JP2021534089A - 細菌株を含む組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、対象の免疫系を刺激するのに使用するための細菌株を含む組成物を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、哺乳動物の消化管から単離された細菌株を含む組成物及び疾患の処置において、特に、疾患の処置において免疫系を刺激することにおけるそのような組成物の使用の分野に属する。
ヒトの腸は、子宮内では無菌であると考えられているが、出生直後に母体及び環境の様々な微生物に曝露される。その後、微生物のコロニー形成及び遷移の動的な期間が生じる。これは、分娩様式、環境、食事及び宿主の遺伝子型などの要素に影響され、これらの要素のすべてが、特に幼年期に腸内細菌叢の組成に影響を与える。その後、細菌叢は安定化し、成人様となる［１］。ヒトの腸内細菌叢は、細菌の２つの主要な門であるＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ及びＦｉｒｍｉｃｕｔｅｓに本質的に属する５００〜１０００種を超える様々な系統型を含む［２］。ヒトの腸における細菌のコロニー形成から生じる相利共生関係の成功は、多種多様な代謝機能、構造的機能、保護機能、及び他の有益な機能をもたらしている。コロニー形成された腸の代謝活性の増強により、さもなければ難消化性の食物成分が確実に分解され、それとともに宿主にとって重要な栄養源を提供する副産物が放出される。同様に、腸内細菌叢の免疫学的重要性は十分に認識されており、共生細菌の導入後に機能的に再構成される障害のある免疫系を有する無菌動物で例示されている［３〜５］。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸障害では、細菌叢組成の劇的な変化が記録されている。例えば、ＩＢＤ患者では、Ｅ．ｃｏｌｉの数が増大する一方でＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクラスターＸＩＶａ細菌のレベルが低下し、このことは、腸内の共生生物と病原性共生生物とのバランスの変化を示唆している［６〜９］。興味深いことに、この微生物のディスバイオシスは、Ｔエフェクター細胞集団の不均衡とも関連している。
ある特定の細菌株が動物の腸に及ぼし得る好影響の可能性が認識され、様々な疾患の処置に使用するための様々な菌株が提案されている（例えば、［１０〜１３］を参照されたい）。また、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を主に含むある特定の菌株を、例えば、抗炎症性メカニズムを通じて、腸に直接関係しない様々な炎症性疾患及び自己免疫疾患の処置に使用することが提案されている（総説については［１４］及び［１５］を参照されたい）。ある特定のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ及びＶｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ菌株、そして比較的程度は低いがＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ及びＬａｃｔｏｂａｃｃｉｌｌｕｓ菌株は、インビトロで様々なサイトカインに対して効果の異なる免疫調節効果を有することが示唆されている。しかしながら、様々な疾患と様々な細菌株との間の関係、そして特定の細菌株が腸及び全身レベルにおいて、また任意の特定のタイプの疾患に及ぼす正確な影響は、十分に特性評価されていない。
最近、様々なＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の抗炎症特性が調査され、いくつかのヒト試験によって、特に炎症性障害及び自己免疫障害について、ビフィズス菌の治療特性を実験室から臨床へと問題なく転換できることが示された。例えば、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＣＥＣＴ ７３４７及びＢ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＮＬＳは、セリアック病の患者において、どちらも保護作用を誘発した［１６、１７］。研究により、腸を超えて疾患を調節するビフィズス菌の能力も示された。Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＢＢ５３６、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ Ｍ−６３及びＢ．ｂｒｅｖｅ Ｍ−１６Ｖからなる３菌株製剤は、小児のアレルギー性鼻炎及び軽度の間欠性喘息に関連する症状を緩和した［１８］。さらに、潰瘍性大腸炎、乾癬及び慢性疲労症候群の患者にＢ．ｌｏｎｇｕｍ ３５６２４を投与すると、３つの障害すべてでＣ反応性タンパク質の血漿中濃度が低下したことから［１９］、この菌株が全身性免疫を調節できる可能性があることが示唆された。
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種に由来する生物を、リノール酸の代謝によって免疫刺激補助剤を調製するのに使用することが、例えば、［２０］及び［２１］において提案されている。しかしながら、それらの文書では、そのような生物が対象に投与されたときに免疫刺激応答を誘発する可能性については、何ら示唆されていない。
参考文献［２２］は、ベータ−ガラクト−オリゴ糖Ａ及びＢを含む栄養組成物が、免疫刺激効果を誘発し得ることを示唆している。これらの糖を含む組成物は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅを含む様々な他の成分をさらに含み得ると述べられているが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅという生物がベータ−ガラクト−オリゴ糖のいずれかの免疫刺激特性に寄与する、またはその免疫刺激特性を増強するという示唆はない。
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種に由来する生物の治療的使用は［２３］で提案されている。しかしながら、そこに開示されている細菌株が免疫刺激効果を有していたという示唆はない。
経口コレラワクチンの免疫原性に対するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株の潜在的な影響を調査するための試験は、［２４］で報告された。しかしながら、その試験の結果は決定的ではなく、その論文では、試験した菌株は忍容性は良好であったが、ワクチン接種後に明らかな免疫刺激効果を示さなかったことが報告された。
当技術分野では、疾患を処置する新しい方法が必要である。また、腸内細菌を使用した新しい療法を開発できるように、腸内細菌の潜在的な影響の特性評価を行う必要もある。
本発明者らは、対象における免疫系の刺激ならびに疾患の処置及び予防に使用することのできる、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む新しい組成物を開発した。本発明者らは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の菌株が免疫系を強力に活性化することができることを特定した。
したがって、本発明は、対象の免疫系を刺激するのに使用するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物を提供する。好ましくは、本発明は、免疫系を刺激するのに使用するための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体（derivative）もしくは生物型（biotype）を含む組成物を提供する。
さらに、本発明は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物を対象に投与することを含む、免疫系を刺激する方法を提供する。さらに、本発明は、対象の免疫系を刺激するための薬物を製造するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物の使用を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ワクチンアジュバントとして使用するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物を提供する。好ましくは、本発明は、ワクチンアジュバントとして使用するための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、免疫老化の処置、予防、または遅延に使用するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物を提供する。好ましくは、本発明は、免疫老化の処置、予防、または遅延に使用するための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
さらなる態様において、本発明は、ＣＡＲ−Ｔなどの細胞療法を増強するのに使用するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物を提供する。好ましくは、本発明は、ＣＡＲ−Ｔなどの細胞療法を増強するのに使用するための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
本発明者らはまた、免疫系を刺激するのに特に強力であるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅの菌株を特性評価し、その効力がその菌体外多糖（ＥＰＳ）によって媒介される可能性があることを明らかにした。したがって本発明は、好ましくは、対象における免疫系を刺激するために、完全なＥＰＳ遺伝子座（complete EPS locus）を含み、及び／または表面にＥＰＳを発現するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物を使用する。
好ましくは、本発明において使用される細菌は、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株である。
好ましい実施形態では、本発明は、実施例で示されるように、疾患の処置または予防において、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−４及び／またはＴＮＦ−αの発現レベル及び／または活性を上昇させるのに使用するための組成物を提供する。好ましくは、本発明は、疾患の処置または予防において、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−４及び／またはＴＮＦ−αの発現レベル及び／または活性を上昇させるのに使用するための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、実施例で示されるように、疾患の処置または予防において、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α及び／またはＩＬ−１７αの発現レベル及び／または活性を上昇させるのに使用するための組成物を提供する。好ましくは、本発明は、疾患の処置または予防において、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−α及び／またはＩＬ−１７αの発現レベル及び／または活性を上昇させるのに使用するための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、ＴＬＲ２を刺激するのに使用するための組成物を提供する。好ましくは、本発明は、ＴＬＲ２を刺激するのに使用するための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
好ましい実施形態では、本発明は、ＮＦκＢを刺激するのに使用するための組成物を提供する。好ましくは、本発明は、ＮＦκＢを刺激するのに使用するための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
好ましい実施形態では、本発明の細菌株はプルラナーゼを発現し、プルラナーゼは、強力なＢ．ｂｒｅｖｅ菌株によって高度に発現されることが実施例において示されており、接着（adhesion）に関与している可能性がある。
さらなる態様において、本発明は、対象における細菌感染症を処置または予防するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物を提供する。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、特に本発明のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株が、強力な抗菌活性を有することが示されている。さらに、本発明は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物を投与することを含む、対象における細菌感染症を処置または予防する方法を提供する。さらに、本発明は、対象における細菌感染症を処置または予防するための薬物を製造するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物の使用を提供する。
好ましい実施形態では、感染症は、胃腸感染症である。好ましい実施形態では、感染症は、グラム陰性菌感染症である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、胃腸のＥ．ｃｏｌｉ感染症の処置または予防に使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、胃腸のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ感染症の処置または予防に使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、細菌感染症の処置において細菌の生存率を低減させるのに使用するためのものである。本発明の細菌を使用して、病原性細菌のレベルを無症候性レベルに回復させるかまたは病原性細菌を対象から完全に排除することにより、細菌レベルの上昇に関連する症状を緩和することに加えて、細菌感染症を処置することができる。
実施例で試験したＢ．ｂｒｅｖｅ菌株と近縁の菌株も、免疫系を刺激するのに特に有効であると予想される。好ましい実施形態では、本発明は、細菌株が配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％同一である１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有するか、または細菌株が配列番号１によって表される１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、経口投与用である。本発明の菌株の経口投与は、免疫系を刺激するのに有効であり得る。また、経口投与は、患者及び医師にとって利便性が高く、腸への送達及び／または腸における部分的または完全なコロニー形成を可能にする。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、１または２以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、凍結乾燥されている細菌株を含む。本発明の組成物はまた、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の凍結乾燥細菌株を含むことができる。凍結乾燥は、細菌を送達することができる安定した組成物を調製するための有効かつ便利な技術である。
ある特定の実施形態において、本発明は、上記のような組成物を含む食品を提供する。本発明はまた、本明細書に記載されるＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む食品を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、上記のような細菌株を含むワクチン組成物を提供する。本発明はまた、本発明に係る組成物を含むワクチン組成物を提供する。
さらに、本発明は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、免疫刺激の低減に関連する疾患または状態を処置または予防する方法を提供する。
細菌株
本発明の組成物は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の菌株を含む。実施例により、そのような細菌株は、免疫系を刺激するのに有用であることが示されている。本発明の好ましい細菌株は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌である。
本発明の組成物は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の菌株を含む。実施例により、そのような細菌株は、免疫系を刺激するのに有用であることが示されている。本発明の好ましい細菌株は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌である。
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ細菌を実施例において試験した。この細菌は、本明細書において菌株７５１、ＭＲＸ００４またはＭＲｘ０００４とも称される。試験したＭＲＸ００４菌株の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列の一部を配列番号１に示す。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株ＭＲＸ００４は、国際寄託機関ＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ．（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ Ｅｓｔａｔｅ，Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２１ ９ＹＡ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）に、ＧＴ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｌｔｄ．（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＡＢ２５ ２ＺＳ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）により、２０１５年３月１２日に識別参照７５１で寄託され、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０を割り当てられた。その後、ＧＴ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｌｔｄ．は名称を４Ｄ Ｐｈａｒｍａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌｉｍｉｔｅｄに変更した。これらの寄託物は、ＷＯ２０１６／２０３２２３で公開された。
菌株ＮＣＩＭＢ ４２３８０のゲノム配列は、ＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に示されている。
実施例で試験した菌株と近縁の細菌株も、免疫系を刺激するのに有効であると予想される。ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％同一である１６ｓ ｒＲＮＡ配列を有する。好ましくは、細菌株は、配列番号１によって表される１６ｓ ｒＲＮＡ配列を有する。最も好ましくは、細菌株は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株である。
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して配列同一性を有するゲノムを有する。好ましい実施形態では、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％）にわたって、ＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性）を有するゲノムを有する。例えば、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の７０％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の８０％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の９０％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の１００％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の７０％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の８０％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の９０％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の１００％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の７０％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の８０％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の９０％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性、またはＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２の１００％にわたってＷＯ２０１６／２０３２２３の配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有するゲノムを有し得る。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、生菌を含む。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、活性状態の生菌、好ましくは、凍結乾燥された生菌を含む。実施例により、生菌の投与は、加熱死細菌または上清よりも有効であることが示されている。
好ましい実施形態では、本発明の細菌は、例えば、実施例に記載されているようなＨＥＫ−ＴＬＲ２レポーターアッセイにおいて、ＴＬＲ２を活性化する。さらなる実施形態では、本発明の細菌は、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５またはＴＬＲ９を活性化させない。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＴＬＲ２を活性化する細菌を含み、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＴＬＲ２を活性化する細菌を含み、細胞療法を増強するのに使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＴＬＲ２を活性化する細菌を含み、免疫老化の処置、予防、または遅延に使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明の細菌は、例えば、実施例に記載されているようなＴＨＰ−１−ＮＦκＢレポーターアッセイにおいて、ＮＦκＢを活性化する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＮＦκＢを活性化する細菌を含み、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＮＦκＢを活性化する細菌を含み、細胞療法を増強するのに使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＮＦκＢを活性化する細菌を含み、免疫老化の処置、予防、または遅延に使用するためのものである。
ある特定の実施形態において、本発明の細菌は、実施例に示すように、例えば液体培養液中で増殖させた場合、ｏｐｐＡ、プルラナーゼ、セルピン及びｔａｄＡからなる群から選択される１または２以上の遺伝子を、後期対数期と比較して定常期においてより高いレベルで発現する。実施例により、これらの遺伝子が有用な治療効果を媒介し得ることが示されている。
ある特定の実施形態において、本発明の細菌は、実施例に示すように、例えば液体培養液中で増殖させた場合、ｅｆｔＵ、エノラーゼ及びｐＧＴＦからなる群から選択される１または２以上の遺伝子を、定常期と比較して後期対数期においてより高いレベルで発現する。実施例により、これらの遺伝子が有用な治療効果を媒介し得ることが示されている。
ある特定の実施形態において、本発明の細菌は、実施例に示すように、例えば液体培養液中で増殖させた場合、エノラーゼ、ｐＧＴＦ、ｏｐｐＡ、セルピン及びトランスアルドラーゼからなる群から選択される１または２以上の遺伝子を、後期対数期と比較して腸管上皮細胞に接触後により高いレベルで発現する。実施例により、これらの遺伝子が有用な治療効果を媒介し得ることが示されている。
ある特定の実施形態において、本発明の細菌は、プルラナーゼ、ＮｌｐＣ／Ｐ６０ファミリータンパク質、ＦｔｓＩ、トランスアルドラーゼ、ＧＡＰＤＨ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ及びエノラーゼのうちの１または２以上を発現し、培養上清中に分泌する。ある特定の実施形態において、本発明の細菌は、表８のタンパク質のうちの１または２以上、例えば２、３、５、１０、１５個またはすべてを発現し、培養上清中に分泌する。実施例により、これらのタンパク質が有用な治療効果を媒介し得ることが示されている。
ある特定の実施形態において、本発明の細菌は、プルラナーゼ、Ｉ型ポリケチドシンターゼ、トランスアルドラーゼ、ＧＡＰＤＨ、ＤｎａＫ、ＧｒｏＥＬ、エノラーゼ及びＥｆＴｕのうちの１または２以上をその細胞表面上に発現する。ある特定の実施形態において、本発明の細菌は、表９のタンパク質のうちの１または２以上、例えば２、３、５、６、８つまたはすべてを発現し、培養上清中に分泌する。実施例により、これらのタンパク質が有用な治療効果を媒介し得ることが示されている。
ある特定の実施形態において、本発明の細菌はプルラナーゼを発現する。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、プルラナーゼを発現する細菌を含み、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、プルラナーゼを発現する細菌を含み、細胞療法を増強するのに使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、プルラナーゼを発現する細菌を含み、免疫老化の処置、予防、または遅延に使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明の細菌は、完全なＥＰＳ遺伝子座を含む。実施例により、完全なＥＰＳ遺伝子座が治療効力の増強に寄与し得ることが示されている。そのような実施形態では、ＥＰＳ遺伝子座は、プライミンググリコシルトランスフェラーゼ、１または２以上の追加のグリコシルトランスフェラーゼ、チアミンピロリン酸結合タンパク質、膜貫通タンパク質、フリッパーゼ及び鎖長決定因子を含む。好ましい実施形態では、ＥＰＳ遺伝子座は、３０Ｋｂを超えるサイズである（隣接する仮想タンパク質を含む）。実施例により、そのようなＥＰＳ遺伝子座が免疫刺激機能に適切であることが示されている。好ましい実施形態では、ＥＰＳ遺伝子座は、２５〜６０Ｋｂ、３０〜５０ｋｂ、３０〜４０ｋｂ、３０〜３５ｋｂまたは３０〜３２Ｋｂのサイズである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、完全なＥＰＳ遺伝子座を有する細菌を含み、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、完全なＥＰＳ遺伝子座を有する細菌を含み、細胞療法を増強するのに使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、完全なＥＰＳ遺伝子座を有する細菌を含み、免疫老化の処置、予防、または遅延に使用するためのものである。
好ましい実施形態では、本発明の細菌は、例えば、実施例において測定されたように、菌株ＭＲＸ００４のＥＰＳ遺伝子座に対して高レベルのヌクレオチド同一性、例えば、少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％または９９．５％のヌクレオチド同一性を有するＥＰＳ遺伝子座を有する。実施例により、菌株ＭＲＸ００４のＥＰＳ遺伝子座が他のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株と遺伝的に異なっており、効能（potency）及び治療的有用性に寄与し得ることが示されている。
好ましい実施形態では、本発明の細菌は、その表面にＥＰＳを保有する。実施例により、ＥＰＳが細胞表面のタンパク質の露出を調節することが示されている。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、その表面にＥＰＳを保有する細菌を含み、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、その表面にＥＰＳを保有する細菌を含み、細胞療法を増強するのに使用するためのものである。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、その表面にＥＰＳを保有する細菌を含み、免疫老化の処置、予防、または遅延に使用するためのものである。
好ましくは、本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、ラフィノースを発酵させることができる。実施例は、最も効果的なＢ．ｂｒｅｖｅ菌株がラフィノースを発酵させることができ、これが、ＥＰＳの生成に関与していることを示唆している。さらに好ましい実施形態では、本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ、α−アラビノース、マンノースならびにラフィノースのうちの１または２以上、例えば２、３、４、５、６または７つすべてを発酵させることができる。さらに好ましい実施形態では、本発明において使用される細菌は、アルギニン、プロリン、フェニルアラニン、ロイシン、チロシン、グリシン及びヒスチジンのうちの１または２以上、例えば２、３、４、５、６または７つすべてを発酵させることができる。当技術分野において既知の任意の適切なアッセイを使用して、炭水化物源またはアミノ酸を発酵させる細菌の能力を評価することができる。好ましくは、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析を使用する（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＲａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ系を使用することが好ましい）。
好ましくは、本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、及び例えば、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析に供された場合に、β−グルコシダーゼの中間の（中程度の）発酵（intermediate fermentation）もしくはα−アラビノースの中間の発酵を示し、またはより好ましくは、β−グルコシダーゼの中間の発酵及びα−アラビノースの中間の発酵を示す。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株ＭＲＸ００４及び試験３のいずれも有用な活性を有し、いずれもβ−グルコシダーゼ及びα−アラビノースの中間の発酵を示すことが示されている。特に好ましい実施形態では、本発明において使用される細菌は、β−グルコシダーゼの中間の発酵、α−アラビノースの中間の発酵及びラビノース（ｒａｂｉｎｏｓｅ）の陽性の発酵（positive fermentation）を示す。
好ましくは、本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、及び例えば、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析に供された場合に、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼの陽性の発酵を示さない。細菌は、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼの中間の発酵のみを示すか、またはＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼの発酵を示さない可能性がある。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株ＭＲＸ００４及び試験２のいずれも有用な活性を有し、いずれもＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼの陽性の発酵を示さないことが示されている。特に好ましい実施形態では、本発明において使用される細菌は、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼの陽性の発酵を示さず、ラビノースの陽性の発酵を示す。
好ましくは、本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、及び例えば、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析に供された場合に、α−ガラクトシダーゼの中間の発酵もしくはα−アラビノースの中間の発酵を示し、またはより好ましくは、α−ガラクトシダーゼの中間の発酵及びα−アラビノースの中間の発酵を示す。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株ＭＲＸ００４及び試験８のいずれも有用な活性を有し、いずれもα−ガラクトシダーゼ及びα−アラビノースの中間の発酵を示すことが示されている。特に好ましい実施形態では、本発明において使用される細菌は、α−ガラクトシダーゼの中間の発酵及びα−アラビノースの中間の発酵、ならびにラビノースの陽性の発酵を示す。
代替的な実施形態では、本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、及び例えば、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析に供された場合に、セリンアリルアミダーゼを発酵させるが、ロイシルグリシンアリルアミダーゼ及びアラニンアリルアミダーゼを発酵させない。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株試験１１及び試験１２のいずれも有用な活性を有し、いずれもセリンアリルアミダーゼを発酵させるが、ロイシルグリシンアリルアミダーゼ及びアラニンアリルアミダーゼを発酵させないことが示されている。特に好ましい実施形態では、本発明において使用される細菌は、ラビノースも発酵させる。
代替的な実施形態では、本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、及び例えば、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析に供された場合に、セリンアリルアミダーゼの中間の発酵を示す。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株試験３及び試験７のいずれも強力な抗菌活性を有し、いずれもセリンアリルアミダーゼの中間の発酵を示すことが示されている。特に好ましい実施形態では、本発明において使用される細菌は、ラビノースも発酵させる。
当技術分野において既知の任意の適切なアッセイを使用して、炭水化物源またはアミノ酸を発酵させる細菌の能力を評価することができる。好ましくは、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析を使用する（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＲａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ系を使用することが好ましい）。
好ましくは、本発明において使用される細菌は、実施例１０で使用したものなどの標準的条件を使用するパルスフィールドゲル電気泳動に供される場合、ＭＲＸ００４について、図２４または図２５に示されるパターンを生成する。
代替的な好ましい実施形態では、本発明において使用される細菌は、アミドン（デンプン）、アミグダリン、アルブチン、セロビオース、エスクリン、ガラクトース、ゲンチオビオース、グルコース、グリコーゲン、フルクトース、フコース、ラクトース、マルトース、マンノース、マンニトール、メリビオース、メレジトース、メチルα−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−アセチルグルコサミン、リボース、サッカロース（スクロース）、サリシン、ソルビトール、トレハロース、ツラノース及びキシリトールのうちの１または２以上、例えば、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５個またはすべてを発酵させることができる。そのような実施形態では、当技術分野において既知の任意の適切なアッセイを使用して、炭水化物源を発酵させる細菌の能力を評価することができる。好ましくは、ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＡＰＩ ５０ ＣＨ分析を使用する。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、特に実施例５の条件下で、特にＹＣＦＡ培地中で試験した場合にヒト細胞への接着の減少を示す、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅの菌株を含む。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌の生物型を含む。アクセッション番号４２３８０で寄託された細菌の生物型である細菌株も、免疫系を刺激するのに有効であると予想される。生物型は、ＮＣＩＭＢ ４２３８０の原菌株と同等の免疫調節活性を有するであろう。生物型は、同一または非常に生理学的及び生化学的特性を有する近縁の菌株である。
生物型は、免疫系に対して実施例に示される効果と同等の効果を誘発し、このことは、実施例に記載される培養及び投与プロトコールを使用することによって明らかにすることができるであろう。特に、生物型はＴ細胞及びサイトカインに対して、ＮＣＩＭＢ ４２３８０と同等の効果を誘発するであろう。
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌の生物型であり、本発明における使用に好適な菌株は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌の他のヌクレオチド配列を配列決定することによって同定してもよい。例えば、実質的に全ゲノムを配列決定することができ、本発明に使用するための生物型菌株は、その全ゲノムの少なくとも８０％にわたって（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは９９％またはその全ゲノムにわたって）少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有し得る。例えば、いくつかの実施形態では、生物型菌株は、そのゲノムの少なくとも９８％にわたる少なくとも９８％の配列同一性、またはそのゲノムの９９％にわたる少なくとも９９％の配列同一性を有する。生物型菌株の同定に使用するための他の好適な配列には、ｈｓｐ６０、または反復配列、例えばＢＯＸ、ＥＲＩＣ、（ＧＴＧ）５もしくはＲＥＰ［２５］が含まれ得る。
生物型菌株は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌の対応する配列に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有するそのような配列を有し得る。いくつかの実施形態では、生物型菌株は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌の対応する配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％または９９．９％の配列同一性を有する１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有し得る。いくつかの実施形態では、生物型菌株は、配列番号１に対して少なくとも９９％同一である（例えば、少なくとも９９．５％または少なくとも９９．９％同一である）１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、生物型菌株は、配列番号１の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列を有する。
あるいは、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌の生物型であり、本発明における使用に好適な菌株を、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０の寄託物、ならびに制限酵素断片分析及び／またはＰＣＲ分析を使用することによって、例えば、蛍光増幅断片長多型（ＦＡＦＬＰ：fluorescent amplified fragment length polymorphism）及び反復ＤＮＡエレメント（ｒｅｐ）−ＰＣＲフィンガープリンティングまたはタンパク質プロファイリング、または部分的な１６Ｓ ｒＤＮＡもしくは２３ｓ ｒＤＮＡの配列決定を使用することによって同定してもよい。好ましい実施形態では、そのような技術は、他のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株を同定するために使用され得る。
ある特定の実施形態において、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌の生物型であり、本発明における使用に好適な菌株は、増幅リボソームＤＮＡ制限分析（ＡＲＤＲＡ：amplified ribosomal DNA restriction analysis）によって分析した場合に、例えばＳａｕ３ＡＩ制限酵素を使用した場合に、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌と同じパターンを示す菌株である（例示的な方法及び指針に関しては、例えば［２６］を参照されたい）。あるいは、生物型菌株は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌と同じ炭水化物発酵パターンを有する菌株として同定される。
アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌の生物型などの、本発明の組成物及び方法において有用である他のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株は、実施例に記載のアッセイを含む任意の適切な方法または方策を使用して同定してもよい。特に、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌と類似の増殖パターン、代謝タイプ、及び／または表面抗原を有する細菌株は、本発明において有用であり得る。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌の派生体を含む。アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌の派生体は、原菌株の娘株（後代）、または原菌株から培養された（サブクローニングされた）菌株であってもよい。本発明の派生菌株は、例えば生物活性を損ねることなく、遺伝子レベルで改変されていてもよい。特に、本発明の派生菌株は、治療的に活性である。派生菌株は、ＮＣＩＭＢ ４２３８０の原菌株と同等の免疫調節活性を有するであろう。派生菌株は、ＮＣＩＭＢ ４２３８０の原菌株と同等の細菌叢調節活性を有するであろう。したがって、派生菌株は免疫系を刺激するのに有効であろう。
派生菌株は、がんモデルに対して実施例に示される効果と同等の効果を誘発し、このことは、実施例に記載される培養及び投与プロトコールを使用することによって明らかにすることができるであろう。特に、派生菌株は、サイトカイン及び遺伝子発現に対して、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌と同等の効果を誘発するであろう。特に、派生菌株は、免疫刺激に対して、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌と同等の効果を誘発するであろう。ＮＣＩＭＢ ４２３８０菌株の派生体は、概してＮＣＩＭＢ ４２３８０菌株の生物型であろう。
細菌株はまた、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された菌株と同じ安全性及び治療効力特性を有する菌株であり得、そのような細胞は、本発明に包含される。したがって、組成物は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された菌株ではないが、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された菌株と同じ安全性及び治療効力特性を有するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株を含むことができる。菌株の安全性特性は、例えば、抗生物質に対する菌株の耐性を試験することによって、例えば、抗生物質に対する内因性耐性及び伝達性耐性を識別することによって立証することができる。菌株の安全性特性は、インビトロで菌株の病原特性、例えば、毒素生成のレベルを評価することによっても立証することができる。その他の安全性試験としては、ラット及びマウスモデルにおける細菌株の急性または慢性毒性の試験が挙げられる。菌株の治療効力は、関連するモデルを使用するインビトロ及びインビボの細菌株の機能的特性評価によって立証することができる。
好ましい実施形態では、本発明の組成物中の細菌株は、生存しており、腸に部分的または完全にコロニー形成することができる。
好ましい実施形態では、本発明に使用するための細菌株はいずれも、図９に記載されているＢ．ｂｒｅｖｅ菌株のうちの１または２以上と比較して、ＹＣＦＡ中でヒト腸管上皮細胞、特にＣａｃｏ−２細胞への接着性が低く（全培養物の１％未満の接着性など、好ましくは０．５％未満または０．３％未満など）、図９に記載されているＢ．ｂｒｅｖｅ菌株のうちの１または２以上と比較して、より多くの結合した表面菌体外多糖を生成する。
ある特定の好ましい実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、多糖ラフィノースを発酵させることができる。
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、ビフィズス菌、特にＢ．ｂｒｅｖｅと比較して、α−グルコシダーゼ及び／またはβ−グルコシダーゼを発酵させる能力が低下している。
ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１６／２０３２２３の表１に記載されている遺伝子のうちの１または２以上、例えば、ＷＯ２０１６／２０３２２３の表１の遺伝子のうちの５、１０、２０、５０個またはすべてを含む。ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１６／２０３２２３の表１に記載されている一重下線で強調された遺伝子のうちの１または２以上、例えば、予測ＥＣＦトランスポーターの賦活モジュールの膜貫通成分ＢＬ０６９４及び／または予測ＥＣＦトランスポーターの賦活モジュールの重複ＡＴＰａｓｅ成分ＢＬ０６９３を含む。ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１６／２０３２２３の表１に記載されている二重下線と太字で強調された遺伝子のうちの１または２以上、例えば、マルトデキストリングルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０）、推定ガラクトシダーゼ、セルロースシンターゼ（ＵＤＰ形成）（ＥＣ ２．４．１．１２）、キチナーゼ（ＥＣ ３．２．１．１４）及び感覚ボックス／ＧＧＤＥＦファミリータンパク質から選択される１、２、３、４または５つの遺伝子を含む。ある特定の実施形態において、本発明に使用するための細菌株は、ＷＯ２０１６／２０３２２３の表１に記載されている斜体で強調された遺伝子のうちの１または２以上、例えば、オメガ−３多価不飽和脂肪酸シンターゼサブユニットＰｆａＡ、Ｉ型ポリケチドシンターゼ、機能不明の推定グリコシルヒドロラーゼ（ＤＵＦ１６８０）、ビオチンＥＣＦトランスポーターの賦活モジュールのＡＴＰａｓｅ成分ＢｉｏＭ、カチオン輸送ＡＴＰａｓｅ Ｅ１〜Ｅ２ファミリー、リボースＡＢＣ輸送系パーミアーゼタンパク質ＲｂｓＣ（ＴＣ ３．Ａ．１．２．１）、リボースＡＢＣ輸送系ＡＴＰ結合タンパク質ＲｂｓＡ（ＴＣ ３．Ａ．１．２．１）、３’−〜−５’オリゴリボヌクレアーゼ（ｏｒｎ）、アクチノバチルスタンパク質に関連する膜タンパク質（１９４４１６８）から選択される１、２、３、４、５、６、７、８または９つの遺伝子を含む。
好ましい実施形態では、本発明に使用するための細菌株は、２−スクシニル−５−エノールピルビル−６−ヒドロキシ−３−シクロヘキセン−１−カルボン酸シンターゼ（ＥＣ ２．２．１．９）；３’−〜−５’オリゴリボヌクレアーゼ（ｏｒｎ）；アルファ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２２）；ＥＣＦトランスポーターの一般的賦活モジュールのＡＴＰａｓｅ成分；キューオシン調節ＥＣＦトランスポーターの賦活モジュールのＡＴＰａｓｅ成分ＳＴＹ３２３３；ＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼｒｅｃＧ（ＥＣ ３．６．１．−）；ベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２１）；セルロースシンターゼ（ＵＤＰ形成）（ＥＣ ２．４．１．１２）；キチナーゼ（ＥＣ ３．２．１．１４）；ＣＯＧ１３０９：転写調節因子；Ｄ−アラニル−Ｄ−アラニンカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ ３．４．１６．４）、予測ＥＣＦトランスポーターの賦活モジュールの重複ＡＴＰａｓｅ成分ＢＬ０６９３；フルクトキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．４）；グルコース／マンノース：Ｈ＋シンポーターＧｌｃＰ；グリコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．−）；ＧＭＰシンターゼ［グルタミン加水分解］（ＥＣ ６．３．５．２）；インジゴイジンシンターゼｉｎｄＡを有するクラスター中の仮想（Hypothetical）糖キナーゼ、キナーゼのＰｆｋＢファミリー；イノシン−ウリジン選好ヌクレオシドヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．２．１）；ＬＳＵリボソームタンパク質Ｌ３１ｐ＠ＬＳＵリボソームタンパク質Ｌ３１ｐ、亜鉛非依存性；ＬＳＵリボソームタンパク質Ｌ３３ｐ＠ＬＳＵリボソームタンパク質Ｌ３３ｐ、亜鉛非依存性；マルトデキストリングルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０）；アクチノバチルスタンパク質に関連する膜タンパク質（１９４４１６８）；膜結合溶解性ムレイントランスグリコシラーゼＤ前駆体（ＥＣ ３．２．１．−）；メチルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．１．１．−）；ＮＡＤＨ依存性ブタノールデヒドロゲナーゼＡ（ＥＣ １．１．１．−）；ホスホグリコール酸ホスファターゼ（ＥＣ ３．１．３．１８）；ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＥＣ ５．３．１．２４）；機能不明の推定グリコシルヒドロラーゼ（ＤＵＦ１６８０）；ラムノース含有多糖転位パーミアーゼ；リボキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．１５）；リボースＡＢＣ輸送系、ＡＴＰ結合タンパク質ＲｂｓＡ（ＴＣ ３．Ａ．１．２．１）；リボースＡＢＣ輸送系、ＡＴＰ結合タンパク質ＲｂｓＡ（ＴＣ ３．Ａ．１．２．１）；リボースＡＢＣ輸送系、高親和性パーミアーゼＲｂｓＤ（ＴＣ ３．Ａ．１．２．１）；リボースＡＢＣ輸送系、周辺質リボース結合タンパク質ＲｂｓＢ（ＴＣ ３．Ａ．１．２．１）；リボースＡＢＣ輸送系、パーミアーゼタンパク質ＲｂｓＣ（ＴＣ ３．Ａ．１．２．１）；リボースＡＢＣ輸送系、パーミアーゼタンパク質ＲｂｓＣ（ＴＣ ３．Ａ．１．２．１）；ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１４）；ＳＳＵリボソームタンパク質Ｓ１４ｐ（Ｓ２９ｅ）＠ＳＳＵリボソームタンパク質Ｓ１４ｐ（Ｓ２９ｅ）、亜鉛非依存性；キューオシン調節ＥＣＦトランスポーターの基質特異的成分ＳＴＹ３２３０；スクロース−６−リン酸ヒドロラーゼ（ＥＣ ３．２．１．Ｂ３）；タイコ酸輸送ＡＴＰ結合タンパク質ＴａｇＨ（ＥＣ ３．６．３．４０）；予測ＥＣＦトランスポーターの賦活モジュールの膜貫通成分ＢＬ０６９４；キューオシン調節ＥＣＦトランスポーターの賦活モジュールの膜貫通成分ＳＴＹ３２３１；ＨｒｔＡＢトランスポーターと共局在する２成分応答調節因子；Ｉ型制限修飾系、ＤＮＡ−メチルトランスフェラーゼサブユニットＭ（ＥＣ ２．１．１．７２）；Ｉ型制限修飾系、制限サブユニットＲ（ＥＣ ３．１．２１．３）；Ｉ型制限修飾系、特異性サブユニットＳ（ＥＣ ３．１．２１．３）；Ｉ型制限修飾系、特異性サブユニットＳ（ＥＣ ３．１．２１．３）；Ｉ型制限修飾系、特異性サブユニットＳ（ＥＣ ３．１．２１．３）；キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．９）；及びキシロースＡＢＣトランスポーター、周辺質キシロース結合タンパク質ＸｙｌＦから選択される１または２以上（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、４５、５０個またはすべて）の遺伝子を含む。好ましい実施形態では、本発明に使用するための細菌株は、先行文に記載されており、ＷＯ２０１６／２０３２２３の表１で強調されていない１または２以上（例えば５、１０、１５、２０、２５、３０、３５個またはすべて）の遺伝子を含む。
治療的使用
免疫系の刺激
実施例は、本発明の組成物の投与が、免疫刺激をもたらし得ることを示す。本発明の組成物の投与が免疫刺激効果を有することが示されたため、本発明の組成物は、疾患、特に免疫活性化の低減を特徴とする疾患、及び免疫応答の増大によって処置可能な疾患の処置に有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激することにより、疾患を処置するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。好ましくは、本発明は、そのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
免疫系の刺激
実施例は、本発明の組成物の投与が、免疫刺激をもたらし得ることを示す。本発明の組成物の投与が免疫刺激効果を有することが示されたため、本発明の組成物は、疾患、特に免疫活性化の低減を特徴とする疾患、及び免疫応答の増大によって処置可能な疾患の処置に有用であり得る。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激することにより、疾患を処置するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。好ましくは、本発明は、そのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
免疫不全は、患者の免疫系が損なわれているか、または完全に欠如している状態である。免疫不全症は、免疫活性化の低減を特徴とする疾患の例であり、この場合、疾患を処置するために、患者の免疫系を刺激することが有益である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、免疫不全症の処置または予防に使用するためのものである。
２つのタイプの免疫不全症が存在する。原発性免疫不全症は、通常出生時に存在し小児期に診断される遺伝子変異に起因する遺伝性免疫障害である。続発性免疫不全症は、疾患または有毒化学物質などの環境源の結果である後天性の免疫不全である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、原発性免疫不全症または続発性免疫不全症の処置または予防に使用するためのものである。
原発性免疫不全障害の例及び例としては、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩＤ）及び無リンパ球症または「バブルボーイ（ｂｏｙ ｉｎ ａ ｂｕｂｂｌｅ）」病としても知られる重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）が挙げられる。続発性免疫不全障害は、例えば、重度の火傷、化学療法、放射線、糖尿病、栄養失調によって引き起こされる可能性がある。続発性免疫不全障害の例としては、ＡＩＤＳ、白血病などの免疫系のがん、ウイルス性肝炎、多発性骨髄腫などの免疫複合体疾患が挙げられる［２７］。インターフェロン−γは、免疫不全症ＣＧＤに対する承認された療法である［２８］。実施例により、本発明の組成物がＩＦＮ−γの生成を増加させることができることが示されたため、本発明の組成物は、原発性及び続発性免疫不全症を含む免疫不全症の処置に特に有効であり得る。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＴＬＲ２への刺激を通じて免疫系を刺激するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、疾患の処置においてＴＬＲ２を刺激するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＴＬＲ２活性の低減に関連する疾患の処置に使用するためのものであるか、またはＴＬＲ２活性が低減していることが確認された患者の処置に使用するためのものである。好ましくは、本発明は、そのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物による処置は、Ｔｈ１細胞応答を促進する。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、疾患の処置においてＴｈ１細胞応答を促進するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、Ｔｈ１細胞活性の低減に関連する疾患の処置に使用するためのものであるか、またはＴｈ１細胞活性が低減していることが確認された患者の処置に使用するためのものである。好ましくは、本発明は、そのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、ＮＦκＢの活性化を通じて免疫系を刺激するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、疾患の処置においてＮＦκＢを刺激するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＮＦκＢ活性の低減に関連する疾患の処置に使用するためのものであるか、またはＮＦκＢ活性が低減していることが確認された患者の処置に使用するためのものである。好ましくは、本発明は、そのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
本発明の組成物は、活性化ＣＤ８＋細胞のレベルの低下を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋細胞の活性またはレベルを上昇させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋細胞の活性またはレベルを上昇させることにより、疾患を処置するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋細胞を活性化させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
本発明の組成物は、Ｂ細胞のレベルの低下を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞の活性またはレベルを上昇させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞の活性またはレベルを上昇させることにより、疾患を処置するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞を活性化させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
本発明の組成物は、活性化ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞のレベルの低下を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞の活性またはレベルを上昇させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞の活性またはレベルを上昇させることにより、疾患を処置するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞を活性化させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
本発明の組成物は、Ｂ細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞の数またはパーセンテージの減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞集団におけるＢ細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものであり、Ｂ細胞の数またはパーセンテージの増大は、免疫刺激をもたらす。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞の数またはパーセンテージを増大させることにより、免疫応答を刺激するのに使用するためのものである。
実施例は、本発明の組成物の投与は、炎症性サイトカインなどの炎症誘発性分子の発現の増大をもたらし得ることを示す。本発明の組成物を投与した際に発現レベルの上昇を示した炎症誘発性分子の例としては、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＦＮγ及びＩＬ−１７αが挙げられる。本発明の組成物の投与が炎症誘発性分子の発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、炎症性サイトカインなどの炎症誘発性分子の発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、炎症誘発性分子の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患、特に炎症性サイトカインの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４及び／またはＩＦＮγの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４及び／またはＩＦＮγの発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４及び／またはＩＦＮγの発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−１７α、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＦＮγ及び／またはＩＬ−１７αの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＦＮγ及び／またはＩＬ−１７αの発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−４、ＩＦＮγ及び／またはＩＬ−１７αの発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＩＬ−１βの発現の増大をもたらし得ることも示す。ＩＬ−１βは炎症性サイトカインである［２９］。ＩＬ−１βの生成及び分泌は、炎症応答の活性化に関連するタンパク質複合体であるインフラマソーム（inflammasome）によって調節される［３０］。本発明の組成物の投与がＩＬ−１βの発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ＩＬ−１βの発現の減少を特徴とする疾患の処置に有用であり得る。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−１βの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１βの発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに使用するためのものである。
実施例は、本発明の組成物の投与が、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現の増大をもたらし得ることを示す。ＴＮＦ−αは、細胞死を促進する様々なシグナル伝達経路に関与することが知られている炎症性サイトカインである。ＴＮＦ−αは、その同族受容体であるＴＮＦＲ−１に結合することによりアポトーシスを開始し、アポトーシス経路における一連の切断事象を引き起こす［３１］。ＴＮＦ−αは、ＲＩＰキナーゼ依存性メカニズムを介して壊死を誘発することもできる［３２］。本発明の組成物の投与によりＴＮＦ−α発現の増大が示されるため、本発明の組成物は、疾患の処置、特にＴＮＦ−αの発現の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−α発現の減少を特徴とする疾患の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αの発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αの発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
本発明の組成物の投与によりＩＬ−４発現の増大が示されるため、本発明の組成物は、疾患の処置、特にＩＬ−４の発現の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−４発現の減少を特徴とする疾患の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−４の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−４の発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−４の発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
本発明の組成物の投与によりＩＬ−１７α発現の増大が示されるため、本発明の組成物は、疾患の処置、特にＩＬ−１７αの発現の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１７α発現の減少を特徴とする疾患の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−１７αの発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１７αの発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１７αの発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
本発明の組成物の投与によりＩＬ−１２ｐ７０発現の増大が示されるため、本発明の組成物は、疾患の処置、特にＩＬ−１２ｐ７０の発現の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０発現の減少を特徴とする疾患の処置に使用するためのものである。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０の発現及び／または活性の減少を特徴とする疾患の処置または予防に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０の発現及び／または活性を上昇させることにより、疾患を処置または予防するのに有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０の発現及び／または活性を上昇させることにより、免疫応答を促進するのに使用するためのものである。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物によって処置される疾患は、がんではない。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物によって処置される疾患は、ＩＬ−１７経路またはＴｈ１７経路によって媒介されない。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１７経路及び／またはＴｈ１７経路の発現または活性を上昇させる。
本発明の好ましい実施形態では、本発明の組成物が投与される対象は、リノール酸補助剤を服用していない、及び／またはリノール酸が豊富な食事をとっていない。それに加えて、またはその代わりに、本発明の組成物はリノール酸を含まない。
実施形態では、本発明の組成物は、ベータ−ガラクト−オリゴ糖Ａ及び／またはＢを含まない。
免疫刺激が必要な患者は、細菌感染症のリスクがある可能性がある。実施例により、本発明の組成物が、抗菌活性を有することが示されている。したがって、ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激し細菌感染症を処置または予防するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫系を刺激し細菌感染の増大を阻害することにより、細菌感染症を処置するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、病原性細菌に対する免疫応答を促進し、細菌増殖を阻害するのに使用するためのものである。好ましくは、細菌感染症は消化管の細菌感染症である。好ましくは、細菌感染症はグラム陰性菌の細菌感染症である。
実施例はまた、本発明の組成物がヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球の分化を促進することも示す。したがって、ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ヘルパーＴ細胞及び／または細胞傷害性Ｔリンパ球の分化を刺激するのに使用するためのものである。
ワクチンアジュバントとしての使用
実施例は、本発明の組成物の投与が、免疫系を刺激し、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現及びＴＬＲ２の活性化の上昇をもたらし得ることを示す。ＴＮＦ−αは、ワクチン応答に重要であることが知られている。例えば、ＴＮＦ−αは、高齢者集団のインフルエンザワクチン接種における効率的なワクチン応答に必要であることが示されている［３３］。同様に、ＴＬＲ２は、応答を向上させるためのワクチンアジュバントの重要な標的である［３４］。本発明の組成物の投与がＴＮＦ−α発現及びＴＬＲ２活性を上昇させることが示されたため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αのレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＬＲ２のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、インフルエンザ治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原に対する免疫応答を増強するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明は、抗原と組み合わせて投与される組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワクチン接種の直前または直後に患者に投与するためのものである。好ましくは、本発明は、ワクチンアジュバントとしてのそのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
実施例は、本発明の組成物の投与が、免疫系を刺激し、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）の発現及びＴＬＲ２の活性化の上昇をもたらし得ることを示す。ＴＮＦ−αは、ワクチン応答に重要であることが知られている。例えば、ＴＮＦ−αは、高齢者集団のインフルエンザワクチン接種における効率的なワクチン応答に必要であることが示されている［３３］。同様に、ＴＬＲ２は、応答を向上させるためのワクチンアジュバントの重要な標的である［３４］。本発明の組成物の投与がＴＮＦ−α発現及びＴＬＲ２活性を上昇させることが示されたため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＮＦ−αのレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＴＬＲ２のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、インフルエンザ治療におけるワクチンアジュバントとして使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原に対する免疫応答を増強するのに使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本発明は、抗原と組み合わせて投与される組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ワクチン接種の直前または直後に患者に投与するためのものである。好ましくは、本発明は、ワクチンアジュバントとしてのそのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
実施例により、本発明の細菌がＴＬＲ２を活性化させることが示されている。ＴＬＲアゴニストは、特に高齢者集団において、様々な抗原タイプに対するワクチンアジュバントとして開発中である［３５］。したがって、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして、特に免疫系の活性が低減している場合がある高齢患者（例えば、４０歳、５０歳、６０歳、７０歳または８０歳超）に投与されるワクチンのために有用であり得る。ＴＬＲ２シグナル伝達は、年齢に関連した自然免疫応答においても重要な役割を果たす［３６］。ある特定の実施形態において、本組成物は、自然免疫応答を増強するのに使用するためのものである。ＴＬＲ２アゴニストはワクチンアジュバントとして開発中であるが、これらはすべて既知の病原体に由来し、及び／または合成である。対照的に、本発明の組成物は、共生細菌を含む。
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＩＬ−１βの発現の増大をもたらし得ることも示す。Ｌｉら［３７］は、アジュバントの水酸化アルミニウムがＩＬ−１βの分泌を活性化させることを示し、ＩＬ−β自体がアジュバントとして作用し得ることを示唆した。本発明の組成物の投与がＩＬ−１βの発現を増大させることが示されたため、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして有用であり得る。
実施例により、本発明の組成物がＩＦＮγレベルを上昇させＴｈ１細胞応答を促進することができ、その両方が抗原に対する抗体応答の増強に関連していることが示されている［３８］。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原、特に病原性抗原またはがん抗原に対する抗体応答を促進するのに使用するためのものである。同様に、調査したマラリアワクチンを投与された志願者における、ワクチン誘導性Ｔ細胞応答のＩＦＮ−γの指標である［３９］。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、抗原、特に病原性抗原またはがん抗原に対するＴ細胞応答を促進するのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＦＮ−γのレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。ある特定の実施形態において、本組成物は、マラリアからの保護に使用するためのものである。
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＩＬ−１２ｐ７０の発現またはレベルの上昇をもたらし得ることも示す。この効果はワクチンアジュバントの効率に関連付けられており、ＩＬ−１２自体がアジュバントとして提案されている［４０］。これは、本発明の組成物がアジュバントとして有効であることを示唆している。一実施形態において、本発明の組成物は、ＩＬ−１２ｐ７０のレベル及び／または活性を上昇させることにより、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである。
いくつかの実施形態では、ワクチンアジュバントとして使用する場合、本発明の組成物は、患者に別々に投与された抗原に対するアジュバント効果をもたらすために単独で投与される。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は経口投与され、抗原は非経口的に注射される。
本発明の組成物は、任意の有用な抗原に対する免疫応答を増強するために使用され得る。本発明で使用される例示的な抗原には、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原；タンパク質及び／または糖類抗原などの細菌抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；ならびに腫瘍抗原が含まれる。本発明は、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、鉤虫、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、クラミジア、ＳＡＲＳコロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルスなどに対するワクチンにとって特に有用である。本発明で使用されるさらなる抗原には、糖タンパク質抗原及びリポグリカン抗原、古細菌抗原、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、シアリル−Ｔｎ（ＳＴｎ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＣＡ−１２５、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、腫瘍性タンパク質、アミロイドベータ、Ｔａｕ、ＰＣＳＫ９ならびに習慣性物質、例えば、ニコチン、アルコール、アヘン剤が含まれる。
本発明で使用される好ましい抗原には、病原体抗原及び腫瘍抗原が含まれる。抗原は、病原体による感染から保護したり、腫瘍を攻撃したりするのに有効な、抗原に特異的な免疫応答を誘発する。抗原は、例えば、ペプチドまたは多糖であり得る。
本発明はまた、患者の免疫応答を高めるための薬物の製造における、（ｉ）抗原の水性調製物、及び（ｉｉ）Ｂ．ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物の使用を提供する。好ましくは、細菌株は、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型である。
これらの方法及び使用によって高められる免疫応答には、概して、抗体応答、好ましくは防御抗体応答が含まれる。
いくつかの実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株は、抗原を提示するように操作されている。本発明の細菌株上に抗原を提示することにより、その免疫刺激活性が最大化し、抗原に対して発生する防御免疫応答がさらに増強され得る。さらに、抗原と本発明の細菌とを含む治療薬を製造及び投与することは、抗原及び細菌株を含む組成物の各々を別々に製造及び投与する場合よりも、この方法でより効率的かつ有効となり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物であって、この細菌が、例えばその細胞表面に抗原を提示する組成物を提供する。いくつかの実施形態では、抗原を提示する細菌株を含む組成物は、ワクチン抗原として使用するためのものである。いくつかの実施形態では、抗原は、ＨＩＶ、鉤虫、Ｂ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病、呼吸器合胞体ウイルス、サイトメガロウイルス、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、クラミジア、ＳＡＲＳコロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、エプスタインバーウイルスまたはヒトパピローマウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、抗原は、糖タンパク質抗原、リポグリカン抗原、古細菌抗原、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、シアリル−Ｔｎ（ＳＴｎ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＣＡ−１２５、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、腫瘍性タンパク質、アミロイドベータ、Ｔａｕ、ＰＣＳＫ９またはアルコール、アヘン剤などのような習慣性物質である。
いくつかの実施形態では、本発明の細菌は、１または２以上の抗原を発現する。概して、抗原は組換えにより発現され、本発明の細菌に対して異種である。したがって、本発明は、異種抗原を発現するＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を提供する。抗原は、細菌に対して同種の１または２以上のポリペプチドとともに発現される融合ポリペプチドの一部であり得る。いくつかの実施形態では、細菌は、非融合ポリペプチドとして抗原を発現する。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株の細胞を含む組成物を提供し、この細胞は異種抗原を発現する。いくつかの実施形態では、組成物は、ワクチンとして使用するためのものである。いくつかの実施形態では、本発明は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株の細胞を提供し、この細胞は異種抗原を発現する。いくつかの実施形態では、細胞は、ワクチンとして使用するためのものである。
本発明で使用される例示的な抗原には、ウイルス表面タンパク質などのウイルス抗原；タンパク質及び／または糖類抗原などの細菌抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；ならびに腫瘍抗原が含まれる。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株において発現させるためのさらなる抗原には、糖タンパク質及びリポグリカン抗原、古細菌抗原、メラノーマ抗原Ｅ（ＭＡＧＥ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ−１、ＨＥＲ２、シアリル−Ｔｎ（ＳＴｎ）、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、ウィルムス腫瘍遺伝子（ＷＴ１）、ＣＡ−１２５、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、エプスタインバーウイルス抗原、ネオ抗原、腫瘍性タンパク質、アミロイドベータ、Ｔａｕ、ＰＣＳＫ９、ならびに習慣性物質、例えばニコチン、アルコール、アヘン剤などが含まれる。
本発明はまた、アルツハイマー病及び他の神経変性障害などの非感染性疾患に対するワクチンへの応答を増強するのに有用であり得、この場合、本発明で使用する抗原はアミロイドベータまたはＴａｕであり得る。非感染性疾患に対する他のそのような抗原としては、ＰＣＳＫ９（コレステロール上昇の処置用）が挙げられる。
本発明はまた、習慣性物質、例えばニコチン、アルコール、またはアヘン剤に対するワクチンへの応答を増強するのに有用であり得る。
実施例により、本発明の組成物が抗菌活性を有することが示されている。したがって、本発明の組成物は、細菌感染症、特にグラム陰性菌感染症に対するワクチンにおける使用に特に有効であり得る。本発明の組成物は、細菌感染に対して抗菌作用を発揮する一方で、免疫系を刺激して感染に対処することもできる。したがって、ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌感染症を処置し将来の細菌感染症を予防している。
細胞療法
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＴＬＲ２の活性化の増大をもたらし得ることも示す。ＴＬＲ２刺激はＣＡＲ−Ｔ療法の効力を増強する［４１］。したがって、本発明の組成物は、細胞療法、特にＣＡＲ−Ｔ細胞療法において有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞療法で使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法で使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、慢性リンパ球性白血病の処置に使用するためのものである。好ましくは、本発明は、そのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）療法
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＴＬＲ２の活性化の増大をもたらし得ることも示す。ＴＬＲ２刺激はＣＡＲ−Ｔ療法の効力を増強する［４１］。したがって、本発明の組成物は、細胞療法、特にＣＡＲ−Ｔ細胞療法において有用であり得る。一実施形態において、本発明の組成物は、細胞療法で使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法で使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、慢性リンパ球性白血病の処置に使用するためのものである。好ましくは、本発明は、そのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
実施例は、本発明の組成物の投与が、ＮＦκＢの活性化の増大をもたらし得ることも示す。ＮＦκＢの活性化はＣＡＲ−Ｔ療法の効力を向上させる［４２］。したがって、本発明の組成物は、細胞療法、特にＣＡＲ−Ｔ細胞療法において有用であり得る。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＡＲ−Ｔ療法の際にＴ細胞養子移入前に患者に投与される。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、ＣＡＲ−Ｔ療法の際にＴ細胞養子移入後に患者に投与される。
したがって、本発明の組成物は、細胞療法において、特に細胞療法に対する応答を増強するのに有用であり得る。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）療法
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）療法には免疫刺激特性があることが報告されている。ＭＳＣをＬＰＳで処理すると、炎症性サイトカインのＩＬ−８が上方制御され、Ｂ細胞増殖の増大がもたらされる［４３］。したがって、本発明の組成物がＢ細胞増殖の発現を増大させることが示されたため、本組成物はＭＳＣ細胞療法との組み合わせにおいて有用であり得る。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）療法には免疫刺激特性があることが報告されている。ＭＳＣをＬＰＳで処理すると、炎症性サイトカインのＩＬ−８が上方制御され、Ｂ細胞増殖の増大がもたらされる［４３］。したがって、本発明の組成物がＢ細胞増殖の発現を増大させることが示されたため、本組成物はＭＳＣ細胞療法との組み合わせにおいて有用であり得る。
幹細胞移植療法
幹細胞移植療法において未分化幹細胞を使用する代わりに、移植前に幹細胞をある程度まで分化させることが有益であり得ることが報告されている。例えば、Ｈｅｎｇら［４４］は、幹細胞の心筋形成分化が、より高い生着効率、筋細胞の再生の増強、及び心臓機能の回復の向上を伴うことにより、有益であり得ることを報告した。また、研究により、特定の共生細菌株によるＧＩコロニー形成が、同種造血細胞移植後の生存率を改善できることが示されている［４５］。本発明の組成物の投与により細胞が刺激されたため、本発明の組成物は、幹細胞移植療法における幹細胞分化に有用であり得る。
幹細胞移植療法において未分化幹細胞を使用する代わりに、移植前に幹細胞をある程度まで分化させることが有益であり得ることが報告されている。例えば、Ｈｅｎｇら［４４］は、幹細胞の心筋形成分化が、より高い生着効率、筋細胞の再生の増強、及び心臓機能の回復の向上を伴うことにより、有益であり得ることを報告した。また、研究により、特定の共生細菌株によるＧＩコロニー形成が、同種造血細胞移植後の生存率を改善できることが示されている［４５］。本発明の組成物の投与により細胞が刺激されたため、本発明の組成物は、幹細胞移植療法における幹細胞分化に有用であり得る。
免疫老化
Ｆｕｌｏｐら［４６］は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大及びＢ細胞数の減少が適応免疫系の老化に関連していることを特定した。したがって、本発明の組成物は、免疫老化を予防または遅延させるために使用され得る。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化の予防に使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｂ細胞数の減少を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大及びＢ細胞数の減少を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数を減少させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞数を増大させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数を減少させ、Ｂ細胞数を増大させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化に起因する疾患の処置に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化を遅延させること及び／または予防することにより、老化関連疾患の処置に使用するためのものである。好ましくは、本発明は、そのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
Ｆｕｌｏｐら［４６］は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大及びＢ細胞数の減少が適応免疫系の老化に関連していることを特定した。したがって、本発明の組成物は、免疫老化を予防または遅延させるために使用され得る。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化の予防に使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｂ細胞数の減少を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数の増大及びＢ細胞数の減少を特徴とする免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数を減少させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、Ｂ細胞数を増大させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇ細胞数を減少させ、Ｂ細胞数を増大させることにより、免疫老化を遅延させるのに使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化に起因する疾患の処置に使用するためのものである。一実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化を遅延させること及び／または予防することにより、老化関連疾患の処置に使用するためのものである。好ましくは、本発明は、そのような使用のいずれかのための、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株またはその派生体もしくは生物型を含む組成物を提供する。
さらに、ワクチンアジュバントが免疫老化を克服し得ることが提唱されている［４７］。本発明の組成物はワクチンアジュバントとして使用するのに好適であるため、本発明の組成物は、免疫老化を予防または遅延させるのに有用であり得る。別の実施形態では、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして免疫老化を遅延させること及び／または予防することに使用するためのものである。別の実施形態では、本発明の組成物は、ワクチンアジュバントとして使用するためのものであり、本組成物は、免疫老化を遅延させ、及び／または予防する。
免疫老化に関連する疾患としては、循環器疾患、アルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性疾患、がん、真性糖尿病２型［４８］、ならびに自己免疫障害［４９］が挙げられる。
免疫老化に罹患している対象は、細菌感染症にかかりやすい恐れがある。実施例は、本発明の組成物が抗菌活性を有することを示す。したがって、ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、免疫老化を示す患者、例えば、高齢患者、または５０歳、５５歳、６０歳、６５歳、７０歳または７５歳を超える患者における細菌感染症の処置または予防に使用するためのものである。
細菌感染症の処置及び予防
実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、特に本発明のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株が、強力な抗菌活性を有することが示されている。したがって、ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌感染症の処置または予防に使用するためのものである。
実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、特に本発明のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株が、強力な抗菌活性を有することが示されている。したがって、ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、細菌感染症の処置または予防に使用するためのものである。
好ましい実施形態では、感染症は、胃腸感染症である。Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株、特に、本発明のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株は、消化管に投与されたときに強力な効果を有することが示されている（実施例及びＷＯ２０１６／２０３２を参照されたい）。好ましい実施形態では、感染症は、グラム陰性菌感染症である。特に好ましい実施形態では、感染症は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉまたはＥ．ｃｏｌｉ感染症などのグラム陰性胃腸感染症である。概して、細菌感染症は病原性細菌感染症である。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、胃腸のＥ．ｃｏｌｉ感染症の処置または予防に使用するためのものである。さらに好ましい実施形態では、本発明の組成物は、胃腸のＳ．ｅｎｔｅｒｉｃａ感染症の処置または予防に使用するためのものである。
いくつかの実施形態では、細菌感染症は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＢａｃｉｌｌｕｓからなるリストから選択される属の細菌感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｅ．ｃｏｌｉ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ感染症である。本発明の組成物は、これらの細菌に対して強力な抗菌活性を有することが示されている。
いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ感染症である。いくつかの実施形態では、処置または予防の対象の細菌感染症は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｐａｒａｔｙｐｈｉ感染症である。これらの細菌はグラム陰性であるため、実施例に示すように、本発明の組成物に対して感受性が高い可能性がある。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、細菌感染症の処置において細菌の生存率を低減させるのに使用するためのものである。本発明の細菌を使用して、病原性細菌のレベルを無症候性レベルに回復させるかまたは病原性細菌を対象から完全に排除することにより、細菌レベルの上昇に関連する症状を緩和することに加えて、細菌感染症を処置することができる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、細菌感染症の予防の処置において、細菌の増殖を阻害するのに使用するためのものである。換言すれば、組成物は、感染を引き起こす細菌に対して細胞増殖阻害活性を有し得る。
ある特定の実施形態において、組成物は、再発性感染症の発症を遅延させるか、または再発性感染症を予防する。ある特定の実施形態において、処置される対象は、細菌の無症候性キャリアであるなど、細菌感染症を発症するリスクがある。他の実施形態では、本発明の組成物は、細菌感染症の症状を示す患者を処置するのに使用するためのものである。
好ましくは、細菌感染症を処置または予防するために本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、ラフィノースを発酵させることができる。
好ましくは、細菌感染症を処置または予防するために本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、及び例えば、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析に供された場合に、β−グルコシダーゼの中間の発酵もしくはα−アラビノースの中間の発酵を示し、またはより好ましくは、β−グルコシダーゼの中間の発酵及びα−アラビノースの中間の発酵を示す。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株ＭＲＸ００４及び試験３のいずれも有用な活性を有し、いずれもβ−グルコシダーゼ及びα−アラビノースの中間の発酵を示すことが示されている。
好ましくは、細菌感染症を処置または予防するために本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、及び例えば、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析に供された場合に、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼの陽性の発酵を示さない。細菌は、Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼの中間の発酵のみを示すか、またはＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼの発酵を示さない可能性がある。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株ＭＲＸ００４及び試験２のいずれも有用な活性を有し、いずれもＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼの陽性の発酵を示さないことが示されている。
好ましくは、細菌感染症を処置または予防するために本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、及び例えば、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析に供された場合に、α−ガラクトシダーゼの中間の発酵もしくはα−アラビノースの中間の発酵を示し、またはより好ましくは、α−ガラクトシダーゼの中間の発酵及びα−アラビノースの中間の発酵を示す。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株ＭＲＸ００４及び試験８のいずれも有用な活性を有し、いずれもα−ガラクトシダーゼ及びα−アラビノースの中間の発酵を示すことが示されている。
代替的な実施形態では、細菌感染症を処置または予防するために本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、及び例えば、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析に供された場合に、セリンアリルアミダーゼを発酵させるが、ロイシルグリシンアリルアミダーゼ及びアラニンアリルアミダーゼを発酵させない。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株試験１１及び試験１２のいずれも有用な活性を有し、いずれもセリンアリルアミダーゼを発酵させるが、ロイシルグリシンアリルアミダーゼ及びアラニンアリルアミダーゼを発酵させないことが示されている。
代替的な実施形態では、細菌感染症を処置または予防するために本発明において使用される細菌は、例えば、適切な懸濁培地（ＡＰＩ懸濁培地など）で３７℃で４時間培養された場合に、及び例えば、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析に供された場合に、セリンアリルアミダーゼの中間の発酵を示す。実施例により、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株試験３及び試験７のいずれも強力な抗菌活性を有し、いずれもセリンアリルアミダーゼの中間の発酵を示すことが示されている。
当技術分野において既知の任意の適切なアッセイを使用して、炭水化物源またはアミノ酸を発酵させる細菌の能力を評価することができる。好ましくは、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析を使用する（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘのＲａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ系を使用することが好ましい）。
投与形態
好ましくは、本発明の組成物は、本発明の細菌株の腸への送達及び／または腸における部分的もしくは全体的なコロニー形成を可能にするために、消化管に投与するように製剤化される。いくつかの実施形態では、「腸の完全なコロニー形成」という用語は、細菌が腸のすべての部分（すなわち、小腸、大腸及び直腸）にコロニー形成したことを意味する。本発明のさらなる実施形態では、「完全コロニー形成」または「部分コロニー形成」という用語はそれぞれ、細菌が永続的または一時的に腸内に保持されることを意味する。一般的には本発明の組成物を経口投与するが、直腸内、鼻腔内、または頬側もしくは舌下経路を介して投与してもよい。
好ましくは、本発明の組成物は、本発明の細菌株の腸への送達及び／または腸における部分的もしくは全体的なコロニー形成を可能にするために、消化管に投与するように製剤化される。いくつかの実施形態では、「腸の完全なコロニー形成」という用語は、細菌が腸のすべての部分（すなわち、小腸、大腸及び直腸）にコロニー形成したことを意味する。本発明のさらなる実施形態では、「完全コロニー形成」または「部分コロニー形成」という用語はそれぞれ、細菌が永続的または一時的に腸内に保持されることを意味する。一般的には本発明の組成物を経口投与するが、直腸内、鼻腔内、または頬側もしくは舌下経路を介して投与してもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、泡状物、スプレーまたはゲルとして投与してもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物を、例えばカカオ脂（カカオバター）、合成硬脂肪（例えば、ｓｕｐｐｏｃｉｒｅ、ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、グリセロゼラチン、ポリエチレングリコール、またはセッケングリセリン組成物の形態で、肛門坐剤などの坐剤として投与してもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、経鼻胃管、経口胃管、胃管、空腸瘻管（Ｊチューブ）、経皮内視鏡的胃瘻造設術（ＰＥＧ）などの管、または胃、空腸、及び他の好適なアクセスポートへのアクセスを提供する胸壁ポートなどのポートを介して、消化管に投与される。
本発明の組成物を、１回投与してもよく、または処置レジメンの一部として連続的に投与してもよい。ある特定の実施形態において、本発明の組成物を毎日（１回または複数回のいずれか）投与する。
本発明のある特定の実施形態において、本発明に係る処置は、患者の腸内細菌叢の評価を伴う。本発明の菌株の送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成が達成されず、効力が観察されなければ処置を繰り返してもよく、または送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成が成功して効力が観察されれば処置を中止してもよい。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、子宮内の子供及び／または出産後の子供に疾患が発生する可能性を減少させるために妊娠中の動物、例えばヒトなどの哺乳動物に投与されてもよい。
本発明の組成物は、免疫活性の低減によって媒介される疾患もしくは状態を有すると診断されている患者、または免疫活性の低減によって媒介される疾患もしくは状態のリスクがあると特定された患者に投与されてもよい。本組成物はまた、健康な患者における免疫活性の低減によって媒介される疾患または状態の発生を予防するための予防手段として投与されてもよい。
本発明の組成物は、免疫活性欠乏と診断された患者、または免疫活性欠乏のリスクがあると特定された患者に投与されてもよい。例えば、患者において、Ｂ．ｂｒｅｖｅのコロニー形成が低減しているか、またはコロニー形成されていない場合がある。
本発明の組成物は、食品、例えば栄養補助剤として投与されてもよい。
概して、本発明の組成物はヒトの処置のためのものであるが、家禽、ブタ、ネコ、イヌ、ウマ、またはウサギなどの単胃哺乳動物を含む動物を処置するのに使用してもよい。本発明の組成物は、動物の成長及び能力の増強に有用であり得る。動物に投与する場合は、強制経口投与を使用してもよい。
組成物
本発明の組成物は、概して、細菌を含む。本発明の好ましい実施形態では、組成物は凍結乾燥形態で製剤化される。例えば、本発明の組成物は、本発明の細菌株を含む顆粒剤またはゼラチンカプセル、例えば硬ゼラチンカプセルを含み得る。
本発明の組成物は、概して、細菌を含む。本発明の好ましい実施形態では、組成物は凍結乾燥形態で製剤化される。例えば、本発明の組成物は、本発明の細菌株を含む顆粒剤またはゼラチンカプセル、例えば硬ゼラチンカプセルを含み得る。
好ましくは、本発明の組成物は、凍結乾燥細菌を含む。細菌の凍結乾燥は十分に確立された手順であり、関連する指針を、例えば参考文献［５０、５２］で入手することができる。実施例により、凍結乾燥組成物が特に有効であることが示されている。
あるいは、本発明の組成物は、生菌の活性な細菌培養物を含み得る。
好ましい実施形態では、本発明の組成物は、腸への細菌株の送達を可能にするようにカプセル封入されている。カプセル封入は、例えば、圧力、酵素活性、またはｐＨの変化によって誘発され得る物理的崩壊などの化学的または物理的な刺激による破裂によって標的部位に送達されるまで、組成物を分解から保護する。任意の適切なカプセル封入方法を使用してよい。例示的なカプセル封入技術には、多孔性マトリックスへの封入、固体担体表面への結合または吸着、凝結または架橋剤による自己凝集、及び微孔性膜またはマイクロカプセルへの機械的封じ込めが含まれる。本発明の組成物を調製するために有用であり得るカプセル化の指針は、例えば参考文献［５３］及び［５４］で入手することができる。
組成物は経口投与されてもよく、錠剤、カプセル、または粉末の形態であってもよい。Ｂ．ｂｒｅｖｅは嫌気性菌であるため、カプセル封入された製品が好ましい。インビボの送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成及び生存率を向上させるための脱酸素剤及びプレバイオティクス基質として、他の成分（例えばビタミンＣなど）を含めてもよい。あるいは、本発明のプロバイオティクス組成物は、食品もしくは栄養製品、例えば乳ベースもしくは乳清ベースの発酵乳製品、または医薬品として経口投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、組成物は、加水分解された乳牛の乳清を含まない。
本発明の組成物は、治療有効量の本発明の細菌株を含む。細菌株の治療有効量は、患者に有益な効果を及ぼすのに十分である。細菌株の治療有効量は、患者の腸への送達及び／または部分的もしくは全体的なコロニー形成をもたらすのに十分であり得る。
例えば成人のヒトに対する細菌の好適な１日用量は、約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）、例えば、約１×１０７〜約１×１０１０ＣＦＵであってもよく、別の例では、約１×１０６〜約１×１０１０ＣＦＵであってもよく、別の例では、約１×１０７〜約１×１０１１ＣＦＵであってもよく、別の例では、約１×１０８〜約１×１０１０ＣＦＵであってもよく、別の例では、約１×１０８〜約１×１０１１ＣＦＵであってもよい。
ある特定の実施形態において、細菌の用量は、少なくとも１日当たり１０９細胞、例えば、少なくとも１日当たり１０１０細胞、少なくとも１日当たり１０１１細胞、または少なくとも１日当たり１０１２細胞である。
ある特定の実施形態において、組成物は、組成物の重量に対して、約１×１０６〜約１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、例えば、約１×１０８〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの量の細菌株を含有する。用量は、例えば、１ｇ、３ｇ、５ｇ、及び１０ｇであり得る。
組成物の１用量は、組成物の重量に対して、約１×１０６〜約１×１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｇの細菌株を含み得る。用量は成人に適し得る。例えば、組成物は、約１×１０３〜約１×１０１１ＣＦＵ／ｇ、例えば、約１×１０７〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの細菌株を含むことができ、別の例では、約１×１０６〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの細菌株を含むことができ、別の例では、約１×１０７〜約１×１０１１ＣＦＵ／ｇの細菌株を含むことができ、別の例では、約１×１０８〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇの細菌株を含むことができ、別の例では、約１×１０８〜約１×１０１１ＣＦＵ／ｇの細菌株を含むことができる。用量は、例えば、１ｇ、３ｇ、５ｇ、及び１０ｇであり得る。
ある特定の実施形態において、本発明は、細菌株の量が、組成物の重量１グラム当たり約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位である、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、上記の医薬組成物を提供し、この組成物は、５００ｍｇ〜１０００ｍｇ、６００ｍｇ〜９００ｍｇ、７００ｍｇ〜８００ｍｇ、５００ｍｇ〜７５０ｍｇまたは７５０ｍｇ〜１０００ｍｇの用量で投与される。ある特定の実施形態において、本発明は、上記の医薬組成物を提供し、この医薬組成物中の凍結乾燥細菌は、５００ｍｇ〜１０００ｍｇ、６００ｍｇ〜９００ｍｇ、７００ｍｇ〜８００ｍｇ、５００ｍｇ〜７５０ｍｇまたは７５０ｍｇ〜１０００ｍｇの用量で投与される。
組成物は、プロバイオティクスとして製剤化されてもよい。プロバイオティクスは、適切な量で投与された場合に宿主に健康上のベネフィットをもたらす生きた微生物として、ＦＡＯ／ＷＨＯによって定義されている。
典型的には、本発明の組成物などのプロバイオティクスを、少なくとも１つの好適なプレバイオティクス化合物と任意で組み合わせる。プレバイオティクス化合物は通常、オリゴ糖もしくは多糖、または糖アルコールなどの非消化性炭水化物であり、これは上部消化管において分解または吸収されない。既知のプレバイオティクスには、市販の製品、例えばイヌリン及びトランスガラクトオリゴ糖が含まれる。
ある特定の実施形態において、本発明のプロバイオティクス組成物は、プレバイオティクス化合物を、組成物の全重量に対して約１〜約３０重量％（例えば、５〜２０重量％）の量で含む。炭水化物は、フラクトオリゴ糖（またはＦＯＳ）、短鎖フラクトオリゴ糖、イヌリン、イソマルトオリゴ糖、ペクチン、キシロオリゴ糖（またはＸＯＳ）、キトサンオリゴ糖（またはＣＯＳ）、ベータグルカン、アレイブル（ａｒａｂｌｅ）ゴム修飾耐性デンプン、ポリデキストロース、Ｄ−タガトース、アカシアファイバー、イナゴマメ、オート麦、及びシトラスファイバーからなる群から選択され得る。一態様では、プレバイオティクスは、短鎖フラクトオリゴ糖（簡単にするために、本明細書において以降ＦＯＳｓ−ｃ．ｃと示す）であり、前記ＦＯＳｓ−ｃ．ｃは、消化可能な炭水化物ではなく、概してビートシュガーの転換によって得られ、３つのグルコース分子が結合しているサッカロース分子を含む。
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体を含み得る。そのような好適な賦形剤の例は、参考文献［５５］に見出すことができる。治療用途に許容される担体または希釈剤は製薬分野において周知であり、例えば参考文献［５６］に記載されている。好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。薬学的担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図される投与経路及び標準的な薬務との関連で選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、もしくは希釈剤として、またはそれに加えて、任意の好適な結合剤（複数可）、潤滑剤（複数可）、懸濁剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、可溶化剤（複数可）を含み得る。好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、天然糖、例えばグルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、ベータ−ラクトース、トウモロコシ甘味料、天然及び合成のガム、例えばアカシア、トラガントまたはアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。好適な潤滑剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。保存剤、安定剤、色素、及びさらには香味料を医薬組成物中に供給してもよい。保存剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。抗酸化剤及び懸濁剤を使用してもよい。
本発明の組成物は、食品として製剤化されてもよい。例えば、食品は、栄養補助剤などにおいて、本発明の治療効果に加えて栄養上のベネフィットを提供し得る。同様に、本発明の組成物の味を向上させるために、または医薬組成物ではなく一般的な食品により類似させることによって組成物の消費をより誘引するために、食品を製剤化してもよい。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は乳ベースの製品として製剤化される。「乳ベースの製品」という用語は、多様な脂肪含有量を有する任意の液体または半固体の乳ベースまたは乳清ベースの製品を意味する。乳ベースの製品は、例えば牛乳、ヤギ乳、ヒツジ乳、スキムミルク、全乳、粉乳から還元した乳、及び加工していない乳清、または加工製品、例えばヨーグルト、凝固乳、カード、サワーミルク、サワー全乳、バターミルク、及び他のサワーミルク製品であり得る。別の重要な群としては、乳飲料、例えば乳清飲料、発酵乳、コンデンスミルク、幼児用または乳児用ミルク；フレーバーミルク、アイスクリーム；ミルク含有食品、例えばスイーツが挙げられる。
ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、単一の細菌株または種を含有し、他のいかなる細菌株または種も含有しない。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、単一の細菌種を含有し、他のいかなる細菌種も含有しない。ある特定の実施形態において、本発明の組成物は、単一の細菌株を含有し、他のいかなる細菌株も含有しない。例えば、本発明の組成物は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌のみを含み得る。そのような組成物は、ごく微量のまたは生物学的に無関係な量のみの他の細菌株または種を含んでもよい。そのような組成物は、他の種の生物を実質的に含まない培養物であってもよい。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、他の種の生物を実質的に含まない凍結乾燥物であってもよい。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、２以上の細菌株または種を含有する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ種に由来する２以上の菌株（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または４５を超える菌株）を含み、任意選択で、いずれかの他の種に由来する細菌を含まない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ種に由来する５０未満の菌株（例えば４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、または３未満の菌株）を含み、任意選択で、いずれかの他の種に由来する細菌を含まない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ種に由来する１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、６〜３０、６〜１５、１６〜２５、または３１〜５０の菌株を含み、任意選択で、いずれかの他の種に由来する細菌を含まない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ属に由来する２以上の種（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２３、２５、３０、３５、または４０を超える種）を含み、任意選択で、いずれかの他の属に由来する細菌を含まない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ属に由来する５０未満の種（例えば５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１２、１０、８、７、６、５、４、または３未満の種）を含み、任意選択で、いずれかの他の属に由来する細菌を含まない。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、同じ属に由来する１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜５０、２〜４０、２〜３０、２〜２０、２〜１５、２〜１０、２〜５、６〜３０、６〜１５、１６〜２５、または３１〜５０の種を含み、任意選択で、いずれかの他の属に由来する細菌を含まない。本発明は、前述の任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、組成物は微生物コンソーシアムを含む。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、微生物コンソーシアムの一部としてＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ細菌株を含む。例えば、いくつかの実施形態では、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ細菌株は、１または２以上（例えば、少なくとも２、３、４、５、１０、１５または２０）のＢｌａｕｔｉａ属及び／または他の属に由来する他の細菌株と組み合わせて存在し、インビボの腸内で、それとともに共生的に生存することができる。例えば、いくつかの実施形態では、組成物は、異なる属に由来する細菌株と組み合わせたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅの細菌株を含む。別の例では、組成物は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に由来する細菌株と組み合わせたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅの細菌株を含むか、または組成物は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に由来する細菌株及び異なる属に由来する細菌株と組み合わせたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅの細菌株を含む。いくつかの実施形態では、微生物コンソーシアムは、単一の生物、例えばヒトの糞便試料から得られた２または３以上の細菌株を含む。いくつかの実施形態では、微生物コンソーシアムは、自然界では一緒に見出されない。例えば、いくつかの実施形態では、微生物コンソーシアムは、少なくとも２つの異なる生物の糞便試料から得られた細菌株を含む。いくつかの実施形態では、２つの異なる生物は、同じ種、例えば、２名の異なるヒトに由来する。いくつかの実施形態では、２つの異なる生物は、乳児ヒト及び成人ヒトである。いくつかの実施形態では、２つの異なる生物は、ヒト及び非ヒト哺乳動物である。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株と同じ安全性及び治療効力特性を有するが、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株ではない細菌株をさらに含む。
本発明の組成物が２以上の細菌株、種または属を含むいくつかの実施形態では、それぞれの細菌株、種または属は、別々の投与、同時投与または逐次投与用であり得る。例えば、組成物に２以上の細菌株、種もしくは属のすべてを含めてもよく、または細菌株、種もしくは属を別々に保管し、それらを別々に投与、同時投与もしくは逐次投与してもよい。いくつかの実施形態では、２以上の細菌株、種または属を別々に保管するが、使用前に一緒に混合する。
いくつかの実施形態では、本発明に使用するための細菌株を、成人ヒトの糞便から得る。本発明の組成物が２以上の細菌株を含むいくつかの実施形態では、すべての細菌株を成人ヒトの糞便から得るか、または他の細菌株が存在する場合は、それらはごく微量でのみ存在する。細菌は、成人ヒトの糞便から得た後に培養され、本発明の組成物に使用されている可能性がある。
いくつかの実施形態では、１または２以上のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ細菌株は、本発明の組成物中の唯一の治療的に活性な作用物質（複数可）である。いくつかの実施形態では、組成物中の細菌株（複数可）は、本発明の組成物中の唯一の治療的に活性な作用物質（複数可）である。
本発明に従って使用するための組成物は、販売承認を必要とする場合と必要としない場合がある。
ある特定の実施形態において、本発明は、前記細菌株が凍結乾燥されている、上記の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、前記細菌株が噴霧乾燥されている、上記の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、細菌株が凍結乾燥または噴霧乾燥されており、生存している、上記の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、細菌株が凍結乾燥または噴霧乾燥されており、生存可能である、上記の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、細菌株が凍結乾燥または噴霧乾燥されており、腸に部分的または完全にコロニー形成することができる、上記の医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本発明は、細菌株が凍結乾燥または噴霧乾燥されており、生存可能であり、腸に部分的または完全にコロニー形成することができる、上記の医薬組成物を提供する。
場合によっては、凍結乾燥または噴霧乾燥細菌株は、投与前に再調製される。場合によっては、再調製は、本明細書に記載の希釈剤の使用による。
本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体を含み得る。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、それを必要とする対象に投与されたときに障害を処置するのに十分な量で存在する。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、疾患または状態を処置または予防するのに十分な量で存在する。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、疾患または状態を処置または予防するのに十分な量で存在する。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、疾患または状態を処置または予防するのに十分な量で存在する。
ある特定の実施形態において、本発明は、本発明の細菌株と、薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤とを含む医薬組成物を提供し、ここで、細菌株は、免疫応答の低減によって媒介される疾患または状態を処置または予防するのに十分な量で存在する。
ある特定の実施形態において、本発明は、細菌株の量が、組成物の重量１グラム当たり約１×１０３〜約１×１０１１コロニー形成単位である、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、組成物が１ｇ、３ｇ、５ｇ、または１０ｇの用量で投与される、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、組成物が経口、直腸内、皮下、経鼻、頬側、及び舌下からなる群から選択される方法で投与される、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール及びソルビトールからなる群から選択される担体を含む、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、エタノール、グリセロール、及び水からなる群から選択される希釈剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、ベータ−ラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、及び塩化ナトリウムからなる群から選択される賦形剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、保存剤、抗酸化剤、及び安定剤のうちの少なくとも１つをさらに含む、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルからなる群から選択される保存剤を含む、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、前記細菌株が凍結乾燥されている、上記の医薬組成物を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、上記の医薬組成物であって、約４℃または約２５℃の密封容器に組成物を保管し、容器を相対湿度５０％の雰囲気に置いた場合、少なくとも約１か月、３か月、６か月、１年、１．５年、２年、２．５年、または３年の期間が経過した後に、コロニー形成単位で測定した細菌株の少なくとも８０％が残る、医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載される組成物を含む密封容器で提供される。いくつかの実施形態では、密封容器は小袋またはボトルである。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、本明細書に記載される組成物を含むシリンジで提供される。
本発明の組成物は、いくつかの実施形態では、医薬製剤として提供されてもよい。例えば、本組成物は、錠剤またはカプセルとして提供され得る。いくつかの実施形態では、カプセルはゼラチンカプセル（「ゲルキャップ」）である。カプセルは、硬カプセルまたは軟カプセルであってよい。いくつかの実施形態では、製剤は軟カプセルである。軟カプセルは、カプセルシェルに存在する、例えばグリセロール、ソルビトール、マルチトール、及びポリエチレングリコールなどの軟化剤の添加により、一定の弾性及び柔軟性を有し得るカプセルである。軟カプセルは、例えば、ゼラチンまたはデンプンをベースとして生成することができる。ゼラチンベースの軟カプセルは、様々な供給元から市販されている。例えば、経口または直腸内などの投与方法に応じて、軟カプセルは様々な形状を有することができ、例えば、円形、楕円形、長方形、または魚雷型であってよい。軟カプセルは、例えば、Ｓｃｈｅｒｅｒプロセス、Ａｃｃｏｇｅｌプロセスまたは液滴もしくは発泡プロセスなどの従来のプロセスによって生成することができる。
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は経口投与される。経口投与は、化合物が消化管に入るように、嚥下を伴うものであり得る。
経口投与に好適な医薬製剤としては、固体プラグ（ｓｏｌｉｄ ｐｌｕｇ）、固体微粒子、半固体及び液体（多相または分散系を含む）、例えば錠剤；複合粒子もしくはナノ粒子、液体（例えば水溶液）、エマルション、または粉末を含む軟カプセルもしくは硬カプセル；ロゼンジ（液体充填型を含む）；咀嚼剤；ゲル；迅速分散剤形；フィルム；オビュール（ｏｖｕｌｅ）；スプレー；ならびに頬側／粘膜付着性パッチが挙げられる。
いくつかの実施形態では、医薬製剤は、腸溶性製剤、すなわち本発明の組成物を経口投与によって腸に送達するのに好適な胃耐性製剤（例えば、胃のｐＨに耐性がある）である。腸溶性製剤は、細菌または組成物の別の成分が酸感受性である場合、例えば胃条件下で分解されやすい場合に特に有用であり得る。
いくつかの実施形態では、腸溶性製剤は腸溶コーティングを含む。いくつかの実施形態では、製剤は腸溶コーティングされた剤形である。例えば、製剤は、腸溶コーティングされた錠剤または腸溶コーティングされたカプセルなどであり得る。腸溶コーティングは、従来の腸溶コーティング、例えば、経口送達用の錠剤、カプセルなどのための従来のコーティングであってよい。製剤は、フィルムコーティング、例えば、腸溶性ポリマー、例えば酸不溶性ポリマーの薄膜層を含み得る。
いくつかの実施形態では、腸溶性製剤は、腸溶コーティングを必要とせずに、本質的に腸溶性、例えば、胃耐性である。したがって、いくつかの実施形態では、製剤は、腸溶コーティングを含まない腸溶性製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、熱ゲル化材料から作製されたカプセルである。いくつかの実施形態では、熱ゲル化材料は、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）などのセルロース材料である。いくつかの実施形態では、カプセルは、いかなるフィルム形成ポリマーも含まないシェルを含む。いくつかの実施形態では、カプセルはシェルを含み、シェルはヒドロキシプロピルメチルセルロースを含み、いかなるフィルム形成ポリマーも含まない（例えば［５７］を参照されたい）。いくつかの実施形態では、製剤は、本質的に腸溶性のカプセル（例えば、ＣａｐｓｕｇｅｌのＶｃａｐｓ（登録商標））である。
培養方法
本発明に使用するための細菌株は、例えば、参考文献［５８〜６０］に詳述されている標準的な微生物学的技術を使用して培養することができる。
本発明に使用するための細菌株は、例えば、参考文献［５８〜６０］に詳述されている標準的な微生物学的技術を使用して培養することができる。
培養に使用する固体または液体培地は、ＹＣＦＡ寒天培地またはＹＣＦＡ培地であってもよい。ＹＣＦＡ培地は、（１００ｍｌ当たり、概算値）カシトン（１．０ｇ）、酵母抽出物（０．２５ｇ）、ＮａＨＣＯ３（０．４ｇ）、システイン（０．１ｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（０．０４５ｇ）、ＮａＣｌ（０．０９ｇ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（０．０９ｇ）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．００９ｇ）、ＣａＣｌ２（０．００９ｇ）、レサズリン（０．１ｍｇ）、ヘミン（１ｍｇ）、ビオチン（１μｇ）、コバラミン（１μｇ）、ｐ−アミノ安息香酸（３μｇ）、葉酸（５μｇ）、及びピリドキサミン（１５μｇ）を含み得る。
ワクチン組成物に使用するための細菌株
本発明者らは、本発明の細菌株が免疫活性の低減に関連する疾患または状態の処置または予防に有用であることを明らかにした。これは、本発明の細菌株が宿主免疫系に対して有する効果の結果である可能性が高い。したがって、本発明の組成物は、ワクチン組成物として投与された場合に、疾患または状態を予防するのに有用であり得る。そのようなある特定の実施形態において、本発明の細菌株は、死滅、不活化または弱毒化され得る。そのような特定の実施形態において、組成物は、ワクチンアジュバントを含み得る。ある特定の実施形態において、組成物は、注射によって、例えば皮下注射によって投与されるためのものである。
本発明者らは、本発明の細菌株が免疫活性の低減に関連する疾患または状態の処置または予防に有用であることを明らかにした。これは、本発明の細菌株が宿主免疫系に対して有する効果の結果である可能性が高い。したがって、本発明の組成物は、ワクチン組成物として投与された場合に、疾患または状態を予防するのに有用であり得る。そのようなある特定の実施形態において、本発明の細菌株は、死滅、不活化または弱毒化され得る。そのような特定の実施形態において、組成物は、ワクチンアジュバントを含み得る。ある特定の実施形態において、組成物は、注射によって、例えば皮下注射によって投与されるためのものである。
概説
本発明の実践には、特記なき限り、当業者が備えている技能の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学、及び薬理学の従来の方法が用いられる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、参考文献［６１］及び［６２、６８］などを参照されたい。
本発明の実践には、特記なき限り、当業者が備えている技能の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学、及び薬理学の従来の方法が用いられる。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、参考文献［６１］及び［６２、６８］などを参照されたい。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘ「を含む」組成物は、Ｘのみからなる場合もあれば、何らかの追加要素を含む、例えばＸ＋Ｙである場合もある。
数値ｘに関する「約」という用語は任意であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
「実質的に」という用語は「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という用語は本発明の定義から省略されてもよい。
２つのヌクレオチド配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アライメントしたとき、そのパーセンテージのヌクレオチドが２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアライメント及び相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野で既知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献［６９］のセクション７．７．１８に記載されているものを使用して決定することができる。好ましいアライメントは、ギャップオープンペナルティが１２、ギャップ延長ペナルティが２、ＢＬＯＳＵＭ行列が６２のアフィンギャップ検索を使用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献［７０］に開示されている。
特に明記しない限り、多数のステップを含むプロセスまたは方法は、方法の最初もしくは最後に追加のステップを含んでもよく、または途中に追加のステップを含んでもよい。また、必要に応じて、ステップを組み合わせたり、省略したり、または代替的な順序で行ったりしてもよい。
本明細書では、本発明の様々な実施形態を記載している。各実施形態で規定した特徴を他の規定の特徴と組み合わせて、さらなる実施形態をもたらすことができることは理解されよう。特に、本明細書で好適、典型的、または好ましいと強調された実施形態は、互いに組み合わせることができる（それらが相互排他的である場合を除く）。
本明細書に引用されている特許及び参照文献はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
薬剤を患者へ投与することを含む処置方法へのあらゆる言及は、また、前記処置方法に使用するためのその薬剤、ならびに前記処置方法における薬剤の使用、及び薬物の製造における薬剤の使用を包含する。
以下の実施例は、例証目的で提示されるにすぎず、決して本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
実施例１
要旨
この試験の目的は、ＭＲｘ０００４のインビトロの免疫調節特性を特性評価することであった。さらに、ゲノミクス、トランスクリプトミクス及びプロテオミクスの組み合わせを使用して、ＭＲｘ０００４に対する宿主応答の媒介を担う可能性のある潜在的な主要エフェクターを同定した。
要旨
この試験の目的は、ＭＲｘ０００４のインビトロの免疫調節特性を特性評価することであった。さらに、ゲノミクス、トランスクリプトミクス及びプロテオミクスの組み合わせを使用して、ＭＲｘ０００４に対する宿主応答の媒介を担う可能性のある潜在的な主要エフェクターを同定した。
材料及び方法
細菌株、プラスミド及びプライマー
本試験において菌株を作製するために使用したすべての細菌株及びプラスミド及びプライマーを表７に示す。特に明記されていない限り、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株を、嫌気性ワークステーション（Ｄｏｎ Ｗｈｉｔｌｅｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｈｉｐｌｅｙ，ＵＫ）内で３７℃で、酵母抽出物−カゼイン脂肪酸加水分解物（ＹＣＦＡ）ブロス（Ｅ＆Ｏ Ｌａｂｓ，Ｂｏｎｎｙｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）中で通常通り培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株を、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス［７１］中で３７℃で攪拌しながら通常通り培養した。必要に応じて、増殖培地に、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（Ｅ．ｃｏｌｉの場合は１０μｇ／ｍｌ、もしくはＢ．ｂｒｅｖｅの場合は３μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（Ｅ．ｃｏｌｉの場合は１００μｇ／ｍｌ、もしくはＢ．ｂｒｅｖｅの場合は１μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン（１００〜３００μｇ／ｍｌ）、またはカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充した（すべての抗生物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，ＵＫからである）。ｐＯＲＩ１９またはｐＷＳＫ２９を含有する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞を、４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）及び０．１ＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより供給）を補充したＬＢ寒天培地上で選択した。
細菌株、プラスミド及びプライマー
本試験において菌株を作製するために使用したすべての細菌株及びプラスミド及びプライマーを表７に示す。特に明記されていない限り、Ｂ．ｂｒｅｖｅ菌株を、嫌気性ワークステーション（Ｄｏｎ Ｗｈｉｔｌｅｙ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓｈｉｐｌｅｙ，ＵＫ）内で３７℃で、酵母抽出物−カゼイン脂肪酸加水分解物（ＹＣＦＡ）ブロス（Ｅ＆Ｏ Ｌａｂｓ，Ｂｏｎｎｙｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）中で通常通り培養した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株を、Ｌｕｒｉａ Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス［７１］中で３７℃で攪拌しながら通常通り培養した。必要に応じて、増殖培地に、テトラサイクリン（１０μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（Ｅ．ｃｏｌｉの場合は１０μｇ／ｍｌ、もしくはＢ．ｂｒｅｖｅの場合は３μｇ／ｍｌ）、エリスロマイシン（Ｅ．ｃｏｌｉの場合は１００μｇ／ｍｌ、もしくはＢ．ｂｒｅｖｅの場合は１μｇ／ｍｌ）、スペクチノマイシン（１００〜３００μｇ／ｍｌ）、またはカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補充した（すべての抗生物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ，ＵＫからである）。ｐＯＲＩ１９またはｐＷＳＫ２９を含有する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞を、４０μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）及び０．１ＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）（いずれもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより供給）を補充したＬＢ寒天培地上で選択した。
不死化細胞の通常培養
ＨＴ２９−ＭＴＸ−Ｅ１２細胞（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１倍の非必須アミノ酸溶液及び１倍の抗生物質抗真菌溶液を補充した高グルコース改変ダルベッコ最小イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、通常通り培養した。細胞をアッセイ容器に播種して９日間培養後、ハンクス平衡塩類溶液で２回洗浄し、処理開始前に共培養培地（４ｍＭのＬ−グルタミン、１倍の非必須アミノ酸溶液、５μｇ／ｍｌのアポトランスフェリン及び２００ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ）に入れた。
ＨＴ２９−ＭＴＸ−Ｅ１２細胞（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，ＵＫ）を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ−グルタミン、１倍の非必須アミノ酸溶液及び１倍の抗生物質抗真菌溶液を補充した高グルコース改変ダルベッコ最小イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、通常通り培養した。細胞をアッセイ容器に播種して９日間培養後、ハンクス平衡塩類溶液で２回洗浄し、処理開始前に共培養培地（４ｍＭのＬ−グルタミン、１倍の非必須アミノ酸溶液、５μｇ／ｍｌのアポトランスフェリン及び２００ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウムを補充したＤＭＥＭ）に入れた。
共培養アッセイのための細菌処理物の調製
共培養実験では、対数期に達するまで細菌を培養した。生菌細胞及び上清を遠心分離により分離後、生菌（ＬＶと表記）をＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１回洗浄し、下流で使用するために適切な細胞培養培地に再懸濁させた。上清（ＳＮと表記）を０．２２μｍフィルターに通し、共培養培地で適切に希釈した。熱不活化細菌（ＨＫと表記）を、８０°Ｃで３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、適切な細胞培養培地に再懸濁させることにより調製した。生存数をプレーティングにより確認した。
共培養実験では、対数期に達するまで細菌を培養した。生菌細胞及び上清を遠心分離により分離後、生菌（ＬＶと表記）をＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で１回洗浄し、下流で使用するために適切な細胞培養培地に再懸濁させた。上清（ＳＮと表記）を０．２２μｍフィルターに通し、共培養培地で適切に希釈した。熱不活化細菌（ＨＫと表記）を、８０°Ｃで３０分間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、適切な細胞培養培地に再懸濁させることにより調製した。生存数をプレーティングにより確認した。
レポーターアッセイ
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞及びＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦ−κＢ細胞を９０％の密度まで増殖させ、ＰＢＳで１回洗浄し、抗生物質を含まない培地にそれぞれ２８０，０００細胞／ｍｌ及び５００，０００細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。細菌処理物（生菌、加熱死及び上清）を１００：１の感染多重度（ＭＯＩ）で細胞に添加した。アッセイの陽性対照であるＰａｍＣＳ３Ｋ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）及び加熱死Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＨＫＬＭ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をそれぞれ、１０ｎｇ／ｍｌの濃度及び２００：１のＭＯＩで使用した。陰性対照、培地及びビヒクルを、各処理に対し同等のものを提供するように調製した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２２時間インキュベートした。共培養からの培地をＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で１０倍に希釈し、１時間（ＮＦκＢ）または２時間（ＴＬＲ２）インキュベートし、６５５ｎｍでの光学濃度を記録した。
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞及びＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦ−κＢ細胞を９０％の密度まで増殖させ、ＰＢＳで１回洗浄し、抗生物質を含まない培地にそれぞれ２８０，０００細胞／ｍｌ及び５００，０００細胞／ｍｌの密度で再懸濁させた。細菌処理物（生菌、加熱死及び上清）を１００：１の感染多重度（ＭＯＩ）で細胞に添加した。アッセイの陽性対照であるＰａｍＣＳ３Ｋ４（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）及び加熱死Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＨＫＬＭ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）をそれぞれ、１０ｎｇ／ｍｌの濃度及び２００：１のＭＯＩで使用した。陰性対照、培地及びビヒクルを、各処理に対し同等のものを提供するように調製した。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２２時間インキュベートした。共培養からの培地をＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）で１０倍に希釈し、１時間（ＮＦκＢ）または２時間（ＴＬＲ２）インキュベートし、６５５ｎｍでの光学濃度を記録した。
ＨＴ２９−ＭＴＸ細胞とのラージスケールの共培養
ＨＴ２９−ＭＴＸ細胞を、前述のように、直径１０ｃｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の上部チャンバーで培養した。細菌を後期対数期まで培養し、前述のように洗浄して再懸濁させた。細菌を１００：１のＭＯＩで細胞に添加し、共培養物を３７℃、嫌気性条件で３時間インキュベートした。トランスウェルの上部チャンバーから細菌を含む培地を採取し、５０００×ｇで５〜１０分間遠心分離して、下流の用途のために細菌細胞を採取した。
ＨＴ２９−ＭＴＸ細胞を、前述のように、直径１０ｃｍのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）の上部チャンバーで培養した。細菌を後期対数期まで培養し、前述のように洗浄して再懸濁させた。細菌を１００：１のＭＯＩで細胞に添加し、共培養物を３７℃、嫌気性条件で３時間インキュベートした。トランスウェルの上部チャンバーから細菌を含む培地を採取し、５０００×ｇで５〜１０分間遠心分離して、下流の用途のために細菌細胞を採取した。
細菌のｑＰＣＲ分析
ＲＮＡ単離のために、後期対数期及び定常増殖期のインビトロ培養物から、ならびにＨＴ２９−ＭＴＸとのラージスケールの共培養後の培養物から、細菌を採取した。製造業者の説明書（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、ＲＮＡＰｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して細菌を採取及び保管した。細菌細胞を、リゾチーム（１５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びプロテイナーゼＫ（６ｍＡＵ）（ＱＩＡＧＥＮ）で３７℃で３０分間インキュベートすることにより溶解させ、続いて、ＦａｓｔＰｒｅｐ ２４装置（６ｍ／ｓで２０秒間のサイクルを２回）及びＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｂ（いずれもＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ，ＵＳＡより）を使用してホモジナイズした。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して全ＲＮＡを単離し、オンカラム消化（ＱＩＡＧＥＮ）でＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを使用して、ゲノムＤＮＡを除去した（いずれも製造業者の説明書に従った）。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って使用して、ｃＤＮＡを合成した。プライマーをＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓソフトウェア［７２］を使用して設計した。ｑＰＣＲ反応を製造業者の推奨に従ってＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で設定し、アッセイを７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて、次のサイクル：９５℃で１０分間の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル使用して実施した。データ分析をデルタデルタＣｔ分析を使用して実施し、試験遺伝子の発現をハウスキーパーｇｒｏＥＬに対して正規化した。
ＲＮＡ単離のために、後期対数期及び定常増殖期のインビトロ培養物から、ならびにＨＴ２９−ＭＴＸとのラージスケールの共培養後の培養物から、細菌を採取した。製造業者の説明書（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に従って、ＲＮＡＰｒｏｔｅｃｔ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｒｅａｇｅｎｔを使用して細菌を採取及び保管した。細菌細胞を、リゾチーム（１５ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びプロテイナーゼＫ（６ｍＡＵ）（ＱＩＡＧＥＮ）で３７℃で３０分間インキュベートすることにより溶解させ、続いて、ＦａｓｔＰｒｅｐ ２４装置（６ｍ／ｓで２０秒間のサイクルを２回）及びＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ｂ（いずれもＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ，ＵＳＡより）を使用してホモジナイズした。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して全ＲＮＡを単離し、オンカラム消化（ＱＩＡＧＥＮ）でＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅを使用して、ゲノムＤＮＡを除去した（いずれも製造業者の説明書に従った）。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の説明書に従って使用して、ｃＤＮＡを合成した。プライマーをＰｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓソフトウェア［７２］を使用して設計した。ｑＰＣＲ反応を製造業者の推奨に従ってＰｏｗｅｒ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で設定し、アッセイを７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて、次のサイクル：９５℃で１０分間の後、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間を４０サイクル使用して実施した。データ分析をデルタデルタＣｔ分析を使用して実施し、試験遺伝子の発現をハウスキーパーｇｒｏＥＬに対して正規化した。
細菌細胞の切り取り
細菌細胞を、後期対数増殖期における遠心分離によって、またはＨＴ２９−ＭＴＸとの接触後に適宜回収した（詳細については上記の共培養のセクションを参照されたい）。次に、細胞を洗浄し、５０ｍＭのＴＥＡＢ緩衝液ｐＨ８．５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に１／２０の希釈度で再懸濁させた。細胞を、１ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した５０ｍＭのＴＥＡＢ緩衝液中で、シーケンスグレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）と３７°Ｃで３０分間インキュベートすることによって、切り取られたタンパク質の画分を生成した。各試料について、トリプシンを含まないチューブを、シェディングされたタンパク質（シェディングされたタンパク質の画分）の対照として並行してインキュベートした。切り取られたタンパク質の画分及びシェディングされたタンパク質の画分を、４０００×ｇ、４°Ｃで１５分間遠心分離して回収し、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ０．２２μｍ低タンパク質結合膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してシリンジ濾過した。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを製造業者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って使用して総タンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって試料の性質を評価した。ＹＣＦＡ寒天培地にプレーティングすることにより、トリプシン処理の前後に生存細胞数の測定を実施した。次に、各アッセイについて、３回の生物学的反復試験からの試料をナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
細菌細胞を、後期対数増殖期における遠心分離によって、またはＨＴ２９−ＭＴＸとの接触後に適宜回収した（詳細については上記の共培養のセクションを参照されたい）。次に、細胞を洗浄し、５０ｍＭのＴＥＡＢ緩衝液ｐＨ８．５（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に１／２０の希釈度で再懸濁させた。細胞を、１ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した５０ｍＭのＴＥＡＢ緩衝液中で、シーケンスグレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）と３７°Ｃで３０分間インキュベートすることによって、切り取られたタンパク質の画分を生成した。各試料について、トリプシンを含まないチューブを、シェディングされたタンパク質（シェディングされたタンパク質の画分）の対照として並行してインキュベートした。切り取られたタンパク質の画分及びシェディングされたタンパク質の画分を、４０００×ｇ、４°Ｃで１５分間遠心分離して回収し、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ ０．２２μｍ低タンパク質結合膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してシリンジ濾過した。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを製造業者の説明書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って使用して総タンパク質濃度を測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって試料の性質を評価した。ＹＣＦＡ寒天培地にプレーティングすることにより、トリプシン処理の前後に生存細胞数の測定を実施した。次に、各アッセイについて、３回の生物学的反復試験からの試料をナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるタンパク質の同定
簡潔に述べると、培養上清を０．５ｍｌまで濃縮して超純水で洗浄し、ＲｅａｄｙＰｒｅｐ ２−Ｄ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してタンパク質を沈降させ、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム１００μｌに再懸濁させた。次に、試料をブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と３７℃で１６時間インキュベートして、得られた上清を真空遠心分離で乾燥させ、０．１％のトリフルオロ酢酸に溶解させた。ペプチドをμ−Ｃ１８ ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｅｒｃｋ，Ｋｅｎｉｌｏｗｏｒｔｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用してさらに脱塩し、９６ウェルマイクロタイタープレートに溶出させて、真空遠心分離で乾燥させ、ＬＣ−ＭＳローディング溶媒（２％アセトニトリル、０．１％ギ酸）１０μｌに溶解させた。ペプチドを、１５ｃｍのＰｅｐＭａｐカラム、６０分でのＬＣ−ＭＳの取得方法及び５μｌの注入量を使用して、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳシステム）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により分離して同定した。切り取られたタンパク質の画分及びシェディングされたタンパク質の画分については、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム７０μｌを、３０μｌの試料に直接添加した。次に、試料をブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と３７℃で一晩インキュベートして、得られた上清を−７０℃で凍結し、真空遠心分離で乾燥させ、２０μＬのＬＣ−ＭＳローディング溶媒に溶解させた。ペプチドを、２５ｃｍのＰｅｐＭａｐカラム、６０分でのＬＣ−ＭＳの取得方法及び２μｌの注入量を使用して、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により分離して同定した。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してデータ分析を実施した。Ｍａｓｃｏｔ Ｓｅｒｖｅｒを、次のパラメータを用いて検索エンジンとして使用した：酵素＝トリプシン、最大混合切断部位＝２、前駆体の質量許容差＝１０ｐｐｍ、動的修飾＝酸化（Ｍ）、静的修飾＝カルバミドメチル（Ｃ）。同定したペプチドを、Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＭＲｘ０００４の配列決定したゲノム（２，０４７配列）に基づいて構築した菌株特異的タンパク質の配列データベースと照合した。３回の生物学的反復試験のすべてにおいて少なくとも５つのペプチドが同定された場合、タンパク質の同定は有効であるとみなされた。
簡潔に述べると、培養上清を０．５ｍｌまで濃縮して超純水で洗浄し、ＲｅａｄｙＰｒｅｐ ２−Ｄ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用してタンパク質を沈降させ、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム１００μｌに再懸濁させた。次に、試料をブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と３７℃で１６時間インキュベートして、得られた上清を真空遠心分離で乾燥させ、０．１％のトリフルオロ酢酸に溶解させた。ペプチドをμ−Ｃ１８ ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｅｒｃｋ，Ｋｅｎｉｌｏｗｏｒｔｈ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用してさらに脱塩し、９６ウェルマイクロタイタープレートに溶出させて、真空遠心分離で乾燥させ、ＬＣ−ＭＳローディング溶媒（２％アセトニトリル、０．１％ギ酸）１０μｌに溶解させた。ペプチドを、１５ｃｍのＰｅｐＭａｐカラム、６０分でのＬＣ−ＭＳの取得方法及び５μｌの注入量を使用して、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳシステム）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により分離して同定した。切り取られたタンパク質の画分及びシェディングされたタンパク質の画分については、５０ｍＭの炭酸水素アンモニウム７０μｌを、３０μｌの試料に直接添加した。次に、試料をブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）と３７℃で一晩インキュベートして、得られた上清を−７０℃で凍結し、真空遠心分離で乾燥させ、２０μＬのＬＣ−ＭＳローディング溶媒に溶解させた。ペプチドを、２５ｃｍのＰｅｐＭａｐカラム、６０分でのＬＣ−ＭＳの取得方法及び２μｌの注入量を使用して、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳシステム、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により分離して同定した。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してデータ分析を実施した。Ｍａｓｃｏｔ Ｓｅｒｖｅｒを、次のパラメータを用いて検索エンジンとして使用した：酵素＝トリプシン、最大混合切断部位＝２、前駆体の質量許容差＝１０ｐｐｍ、動的修飾＝酸化（Ｍ）、静的修飾＝カルバミドメチル（Ｃ）。同定したペプチドを、Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＭＲｘ０００４の配列決定したゲノム（２，０４７配列）に基づいて構築した菌株特異的タンパク質の配列データベースと照合した。３回の生物学的反復試験のすべてにおいて少なくとも５つのペプチドが同定された場合、タンパク質の同定は有効であるとみなされた。
Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＭＲｘ０００４−ＥＰＳｎｅｇの補完
一次グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｐＧＴＦ及びその推定プロモーターを包含するＤＮＡ断片を、Ｑ５ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｈｅｒｅｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）ならびにプライマー対：ｐＧＴＦｃｏｍｐＦ及びｐＧＴＦｃｏｍｐＲを使用した、Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＭＲｘ０００４の染色体ＤＮＡからのＰＣＲ増幅により作製した。得られた断片をＨｉｎＤＩＩＩ及びＸｂａＩ（いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡより）で消化して、同様に消化したｐＢＣ１．２にライゲーションした。ライゲーション混合物を電気的形質転換によりＥ．ｃｏｌｉ ＥＣ１０１に導入し、次に、形質転換体をＣｍ耐性に基づき選択した。いくつかのＣｍ耐性形質転換体のプラスミド含有量を、制限分析によってスクリーニングした。いくつかの組換えプラスミドにおけるクローニングされたインサートの完全性を、メチル化を促進するためにそれらをＥ．ｃｏｌｉ ＥＣ１０１ ｐＷＳＫ２９−ＭＲＸ−Ｍ＋Ｓに導入する前に、配列決定することによって確認した。メチル化ｐＢＣ１．２またはｐＢＣ１．２−ｐＧＴＦを、エレクトロポレーションによってＭＲｘ０００４ｎｅｇに形質転換し、Ｔｅｔ及びＣｍを補充した強化クロストリジウム寒天培地（ＲＣＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で選択した。コロニーＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの制限分析を使用して形質転換体のプラスミド含有量について検査し、配列決定によって確認した。得られた菌株を、Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＭＲｘ０００４−ＥＰＳ−−ｐＢＣ１．２及びＭＲｘ０００４−ＥＰＳ−−ｐＢＣ１．２−ｐＧＴＦと命名した。
一次グリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｐＧＴＦ及びその推定プロモーターを包含するＤＮＡ断片を、Ｑ５ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ，Ｈｅｒｅｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）ならびにプライマー対：ｐＧＴＦｃｏｍｐＦ及びｐＧＴＦｃｏｍｐＲを使用した、Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＭＲｘ０００４の染色体ＤＮＡからのＰＣＲ増幅により作製した。得られた断片をＨｉｎＤＩＩＩ及びＸｂａＩ（いずれもＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡより）で消化して、同様に消化したｐＢＣ１．２にライゲーションした。ライゲーション混合物を電気的形質転換によりＥ．ｃｏｌｉ ＥＣ１０１に導入し、次に、形質転換体をＣｍ耐性に基づき選択した。いくつかのＣｍ耐性形質転換体のプラスミド含有量を、制限分析によってスクリーニングした。いくつかの組換えプラスミドにおけるクローニングされたインサートの完全性を、メチル化を促進するためにそれらをＥ．ｃｏｌｉ ＥＣ１０１ ｐＷＳＫ２９−ＭＲＸ−Ｍ＋Ｓに導入する前に、配列決定することによって確認した。メチル化ｐＢＣ１．２またはｐＢＣ１．２−ｐＧＴＦを、エレクトロポレーションによってＭＲｘ０００４ｎｅｇに形質転換し、Ｔｅｔ及びＣｍを補充した強化クロストリジウム寒天培地（ＲＣＡ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で選択した。コロニーＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの制限分析を使用して形質転換体のプラスミド含有量について検査し、配列決定によって確認した。得られた菌株を、Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＭＲｘ０００４−ＥＰＳ−−ｐＢＣ１．２及びＭＲｘ０００４−ＥＰＳ−−ｐＢＣ１．２−ｐＧＴＦと命名した。
ＨＴ２９−ＭＴＸ細胞からのサイトカイン分析
生菌（前述の通りに調製）を１００：１のＭＯＩで、３７℃、５％ＣＯ２で３時間、２４ウェルプレート中でＨＴ２９−ＭＴＸ細胞と共インキュベートした。次に、ヒト組換えＴＮＦα（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）を１０ｎｇ／ｍｌで細胞に添加し、その後、共培養物をさらに２４時間インキュベートし、続いて上清を回収して、４℃、１２０００×ｇで３分間遠心分離して細胞デブリを除去した。製造業者の推奨に従ってＨｕｍａｎ ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）Ｓｔａｎｄａｒｄ ＡＢＴＳ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を使用して、上清中のＩＬ−８レベルを分析した。
生菌（前述の通りに調製）を１００：１のＭＯＩで、３７℃、５％ＣＯ２で３時間、２４ウェルプレート中でＨＴ２９−ＭＴＸ細胞と共インキュベートした。次に、ヒト組換えＴＮＦα（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）を１０ｎｇ／ｍｌで細胞に添加し、その後、共培養物をさらに２４時間インキュベートし、続いて上清を回収して、４℃、１２０００×ｇで３分間遠心分離して細胞デブリを除去した。製造業者の推奨に従ってＨｕｍａｎ ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）Ｓｔａｎｄａｒｄ ＡＢＴＳ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｋｉｔ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を使用して、上清中のＩＬ−８レベルを分析した。
ＰＢＭＣとの共培養
健康なヒトの凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。細胞を解凍して、完全増殖培地（１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ．グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０）中に３７℃、５％ＣＯ２で一晩静置した（すべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからである）。細菌処理物を前述の通りに調製した。共インキュベーションでは、細胞を４８ウェルプレートに７５０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、１０：１のＭＯＩで熱不活化細菌、及び細菌上清と、ならびに対照として適切なビヒクル及び５ｕｇ／ｍｌのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、共インキュベートした。共培養物を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、細胞を採取して、４℃、１００００×ｇで３分間遠心分離した。無細胞上清を回収し、サイトカイン分析のために−８０℃で保管した。細胞ペレットを１回洗浄し、次いで、氷上でＰＢＳに再懸濁させた。
健康なヒトの凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。細胞を解凍して、完全増殖培地（１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ．グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０）中に３７℃、５％ＣＯ２で一晩静置した（すべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからである）。細菌処理物を前述の通りに調製した。共インキュベーションでは、細胞を４８ウェルプレートに７５０，０００細胞／ウェルの密度で播種し、１０：１のＭＯＩで熱不活化細菌、及び細菌上清と、ならびに対照として適切なビヒクル及び５ｕｇ／ｍｌのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、共インキュベートした。共培養物を３７℃、５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後、細胞を採取して、４℃、１００００×ｇで３分間遠心分離した。無細胞上清を回収し、サイトカイン分析のために−８０℃で保管した。細胞ペレットを１回洗浄し、次いで、氷上でＰＢＳに再懸濁させた。
フローサイトメトリー
１群当たり１．５×１０６のＰＢＭＣとなるように処理ウェルをプールして、１５０ｕｌのＰＢＳに再懸濁させ、染色の準備がなされている９６Ｖ字底プレートに移した。まず、細胞をＶｉｏｂｉｌｉｔｙ ４０５／５２０ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｙｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｌｔｄ． Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色して、暗所で室温において１０分間、生細胞と死細胞とを判別した。次に、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ１９に対する抗体の混合物で染色して細胞の表現型を決定し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＲＥＡ抗体）、室温でさらに１０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄してＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー分析によって直ちに分析した。最初の実験の際に、ゲートの設定を支援するためにすべての抗体に対してアイソタイプを使用し、すべての実験にわたりＦＭＯ対照を含めた。すべての実験は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩを使用して実施し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）を使用して、「生（Ｌｉｖｅ）」ゲート内に１００，０００細胞で設定した取得用のストップゲートを用いた。Ｆｌｏｗｊｏバージョン１０．４．２ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して分析を実施し、分析は、生死判定用色素で特定した生細胞に基づくものであった。
１群当たり１．５×１０６のＰＢＭＣとなるように処理ウェルをプールして、１５０ｕｌのＰＢＳに再懸濁させ、染色の準備がなされている９６Ｖ字底プレートに移した。まず、細胞をＶｉｏｂｉｌｉｔｙ ４０５／５２０ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｙｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｌｔｄ． Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色して、暗所で室温において１０分間、生細胞と死細胞とを判別した。次に、細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７及びＣＤ１９に対する抗体の混合物で染色して細胞の表現型を決定し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＲＥＡ抗体）、室温でさらに１０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄してＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー分析によって直ちに分析した。最初の実験の際に、ゲートの設定を支援するためにすべての抗体に対してアイソタイプを使用し、すべての実験にわたりＦＭＯ対照を含めた。すべての実験は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩを使用して実施し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）を使用して、「生（Ｌｉｖｅ）」ゲート内に１００，０００細胞で設定した取得用のストップゲートを用いた。Ｆｌｏｗｊｏバージョン１０．４．２ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して分析を実施し、分析は、生死判定用色素で特定した生細胞に基づくものであった。
サイトカイン分析
カスタムＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘマルチプレックスイムノアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の推奨に従って使用して、ＰＢＭＣ共培養物の無細胞上清中のサイトカインの定量化を実施した。簡潔に述べると、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）システム（Ｍｅｒｃｋ）をｘＰＯＮＥＮＴソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）とともに使用して、５０μｌの上清を処理した。５パラメータロジスティック曲線及びバックグラウンド除去を用いた、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ａｎａｌｙｓｔソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ）を使用してデータを分析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｐｇ／ｍｌ値に変換した。
カスタムＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘマルチプレックスイムノアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造業者の推奨に従って使用して、ＰＢＭＣ共培養物の無細胞上清中のサイトカインの定量化を実施した。簡潔に述べると、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）システム（Ｍｅｒｃｋ）をｘＰＯＮＥＮＴソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）とともに使用して、５０μｌの上清を処理した。５パラメータロジスティック曲線及びバックグラウンド除去を用いた、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ａｎａｌｙｓｔソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ）を使用してデータを分析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をｐｇ／ｍｌ値に変換した。
データ分析
統計分析を、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ ＵＳＡ）を使用して実施した。一元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定を使用してデータを分析した。ベン図をＩｎｔｅｒａｃｔｉｖｅｎｎ［７３］を使用して作成した。
統計分析を、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．００（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ ＵＳＡ）を使用して実施した。一元配置分散分析及びテューキーの多重比較検定を使用してデータを分析した。ベン図をＩｎｔｅｒａｃｔｉｖｅｎｎ［７３］を使用して作成した。
結果
ＭＲｘ０００４はＮＦκＢレポーター細胞及びＴＬＲ２レポーター細胞を刺激する
炎症誘発性転写因子ＮＦκＢの活性化に対するＭＲｘ０００４の影響を、自然免疫の調節におけるその役割が不可欠であることから、ＴＨＰ−１−ＮＦκＢレポーター細胞株を用いて調査した。このアッセイでは、加熱死させたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＨＫＬＭ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を陽性対照として使用した。この菌株の有効画分（複数可）を同定するために、ＴＨＰ−１−ＮＦκＢ細胞を生菌（ＭＲｘ０００４ＬＶ）、細菌培養上清（ＭＲｘ０００４ＳＮ）及び熱不活化細菌（ＭＲｘ０００４ＨＫ）の処理物と共インキュベートした。３種の細菌処理物はすべて、未処理細胞及び細菌増殖培地（ＹＣＦＡ）の陰性対照と比較してＮＦκＢを有意に活性化させた（すべての比較でｐ＜０．０００１）（図７Ａ）。ＭＲｘ０００４ＬＶが最も有効な処理物であり、ＭＲｘ０００４ＳＮ及びＭＲｘ０００４ＨＫよりも有意に刺激した（両方の比較についてｐ＜０．０００１）。次に、ＭＲｘ０００４ＨＫは、ＭＲｘ０００４ＳＮよりも有意に活性であった（ｐ＝０．００６）。
ＭＲｘ０００４はＮＦκＢレポーター細胞及びＴＬＲ２レポーター細胞を刺激する
炎症誘発性転写因子ＮＦκＢの活性化に対するＭＲｘ０００４の影響を、自然免疫の調節におけるその役割が不可欠であることから、ＴＨＰ−１−ＮＦκＢレポーター細胞株を用いて調査した。このアッセイでは、加熱死させたＬｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＨＫＬＭ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を陽性対照として使用した。この菌株の有効画分（複数可）を同定するために、ＴＨＰ−１−ＮＦκＢ細胞を生菌（ＭＲｘ０００４ＬＶ）、細菌培養上清（ＭＲｘ０００４ＳＮ）及び熱不活化細菌（ＭＲｘ０００４ＨＫ）の処理物と共インキュベートした。３種の細菌処理物はすべて、未処理細胞及び細菌増殖培地（ＹＣＦＡ）の陰性対照と比較してＮＦκＢを有意に活性化させた（すべての比較でｐ＜０．０００１）（図７Ａ）。ＭＲｘ０００４ＬＶが最も有効な処理物であり、ＭＲｘ０００４ＳＮ及びＭＲｘ０００４ＨＫよりも有意に刺激した（両方の比較についてｐ＜０．０００１）。次に、ＭＲｘ０００４ＨＫは、ＭＲｘ０００４ＳＮよりも有意に活性であった（ｐ＝０．００６）。
ＭＲｘ０００４がＮＦκＢを活性化することが示されたため、上流の受容体であるＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５及びＴＬＲ９を刺激するＭＲｘ０００４の能力を調査した。予備データは、ＭＲｘ０００４がＴＬＲ４、ＴＬＲ５及びＴＬＲ９を活性化させないことを示唆した（データは示さず）。ＨＥＫ−ＴＬＲ２レポーターアッセイを、陽性対照であるＰａｍ３ＣＳＫ４、ならびに上記と同じＭＲｘ０００４処理物及び陰性対照で処理した（図７Ｂ）。ＭＲｘ０００４処理物はすべて、陰性対照と比較してＴＬＲ２を刺激した（すべての比較でｐ＜０．０００１）。ＭＲｘ０００４ＬＶが、ＭＲｘ０００４ＳＮ（ｐ＜０．０００１）及びＭＲｘ０００４ＨＫ（ｐ＜０．０００１）と比較して最も刺激性の高い処理物であり、後者は最も有効性の低い処理物であった。これらのデータに基づいて、ＭＲｘ０００４は、ＴＬＲ２に関連する様式で自然免疫応答を強力に刺激することができる。
ＭＲｘ０００４の転写プロファイリング及びプロテオミクスプロファイリングにより、潜在的な宿主応答エフェクターが明らかとなる
ＭＲｘ０００４における宿主応答の潜在的なエフェクターを同定するために、３つのアプローチを採用した。標的化した転写アッセイを使用して、ビフィズス菌−宿主相互作用の既知のエフェクターとしての同一性が予測される１０個のＭＲｘ０００４遺伝子を分析した（データは示さず）。これらには、推定アドヘシン及びムーンライティングタンパク質（ｏｐｐＡ、エノラーゼ、トランスアルドラーゼ、ｔａｄＡ、ｅｆｔＵ、プルラナーゼ（［７４］に広範に概説されている））をコードする遺伝子、ならびにコロニー形成及び免疫調節において役割を果たすと推定されている遺伝子（ＭＲｘ０００４のＥＰＳ遺伝子座［７５］、ｌｕｘＳ［７６］及びセルピン［７７］の一次グリコシルトランスフェラーゼ（ｐＧＴＦ））ならびに治療効果を有すると推定されている遺伝子（ｐｋｓ［７８］）が含まれた。これらの遺伝子の発現を、液体培養液中で後期対数期及び定常期まで増殖させたＭＲｘ０００４から単離したＲＮＡ、ならびにラージスケールのトランスウェルで培養したＨＴ２９−ＭＴＸ細胞と３時間接触させた後のＭＲｘ０００４から単離したＲＮＡにおいて分析した。ｑＰＣＲ分析（図８）により、ｅｆｔＵ、エノラーゼ及びｐＧＴＦは、後期対数期において定常期よりも著しく上方制御され、一方で、ｏｐｐＡ、プルラナーゼ、セルピン及びｔａｄＡの発現は、定常期において後期対数期よりも著しく上昇したことが示された。６つの遺伝子（ｅｆｔＵ、エノラーゼ、ｐＧＴＦ、ｏｐｐＡ、セルピン及びトランスアルドラーゼ）は、後期対数期と比較して、腸管上皮細胞（ＩＥＣ）に応答して著しく上方制御された。この分析から、ＭＲｘ０００４の遺伝子発現がＩＥＣとの接触によって変化したことが明らかであり、ＭＲｘ０００４−宿主相互作用における上方制御された遺伝子の潜在的な役割が推測された。このｑＰＣＲ分析で著しく上方制御された遺伝子の大部分は、ＩＥＣへの接着における役割を有することが予測されており、これは、このことがＭＲｘ０００４の重要な機能特性である可能性があることを示唆している。
ＭＲｘ０００４における宿主応答の潜在的なエフェクターを同定するために、３つのアプローチを採用した。標的化した転写アッセイを使用して、ビフィズス菌−宿主相互作用の既知のエフェクターとしての同一性が予測される１０個のＭＲｘ０００４遺伝子を分析した（データは示さず）。これらには、推定アドヘシン及びムーンライティングタンパク質（ｏｐｐＡ、エノラーゼ、トランスアルドラーゼ、ｔａｄＡ、ｅｆｔＵ、プルラナーゼ（［７４］に広範に概説されている））をコードする遺伝子、ならびにコロニー形成及び免疫調節において役割を果たすと推定されている遺伝子（ＭＲｘ０００４のＥＰＳ遺伝子座［７５］、ｌｕｘＳ［７６］及びセルピン［７７］の一次グリコシルトランスフェラーゼ（ｐＧＴＦ））ならびに治療効果を有すると推定されている遺伝子（ｐｋｓ［７８］）が含まれた。これらの遺伝子の発現を、液体培養液中で後期対数期及び定常期まで増殖させたＭＲｘ０００４から単離したＲＮＡ、ならびにラージスケールのトランスウェルで培養したＨＴ２９−ＭＴＸ細胞と３時間接触させた後のＭＲｘ０００４から単離したＲＮＡにおいて分析した。ｑＰＣＲ分析（図８）により、ｅｆｔＵ、エノラーゼ及びｐＧＴＦは、後期対数期において定常期よりも著しく上方制御され、一方で、ｏｐｐＡ、プルラナーゼ、セルピン及びｔａｄＡの発現は、定常期において後期対数期よりも著しく上昇したことが示された。６つの遺伝子（ｅｆｔＵ、エノラーゼ、ｐＧＴＦ、ｏｐｐＡ、セルピン及びトランスアルドラーゼ）は、後期対数期と比較して、腸管上皮細胞（ＩＥＣ）に応答して著しく上方制御された。この分析から、ＭＲｘ０００４の遺伝子発現がＩＥＣとの接触によって変化したことが明らかであり、ＭＲｘ０００４−宿主相互作用における上方制御された遺伝子の潜在的な役割が推測された。このｑＰＣＲ分析で著しく上方制御された遺伝子の大部分は、ＩＥＣへの接着における役割を有することが予測されており、これは、このことがＭＲｘ０００４の重要な機能特性である可能性があることを示唆している。
ＭＲｘ０００４による追加の宿主応答エフェクターの発現を、培養上清及び細胞表面に存在するタンパク質を同定することにより、さらに特性評価した。ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析により、ＭＲｘ０００４ＳＮ中で６４個のタンパク質を同定した（表８）。マッチしたペプチド（ＰＳＭ）の数が最も多い同定されたタンパク質は、プルラナーゼ（３５１．３３±３３．６２）、２つのＮｌｐＣ／Ｐ６０ファミリータンパク質（８２±１５．６２及び７１．６７±１３．６１）、ＡＢＣトランスポーター系の溶質結合タンパク質（５６±７）ならびに細胞分裂タンパク質ＦｔｓＩ（５６±４．３６）であった。Ｂ．ｂｒｅｖｅ及びその他の細菌種における宿主相互作用に関与するいくつかのムーンライティングタンパク質を同定し、それらには、トランスアルドラーゼ（３２．６７±３．７９）、ＧＡＰＤＨ（３０±３．６１）、ＤｎａＫ（１７．６７±３．２１）、ＧｒｏＥＬ（１２．６７±０．５８）及びエノラーゼ（５．６７±０．５８）が含まれた［７４、７９〜８４］。
ＭＲｘ０００４細胞の表面に存在するタンパク質の同定を、酵素による細胞切り取りの手法を使用して実施した。細菌細胞をトリプシンを使用して切り取り、切断した表面結合タンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して同定した（切り取られたタンパク質の画分）。トリプシンを含まない対照からのタンパク質も回収してＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析することにより、表面に緩く結合したタンパク質（シェディングされたタンパク質の画分）の同定が可能であった。合計１０６個の切り取られたタンパク質を同定し、そのうち４４個は細胞壁に固定されていると予測された（すなわち、切り取られたタンパク質の画分に存在し、シェディングされたタンパク質の画分には存在しない）（表９、図１５）。ＭＲｘ０００４ＳＮで観察されたように、同定された最も豊富な切り取られたタンパク質はプルラナーゼ（１３６．６７±１７．４７）であり、これはシェディングされたタンパク質の画分中にも検出された（７９±１０．５４）。興味深いことに、Ｉ型ポリケチドシンターゼもまた、細胞の切り取られた画分の両方において同定されたが、切り取られたタンパク質の画分において、シェディングされたタンパク質の画分よりも多くのマッチするペプチドが同定された（それぞれ５４．６７±１０．６９及び１１．６７±６．４３）。ＭＲｘ０００４ＳＮに存在する、上記のすべてのムーンライティングタンパク質もまた、ＭＲｘ０００４細胞の切り取られた画分中に検出された（表９）。さらに、ＥｆＴｕは、切り取られたタンパク質の画分及びシェディングされたタンパク質の画分の両方において同定された（それぞれ、ＰＳＭ＝３２±５及び２４．３３±８．３９）。ｑＰＣＲによって分析された５つの遺伝子（ｅｆｔＵ、エノラーゼ、ｌｕｘＳ、プルラナーゼ及びトランスアルドラーゼ）もまた、細胞から切り取られたもののデータセット及び上清のデータセットの一方または両方で検出され、これにより、これらの遺伝子の翻訳が確認された。転写データセット及びプロテオミクスデータセットからのデータによって、ＭＲｘ０００４中の目的とする潜在的な新規エフェクターを一括して同定することが可能であった。
興味深いことに、細胞から切り取られたもののデータセット中で最も豊富なタンパク質であるアミロース分解性酵素プルラナーゼは、インビトロにおいてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの糖タンパク質及び宿主細胞に対する接着に関与することが報告されている、ムーンライティングタンパク質である［８５、８６］。さらに、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓに由来するＤｎａＫ及びエノラーゼ［８２、８３］及びＢ．ｌｏｎｇｕｍに由来するＥｆＴｕ［８７］は、インビトロでプラスミノーゲンに接着することが報告されている。加えて、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおけるＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ Ａ８の解糖系酵素トランスアルドラーゼの組換え発現は、この菌株のムチンへの接着を増加させた［８４］。ＭＲｘ０００４によるこれらのムーンライティングタンパク質の生成は、それらがＭＲｘ０００４の接着能力における役割を果たし、それにより宿主細胞表面との相互作用を促進し得ることを示唆する。特定の宿主細胞受容体及びシグナル伝達経路に対する、ビフィズス菌のムーンライティングタンパク質の影響は依然として説明されておらず、これは、ＭＲｘ０００４が宿主と相互作用する、ＭＲｘ０００４の新規の調節経路を表している可能性がある。
ＭＲｘ０００４による自然免疫応答の調節の特徴の調査
ＭＲｘ０００４に対する宿主反応の特性を明らかにするために、さらなる実験を実施した。
ＭＲｘ０００４に対する宿主反応の特性を明らかにするために、さらなる実験を実施した。
この試験を補助するため、挿入変異導入を通じてＥＰＳ遺伝子座のｐＧＴＦ遺伝子が不活化されている菌株（ＥＰＳｎｅｇ）を構築した（図１６Ａ）。この菌株を、［８８］に記載されている方法論を用いて構築したが、ＩＩ型制限修飾（ＲＭ）系を操作するのではなく、ＭＲｘ０００４のＩ型ＲＭ系に由来するメチラーゼ及び特異性サブユニットを発現させ、形質転換前にプラスミドＤＮＡをメチル化するために使用した。補完されたＥＰＳｎｅｇ菌株（ＥＰＳｃｏｍｐ）及びＥＰＳｎｅｇ空ベクター菌株（ＥＰＳｖｅｃ）もまた、対照として作製した。
ＴＬＲ２及びＮＦκＢ活性化に対するＥＰＳの影響を、ＨＥＫ−ＴＬＲ２レポーター細胞及びＴＨＰ−１−ＮＦκＢレポーター細胞の、ＭＲｘ０００４、ＥＰＳｎｅｇ、ＥＰＳｖｅｃ及びＥＰＳｃｏｍｐの生菌処理物及び上清処理物との共インキュベーションにより評価した。すべての生菌処理物は、同等の程度までＴＬＲ２を活性化した（図１２Ａ）。対照的に、ＭＲｘ０００４ＬＶによるＮＦκＢの活性化は、ＥＰＳｎｅｇ ＬＶ（ｐ＝０．００３）及びＥＰＳｖｅｃ ＬＶ（ｐ＝０．００９）による活性化よりも有意に低かったが、ＥＰＳｃｏｍｐ ＬＶより有意に低くはなかった（図１２Ｂ）。ＭＲｘ０００４ＳＮとＥＰＳｃｏｍｐ ＳＮとの間で、ＴＬＲ２及びＮＦκＢ活性化に差は存在せず、この例において、野生型及び補完物は同様の表現型を示したことが実証された。ＥＰＳｎｅｇ ＳＮ及びＥＰＳｖｅｃ ＳＮは、ＭＲｘ０００４ＳＮよりもＴＬＲ２（両方についてｐ＜０．０００１）及びＮＦκＢ（それぞれｐ＝０．００２及び０．００１３）に対する刺激性が有意に高かった。これらのデータは、ＭＲｘ０００４によるＴＬＲ２の活性化が、そのＥＰＳによって直接媒介されていないことを示唆している。対照的に、ＮＦκＢの活性化は、ＥＰＳの非存在下におけるＭＲｘ０００４の細胞表面の露出に応答して増大する。これらのデータは、ＭＲｘ０００４による効果的な免疫調節は、インタクトな細胞全体を使用して最も良好に実現されること、及びＴＬＲ２に対するＭＲｘ０００４リガンドは主に細胞表面に結合しているが、シェディングまたは分泌される可能性もあることを示唆している。
ＭＲｘ０００４及びその派生菌株がＩＥＣ炎症のインビトロモデルに与える影響も調査した。ＨＴ２９−ＭＴＸ細胞をＭＲｘ０００４及びその派生体で３時間プライミングした後、ウェルに炎症性刺激物質としてＴＮＦαをさらに２４時間添加した。このモデルを使用すると、ＭＲｘ０００４は、細菌を含まない対照と比較して、ＴＮＦαによって媒介されるＩＬ−８の分泌を減少させなかった（図１２Ｃ）。しかしながら、非ＴＮＦα刺激細胞におけるＩＬ−８の分泌は、ベースライン対照と比較して、ＭＲｘ０００４処理物によって減少した。ＥＰＳｎｅｇ処理物は、ＴＮＦαによって誘導されるＩＬ−８の分泌を、ＭＲｘ０００４と比較して有意に減少させた（ｐ＜０．０００１）。ＥＰＳｖｅｃ及びＥＰＳｃｏｍｐで処理した細胞におけるＩＬ−８の分泌も、ＭＲｘ０００４に対する応答よりも有意に低かった（両方の比較についてｐ＜０．０００１）。興味深いことに、レポーターアッセイにおけるＥＰＳｎｅｇにより示された効果と対照的に、表面結合抗原の非保護は、ＩＥＣに対して抗炎症性効果を有すると思われた。
適応免疫応答に対するＭＲｘ０００４の影響
適応免疫系に対するＭＲｘ０００４の影響を調査するために、健康ヒトドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、細胞集団及びサイトカイン分泌プロファイルを特性評価した。このアッセイでは、ＰＨＡを陽性対照として使用した（データは示さず）。ＭＲｘ０００４及びその派生菌株に由来する熱不活化細菌細胞及び無細胞培養上清と、ＰＢＭＣを７２時間共インキュベートした。Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−）及びＢ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９＋）の表面マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって（活性化マーカーＣＤ２５とともに）分析した（ゲーティング戦略については図１８を参照されたい）。７２時間のインキュベーション期間中に生菌が増殖し、栄養素を求めてヒト細胞を排除する可能性があることから、生菌ではなく熱不活化細菌をこのモデルにおける処理物として使用した。試験したすべての菌株からの細菌上清に応答した細胞表面マーカー及びサイトカインの両方の発現は、ビヒクル（ＹＣＦＡ）に応答して観察されたものと比較して大幅に異なってはいなかった（データは示さず）。ＥＰＳｖｅｃ及びＥＰＳｃｏｍｐのデータを、図２０及び図２１に示す。
適応免疫系に対するＭＲｘ０００４の影響を調査するために、健康ヒトドナーに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用して、細胞集団及びサイトカイン分泌プロファイルを特性評価した。このアッセイでは、ＰＨＡを陽性対照として使用した（データは示さず）。ＭＲｘ０００４及びその派生菌株に由来する熱不活化細菌細胞及び無細胞培養上清と、ＰＢＭＣを７２時間共インキュベートした。Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋）、Ｔｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−）及びＢ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９＋）の表面マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって（活性化マーカーＣＤ２５とともに）分析した（ゲーティング戦略については図１８を参照されたい）。７２時間のインキュベーション期間中に生菌が増殖し、栄養素を求めてヒト細胞を排除する可能性があることから、生菌ではなく熱不活化細菌をこのモデルにおける処理物として使用した。試験したすべての菌株からの細菌上清に応答した細胞表面マーカー及びサイトカインの両方の発現は、ビヒクル（ＹＣＦＡ）に応答して観察されたものと比較して大幅に異なってはいなかった（データは示さず）。ＥＰＳｖｅｃ及びＥＰＳｃｏｍｐのデータを、図２０及び図２１に示す。
ＭＲｘ０００４ＨＫ処理物は、未処理対照と比較して、活性化ＣＤ８＋ＣＤ２５＋サブセットを有意に増大させた（ｐ＝０．００３８、図１３Ａ）が、一方で、ＥＰＳｎｅｇ ＨＫは、対照と比較して、活性化ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを有意に増大させなかった。ＭＲｘ０００４ＨＫ及びＥＰＳｎｅｇ ＨＫのいずれも、対照と比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団またはＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団のパーセンテージを有意に増大させなかった（図１９Ａ及び図１９Ｂ、図１３Ｂ）。Ｂ細胞集団は、未処理細胞と比較して、ＭＲｘ０００４ＨＫ及びＥＰＳｎｅｇ ＨＫの両方で類似した、統計学的に有意な程度まで増大した（それぞれＰ＝０．００１及び０．００１３、図１３Ｅ）。Ｂ細胞の活性化（ＣＤ１９＋ＣＤ２５＋）は、適用した処理物のいずれによっても有意な影響を受けなかった（図１９Ｃ）。ＣＤ４＋細胞集団内において、Ｔｒｅｇ細胞の割合をＣＤ２５＋ＣＤ１２７−表面マーカーを使用して分析した。未処理細胞と比較した場合、ＥＰＳｎｅｇ ＨＫで処理したＰＢＭＣではＴｒｅｇの相対パーセンテージの増大が観察されたが、ＭＲｘ０００４ＨＫ ＰＢＭＣでは観察されなかった（ｐ＝０．００１４、図１３Ｃ）。ＥＰＳｎｅｇ ＨＫは、ＭＲｘ０００４ＨＫと比較してＴｒｅｇを増大させた（ｐ＝０．０１９６）。ＭＲｘ０００４ＨＫ処理物において、未処理細胞と比較して制御性Ｔ細胞応答に対するＴｒｅｇ／ＣＤ８＋の比に歪み（ｓｋｅｗ）が観察された（ｐ＝０．０００８、図１３Ｄ）。さらに、ＭＲｘ０００４ＨＫに応答したＣＤ８＋の正の歪みの増大は、ＥＰＳｎｅｇ ＨＫに対するものよりも有意に強かった（ｐ＝０．０２７２、図１３Ｄ）。総合すると、これらのデータにより、ＭＲｘ０００４の免疫刺激効果が確認され、ＥＰＳの喪失がＴｒｅｇの刺激及びＴｒｅｇ／ＣＤ８＋比の増大、及び免疫刺激効果の低下をもたらし得ることが示唆される。ＥＰＳはＣＤ８＋細胞の活性化に役割を果たす可能性があるが、Ｂ細胞集団の大幅な調節には関与していないように思われる。
ＭＲｘ０００４ＨＫ及びＥＰＳｎｅｇ ＨＫで処理したＰＢＭＣの分泌されたサイトカインの特性もまた、主にＴｈ１（ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）、Ｔｈ２（ＩＬ−４）、Ｔｈ１７（ＩＬ−１７α、ＩＬ−１β）及びＴｒｅｇ（ＩＬ−１０）集団に関連するサイトカインを定量化することにより決定した。ＴＮＦα、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−４及びＩＬ−１７αは、未処理細胞と比較して、ＭＲｘ０００４ＨＫ処理によって有意に増大した（それぞれｐ＝０．００３８、０．００２５、０．００３６、０．０２７及び０．０３１６、図１４Ａ〜図１４Ｄ）。ＥＰＳｎｅｇ ＨＫによる処理は、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０及びＩＬ−１７αにおける有意な応答を誘導した（それぞれｐ＝０．０００１、０．０２６７、＜０．０００１、０．０００４及び０．０１０３、図１４Ａ、図１４Ｃ、図１４Ｅ〜図１４Ｇ）。ＭＲｘ０００４ＨＫとは対照的に、ＥＰＳｎｅｇ ＨＫは、未処理の細胞と比較して、ＩＬ−１２ｐ７０またはＩＬ−４の分泌を有意に増大させなかった。ＭＲｘ０００４ＨＫはまた、ＥＰＳｎｅｇ ＨＫと比較してＩＬ−１２ｐ７０を有意に増大させた（ｐ＝０．０１１８、図１４Ｂ）が、逆に、ＥＰＳｎｅｇ ＨＫ処理物は、ＭＲｘ０００４ＨＫよりも高濃度のＩＬ−１β及びＩＬ−１０を生成することが判明した（それぞれｐ＝０．０００８及び０．０１４、図１４Ｅ〜図１４Ｆ）。
細菌処理物が特定のサブタイプに対してヘルパーＴ細胞応答を歪めるかどうかを推測するために、個々のヘルパーＴ細胞サブタイプによって生成されるサイトカイン（Ｔｈ１またはＴｈ２；ＩＬ−１２ｐ７０／ＩＬ−４、Ｔｒｅｇ；ＩＬ−１０／ＩＬ１ｐ７０、Ｔｈ１７；ＩＬ−１β／ＩＬ１２ｐ７０、図１４Ｈ〜図１４Ｊ）を指標に使用して、サイトカイン比を分析した。ＭＲｘ０００４ＨＫ処理物は、未処理細胞と比較してＴｈ１表現型に対する免疫応答を有意に歪めるように思われた（ｐ＝０．０１７２、図１４Ｈ）が、一方で、ＥＰＳｎｅｇ ＨＫ処理物は、未処理細胞と比較してＴｒｅｇ及びＴｈ１７応答の両方に対して歪みを誘発するように思われた（ｐ＝０．０３１２及び０．０００５、図１４Ｉ〜図１４Ｊ）。ＥＰＳｎｅｇ ＨＫのＴｒｅｇ及びＴｈ１７の歪みもまた、ＭＲｘ０００４ＨＫと比較して有意に増大した（ｐ＝０．０４２３及び０．０００８、図１４Ｊ）。ＭＲｘ０００４ＨＫ処理物及びＥＰＳｎｅｇ ＨＫ処理物の間に、異なるサブセットのＴ細胞応答を促進する能力における明確な差異が観察された。
総合すると、この試験の観察結果は、ＭＲｘ０００４が自然免疫応答及び獲得免疫応答の炎症誘発性アームを調節していることを示している。したがって、ＭＲｘ０００４及び他のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株は、免疫系を刺激し、免疫活性の低減に関連する疾患を処置するのに有用であり得る。
実施例２−ＭＲｘ０００４のｅｐｓ遺伝子座が効力に及ぼす影響の特性評価
要旨
この試験の目的は、ＭＲｘ０００４の免疫刺激及び治療特性におけるＭＲｘ０００４菌体外多糖（ＥＰＳ）の役割を明らかにすることであった。
要旨
この試験の目的は、ＭＲｘ０００４の免疫刺激及び治療特性におけるＭＲｘ０００４菌体外多糖（ＥＰＳ）の役割を明らかにすることであった。
材料及び方法
実験を、以下に記載する追加の手順を含めて、実施例１に記載の通りに実施した。
実験を、以下に記載する追加の手順を含めて、実施例１に記載の通りに実施した。
不死化細胞の通常培養
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、４．５ｍｇ／ｍｌのグルコース、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、３０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（ｂｌａｓｔｏｃｙｄｉｎ）及び１００μｇ／ｍｌのゼオシンを補充したＤＭＥＭ中で、密度９０％まで増殖させた。ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦ−κＢ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを補充したＲＰＭＩ １６４０（ｃＲＰＭＩ）中で増殖させた。細胞株を、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。特に明記されていない限り、すべての試薬はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから供給された。
ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）−ｈＴＬＲ２細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、４．５ｍｇ／ｍｌのグルコース、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）、３０μｇ／ｍｌのブラストサイジン（ｂｌａｓｔｏｃｙｄｉｎ）及び１００μｇ／ｍｌのゼオシンを補充したＤＭＥＭ中で、密度９０％まで増殖させた。ＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）ＮＦ−κＢ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を、１０％（ｖ／ｖ）の熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００μｇ／ｍｌのＮｏｒｍｏｃｉｎ（商標）、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンを補充したＲＰＭＩ １６４０（ｃＲＰＭＩ）中で増殖させた。細胞株を、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。特に明記されていない限り、すべての試薬はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから供給された。
ＭＲｘ０００４のＥＰＳ遺伝子座とＢ．ｂｒｅｖｅの近縁菌株との比較分析
ＧｅｎＢａｎｋデータベースで利用可能なＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株のゲノムを、ＥＰＳクラスターのインシリコ分析及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に由来する推定上の菌体外多糖の遺伝子クラスターの物理的地図のために使用した。
ＧｅｎＢａｎｋデータベースで利用可能なＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株のゲノムを、ＥＰＳクラスターのインシリコ分析及びＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株に由来する推定上の菌体外多糖の遺伝子クラスターの物理的地図のために使用した。
ＭＲｘ０００４のＥＰＳ遺伝子座に関する差次的発現の分析
わずかな変更を加えた製造業者のプロトコールに従って、ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡをＭＲｘ０００４菌株の後期対数期培養物から抽出した。機械的細胞溶解を、Ｌｙｓｉｎｇ ＭａｔｒｉｘＢ及びＭＰ Ｆａｓｔ−Ｐｒｅｐ−２４組織及び細胞ホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、振動を６ｍ／ｓに設定して実施した。細胞を、２０秒間のサイクル２回で破壊し、サイクルの合間には氷上で１分間静置させた。ＲＮＡの品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ Ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で確認した。ＲＮＡの分解がないことを確認し、すべての試料の最小ＲＮＡ完全性数（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）は９以上であった。ＭＩＣＲＯＢＥｘｐｒｅｓｓキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｒＲＮＡ種を除去した。１６Ｓ ｒＲＮＡ種及び２３Ｓ ｒＲＮＡ種が存在しないことを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ＲＮＡ Ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで評価し、確認した。ｒＲＮＡを除去したＲＮＡ試料を、ストランド特異的ライブラリー調製のためにＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈに送り、イルミナシーケンシングで配列決定し１５０ｂｐのシングルエンドリードを生成した。ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー当たり、平均２２，３８７８，０８（後期対数期試料）及び１８６２７１７８．６（定常期試料）の生の読み取りデータを、それぞれ合計１０．０７Ｇｂｐ超及び８．３８Ｇｂｐ超得た。生の読み取りデータをＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（１）を使用してトリミングし、Ｂｏｗｔｉｅ（２）を使用して、ＭＲｘ０００４ゲノムに対して性質をフィルタリングした（９８．３６％の後期対数期試料及び９８．２６％の定常期試料の読み取りデータがＱＣを通過し、マッピングしたクリーンな読み取りデータの９９．１１％（ＬＬ）及び９８．７２％（ＳＰ）に整列した）。各増殖期の反復試験試料の発現レベルを、ＸＸ及びＤｅＳｅｑ２ ｖ Ｘ（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ，２０１４）を使用してＭＲｘ０００４のＥＰＳ遺伝子座の各遺伝子について算出し、続いてＧｅｎｅｉｏｕｓ Ｒ１１（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ，Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して可視化した。２つの増殖期の間の差次的発現が表される。２つの試料間の正規化された値の比の、底を２とする対数であり、一方の試料の発現がないかまたは非常に低い場合、ｌｏｇ２の比は＋／−１，０００，０００が上限となる。
わずかな変更を加えた製造業者のプロトコールに従って、ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡをＭＲｘ０００４菌株の後期対数期培養物から抽出した。機械的細胞溶解を、Ｌｙｓｉｎｇ ＭａｔｒｉｘＢ及びＭＰ Ｆａｓｔ−Ｐｒｅｐ−２４組織及び細胞ホモジナイザー（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、振動を６ｍ／ｓに設定して実施した。細胞を、２０秒間のサイクル２回で破壊し、サイクルの合間には氷上で１分間静置させた。ＲＮＡの品質を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ Ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で確認した。ＲＮＡの分解がないことを確認し、すべての試料の最小ＲＮＡ完全性数（ＲＮＡ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ｎｕｍｂｅｒ）は９以上であった。ＭＩＣＲＯＢＥｘｐｒｅｓｓキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してｒＲＮＡ種を除去した。１６Ｓ ｒＲＮＡ種及び２３Ｓ ｒＲＮＡ種が存在しないことを、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ＲＮＡ Ｓｃｒｅｅｎｔａｐｅ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで評価し、確認した。ｒＲＮＡを除去したＲＮＡ試料を、ストランド特異的ライブラリー調製のためにＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈに送り、イルミナシーケンシングで配列決定し１５０ｂｐのシングルエンドリードを生成した。ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー当たり、平均２２，３８７８，０８（後期対数期試料）及び１８６２７１７８．６（定常期試料）の生の読み取りデータを、それぞれ合計１０．０７Ｇｂｐ超及び８．３８Ｇｂｐ超得た。生の読み取りデータをＴｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（１）を使用してトリミングし、Ｂｏｗｔｉｅ（２）を使用して、ＭＲｘ０００４ゲノムに対して性質をフィルタリングした（９８．３６％の後期対数期試料及び９８．２６％の定常期試料の読み取りデータがＱＣを通過し、マッピングしたクリーンな読み取りデータの９９．１１％（ＬＬ）及び９８．７２％（ＳＰ）に整列した）。各増殖期の反復試験試料の発現レベルを、ＸＸ及びＤｅＳｅｑ２ ｖ Ｘ（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ，２０１４）を使用してＭＲｘ０００４のＥＰＳ遺伝子座の各遺伝子について算出し、続いてＧｅｎｅｉｏｕｓ Ｒ１１（Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ，Ａｕｃｋｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ）を使用して可視化した。２つの増殖期の間の差次的発現が表される。２つの試料間の正規化された値の比の、底を２とする対数であり、一方の試料の発現がないかまたは非常に低い場合、ｌｏｇ２の比は＋／−１，０００，０００が上限となる。
透過型電子顕微鏡検査（ＴＥＭ）
細菌を固定液（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の０．５Ｍスクロース、２％パラホルムアルデヒド及び０．１６％グルタルアルデヒド）で１：５に希釈し、室温で２時間固定した。その後、フォルムバールカーボンでコーティングされた銅グリッドを、Ｂ．ｂｒｅｖｅ懸濁液の１００μｌの液滴に１時間浮遊させ、ＰＢＳ中の０．０２Ｍのグリシンで３回洗浄した。細胞を１．０％のモリブデン酸アンモニウムで陰性に染色した。ＪＥＭ−１４００透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、グリッドを検査し、顕微鏡写真を可視化した。
細菌を固定液（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の０．５Ｍスクロース、２％パラホルムアルデヒド及び０．１６％グルタルアルデヒド）で１：５に希釈し、室温で２時間固定した。その後、フォルムバールカーボンでコーティングされた銅グリッドを、Ｂ．ｂｒｅｖｅ懸濁液の１００μｌの液滴に１時間浮遊させ、ＰＢＳ中の０．０２Ｍのグリシンで３回洗浄した。細胞を１．０％のモリブデン酸アンモニウムで陰性に染色した。ＪＥＭ−１４００透過型電子顕微鏡（ＪＥＯＬ Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、グリッドを検査し、顕微鏡写真を可視化した。
細菌接着アッセイ
生菌（前述の通りに調製し共培養培地に再懸濁させたもの）を、２４ウェルプレート中で１００：１のＭＯＩでＨＴ２９−ＭＴＸ細胞にアプライし、３７℃、嫌気性条件で３時間共インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄して未結合の細菌を除去し、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解させた。溶解物を播種し、回収したコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を使用して、接着のパーセンテージを決定した。
生菌（前述の通りに調製し共培養培地に再懸濁させたもの）を、２４ウェルプレート中で１００：１のＭＯＩでＨＴ２９−ＭＴＸ細胞にアプライし、３７℃、嫌気性条件で３時間共インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄して未結合の細菌を除去し、０．１％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で溶解させた。溶解物を播種し、回収したコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を使用して、接着のパーセンテージを決定した。
結果
ＭＲｘ０００４のｅｐｓ遺伝子座は、Ｂ．ｂｒｅｖｅの他の菌株とは遺伝的に異なり、後期対数増殖の際に高度に発現する。
菌株ＭＲｘ０００４のゲノム配列決定によって、菌株ＭＲｘ０００４が、２７個の遺伝子をコードすることが判明した２８ＫｂのＥＰＳ遺伝子座を保有することが示され、これは、Ｂ．ｂｒｅｖｅにおけるＥＰＳの生合成に必要であると予想される機能の完全な補完を表している。この領域には、プライミンググリコシルトランスフェラーゼ、４つの追加のグリコシルトランスフェラーゼ、膜貫通タンパク質の下流にコードされるチアミンピロリン酸結合タンパク質、フリッパーゼ及び鎖長決定因子が含まれる（図９）。Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＥＰＳ遺伝子座の大部分（菌株ＭＲｘ０００４のものを含む）は、仮想タンパク質に隣接しており（ＭＲｘ０００４領域を３１．５Ｋｂに拡張している）、これは、図９に表すＢ．ｂｒｅｖｅのＥＰＳ遺伝子座の表示からは除外されている。図９に示す大部分（１６／１９）の菌株は乳児単離株であり、それらのゲノムは公共データベースにおいて大きな比率を占めている。５０Ｋｂを超えるＢ．ｂｒｅｖｅのＥＰＳ領域は、ＥＰＳ陽性の表現型を生成するために必要なすべての機能をコードする完全な遺伝子座を表すと考えられている［８９］。対照的に、これらの領域が３０Ｋｂ未満の場合、これらは不完全なまたは残余の遺伝子座を表すと考えられる［８９］。
ＭＲｘ０００４のｅｐｓ遺伝子座は、Ｂ．ｂｒｅｖｅの他の菌株とは遺伝的に異なり、後期対数増殖の際に高度に発現する。
菌株ＭＲｘ０００４のゲノム配列決定によって、菌株ＭＲｘ０００４が、２７個の遺伝子をコードすることが判明した２８ＫｂのＥＰＳ遺伝子座を保有することが示され、これは、Ｂ．ｂｒｅｖｅにおけるＥＰＳの生合成に必要であると予想される機能の完全な補完を表している。この領域には、プライミンググリコシルトランスフェラーゼ、４つの追加のグリコシルトランスフェラーゼ、膜貫通タンパク質の下流にコードされるチアミンピロリン酸結合タンパク質、フリッパーゼ及び鎖長決定因子が含まれる（図９）。Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＥＰＳ遺伝子座の大部分（菌株ＭＲｘ０００４のものを含む）は、仮想タンパク質に隣接しており（ＭＲｘ０００４領域を３１．５Ｋｂに拡張している）、これは、図９に表すＢ．ｂｒｅｖｅのＥＰＳ遺伝子座の表示からは除外されている。図９に示す大部分（１６／１９）の菌株は乳児単離株であり、それらのゲノムは公共データベースにおいて大きな比率を占めている。５０Ｋｂを超えるＢ．ｂｒｅｖｅのＥＰＳ領域は、ＥＰＳ陽性の表現型を生成するために必要なすべての機能をコードする完全な遺伝子座を表すと考えられている［８９］。対照的に、これらの領域が３０Ｋｂ未満の場合、これらは不完全なまたは残余の遺伝子座を表すと考えられる［８９］。
比較分析により、菌株ＭＲｘ０００４とＢ．ｂｒｅｖｅの他の菌株のゲノムとの間の、遺伝的相違の主要領域としてのＥＰＳ遺伝子座が同定された（データは示さず）。ＭＲｘ０００４のＥＰＳ遺伝子座を、公的に利用可能なＢ．ｂｒｅｖｅゲノムの遺伝子座と比較した。ＥＰＳ遺伝子座が、菌株ＭＲｘ０００４の遺伝子座と高レベルの配列同一性（ＩＤ）及び遺伝子シンテニーを示したＢ．ｂｒｅｖｅの菌株を図９に示し、菌株ＭＲｘ０００４との類似性の順に従って並べた（オペロンの長さ全体にわたる平均％ ｎｔ ＩＤ）。（母乳で育てられた）乳児の単離株であるＢ．ｂｒｅｖｅ ＮＲＢＢ５１は、２つの遺伝子座の全長にわたって、菌株ＭＲｘ０００４と最も高いレベルのヌクレオチド同一性（ＩＤ）（９１．５％）を共有した。両方の菌株において推定トランスポザーゼをコードする中央の１．３Ｋｂの領域は、菌株ＭＲｘ０００４とＮＲＢＢ５１の間における多様性の主要な領域を表す。ＭＲｘ０００４遺伝子座の開始及び終了にコードされた遺伝子は、他のＢ．ｂｒｅｖｅ単離株との最も高いレベルの配列保存性を示した（図９）。ＥＰＳの生合成の主要なステップに不可欠であるＭＲｘ０００４のｐＧＴＦは、比較菌株のホモログと９２．２％のペアワイズＩＤ（ａａ）を共有していた。鎖長制御因子、ならびに仮想タンパク質及び膜貫通タンパク質をコードする遺伝子を包含する４Ｋｂの領域は、試験した菌株間で９８．３％のｎｔ ＩＤを共有する。仮想タンパク質及びトランスポザーゼをコードする遺伝子は、菌株ＭＲｘ０００４と最も近縁である１０個のＥＰＳ遺伝子座との間の配列多様性の主要な領域を占めていた（図９）。対照的に、菌株ＭＲｘ０００４のＥＰＳ遺伝子座とより異なっていることが判明したＢ．ｂｒｅｖｅのＥＰＳ遺伝子座（図９の下位９菌株）は、ｇｔｆ遺伝子、ポリメラーゼ遺伝子及びアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む、ＥＰＳの生成に最も重要な遺伝子の数及び順番に相違を示した（図９）。
ＭＲｘ０００４のＥＰＳ遺伝子座が、後期対数期増殖中または定常期増殖中のいずれでより高度に転写されるかを確認するために、ＹＣＦＡ中で増殖させた菌株ＭＲｘ０００４の単培養物上で差次的発現分析を実施した（図９Ｂ）。ＭＲｘ０００４のＥＰＳ合成を主に担うと予測される遺伝子（前述）の大部分は、後期対数期増殖中に上方制御された。ＭＲｘ０００４のＥＰＳ遺伝子座は、１０個の仮想タンパク質及び５つのトランスポザーゼをコードしており、これらは、ＭＲｘ０００４の定常期増殖中に上方制御された遺伝子の唯一のカテゴリを表す（図９）。ＭＲｘ０００４のＥＰＳの合成における仮想タンパク質の役割は、依然として不明である。
ＭＲｘ０００４のＥＰＳ陰性菌株の作製
ＭＲＸ００４ ＥＰＳの宿主−微生物相互作用及び免疫調節における役割を調査し、上記の通り、挿入変異導入を通じてＥＰＳ遺伝子座のｐＧＴＦ遺伝子が不活化されている菌株（ＥＰＳｎｅｇ）を構築した（図１６Ａ）。この菌株を、［８８］に記載されている方法論を用いて構築したが、ＩＩ型制限修飾（ＲＭ）系を操作するのではなく、ＭＲｘ０００４のＩ型ＲＭ系に由来するメチラーゼ及び特異性サブユニットを発現させ、形質転換前にプラスミドＤＮＡをメチル化するために使用した。補完されたＥＰＳｎｅｇ菌株（ＥＰＳｃｏｍｐ）及びＥＰＳｎｅｇ空ベクター菌株（ＥＰＳｖｅｃ）もまた、対照として作製した。ＥＰＳｎｅｇ及びＥＰＳｖｅｃは、ＭＲｘ０００４と比較して、自己凝集性の表現型の増加を示した（図１６Ｂ）。ＥＰＳｃｏｍｐは、ＥＰＳｎｅｇ及びＥＰＳｖｅｃよりも凝集性が低かったが、その自己凝集はＭＲｘ０００４と比較して増加しているように思われ、このことは、この菌株が野生型ＥＰＳの表現型に完全に復帰していないことを示唆する。
ＭＲＸ００４ ＥＰＳの宿主−微生物相互作用及び免疫調節における役割を調査し、上記の通り、挿入変異導入を通じてＥＰＳ遺伝子座のｐＧＴＦ遺伝子が不活化されている菌株（ＥＰＳｎｅｇ）を構築した（図１６Ａ）。この菌株を、［８８］に記載されている方法論を用いて構築したが、ＩＩ型制限修飾（ＲＭ）系を操作するのではなく、ＭＲｘ０００４のＩ型ＲＭ系に由来するメチラーゼ及び特異性サブユニットを発現させ、形質転換前にプラスミドＤＮＡをメチル化するために使用した。補完されたＥＰＳｎｅｇ菌株（ＥＰＳｃｏｍｐ）及びＥＰＳｎｅｇ空ベクター菌株（ＥＰＳｖｅｃ）もまた、対照として作製した。ＥＰＳｎｅｇ及びＥＰＳｖｅｃは、ＭＲｘ０００４と比較して、自己凝集性の表現型の増加を示した（図１６Ｂ）。ＥＰＳｃｏｍｐは、ＥＰＳｎｅｇ及びＥＰＳｖｅｃよりも凝集性が低かったが、その自己凝集はＭＲｘ０００４と比較して増加しているように思われ、このことは、この菌株が野生型ＥＰＳの表現型に完全に復帰していないことを示唆する。
ＭＲｘ０００４及びＥＰＳｎｅｇのＥＰＳの表現型を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用して調査した。ＭＲｘ０００４と比較したＥＰＳｎｅｇ菌株におけるＥＰＳの欠如を、図１０Ａ及び図１０Ｂに示す。野生型ＭＲｘ０００４及びその派生菌株の接着能力を、インビトロＩＥＣモデルを使用して分析した。ＥＰＳｎｅｇは、ＭＲｘ０００４よりもＩＥＣに対する接着性が２倍超高く（それぞれ、４７．５％対１８．７％の接着性、ｐ＝０．００６）（図１０Ｃ）、ＥＰＳの欠如がＥＰＳｎｅｇの接着能力を向上させたことが示唆される。ＥＰＳｎｅｇで見られる接着表現型の増加は、ＥＰＳｖｅｃでも維持された（４０．１％の接着性、ＭＲｘ０００４に対してｐ＝０．０３）が、ＥＰＳｃｏｍｐの接着性（３４．１％）は、他のいずれの菌株と比較した場合に有意に異なってはおらず、これは、ＥＰＳｃｏｍｐの野生型表現型への復帰が不完全であったことをさらに意味している。
ＭＲｘ０００４におけるＥＰＳの除去により、宿主刺激に関与する表面タンパク質が露出する。
ＥＰＳｎｅｇのＩＥＣに対する接着性の向上は、ＥＰＳの除去が、表面結合タンパク質の露出の増加、または「非保護」をもたらし得ることを示唆する。ＭＲｘ０００４及びＥＰＳｎｅｇの表面結合タンパク質の組成物を、ＩＥＣと接触させた後に分析した。ＨＴ２９−ＭＴＸ細胞と３時間接触させた後、前述のように細菌細胞をトリプシンで切り取り、得られた切り取られたタンパク質の画分及びシェディングされたタンパク質の画分をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ＩＥＣとの接触後のＭＲｘ０００４細胞の切り取りにより、５５個の切り取られたタンパク質（そのうち３４個は表面に固定されていると予測された）及び２４個のシェディングされたタンパク質を得た（図１１Ａ）。ＩＥＣへの接触後のＥＰＳｎｅｇ細胞から切り取られたものには、ＭＲｘ０００４のものよりもはるかに多くのタンパク質が含まれており、切り取られたタンパク質の画分中に１０１個のタンパク質、シェディングされたタンパク質の画分中に４５個のタンパク質であった（図１１Ｂ）。ＭＲｘ０００４のシェディングされたタンパク質の画分中で同定された３つのタンパク質（炭水化物、脂質、及びタンパク質の代謝に関与する酵素）を除いて、同定されたすべてのタンパク質は、両方の菌株の切り取られたタンパク質の画分中に存在していた。
ＥＰＳｎｅｇのＩＥＣに対する接着性の向上は、ＥＰＳの除去が、表面結合タンパク質の露出の増加、または「非保護」をもたらし得ることを示唆する。ＭＲｘ０００４及びＥＰＳｎｅｇの表面結合タンパク質の組成物を、ＩＥＣと接触させた後に分析した。ＨＴ２９−ＭＴＸ細胞と３時間接触させた後、前述のように細菌細胞をトリプシンで切り取り、得られた切り取られたタンパク質の画分及びシェディングされたタンパク質の画分をＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ＩＥＣとの接触後のＭＲｘ０００４細胞の切り取りにより、５５個の切り取られたタンパク質（そのうち３４個は表面に固定されていると予測された）及び２４個のシェディングされたタンパク質を得た（図１１Ａ）。ＩＥＣへの接触後のＥＰＳｎｅｇ細胞から切り取られたものには、ＭＲｘ０００４のものよりもはるかに多くのタンパク質が含まれており、切り取られたタンパク質の画分中に１０１個のタンパク質、シェディングされたタンパク質の画分中に４５個のタンパク質であった（図１１Ｂ）。ＭＲｘ０００４のシェディングされたタンパク質の画分中で同定された３つのタンパク質（炭水化物、脂質、及びタンパク質の代謝に関与する酵素）を除いて、同定されたすべてのタンパク質は、両方の菌株の切り取られたタンパク質の画分中に存在していた。
ＭＲｘ０００４とＥＰＳｎｅｇの切り取られたタンパク質の画分の比較により、両方の試料に存在していた５４個のタンパク質及びＥＰＳｎｅｇ菌株に特異的であった４７個のタンパク質を同定した（図１１Ｃ）。ＭＲｘ０００４の切り取られたタンパク質のデータセット中でのみ同定された唯一のタンパク質は、ＮｌｐＣ／Ｐ６０ファミリータンパク質であった。細胞の切り取りによって回収されたタンパク質の数は、ＭＲｘ０００４よりもＥＰＳｎｅｇ菌株の方が多く、ＥＰＳの除去により、トリプシン切断のために表面タンパク質へより接近しやすくなったことが推測された。さらに、ビフィズス菌及び他の属における宿主相互作用に関与することが知られているタンパク質は、ＥＰＳｎｅｇの切り取られたタンパク質の画分において、ＭＲｘ０００４の切り取られたタンパク質の画分におけるものよりも、（同定されたペプチドの数／総タンパク質（μｇ）で評価して）より豊富であった（表１０）。これらの結果は、ＥＰＳの除去が非保護作用をもたらし、さもなければＭＲｘ０００４のＥＰＳによって遮蔽される表面タンパク質及び潜在的なＭＲｘ０００４の免疫原を露出させるという仮説にさらなる裏付けを加える。
ＥＰＳｎｅｇ培養上清のタンパク質含有量もＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析し、ＥＰＳの欠如により、ＥＰＳｎｅｇ菌株によって細胞外環境中にシェディング及び分泌される可能性のあるタンパク質の数が増加することが確認された（図１７）。ＭＲｘ０００４ＳＮ中で６４個のタンパク質のみが同定されたのとは対照的に、ＥＰＳｎｅｇ ＳＮ中では合計１４６個のタンパク質が同定され、そのうち８７個はＥＰＳｎｅｇ ＳＮ中でのみ検出され、５９個は両方の試料中で検出された。ＭＲｘ０００４ＳＮ中で同定された、前述したムーンライティングタンパク質は、両方の試料間で同等（ＭＲｘ０００４ＳＮ中で３０±３．６１、及びＥＰＳｎｅｇ ＳＮ中で２８．３３±０．５８）であったＧＡＰＤＨを除き、すべてＥＰＳｎｅｇ ＳＮ中でより豊富に検出された。興味深いことに、Ｂ．ｌａｃｔｉｓ及びＢ．ｌｏｎｇｕｍにおけるヒトプラスミノーゲン結合で役割を果たすことが示されているコロイルグリシンヒドロラーゼ（胆汁酸塩ヒドロラーゼ）及びＥｆＴｕは、ＥＰＳｎｅｇ ＳＮ中においてのみ検出された［８０、８７］。胆汁酸塩ヒドロラーゼはまた、腸内の環境ストレスから共生種を保護し得る［９０］。ＭＲｘ０００４ＳＮと比較した、ＥＰＳｎｅｇ ＳＮにおけるタンパク質の検出の増加は、ＥＰＳの非存在下における非保護により、ＭＲｘ０００４の表面結合タンパク質のシェディングまたは分泌の増加がもたらされる可能性があることを示唆する。
結論
比較ゲノム分析により、ＭＲｘ０００４においてＥＰＳの合成を担う遺伝子座は、他のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株とは遺伝的に異なることが示された。この領域で観察された遺伝的相違は、ＭＲｘ０００４及び近縁菌株の効力及び治療的有用性の増強に寄与し得る。
比較ゲノム分析により、ＭＲｘ０００４においてＥＰＳの合成を担う遺伝子座は、他のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株とは遺伝的に異なることが示された。この領域で観察された遺伝的相違は、ＭＲｘ０００４及び近縁菌株の効力及び治療的有用性の増強に寄与し得る。
ＭＲｘ０００４：宿主相互作用のメディエーターとして、及び免疫応答のエフェクターとしてのＥＰＳの潜在的な重要性は、ＩＥＣとの接触時のｐＧＴＦ発現の相対的な増大によって裏付けられた。ｐＧＴＦに加えて、ｑＰＣＲ分析で著しく上方制御された他の遺伝子の大部分は、ＩＥＣへの接着における役割を有することが予測されており、これは、このことがＭＲｘ０００４の重要な機能特性である可能性があることを意味している。ＭＲｘ０００４のＩＶ型線毛関連遺伝子ｔａｄＡはインビトロ培養中で発現したが、これは、Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＵＣＣ２００３のＴａｄ線毛はインビトロ条件下では生成されないという以前の観察結果［９１］から、興味深いものであった。セルピンの発現もまた、ＩＥＣに応答して著しく増大した。Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ ＮＣＣ２７０５に由来するセルピンは、近年、インビボセリアック病モデルの小腸における上皮内リンパ球の浸潤を低減させ［９２］、これにより免疫刺激性作用及び保護作用を誘導することが報告されており、これは、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、特にＭＲｘ０００４のセルピンが類似の免疫調節効果を有し得ることを示唆する。
上清及び細胞から切り取られたもののプロテオミクス分析により、炭水化物代謝において役割を有することが予測される多数のタンパク質が検出された。興味深いことに、細胞から切り取られたもののデータセット中で最も豊富なタンパク質であるアミロース分解性酵素プルラナーゼは、インビトロにおいてＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓの糖タンパク質及び宿主細胞に対する接着に関与することが報告されている、ムーンライティングタンパク質である［８５、８６］。さらに、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓに由来するＤｎａＫ及びエノラーゼ［８２、８３］及びＢ．ｌｏｎｇｕｍ［８７］に由来するＥｆＴｕは、インビトロでプラスミノーゲンに接着することが報告されている。加えて、Ｌ．ｌａｃｔｉｓにおけるＢ．ｂｉｆｉｄｕｍ Ａ８の解糖系酵素トランスアルドラーゼの組換え発現は、この菌株のムチンへの接着を増加させた［８４］。ＭＲｘ０００４によるこれらのムーンライティングタンパク質の生成は、それらがＭＲｘ０００４の接着能力における役割を果たし、それにより宿主細胞表面との相互作用を促進し得ることを示唆する。これらのビフィズス菌のムーンライティングタンパク質は、免疫系に対するＭＲｘ０００４の増強された効果を媒介する特定の宿主細胞受容体及びシグナル伝達経路に対し、特定の効果を及ぼし得る。
ＭＲｘ０００４は、活性化ＣＤ８＋サブセットの著しい増加を誘導し、これは、ＥＰＳの存在に部分的に関連しているように思われた。
ＥＰＳｎｅｇ処理物は、ＭＲｘ０００４と比較してＴｒｅｇを著しく増加させた。これは、ＥＰＳを除去することにより、宿主細胞と相互作用してＴｒｅｇ応答を促進することができる別の細菌表面成分が露出することを示唆している。ＣＤ８＋集団及びＴｒｅｇ集団の両方において変動が明らかであった。ＥＰＳｎｅｇは、ベースラインと比較したＴｒｅｇ／ＣＤ８比の著しい増大によって示されているように、Ｔｒｅｇ応答に対して著しい歪みを誘発した。これは、ＥＰＳｎｅｇにおける細胞表面の非保護が抗炎症性作用をもたらし、ＭＲｘ０００４におけるＥＰＳの存在がその免疫刺激効力を補助することを意味する。
ＭＲｘ０００４のＥＰＳが、ＩＬ−１２ｐ７０の分泌に直接関与することが判明した。さらに、試験した３つすべてのＴｈ１サイトカイン（ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＴＮＦα）の分泌は、ＭＲｘ０００４ＨＫによって著しく上方制御され、これは、この菌株が、菌株のＥＰＳによって部分的に媒介されるＴｈ１応答に対する歪みを誘発することを示唆している。ＭＲｘ０００４ＨＫはまた、Ｔｈ２サイトカインのＩＬ−４を著しく誘導し、ＩＬ−１０、ＩＬ−１β及びＩＬ−１７αを大幅ではないが上方制御したため、この菌株がヘルパーＴ細胞の微小環境の変化を誘導し得ることが推測された。Ｔｈ１の誘導は、インビボでの腸の障壁の安定性を向上させ、免疫恒常性の維持に有益であり得る。
ＭＲｘ０００４のＥＰＳは、特定の免疫調節効果、すなわちＣＤ８＋、Ｔｒｅｇ及びＴｈ１応答の調節を有している可能性があり、これらの効果は効力及び治療効果の増強をもたらし得る。
実施例３−がんのマウスモデルにおける細菌接種物の効力
要旨
先行実施例に記載されているように、本発明者らは、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、特に菌株ＭＲＸ００４の新しい免疫刺激効果を同定した。上記の新しいデータを踏まえて、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、特に菌株ＭＲＸ００４を含む組成物は、免疫系を刺激して、免疫系の活性の低減に関連する疾患または免疫系の活性の増大からベネフィットを得られる疾患を処置するのに有効であると予想される。
要旨
先行実施例に記載されているように、本発明者らは、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、特に菌株ＭＲＸ００４の新しい免疫刺激効果を同定した。上記の新しいデータを踏まえて、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、特に菌株ＭＲＸ００４を含む組成物は、免疫系を刺激して、免疫系の活性の低減に関連する疾患または免疫系の活性の増大からベネフィットを得られる疾患を処置するのに有効であると予想される。
がんは、腫瘍を攻撃する免疫系の活性の増大からベネフィットを得られる可能性のある疾患である。上記の新しいデータ及びＭＲＸ００４の新しい免疫刺激効果と一致して、ＭＲＸ００４がマウス腫瘍モデルの腫瘍体積を強力に減少させることを以下の試験で示し、ＭＲＸ００４の投与が疾患の処置に有効であることを実証する。
この試験では、４つの腫瘍モデルにおいて本発明に係る細菌株を含む組成物の効力を試験し、抗ＣＴＬＡの効力と比較した。
材料
試験物質−細菌株＃ＭＲＸ００４、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ。
試験物質−細菌株＃ＭＲＸ００４、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ。
参照物質−抗ＣＴＬＡ−４抗体（クローン：９Ｈ１０、カタログ：ＢＥ０１３１、アイソタイプ：シリアンハムスターＩｇＧ１、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）。
試験物質及び参照物質のビヒクル−細菌培地（酵母抽出物、カシトン、脂肪酸培地（ＹＣＦＡ））。マウスへ注射する各日に、抗体をＰＢＳで希釈した（参照：ＢＥ１４−５１６Ｆ、Ｌｏｎｚａ、Ｆｒａｎｃｅ）。
処理用量−細菌：２００μＬ中に２×１０８個。抗ＣＴＬＡ−４を１０ｍｇ／ｋｇ／注射で注射した。マウスの直近の体重に従って、抗ＣＴＬＡ−４を１０ｍＬ／ｋｇ／投与の投与量で投与した（すなわち、体重２０ｇのマウス１匹に対して２００μＬの試験物質が投与される）。
投与経路−細菌接種物を、カニューレによる強制経口投与（経口、ＰＯ）によって投与した。カニューレは毎日汚染除去した。抗ＣＴＬＡ−４をマウスの腹腔内に注射した（腹腔内、ＩＰ）。
細菌株の培養条件−細菌株の培養条件は以下の通りであった。
・（調製済の１０ｍＬ Ｅ＆Ｏラボボトルより）１０ｍＬのＹＣＦＡをピペットで取り、Ｈｕｎｇａｔｅチューブに入れる
・チューブを密封し、シリンジによる投入でＣＯ２を流して、系を排気する
・Ｈｕｎｇａｔｅチューブをオートクレーブする
・冷却後、Ｈｕｎｇａｔｅチューブに１ｍＬのグリセロールストックを接種する
・３７℃のインキュベータ内でチューブを約１６時間静置する。
・翌日、この継代培養物１ｍＬを取り、１０ｍＬのＹＣＦＡに接種する（再度予熱してフラッシュしたＨｕｎｇａｔｅチューブ、すべて二連）
・３７℃のインキュベータ内でチューブを５〜６時間静置する
・（調製済の１０ｍＬ Ｅ＆Ｏラボボトルより）１０ｍＬのＹＣＦＡをピペットで取り、Ｈｕｎｇａｔｅチューブに入れる
・チューブを密封し、シリンジによる投入でＣＯ２を流して、系を排気する
・Ｈｕｎｇａｔｅチューブをオートクレーブする
・冷却後、Ｈｕｎｇａｔｅチューブに１ｍＬのグリセロールストックを接種する
・３７℃のインキュベータ内でチューブを約１６時間静置する。
・翌日、この継代培養物１ｍＬを取り、１０ｍＬのＹＣＦＡに接種する（再度予熱してフラッシュしたＨｕｎｇａｔｅチューブ、すべて二連）
・３７℃のインキュベータ内でチューブを５〜６時間静置する
がん細胞株及び培養条件
使用した細胞株を以下の表に詳述する。
使用した細胞株を以下の表に詳述する。
ＥＭＴ−６細胞株は、乳腺過形成胞状結節の移植後、ＢＡＬＢ／ｃＣＲＧＬマウスに生じた可移植性マウス乳癌から確立された［９３］。
ＬＬ／２（ＬＬＣ１）細胞株は、原発性Ｌｅｗｉｓ肺癌の移植により生じた腫瘍を担持するＣ５７ＢＬマウスの肺から確立された［９４］。
Ｈｅｐａ １−６細胞株は、Ｃ５７／Ｌマウスに生じたＢＷ７７５６マウス肝癌の派生株である［９５］。
細胞培養条件−細胞株はすべて湿潤雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気）中、３７℃で単層として増殖させた。培地及び添加物を以下の表に示す。
実験で使用するために、カルシウムまたはマグネシウムを含まないＨａｎｋｓ培地（参照：ＢＥ１０−５４３Ｆ、Ｌｏｎｚａ）中でトリプシン−バーゼン（参照：ＢＥ１７−１６１Ｅ、Ｌｏｎｚａ）による５分間の処理によって、接着した腫瘍細胞を培養フラスコから剥離させ、完全培地を添加することにより中和した。細胞をヘモサイトメーターで計数し、その生存率は０．２５％トリパンブルー排除アッセイによって評価することになる。
動物の使用
体重及び週齢を一致させた健康な雌Ｂａｌｂ／Ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウスを、ＥＭＴ６モデルの実験のために、ＣＨＡＲＬＥＳ ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手した。
体重及び週齢を一致させた健康な雌Ｂａｌｂ／Ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウスを、ＥＭＴ６モデルの実験のために、ＣＨＡＲＬＥＳ ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手した。
体重及び週齢を一致させた健康な雌Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃ５７ＢＬｌ６Ｊ）マウスを、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）モデル及びＨｅｐａ１−６モデルの実験のために、ＣＨＡＲＬＥＳ ＲＩＶＥＲ（Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅｓ）から入手した。
動物を、ＦＥＬＡＳＡのガイドラインに従ってＳＰＦ健康状態で維持し、フランス及び欧州の規則ならびにＮＲＣ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従う動物の収容及び実験手順を遵守した［９６、９７］。動物を、管理された環境条件下の飼育室（温度２２±２℃、湿度５５±１０％、照明時間（１２時間照明／１２時間消灯）、ＨＥＰＡフィルター濾過空気、再循環せずに１時間に１５回換気）で維持した。動物飼育室には、床敷材料、飼料及び水を備えた無菌で適切な空間、環境及び社会的エンリッチメント（群飼育）を備え、その詳細は、換気ラック中の９００ｃｍ２ケージ（参照：緑色、Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）、Ｅｐｉｃｅａ床敷（ＳＡＦＥ）、１０ｋＧｙ照射飼料（Ａ０４−１０、ＳＡＦＥ）、免疫コンピテントげっ歯類用完全飼料（Ｒ／Ｍ−Ｈ Ｅｘｔｒｕｄａｔｅ）、水ボトルからの水であった。
実験計画及び処理
抗腫瘍活性、ＥＭＴ６モデル
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、Ｖｉｖｏ ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスをマウスの個々の体重に従って９／８匹の群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株を投与した。１４日目に、以下に記載の通りにすべてのマウスにＥＭＴ−６腫瘍細胞を移植した。２４日目に陽性対照群のマウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体処理を施した。
抗腫瘍活性、ＥＭＴ６モデル
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、Ｖｉｖｏ ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスをマウスの個々の体重に従って９／８匹の群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株を投与した。１４日目に、以下に記載の通りにすべてのマウスにＥＭＴ−６腫瘍細胞を移植した。２４日目に陽性対照群のマウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体処理を施した。
処理スケジュールを以下の表に要約する。
動物のモニタリングを以下に記載の通りに実施した。
動物におけるＥＭＴ６腫瘍の誘導−１４日目に、２００μＬのＲＰＭＩ １６４０中のＥＭＴ−６細胞１×１０６個をマウスの右側腹部に皮下注射することによって腫瘍を誘導した。
安楽死−マウスが以下に記載される人道的エンドポイントに達した場合、または投与開始後最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
抗腫瘍活性、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）モデル
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、Ｖｉｖｏ ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスを個々の体重に従って９／８匹の７つの群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株を投与する。１４日目に、以下に記載の通りにすべてのマウスにＬＬ／２腫瘍細胞を移植した。２７日目に陽性対照群のマウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体処理を施した。
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、Ｖｉｖｏ ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスを個々の体重に従って９／８匹の７つの群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株を投与する。１４日目に、以下に記載の通りにすべてのマウスにＬＬ／２腫瘍細胞を移植した。２７日目に陽性対照群のマウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体処理を施した。
処理スケジュールを以下の表に要約する。
動物のモニタリングを以下に記載の通りに実施した。
動物におけるＬＬ／２（ＬＬＣ１）腫瘍の誘導−１４日目に、２００μＬのＲＰＭＩ １６４０中のＬＬ／２（ＬＬＣ１）細胞１×１０６個をマウスの右側腹部に皮下注射することによって腫瘍を誘導した。
安楽死−マウスが以下に記載される人道的エンドポイントに達した場合、または投与開始後最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
抗腫瘍活性、Ｈｅｐａ１−６モデル
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、Ｖｉｖｏ ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスをマウスの個々の体重に従って９匹の７つの群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株を投与した。１４日目に、以下に記載の通りにすべてのマウスにＨｅｐａ１−６腫瘍細胞を移植した。１６日目に陽性対照群のマウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体処理を施した。
処理スケジュール−最初の投与の開始を０日目とした。０日目に、Ｖｉｖｏ ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅｓ，Ｃｏｕｔｅｒｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、非移植マウスをマウスの個々の体重に従って９匹の７つの群に無作為化した。０日目に、マウスにビヒクル（培地）または細菌株を投与した。１４日目に、以下に記載の通りにすべてのマウスにＨｅｐａ１−６腫瘍細胞を移植した。１６日目に陽性対照群のマウスに抗ＣＴＬＡ−４抗体処理を施した。
処理スケジュールを以下の表に要約する。
動物のモニタリングを以下に記載の通りに実施した。
動物における脾臓内注射によるＨｅｐａ１−６腫瘍細胞の同所性の誘導−１４日目に、５０μＬのＲＰＭＩ １６４０培地中のＨｅｐａ１−６腫瘍細胞１００万個（１×１０６個）を、脾臓内注射によってマウスに移植した。簡潔に述べると、左肋骨下側腹部に小さな切開を置き、脾臓を体外に露出させた。脾臓を滅菌ガーゼパッド上に露出させ、細胞懸濁液を２７ゲージ針により目視下で注射した。細胞の接種後、脾臓を切除した。
安楽死−マウスが以下のセクションに記載される人道的エンドポイントに達した場合、または投与開始後最大６週間後に、各マウスを安楽死させた。
安楽死時の腫瘍量の評価−終了時、肝臓を回収して重量を測定した。
動物のモニタリング
臨床モニタリング−腫瘍の長さ及び幅をノギスで週に２回測定して、腫瘍の体積をこの式によって推定した［９８］。
臨床モニタリング−腫瘍の長さ及び幅をノギスで週に２回測定して、腫瘍の体積をこの式によって推定した［９８］。
人道的エンドポイント［９９］：疼痛、苦しみまたは苦痛の徴候：疼痛の姿勢、疼痛の表情（ｐａｉｎ ｆａｃｅ ｍａｓｋ）、行動；通常の体重の１０％を超えるが２０００ｍｍ３を超えない腫瘍；移動または栄養摂取に干渉する腫瘍；潰瘍化した腫瘍または組織のびらん；３日連続して持続する２０％の体重減少；不良な身体状態、羸痩、悪液質、脱水症状；外部刺激に対する随意反応の持続的な欠如；速い努力呼吸、貧血、著しい出血；神経学的徴候：旋回、痙攣、麻痺；体温の持続的な低下；腹部膨満。
麻酔−イソフルランガス麻酔をすべての処置、すなわち外科手術または腫瘍の接種、静脈内注射、採血に使用した。ケタミン麻酔及びキシラジン麻酔を定位外科的処置に使用した。
鎮痛−カルプロフェンまたはカルプロフェン／ブプレノルフィンのマルチモーダルな鎮痛プロトコールを、外科的処置の重症度に合わせた。痛みを伴うすべての処置に非薬理学的ケアを提供した。さらに、試験に干渉しない薬理学的ケア（局所処置）を、担当獣医師の推奨により提供した。
安楽死−動物の安楽死を、ガス麻酔（イソフルラン）の過量投与後、頸椎脱臼または瀉血によって実施した。
結果
抗腫瘍活性、ＥＭＴ６モデル
結果を図１に示す。本発明の細菌株による処理によって、両方の陰性対照と比較して腫瘍体積の明らかな減少が生じた。予想されていたように、免疫系を活性化させることが知られている陽性対照によっても腫瘍体積の減少が生じた。
抗腫瘍活性、ＥＭＴ６モデル
結果を図１に示す。本発明の細菌株による処理によって、両方の陰性対照と比較して腫瘍体積の明らかな減少が生じた。予想されていたように、免疫系を活性化させることが知られている陽性対照によっても腫瘍体積の減少が生じた。
抗腫瘍活性、ＬＬ／２（ＬＬＣ１）モデル
結果を図２に示す。腫瘍体積が陰性対照群よりも陽性対照で処理したマウスにおいて大きかったことから、陰性対照及び陽性対照は予想通りに表示されていない。それにもかかわらず、本発明の細菌株で処理したマウスの腫瘍体積は陽性対照群と同等であり、これは、有用な治療効果及び免疫刺激効果に合致する。
結果を図２に示す。腫瘍体積が陰性対照群よりも陽性対照で処理したマウスにおいて大きかったことから、陰性対照及び陽性対照は予想通りに表示されていない。それにもかかわらず、本発明の細菌株で処理したマウスの腫瘍体積は陽性対照群と同等であり、これは、有用な治療効果及び免疫刺激効果に合致する。
抗腫瘍活性、Ｈｅｐａ１−６モデル
結果を図３に示す。未処理陰性対照群における肝臓重量が他の群より低かったことから、未処理陰性対照は予想通りに表示されていない。しかし、ビヒクルのみで処理したマウスは、抗ＣＴＬＡ４抗体によって処理したマウスより肝臓が大きく、ビヒクル陰性対照群において腫瘍量がより大きいことを反映していることから、ビヒクル陰性対照群及び陽性対照群はいずれも予想通りに表示されている。本発明の細菌株による処理によって、ビヒクル陰性対照群におけるマウスと比較して、肝臓重量（したがって、腫瘍量）の明らかな減少が生じた。
結果を図３に示す。未処理陰性対照群における肝臓重量が他の群より低かったことから、未処理陰性対照は予想通りに表示されていない。しかし、ビヒクルのみで処理したマウスは、抗ＣＴＬＡ４抗体によって処理したマウスより肝臓が大きく、ビヒクル陰性対照群において腫瘍量がより大きいことを反映していることから、ビヒクル陰性対照群及び陽性対照群はいずれも予想通りに表示されている。本発明の細菌株による処理によって、ビヒクル陰性対照群におけるマウスと比較して、肝臓重量（したがって、腫瘍量）の明らかな減少が生じた。
これらのデータは、ＭＲＸ００４が、がんの処置に有効であることを示しており、実施例１及び２のデータを踏まえると、これらのデータは、菌株ＭＲＸ００４が免疫系の活性の低減に関連する他の疾患の処置または予防に有用であり得ることを裏付けている。
実施例４−酵素活性の特性評価
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｉｎｄｅｘ（ＡＰＩ（登録商標））試験系は、細菌種における酵素活性に関してアッセイする小型化した生化学的試験を含有するストリップからなる。ＭＲＸ００４（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌）を２つのＡＰＩ試験系を使用して特性評価した：Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ−この系は、特に嫌気性種用に設計されており、炭水化物、アミノ酸及び硝酸塩の代謝、ならびにアルカリホスファターゼ活性についての試験を包含する；ＡＰＩ（登録商標）５０ ＣＨ−この系は、４９個の炭水化物源の発酵について試験し、嫌気性種の分析のためにＡＰＩ（登録商標）ＣＨＬ Ｍｅｄｉｕｍと併せて利用することができる。
Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｉｎｄｅｘ（ＡＰＩ（登録商標））試験系は、細菌種における酵素活性に関してアッセイする小型化した生化学的試験を含有するストリップからなる。ＭＲＸ００４（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託された細菌）を２つのＡＰＩ試験系を使用して特性評価した：Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ−この系は、特に嫌気性種用に設計されており、炭水化物、アミノ酸及び硝酸塩の代謝、ならびにアルカリホスファターゼ活性についての試験を包含する；ＡＰＩ（登録商標）５０ ＣＨ−この系は、４９個の炭水化物源の発酵について試験し、嫌気性種の分析のためにＡＰＩ（登録商標）ＣＨＬ Ｍｅｄｉｕｍと併せて利用することができる。
Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ試験を、製造業者の説明書に従って細菌コロニー上で実施した。簡潔に述べると、嫌気性ワークステーション内で、細菌をＹＣＦＡ寒天培地上で３７℃で２４時間培養した。５μｌの滅菌白金耳を使用してプレートからコロニーを除去し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液番号４とほぼ等しい濃度が得られるまで、２ｍｌアンプルのＡＰＩ（登録商標）Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに再懸濁させた。Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａストリップの各小チューブ（ｃｕｐｕｌｅ）に５５マイクロリットルの細菌懸濁液を加え、ウレアーゼ試験を２滴の鉱油で覆った。ストリップをプラスチック製の蓋で覆い、３７℃で４時間好気的にインキュベートした後、次の試薬を使用して下の列の小チューブを発色させた：ＮＩＴ：ＮＩＴ１及びＮＩＴ２を各１滴；ＩＮＤ：Ｊａｍｅｓ試薬を１滴；残りのすべての小チューブ：ＦａｓｔＢｌｕｅ試薬を１滴。ストリップを室温で５分間インキュベートした後、それぞれの小チューブの色を記録して、陰性、中間陽性または陽性の値に割付けた。
Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析の結果を図４に示す。ＭＲＸ００４は、いくつかの炭水化物源、すなわちα−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ、α−アラビノース、マンノースならびにラフィノース、加えて、アミノ酸のアルギニン、プロリン、フェニルアラニン、ロイシン、チロシン、グリシン及びヒスチジンの発酵について陽性と試験された。
ＲａｐｉｄＩＤ ３２Ａの比較分析を、ＭＲＸ００４と４種のＢ．ｂｒｅｖｅ基準株との間で実施し、図４Ｂにおいて、これらにＢｉｆ参照１（ＤＳＭ ２００９１）、Ｂｉｆ参照２（ＤＳＭ ２０２１３）、Ｂｉｆ参照６（ＪＣＭ ７０１７）及びＢｉｆ参照７（ＵＣＣ２００３）として注釈を付した。この分析は、ＭＲＸ００４が多糖ラフィノースを発酵させる唯一の試験菌株であることを示した。このことは、ラフィノースは菌体外多糖などの細菌成分の生成に関与しており、ラフィノースの発酵はまた、報告によれば盲腸酪酸の増加、胃腸増殖の増大及び体重減少など、宿主に影響を及ぼす可能性があることから、重要であり得る。
ＭＲＸ００４における炭水化物代謝をさらに調査するために、ＡＰＩ（登録商標）５０ ＣＨ試験を実施した。製造業者の説明書に従って、嫌気性ワークステーション内で、細菌を１０ｍｌのＹＣＦＡブロス中で３７℃で１６〜１８時間培養した。この培養物を、ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液番号２にほぼ等しい濃度が得られるように１０ｍｌのＡＰＩ（登録商標）ＣＨＬ Ｍｅｄｉｕｍ中で希釈し、１１０μｌのこの混合物を使用してＡＰＩ（登録商標）５０ ＣＨ試験ストリップのセットの各小チューブに接種した。試験ストリップを、嫌気性ワークステーション内の加湿インキュベーションボックス中で３７℃で４８時間インキュベートした後、それぞれの小チューブの色を記録して、陰性、中間陽性、陽性、または疑わしいという値に割付けた。
ＡＰＩ（登録商標）５０を使用すると、ＭＲＸ００４は、次の炭水化物源：アミドン（デンプン）、アミグダリン、アルブチン、セロビオース、エスクリン、ガラクトース、ゲンチオビオース、グルコース、グリコーゲン、フルクトース、フコース、ラクトース、マルトース、マンノース、マンニトール、メリビオース、メレジトース、メチルα−Ｄ−グルコピラノシド、Ｎ−アセチルグルコサミン、リボース、サッカロース（スクロース）、サリシン、ソルビトール、トレハロース、ツラノース及びキシリトールの使用に対して陽性であると試験された（図５）。これらの結果は、ＭＲＸ００４が両方の試験系においてガラクトース、グルコース、マンノース及びラフィノースの発酵を示したという点で、Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ試験で得られた結果と相関した。
実施例５−ＹＣＦＡ培地におけるヒト細胞への接着
要旨
菌株ＭＲＸ００４及び他のいくつかのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株のヒト細胞への結合レベルを、ＹＣＦＡ培地中で３つの異なる時点において測定した。ヒト細胞に接着した細菌を培地中に再懸濁させ、次に、培地の光学濃度を分析した。光学濃度が高いほど細菌細胞の数が多くなり、したがって、細菌細胞のヒト細胞への結合レベルが高くなる。ＭＲＸ００４菌株が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ参照菌株と比較して、ヒト細胞への接着の減少を示すことが判明した。
要旨
菌株ＭＲＸ００４及び他のいくつかのＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株のヒト細胞への結合レベルを、ＹＣＦＡ培地中で３つの異なる時点において測定した。ヒト細胞に接着した細菌を培地中に再懸濁させ、次に、培地の光学濃度を分析した。光学濃度が高いほど細菌細胞の数が多くなり、したがって、細菌細胞のヒト細胞への結合レベルが高くなる。ＭＲＸ００４菌株が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ参照菌株と比較して、ヒト細胞への接着の減少を示すことが判明した。
結果及び分析
この実験の結果を図６に示す。
この実験の結果を図６に示す。
図６に示すように、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ参照菌株は、すべての時点でヒト細胞への高レベルの接着を示す。一方、ＭＲＸ００４菌株は、ヒト細胞への付着レベルが大幅に低下している。したがって、ＭＲＸ００４菌株のヒト細胞への低い付着性は、免疫系に対する本発明の組成物の有益な効果を向上させ得る。
実施例６−安定性試験
本明細書に記載の少なくとも１つの細菌株を含有する本明細書に記載の組成物を、２５℃または４℃で密封容器の中で保管して、容器を相対湿度が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％である雰囲気中に置く。１か月、２か月、３か月、６か月、１年、１．５年、２年、２．５年、または３年後に、細菌株の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が、標準的なプロトコールによって決定したコロニー形成単位で測定した場合に残るものとする。
本明細書に記載の少なくとも１つの細菌株を含有する本明細書に記載の組成物を、２５℃または４℃で密封容器の中で保管して、容器を相対湿度が３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％または９５％である雰囲気中に置く。１か月、２か月、３か月、６か月、１年、１．５年、２年、２．５年、または３年後に、細菌株の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が、標準的なプロトコールによって決定したコロニー形成単位で測定した場合に残るものとする。
実施例７−抗菌活性
概要
この実験の目的は、ヒト乳児に由来するいくつかのＢ．ｂｒｅｖｅ菌株の抗菌活性の潜在能力を様々な指標菌株に対して試験すること、及びそれらがインビトロでバクテリオシンを生成するかどうかを評価することであった。
概要
この実験の目的は、ヒト乳児に由来するいくつかのＢ．ｂｒｅｖｅ菌株の抗菌活性の潜在能力を様々な指標菌株に対して試験すること、及びそれらがインビトロでバクテリオシンを生成するかどうかを評価することであった。
方法
菌株のパネルを指標菌株として選択し（表５）、これには、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種によって阻害されることが既に示されている近縁のグラム陽性菌、他のグラム陽性菌及びグラム陰性菌が含まれた［エラー！ブックマーク未定義］。
菌株のパネルを指標菌株として選択し（表５）、これには、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種によって阻害されることが既に示されている近縁のグラム陽性菌、他のグラム陽性菌及びグラム陰性菌が含まれた［エラー！ブックマーク未定義］。
共培養アッセイ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから（Ｂ．ｂｒｅｖｅ試験菌株及び参照菌株用）またはビーズストックから（指標菌株用）の菌株を、嫌気性条件下（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＳ．ａｕｒｅｕｓについては好気性条件下）で、３７℃（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓについては３０℃）で１６時間増殖させた。ＹＣＦＡプレート（Ｅ＆Ｏ Ｌａｂｓ，ＵＫ）上に指標菌株の菌叢を作製し、乾燥させ、菌叢の表面に１０μｌの試験菌株培養物をスポットした。プレートを嫌気性条件下で３７℃で４８時間（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＳ．ａｕｒｅｕｓについては嫌気性条件下で３７℃で２４時間、続いて好気性条件下で３７℃で２４時間）インキュベートした。各アッセイを三連で実施した（ＭＲｘ０００４、試験１、試験２、試験３、試験４、試験５、試験６、試験７及び試験８を用いたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＩＭＢ８０４５、ならびにすべてのＢ．ｂｒｅｖｅ菌株を用いたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＤＳＭ２０２１３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＣＩＭＢ８８２６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ３５８４及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＮＣＩＭＢ９５１８に対して二連で実施したことを除く）。
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋから（Ｂ．ｂｒｅｖｅ試験菌株及び参照菌株用）またはビーズストックから（指標菌株用）の菌株を、嫌気性条件下（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＳ．ａｕｒｅｕｓについては好気性条件下）で、３７℃（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓについては３０℃）で１６時間増殖させた。ＹＣＦＡプレート（Ｅ＆Ｏ Ｌａｂｓ，ＵＫ）上に指標菌株の菌叢を作製し、乾燥させ、菌叢の表面に１０μｌの試験菌株培養物をスポットした。プレートを嫌気性条件下で３７℃で４８時間（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＳ．ａｕｒｅｕｓについては嫌気性条件下で３７℃で２４時間、続いて好気性条件下で３７℃で２４時間）インキュベートした。各アッセイを三連で実施した（ＭＲｘ０００４、試験１、試験２、試験３、試験４、試験５、試験６、試験７及び試験８を用いたＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＣＩＭＢ８０４５、ならびにすべてのＢ．ｂｒｅｖｅ菌株を用いたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ ＤＳＭ２０２１３、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＮＣＩＭＢ８８２６、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ ＡＴＣＣ３５８４及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ ＮＣＩＭＢ９５１８に対して二連で実施したことを除く）。
抗菌活性を、試験菌株のスポット周囲の明瞭な区域である、観察された阻害区域の幅を測定することによって評価した（図２２）。各生物学的反復試験の各菌株に、０〜３のスコアを付与した。
培養上清
寒天拡散法を使用して、培養上清の潜在的な抗菌能力を試験した。簡潔に述べると、１００μｌの濾過した無細胞上清を、指標菌株の菌叢を（上記の通り）事前に接種したＹＣＦＡ寒天培地上にスポットして、寒天培地に打ち抜いたウェルに入れた。プレートを１時間放置して拡散させ、次に、嫌気性条件下で（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＳ．ａｕｒｅｕｓについては好気性条件で）３７℃で４８時間インキュベートした。３回の生物学的反復試験を実施した。
寒天拡散法を使用して、培養上清の潜在的な抗菌能力を試験した。簡潔に述べると、１００μｌの濾過した無細胞上清を、指標菌株の菌叢を（上記の通り）事前に接種したＹＣＦＡ寒天培地上にスポットして、寒天培地に打ち抜いたウェルに入れた。プレートを１時間放置して拡散させ、次に、嫌気性条件下で（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＳ．ａｕｒｅｕｓについては好気性条件で）３７℃で４８時間インキュベートした。３回の生物学的反復試験を実施した。
結果
共培養
試験した大部分のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して拮抗活性を示した（表１２）。Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＤＳＭ ２００９１は、Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＤＳＭ２０２１３の増殖を阻害した唯一の試験菌株であった。ＭＲｘ０００４及び他のＢ．ｂｒｅｖｅ試験菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して抗菌活性を示し（表１２）、全体として、Ｂ．ｂｒｅｖｅ参照菌株で観察されたものよりも強く阻害した。ＭＲｘ０００４、試験１、試験２、試験３、試験７、試験８、試験１１及び試験１２は、特に強力な抗菌活性を示した。試験した条件では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍに対して、拮抗作用は検出されなかった。
共培養
試験した大部分のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して拮抗活性を示した（表１２）。Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＤＳＭ ２００９１は、Ｂ．ｂｒｅｖｅ ＤＳＭ２０２１３の増殖を阻害した唯一の試験菌株であった。ＭＲｘ０００４及び他のＢ．ｂｒｅｖｅ試験菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに対して抗菌活性を示し（表１２）、全体として、Ｂ．ｂｒｅｖｅ参照菌株で観察されたものよりも強く阻害した。ＭＲｘ０００４、試験１、試験２、試験３、試験７、試験８、試験１１及び試験１２は、特に強力な抗菌活性を示した。試験した条件では、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ及びＬ．ｐｌａｎｔａｒｕｍに対して、拮抗作用は検出されなかった。
これらのデータは、ＭＲＸ０００４及び近縁の試験菌株が、細菌感染症の処置に有用であり得ることを示す。
培養上清
無細胞上清の抗菌活性を、同じパネルの指標菌株に対して試験した。いずれの指標菌株に対しても、試験したすべてのＢ．ｂｒｅｖｅ菌株で阻害は観察されなかった（データは示さず、ｎ＝３）。これは、共培養アッセイで観察された阻害が、抗菌分子の分泌によるものではなかったことを示唆している。
無細胞上清の抗菌活性を、同じパネルの指標菌株に対して試験した。いずれの指標菌株に対しても、試験したすべてのＢ．ｂｒｅｖｅ菌株で阻害は観察されなかった（データは示さず、ｎ＝３）。これは、共培養アッセイで観察された阻害が、抗菌分子の分泌によるものではなかったことを示唆している。
実施例８−酵素活性のさらなる特性評価
実施例４に記載されているＡＰＩ ３２Ａ試験系を使用して、実施例７で試験したＢ．ｂｒｅｖｅ菌株を特性評価した。Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ試験を、製造業者の説明書に従って細菌コロニー上で実施した。簡潔に述べると、嫌気性ワークステーション内で、細菌をＹＣＦＡ寒天培地上で３７℃で２４時間培養した。５μｌの滅菌白金耳を使用してプレートからコロニーを除去し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液番号４とほぼ等しい濃度が得られるまで、２ｍｌアンプルのＡＰＩ（登録商標）Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに再懸濁させた。Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａストリップの各小チューブに５５マイクロリットルの細菌懸濁液を加え、ウレアーゼ試験を２滴の鉱油で覆った。ストリップをプラスチック製の蓋で覆い、３７℃で４時間好気的にインキュベートした後、次の試薬を使用して下の列の小チューブを発色させた：ＮＩＴ：ＮＩＴ１及びＮＩＴ２を各１滴；ＩＮＤ：Ｊａｍｅｓ試薬を１滴；残りのすべての小チューブ：ＦａｓｔＢｌｕｅ試薬を１滴。ストリップを室温で５分間インキュベートした後、それぞれの小チューブの色を記録して、陰性、中間陽性または陽性の値に割付けた。
実施例４に記載されているＡＰＩ ３２Ａ試験系を使用して、実施例７で試験したＢ．ｂｒｅｖｅ菌株を特性評価した。Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ試験を、製造業者の説明書に従って細菌コロニー上で実施した。簡潔に述べると、嫌気性ワークステーション内で、細菌をＹＣＦＡ寒天培地上で３７℃で２４時間培養した。５μｌの滅菌白金耳を使用してプレートからコロニーを除去し、ＭｃＦａｒｌａｎｄ標準液番号４とほぼ等しい濃度が得られるまで、２ｍｌアンプルのＡＰＩ（登録商標）Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍに再懸濁させた。Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａストリップの各小チューブに５５マイクロリットルの細菌懸濁液を加え、ウレアーゼ試験を２滴の鉱油で覆った。ストリップをプラスチック製の蓋で覆い、３７℃で４時間好気的にインキュベートした後、次の試薬を使用して下の列の小チューブを発色させた：ＮＩＴ：ＮＩＴ１及びＮＩＴ２を各１滴；ＩＮＤ：Ｊａｍｅｓ試薬を１滴；残りのすべての小チューブ：ＦａｓｔＢｌｕｅ試薬を１滴。ストリップを室温で５分間インキュベートした後、それぞれの小チューブの色を記録して、陰性、中間陽性または陽性の値に割付けた。
Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析の結果を図２３に示す。実施例４に見られるように、ＭＲＸ００４は、いくつかの炭水化物源、すなわちα−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ、α−アラビノース、マンノースならびにラフィノース、加えて、アミノ酸のアルギニン、プロリン、フェニルアラニン、ロイシン、チロシン、グリシン及びヒスチジンの発酵について陽性と試験された。
Ｒａｐｉｄ ＩＤ ３２Ａ分析を、実施例７で試験した他のＢ．ｂｒｅｖｅ試験菌株（試験１〜試験１２）ならびにＢ．ｂｒｅｖｅ参照菌株（ＤＳＭ ２００９１、ＤＳＭ ２０２１３、ＪＣＭ ７０１７及びＮＣＩＭＢ ８８０７／ＵＣＣ２００３）に対しても実施した。試験菌株は、概して参照菌株よりも高い抗菌活性を示し、ＭＲＸ００４と類似した代謝パターンを示した。
興味深いことに、ＭＲＸ００４及び試験菌株は多糖ラフィノースを発酵させるが、一方で、４つの参照菌株は多糖ラフィノースを発酵させない。上記の通り、ラフィノースは菌体外多糖などの細菌成分の生成に関与している。
また、ＭＲＸ００４及び試験３のいずれも強力な抗菌活性を有し、いずれもβ−グルコシダーゼ及びα−アラビノースの中間の発酵を示す。
ＭＲＸ００４及び試験２のいずれも強力な抗菌活性を有し、いずれもＮ−アセチル−β−グルコサミニダーゼの陽性の発酵を示さない。
ＭＲＸ００４及び試験８のいずれも強力な抗菌活性を有し、いずれもα−ガラクトシダーゼ及びα−アラビノースの中間の発酵を示す。
試験１１及び試験１２のいずれも強力な抗菌活性を有し、いずれもセリンアリルアミダーゼを発酵させるが、ロイシルグリシンアリルアミダーゼ及びアラニンアリルアミダーゼを発酵させない。
試験３及び試験７のいずれも強力な抗菌活性を有し、いずれもセリンアリルアミダーゼの中間の発酵を示す。
実施例９−パルスフィールドゲル電気泳動
パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を使用して、実施例７で試験したＢ．ｂｒｅｖｅ菌株を特性評価した。結果を図２４に示す。Ｂ．ｂｒｅｖｅ参照菌株よりも高い抗菌活性を示したＢ．ｂｒｅｖｅ試験菌株を、類似のパターンにグループ化し、参照菌株と識別できることが判明した。
パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を使用して、実施例７で試験したＢ．ｂｒｅｖｅ菌株を特性評価した。結果を図２４に示す。Ｂ．ｂｒｅｖｅ参照菌株よりも高い抗菌活性を示したＢ．ｂｒｅｖｅ試験菌株を、類似のパターンにグループ化し、参照菌株と識別できることが判明した。
実施例１０−パルスフィールドゲル電気泳動
ＭＲｘ００４及びＢ．ｂｒｅｖｅ参照菌株に対して、さらなるパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）試験を実施した。ＰＦＧＥは、臨床実験室における菌株タイピングの「至適基準」として日常的に適用されており［１００］、ヒト糞便ビフィズス菌単離株を判別するための有効な方法であると報告されている［１０１］。実際、多くの試験において、ＸｂａＩまたはＳｐｅＩ制限酵素のいずれかで消化したゲノムＤＮＡのＰＦＧＥで分解した断片のフィンガープリント分析を使用して、ビフィズス菌単離株の関係性が調査されてきた［１０２、１０３］。ＳｐｅＩは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅのプラスミドプロファイリング及び種内遺伝子型同定に特に有用であることが証明されている［１０４、１０５］。
ＭＲｘ００４及びＢ．ｂｒｅｖｅ参照菌株に対して、さらなるパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）試験を実施した。ＰＦＧＥは、臨床実験室における菌株タイピングの「至適基準」として日常的に適用されており［１００］、ヒト糞便ビフィズス菌単離株を判別するための有効な方法であると報告されている［１０１］。実際、多くの試験において、ＸｂａＩまたはＳｐｅＩ制限酵素のいずれかで消化したゲノムＤＮＡのＰＦＧＥで分解した断片のフィンガープリント分析を使用して、ビフィズス菌単離株の関係性が調査されてきた［１０２、１０３］。ＳｐｅＩは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅのプラスミドプロファイリング及び種内遺伝子型同定に特に有用であることが証明されている［１０４、１０５］。
ＰＦＧＥプラグの調製
ＰＦＧＥ用の高分子量ＤＮＡのアガロースゲルプラグを、公開されているプロトコール［１０６］に従って調製した。
ＰＦＧＥ用の高分子量ＤＮＡのアガロースゲルプラグを、公開されているプロトコール［１０６］に従って調製した。
ＰＦＧＥプラグの制限
単一の薄片（２ｍｍ×２ｍｍ）を１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で１５分間、室温で３回洗浄した。各薄片を、酵素に推奨される２５０μｌの制限緩衝液と４℃で３０分間プレインキュベートし、次に２０ユニットの制限酵素ＳｍａＩを含む２５０μｌの新鮮な緩衝液に交換した。供給元（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＫ）Ｌｔｄ）の推奨に従って、制限消化を２５℃で一晩実施した。
単一の薄片（２ｍｍ×２ｍｍ）を１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で１５分間、室温で３回洗浄した。各薄片を、酵素に推奨される２５０μｌの制限緩衝液と４℃で３０分間プレインキュベートし、次に２０ユニットの制限酵素ＳｍａＩを含む２５０μｌの新鮮な緩衝液に交換した。供給元（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＫ）Ｌｔｄ）の推奨に従って、制限消化を２５℃で一晩実施した。
ＰＦＧＥ
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の処理済（制限酵素）及び未処理のプラグを以下の条件下で検査した。λラダーを、ゲルにロードする前に４５℃に加熱した。実施条件は、０．５倍のＴＰＥ緩衝液中、１４℃、６．０Ｖ／ｃｍで２０時間であり、パルス時間は１秒から２０秒まで増加させた。ラムダＤＮＡラダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をサイズマーカーとして使用した。０．５倍のＴＢＥ（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）で作製した１．０％アガロースゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のウェルにプラグを入れ、同じアガロースで密封した。ＤＮＡ断片を、ＣＨＥＦ−ＤＲ ＩＩＩパルスフィールドシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、１４℃に維持した０．５倍のＴＢＥ泳動用緩衝液中で６Ｖ／ｃｍで１８時間分離させた。直線的に増加するパルス時間を選択した。断片の分離には、１秒から１５秒の直線的に増加するパルス時間を使用した。光制限条件下で、ゲルを０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する蒸留水で１２０分間染色した。
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）の処理済（制限酵素）及び未処理のプラグを以下の条件下で検査した。λラダーを、ゲルにロードする前に４５℃に加熱した。実施条件は、０．５倍のＴＰＥ緩衝液中、１４℃、６．０Ｖ／ｃｍで２０時間であり、パルス時間は１秒から２０秒まで増加させた。ラムダＤＮＡラダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）をサイズマーカーとして使用した。０．５倍のＴＢＥ（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ホウ酸塩、０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）で作製した１．０％アガロースゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のウェルにプラグを入れ、同じアガロースで密封した。ＤＮＡ断片を、ＣＨＥＦ−ＤＲ ＩＩＩパルスフィールドシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、１４℃に維持した０．５倍のＴＢＥ泳動用緩衝液中で６Ｖ／ｃｍで１８時間分離させた。直線的に増加するパルス時間を選択した。断片の分離には、１秒から１５秒の直線的に増加するパルス時間を使用した。光制限条件下で、ゲルを０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する蒸留水で１２０分間染色した。
ＰＦＧＥバンドパターン分析
バンドパターンを、［１０７］で概説されているガイドラインを使用して手動で評価した。ＰＦＧＥ画像をＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ７．６（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ）で処理し、各菌株のバンドのフィンガープリントを生成した。フィンガープリントのクラスター分析を、Ｊａｃｃａｒｄ類似度係数（フィンガープリント型の分析に推奨されている）及び算術平均を用いた非加重結合法（ＵＰＧＭＡ）を使用して実施した。
バンドパターンを、［１０７］で概説されているガイドラインを使用して手動で評価した。ＰＦＧＥ画像をＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ７．６（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ）で処理し、各菌株のバンドのフィンガープリントを生成した。フィンガープリントのクラスター分析を、Ｊａｃｃａｒｄ類似度係数（フィンガープリント型の分析に推奨されている）及び算術平均を用いた非加重結合法（ＵＰＧＭＡ）を使用して実施した。
結果
この試験で用いたＤＮＡ消化及び電気泳動の条件は、Ｂ．ｂｒｅｖｅ種のサブタイピングに有効であることが既に示されており［１０４］、Ｂ．ｂｒｅｖｅの菌株を亜種レベルで識別するのに十分な解像度（１０本を超える観察可能なバンド）を提供することが判明した。４／５の菌株の制限断片は明瞭であり、十分に分離されていた（図２５）。クラスター分析（図２６）により、菌株ＭＲｘ０００４の遺伝子型は、この試験において分析された他のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株よりも、Ｂ．ｂｒｅｖｅ参照７の遺伝子型により近縁であることが示唆される。
この試験で用いたＤＮＡ消化及び電気泳動の条件は、Ｂ．ｂｒｅｖｅ種のサブタイピングに有効であることが既に示されており［１０４］、Ｂ．ｂｒｅｖｅの菌株を亜種レベルで識別するのに十分な解像度（１０本を超える観察可能なバンド）を提供することが判明した。４／５の菌株の制限断片は明瞭であり、十分に分離されていた（図２５）。クラスター分析（図２６）により、菌株ＭＲｘ０００４の遺伝子型は、この試験において分析された他のＢ．ｂｒｅｖｅ菌株よりも、Ｂ．ｂｒｅｖｅ参照７の遺伝子型により近縁であることが示唆される。
実施例１１−Ｔ細胞分化
Ｔ細胞分化を誘導するＭＲｘ０００４の能力について、インビトロで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号７００２５）を用いて調査した。簡潔に述べると、ウェル当たり５０μｌのｃＲＰＭＩ培地中、４００，０００／ウェルで、抗ＣＤ３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３クローン）、機能的グレード、カタログ番号１６−００３７−８１）を播種した９６ウェルプレートに、ＰＢＭＣを播種した（ｃＲＰＭＩは、ＲＰＭＩ １６４０（＋Ｌ−グルタミン、２１８７５−０３４）２ｍＭ最終濃度ストック２００ｍＭ、１０％のＨＩ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１００８２−１４７）、５０μｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１９８５−０２３）、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ４３３３、１０ｍｇ／ｍｌ）を含む）。次いで、加熱死ＭＲｘ０００４（８０℃で３０分間インキュベートし、その後培養物をＰＢＳで洗浄して、適切な細胞培地に再懸濁することにより調製し、生存数をプレーティングによって確認した）を、１００μｌ／ウェル中に４，０００，０００個で各ウェルに添加した。３７℃のインキュベータに３日間入れた後、細胞を取り出し、ＰＭＡ−（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８１３９）、イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ３９０９）、及びＧｏｌｇｉＳＴＯＰ（ＢＤ、カタログ番号５５４７２４）を含む培地に５時間再懸濁させた。ＰＭＡストックはＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌであり、これを１００ｕｇ／ｍｌにさらに希釈し（各試料でｃＲＰＭＩ中５０ｎｇ／ｍｌが必要であった）、イオノマイシンストックはＤＭＳＯ中１ｍＭであり（ｃＲＰＭＩ中１μＭを使用した）、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ濃度は４μｌ／６ｍｌで使用した。上清を０．２２μｍフィルターに通し、共培養培地で適切に希釈した。
Ｔ細胞分化を誘導するＭＲｘ０００４の能力について、インビトロで末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号７００２５）を用いて調査した。簡潔に述べると、ウェル当たり５０μｌのｃＲＰＭＩ培地中、４００，０００／ウェルで、抗ＣＤ３（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３クローン）、機能的グレード、カタログ番号１６−００３７−８１）を播種した９６ウェルプレートに、ＰＢＭＣを播種した（ｃＲＰＭＩは、ＲＰＭＩ １６４０（＋Ｌ−グルタミン、２１８７５−０３４）２ｍＭ最終濃度ストック２００ｍＭ、１０％のＨＩ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１００８２−１４７）、５０μｍのメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、２１９８５−０２３）、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ４３３３、１０ｍｇ／ｍｌ）を含む）。次いで、加熱死ＭＲｘ０００４（８０℃で３０分間インキュベートし、その後培養物をＰＢＳで洗浄して、適切な細胞培地に再懸濁することにより調製し、生存数をプレーティングによって確認した）を、１００μｌ／ウェル中に４，０００，０００個で各ウェルに添加した。３７℃のインキュベータに３日間入れた後、細胞を取り出し、ＰＭＡ−（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｐ８１３９）、イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｉ３９０９）、及びＧｏｌｇｉＳＴＯＰ（ＢＤ、カタログ番号５５４７２４）を含む培地に５時間再懸濁させた。ＰＭＡストックはＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌであり、これを１００ｕｇ／ｍｌにさらに希釈し（各試料でｃＲＰＭＩ中５０ｎｇ／ｍｌが必要であった）、イオノマイシンストックはＤＭＳＯ中１ｍＭであり（ｃＲＰＭＩ中１μＭを使用した）、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ濃度は４μｌ／６ｍｌで使用した。上清を０．２２μｍフィルターに通し、共培養培地で適切に希釈した。
次に、細胞をフローサイトメトリー染色に供した。
洗浄後、これらの細胞を、ＰＢＳ中で、生死判定用色素（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃのＶｉｏｂｉｌｉｔｙ ４０５／５２０ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｙｅ、１μｌ／試料）とヒトＦｃブロック（カタログ番号５６４２１９）（１μｌ／試料）とともに、暗所で室温において１０分間インキュベートした。次に、表面抗体（ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｖｉｏ ７７０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１３−１３６）、ＣＤ４−ＶｉｏＢｌｕｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１４−５３４）、及びＣＤ２５−ＶｉｏＢｒｉｇｈｔ ＦＩＴＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１３−２８３）、各２μｌ）を、暗所で室温において、１０分間にわたってウェルに直接加えた。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３００ｇ／５分／室温でスピンダウンした。
次に、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦｏｘＰ３転写因子染色緩衝液（カタログ番号００−５５２３）を使用して、細胞の固定及び透過処理を行った。ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのプロトコールに従い、１倍濃縮液及び３倍希釈剤を使用して、透過処理／固定緩衝液を調製した。細胞を室温で１時間固定し、次に１倍の透過洗浄液で２回洗浄し、３００ｇ／５分／室温でスピンダウンした。以下の細胞内染色抗体または転写因子抗体を、透過洗浄液（１倍）中の試料に加え、４５分／暗所／室温で、または冷蔵庫で一晩（最長１８時間）おいた後、透過洗浄液（３００μｌ）を使用して抗体を２回洗浄し、ＰＢＳ（２５０μｌ）に再懸濁して、サイトメーターで取得した。
・抗ＩＦＮｙ−ＰＥ Ｖｉｏ７７０ヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１４−０２５）
・抗ＩＬ１０−ＰＥヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１１２−７２８）
・抗ＩＬ１７ａ−ＡＰＣヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９９−２０２）
・抗ＲｏＲｙｔ−ＰＥヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−１０３−８３７）
・抗Ｔｂｅｔ−ＡＰＣヒト抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９８−６５５）
・Ｆｏｘｐ３モノクローナル抗体（２３６Ａ／Ｅ７）、Ｐｅ ｃｙ７（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カタログ番号２５−４７７７−４１
図２７〜図２８に見られるように、ＭＲｘ０００４の上清（ＳＰ４）及び加熱死ＭＲｘ０００４（ＨＫ４）のいずれも、分化を誘導するサイトカインの不存在下（サイトカインなし）であっても、それぞれヘルパーＴ細胞及び細胞傷害性Ｔ細胞の分化を誘導することが可能であった。
ｂＲＡＳＴによりアノテーションされたサブシステムカテゴリの分布［１１４、１１５］。ｎ．ａ．：未割り当て。
ｃＰＳＯＲＴｂ ｖ３．０（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１０ａ）を使用して予測された細胞局在化。Ｃ：細胞質、ＣＭ：細胞膜、ＣＷ：細胞壁、Ｅ：細胞外、ｎ．ｄ．：未特定。
ｄＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）により算出したパラメータ。ＭＷ：分子量、ｐＩ：等電点。
ｂＲＡＳＴによりアノテーションされたサブシステムカテゴリの分布［１１６、１１４］。ｎ．ａ．：未割り当て。
ｃＰＳＯＲＴｂ ｖ３．０を使用して予測された細胞局在化［１１７］。Ｃ：細胞質、ＣＭ：細胞膜、ＣＷ：細胞壁、Ｅ：細胞外、ｎ．ａ．：未割り当て。
ｂＲＡＳＴによりアノテーションされたサブシステムカテゴリの分布［１１６、１１４］。ｎ．ａ．：サブカテゴリ割り当てなし。
実施例１２−ＭＲｘ００４は、脾臓において免疫刺激効果を有する。
要旨
この試験の目的は、脾臓におけるＭＲｘ０００４のインビトロの免疫刺激特性を特性評価することであった。
要旨
この試験の目的は、脾臓におけるＭＲｘ０００４のインビトロの免疫刺激特性を特性評価することであった。
材料及び方法
処理：未処理、１０％ＹＣＦＡ及び１０％Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株ＭＲｘ０００４。
処理：未処理、１０％ＹＣＦＡ及び１０％Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株ＭＲｘ０００４。
脾細胞の調製
脾細胞を、６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した脾臓から新たに調製した。簡潔に述べると、脾細胞を、９６ウェルプレート中の１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５５μＭのβ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ １６４０に９００，０００細胞／ウェルで播種し、１０％の細菌培地ＹＣＦＡ＋（ブランク培地）またはＭＲｘ０５１８の静置培養物からの１０％の無細胞細菌上清に静置またはそれらで刺激して、次に、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で７２時間インキュベートした。その後、無細胞上清を採取し、４℃、５００ｇで５分間スピンダウンした。次に、サイトカイン分析のために試料を採取して−８０℃で保管した。
脾細胞を、６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した脾臓から新たに調製した。簡潔に述べると、脾細胞を、９６ウェルプレート中の１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５５μＭのβ−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ １６４０に９００，０００細胞／ウェルで播種し、１０％の細菌培地ＹＣＦＡ＋（ブランク培地）またはＭＲｘ０５１８の静置培養物からの１０％の無細胞細菌上清に静置またはそれらで刺激して、次に、ＣＯ２インキュベータ内で３７℃で７２時間インキュベートした。その後、無細胞上清を採取し、４℃、５００ｇで５分間スピンダウンした。次に、サイトカイン分析のために試料を採取して−８０℃で保管した。
ＭＴＴアッセイ
ＭＴＴアッセイキットは、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（カタログ番号ＣＴ０１）から購入した。７２時間のインキュベーション後、１０μｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、細胞をＣＯ２インキュベータ内で４時間インキュベートした。その後、１００μｌのイソプロパノール／０．０４Ｍ ＨＣＬ溶液を各ウェルに添加し、波長５６０ｎｍ及び参照波長６５５ｎｍで吸光度を測定した。
ＭＴＴアッセイキットは、Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（カタログ番号ＣＴ０１）から購入した。７２時間のインキュベーション後、１０μｌのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、細胞をＣＯ２インキュベータ内で４時間インキュベートした。その後、１００μｌのイソプロパノール／０．０４Ｍ ＨＣＬ溶液を各ウェルに添加し、波長５６０ｎｍ及び参照波長６５５ｎｍで吸光度を測定した。
サイトカイン分析
製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の推奨に従って２６−ｐｌｅｘ Ｍｏｕｓｅ ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘマルチプレックスイムノアッセイを使用して、サイトカインの定量化を実施した。簡潔に述べると、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）システム（Ｍｅｒｃｋ）をｘＰＯＮＥＮＴソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）とともに用いて、５０μｌの無細胞の共培養上清をサイトカインの定量化に使用した。５パラメータロジスティック曲線及びバックグラウンド除去を用いた、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ａｎａｌｙｓｔソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ）を使用してデータを分析し、平均蛍光強度をｐｇ／ｍｌ値に変換した。
製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の推奨に従って２６−ｐｌｅｘ Ｍｏｕｓｅ ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘマルチプレックスイムノアッセイを使用して、サイトカインの定量化を実施した。簡潔に述べると、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）システム（Ｍｅｒｃｋ）をｘＰＯＮＥＮＴソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）とともに用いて、５０μｌの無細胞の共培養上清をサイトカインの定量化に使用した。５パラメータロジスティック曲線及びバックグラウンド除去を用いた、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）ａｎａｌｙｓｔソフトウェア（Ｍｅｒｃｋ）を使用してデータを分析し、平均蛍光強度をｐｇ／ｍｌ値に変換した。
フローサイトメトリー
まず、細胞をＶｉｏｂｉｌｉｔｙ ４０５／５２０ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｙｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｌｔｄ．Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色して、暗所で室温において１０分間、生細胞と死細胞とを判別した。次に、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＩＦＮ−γに対する抗体の混合物で染色して、細胞の表現型を決定し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＲＥＡ抗体）、室温でさらに１０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄してＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー分析によって直ちに分析した。最初の実験の際に、ゲートの設定を支援するためにすべての抗体に対してアイソタイプを使用し、すべての実験にわたりＦＭＯ対照を含めた。すべての実験は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩを使用して実施し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）を使用して、「生（Ｌｉｖｅ）」ゲート内に１００，０００細胞で設定した取得用のストップゲートを用いた。Ｆｌｏｗｊｏバージョン１０．４．２ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して分析を実施し、分析は、生死判定用色素で特定した生細胞に基づくものであった。
まず、細胞をＶｉｏｂｉｌｉｔｙ ４０５／５２０ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｙｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｌｔｄ．Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で染色して、暗所で室温において１０分間、生細胞と死細胞とを判別した。次に、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８及びＩＦＮ−γに対する抗体の混合物で染色して、細胞の表現型を決定し（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＲＥＡ抗体）、室温でさらに１０分間インキュベートした。次に、細胞を洗浄してＰＢＳに再懸濁し、フローサイトメトリー分析によって直ちに分析した。最初の実験の際に、ゲートの設定を支援するためにすべての抗体に対してアイソタイプを使用し、すべての実験にわたりＦＭＯ対照を含めた。すべての実験は、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩを使用して実施し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｅａｄｉｎｇ，ＵＫ）を使用して、「生（Ｌｉｖｅ）」ゲート内に１００，０００細胞で設定した取得用のストップゲートを用いた。Ｆｌｏｗｊｏバージョン１０．４．２ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）を使用して分析を実施し、分析は、生死判定用色素で特定した生細胞に基づくものであった。
結果
処理後の脾細胞の生存率を、脾細胞の代謝活性を測定するＭＴＴアッセイを使用して評価した。図２９は、ＭＲｘ０００４による処理後に脾細胞が生存可能であることを示す。
処理後の脾細胞の生存率を、脾細胞の代謝活性を測定するＭＴＴアッセイを使用して評価した。図２９は、ＭＲｘ０００４による処理後に脾細胞が生存可能であることを示す。
図３０は、ＭＲｘ０００４による処理により、ＩＬ−６、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−２２、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＦＮ−γ、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４及びＣＸＣＬ２をはじめとする脾臓の様々な炎症性サイトカインが増加したことを示す。これらのデータは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ生菌が免疫系に対して刺激効果を有することを示す。ＭＲｘ０００４がＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞を活性化してＩＦＮγを生成する能力を、図３１に示す。
実施例２及び１１で論じたＰＢＭＣのデータを組み合わせると、これらのデータは、複数の組織においてＴ細胞の活性化及び炎症性サイトカインレベルの上昇により免疫系を刺激する、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種に由来する細菌株の能力を裏付ける。
配列
配列番号１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株のコンセンサス１６Ｓ ｒＲＮＡ配列）
ＧＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＴＧＣＡＣＣＧＧＡＡＴＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧＧＴＡＡＴＧＣＣＧＧＡＴＧＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧＣＧＴＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＣＧＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＴＧＴＴＡＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＧＴＧＴＡＣＣＴＴＴＣＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＧＴＴＣＧＴＣＧＣＧＴＣＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＣＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＡＣＧＧＧＣＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＣＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＴＧＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＡＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＧＴＴＣＣＡＣＧＧＧＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＧＣＧＴＴＡＡＧＣＡＴＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＧＴＴＣＣＣＧＡＣＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＧＧＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＧＧＡＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧＣＣＧＧＧＧＴＴＡＡＣＴＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＣＡＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＡＣＧＧＧＡＴＧＣＧＡＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＧＡＧＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＴＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＧＡＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＫＣ
配列番号２〜５−表７を参照されたい
配列番号１（アクセッション番号ＮＣＩＭＢ ４２３８０で寄託されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ菌株のコンセンサス１６Ｓ ｒＲＮＡ配列）
ＧＧＧＡＣＡＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣＧＡＡＣＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＴＧＧＣＧＡＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＴＧＣＡＣＣＧＧＡＡＴＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＧＧＧＴＧＧＴＡＡＴＧＣＣＧＧＡＴＧＣＴＣＣＡＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＴＧＧＴＧＴＧＴＴＧＧＧＡＡＡＧＣＣＴＴＴＧＣＧＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＧＧＧＴＣＧＣＧＴＣＣＴＡＴＣＡＧＣＴＴＧＡＴＧＧＣＧＧＧＧＴＡＡＣＧＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＧＧＴＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＧＣＧＡＣＣＧＧＣＣＡＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＧＧＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＧＧＧＣＧＣＡＡＧＣＣＴＧＡＴＧＣＡＧＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＡＴＧＧＡＧＧＣＣＴＴＣＧＧＧＴＴＧＴＡＡＡＣＣＴＣＴＴＴＴＧＴＴＡＧＧＧＡＧＣＡＡＧＧＣＡＣＴＴＴＧＴＧＴＴＧＡＧＴＧＴＡＣＣＴＴＴＣＧＡＡＴＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＡＡＣＴＡＣＧＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＴＡＧＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＴＴＡＴＣＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＧＧＧＣＧＴＡＡＡＧＧＧＣＴＣＧＴＡＧＧＣＧＧＴＴＣＧＴＣＧＣＧＴＣＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＧＴＣＣＡＴＣＧＣＴＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＡＣＧＧＧＣＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＣＧＧＴＡＧＧＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＣＣＧＧＴＧＴＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴＡＧＡＴＡＴＣＧＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＴＧＧＣＧＡＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴＣＴＧＧＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＣＧＡＡＡＧＣＧＴＧＧＧＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＡＴＡＣＣＣＴＧＧＴＡＧＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＣＧＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＧＧＧＣＣＣＧＴＴＣＣＡＣＧＧＧＴＴＣＣＧＴＧＴＣＧＧＡＧＣＴＡＡＣＧＣＧＴＴＡＡＧＣＡＴＣＣＣＧＣＣＴＧＧＧＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＡＣＴＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＧＧＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＡＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＴＡＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＡＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＧＣＴＴＧＡＣＡＴＧＴＴＣＣＣＧＡＣＧＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＴＴＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＧＧＴＴＣＡＣＡＧＧＴＧＧＴＧＣＡＴＧＧＴＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＴＧＴＣＧＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣＴＣＧＣＣＣＣＧＴＧＴＴＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＴＧＴＧＣＣＧＧＧＡＡＣＴＣＡＣＧＧＧＧＧＡＣＣＧＣＣＧＧＧＧＴＴＡＡＣＴＣＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＡＴＧＣＣＣＣＴＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＡＣＧＣＡＴＧＣＴＡＣＡＡＴＧＧＣＣＧＧＴＡＣＡＡＣＧＧＧＡＴＧＣＧＡＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＴＧＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＡＴＣＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＴＧＡＡＧＧＣＧＧＡＧＴＣＧＣＴＡＧＴＡＡＴＣＧＣＧＡＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧＴＣＧＣＧＧＴＧＡＡＴＧＣＧＴＴＣＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＴＡＣＡＣＡＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＡＧＴＣＡＴＧＡＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＣＣＣＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＣＣＣＴＧＣＧＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＫＣ
配列番号２〜５−表７を参照されたい
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［８０］Ｃａｎｄｅｌａ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８９（１６），５９２９−５９３６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．００１５９−０７
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［８２］Ｃａｎｄｅｌａ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５５（Ｐｔ １０），３２９４−３３０３．ｄｏｉ：１０．１０９９／ｍｉｃ．０．０２８７９５−０。
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［５］Ｍａｚｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｅｌｌ １５；１２２（１）：１０７−１８。
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［８］Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｉｎｆｌａｍｍ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓ．１６（１２）：２０３４−４２。
［９］Ｍａｃｈｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｇｕｔ．６３（８）：１２７５−８３。
［１０］ＷＯ ２０１３／０５０７９２
［１１］ＷＯ ０３／０４６５８０
［１２］ＷＯ ２０１３／００８０３９
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［１５］Ａｚａｄ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＢＭＪ．３４７：ｆ６４７１。
［１６］Ｏｌｉｖａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ １１２（１），３０−４０。
［１７］Ｐｉｎｔｏ−Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ５１（９），８１４−８１７。
［１８］Ｍｉｒａｇｌｉａ Ｄｅｌ Ｇｉｕｄｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｉｔａｌｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ ４３（１），２５。
［１９］Ｇｒｏｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｇｕｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ４（４），３２５−３３９．ｄｏｉ：１０．４１６１／ｇｍｉｃ．２５４８７。
［２０］ＫＲ２０１００１３５６１２
［２１］Ｃｏａｋｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，５６（１）：９５−１０２
［２２］ＷＯ２０１０／１４３９４０
［２３］ＷＯ２０１７／２０９１５６
［２４］Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｖａｃｃｉｎｅ，２９：１８５５−１８５８
［２５］Ｍａｓｃｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２６：５５７−５６３。
［２６］Ｓｒｕｔｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８７（１）：１０−６。
［２７］ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／ｐｏｌｉｃｙ−ａｎｄ−ｐｕｂｌｉｃ−ａｆｆａｉｒｓ／ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ−ａｎｄ−ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｔａｔｅｍｅｎｔｓ／ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
［２８］Ｍａｒｃｉａｎｏ ａｎｄ Ｈｏｌｌａｎｄ（２０１７）Ｒｅｖｉｅｗ ａｒｔｉｃｌｅ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１７．００９３７
［２９］Ｒｅｎ ａｎｄ Ｔｏｒｒｅｓ（２００９）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．；６０（１）：５７−６４
［３０］Ｍａｒｔｉｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．；１０（２）：４１７−２６。
［３１］Ｇａｕｒ ａｎｄ Ａｇｇａｒｗａｌ（２００３）．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．；６６（８）：１４０３−８。
［３２］Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｌｉｎ（２００８）Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．；２９（１１）：１２７５−１２８８。
［３３］Ｂｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ．；２７（３）：６３−６７
［３４］Ｄｏｗｌｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎｓｅｌｌ（２０１６）Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１６ Ｍａｙ；５（５）：ｅ８５。
［３５］Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ（２０１８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，４１，３４−４１。
［３６］Ｌｉｍ（２０１５）Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ １４，９０７−９１５
［３７］Ｌｉ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７８（８），５２７１−５２７６
［３８］Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６９（３），１４３３−１４４３
［３９］Ｂｅｒｔｈｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４０（１）３３−４１
［４０］Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２），Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４２，２７０９−２７１９
［４１］Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，３２（３）：８０１−８０８。
［４２］Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ．２０１５；３：１。
［４３］Ｇｌｅｎｎ ａｎｄ Ｗｈａｒｔｅｎｂｙ（２０１４）Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．；６（５）：５２６−５３９。
［４４］Ｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｒｅｓ．２００４ Ａｐｒ １；６２（１）：３４−４２。
［４５］Ｒａｓｈｉｄｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ２４，Ｉｓｓｕｅ ６，Ｐａｇｅｓ １２６０−１２６３
［４６］Ｆｕｌｏｐ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇ．２０１３；１８（６）：４８９−５１３。
［４７］Ｂｅｋｔａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ．；１０２（４）：９７７−９８８。
［４８］Ｆｕｌｏｐ ｅｔ ａｌ（２０１６）Ｒｅｖ Ｉｎｖｅｓｔ Ｃｌｉｎ．；６８（２）：８４−９１。
［４９］Ｆｕｌｏｐ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．；８：１９６０。
［５０］Ｍｉｙａｍｏｔｏ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５４，９−２４。
［５１］Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｙｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｅｄ．ｂｙ Ｄａｙ ａｎｄ ＭｃＬｅｌｌａｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ。
［５２］Ｌｅｓｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１，３５９２−３５９７。
［５３］Ｍｉｔｒｏｐｏｕｌｏｕ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｎｕｔｒ Ｍｅｔａｂ．（２０１３）７１６８６１。
［５４］Ｋａｉｌａｓａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ Ｉｓｓｕｅｓ Ｉｎｔｅｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３（２）：３９−４８。
［５５］Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９４），Ａ Ｗａｄｅ ａｎｄ ＰＪ Ｗｅｌｌｅｒにより編集
［５６］Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．１９８５）
［５７］ＵＳ ２０１６／００６７１８８
［５８］Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１０）Ｒｏｎａｌｄ Ａｔｌａｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ。
［５９］Ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ（１９９６）Ｊｅｎｎｉｅ Ｃ．Ｈｕｎｔｅｒ−Ｃｅｖｅｒａ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
［６０］Ｓｔｒｏｂｅｌ（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．５８１：２４７−６１。
［６１］Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２。
［６２］Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ，（Ｒｅａｍ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。
［６３］Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）
［６４］Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
［６５］Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
［６６］Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）
［６７］Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）（２００２）Ｓｈｏｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）。
［６８］ＰＣＲ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ），２ｎｄ ｅｄ．（Ｎｅｗｔｏｎ ＆ Ｇｒａｈａｍ ｅｄｓ．，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ）
［６９］Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ３０
［７０］Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９
［７１］Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９
［７２］Ｕｎｔｅｒｇａｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３５（ウェブサーバー発行），Ｗ７１−７４．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｍ３０６。
［７３］Ｈｅｂｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １６（１），１６９．ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１２８５９−０１５−０６１１−３。
［７４］Ｒｕｉｚ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７，１１９３．ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１６．０１１９３。
［７５］Ｆａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０９（６），２１０８−２１１３
［７６］Ｃｈｒｉｓｔｉａｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９（５），ｅ９８１１１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９８１１１
［７７］ＭｃＣａｒｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ８３（１９），ｅ０１３２３−０１３１７．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＥＭ．０１３２３−１７。
［７８］Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｆｅｍｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３５１（２），１１６−１２５．ｄｏｉ：１０．１１１１／１５７４−６９６８．１２３６５。
［７９］Ｂｅｒｇｏｎｚｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７４（１），４２５−４３４．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＩＡＩ．７４．１．４２５−４３４．２００６。
［８０］Ｃａｎｄｅｌａ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８９（１６），５９２９−５９３６．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＢ．００１５９−０７
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［１０６］Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８９，６１２８−６１３９
［１０７］Ｔｅｎｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３３，２２３３−２２３９
［１０８］Ｌａｗ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７７（２４），７０１１−７０１８。
［１０９］Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｋｕｓｈｎｅｒ，（１９９１）Ｇｅｎｅ １００，１９５−１９９。
［１１０］ｄｅ Ｒｕｙｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ６２（１０），３６６２−３６６７。
［１１１］Ａｌｖａｒｅｚ−Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７６（６），１３９５。
［１１２］Ｃｒｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ７３（２４），７８５８−７８６６。
［１１３］Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ Ｍｏｔｈｅｒｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）ＭｉｃｒｏｂｉａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１），６７−７９。
［１１４］Ａｚｉｚ ｅｔ ａｌ．，２００８ ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９，７５．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１６４−９−７５。
［１１５］Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９（５），ｅ９５４４１．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９５４４１。
［１１６］Ｏｖｅｒｂｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１７），５６９１−５７０２。
［１１７］Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２６（１３），１６０８−１６１５。
Claims (30)
- 対象の免疫系を刺激するのに使用するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物。
- 前記組成物が、対象の免疫不全症の処置に使用するためのものである、請求項１に記載の組成物。
- 前記免疫不全症が、原発性免疫不全症または続発性免疫不全症である、請求項２に記載の組成物。
- 前記原発性免疫不全症が選択される、請求項３に記載の組成物。
- 前記続発性免疫不全症が、ＡＩＤＳ、白血病などの免疫系のがん、ウイルス性肝炎、多発性骨髄腫などの免疫複合体疾患から選択される、請求項３に記載の組成物。
- 前記組成物が、ワクチンアジュバントとして使用するためのものである、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、免疫老化の処置、予防、または遅延に使用するためのものである、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、ＣＡＲ−Ｔなどの細胞療法を増強するのに使用するためのものである、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＴＮＦ−αならびに／またはＩＬ−１７αの発現レベル及び／もしくは活性の上昇に使用するためのものである、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物が、ＴＬＲ２を刺激するのに使用するためのものである、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物が、ＮＦκＢを刺激するのに使用するためのものである、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
- 前記細菌株が、完全な菌体外多糖遺伝子座を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の組成物。
- 前記細菌株が、プルラナーゼを発現する、請求項１〜１２のいずれかに記載の組成物。
- 細菌感染症の処置または予防に使用するための、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物。
- 前記組成物が、胃腸細菌感染症の処置または予防に使用するためのものである、請求項１４に記載の組成物。
- 前記組成物が、グラム陰性菌感染症の処置または予防に使用するためのものである、請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
- 前記細菌株が、配列番号１と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％もしくは９９．９％同一である１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有するか、または配列番号１によって表される１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の組成物。
- 前記細菌株が、ラフィノースを発酵させることができる、請求項１〜１７のいずれかに記載の組成物。
- 前記細菌株が、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ、α−アラビノース、マンノース及びラフィノースのうちの１または２以上、例えば２、３、４、５、６または７つすべてを発酵させることができる、請求項１〜１８のいずれかに記載の組成物。
- 前記細菌株が、アクセッション番号４２３８０でＮＣＩＭＢに寄託された菌株である、請求項１〜１９のいずれかに記載の組成物。
- 経口投与用である、請求項１〜２０のいずれかに記載の組成物。
- 前記組成物が、１もしくは２以上の薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の組成物。
- 前記細菌株が、凍結乾燥されている、請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物。
- Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ種の細菌株を含む組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、免疫刺激の低減に関連する疾患もしくは状態を処置または予防する方法。
- 請求項１〜１９のいずれかに記載された細菌株の細胞を含む組成物であって、前記細胞が１または２以上の異種抗原を発現する、前記組成物。
- 前記細胞が、前記１または２以上の異種抗原を提示する、請求項２５に記載の組成物。
- ワクチンとして使用するための、請求項２５または請求項２６に記載の組成物。
- 請求項１〜２３のいずれかに記載された細菌株の細胞であって、前記細胞が１または２以上の異種抗原を発現する、前記細胞。
- 前記細胞が、前記１または２以上の異種抗原を提示する、請求項２８に記載の細胞。
- ワクチンとして使用するための、請求項２８または請求項２９に記載の細胞。
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