞數目而用於延遲免疫衰老。在一個實施例中，本發明之組合物用於治療由免疫衰老引起之疾病。在一個實施例中，本發明之組合物因延遲及/或預防免疫衰老而用於治療衰老相關之疾病。較佳地，本發明提供包含以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株、或其衍生物或生物型之組合物，其用於任何此用途。
此外，已提出疫苗佐劑可克服免疫衰老[47]。由於本發明之組合物適合用作疫苗佐劑，因此本發明之組合物可用於預防或延遲免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物作為疫苗佐劑用於延遲及/或預防免疫衰老。在另一實施例中，本發明之組合物用作疫苗佐劑，其中該等組合物延遲及/或預防免疫衰老。
與免疫衰老相關之疾病包括心血管疾病、神經退化性疾病(諸如阿茲海默氏病及帕金森氏病(Parkinson’s disease)、癌症、2型糖尿病[48]及自體免疫性病症[49]。
罹患免疫衰老之個體可能易受細菌感染。實例顯示本發明之組合物具有抗微生物活性。因此，在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防展現出免疫衰老之患者(諸如老年患者、或年齡超過50歲、55歲、60歲、65歲、70歲或75歲之患者)之細菌感染。治療及預防細菌感染
實例證實短雙歧桿菌且尤其本發明之短雙歧桿菌菌株具有有效之抗微生物活性。因此，在某些實施例中，本發明之組合物用於治療或預防細菌感染。
在較佳實施例中，感染係胃腸感染。已顯示短雙歧桿菌菌株、尤其本發明之短雙歧桿菌菌株在投與於胃腸道時具有有效作用(參見實例及WO2016/2032)。在較佳實施例中，感染係革蘭氏(Gram)陰性細菌感染。在尤佳實施例中，感染係革蘭氏陰性胃腸感染，諸如幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)、腸炎沙門氏桿菌、傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhi)或大腸桿菌感染。通常，細菌感染係病原性細菌感染。在較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防胃腸大腸桿菌感染。在其他較佳實施例中，本發明之組合物用於治療或預防胃腸道沙門氏桿菌感染。
在一些實施例中，細菌感染屬於選自由以下組成之清單之屬：大腸桿菌屬(Escherichia
)、
克留氏菌屬(Klebsiella
)、
沙門氏桿菌屬(Salmonella
)及芽孢桿菌屬(Bacillus
)。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染為大腸桿菌感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染為克留氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae
)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係鼠傷寒沙門氏桿菌(S.
Typhimurium)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係枯草芽孢桿菌(B. subtilis
)感染。本發明之組合物顯示對此等細菌具有有效之抗微生物活性。
在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa
)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae
)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染為沙眼披衣菌(Chlamydia trachomatis
)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染為鼠疫耶氏桿菌(Yersinia pestis
)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染為腦膜炎奈瑟氏球菌感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染為卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis
)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染為流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae
)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染為嗜肺性退伍軍人菌(Legionella pneumophila
)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係銅綠假單胞菌感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae
)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係幽門螺旋桿菌感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係腸炎沙門氏桿菌感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係傷寒沙門氏桿菌感染。在一些實施例中，用於治療或預防之細菌感染係副傷寒沙門氏桿菌(Salmonella
paratyphi)感染。此等細菌為革蘭氏陰性，因此可能對本發明之組合物敏感，如實例中所示。
在一些實施例中，本發明之組合物用於在細菌感染之治療中降低細菌活力。本發明之細菌可用於將病原細菌之水準恢復至無症狀水準或自個體中完全消除病原細菌，從而治療細菌感染，以及減輕與細菌水準升高相關之症狀。
在一些實施例中，本發明之組合物用於在細菌感染之預防治療中抑制細菌之生長。換言之，組合物可對引起感染之細菌具有細胞生長抑制活性。
在某些實施例中，組合物延遲復發性感染之發作或預防復發性感染。在某些實施例中，欲治療之個體處於發展為細菌感染之風險下，諸如為無症狀帶菌者。在其他實施例中，本發明之組合物用於治療展現出細菌感染症狀之患者。
較佳地，本發明中用於治療或預防細菌感染之細菌能夠使棉子糖發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時。
較佳地，本發明中用於治療或預防細菌感染之細菌展現出β-葡萄糖苷酶之中間發酵或α-阿拉伯糖之中間發酵，或更佳β-葡萄糖苷酶之中間發酵及α-阿拉伯糖之中間發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時，及例如當經歷Rapid ID 32A分析時。實例證實短雙歧桿菌菌株MRX004及測試3二者皆具有有用之活性，且二者皆展現出β-葡萄糖苷酶及α-阿拉伯糖之中間發酵。
較佳地，本發明中用於治療或預防細菌感染之細菌未展現出N-乙醯基-β-胺基葡萄糖苷酶之陽性發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時，及例如當經歷Rapid ID 32A分析時。細菌可能僅展現出N-乙醯基-β-胺基葡萄糖苷酶之中間發酵或不發酵。實例證實短雙歧桿菌菌株MRX004及測試2二者皆具有有用之活性，且二者皆未展現出N-乙醯基-β-胺基葡萄糖苷酶之陽性發酵。
較佳地，本發明中用於治療或預防細菌感染之細菌展現出α-半乳糖苷酶之中間發酵或α-阿拉伯糖之中間發酵，或更佳α-半乳糖苷酶之中間發酵及α-阿拉伯糖之中間發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時，及例如當經歷Rapid ID 32A分析時。實例證實短雙歧桿菌菌株MRX004及測試8二者皆具有有用之活性，且二者皆展現出α-半乳糖苷酶及α-阿拉伯糖之中間發酵。
在替代實施例中，本發明中用於治療或預防細菌感染之細菌使絲胺酸芳基醯胺酶發酵，而不使白胺醯基甘胺酸芳基醯胺酶發酵，且不使丙胺酸芳基醯胺酶發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時，及例如當經歷Rapid ID 32A分析時。實例證實短雙歧桿菌菌株測試11及測試12二者皆具有有用之活性，且二者皆使絲胺酸芳基醯胺酶發酵，而不使白胺醯基甘胺酸芳基醯胺酶發酵，且不使丙胺酸芳基醯胺酶發酵。
在替代實施例中，本發明中用於治療或預防細菌感染之細菌展現出絲胺酸芳基醯胺酶之中間發酵，例如當在適當懸浮培養基(諸如API懸浮培養基)中於37℃下培養4小時時，及例如當經歷Rapid ID 32A分析時。實例證實短雙歧桿菌菌株測試3及測試7二者皆具有有效之抗微生物活性，且二者皆展現出絲胺酸芳基醯胺酶之中間發酵。
可使用此項技術中已知之任何合適之分析來評估細菌使碳水化合物源或胺基酸發酵之能力。較佳地，使用Rapid ID 32A分析(較佳使用來自bioMérieux之Rapid ID 32A系統)。 投與模式
較佳地，本發明之組合物經調配以投與胃腸道，以便使得能夠遞送至腸部及/或使本發明之細菌菌株能夠部分或全部定殖腸部。在一些實施例中，術語「腸之完全定殖」意指細菌已定殖在腸之所有部分(即小腸、大腸及直腸)。在本發明之其他實施例中，術語「完全定殖」或「部分定殖」意指細菌分別永久或暫時保留在腸中。一般地，雖然本發明之組合物係經口投與，但其可經直腸、經鼻內或經由頰或舌下途徑投與。
在某些實施例中，本發明之組合物可呈泡沫、噴霧或凝膠形式投與。
在某些實施例中，本發明之組合物可呈栓劑，諸如直腸栓劑，例如呈可哥豆油(可哥脂)、合成硬脂(例如suppocire、witepsol)、甘油基-明膠、聚乙二醇或肥皂甘油組合物之形式投與。
在某些實施例中，本發明之組合物經由管(諸如鼻胃管、口胃管、胃管、空腸造瘺管(J型管)、經皮內視鏡胃造瘺術(percutaneous endoscopic gastrostomy, PEG))或口(port) (諸如提供出入胃、空腸之胸壁口及其他合適出入口)投與胃腸道。
本發明之組合物可投與一次，或其可作為治療方案之一部分依序投與。在某些實施例中，本發明之組合物將每日投與(一次或若干次)。
在本發明之某些實施例中，根據本發明之治療伴隨有患者腸微生物區之評估。若未達成本發明之菌株之遞送及/或部分或全部定殖而使得未觀測到功效，則可重複治療，或者若遞送及/或部分或全部定殖成功且觀測到功效，則可停止治療。
在某些實施例中，本發明之組合物可投與懷孕動物，例如哺乳動物，諸如人類，以降低其子代在子宮內及/或其子代在出生後發生疾病之可能性。
本發明之組合物可投與已診斷患有由免疫活性降低介導之疾病或病狀或已鑒別為處於由免疫活性降低介導之疾病或病狀風險下的患者。組合物亦可作為預防措施投與以預防健康患者中由免疫活性降低介導之疾病或病狀的發生。
本發明之組合物可投與已診斷有免疫活性缺乏或已鑒別為處於免疫活性缺乏風險下之患者。舉例而言，患者可具有減少或缺乏之短雙歧桿菌定殖。
本發明之組合物可作為食品，諸如營養補充劑投與。
一般地，本發明之組合物用於治療人類，但其可用於治療動物，包括單胃哺乳動物，諸如家禽、豬、貓、犬、馬或兔。本發明之組合物可用於增強動物之生長及效能。若投與動物，則可使用經口胃管灌食。 組合物
一般地，本發明之組合物包含細菌。在本發明之較佳實施例中，組合物係以凍乾形式調配。舉例而言，本發明之組合物可包含含有本發明之細菌菌株的顆粒或明膠膠囊，例如硬明膠膠囊。
較佳地，本發明之組合物包含凍乾細菌。細菌凍乾為公知程式且相關指導可於例如參考文獻[50-52]中獲得。實例證實凍乾組合物尤其有效。
或者，本發明之組合物可包含活的活性細菌培養物。
在較佳實施例中，本發明之組合物經囊封以使得能夠將細菌菌株遞送至腸。囊封保護組合物免於降解，直至藉助例如用可藉由pH值變化引起之化學或物理刺激(諸如壓力、酶促活性或物理崩解)破裂而在目標位置遞送。可使用任何適當之囊封法。例示例性囊封技術包括截留在多孔基質內、附著或吸附在固體載體表面上、藉由絮凝或利用交聯劑而自我聚集以及機械容納在微孔膜或微膠囊後。關於可用於製備本發明之組合物之囊封的指導可於例如參考文獻[53]及[54]中獲得。
組合物可經口投與且可呈錠劑、膠囊或粉劑之形式。囊封產品較佳，此乃因短雙歧桿菌為厭氧菌。其他成分(諸如維生素C)可作為除氧劑及益生元基質包括以改良活體內遞送及/或部分或全部定殖及存活。或者，本發明之益生菌組合物可作為食品或營養產品，諸如基於牛乳或乳清之發酵乳製品，或作為醫藥產品經口投與。
在一些實施例中，組合物不包含水解牛乳清。
本發明之組合物包括治療有效量之本發明之細菌菌株。治療有效量之細菌菌株足以對患者發揮有益作用。治療有效量之細菌菌株可足以使得遞送至患者腸部及/或部分或全部定殖患者腸部。
例如適於成年人之細菌日劑量可為約1×103
至約1×1011
菌落形成單位(colony forming unit，CFU)；例如約1×107
至約1×1010
CFU；在另一實例中，約1×106
至約1×1010
CFU；在另一實例中，約1×107
至約1×1011
CFU；在另一實例中，約1×108
至約1×1010
CFU；在另一實例中，約1×108
至約1×1011
CFU。
在某些實施例中，細菌之劑量為每日至少109
個細胞，諸如每日至少1010
個、至少1011
個或至少1012
個細胞。
在某些實施例中，組合物含有相對於組合物之重量，約1×106
至約1×1011
CFU/g，例如約1×108
至約1×1010
CFU/g之量的細菌菌株。劑量可為例如1 g、3 g、5 g及10 g。
組合物之劑量可包含相對於組合物之重量約1×106
至約1×1011
菌落形成單位(CFU)/g之細菌菌株。劑量可適於成年人。例如，組合物可包含如下量之細菌菌株：約1×103
至約1×1011
CFU/g；例如約1×107
至約1×1010
CFU/g；在另一實例中，約1×106
至約1×1010
CFU/g；在另一實例中，約1×107
至約1×1011
CFU/g；在另一實例中，約1×108
至約1×1010
CFU/g；在另一實例中，約1×108
至約1×1011
CFU/g。該劑量可為例如1 g、3 g、5 g及10 g。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中細菌菌株之量為相對於組合物之重量每克約1×103
至約1×1011
菌落形成單位。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該組合物係以500 mg與1000 mg之間、600 mg與900 mg之間、700 mg與800 mg之間、500 mg與750 mg之間或750 mg與1000 mg之間的劑量投與。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該醫藥組合物中之凍乾細菌係以500 mg與1000 mg之間、600 mg與900 mg之間、700 mg與800 mg之間、500 mg與750 mg之間或750 mg與1000 mg之間的劑量投與。
組合物可調配為益生菌。益生菌由FAO/WHO定義為當以足夠量投與時，賦予宿主健康益處之活微生物。
通常，視情況將益生菌(諸如本發明之組合物)與至少一種合適之益生元化合物組合。益生元化合物通常為在上消化道中不降解或吸收之不易消化之碳水化合物，諸如寡糖或多糖，或糖醇。已知益生元包括商業產品，諸如菊糖及反式半乳寡糖。
在某些實施例中，本發明之益生菌組合物包括相對於組合物總重量，約1至約30重量% (例如5重量%至20重量%)之量的益生元化合物。碳水化合物可選自由以下組成之群：果寡糖(或FOS)、短鏈果寡糖、菊糖、異麥芽寡糖、果膠、木寡糖(或XOS)、幾丁寡糖(或COS)、β-葡聚糖、阿拉伯膠改性及抗性澱粉、聚右旋糖、D-塔格糖、阿拉伯膠纖維、角豆膠(carob)、燕麥及柑橘纖維。在一個態樣中，益生元為短鏈果糖-寡糖(下文中為簡單起見而顯示為FOSs-c.c)；該FOSs-c.c為不可消化之碳水化合物，一般由甜菜糖轉變獲得且包括三個葡萄糖分子鍵結之蔗糖分子。
本發明之組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。此等合適賦形劑之實例可見於參考文獻[55]中。用於治療用途之可接受之載劑或稀釋劑為醫藥技術中所習知且闡述於例如參考文獻[56]中。合適載劑之實例包括乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇、山梨糖醇及諸如此類。合適稀釋劑之實例包括乙醇、甘油及水。醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑之選擇可針對意欲投與途徑及標準醫藥實踐來選擇。醫藥組合物可包含任何合適的黏合劑、潤滑劑、懸浮劑、包被劑、增溶劑作為載劑、賦形劑或稀釋劑，或除載劑、賦形劑或稀釋劑之外亦可包含任何合適的黏合劑、潤滑劑、懸浮劑、包被劑、增溶劑。合適黏合劑之實例包括澱粉、明膠、天然糖(諸如葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、β-乳糖、玉米甜味劑)、天然及合成膠(例如阿拉伯膠、黃蓍膠)或海藻酸鈉、羧甲基纖維素及聚乙二醇。合適潤滑劑之實例包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉及諸如此類。防腐劑、穩定劑、染料及甚至矯味劑可提供於醫藥組合物中。防腐劑之實例包括苯甲酸鈉、山梨酸及對羥基苯甲酸酯。亦可使用抗氧化劑及懸浮劑。
本發明之組合物可調配為食品。舉例而言，除本發明之治療作用之外，食品亦可提供營養益處，諸如在營養補充劑中。類似地，可將食品調配成增強本發明組合物之口味，或藉由使其更類似於常見食品而非醫藥組合物，使得組合物食用起來更具吸引力。在某些實施例中，將本發明之組合物調配為基於乳之產品。術語「基於乳之產品」意指具有變化脂肪含量之任何基於乳或乳清之液體或半固體產品。基於乳之產品可為例如牛乳、山羊乳、綿羊乳、脫脂乳、全乳、無任何加工下由乳粉與乳清重組之乳或加工產品，諸如酸乳酪、凝乳、凝塊、酸乳、酸全乳、酪乳及其他酸乳產品。另一重要群包括乳飲料，諸如乳清飲料、發酵乳、煉乳、嬰兒或嬰孩乳；增香乳、霜淇淋；含乳食品，諸如甜食。
在某些實施例中，本發明之組合物含有單一細菌菌株或物種且不含有任何其他細菌菌株或物種。在某些實施例中，本發明之組合物含有單一細菌物種且不含有任何其他細菌物種。在某些實施例中，本發明之組合物含有單一細菌菌株且不含有任何其他細菌菌株。舉例而言，本發明之組合物可僅包含短雙岐桿菌物種之細菌。此等組合物可僅包含最低限度量或生物學上不相干量之其他細菌菌株或物種。此等組合物可為實質上不含其他生物體物種之培養物。在一些實施例中，此等組合物可為實質上不含其他生物體物種之凍乾物。
在一些實施例中，本發明之組合物包含超過一種細菌菌株或物種。舉例而言，在一些實施例中，本發明之組合物包含超過一種來自同一物種內之菌株(例如超過1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、15種、20種、25種、30種、35種、40種或45種菌株)，且視情況不含來自任何其他物種之細菌。在一些實施例中，本發明之組合物包含小於50種來自同一物種內之菌株(例如小於45種、40種、35種、30種、25種、20種、15種、12種、10種、9種、8種、7種、6種、5種、4種或3種菌株)，且視情況不含來自任何其他物種之細菌。在一些實施例中，本發明之組合物包含1-40種、1-30種、1-20種、1-19種、1-18種、1-15種、1-10種、1-9種、1-8種、1-7種、1-6種、1-5種、1-4種、1-3種、1-2種、2-50種、2-40種、2-30種、2-20種、2-15種、2-10種、2-5種、6-30種、6-15種、16-25種或31-50種來自同一物種內之菌株，且視情況不含來自任何其他物種之細菌。在一些實施例中，本發明之組合物包含超過一個來自同一屬內之物種(例如超過1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、12個、15個、17個、20個、23個、25個、30個、35個或40個物種)，且視情況不含來自任何其他屬之細菌。在一些實施例中，本發明之組合物包含小於50個來自同一屬內之物種(例如小於50個、45個、40個、35個、30個、25個、20個、15個、12個、10個、8個、7個、6個、5個、4個或3個物種)，且視情況不含來自任何其他屬之細菌。在一些實施例中，本發明之組合物包含1-50個、1-40個、1-30個、1-20個、1-15個、1-10個、1-9個、1-8個、1-7個、1-6個、1-5個、1-4個、1-3個、1-2個、2-50個、2-40個、2-30個、2-20個、2-15個、2-10個、2-5個、6-30個、6-15個、16-25個或31-50個來自同一屬內之物種，且視情況不含來自任何其他屬之細菌。本發明包含前述之任何組合。
在一些實施例中，組合物包含微生物共生物種(consortium)。舉例而言，在一些實施例中，組合物包含短雙歧桿菌細菌菌株作為微生物共生物種之一部分。舉例而言，在一些實施例中，短雙歧桿菌細菌菌株與一或多種(例如至少2種、3種、4種、5種、10種、15種或20種)來自布勞特氏菌屬(Blautia
)及/或其他屬之其他細菌菌株組合存在，該短雙歧桿菌細菌菌株可與其他屬在活體內腸內共生生活。舉例而言，在一些實施例中，組合物包含短雙歧桿菌之細菌菌株與來自不同屬之細菌菌株之組合。在另一實例中，組合物包含短雙歧桿菌之細菌菌株與來自雙歧桿菌屬之細菌菌株之組合，或組合物包含短雙歧桿菌之細菌菌株與來自雙歧桿菌屬之細菌菌株及來自不同屬之細菌菌株之組合。在一些實施例中，微生物共生物種包含兩種或更多種自單一生物體(例如人類)之糞便樣品獲得之細菌菌株。在一些實施例中，發現微生物共生物種在自然界中不一起存在。舉例而言，在一些實施例中，微生物共生物種包含自至少兩種不同生物體之糞便樣品獲得之細菌菌株。在一些實施例中，兩種不同生物體來自同一物種，例如兩種不同人類。在一些實施例中，兩種不同生物體係人類嬰兒及成年人。在一些實施例中，兩種不同生物體係人類及非人類哺乳動物。
在一些實施例中，本發明之組合物另外包含一種細菌菌株，該細菌菌株具有與以登錄號NCIMB 42380寄存之短雙歧桿菌菌株相同之安全性及治療功效特性，但其並非以登錄號NCIMB 42380寄存之短雙歧桿菌菌株。
在本發明之組合物包含超過一種細菌菌株、物種或屬之一些實施例中，個別細菌菌株、物種或屬可用於分開、同時或依序投與。舉例而言，組合物可包含所有超過一種之細菌菌株、物種或屬，或細菌菌株、物種或屬可分開儲存且可分開、同時或依序投與。在一些實施例中，將超過一種細菌菌株、物種或屬分開儲存，但在使用前混合在一起。
在一些實施例中，用於本發明中之細菌菌株獲自人類成體糞便。在本發明之組合物包含超過一種細菌菌株之一些實施例中，所有細菌菌株皆獲自人類成體糞便，或者若存在其他細菌菌株，則其僅以最低量存在。細菌可能已在自人類成體糞便中獲得且用於本發明之組合物中之後進行培養。
在一些實施例中，一或多種短雙歧桿菌細菌菌株係本發明之組合物中之唯一治療活性劑。在一些實施例中，組合物中之細菌菌株係本發明之組合物中之唯一治療活性劑。
根據本發明使用之組合物可能需要或可能無需上市許可。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該細菌菌株經凍乾。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該細菌菌株經噴霧乾燥。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該細菌菌株經凍乾或噴霧乾燥且其中其為活的。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該細菌菌株經凍乾或噴霧乾燥且其中其能存活。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該細菌菌株經凍乾或噴霧乾燥且其中其能夠部分或全部定殖腸部。在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該細菌菌株經凍乾或噴霧乾燥且其中其能存活且能夠部分或全部定殖腸部。
在一些情況下，使凍乾或噴霧乾燥之細菌菌株在投與之前復原。在一些情況下，復原係藉由使用本文中所述之稀釋劑達成。
本發明之組合物可包含醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑。
在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中在投與有需要之個體時，該細菌菌株之量足以治療病症。
在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足以治療或預防疾病或病狀。
在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足以治療或預防疾病或病狀。
在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足以治療或預防疾病或病狀。
在某些實施例中，本發明提供醫藥組合物，其包含：本發明之細菌菌株；及醫藥學上可接受之賦形劑、載劑或稀釋劑；其中該細菌菌株之量足以治療或預防由降低之免疫反應介導之疾病或病狀。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中細菌菌株之量為相對於組合物之重量每克約1×103
至約1×1011
菌落形成單位。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該組合物係以1 g、3 g、5 g或10 g之劑量投與。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該組合物係藉由選自由口腔、直腸、皮下、鼻、頰及舌下組成之群的方法投與。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由乳糖、澱粉、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、甘露糖醇及山梨糖醇組成之群的載劑。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由乙醇、甘油及水組成之群的稀釋劑。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由以下組成之群的賦形劑：澱粉、明膠、葡萄糖、無水乳糖、自由流動乳糖、β-乳糖、玉米甜味劑、阿拉伯膠、黃蓍膠、海藻酸鈉、羧甲基纖維素、聚乙二醇、油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉及氯化鈉。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其進一步包含防腐劑、抗氧化劑及穩定劑中之至少一者。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其包含選自由苯甲酸鈉、山梨酸及對羥基苯甲酸酯組成之群的防腐劑。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中該細菌菌株經凍乾。
在某些實施例中，本發明提供以上醫藥組合物，其中當將組合物在密封容器中於約4℃或約25℃下儲存且將容器置於具有50%相對濕度之氛圍中時，在至少約1個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年時期後，至少80%如以菌落形成單位量測之細菌菌株保留。
在一些實施例中，本發明之組合物提供於包含如本文所述組合物之密封容器中。在一些實施例中，密封容器係藥囊或瓶。在一些實施例中，本發明之組合物提供於包含如本文所述組合物之注射器中。
在一些實施例中，本發明之組合物可作為醫藥調配物提供。舉例而言，組合物可作為錠劑或膠囊提供。在一些實施例中，膠囊係明膠膠囊(「gel-cap」)。膠囊可為硬膠囊或軟膠囊。在一些實施例中，調配物係軟膠囊。軟膠囊係如下膠囊：其由於添加存在於膠囊殼中之軟化劑(諸如甘油、山梨糖醇、麥芽糖醇及聚乙二醇)而可具有一定彈性及柔軟性。軟膠囊可例如基於明膠或澱粉來生產。基於明膠之軟膠囊可自各種供應商購得。端視投與方法，諸如經口或經直腸投與，軟膠囊可具有各種形狀，其可為例如圓形、橢圓形、長橢圓形或魚雷形。軟膠囊可藉由慣用製程產生，諸如藉由Scherer製程、Accogel製程或微滴或吹製製程。
在一些實施例中，本發明之組合物係經口投與。經口投與可能涉及吞咽，使化合物進入胃腸道。
適於經口投與之醫藥調配物包括固體栓(solid plug)、固體微粒、半固體及液體系統(包括多相或分散系統)，諸如錠劑；含有多顆粒或納米顆粒之軟或硬膠囊、液體(例如水溶液)、乳液或粉劑；菱形錠劑(包括充液型)；嚼錠(chew)；凝膠；快速分散劑型；膜劑；珠形劑(ovule)；噴霧劑；及經頰/黏膜黏著貼片。
在一些實施例中，醫藥調配物係腸溶調配物，即適於藉由經口投與將本發明之組合物遞送至腸之耐胃調配物(例如，耐胃pH)。當細菌或組合物之另一組分對酸敏感(例如在胃條件下易於降解)時，腸溶調配物可能尤其有用。
在一些實施例中，腸溶調配物包含腸溶包衣。在一些實施例中，調配物係腸溶包衣劑型。舉例而言，調配物可為腸溶包衣錠劑或腸溶包衣膠囊或諸如此類。腸溶包衣可為慣用腸溶包衣，例如，用於經口遞送之錠劑、膠囊或諸如此類之慣用包衣。調配物可包含膜包衣，例如腸溶聚合物之薄膜層，例如酸不溶性聚合物。
在一些實施例中，腸溶調配物係本質上腸溶性的，例如耐胃的，而無需腸溶包衣。因此，在一些實施例中，調配物係不包含腸溶包衣之腸溶調配物。在一些實施例中，調配物係由熱膠凝材料製成之膠囊。在一些實施例中，熱膠凝材料係纖維素材料，諸如甲基纖維素、羥甲基纖維素或羥丙基甲基纖維素(HPMC)。在一些實施例中，膠囊包含不含任何成膜聚合物之殼。在一些實施例中，膠囊包含殼，且殼包含羥丙基甲基纖維素，且不包含任何成膜聚合物(例如參見[57])。在一些實施例中，調配物係本質上腸溶性之膠囊(例如，來自Capsugel之Vcaps®)。 培養方法
用於本發明之細菌菌株可使用如例如參考文獻[58-60]中詳述之標準微生物學技術來培養。
用於培養之固體或液體培養基可為YCFA瓊脂或YCFA培養基。YCFA培養基可包括(每100 ml，近似值)：酪腖(1.0 g)、酵母提取物(0.25 g)、NaHCO3
(0.4 g)、半胱胺酸(0.1 g)、K2
HPO4
(0.045 g)、KH2
PO4
(0.045 g)、NaCl (0.09 g)、(NH4
)2
SO4
(0.09 g)、MgSO4
·7H2
O (0.009 g)、CaCl2
(0.009 g)、刃天青(0.1 mg)、氯化血紅素(1 mg)、生物素(1 μg)、鈷胺素(1 μg)、對胺基苯甲酸(3 μg)、葉酸(5 μg)及吡哆胺(15 μg)。 用於疫苗組合物中之細菌菌株
本發明者已確定本發明之細菌菌株可用於治療或預防與免疫活性降低相關之疾病或病狀。此可能為本發明之細菌菌株對宿主免疫系統所具有的作用之結果。因此，當作為疫苗組合物投與時，本發明之組合物亦可用於預防疾病或病狀。在某些此等實施例中，本發明之細菌菌株可經殺死、滅活或減毒。在某些此等實施例中，組合物可包含疫苗佐劑。在某些實施例中，組合物用於經由注射，諸如經由皮下注射投與。 通則
除非另外指明，否則本發明之實施將採用在本領域技術內之習知化學、生物化學、分子生物學、免疫學及藥理學方法。此等技術在文獻中有充分解釋。參見例如參考文獻[61]及[62-68]等。
術語「包含」涵蓋「包括」以及「由......組成」，例如「包含」X之組合物可排他性地由X組成，或可包括其他某物，例如X + Y。
關於數值x
之術語「約」為視情況存在的且意指例如x
±10%。
詞語「實質上」不排除「完全」，例如「實質上不含」Y之組合物可完全不含Y。必要時，本發明之定義中可省略詞語「實質上」。
提及兩個核苷酸序列之間的序列一致性百分比意指在比對時，在比較該兩個序列時該百分比之核苷酸相同。此比對及同源性或序列一致性百分比可使用此項技術中已知之軟體程式，例如參考文獻[69]之部分7.7.18中所述之軟體程式來測定。較佳比對藉由Smith-Waterman同源性搜索演算法使用仿射空位搜索(其中開放空位罰分為12且空位延伸罰分為2、BLOSUM矩陣為62)來確定。Smith-Waterman同源性搜索演算法揭示於參考文獻[70]中。
除非特別陳述，否則包括多個步驟之製程或方法可在方法開始或結束包括其他步驟，或可包括其他插入步驟。此外，適當時可組合，省略或以替代次序進行。
本文中闡述本發明之各個實施例。應瞭解各實施例中說明之特徵均可與其他所說明之特徵組合以提供其他實施例。特定而言，本文中強調為合適、典型或較佳之實施例可彼此組合(除非其互斥時)。
本說明書中引用之所有專利及參考文獻皆特此以全文引用之方式併入。
任何對治療方法之提及(包括向患者投與劑)亦涵蓋用於該治療方法中之該劑，以及該劑在該治療方法中之用途，以及該劑在製造藥物中之用途。
以下實例僅出於說明目的而提供，且並不意欲以任何方式限制本發明之範疇。實施本發明之模式 實例 1 概述
此研究之目的係表徵MRx0004之活體外免疫調節性質。此外，基因體學、轉錄體學及蛋白質體學之組合用於鑒別可能負責介導宿主對MRx0004之反應之潛在關鍵效應物。材料與方法 細菌菌株、質體及引子
用於產生此研究中之菌株之所有細菌菌株及質體及引子皆列於表1中。除非另有說明，否則在厭氧操作臺(workstation) (Don Whitley Scientific, Shipley, UK)中在酵母提取物-酪蛋白水解產物-脂肪酸(YCFA)肉湯(E&O Labs, Bonnybridge, UK)中在37℃下常規培養短芽孢桿菌菌株。在37℃下將大腸桿菌菌株在Luria Bertani (LB)肉湯[71]中在攪動下常規培養。適當時，生長培養基補充有四環素(tetracycline) (10 μg/ml)、氯黴素(對於大腸桿菌為10 μg/ml或對於短雙歧桿菌為3 μg/ml)、紅黴素(對於大腸桿菌為100 μg/ml或對於短雙歧桿菌為1 μg/ml)、奇黴素(100-300 μg/ml)或康黴素(kanamycin) (50 μg/ml) (所有抗生素皆來自Sigma-Aldrich，Gillingham，UK)。在補充有40 μg/ml X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)及0.1 M IPTG (異丙基-β-D-半乳吡喃糖苷) (二者皆由Sigma-Aldrich供應)之LB瓊脂上選擇含有pORI19或pWSK29之重組大腸桿菌細胞。永生化細胞之常規培養
在補充有10% (v/v)胎牛血清(FBS)、4 mM L-麩醯胺酸、1X非必需胺基酸溶液及1X抗生素抗真菌溶液之經高葡萄糖改良的達爾伯克氏最低伊格爾氏培養基(Dulbecco's Minimal Eagle's Medium) (DMEM)中常規培養HT29-MTX-E12細胞(Public Health England, Salisbury, UK)。將細胞接種至分析容器中且培養9天，接著將其用漢克氏(Hank's)平衡鹽水溶液洗滌兩次且置於共培養基(補充有4 mM L-麩醯胺酸、1X非必需胺基酸溶液、5 μg/ml脫鐵運鐵蛋白(apo-transferrin)及200 ng/ml亞硒酸鈉之DMEM)中，之後開始處理。用於共培養分析之細菌處理物之製備
對於共培養實驗，培養細菌直至其達到對數期。藉由離心分離活細菌細胞及上清液，接著用PBS (Sigma-Aldrich)將活細菌(命名為LV
)洗滌一次，且再懸浮於適當細胞培養基中用於下游使用。使上清液(命名為SN
)通過0.22 μm過濾器且在共培養基中適當稀釋。藉由在80℃培育30分鐘，接著用PBS洗滌且再懸浮於適當細胞培養基中來製備熱滅活細菌(命名為HK
)。藉由塗鋪確認活菌計數。報告分析
使HEK-BlueTM
-hTLR2及THP1-BlueTM
NF-κB細胞生長至90%密度，用PBS洗滌一次，且分別以280,000個細胞/ml及500,000個細胞/ml之密度再懸浮於不含抗生素之培養基中。
將細菌處理物(活的、熱殺死的及上清液)以100:1之感染複數(MOI)添加至細胞中。陽性分析對照、PamCS3K4 (Invivogen)及熱殺死之單核球增多性李氏菌(L. monocytogenes
) (HKLM) (Invivogen)分別以10 ng/ml濃度及200:1之MOI使用。製備陰性對照、培養基及媒劑以提供每處理之等效物。接著將細胞在37℃及5% CO2
下培育22 h。將來自共培養物之培養基在QUANTI-BlueTM
(Invivogen)中稀釋10倍，且培育1小時(NFκB)或2小時(TLR2)並且記錄655 nm處之光密度。與 HT29-MTX 細胞之大規模共培養物
如先前所述，在10 cm直徑之Transwells® (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)之上室中培養HT29-MTX細胞。如先前所述將細菌培養至對數後期，洗滌且再懸浮。將細菌以100:1之MOI添加至細胞中，且將共培養物在厭氧條件下在37℃下培育3小時。自transwell之上室收集含有細菌之培養基，且以5000xg離心5-10分鐘以收集細菌細胞用於下游應用。細菌 qPCR 分析
收集細菌用於在對數後期及靜止生長期以及在與HT29-MTX大規模共培養後自活體外培養物中分離RNA。依照製造商之說明書(QIAGEN, Hilden, Germany)，使用RNAProtect細菌試劑收集且儲存細菌。藉由以下方式來裂解細菌細胞：將其與溶菌酶(15 mg/ml) (Sigma-Aldrich)及蛋白酶K (6 mAU) (QIAGEN)在37℃下培育30分鐘，隨後使用FastPrep 24儀器(6 m/s持續20 s，2個循環)及裂解基質(Lysing Matrix) B (皆來自MP Biomedicals，Santa Ana，CA，USA)進行均質化。使用RNeasy微型套組(Mini Kit) (QIAGEN)分離總RNA，且使用無RNA酶之DNA酶(RNase-Free DNase)在柱上消化(on-column digest) (QIAGEN)中去除基因體DNA，兩者皆依照製造商之說明書進行。依照製造商之說明書，使用Superscript IV套組(Thermo Fisher Scientific)合成cDNA。使用Primer3Plus軟體設計引子[72]。依照製造商之建議在Power SYBRTM
綠色PCR主混合物(Green PCR Master Mix) (Thermo Fisher Scientific)中設立qPCR反應，且使用以下循環在7500快速即時PCR系統(Fast Real-time PCR System) (Thermo Fisher Scientific)上實施分析：95℃ 10分鐘，接著進行95℃ 15秒、60℃ 1分鐘的40個循環。使用雙ΔCt分析對數據實施分析，且相對於持家groEL
將測試基因之表現正規化。細菌細胞刮取
視情況在對數後期生長期中或在與HT29-MTX接觸(詳情參見上文共培養部分)後藉由離心收穫細菌細胞。接著洗滌細胞並以1/20稀釋度將其再懸浮於50 mM TEAB緩衝液(pH 8.5) (Sigma-Aldrich)中。藉由將細胞與測序級經修飾之胰蛋白酶(Promega, Madison, WI, USA)在37℃下在補充有1 mM DTT (Sigma-Aldrich)之50 mM TEAB緩衝液中培育30分鐘來產生經刮取蛋白質級分。對於各樣品，平行培育不含胰蛋白酶之管，作為脫落蛋白質之對照(脫落蛋白質級分)。藉由在4℃下以4000xg離心15分鐘收穫經刮取及脫落之蛋白質級分，且藉助Millex-GV 0.22 μm之低蛋白質結合膜(Millipore)進行注射器式過濾。根據製造商之說明書使用PierceTM
BCA蛋白質分析套組(Thermo Fisher Scientific)量測總蛋白質濃度，且藉由SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)評估樣品品質。在胰蛋白酶處理之前及之後，藉由在YCFA瓊脂上塗鋪，進行存活細胞計數。對於各分析，接著藉由奈米LC-MS/MS分析來自三個生物學重複之樣品。藉由 LC-MS/MS 鑒別蛋白質
簡言之，將培養上清液濃縮至0.5 ml並用超純水洗滌，使用ReadyPrep 2-D純化套組(Cleanup Kit) (Bio-Rad)使蛋白質沈澱，且將其再懸浮於100 μl 50 mM碳酸氫銨中。接著將樣品與豬胰蛋白酶(Promega)在37℃下培育16 h，且藉由真空離心將所得上清液乾燥並溶解於0.1%三氟乙酸中。使用μ-C18 ZipTips (Merck, Keniloworth, NJ, USA)將肽進一步去鹽且溶析至96孔微量滴定板中，藉由真空離心乾燥且溶解於10 μl LC-MS載入溶劑(2%乙腈、0.1%甲酸)中。藉由奈米LC-MS/MS (Q精確混合四極-軌道阱MS系統，Q Exactive hybrid quadrupole-Orbitrap MS system) (Thermo Fisher Scientific)使用15-cm PepMap柱、60分鐘LC-MS採集方法及5 μl之注射體積分離且鑒別肽。對於刮取及脫落之蛋白質級分，將70 μl 50 mM碳酸氫銨直接添加30 μl樣品中。接著將樣品與豬胰蛋白酶(Promega)在37℃下培育隔夜，且將所得上清液在-70℃下冷凍，藉由真空離心乾燥且溶解於20 μL LC-MS載入溶劑中。藉由奈米LC-MS/MS (Q精確混合四極-軌道阱MS系統，Thermo Scientific)使用25-cm PepMap柱、60分鐘LC-MS採集方法及2 μl之注射體積分離且鑒別肽。利用Proteome Discoverer (Thermo Fisher Scientific)進行數據分析。Mascot Server用作具有以下參數之搜尋引擎：酶=胰蛋白酶，最大混合切割位點=2，前驅物質量允差=10 ppm，動態修飾=氧化(M)，靜態修飾=脲甲基(C)。將鑒別之肽與基於短雙歧桿菌MRx0004之測序基因體構築的菌株特異性蛋白質序列資料庫(2,047個序列)相匹配。當在所有三個生物學重複中鑒別出至少五種肽時，認為蛋白質鑒別有效。短雙歧桿菌 MRx0004-EPSneg 之互補
藉由使用Q5高保真度聚合酶(High-Fidelity Polymerase) (New England BioLabs, Herefordshire, United Kingdom)及引子對(pGTFcompF及pGTFcompR)自短雙歧桿菌MRx0004染色體DNA進行PCR擴增，產生涵蓋編碼主要糖基轉移酶之基因pGTF
及其假定啟動子之DNA片段。用HinDIII及XbaI (二者皆來自New England Biolabs，Ipswich，MA，USA)消化所得片段，且將其連接至類似消化之pBC1.2。藉由電轉型將連接混合物引入大腸桿菌EC101中，接著基於Cm抗性選擇轉型體。藉由限制性分析篩選許多Cm抗性轉型體之質體含量。藉由測序確認選殖插入物在許多重組質體中之完整性，然後將其引入大腸桿菌EC101 pWSK29-MRX-M+S中，以促進甲基化。藉由電穿孔與在補充有Tet及Cm之強化梭菌瓊脂(Reinforced Clostridial Agar) (RCA; Thermo Fisher Scientific)進行選擇將甲基化pBC1.2或pBC1.2-pGTF轉型至MRx0004-EPSneg
中。使用質體DNA之菌落PCR限制分析檢查轉型體之質體含量，且藉由測序進行驗證。將所得菌株分別命名為短雙歧桿菌MRx0004-EPS-
-pBC1.2及MRx0004-EPS-
-pBC1.2-pGTF。來自 HT29-MTX 細胞之細胞介素分析
將活細菌(如先前所述製備)與HT29-MTX細胞在24孔板中在37℃及5% CO2
下以100:1之MOI共培育3小時。接著將人類重組TNFα (PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA)以10 ng/ml添加至細胞中，接著將共培養物再培養24小時，隨後收集上清液且在4℃下以12000xg離心3分鐘以去除細胞碎屑。依照製造商之推薦，使用人類IL-8 (CXCL8)標準ABTS ELISA顯色套組(Development Kit) (PeproTech)分析上清液中之IL-8含量。與 PBMC 之共培養
健康冷凍之人周邊血單核細胞(PBMC)購自STEMCELL Technologies (Cambridge, UK)。將細胞解凍且在具有10% FBS、2 mM L麩醯胺酸及100 U/ml青黴素(penicillin)、100 μg/ml鏈黴素(streptomycin)之完全生長培養基RPMI 1640中在37℃及5% CO2
下靜置隔夜(所有試劑皆來自Sigma-Aldrich)。如先前所述製備細菌處理物。對於共培育，將細胞以750,000個細胞/孔之密度塗鋪在48孔板中，且與熱滅活之細菌及MOI為10:1之細菌上清液共培養，使用適當媒劑及5 ug/ml PHA (Sigma-Aldrich)作為對照。將共培養物在37℃及5% CO2
下培育72小時，接著收集細胞且在4℃下以10000xg離心3分鐘。收集無細胞上清液且將其儲存在-80℃下用於細胞介素分析。將細胞沈澱洗滌一次，接著在冰上再懸浮於PBS中。流式細胞術
彙集處理孔，每組得到1.5×106
個PBMC，將其再懸浮於150 μl PBS中且轉移至準備用於染色之96 V型底板中。首先在室溫下在黑暗中用Viobility 405/520可固定染料(Fixable Dye) (Miltenyi Biotec Ltd.，Bergisch Gladbach，Germany)將細胞染色10分鐘，以區分活細胞及死細胞。接著將其與CD3、CD4、CD8、CD25、CD127及CD19之抗體混合物一起染色以確定細胞表型(Miltenyi REA抗體)且在室溫下再培育10分鐘。接著洗滌細胞且將其再懸浮於PBS中，且立即經由流式細胞術分析進行分析。同型用於第一實驗期間之所有抗體以幫助設定門(gate)，且在所有實驗中皆包括FMO對照。使用BD FACS Aria II進行所有實驗，其中使用FACSDiva軟體(BD Biosciences, Reading, UK)在「活」門中對100,000個細胞設定用於採集之停止門(stopping gate)。該分析係使用Flowjo 10.4.2版軟體(FlowJo LLC, Oregon, USA)進行，且係基於用活力染料鑒別之活細胞。細胞介素分析
依照製造商之推薦，使用定制之ProcartaPlex多重免疫分析(Thermo Fisher Scientific)，在來自PBMC共培養物之無細胞上清液中實施細胞介素定量。簡言之，使用MAGPIX® MILLIPLEX®系統(Merck)，利用xPONENT軟體(Luminex, Austin, TX, USA)處理50 μl上清液。使用MILLIPLEX®分析軟體(Merck)，利用5參數邏輯曲線及背景扣除將平均螢光強度(MFI)轉換成pg/ml值來分析數據。數據分析
使用用於Windows，GraphPad Software，La Jolla CA USA之GraphPad Prism 7.00版實施統計分析。使用單因子變異數分析及Tukey多重比較檢定分析數據。使用Interactivenn產生文氏圖[73]。結果 MRx0004 刺激 NFκB 及 TLR2 報告細胞
由於促炎轉錄因子NFκB在先天性免疫之調控中之必要作用，因此採用THP-1-NFκB報告細胞株來檢查MRx0004對促炎轉錄因子NFκB活化之影響。熱殺死之單核球增多性李氏菌(HKLM) (InvivoGen)用作此分析之陽性對照。為了鑒別此菌株之有效級分，將THP-1-NFκB細胞與活細菌(MRx0004LV
)、細菌培養上清液(MRx0004SN
)及熱滅活細菌(MRx0004HK
)之處理物共培養。與未處理細胞及細菌生長培養基(YCFA)之陰性對照相比，所有三種細菌處理物皆顯著活化NFκB (對於所有比較，p
＜0.0001) (圖7A)。MRx0004LV
係最有效之處理，且比MRx0004SN
及MRx0004HK
顯著更具刺激性(對於兩種比較，p＜
0.0001)。MRx0004HK
之活性進而顯著高於MRx0004SN
(p=
0.006)。
由於MRx0004顯示活化NFκB，因此研究MRx0004刺激上游受體TLR2、TLR4、TLR5及TLR9之能力。初步資料表明MRx0004不活化TLR4、TLR5及TLR9 (資料未顯示)。用陽性對照Pam3CSK4以及與上文所述相同之MRx0004處理物及陰性對照處理HEK-TLR2報告分析(圖7B)。與陰性對照相比，所有MRx0004處理皆刺激TLR2 (對於所有比較，p
＜0.0001)。與MRx0004SN
(p＜
0.0001)及MRx0004HK
(p
＜0.0001)相比，MRx0004LV
係最具刺激性之處理，後者MRx0004HK
係有效性最低之處理。基於此等資料，MRx0004能夠以TLR2相關方式有效刺激先天免疫反應。MRx0004 之轉錄及蛋白質體剖析揭示潛在宿主反應效應物
為了在MRx0004中鑒別宿主反應之潛在效應物，採用了三種方法。採用靶向轉錄分析來分析10個作為雙歧桿菌-宿主相互作用之已知效應物的具有預測一致性之MRx0004基因(資料未顯示)。此等基因包括編碼預測之黏附素及兼職(moonlighting)蛋白質(oppA
、烯醇酶
、轉醛醇酶
、tadA
、eftU
、支鏈澱粉酶
)之基因(廣泛綜述於[74]中)，以及在定殖及免疫調節中具有推定作用之基因(MRx0004 EPS基因座之主要糖基轉移酶(pGTF)
[75]、luxS
[76]及絲胺酸蛋白酶抑制劑[77])及具有推定治療作用之基因(pks
[78])。在自MRx0004分離之RNA中分析此等基因之表現，該MRx0004在液體培養中生長至對數後期及靜止期，以及已與大規模transwell中培養之HT29-MTX細胞接觸3 h。qPCR分析(圖8)證實，與靜止期相比，eftU
、烯醇酶
及pGTF
在對數後期顯著上調，而oppA
、支鏈澱粉酶
、絲胺酸蛋白酶抑制劑
及tadA
在靜止期之表現顯著高於對數後期。六種基因(eftU
、烯醇酶
、pGTF
、oppA
、絲胺酸蛋白酶抑制劑
及轉醛醇酶
)相對於對數後期，因應腸上皮細胞(IEC
)而顯著上調。自此分析顯而易見，MRx0004之基因表現藉由與IEC之接觸而改變，推斷上調基因在MRx0004-宿主相互作用中之潛在作用。此qPCR分析中大多數顯著上調之基因已預測在與IEC之黏附中之作用，此表明此可能為MRx0004之重要功能性質。
藉由鑒別培養上清液中和細胞表面上存在之蛋白質，進一步表徵MRx0004對其他宿主-反應效應物之表現。奈米LC-MS/MS分析在MRx0004SN
中鑒別出64種蛋白質(表2)。用最高匹配肽數目(PSM)鑒別之蛋白質係支鏈澱粉酶(351.33±33.62)、兩種NlpC/P60家族蛋白質(82±15.62及71.67±13.61)、ABC運輸蛋白系統之溶質結合蛋白質(56±7)及細胞分裂蛋白質FtsI (56±4.36)。鑒別若干參與短雙歧桿菌及其他細菌物種中之宿主相互作用之兼職蛋白質，其包括轉醛醇酶(32.67±3.79)、GAPDH (30±3.61)、DnaK (17.67±3.21)、GroEL (12.67±0.58)及烯醇酶(5.67±0.58)[66、79-84]。
使用酶促細胞刮取方法進行MRx0004細胞表面上存在之蛋白質之鑒別。使用胰蛋白酶刮取細菌細胞，且使用LC-MS/MS鑒別經切割之表面相關蛋白質(經刮取蛋白質級分)。亦收集來自非胰蛋白酶對照之蛋白質且藉由LC-MS/MS分析，允許鑒別鬆散地結合至表面之蛋白質(脫落蛋白質級分)。鑒別出總共106種經刮取蛋白質，其中44種經預測錨定在細胞壁中(即存在於經刮取蛋白質級分中且不存在於經脫落蛋白質級分中) (表3，圖15)。如對MRx0004SN
所觀測到的，所鑒別之最豐富之經刮取蛋白質係支鏈澱粉酶(136.67±17.47)，其亦在經脫落蛋白質級分(79±10.54)中偵測到。有趣地，亦在兩種細胞刮取級分中鑒別出I型聚酮化合物合成酶，儘管在經刮取蛋白質級分中比在經脫落蛋白質級分中鑒別出更多匹配之肽(分別為54.67±10.69及11.67±6.43)。亦在MRx0004細胞刮取級分中偵測到所有在MRx0004SN
中存在且在上文列示的兼職蛋白質(表3)。此外，在經刮取蛋白質級分及經脫落蛋白質級分二者中皆鑒別出EfTu (PSM分別=32±5及24.33±8.39)。亦在細胞刮取及上清液資料集中之一者或二者中偵測到五種藉由qPCR分析之基因(eftU
、烯醇酶
、luxS
、支鏈澱粉酶
及轉醛醇酶
)，從而確認此等基因之轉譯。來自轉錄及蛋白質體資料集之資料共同使吾人能夠識別MRx0004中之潛在相關新穎效應物。
有趣地，澱粉分解酶支鏈澱粉酶(細胞刮取資料集中最豐富之蛋白質)係兼職蛋白質，已報導其可能參與釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes
)與糖蛋白及宿主細胞之活體外黏附[85、86]。此外，已報導來自動物雙歧桿菌乳酸亞種(B. animalis
subsp.lactis
)之DnaK及烯醇酶[74、75]及來自長雙歧桿菌之EfTu [87]活體外黏附至胞漿素原。此外，兩叉雙歧桿菌(B. bifidum
) A8之糖酵解酶轉醛醇酶在乳酸乳球菌(L. lactis
)中之重組表現增加該菌株對黏蛋白之黏附性[76]。MRx0004生產此等兼職蛋白質表明其可能在MRx0004之黏附能力中起作用，從而促進與宿主細胞表面之相互作用。尚未闡述雙歧桿菌兼職蛋白質對特定宿主細胞受體及信號傳導途徑之作用，且此等可能代表MRx0004之新穎調控路徑，MRx0004藉助該等新穎調控路徑與宿主相互作用。研究 MRx0004 調節先天免疫反應之特徵
進行進一步實驗以表徵宿主對MRx0004之反應。
為了輔助此研究，構築一種菌株(EPSneg
)，其中EPS基因座之pGTF
基因藉助插入誘變而失活(圖16A)。藉由利用[88]中所述之方法而非操縱II型限制-修飾(RM)系統來構築此菌株，使來自MRx0004 I型RM系統之甲基化酶及特異性次單元表現且用於使質體DNA甲基化，接著進行轉型。亦產生互補EPSneg
菌株(EPScomp
)及EPSneg
空載體菌株(EPSvec
)作為對照。
藉由將HEK-TLR2及THP-1-NFκB報告細胞與MRx0004、EPSneg
、EPSvec
及EPScomp
之活的上清液處理物共培育來評估EPS對TLR2及NFκB活化之影響。所有活細菌處理皆以相當之程度活化TLR2 (圖12A)。相比之下，MRx0004LV
對NFκB之活化顯著低於EPSneg LV
(p
= 0.003)及EPSvec LV
(p
= 0.009)，但不低於EPScomp LV
(圖12B)。MRx0004SN
及EPScomp SN
之間之TLR2及NFκB活化沒有差異，證實在此情況下野生型及互補型展示出相似之表型。EPSneg SN
及EPSvec SN
對於TLR2 (對於兩者，p
＜0.0001)及NFκB (分別為p
=0.002及0.0013)之刺激性顯著高於MRx0004SN
。此等資料表明MRx0004對TLR2之活化並非藉助其EPS直接介導。相比之下，在不存在EPS之情況下，因應於MRx0004細胞表面之暴露，NFκB之活化增加。此等資料表明MRx0004之有效免疫調節最佳使用整個完整細胞來達成，且TLR2之MRx0004配位體主要為細胞表面相關的，但亦可脫落或分泌。
亦研究了MRx0004及其衍生菌株對活體外IEC發炎模型之影響。用MRx0004及其衍生物將HT29-MTX細胞引發3小時，接著將TNFα作為發炎刺激劑添加至孔中且再持續24小時。使用此模型，與無細菌對照相比，MRx0004不降低TNFα介導之IL-8分泌(圖12C)。然而，與基線對照相比，MRx0004處理使非TNFα刺激之細胞中之IL-8分泌降低。與MRx0004之處理相比，EPSneg
處理使TNFα誘導之IL-8分泌顯著降低(p
＜0.0001)。EPSvec
處理細胞及EPScomp
處理細胞中之IL-8分泌亦顯著低於對MRx0004之反應(對於兩種比較，p
＜0.0001)。有趣地，與報告分析中由EPSneg
所證實之作用不同，表面相關抗原之未遮罩似乎對IEC具有抗炎作用。MRx0004 對適應性免疫反應之影響
為了檢查MRx0004對適應性免疫系統之作用，使用來自健康人類供體之周邊血單核細胞(PBMC)來表徵細胞群體及細胞介素分泌譜。PHA在此分析中用作陽性對照(資料未顯示)。將PBMC與來自MRx0004及其衍生菌株之熱滅活細菌細胞及無細胞培養上清液共培育72小時。藉由流式細胞術分析T細胞(CD3+
CD4+
及CD3+
CD8+
)、Treg (CD3+
CD4+
CD25+
CD127-
)及B細胞(CD3-
CD19+
)表面標記物(連同活化標記物CD25)之表現(圈選策略參照圖18)。在此模型中使用熱滅活細菌而並非活細菌作為處理物，此乃因在72小時培育期間活細菌可能生長且在營養物競爭方面超過人類細胞。細胞表面標記物及細胞介素因應於來自所有測試菌株之細菌上清液之表現與因應於媒劑(YCFA)觀測到之表現相比並無顯著不同(資料未顯示)。EPSvec
及EPScomp
之資料示於圖20及圖21中。
與未處理之對照相比，MRx0004HK
處理使活化CD8+
CD25+
子集顯著增加(p
=0.0038，圖13A)，而與對照相比，EPSneg HK
並未顯著增加活化CD8+
CD25+
細胞之百分比。與對照相比，MRx0004HK
及EPSneg HK
均未顯著增加CD8+
、CD4+
或CD4+
CD25+
T細胞群體之百分比(圖19A及19B、圖13B)。與未處理細胞相比，MRx0004HK
及EPSneg HK
以相似之統計學顯著程度增加B細胞群體(分別為p=
0.001及0.0013，圖13E)。B細胞活化(CD19+
CD25+
)未受到任何施加之處理之顯著影響(圖19-C)。在CD4+
細胞群體內，使用CD25+
CD127-
表面標記物分析Treg細胞之比例。當與未處理之細胞相比時，在EPSneg HK
處理之PBMC中而並非MRx0004HK
PBMC中觀察到Treg之相對百分比之增加(p
=0.0014，圖13C)。EPSneg HK
相對於MRx0004HK
增加Treg (p
=0.0196)。與未處理之細胞相比，對於MRx0004HK
處理觀測到Treg/CD8+
比率向調控性T細胞反應之偏斜(skew) (p
= 0.0008，圖13D。此外，增加之因應MRx0004HK
之CD8+
正偏斜顯著高於向EPSneg HK
之偏斜(p
=0.0272，圖13D)。總之，此等資料確認MRx0004之免疫刺激作用，且表明EPS之喪失可導致增加之Treg刺激及Treg/CD8+
比率以及降低之免疫刺激作用。雖然EPS可能在CD8+
細胞之活化中起作用，但它似乎不參與顯著調節B細胞群體。
藉由對主要與Th1 (IL-12p70、IFNγ、TNFα)、Th2 (IL-4)、Th17 (IL-17α、IL-1β)及Treg (IL-10)群體相關之細胞介素進行定量，亦確定用MRx0004HK
及EPSneg HK
處理之PBMC的分泌細胞介素特徵(signature)。與未處理細胞相比，MRx0004HK
處理顯著增加TNFα、IL-12p70、IFNγ、IL-4及IL-17α (分別為p
=0.0038、0.0025、0.0036、0.027及0.0316，圖14A-D)。用EPSneg HK
處理誘導TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-10及IL-17α之顯著反應(分別為p
=0.0001、0.0267、＜
0.0001、0.0004及0.0103，圖14A、圖14C、圖14E-G)。與MRx0004HK
不同，與未處理細胞相比，EPSneg HK
並未顯著增加IL-12p70或IL-4之分泌。與EPSneg HK
相比，MRx0004HK
亦顯著增加IL-12p70 (p
=0.0118，圖14B)，而相反，發現EPSneg HK
處理比MRx0004HK
產生更高濃度之IL-1β及IL-10 (分別為p
=0.0008及0.014，圖14E-F)。
使用由各個別T輔助細胞次型產生之細胞介素作為指標分析細胞介素比率以推斷細菌處理是否使T輔助細胞反應向特定次型偏斜(Th1或Th2；IL-12p70/IL-4，Treg；IL-10/IL1p70、Th17；IL-1β/IL12p70，圖14H-J)。與未處理細胞相比，MRx0004HK
處理似乎使免疫反應顯著向Th1表型偏斜(p
=0.0172，圖14H)，而與未處理細胞相比，EPSneg HK
處理似乎誘導向Treg反應及Th17反應兩者之偏斜(p
=0.0312及0.0005，圖14I-J)。與MRx0004HK
相比，EPSneg HK
Treg及Th17偏斜亦顯著增加(p
=0.0423及0.0008，圖14J)。在MRx0004HK
與EPSneg HK
處理之間觀測到其驅動不同T細胞反應子集之能力之明顯區別。
總之，此研究中之觀測結果證實MRx0004調控先天性及適應性免疫反應之促炎小組(arm)。因此，MRx0004及其他短雙歧桿菌菌株可用於刺激免疫系統及治療與免疫活性降低相關之疾病。 實例 2- 表徵 MRx0004 eps 基因座對效力的作用 概述
本研究之目的係表徵MRx0004胞外多糖(EPS)在MRx0004之免疫刺激及治療性質中之作用。材料與方法
如實例1中所述進行實驗，其他程序如下文所述。永生化細胞之常規培養
使HEK-BlueTM
-hTLR2細胞(InvivoGen, San Diego, CA, USA)在補充有10% (v/v) FBS、4 mM L-麩醯胺酸、4.5 mg/ml葡萄糖、100 U/ml青黴素、100 μg/ml鏈黴素、100 μg/ml NormocinTM
(InvivoGen)、30 μg/ml滅瘟素(blastocydin)及100 μg/ml吉歐黴素(zeocin)之DMEM中生長至90%密度。使THP1-Blue™ NF-kB細胞(InvivoGen)在補充有10% (v/v)熱滅活FBS、2 mM L-麩醯胺酸、100 U/ml青黴素、100 μg/ml鏈黴素、25 mM HEPES、100 μg/ml NormocinTM
、10 μg/ml滅瘟素(cRPMI)之RPMI 1640中生長。在37℃及5% CO2
下培養細胞株。除非另有說明，否則所有試劑皆由Sigma-Aldrich供應。MRx0004 EPS 基因座與相關短雙歧桿菌菌株之比較分析
在GenBank資料庫中可獲得之雙歧桿菌屬菌株基因體，其用於來自雙歧桿菌屬菌株之推定胞外多糖基因簇之EPS簇及物理圖譜的電腦分析MRx0004 EPS 基因座之差異表現分析
根據略作修改之製造商方案，利用RNAprotect (Qiagen)及RNeasy微型套組(Qiagen)對菌株MRx0004之對數後期培養物提取總RNA。使用裂解基質B及振盪設定為6 m/s之MP Fast-Prep-24組織及細胞均質器(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)進行機械細胞裂解。將細胞破碎兩個20 s循環，在循環之間在冰上靜置1分鐘。利用Agilent RNA Screentape (Agilent Technologies)在Tapestation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)上檢查RNA品質。檢查到RNA降解之缺失，且所有樣品皆具有≥9之最小RNA完整性數(Integrity Number)。MICROBExpress套組(Thermo Fisher Scientific)用於耗盡rRNA種類。使用Agilent RNA RNA Screentape (Agilent Technologies)在Agilent生物分析儀(Bioanalyzer)上檢查評估16S及23S rRNA種類之缺失。將耗盡rRNA之RNA樣品送至GATC Biotech進行股特異性文庫製備，且在Illumina測序上測序以產生150 bp之單端讀段(read)。獲得每個RNA-Seq文庫平均22,3878,08個(對數後期樣品)及18627178.6個(靜止期樣品)原始讀段，總計分別超過10.07 Gbp及8.38 Gbp。使用Trimmomatic修剪原始讀段 (1)且使用Bowtie相對於MRx0004基因體進行品質過濾(98.36%對數後期樣品及98.26% (靜止期樣品)讀段通過QC且係經比對99.11% (LL)及98.72% (SP)之經作圖有效讀段(clean reads mapped)) (2)。使用XX及DeSeq2 v X (Love等人，2014)計算MRx0004 EPS基因座中各基因之各生長期的重複樣品之表現水準，隨後使用Geneious R11 (Biomatters, Auckland, New Zealand)顯現。呈現兩個生長期之間之差異表現。兩個樣品之間之正規化值之比率的以2為底之對數，且當一個樣品沒有或有非常低之表現時，log2比率之上限為+/-1,000,000。穿透式電子顯微術 (TEM)
將細菌在固定溶液(於0.1 M磷酸鈉緩衝液中之0.5 M蔗糖、2%多聚甲醛及0.16%戊二醛)中以1:5稀釋，且在室溫下固定2小時。此後，使Formvar-碳塗覆之銅格網在100 μl短雙歧桿菌懸浮液微滴上漂浮1小時，用PBS中之0.02 M甘胺酸洗滌三次。用1.0%鉬酸銨對細胞進行負染色。使用JEM-1400穿透式電子顯微鏡(JEOL Ltd.，Tokyo，Japan)檢查格網，且使顯微照片顯現。細菌黏附分析
將活細菌(如先前所述製備且再懸浮於共培養基中)以100:1之MOI施加至24孔板中之HT29-MTX細胞，且在厭氧條件下在37℃下共培育3小時。用PBS將細胞洗滌兩次以去除未結合之細菌，且用0.1% (v/v) Triton X-100 (Sigma-Aldrich)裂解。將裂解物塗鋪，且使用恢復之菌落形成單位(CFU)之數目來確定黏附百分比。結果
MRx0004
之
eps
基因座在遺傳上不同於其他短雙歧桿菌菌株，且在對數後期生長期間高度表現。
菌株MRx0004之基因體測序表明其含有28 Kb EPS基因座，發現該基因座編碼27個基因，代表了預測在短雙歧桿菌中EPS生物合成所需之完整全套功能。此區域包括：引發糖基轉移酶、四種額外糖基轉移酶、在跨膜蛋白質下游編碼之焦磷酸噻胺結合蛋白質、翻轉酶及鏈長決定子(圖9)。大多數短雙歧桿菌EPS基因座(包括菌株MRx0004之EPS基因座)側接假設蛋白質(將MRx0004區域延伸至31.5 Kb)，該等假設蛋白質已被排除在圖9中所呈現之短雙歧桿菌EPS基因座之代表之外。大多數(16/19)於圖9中所示之菌株係嬰兒分離物，其基因體在公共資料庫中過度呈現。認為超過50 Kb之短雙歧桿菌EPS區域代表編碼所有產生EPS陽性表型所需功能的完整基因座[89]。相比之下，當此等區域＜30 Kb時，認為其代表不完整或殘留之基因座[81]。
比較分析將EPS基因座鑒別為菌株MRx0004 (資料未顯示)與其他短雙歧桿菌菌株之基因體之間之遺傳差異的主要區域。將MRx0004 EPS基因座與可公開獲得之短雙歧桿菌基因體進行比較。EPS基因座展示與菌株MRx0004之高水準之序列一致性(ID)及基因同線性的短雙歧桿菌菌株示於圖9中，且根據其與MRx0004之相似性(在操縱子之長度上之平均nt ID%)排序。短雙歧桿菌NRBB51 (嬰兒(母乳餵養)分離物)與菌株MRx0004在兩個基因座之整個長度上共有最高水準之核苷酸一致性(ID) (91.5%)。編碼兩種菌株中預測轉位酶之中心1.3 Kb區域代表菌株MRx0004與NRBB51之間之多樣性的主要區域。在MRx0004基因座之起點及終點編碼之基因展示出與其他短雙歧桿菌分離物之最高水準的序列保守性(圖9)。對於主要EPS生物合成步驟必不可少的MRx0004之pGTF
與比較菌株中之同源物共有92.2%配對ID (aa)。涵蓋鏈長調控物之4 Kb區域以及編碼假設蛋白質及跨膜蛋白質之基因在所檢查之菌株中共有98.3% nt ID。編碼假設蛋白質及轉座酶之基因代表菌株MRx0004與十個最密切相關之EPS基因座之間的序列多樣性之主要區域(圖9)。相比之下，發現與菌株MRx0004之EPS基因座較不相似之短雙歧桿菌EPS基因座(圖9中之底部9個菌株)展示出對EPS產生至關重要之基因(包括gtf
、聚合酶及乙醯基轉移酶基因)之數目及順序的變異(圖9)。
為了確定MRx0004之EPS基因座是否在對數後期或靜止期生長期間更高轉錄，對在YCFA中生長之菌株MRx0004之單培養物實施差異表現分析。(圖9B)。大多數預測主要負責MRx0004 EPS合成(如上所述)之基因在對數後期生長期間上調。MRx0004 EPS基因座編碼10種假設蛋白質及5種轉座酶，其代表在MRx0004靜止期生長期間上調之唯一基因類別(圖9)。假設蛋白質在MRx0004 EPS合成中之作用仍然未知。MRx0004 之 EPS 陰性菌株之產生
研究MRx004 EPS在宿主-微生物相互作用及免疫調節中之作用，且如上文所述構築一種菌株(EPSneg
)，其中EPS基因座之pGTF
基因藉助插入誘變而失活(圖16A)。藉由利用[80]中所述之方法而非操縱II型限制-修飾(RM)系統來構築此菌株，使來自MRx0004 I型RM系統之甲基化酶及特異性次單元表現且用於使質體DNA甲基化，之後進行轉型。亦產生互補EPSneg
菌株(EPScomp
)及EPSneg
空載體菌株(EPSvec
)作為對照。與MRx0004相比，EPSneg
及EPSvec
展示出增加之自動聚集表型(圖16B)。EPScomp
之聚集性低於EPSneg
及EPSvec
，但其自動聚集似乎與MRx0004相比有所增加，表明此菌株可能未完全恢復至野生型EPS表型。
使用穿透式電子顯微術(TEM)研究MRx0004及EPSneg
之EPS表型。與MRx0004相比在EPSneg
菌株不存在EPS示於圖10A及圖10B中。使用活體外IEC模型分析野生型MRx0004及其衍生菌株之黏附能力。EPSneg
與IEC之黏附性為MRx0004之兩倍以上(分別為47.5%黏附性相對於18.7%，p
=0.006) (圖10C)，表明EPS之缺失增加EPSneg
之黏附能力。用EPSvec
維持在EPSneg
中所見增加之黏附表型(40.1%黏附，相對於MRx0004，p
=0.03)，但當與任何其他菌株比較時，EPScomp
之黏附(34.1%)並無顯著不同，進一步暗示EPScomp
逆轉為野生型表型係不完全的。MRx0004 中之 EPS 耗盡暴露參與宿主刺激之表面蛋白質
EPSneg
對IEC之黏附增加表明EPS之耗盡可能導致表面相關蛋白質之暴露增加或「未遮罩」。在MRx0004及EPSneg
表面相關蛋白質與IEC接觸後分析其組成。在與HT29-MTX細胞接觸3 h後，如先前所述用胰蛋白酶刮取細菌細胞，且藉由LC-MS/MS分析所得之刮取及脫落之蛋白質級分。與IEC接觸後之MRx0004細胞刮取產生55種刮取蛋白質(預測其中34種為表面錨定)及24種脫落蛋白質(圖11A)。與IEC接觸後，EPSneg
細胞之刮取含有比MRx0004多得多的蛋白質，刮取蛋白質級分中有101種蛋白質，且脫落蛋白質級分中有45種蛋白質(圖11B)。除了三種在MRx0004脫落蛋白質級分中鑒別出之蛋白質(參與碳水化合物、脂質及蛋白質代謝之酶)之外，所有鑒別之蛋白質皆存在於兩種菌株之刮取蛋白質級分中。
MRx0004及EPSneg
刮取蛋白質級分之比較鑒別出54種存在於兩個樣品中之蛋白質及47種對EPSneg
菌株特異之蛋白質(圖11C)。在MRx0004刮取蛋白質資料集中獨特鑒別之唯一蛋白質係NlpC/P60家族蛋白質。對於EPSneg
菌株，藉由細胞刮取收穫之蛋白質之數目高於MRx0004，推斷EPS耗盡促進更好地獲取用於胰蛋白酶切割之表面蛋白質。另外，已知參與雙歧桿菌及其他屬中宿主相互作用之蛋白質在EPSneg
刮取蛋白質級分中比在MRx0004之刮取蛋白質級分中更豐富(如藉由所鑒別肽之數目/μg總蛋白質所評估) (表4)。此等結果進一步增加EPS耗盡導致未遮罩效應，從而暴露表面蛋白質及原本被MRx0004 EPS遮蔽之潛在MRx0004免疫原之假設之可信度。
亦藉由LC-MS/MS分析EPSneg
培養上清液之蛋白質含量，且確認EPS之缺乏導致EPSneg
菌株在細胞外環境中可能脫落及分泌之蛋白質數目增加(圖17)。在EPSneg SN
中鑒別出總共146種蛋白質，相比之下，在MRx0004SN
中僅鑒別出64種蛋白質，其中87種僅在EPSneg SN
中偵測到，而59種在兩個樣品中皆偵測到。除GAPDH之外，在MRx0004SN
中鑒別及上面討論之兼職蛋白質皆在EPSneg SN
中以較高豐度偵測到，該GAPDH在兩個樣品之間相當(MRx0004SN
及EPSneg SN
中為30±3.61及28.33±0.58)。有趣地，在EPSneg SN
中排他性地偵測到已顯示在乳酸乳球菌及長雙歧桿菌中之人類胞漿素原結合中起作用的膽醯甘胺酸(choloylglycine)水解酶(膽鹽水解酶)及EfTu [72、79]。膽鹽水解酶亦可保護共生物種免受腸中之環境應力[90]。與MRx0004SN
相比，在EPSneg SN
中之蛋白質之偵測增加表明，在缺失EPS之情況下未遮罩可導致MRx0004表面相關蛋白質之脫落或分泌增加。結論
比較基因體分析證實，MRx0004中負責EPS合成之基因座在遺傳上不同於其他短雙歧桿菌菌株。在此區域中觀測到之遺傳變異數可能有助於增強MRx0004及相關菌株之效力及治療效用。
EPS作為MRx0004:宿主相互作用之介質及作為免疫反應之效應物的潛在重要性受到其與IEC
接觸後其pGTF
表現之相對增加之支持。除pGTF
外，qPCR分析中大多數其他顯著上調之基因亦已預測在與IEC之黏附中之作用，此暗示此可能為MRx0004之重要功能性質。MRx0004之IV型菌毛相關基因tadA
在活體外培養中表現，由於先前觀測到短雙歧桿菌UCC2003之Tad菌毛不在活體外條件下產生，因此此係有趣的[91]。絲胺酸蛋白酶抑制劑之表現亦因應於IEC而顯著增加。最近已報導來自長雙歧桿菌NCC2705之絲胺酸蛋白酶抑制劑減少活體內腹腔疾病模型之小腸內上皮內淋巴球之浸潤[92]，從而誘導免疫刺激及保護作用，此表明短雙歧桿菌、尤其MRx0004之絲胺酸蛋白酶抑制劑可能具有相似之免疫調節作用。
上清液及細胞刮取物之蛋白質體學分析偵測到大量在碳水化合物代謝中具有預測作用之蛋白質。有趣地，澱粉分解酶支鏈澱粉酶(細胞刮取資料集中最豐富之蛋白質)係兼職蛋白質，已報導其可能參與釀膿鏈球菌與糖蛋白及宿主細胞之活體外黏附[77、78]。此外，已報導來自動物雙歧桿菌乳酸亞種之DnaK及烯醇酶[74、75]及來自長雙歧桿菌之EfTu [79]活體外黏附至胞漿素原。此外，兩叉雙歧桿菌A8之糖酵解酶轉醛醇酶在乳酸乳球菌中之重組表現增加該菌株對黏蛋白之黏附性[76]。MRx0004生產此等兼職蛋白質表明其可能在MRx0004之黏附能力中起作用，從而促進與宿主細胞表面之相互作用。此等雙歧桿菌兼職蛋白質可能對介導MRx0004對免疫系統之增強作用的特定宿主細胞受體及信號傳導路徑具有特定作用。
MRx0004誘導活化CD8+
子集之顯著增加，此似乎與EPS之存在部分地相關。
與MRx0004相比，EPSneg
處理顯著增加Treg。此表明EPS之去除暴露了另一種能夠與宿主細胞相互作用且促進Treg反應之細菌表面組分。CD8+群體及Treg群體二者中之波動皆很明顯。EPSneg
誘導向Treg反應之顯著偏斜，如藉由與基線相比顯著增加之Treg/CD8比率所示。此暗示EPSneg
中細胞表面之未遮罩引起抗炎作用，且MRx0004中存在EPS支持其免疫刺激效力。
發現MRx0004之EPS直接參與IL-12p70之分泌。此外，所有三種測試之Th1細胞介素(IL-12p70、IFNγ、TNFα)之分泌皆被MRx0004HK
顯著上調，表明此菌株誘導向Th1反應之偏斜，該Th1反應部分地藉助MRx0004HK
之EPS介導。MRx0004HK
亦顯著誘導Th2細胞介素IL-4，且上調IL-10、IL-1β及IL-17α，但不顯著，從而推斷此菌株可誘導T輔助細胞微環境之轉變。Th1之誘導可改良活體內腸障壁穩定性且有益於維持免疫穩態。
MRx0004之EPS可具有特異性免疫調控作用，即調控CD8+、Treg及Th1反應，且此等作用可提供增強之效力及治療功效。 實例 3- 細菌接種物在小鼠癌症模型中之功效 概述
如前述實例中所述，本發明者已鑒別出短雙歧桿菌、尤其MRX004菌株之新的免疫刺激作用。鑒於上文所呈現之新資料，包含短雙歧桿菌、尤其MRX004菌株之組合物預期有效刺激免疫系統且治療與免疫系統活性降低或受益於免疫系統活性增加相關之疾病。
癌症係可受益於攻擊腫瘤之免疫系統活性增加之疾病。與上文所呈現之新資料及MRX004之新免疫刺激作用一致，MRX004在下面之研究中顯示有效降低小鼠腫瘤模型中之腫瘤體積，此證實投與MRX004有效治療疾病。
此研究在四種腫瘤模型中測試包含根據本發明之細菌菌株之組合物之功效，且與抗-CTLA抗體比較了功效。材料
測試物質
-細菌菌株編號MRX004短雙歧桿菌。
參考物質
-抗-CTLA-4抗體(純系：9H10，目錄：BE0131，同型：敘利亞倉鼠(Syrian Hamster) IgG1，Bioxcell)。
測試及參考物質媒劑
-細菌培養基(酵母提取物-酪腖-脂肪酸培養基(YCFA))。每天注射給小鼠，用PBS稀釋抗體(參考：BE14-516F，Lonza，France)。
處理劑量
-細菌：200 μL中2×108
個。以10 mg/kg/注射來注射抗-CTLA-4。根據小鼠最近體重，以10 mL/kg/投與之劑量體積投與抗-CTLA-4 (即，對於一隻稱重為20 g之小鼠，將投與200 μL測試物質)。
投與途徑
-藉由經口胃管灌食(經口，PO)經由插管投與細菌接種物。每天將插管除污。將抗-CTLA-4注射至小鼠之腹膜腔中(腹膜內，IP)。
細菌菌株之培養條件
-細菌菌株之培養條件如下：
● 移取10 mL YCFA (自製備之10 mL E＆O實驗室瓶中)至Hungate管中
● 將管密封且使用注射器輸入及排氣系統用CO2
沖洗
● 對Hungate管進行高壓滅菌
● 在冷卻時，用1 mL甘油儲備液接種Hungate管
● 將管置於37℃靜態培育箱中且保持約16小時。
● 次日，取1 mL此繼代培養物且接種10 mL YCFA (再次預熱沖洗之Hungate管，全部一式兩份)
● 將其於37℃之靜態培育箱中放置5至6 h癌細胞株及培養條件
-
所用細胞株詳述於下表中：
| 細胞株 | 類型 | 小鼠品系 | 來源 |
| EMT-6 | 乳癌 | BALB/c | ATCC |
| LL/2 (LLC1) | 肺癌 | C57BL/6 | ATCC CRL1642 |
| Hepa1-6 | 肝細胞癌 | C57BL/6 | IPSEN INNOVATION |
由可移植鼠類乳癌建立EMT-6細胞株，在BALB/cCRGL小鼠中植入增生性乳腺小泡結節後出現該鼠類乳癌[93]。
由C57BL小鼠之帶有腫瘤之肺建立LL/2 (LLC1)細胞株，該腫瘤係由原發性Lewis肺癌之植入引起[94]。
Hepa 1-6細胞株係在C57/L小鼠中產生之BW7756小鼠肝瘤之衍生物[95]。
細胞培養條件
-所有細胞株皆在37℃下在加濕氛圍(5% CO2
、95%空氣)中作為單層生長。培養基及補充劑示於下表中：
| 細胞株 | 培養基 | 補充劑 |
| EMT6 | 含有2 mM L-麩醯胺酸之RPMI 1640 (參考：BE12-702F，Lonza) | 10%胎牛血清(參考：編號3302，Lonza) |
| LL/2 (LLC1) | 含有2 mM L-麩醯胺酸之RPMI 1640 (參考：BE12-702F，Lonza) | 10%胎牛血清(參考：編號3302，Lonza) |
| Hepa1-6 | DMEM (參考：11960-044，Gibco) | 10%胎牛血清(參考：編號3302，Lonza) 2 mM L-麩醯胺酸 青黴素-鏈黴素(Sigma G-6784) |
對於實驗使用，藉由在不含鈣或鎂且藉由添加完全培養基中和之漢克氏培養基(參考：BE10-543F，Lonza)中用胰蛋白酶-維耳新(versene) (參考：BE17-161E，Lonza)處理5分鐘，自培養瓶中分離黏附腫瘤細胞。在血球計中對細胞進行計數且藉由0.25%台盼藍排除分析(trypan blue exclusion assay)評估其活力。動物使用
-
自CHARLES RIVER (L'Arbresles)獲得匹配重量及年齡之健康雌性Balb/C (BALB/cByJ)小鼠用於EMT6模型實驗。
自CHARLES RIVER (L'Arbresles)獲得匹配重量及年齡之健康雌性C57BL/6 (C57BLl6J)小鼠用於LL/2(LLC1)及Hepa1-6模型實驗。
根據FELASA導則，使動物維持SPF健康狀態，且遵循根據法國及歐洲法規(French and European Regulations)之動物飼養及實驗程序以及NRC實驗動物照護及使用指南(Care and Use of Laboratory Animals)[96、97]。將動物維持在飼養室中受控環境條件下：溫度：22±2℃，濕度55±10%，光週期(12 h光照/12 h黑暗)，HEPA過濾空氣，每小時15次空氣交換，無再循環。動物圍欄(Animal enclosure)設有無菌且足夠之空間，該空間有如所述之墊鋪材料、食物及水、環境及社群豐富化(成群飼養)：通風架中的900 cm2
籠(參考：綠色，Tecniplast)、Epicea墊料(SAFE)、10 kGy輻照飲食(A04-10, SAFE)、用於免疫活性齧齒類動物之完整食品-R/M-H擠出物、來自水瓶之水。實驗設計及治療 抗腫瘤活性， EMT6 模型
治療時間表-首次給藥之開始視為D0。在D0，使用Vivo manager®軟體(Biosystemes, Couternon, France)將未植入小鼠根據其個體體重隨機分組，每組9隻或8隻。在D0，小鼠接受媒劑(培養基)或細菌菌株。在D14，如下文所述，向所有小鼠植入EMT-6腫瘤細胞。在D24，來自陽性對照組之小鼠接受抗-CTLA-4抗體治療。
治療時間表匯總於下表中：
| 組 | 動物數目 | 治療 | 劑量 | 途徑 | 治療時間表 |
| 1 | 8 | 未治療 | - | - | - |
| 2 | 8 | 媒劑(培養基) | - | PO | Q1Dx42 |
| 3 | 9 | 細菌菌株1號(MRX004) | 2×108 個細菌 | PO | Q1Dx42 |
| 4 | 8 | 抗CTLA4 | 10 mg/kg | IP | TWx2 |
如下文所述進行動物監測。
在動物中誘導EMT6腫瘤-在D14，藉由將1×106
個於200 μL RPMI 1640中之EMT-6細胞皮下注射至小鼠之右側腹中來誘導腫瘤。
安樂死-當每隻小鼠達到如下文所述之人道終點時，或在開始給藥後最多6週後，對每隻小鼠實施安樂死。抗腫瘤活性， LL/2 (LLC1) 模型
治療時間表-首次給藥之開始視為D0。在D0，使用Vivo manager®軟體(Biosystemes, Couternon, France)將未植入小鼠根據其個體體重隨機分成7組，每組9隻或8隻。在D0，小鼠將接受媒劑(培養基)或細菌菌株。在D14，如下文所述，向所有小鼠植入LL/2腫瘤細胞。在D27，來自陽性對照組之小鼠接受抗-CTLA-4抗體治療。
治療時間表匯總於下表中：
| 組 | 動物數目 | 治療 | 劑量 | 途徑 | 治療時間表 |
| 1 | 8 | 未治療 | - | - | - |
| 2 | 9 | 媒劑(培養基) | - | PO | Q1Dx42 |
| 3 | 9 | 細菌菌株1號(MRX004) | 2×108 個細菌 | PO | Q1Dx42 |
| 4 | 8 | 抗CTLA4 | 10 mg/kg | IP | TWx2 |
如下文所述進行動物監測。
在動物中誘導LL/2 (LLC1)腫瘤-在D14，藉由將1×106
個於200 μL RPMI 1640中之LL/2 (LLC1)細胞皮下注射至小鼠之右側腹中來誘導腫瘤。
安樂死-當每隻小鼠達到如下文所述之人道終點時，或在開始給藥後最多6週後，對每隻小鼠實施安樂死。抗腫瘤活性， Hepa1-6 模型
治療時間表-首次給藥之開始視為D0。在D0，使用Vivo manager®軟體(Biosystemes, Couternon, France)將未植入小鼠根據其個體體重隨機分成7組，每組9隻。在D0，小鼠接受媒劑(培養基)或細菌菌株。在D14，如下文所述，向所有小鼠植入Hepa1-6腫瘤細胞。在D16，來自陽性對照組之小鼠接受抗-CTLA-4抗體治療。
治療時間表匯總於下表中：
| 組 | 動物數目 | 治療 | 劑量 | 途徑 | 治療時間表 |
| 1 | 9 | 未治療 | - | - | - |
| 2 | 9 | 媒劑(培養基) | - | PO | Q1Dx42 |
| 4 | 9 | 細菌菌株2號(MRX004) | 2×108 個細菌 | PO | Q1Dx42 |
| 7 | 9 | 抗CTLA4 | 10 mg/kg | IP | TWx2 |
如下文所述進行動物監測。
藉由脾內注射在動物中原位誘導Hepa 1-6腫瘤細胞-在D14，經由脾內注射將一百萬(1×106
)個於50 μL RPMI 1640培養基中之Hepa 1-6腫瘤細胞移植至小鼠中。簡言之，製成左肋下側腹小切口且自腹內取出脾臟。將脾臟暴露在無菌紗布墊上，且在視覺控制下用27號針頭注射細胞懸浮液。在細胞接種後，切除脾臟。
安樂死-當每隻小鼠達到如以下部分中所述之人道終點時，或在開始給藥後最多6週後，對每隻小鼠實施安樂死。
評價安樂死時之腫瘤負荷-在終止時，收集肝臟並稱重。動物監測
臨床監測-每週兩次用卡尺量測腫瘤之長度及寬度，且藉由下式估計腫瘤之體積[98]：
人道終點[99]：疼痛、痛苦或困苦之徵象：疼痛姿勢、疼痛面罩、行為；超過正常體重之10%、但不超過2000 mm3
之腫瘤；干擾行走或營養之腫瘤；潰瘍性腫瘤或組織侵蝕；連續3天保持體重減輕20%；身體狀況差、消瘦、惡病體質、脫水；長期缺乏對外部刺激之自主性反應；呼吸急促困難(Rapid laboured breathing)、貧血、大量出血；神經系統徵象：環狀運動、抽搐、麻痹；體溫持續下降；腹脹。
麻醉-異氟醚氣體麻醉用於所有程式：手術或腫瘤接種、靜脈內注射、血液採集。氯胺酮及甲苯噻嗪麻醉用於立體定向(stereotaxia)外科手術。
止痛-卡普洛芬(carprofen)或多模式卡普洛芬/丁基原啡因(buprenorphine)止痛方案適應於外科手術之嚴重程度。為所有疼痛性程序提供非藥理學照護。另外，在主治獸醫之建議下，提供不干擾研究之藥理學照護(主題治療)。
安樂死-藉由過劑量氣體麻醉(異氟醚)、接著進行頸椎脫位或放血進行動物安樂死。結果 抗腫瘤活性， EMT6 模型
結果示於圖1中。用本發明之細菌菌株處理使得腫瘤體積相對於兩種陰性對照明顯減小。如所預期，已知活化免疫系統之陽性對照亦使得腫瘤體積減小抗腫瘤活性， LL/2 (LLC1) 模型
結果示於圖2中。陰性對照及陽性對照表現不如所預期的，此乃因用陽性對照治療之小鼠之腫瘤體積大於陰性對照組。然而，用本發明之細菌菌株治療之小鼠中之腫瘤體積與陽性對照組相當，此與有用之治療及免疫刺激作用一致。抗腫瘤活性， Hepa1-6 模型
結果示於圖3中。未治療陰性對照表現不如所預期的，此乃因此組中之肝臟重量低於其他組。然而，媒劑陰性對照組及陽性對照組二者皆表現為如所預期的，此乃因單獨用媒劑治療之小鼠比用抗CTLA4抗體治療之小鼠具有更大之肝臟，反映了媒劑陰性對照組中更大之腫瘤負荷。用本發明之細菌菌株治療使得肝重量(及因此腫瘤負荷)相對於媒劑陰性對照組中之小鼠明顯降低。
此等資料證實MRX004有效治療癌症，且鑒於實例1及2中之資料，此等資料支持菌株MRX004可用於治療或預防與免疫系統活性降低相關之其他疾病。 實例 4- 酶促活性之表徵
分析概況指數(Analytical Profile Index) (API®)測試系統由含有分析細菌物種中之酶促活性之小型化生化測試的條帶組成。使用兩種API測試系統對MRX004 (以登錄號NCIMB 42380寄存之細菌)進行表徵：Rapid ID 32A-此系統專門設計用於厭氧物種，且涵蓋用於碳水化合物、胺基酸及硝酸鹽代謝以及鹼性磷酸酶活性之測試；及API® 50 CH-此系統測試49種碳水化合物源之發酵，且可與API® CHL Medium結合用於分析厭氧物種。
依照製造商之說明書對細菌菌落實施Rapid ID 32A測試。簡言之，將細菌在厭氧操作臺中在37℃下在YCFA瓊脂上培養24小時。使用無菌之5 μl接種環自板移出菌落，且將其再懸浮於2 ml之API®懸浮培養基安瓿中，直到達到與McFarland標準4號之密度大致相當之密度。向Rapid ID 32A條帶上之各杯狀凹(cupule)中添加55微升細菌懸浮液，且用兩滴礦物油覆蓋尿素酶測試物。用塑膠蓋覆蓋條帶且在37℃下有氧培育4小時，接著使用以下試劑使底列杯狀凹顯色：NIT：NIT1及NIT2各1滴；IND：1滴詹姆斯試劑(James reagent)；所有剩餘之杯狀凹：1滴堅牢藍(FastBlue)試劑。將條帶在室溫下培育5分鐘，接著記錄各杯狀凹之顏色並指定陰性值、中間陽性值或陽性值。
Rapid ID 32A分析結果示於圖4中。MRX004對幾種碳水化合物源(即α-半乳糖苷酶及β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶及β-葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖、甘露糖及棉子糖)、以及胺基酸(精胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、甘胺酸及組胺酸)之發酵測試呈陽性。
在MRX004及四種短雙歧桿菌型菌株之間實施比較Rapid ID 32A分析，該四種菌株在圖4B中注釋為Bif Ref 1 (DSM 20091)、Bif Ref 2 (DSM 20213)、Bif Ref 6 (JCM 7017)及Bif Ref 7 (UCC2003)。此分析證實，MRX004係經測試使多糖棉子糖發酵之唯一菌株，此可能有重大意義，此乃因棉子糖參與諸如胞外多糖之細胞組分之產生，且據報導棉子糖發酵亦可對宿主產生諸如以下之作用：增加盲腸丁酸鹽、增加胃腸道增殖及減輕體重。
實施API® 50 CH測試以進一步檢查MRX004中之碳水化合物代謝。依照製造商之說明書，將細菌在厭氧操作臺中在37℃下在10 ml YCFA肉湯中培養16-18小時。將此培養物在10 ml API® CHL Medium中稀釋，以達到與McFarland標準2號大致相當之密度，且將110 μl此混合物用於接種一組API® 50 CH測試條上之各杯狀凹。將測試條在厭氧操作臺中在加濕培育箱中在37℃下培育48小時，接著記錄各杯狀凹之顏色並指定陰性值、中間陽性值、陽性值或可疑值。
使用API® 50，MRX004對於以下碳水化合物源之利用測試呈陽性：阿米酮(澱粉)、苦杏仁苷、熊果苷、纖維二糖、七葉苷、半乳糖、龍膽二糖、葡萄糖、糖原、果糖、岩藻糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、甘露糖醇、蜜二糖、松三糖、甲基α-D-葡萄吡喃糖苷、N-乙醯胺基葡萄糖、核糖、蔗糖、柳苷、山梨糖醇、海藻糖、松二糖及木糖醇(圖5)。此等結果與針對Rapid ID 32A測試獲得之結果相關，此乃因MRX004在兩種測試系統中皆表現出對半乳糖、葡萄糖、甘露糖及棉子糖之發酵。 實例 5- 在 YCFA 培養基中與人類細胞的附著 概述
在YCFA培養基中之3個不同時間點確定菌株MRX004及多個其他短雙歧桿菌菌株與人類細胞之結合水準。將附著至人類細胞之細菌再懸浮於培養基中，且接著分析培養基之光密度-光密度愈高，細菌細胞數愈高，因此細菌細胞與人類細胞之結合水準愈高。發現MRX004菌株與短雙歧桿菌參考菌株相比，展示出對人類細胞之附著降低。結果及分析
實驗結果示於圖6中。
如圖6中所示，參考短雙歧桿菌菌株在所有時間點皆顯示出對人類細胞之高水準附著。另一方面，MRX004菌株對人類細胞之附著水準顯著降低。因此，菌株MRX004對人類細胞之低黏附性可增加本發明組合物對免疫系統之有益作用。 實例 6- 穩定性測試
將含有至少一種本文中所述之細菌菌株的本文中所述之組合物儲存在密封容器中25℃或4℃下且將容器置於具有30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%或95%相對濕度之氛圍中。在1個月、2個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、2.5年或3年之後，至少50%、60%、70%、80%或90%之細菌菌株應殘留，如以藉由標準方案測定之菌落形成單位量測。 實例 7- 抗微生物活性 引言
此實驗之目的係測試幾種來源於人類嬰兒之短雙歧桿菌菌株針對各種指示菌株之抗微生物活性潛力，及評估其是否在活體外產生細菌素。方法
選擇一組菌株作為指示菌株(表5)，其包括密切相關之革蘭氏陽性細菌、其他革蘭氏陽性細菌及革蘭氏陰性細菌，先前已顯示此等細菌受雙歧桿菌屬物種抑制[93]。共培養分析
使菌株在37℃ (對於枯草芽孢桿菌，為30℃)下在厭氧條件(對於大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌，為好氧條件)下，自研究細胞庫(Research Cell Bank) (對於短雙歧桿菌測試及參考菌株)或自珠粒儲備液(對於指示菌株)生長16 h。在YCFA板(E&O Labs, UK)上製得指示菌株菌苔(lawn)，使其乾燥，且將10 μl測試菌株培養物點漬於菌苔頂部上。將板在厭氧條件下於37℃下培育48 h (對於大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌，在厭氧條件下在37℃下培育24 h，接著在好氧條件下於37℃下培育24 h)。以一式三份進行各分析(除了以下為一式兩份：枯草芽孢桿菌NCIMB8045與MRx0004、測試1、測試2、測試3、測試4、測試5、測試6、測試7及測試8，以及短雙歧桿菌DSM20213、胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum
) NCIMB8826、產芽孢梭菌(Clostridium sporogenes
) ATCC3584及金黃色葡萄球菌NCIMB9518與所有短雙歧桿菌菌株)。
藉由量測觀測到之抑制區之寬度來評估抗微生物活性，該抑制區係測試菌株斑點周圍之透明區(圖22)。對於各生物學重複，對各菌株給出0至3之間之評分。培養上清液
使用瓊脂擴散法來測試培養上清液之抗微生物潛力。簡言之，將100 μl經過濾無細胞上清液點漬於預先接種指示菌株菌苔(如上所述)之YCFA瓊脂上，至穿孔至瓊脂中之孔中。將板靜置1 h以使其擴散，接著在厭氧條件(對於大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌為好氧條件)下於37℃下培育48 h。進行三個生物學重複。結果 共培養
多數測試之短雙歧桿菌菌株展現出針對大腸桿菌、克留氏肺炎桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌及枯草芽孢桿菌之拮抗活性(表6)。短雙歧桿菌DSM 20091係抑制短雙歧桿菌DSM20213生長之唯一測試菌株。MRx0004及其他測試短雙歧桿菌菌株展示出針對大腸桿菌、克留氏肺炎桿菌、鼠傷寒沙門氏桿菌及枯草芽孢桿菌之抗微生物活性(表6)，所觀測到之總體抑制活性高於短雙歧桿菌參考菌株。MRx0004、測試1、測試2、測試3、測試7、測試8、測試11及測試12展現出尤其有效之抗微生物活性。在測試條件下未偵測到針對金黃色葡萄球菌、產芽孢梭菌及胚芽乳桿菌之拮抗活性。
此等資料表明MRX0004及相關測試菌株可用於治療細菌感染。培養上清液
針對同一組指示菌株測試無細胞上清液之抗微生物活性。對於所有針對任何指示菌株測試之短雙歧桿菌菌株皆未觀測到抑制(資料未顯示，n=3)。此表明在共培養分析中觀測到之抑制並非歸因於抗微生物分子之分泌。 實例 8- 酶促活性之進一步表徵
實例4中所述之API 32A測試系統用於表徵實例7中測試之短雙歧桿菌菌株。依照製造商之說明書對細菌菌落實施Rapid ID 32A測試。簡言之，將細菌在厭氧操作臺中在37℃下在YCFA瓊脂上培養24小時。使用無菌之5 μl接種環自板移出菌落，且將其再懸浮於2 ml之API®懸浮培養基安瓿中，直到達到與McFarland標準4號之密度大致相當之密度。向Rapid ID 32A條帶上之各杯狀凹(cupule)中添加55微升細菌懸浮液，且用兩滴礦物油覆蓋尿素酶測試物。用塑膠蓋覆蓋條帶且在37℃下有氧培育4小時，接著使用以下試劑使底列杯狀凹顯色：NIT：NIT1及NIT2各1滴；IND：1滴詹姆斯試劑；所有剩餘之杯狀凹：1滴堅牢藍試劑。將條帶在室溫下培育5分鐘，接著記錄各杯狀凹之顏色並指定陰性值、中間陽性值或陽性值。
Rapid ID 32A分析結果示於圖23中。如實例4中所見，MRX004對幾種碳水化合物源(即α-半乳糖苷酶及β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶及β-葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖、甘露糖及棉子糖)、以及胺基酸(精胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、白胺酸、酪胺酸、甘胺酸及組胺酸)之發酵測試呈陽性。
亦對在實例7中研究之其他測試短雙歧桿菌菌株(測試1-測試12)及短雙歧桿菌參考菌株(DSM 20091、DSM 20213、JCM 7017及NCIMB 8807/UCC2003)進行了Rapid ID 32A分析。測試菌株通常顯示出比參考菌株更大之抗微生物活性，且顯示出與MRX004相似之代謝模式。
有趣地，MRX004及測試菌株使多糖棉子糖發酵，而四種參考菌株則不會。如上所述，棉子糖參與諸如胞外多糖之細菌組分之產生。
此外，MRX004及測試3二者皆具有有效之抗微生物活性，且二者皆展現出β-葡萄糖苷酶及α-阿拉伯糖之中間發酵。
MRX004及測試2皆具有有效之抗微生物活性，且皆未展現出N-乙醯基-β-胺基葡萄糖苷酶之陽性發酵。
MRX004及測試8二者皆具有有效之抗微生物活性，且二者皆展現出α-半乳糖苷酶及α-阿拉伯糖之中間發酵。
測試11及測試12二者皆具有有效之抗微生物活性，且二者皆使絲胺酸芳基醯胺酶發酵，而不使白胺醯基甘胺酸芳基醯胺酶發酵，且不使丙胺酸芳基醯胺酶發酵。
測試3及測試7二者皆具有有效之抗微生物活性，且二者皆展現出絲胺酸芳基醯胺酶之中間發酵。 實例 9- 脈衝場凝膠電泳
脈衝場凝膠電泳(PFGE)用於表徵實例7中測試之短雙歧桿菌菌株。結果示於圖24中。發現展現出大於參考短雙歧桿菌菌株之抗微生物活性的測試短雙歧桿菌菌株以相似之模式分組在一起且可與參考菌株區分開。 實例 10- 脈衝場凝膠電泳
對MRx004及參考短雙歧桿菌菌株進行進一步之脈衝場凝膠電泳(PFGE)研究。PFGE常規地用作用於臨床實驗室中菌株分型之「金標準」[100]，且據報導係區分人類糞便雙歧桿菌分離物之有效方法[101]。實際上，許多研究已使用PFGE拆分之用XbaI或SpeI限制酶消化之基因體DNA片段的指紋分析探索了雙歧桿菌屬分離物之關係[102、103]。已證明SpeI尤其用於短雙歧桿菌之質體剖析及種內基因分型[104、105]。PFGE 栓之製備
根據公佈之方案[106]製備用於PFGE之高分子量DNA之瓊脂糖凝膠栓。PFGE 栓之限制
在室溫下，在1 ml 10 mM Tris.Cl、0.1 mM EDTA (pH 8.0)中將單一切片(2 mm×2 mm)洗滌三次，保持15分鐘。將各切片與250 μl推薦用於酶之限制緩衝液在4℃下預培育30分鐘，接著用250 μl含有20單位限制酶SmaI之新鮮緩衝液替換。根據供應商(New England Biolabs(UK) Ltd)之建議，在25℃下實施隔夜限制性消化。PFGE
在以下條件下檢查經處理(限制酶)及未處理之基因體DNA (gDNA)栓。將λ梯(ladder)在45℃下加熱，接著將其載入至凝膠中。運行條件係在14℃下在0.5×TBE緩衝液中以6.0 V/cm持續20 h，脈衝時間自1 s斜升至20 s。使用λ DNA梯(Bio-Rad)作為大小標記物。將栓置於用0.5xTBE (1 M Tris-硼酸鹽，0.5 M EDTA，pH 8.5)製成之1.0%瓊脂糖凝膠(Bio-Rad)之孔中，用相同瓊脂糖密封。使用CHEF-DR III脈衝場系統(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)將DNA片段在維持在14℃之0.5×TBE運行緩衝液中以6 V/cm拆分18 h。選擇線性斜坡脈衝時間。採用1s-15s之線性斜坡脈衝時間來分離片段。在光限制條件下，將凝膠在含有0.5 μg/ml溴化乙菲錠之蒸餾水中染色120分鐘。PFGE 條帶圖譜分析
使用[107]概述之導則手動評估條帶圖譜。在BioNumerics 7.6 (Applied Maths)中處理PFGE影像以產生各菌株之條帶指紋。使用Jaccard相似性係數(推薦用於指紋型分析)及有算術平均值之未加權成組配對法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean, UPGMA)實施對指紋之集群分析(Cluster analysis)。結果
先前已顯示用於此研究中之DNA消化及電泳條件有效用於對短雙歧桿菌物種進行次分型[98]，且發現提供足夠解析度(超過10個可觀測帶)以在亞種水準下區分短雙歧桿菌菌株。4/5菌株之限制片段係不同的且經充分拆分(圖25)。集群分析(圖26)表明，與此研究中分析之其他短雙歧桿菌株相比，菌株MRx0004之基因型與短雙歧桿菌REF7之基因型更密切相關。 實例 11-T 細胞分化
在周邊血單核細胞(PBMC，Stemcell，目錄號：70025)上活體外探索MRx0004誘導T細胞分化之能力。簡言之，將PBMC以每孔50 μl cRPMI培養基中400,000個/孔接種在塗鋪有抗-CD3 (Ebioscience，CD3單株抗體(OKT3純系)，功能級，目錄號16-0037-81)之96孔板中(cRPMI含有RPMI 1640 (+L-Glut, 21875-034) 2 mM最終濃度儲備液200 mM；10% HI FBS (Gibco life technologies, 10082-147)；50 μm巰基乙醇(Gibco life technologies, 21985-023)；及1%青黴素/鏈黴素(P4333, 10 mg/ml))。接著將熱殺死之MRx0004 (藉由以下方式製備：在80℃下培育30分鐘，接著將培養物用PBS洗滌且再懸浮於適當細胞培養基中且藉由塗鋪確認活菌計數)以每孔於100 μl中之4,000,000個添加至各孔中。在37℃培育箱中3天后，移出細胞且將其再懸浮於含有PMA- (Sigma，目錄號P8139)、離子黴素(Ionomycin) (Sigma，目錄號I3909)及GolgiSTOP (BD，目錄號554724)之培養基中保持5小時。PMA儲備液為在DMSO中1 mg/ml，其進一步以100 ug/ml稀釋(各樣品需要於cRPMI中50 ng/ml)，離子黴素儲備液為在DMSO中1 mM (使用在cRPMI中1 μM)，且GolgiStop濃度以4 μl/6 ml使用。使上清液通過0.22 μm過濾器且在共培養基中適當稀釋。
接著使細胞經歷流式細胞術染色：
在洗滌後，在室溫下在黑暗中將細胞與活力染料(來自Miltenyi biotec之活力405/520可固定染料，1 μl/樣品)+於PBS中之人類Fc阻斷劑(block) (目錄號564219) (1 μl/樣品)培育10分鐘。接著將表面抗體(各2 μl)-CD3-APC-Vio 770 (Miltenyi，目錄號130-113-136)、CD4-VioBlue (Miltenyi，目錄號130-114-534)及CD25-VioBright FITC (Miltenyi，目錄號130-113-283)直接添加至孔中在室溫下在黑暗中保持10分鐘。接著將細胞在PBS中洗滌兩次且以300 g/5分鐘/RT旋轉沉降。
接著使用eBioscience FoxP3轉錄因子染色緩衝液來固定及透化細胞(目錄號00-5523號)。遵循eBioscience方案，使用1×濃縮物及3份稀釋劑製備透化/固定緩衝液。將細胞在RT下固定1 h，接著在1× Perm洗滌液中洗滌2次，且以300 g/5分鐘/RT旋轉沉降。將以下細胞內染色或轉錄因子抗體添加至於perm洗滌液(1×)中之樣品中保持45 mis/暗/RT或於冰箱中之樣品中隔夜(至多18 h)，接著使用Perm洗滌液(300 μl)將抗體洗滌2次且再懸浮於PBS (250 μl)中以在細胞計數器上獲得：
● 抗IFNγ-PE Vio770人類抗體(Miltenyi，目錄號130-114-025)
● 抗IL10-PE人類抗體(Miltenyi，目錄號130-112-728)
● 抗IL17a-APC人類抗體(Miltenyi，目錄號130-099-202)
● 抗RoRyt-PE人類抗體(Miltenyi，目錄號130-103-837)
● 抗Tbet-APC人類抗體(Miltenyi，目錄號130-098-655
● Foxp3單株抗體(236A/E7)，Pe cy7 (ebioscience)目錄號25-4777-41
| 細胞內標記物 | 轉錄因子 |
| 2 ul IL10-PE | 5.5 ul FoxP3-PE-Cy7 |
| 2 ul IFNy-PE Vio770 | 9 ul Tbet-APC |
| 10 ul IL17a-APC | 9 ul RoRyt-PE |
自圖27及圖28中可以看出，MRx0004 (SP 4)及熱殺死之MRx0004 (HK 4)之上清液二者皆能夠分別誘導T輔助細胞及細胞毒性T細胞之分化，即使在缺失誘導分化之細胞介素(無細胞介素)下亦如此。 表
表
1.
用於此研究中之菌株、質體及引子
| 菌株 | 說明 | 參考 |
| 短雙歧桿菌 菌株 | ||
| MRx0004 | 短雙歧桿菌人類分離物 | 此研究 |
| MRx0004pGTF ::pORI19 | MRx0004 pGTF插入突變體 | 此研究 |
| MRx0004pGTF:: pORI19 pBC1.2 | 含有空pBC1.2載體之MRx0004 pGTF插入突變體 | 此研究 |
| MRx0004pGTF:: pORI19pGTF -pBC1.2 | 互補MRx0004 pGTF插入突變體 | 此研究 |
| 大腸桿菌 菌株 | ||
| X11 Blue | 選殖宿主，tetr | Stratgene, La Jolla, CA, USA |
| EC101 | 選殖宿主，repA+ kmr | [108] |
| EC101 pWSK29-MRx-M+S | 用於藉由MRx0004 I型甲基化酶進行活體外甲基化之大腸桿菌菌株 | 此研究 |
| 質體 | ||
| pORI19 | 乳球菌ORI+ RepA- 表現載體 | [92] |
| pWSK29 | Ampr ，低拷貝數大腸桿菌選殖質體 | [109] |
| pNZ8048 | Cmr ，乳酸鏈球菌素誘導型轉譯融合因子 | [110] |
| pAM5 | pBC1-pUC19-Tcr | [111] |
| pPKCM | 含有rep pCIBA089之pblueCm | [112] |
| pSKEM | 含有rep pCIBA089之pblueEm | [96] |
| pNZEM | EMr ，乳酸鏈球菌素誘導型 | Margolles，未公開 |
| pDM1 | 含有奇黴素抗性盒之pAM5衍生物 | [113] |
| pDM2 | 含有奇黴素抗性盒之pDG7衍生物 | [97] |
| 引子 | ||
| 引子名稱 | 序列(5’-3’) | 參考 |
| PWSK_MRxM+SFxbaI | CGTCCGTCTAGAATAAGGAGGCACTCACCATGAATAAGCAGCAGCTTGC (SEQ ID NO:2) | 此研究 |
| PWSK_MRxM+SFxhoI | GCTCTACTCGAGGCGATATGAGGCGAGCTTCACG (SEQ ID NO:3) | 此研究 |
| TetWconfirm F2 | CAGGCATTGAAGGAATCG (SEQ ID NO:4) | 此研究 |
| TetWconfirm F2 +MRx-pGTF-comp | CTGGCTAAGCTTGTGCATGGGCTCAGTCCTTC (SEQ ID NO:5) | 此研究 |
表
2.
如藉由奈米
LC-MS/MS
鑒別之在
MRx0004
對數後期培養上清液中鑒別的
20
種具有最高肽譜匹配
(PSM)
值之蛋白質之列表。
此表列示了在三個生物學重複中鑒別的PSM值≥5之所有蛋白質。
| 注 釋 | 正 規 化PSM 值a | 功能 類別b | 預測 定位( 評 分)c | MW (kDa)d | pId | |
| 平均值 | SD | |||||
| 支 鏈澱 粉酶 | 351.33 | 33.62 | 碳水化合物 | E (9.98) | 181.9 | 4.77 |
| NlpC/P60 家族蛋白 質 | 82.00 | 15.62 | n.a. | E (9.72) | 33.5 | 8.18 |
| NlpC/P60 家族蛋白 質 | 71.67 | 13.61 | n.a. | n.d.(3.33) | 24.9 | 6.18 |
| ABC 運輸 蛋白系 統 之可能溶 質結 合蛋白 質 | 56.00 | 7.00 | n.a. | n.d.(3.33) | 32.8 | 4.69 |
| 細 胞分裂蛋白 質FtsI | 56.00 | 4.36 | 細胞分裂及細胞週期 | CM (9.68) | 63.4 | 5.39 |
| 多重糖ABC 運輸 蛋白，受 質結 合蛋白 質 | 54.67 | 4.16 | 碳水化合物 | n.d.(3.33) | 49.3 | 5.01 |
| 木酮糖 -5- 磷酸磷酸酮醇酶 | 45.33 | 7.02 | n.a. | n.d.(2.5) | 92.3 | 5.26 |
| 甲硫胺酸ABC 運輸 蛋白受 質結 合蛋白 質 | 38.67 | 2.08 | 胺基酸及衍生物 | CM (9.51) | 35.2 | 5.17 |
| 假 設 蛋白 質 | 35.67 | 8.33 | n.a. | n.d.(2.5) | 34.6 | 7.47 |
| 轉 醛醇酶 | 32.67 | 3.79 | 碳水化合物 | C (7.5) | 39.7 | 4.97 |
| 麥 芽糖/ 麥 芽糊精ABC 運輸 蛋白 | 30.00 | 6.08 | 碳水化合物 | n.d.(3.33) | 43.9 | 4.48 |
| NAD 依 賴 性甘油醛-3- 磷酸去 氫 酶 | 30.00 | 3.61 | 碳水化合物 | C (9.97) | 37.8 | 5.44 |
| 假 設 蛋白 質 | 29.67 | 4.93 | n.a. | CW (9.21) | 47.1 | 5.48 |
| 用於肽之ABC 運輸 蛋白系 統 之溶 質結 合蛋白 質 | 26.67 | 1.15 | n.a. | CW (9.2) | 58.7 | 5.45 |
| 結 合二肽之ABC 運輸 蛋白，周 質 受 質結 合 組 分 | 24.00 | 4.58 | 膜運輸 | n.d.(5.13) | 59.1 | 5.31 |
| NlpC/P60 家族蛋白 質 | 21.00 | 1.00 | n.a. | E (9.73) | 24.5 | 6.30 |
| FKBP 型肽基- 脯胺醯基 順 反 異構 酶FkpA 前 驅 物 | 20.00 | 2.65 | 鉀代謝 | n.d.(5.15) | 33.4 | 5.83 |
| 葡萄糖-6- 磷酸 異構 酶 | 18.67 | 3.21 | 碳水化合物 | C (9.97) | 62.9 | 4.97 |
| 多模式 轉 肽酶 - 轉 糖苷酶 | 18.00 | 2.65 | 細胞壁及莢膜(Capsule) | CM (10) | 81.9 | 5.72 |
| 伴 護 蛋白 質DnaK | 17.67 | 3.21 | 蛋白質代謝 | C (9.97) | 66.9 | 4.87 |
a
來自3個生物學重複之相對於1×109
cfu正規化之平均肽譜匹配值及相應標準偏差值。
b
如由RAST注釋之子系統類別分配[114、115]。n.a.未指定。
c
如使用PSORTb v3.0預測之細胞定位(Yu等人，2010a)。C：細胞質，CM：細胞質膜，CW：細胞壁，E：細胞外，n.d.：未確定。
d
由Proteome Discoverer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)計算之參數。MW：分子量，pI：等電點。
表
3.
如藉由奈米
LC-MS/MS
鑒別之在
MRx0004
細胞刮取物中鑒別的前
20
種具有最高肽譜匹配
(PSM)
值之蛋白質之列表。
此表列示了62種在MRx0004刮取及脫落蛋白質級分兩者中鑒別之蛋白質以及44種排他性地在MRx0004刮取蛋白質級分中鑒別之蛋白質。在PSM值≥5下及三個生物學重複中偵測到列示之蛋白質。
| 注釋 | 經刮取蛋白質 | 脫落蛋白質 | 功能類別 b | 預測定位 ( 評分 )c | ||
| 平均 PSMa | SD | 平均 PSMa | SD | |||
| 支鏈澱粉酶 | 136.67 | 17.47 | 79.00 | 10.54 | 碳水化合物 | E (9.98) |
| I型聚酮合成酶 | 54.67 | 10.69 | 11.67 | 6.43 | 未指定 | CM (9.78) |
| 木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶 | 49.67 | 2.89 | 52.00 | 9.17 | 未指定 | n.a.(2.5) |
| 細胞分裂蛋白質FtsI | 34.33 | 9.24 | 33.00 | 10.00 | 細胞分裂及細胞週期 | CM (9.68) |
| 葡萄糖-6-磷酸異構酶 | 32.33 | 2.31 | 30.33 | 5.86 | 碳水化合物 | C (9.97) |
| 轉譯延伸因子Tu | 32.00 | 5.00 | 24.33 | 8.39 | 蛋白質代謝 | C (9.97) |
| 麥芽糖/麥芽糊精ABC運輸蛋白，受質結合周質蛋白質MalE | 32.00 | 7.94 | 18.67 | 5.13 | 碳水化合物 | n.a.(3.33) |
| 糖原磷酸化酶 | 31.00 | 3.00 | 34.33 | 5.69 | 碳水化合物 | C (7.5) |
| 轉醛醇酶 | 31.00 | 2.65 | 33.33 | 2.08 | 碳水化合物 | C (7.5) |
| 多重糖ABC運輸蛋白，受質結合蛋白質 | 30.00 | 6.93 | 36.00 | 11.79 | 碳水化合物 | n.a.(3.33) |
| 丙酮酸甲酸裂解酶 | 26.67 | 8.33 | 21.67 | 7.77 | 碳水化合物 | C (9.97) |
| 用於肽之ABC運輸蛋白系統之溶質結合蛋白質 | 26.00 | 0.00 | 12.67 | 2.89 | 未指定 | CW (9.2) |
| 轉酮醇酶 | 24.00 | 6.08 | 23.67 | 3.79 | 碳水化合物 | C (7.5) |
| 甲硫胺酸ABC運輸蛋白受質結合蛋白質 | 23.33 | 2.52 | 22.33 | 4.04 | 胺基酸及衍生物 | CM (9.51) |
| 轉譯延伸因子G | 23.00 | 13.89 | 15.67 | 8.02 | 蛋白質代謝 | C (9.97) |
| 聚核糖核苷酸核苷酸轉移酶 | 22.67 | 5.03 | 12.33 | 5.69 | 未指定 | C (9.97) |
| PTS系統，β-葡萄糖苷特異性IIB組分 | 21.67 | 4.62 | 6.67 | 2.89 | 未指定 | CM (10) |
| FKBP型肽基-脯胺醯基順反異構酶FkpA前驅物 | 21.33 | 5.86 | 7.67 | 3.06 | 鉀代謝 | n.a.(5.15) |
| 伴護蛋白質DnaK | 21.00 | 6.24 | 10.00 | 3.61 | 蛋白質代謝 | C (9.97) |
| ABC運輸蛋白系統之可能溶質結合蛋白質 | 20.33 | 4.04 | 19.67 | 2.08 | 未指定 | n.a.(3.33) |
a
來自3個生物學重複之平均肽譜匹配值及相應標準偏差值。n.d.：未偵測到。
b
如由RAST注釋之子系統類別分配[116、98]。n.a.未指定。
c
如使用PSORTb v3.0預測之細胞定位[117]。C：細胞質，CM：細胞質膜，CW：細胞壁，E：細胞外，n.a.：未指定。
表
4.
在
MRx0004
及
EPSneg
菌株刮取蛋白質級分中鑒別之宿主相互作用蛋白質的比較。
此表列示了藉由奈米LC-MS/MS在經刮取蛋白質級分中在三個生物學重複中且PSM值≥5的情況下鑒別的所選蛋白質。
| 說明 | MRx0004a | EPSneg a | 功能類別b | |||
| 平均正規化 PSM | SD | 平均正規化PSM | SD | |||
| I 型聚酮合成酶 | 28.04 | 4.47 | 57.06 | 2.17 | n.a. | |
| 轉醛醇酶 | 17.33 | 1.44 | 24.70 | 0.60 | 碳水化合物 | |
| 轉酮醇酶 | 14.18 | 2.50 | 25.40 | 0.60 | 碳水化合物 | |
| 轉譯延伸因子Tu | 13.23 | 1.64 | 26.10 | 4.55 | 蛋白質代謝 | |
| 伴護蛋白質DnaK | 12.29 | 4.33 | 21.92 | 2.09 | 蛋白質代謝 | |
| NAD 依賴性甘油醛-3- 磷酸去氫酶 | 11.97 | 3.32 | 16.35 | 1.59 | 碳水化合物 | |
| 熱休克蛋白質60 家族伴護蛋白GroEL | 11.66 | 6.29 | 13.92 | 2.17 | 蛋白質代謝 | |
| 烯醇酶 | 5.04 | 3.04 | 8.70 | 1.59 | 碳水化合物 | |
| 磷酸甘油酸變位酶 | n.d. | n.d. | 5.22 | 1.04 | 碳水化合物 | |
a
來自3個生物學重複之每μg總蛋白質正規化之平均肽譜匹配值及相應標準偏差值(SD)。n.d.：未偵測到肽。
b
如由RAST注釋之子系統類別分配[100、98]。n.a.未指定子類別。
表
5.
用於實例
7
中之指示菌株列表
| 菌株名稱 | 革蘭氏染色 | 說明 |
| 大腸桿菌 ATCC 11775 | 陰性 | 人類腸道共生 |
| 克留氏肺炎桿菌 NCIMB 10197 | 陰性 | 人類腸道共生之肺病原體 |
| 鼠傷寒沙門氏桿菌 NCIMB 10248 | 陰性 | 人類腸道共生之伺機性病原體 |
| 胚芽乳桿菌 NCIMB 8826 | 陽性 | 人類腸道共生之密切相關之細菌 |
| 產芽孢梭菌 ATCC 3584 | 陽性 | 遍在之人類腸道共生 |
| 枯草芽孢桿菌 NCIMB 8045 | 陽性 | 人類腸道共生 |
| 金黃色葡萄球菌 NCIMB 9518 | 陽性 | 人類共生之伺機性病原體 |
| 短雙岐桿菌 DSM20213 | 陽性 | 短雙歧桿菌型菌株 |
表
6.
測試菌株及參考短雙歧桿菌菌株針對一組指示菌株之抗微生物活性
(n=3)
實例
12-MRx004
在脾中具有免疫刺激作用。
概述
| 菌株 | 大腸桿菌 ATCC 11775 | 克留氏肺炎桿菌 NCIMB 10197 | 鼠傷寒沙門氏桿菌 NCIMB 10248 | 枯草芽孢桿菌 NCIMB 8045 | 短雙歧桿菌 DSM 20213* | 金黃色葡萄球菌 NCIBM 9518* | 產芽孢梭菌 ATCC 3584* | 胚芽乳桿菌 NCIMB 8826* |
| MRx0004 | 3 | 2 | 2 | 2* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 1 | 1 | 2 | 1 | 2* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 2 | 2 | 2 | 2 | 2* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 3 | 2 | 2 | 2 | 2* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 4 | 1 | 2 | 0 | 1* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 5 | 1 | 1 | 1 | 1* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 6 | 1 | 1 | 1 | 1* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 7 | 2 | 2 | 2 | 1* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 8 | 2 | 1 | 1 | 2* | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 9 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 10 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 11 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 測試 12 | 2 | 2 | 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 短雙歧桿菌 REF1 (DSM 20091) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 短雙歧桿菌 REF2 (DSM 20213) | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 短雙歧桿菌 REF6 (JCM 7017) | 1 | 1 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 短雙歧桿菌 REF7 (NCIMB 8807/UCC2003) | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
此研究之目的係表徵MRx0004在脾中之活體外免疫刺激性質。材料與方法
處理：未處理、10% YCFA和10%短雙岐桿菌菌株MRx0004。脾細胞之製備
自6至8週齡之雌性C57BL/6小鼠分離之脾新製備脾細胞。簡言之，將脾細胞於具有10% FBS、2 mM L-麩醯胺酸及100 U/ml青黴素、100 μg/ml鏈黴素、55 μM β-巰基乙醇之RPMI 1640中以900,000個細胞/孔平鋪於96孔板中，靜置或用10%細菌培養基YCFA+(空白培養基)或用來自靜止MRx0518培養物之10%無細胞細菌上清液刺激，接著在CO2
培育箱中於37℃下培育72 h。此後收集無細胞上清液，在4℃下以500 g旋轉沉降(spun down) 5分鐘。接著將樣品收集且儲存在-80℃下用於細胞介素分析。MTT 分析
MTT分析套組購自Merck Millipore (目錄號CT01)。在培育72小時後，向各孔中添加10 μl MTT溶液，將細胞在CO2
培育箱中培育4 h。此後向各孔中添加100 µl異丙醇/0.04 M HCL溶液且在560 nm波長及655 nm參考波長下量測吸光度。細胞介素分析
依照製造商建議，使用26重小鼠ProcartaPlex多重免疫分析(Thermo Fischer Scientific)，進行細胞介素定量。簡言之，將50 μl無細胞之共培養上清液用於使用MAGPIX® MILLIPLEX®系統(Merck)，利用xPONENT軟體(Luminex, Austin, TX, USA)進行細胞介素定量。使用MILLIPLEX®分析軟體(Merck)，利用5參數邏輯曲線及背景扣除將平均螢光強度轉換成pg/ml值來分析數據。流式細胞術
首先在室溫下在黑暗中用Viobility 405/520可固定染料(Miltenyi Biotec Ltd. ，Bergisch Gladbach，Germany)將細胞染色10分鐘，以區分活細胞及死細胞。接著將其用CD3、CD4、CD8及IFN-γ之抗體混合物染色以確定細胞表型(Miltenyi REA抗體)且在室溫下再培育10分鐘。接著洗滌細胞且將其再懸浮於PBS中，且立即經由流式細胞術分析進行分析。同型用於第一實驗期間之所有抗體以幫助設定門(gate)，且在所有實驗中皆包括FMO對照。使用BD FACS Aria II進行所有實驗，其中使用FACSDiva軟體(BD Biosciences, Reading, UK)在「活」門中對100,000個細胞設定用於採集之停止門(stopping gate)。該分析係使用Flowjo 10.4.2版軟體(FlowJo LLC, Oregon, USA)進行，且基於用活力染料鑒別之活細胞。結果
使用量測代謝活性之MTT分析來評估脾細胞在處理後之活力。圖29顯示脾細胞在用MRx0004處理後係可存活的。
圖30顯示用MRx0004處理導致脾中多種促炎細胞介素(包括IL-6、IL-17a IL-22、TNF-α、RANTES、IFN-γ、CCL3、CCL4及CXCL2)之增加。此等資料表明活短雙歧桿菌對免疫系統具有刺激作用。MRx0004活化CD8+及CD4+ T細胞以產生IFNγ之能力示於圖31中。
與實例2及11中討論之PBMC資料組合，此等資料支持來自短雙歧桿菌物種之細菌菌株藉由活化T細胞及增加促炎細胞介素之水準在多種組織中刺激免疫系統之能力。序列
SEQ ID NO：1 (以登錄號NCIMB 42380寄存之短雙歧桿菌菌株之一致16S rRNA序列)
GGGACAGGCTCAGGATGAACGCCGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGGGATCCATCGGGCTTTGCCTGGTGGTGAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGCGTGACCGACCTGCCCCATGCACCGGAATAGCTCCTGGAAACGGGTGGTAATGCCGGATGCTCCATCACACCGCATGGTGTGTTGGGAAAGCCTTTGCGGCATGGGATGGGGTCGCGTCCTATCAGCTTGATGGCGGGGTAACGGCCCACCATGGCTTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACATTGGGACTGAGATACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGGAGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTGTTAGGGAGCAAGGCACTTTGTGTTGAGTGTACCTTTCGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGTAGGCGGTTCGTCGCGTCCGGTGTGAAAGTCCATCGCTTAACGGTGGATCCGCGCCGGGTACGGGCGGGCTTGAGTGCGGTAGGGGAGACTGGAATTCCCGGTGTAACGGTGGAATGTGTAGATATCGGGAAGAACACCAATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCCGTTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGATGCTGGATGTGGGGCCCGTTCCACGGGTTCCGTGTCGGAGCTAACGCGTTAAGCATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGTTCCCGACGATCCCAGAGATGGGGTTTCCCTTCGGGGCGGGTTCACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCCCGTGTTGCCAGCGGATTGTGCCGGGAACTCACGGGGGACCGCCGGGGTTAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGATCATCATGCCCCTTACGTCCAGGGCTTCACGCATGCTACAATGGCCGGTACAACGGGATGCGACAGCGCGAGCTGGAGCGGATCCCTGAAAACCGGTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGGCGGAGTCGCTAGTAATCGCGAATCAGCAACGTCGCGGTGAATGCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGTCATGAAAGTGGGCAGCACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCCTGCGGGAGGGAGCCKC
SEQ ID NO:2-5-參見表1參考文獻
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圖 1 ：
小鼠乳癌模型-腫瘤體積。
圖 2 ：
小鼠肺癌模型-腫瘤體積。
圖 3 ：
小鼠肝癌模型-肝臟重量。
圖 4 ：
單獨MRX004之Rapid ID 32 A譜(A)及與短雙歧桿菌型菌株之Rapid ID 32 A譜(B)之比較。白色=陰性反應(無顏色變化)、向下交叉影線=中間陽性反應(弱顏色變化)及黑色=陽性反應(適當之強顏色變化)。
圖 5 ：
MRX004之API® 50 CH分析。向上交叉影線=陰性反應(無顏色變化)、向下交叉影線=中間陽性反應(弱顏色變化)、黑色=陽性反應(適當之強顏色變化)及白色=可疑反應(意外顏色變化)。
圖 6 ：
MRX004及短雙歧桿菌型菌株與人類細胞之附著。
圖 7 ：藉由 MRx0004 處理刺激 NFκB 及 TLR2 。
用活MRx0004 (MRx0004LV
)、MRx0004培養上清液(MRx0004SN
)及熱滅活MRx0004 (MRx0004HK
)之處理物以MOI 100:1將THP-1-NFκB(A)
及HEK-TLR2(B)
報告細胞株處理22小時。數據代表三個生物學重複。使用常規單因子變異數分析(one-way ANOVA)及Tukey多重比較檢定實施統計分析。統計學上顯著之差異呈現為*p
＜0.05、***p
＜0.001及****p
＜0.0001。
圖 8 ： MRx0004 在活體外及因應 IEC 之轉錄反應。
在對數後期生長中之培養物及與IEC接觸(3小時)後之培養物之間分析且比較十個MRx0004基因之表現。數據呈現為在命名條件之間計算且相對於groEL
正規化之變化倍數(2-ΔΔCt
)值，且代表三個獨立生物學重複。使用常規單因子變異數分析及Tukey多重比較檢定實施統計分析。*p
＜0.05，**p
＜0.01，***p
＜0.001，****p
＜0.0001。
圖
9
：
MRx0004
及相關菌株之
EPS
基因座內之序列多樣性
圖 10 ： MRx0004 之 EPS 陰性衍生菌株之表型性質。
對MRx0004(A)
及其EPS陰性菌株(EPSneg
) (B)
實施穿透式電子顯微術(TEM)。(C)
在將HT29-MTX細胞及細菌菌株以MOI 100:1共培育3小時後，分析細菌與IEC之黏附。呈現之數據係來自初始接種物之黏附CFU百分比之三個生物學重複的平均值。使用常規單因子變異數分析及Tukey多重比較檢定實施統計分析。*p
＜0.05，**p
＜0.01。
圖 11 ： EPS 耗盡對 MRx0004 表面蛋白質偵測之影響。
顯示在(A)
MRx0004刮取(shave)及脫落(shed)之蛋白質級分、(B)
EPSneg
刮取及脫落之蛋白質級分以及(C)
MRx0004及EPSneg
刮取之蛋白質級分中鑒別之蛋白質數目的文氏圖(Venn diagram)。
圖 12. 藉由 MRx0004 闡明 EPS 在免疫調節中之作用。
將活處理物(LV
)及培養上清液(SN
)以100:1之MOI添加至HEK-TLR2報告細胞(A)
及THP-1-NFκB報告細胞(B)
中，且培育22小時。先前已在圖7中呈現針對MRx0004LV
及MRx0004SN
所呈現之數據。數據代表三個獨立重複。(C)
將HT29-MTX細胞與活細菌共培育3小時，接著以10 ng/ml之濃度引入TNFα且保持24小時。使用ELISA分析共培養上清液中之IL-8水準。數據代表五個生物學重複。使用常規單因子變異數分析及Tukey多重比較檢定實施統計分析。*p
＜0.05，**p
＜0.01，***p
＜0.001，****p
＜0.0001。
圖 13 ：藉由流式細胞術鑒別免疫細胞子集。
將來自六個健康供體之PBMC與以下處理物中之一者培育72小時；單獨RPMI培養基、MRx0004HK
或EPSneg HK
。顯示盒須圖，其最小值及最大值由豎直須線(whisker)表示。細胞活化標記物CD25之表現顯示為CD8+
細胞及CD4+
細胞之百分比(A-B)
。Treg (CD25+
(高)/CD127-
(低))顯示為CD4+
細胞之百分比(C)
。自各供體計算獨立Treg/CD8+
比率(D)
且將B細胞(CD19+
)計算為CD3-
細胞之百分比(E)
，並且使用常規單因子變異數分析，接著使用Tukey多重比較檢定實施統計分析。*p
＜0.05，**p
＜0.01 ***p
＜0.001 ****p
＜0.0001。
圖 14 ：由周邊血單核細胞 (PBMC) 產生之細胞介素譜。
將細胞與以下處理物中之一者培育72小時；單獨RPMI培養基、MRx0004HK
或EPSneg HK
。顯示盒須圖，其最小值及最大值由豎直須線表示。自6個健康供體獲得PBMC，且使用多重分析確定細胞介素濃度(A-G)
。自各供體計算獨立IL-12p70/IL-4比率、IL-10/IL1p70比率及IL-1β/IL12p70比率(H-J)
，且使用常規單因子變異數分析，接著使用Tukey多重比較檢定實施統計分析。*p
＜0.05，**p
＜0.01 ***p
＜0.001 ****p
＜0.0001。
圖 15 ：
利用InteractiVenn產生之文氏圖，其顯示在MRx0004刮取及脫落之蛋白質級分中鑒別的蛋白質數目(列於表2中)。
圖 16 ： (A)
藉由插入誘變產生MRx0004之EPS陰性菌株。(B)
MRx0004及其衍生菌株EPSneg
、EPSvec
及EPScomp
之自動聚集。
圖 17 ：
比較MRx0004SN及EPSnegSN中鑒別之蛋白質數目的文氏圖。
圖 18 ：用於七色板 (seven colour panel) 流式細胞術實驗之圈選 (Gating) 策略。
使用活細胞群體以1×105
個事件(event)設定採集臨限值。顯示來自未處理樣品之人類周邊血單核細胞(PBMC)之代表性偽彩圖。在FloJo中使用同型對照及FMO設定門。使用正向散射及側向散射鑒別淋巴球，接著圈選出雙峰群體且利用活力染料排除死細胞。利用CD19對CD3-
細胞進行次圈選(sub-gated)以鑒別B細胞，而CD3+
細胞群體用於進一步區分CD4+
細胞及CD8+
細胞二者。接著使用CD25來觀察活化細胞之百分比，且在CD4+
群體之情況下，其亦與CD127結合用於鑒別Treg (CD25+
/CD127-
)。
圖 19 ：藉由流式細胞術鑒別免疫細胞子集。
將來自六個健康供體之PBMC與以下處理物中之一者培育72小時；單獨RPMI培養基、MRx0004HK
或EPSneg HK
。顯示盒須圖，其最小值及最大值由豎直須線表示。CD8+
及CD4+
細胞顯示為CD3+
之百分比(A-B
)且活化B細胞顯示為CD19+
之百分比(C)
。使用常規單因子變異數分析，接著使用Tukey多重比較檢定實施統計分析。*p
＜0.05，**p
＜0.01 ***p
＜0.001 ****p
＜0.0001。
圖 20 ：藉由流式細胞術鑒別免疫細胞子集。
將來自六個健康供體之PBMC與以下處理物中之一者培育72小時：MRx0004HK
、EPSneg HK
、EPSvec HK
或EPScomp HK
。顯示散佈圖，其標準偏差由豎直條表示。CD8+
及CD4+
細胞之表現顯示為CD3+
細胞之百分比(A 、 C)
。細胞活化標記物CD25之表現顯示為CD4+
及CD8+
細胞之百分比(B 、 D)
。Treg (CD25+
(高)/CD127-
(低))顯示為CD4+
細胞之百分比(E) ，
且B細胞(CD19+
)顯示為CD3-
細胞之百分比(F)
且活化B細胞顯示為CD19+
之百分比(G)
。自各供體計算獨立Treg/CD8+
比率(H)
，且使用常規單因子變異數分析，接著使用Tukey多重比較檢定實施統計分析。*p
＜0.05，**p
＜0.01 ***p
＜0.001 ****p
＜0.0001。
圖 21 ：由周邊血單核細胞 (PBMC) 產生之細胞介素譜。
將細胞與以下處理物中之一者培育72小時：MRx0004HK
、EPSneg HK
、EPSvec HK
或EPScomp HK
。顯示盒須圖，其最小值及最大值由豎直須線表示。自6個健康供體獲得PBMC，且使用多重分析確定細胞介素濃度(A-G)
。自各供體計算獨立IL-12p70/IL-4比率、IL-10/IL1p70比率及IL-1β/IL12p70比率(H-J)
。使用常規單因子變異數分析，接著使用Tukey多重比較檢定實施統計分析。*p
＜0.05，**p
＜0.01 ***p
＜0.001 ****p
＜0.0001。
圖 22 ：共培養抗微生物板分析之實例
。顯示指示菌株、測試菌株及抑制區。
圖 23 ：測試菌株及參考短雙歧桿菌菌株之 API 32A 測試結果。
白色=陰性反應(無顏色變化)、星形=中間陽性反應(弱顏色變化)及黑色=陽性反應(適當之強顏色變化)。
圖
24
：測試菌株及參考短雙歧桿菌菌株之
PFGE SpeI
消化。
圖 25 ：
SpeI消化之1% PFGE凝膠，其在0.5% TBE中運行，18小時，6 V/cm，1-15秒ST。黑色箭頭指示DNA大小標準品。將泳道1及2與來自同一凝膠之不同部分之泳道3-7分為一組。泳道1=λ，泳道2=MRx0004，泳道3=短雙歧桿菌REF 7，泳道4=短雙歧桿菌REF6，泳道5=短雙歧桿菌REF1，泳道6=短雙歧桿菌REF2，泳道7=λ
圖 26 ：
基於此研究中包括之短雙歧桿菌之PFGE圖譜之UPGMA樹狀圖(A)。自圖B代表之PFGE條帶圖譜產生之相似性矩陣。
圖 27 ：
在不添加細胞介素(無細胞介素)之情況下，使用熱殺死之MRx0004 (HK 4)、來自MRx0004培養物之上清液(SP 4)或RPMI培養基在T輔助細胞群體中誘導T細胞分化。**=p≤0.01。
圖 28 ：
在不添加細胞介素(無細胞介素)之情況下，使用熱殺死之MRx0004 (HK 4)、來自MRx0004培養物之上清液(SP 4)或RPMI培養基在細胞毒性T淋巴球(CTL)群體中誘導T細胞分化。*=p≤0.05；***=p≤0.001；****=p≤0.0001。
圖 29 ：
脾細胞之活力。
圖 30 ：
脾細胞在用MRx004處理後產生之細胞介素譜。
圖
31
：脾臟中
CD8+IFNγ+
及
CD4+IFNγ+
細胞之頻率及每細胞
IFNγ
之產生。
國外寄存
GB英國；National Collections of Industria, Food and Marine Bacteria (NCIMB)；2015/03/12；NCIMB 42380國內寄存
食品工業發展研究所；105年9月20日；BCRC 910742
Claims (30)
- 一種包含短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve )物種之細菌菌株的組合物之用途，其用於製備刺激個體之免疫系統之藥物。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該組合物係用於治療個體之免疫缺乏疾病。
- 如申請專利範圍第2項之用途，其中該免疫缺乏疾病係原發性免疫缺乏疾病或繼發性免疫缺乏疾病。
- 如申請專利範圍第3項之用途，其中該原發性免疫缺乏疾病係選自X性聯無γ球蛋白血症(XLA)、慢性肉芽腫病(CGD)、常見可變性免疫缺乏(CVID)及重症聯合免疫缺乏(SCID)。
- 如申請專利範圍第3項之用途，其中該繼發性免疫缺乏疾病係選自AIDS、免疫系統之癌症諸如白血病、免疫複合體性疾病諸如病毒性肝炎多發性骨髓瘤。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該組合物係用作疫苗佐劑。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該組合物係用於治療、預防或延遲免疫衰老。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該組合物係用於增強細胞療法，諸如CAR-T。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該組合物係用於增加IL-12p70、IFNγ、IL-4、TNF-α及/或IL-17α之表現水準及/或活性。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該組合物係用於刺激TLR2。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該組合物係用於刺激NFκB。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該細菌菌株包含完整胞外多醣基因座。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該細菌菌株表現支鏈澱粉酶。
- 一種包含短雙歧桿菌物種之細菌菌株的組合物之用途，其用於製備治療或預防細菌感染之藥物。
- 如申請專利範圍第14項之用途，其中該組合物係用於治療或預防胃腸道細菌感染。
- 如申請專利範圍第14項或第15項之用途，其中該組合物係用於治療或預防革蘭氏(Gram)陰性細菌感染。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該細菌菌株具有與SEQ ID NO:1至少95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%一致的16s rRNA基因序列，或其中該細菌菌株具有由SEQ ID NO:1表示之16s rRNA基因序列。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該細菌菌株能夠使棉子糖發酵。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該細菌菌株能夠使以下中之一或多種諸如2種、3種、4種、5種、6種或全部7種發酵：α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶及β-葡萄糖苷酶、α-阿拉伯糖、甘露糖及棉子糖。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該細菌菌株係以登錄號42380寄存在NCIMB之菌株；其食品工業發展研究所寄存編號係BCRC 910742。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該藥物係用於經口投與。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該藥物包含一或多種醫藥學上可接受之賦形劑或載劑。
- 如前述申請專利範圍中任一項之用途，其中該細菌菌株係凍乾的。
- 一種包含短雙岐桿菌物種之細菌菌株的組合物之用途，其用於製備治療或預防與免疫刺激降低相關之疾病或病狀的藥物。
- 一種包含如申請專利範圍第1項至第19項中任一項定義之細菌菌株之細胞的組合物，其中該細胞表現一或多種異源抗原。
- 如申請專利範圍第25項之組合物，其中該細胞呈現該一或多種異源抗原。
- 如申請專利範圍第25項或第26項之組合物，其用作疫苗。
- 一種如申請專利範圍第1項至第23項中任一項定義之細菌菌株的細胞，其中該細胞表現一或多種異源抗原。
- 如申請專利範圍第28項之細胞，其中該細胞呈現該一或多種異源抗原。
- 如申請專利範圍第28項或第29項之細胞，其用作疫苗。
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