TW202017945A - 抗ｃｄ７３抗體、其抗原結合片段及應用 - Google Patents
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Abstract
本公開涉及抗CD73抗體、其抗原結合片段及應用。具體地，本公開公開包含特定CDR區的鼠源、嵌合或人源化抗CD73抗體及其抗原結合片段。本公開還公開包含所述抗CD73抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為CD73相關疾病診斷劑和治療藥物的用途。
Description
本公開屬於生物技術領域，更具體地，本公開涉及抗CD73抗體及其應用。
這裡的陳述僅是提供與本公開有關的背景信息，而不必然地構成現有技術。
CD73又稱胞外-5'-核苷酸酶(Ecto-5'-Nucleotidase，EC3.1.3.5,ecto-5'-NT)，是藉由糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨定於質膜的一種糖蛋白。CD73廣泛表達於人體多種組織細胞表面，例如內皮細胞、淋巴細胞、Treg等細胞。近來，研究發現CD73在多種腫瘤中高表達，大量研究證實CD73與腫瘤的發生發展密切相關。
編碼人CD73的基因位於染色體6q14-q21。CD73的進化相對保守，編碼人CD73的DNA序列與鼠的DNA序列有86%的同源性。CD73基因由57kbp組成，編碼區長1725bp。CD73基因組啟動子區序列中G+C的比例較高，其中有許多轉錄因子的結合位點，包括1個cAMP反應元件(eRE)、5個Sp-
1結合位點、2個Ap- 2結合位點、1個缺氧反應元件(HRE)、1個TCF/LEF結合位點。在啟動子上游區域有3個GATA盒、2個MyoD位點、IgH及NF-κb結合位點，還有3個C-EBP位點。人CD73前體蛋白由574個胺基酸殘基組成。CD73分子N末端第1-26位胺基酸殘基及C末端第550-574位胺基酸殘基被剪切後，第27-549位胺基酸殘基序列即為成熟CD73，形成1個分子量約為70KD的亞單位。由兩個亞單位構成具有生物活性的同源二聚體。成熟CD73中包括5個N-連接糖化位點；C端胺基酸序列是GPI錨定序列，其中第523位絲胺酸作為錨定位點，藉由GPI錨定在細胞外膜。CD73可因內源性磷脂酶C水解GPI而從質膜表面脫落，進而腺苷生成降低。
CD73廣泛表達於人體內皮細胞、淋巴細胞等組織細胞表面。CD73具有胞外核苷酸酶活性，水解AMP產生具有免疫抑制作用的腺苷。腺苷與受體結合可促進血管新生、預防組織缺血再灌注損傷、抑制炎症和免疫反應。最近發現腺苷能夠抑制人類血管內皮細胞的前炎症反應。CD73還具有非水解酶活性，參與細胞的粘附和信號轉導。
CD73在腫瘤發生發展中發揮重要作用。CD73參與腫瘤血管生成，有關有研究顯示，CD73可促進體內有B16F10黑色素瘤細胞的C57BL/6小鼠的新生血管形成。在藥理學上抑制CD73可降低新生血管的數量並阻礙新生血管的成熟，從而減弱黑色素瘤的血管生成。另有研究發現，對荷瘤小鼠進行抗CD73單株抗體治療可降低腫瘤的血管生成。基於CD73的酶與非酶功能，其也能促進微血管內皮細胞的轉移並形成管狀結構。CD73藉由上調細胞增殖蛋白D1來誘導上皮細胞增長。此外，CD73產生的腺苷可藉由A2A受體導致的組織缺氧促進VEGF的生成和釋放，支持新血管的生成。
其次，體內外的研究均表明，CD73可促進腫瘤細胞的生長。ZHI等(Cancer Sci,2010,101(12)：2561-2569)的研究結果顯示，藉由siRNA抑制CD73的表達可阻斷細胞週期循環和細胞凋亡，從而抑制乳腺癌細胞的增殖與分化。使用CD73酶活性的特異性抑制劑5’-α,β-亞甲基-二磷酸腺苷(APCP)也能以劑量依賴的方式抑制腫瘤細胞的增殖。而在轉染CD73的乳腺癌細胞中，CD73的過表達增加了細胞活性並促進了細胞週期。有學者發現APCP能使神經膠質瘤細胞的增殖下降30%，而腺苷則使細胞的增殖增加35%。Stagg J等(PNAS,2010,107(4)：1547-1552)發現CD73的活性在惡性程度較高的膀胱癌細胞中顯著增高，證實嘌呤信號途徑促進膀胱腫瘤的形成。另外CD73還可以促進結腸癌細胞、黑色素瘤細胞和淋巴瘤細胞的生長。最近研究發現CD73表達上調的白血病T淋巴細胞能特異性地抑制TRAIL誘導的凋亡，並誘導細胞產生多藥耐藥，從而促進腫瘤細胞的生存。
此外，腫瘤細胞表面表達的腫瘤來源的CD73是腫瘤發生免疫逃逸的重要原因。RYZHOV等人(J Immunol,2011,187(11)：6120-6129)還發現腫瘤中的CD73與MDSC的滲透和聚集相關，而MDSC是有著抑制T細胞活化功能的未成熟骨髓細胞，腫瘤微環境中的腺苷也可以幫助Treg抑制免疫活性。因此CD73可以藉由抑制免疫反應間接促進腫瘤的進展。
CD73除了上述在腫瘤中的作用，還被發現與腫瘤轉移密切相關。獲得侵襲性表型，增加腫瘤細胞的遷移能力是腫瘤轉移的首要條件。CD73與轉移相關標誌物之間的關聯已被發現。相比未發生轉移的前列腺癌，CD73水平在前列腺癌淋巴轉移的患者中明顯升高，表明CD73在腫瘤細胞轉移的過程中可能扮演著重要的角色。XIONG等(Cell Tissue Res,2014,355(2)：365-374)證明CD73
可藉由誘導腫瘤細胞的間質轉化來促進細胞的轉移和侵襲。STAGG和WANG等(Cancer Res,2011,71(8)：2892-2900；J Cancer Res Clin Oncol,2008,134(3)：365-372)發現體內CD73缺陷的小鼠能在靜脈注射B16F10黑色素瘤細胞後抵抗腫瘤肺轉移的發生，而且宿主CD73缺陷能增強腫瘤T細胞特異性抗原歸位到腫瘤中。在臨床腫瘤患者中，也有研究揭示了腫瘤中CD73的過表達與胃癌、前列腺癌和惡性黑色素瘤的轉移相關。上述結果證明宿主CD73和腫瘤CD73都能顯著促進腫瘤轉移，而宿主CD73缺陷對腫瘤轉移的抵抗作用與增強的內源性抗腫瘤免疫相關。
目前已見US9938356、US9605080、WO2016075099、WO2017152085、WO2017064043、WO2018013611等專利報道了CD73有關的抗體。
本申請的發明人經過大量的實驗，開發了新的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中：
在一些實施方式中，本公開公開一種與人CD73特異性結合的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中該抗體包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中：
該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：27、28和29所示的輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3或包含與如SEQ ID NO：27、28和29所示的序列分別具有不超過3個胺基酸突變的LCDR變體；
該重鏈可變區包含：
i)分別如SEQ ID NO：10、11、12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3或與如SEQ ID NO：10、11、12所示的序列分別具有不超過3個胺基酸突變的HCDR變體；或
ii)分別如SEQ ID NO：16、17、18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3或與如SEQ ID NO：16、17、18所示的序列分別具有不超過3個胺基酸突變的HCDR變體；或
iii)包含分別如SEQ ID NO：22、67和24所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3或與如SEQ ID NO：22、67和24所示的序列分別具有不超過3個胺基酸突變的HCDR變體；
在其中一些實施方式中，上述不超過3個胺基酸突變為3個、2個、1個或0個胺基酸突變。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段以等於或小於10-7M解離平衡常數與人CD73結合，在一些實施方式中，以等於或小於10-8M、10-9M、10-10M或10-11M解離平衡常數與人CD73結合。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段包含：
iv)分別如SEQ ID NO：10、11、12、13、14和15所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
v)分別如SEQ ID NO：16、17、18、19、20和21所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
vi)如SEQ ID NO：23、68、69、70、71、72、73、74、75或76所示的HCDR2和分別如SEQ ID NO：22、24、25、14和26所示的HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段包含：
vii)分別如SEQ ID NO：22、23、24、25、14和26所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
viii)分別如SEQ ID NO：22、71、24、25、14和26所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
ix)分別如SEQ ID NO：22、76、24、25、14和26所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該抗體是重組抗體，較佳為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其為鼠源或嵌合抗體，其選自以下A-C任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段：
(A)包含如SEQ ID NO：4所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：5所示的輕鏈可變區的抗CD73抗體或其抗原結合片段；
(B)包含如SEQ ID NO：6所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：7所示的輕鏈可變區的抗CD73抗體或其抗原結合片段；
(C)包含如SEQ ID NO：8所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：9所示的輕鏈可變區的抗CD73抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該抗體為人源化抗體，該抗體的輕鏈框架區(FR)和重鏈框架區區序列分別來源於人種系輕鏈和重鏈或其突變序列；較佳地，該人源化抗體包含選自以下D-F中的任一項：
(D)分別如SEQ ID NO：10、11、12、13、14和15所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及重鏈框架區和輕鏈框架區；且
該重鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：6Q、10G、30K、37V、44G、49G和94G；該輕鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：36L、42G、44I、60K、69S、71Y和85D；
(E)分別如SEQ ID NO：16、17、18、19、20和21所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及重鏈框架區和輕鏈框架區；且
該重鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：38K、44G、48I、66K、67A、69L和71A；該輕鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：36L、42G、44I、66R、71Y和85D；和
(F)如SEQ ID NO：23、68、69、70、71、72、73、74、75或76所示的HCDR2和分別如SEQ ID NO：22、24、25、14和26所示的HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及重鏈框架區和輕鏈框架區；且
該重鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：38M、44S、48I、67A、69L、71V、73K、82A R和94T；該輕鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：36L、42G、44L、69S、70D和71Y；其中，該回復突變的位點根據Kabat編號規則編號。在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該抗體包含如SEQ ID NO：30、41或49所示的重鏈可變區或其變體。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該重鏈可變區變體是在SEQ ID NO：30、41或49所示的重鏈可變區的FR區位置上具有1-10個胺基酸的回復突變；
在一些實施方式中，本公開所述的重鏈可變區變體選自以下G-I任一項：
(G)在如SEQ ID NO：30所示的重鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：E6Q、V10G、S30K、I37V、L44G、A49G和R94G；
(H)在如SEQ ID NO：41所示的重鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：R38K、R44G、M48I、R66K、V67A、I69L和R71A；和
(I)在如SEQ ID NO：49所示的重鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：R38M、G44S、M48I、V67A、M69L、R71V、T73K、S82AR和R94T。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含選自以下J-L任一項所述的重鏈可變區：
(J)如SEQ ID NO：30、37、38、39或40所示的重鏈可變區；
(K)如SEQ ID NO：41、45、46、47或48所示的重鏈可變區；和
(L)如SEQ ID NO：49、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66所示的重鏈可變區。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該抗體包含如SEQ ID NO：31、41或50所示的輕鏈可變區或其變體。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該輕鏈可變區變體是在SEQ ID NO：31、41或50所示的輕鏈可變區的FR區位置上具有1-10個胺基酸的回復突變。
在一些實施方式中，本公開所述的輕鏈可變區變體選自以下M-O任一項：
(M)在如SEQ ID NO：31所示的輕鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：36L、42G、44I、60K、69S、F71Y和T85D；
(N)在如SEQ ID NO：42所示的輕鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：Y36L、K42G、P44I、G66R、F71Y和T85D；和
(O)在如SEQ ID NO：50所示的輕鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：Y36L、K42G、P44L、T69S、E70D和F71Y。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含選自以下P-R任一所述的輕鏈可變區：
(P)如SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36所示的輕鏈可變區；
(Q)如SEQ ID NO：42、43或44所示的輕鏈可變區；和
(R)如SEQ ID NO：50、51、52或53所示的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含選自以下S-U任一項所述的重鏈可變區和輕鏈可變區：
(S)重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：30、37、38、39或40所示或與SEQ ID NO：41、45、46、47或48具有至少95%序列同一性，且輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36所示或與SEQ ID NO：42、43或44具有至少95%序列同一性；
(T)重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：41、45、46、47或48所示或與SEQ ID NO：41、45、46、47或48具有至少95%序列同一性，且輕鏈可變區胺基酸序
列如SEQ ID NO：42、43或44所示或與SEQ ID NO：42、43或44具有至少95%序列同一性；和
(U)重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：49、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66所示或與SEQ ID NO：49、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66具有至少95%序列同一性，且輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：50、51、52或53所示或與SEQ ID NO：50、51、52或53具有至少95%序列同一性。
在一些實施方式中，本公開所述抗CD73抗體或其抗原結合片段包含選自以下V-W任一項：
(V)如SEQ ID NO：39所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：36所示的輕鏈可變區；
(W)如SEQ ID NO：41所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：43所示的輕鏈可變區；和
(X)如SEQ ID NO：61所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：52所示的輕鏈可變區。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段包含恆定區。
在一些實施方式中，本公開的抗體為嵌合抗體或人源化抗體，其重鏈恆定區來源於人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的突變序列，輕鏈恆定區來源於人源κ、λ鏈或其突變序列。
在一些實施方式中，本公開的抗體重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示或與SEQ ID NO：77具有至少85%序列同一性，輕鏈恆定
區的胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示或與SEQ ID NO：78具有至少85%序列同一性。
在一些具體實施方式中，上述具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，是具有至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些具體實施方式中，上述具有至少85%序列同一性的胺基酸序列包括藉由一個或者多個胺基酸缺失、插入或替換突變獲得。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，該抗體選自以下iv)-vi)任一項所述的抗體：
iv)包含如SEQ ID NO：79所示或與SEQ ID NO：79具有至少85%序列同一性的重鏈和如SEQ ID NO：80所示或與SEQ ID NO：80具有至少85%序列同一性的輕鏈的抗CD73抗體；
v)包含如SEQ ID NO：81所示或與SEQ ID NO：81具有至少85%序列同一性的重鏈和如SEQ ID NO：82所示或與SEQ ID NO：82具有至少85%序列同一性的輕鏈的抗CD73抗體；和
vi)包含如SEQ ID NO：83所示或與SEQ ID NO：83具有至少85%序列同一性的重鏈和如SEQ ID NO：84所示或與SEQ ID NO：84具有至少85%序列同一性的輕鏈的抗CD73抗體。
在一些實施方式中，本公開的上述具有至少85%序列同一性的胺基酸序列，是具有至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性的胺基酸序列。
在一些具體實施方式中，上述具有至少85%序列同一性的胺基酸序列包括藉由一個或者多個胺基酸缺失、插入或替換突變獲得；在一些具體實施方式中，上述具有至少85%序列同一性的胺基酸序列是藉由對抗體輕、重鏈胺基酸序列的框架區或恆定區進行一個或者多個胺基酸缺失、插入或替換突變獲得。
在一些實施方式中，本公開的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段為選自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、雙抗體和dsFv。
在一些實施方式中，本公開公開一種分離的單株抗體或其抗原結合片段，該抗體或其抗原結合片段與前述任一項所述的抗體或其抗原結合片段競爭性結合人CD73，或與前述任一項所述的抗體或其抗原結合片段結合相同的人CD73抗原表位和或猴CD73抗原表位。
在一些實施方式中，本公開公開一種核酸分子，其編碼前述任一項所述抗CD73抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方式中，本公開公開一種載體，其包含前述的核酸分子。
在一些實施方式中，本公開公開一種宿主細胞，其由前述的重組載體轉化獲得；該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，在一些實施方式中，為真核細胞，在一些實施方式中，為哺乳動物細胞；該宿主細胞不包括任何能夠發育成完整個體的人細胞，如人胚胎乾細胞、受精卵、生殖細胞。
在一些實施方式中，本公開公開一種製備前述任一項所述抗CD73抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括以下步驟：
在適合的培養基中、在適於生長的條件下培養前述宿主細胞，然後從該培養基中純化並回收抗CD73抗體或其抗原結合片段的步驟。
在一些實施方式中，本公開公開一種醫藥組成物，其含有前述任一項該的宿主細胞表達的抗CD73抗體或其抗原結合片段或核酸分子，以及一種或多種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
在一些實施方式中，該醫藥組成物單位劑量中可含有0.01至99重量%的抗CD73抗體或其抗原結合片段；在一些實施方式中，醫藥組成物單位劑量中含單株抗體或其抗原結合片段的量為0.1-2000mg；在另外一些實施方式中，醫藥組成物單位劑量中含單株抗體或其抗原結合片段的量為1-1000mg。
在一些實施方式中，本公開公開用於體外檢測待測樣本中人CD73的方法，該方法包括：使用前述任一項所述抗CD73抗體或其抗原結合片段或前述醫藥組成物接觸待測樣本；
確定該待測樣本中人CD73的存在或水平。
在一些實施方式中，本公開公開前述任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段、核酸分子、或醫藥組成物在製備用於治療或預防疾病或病症的藥物中的用途。在一些實施方式中，其中該疾病或病症是CD73相關的疾病或病症。
在一些實施方式中，該CD73相關的疾病或病症為細胞增殖性疾病，在一些實施方式中，該細胞增殖性疾病為腫瘤。
在一些實施方式中，該腫瘤為乳腺癌、神經膠質瘤、膀胱癌、結腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、甲狀腺癌、食道癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、淋巴瘤、前列腺癌或胃癌，在一些實施方式中，該腫瘤為轉移性腫瘤。
在一些實施方式中，本公開公開一種治療或預防CD73相關的疾病或病症的方法，該方法包括向受試者施用治療有效量的前述任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段、編碼其的核酸分子或含有其的醫藥組成物；在一些實施方式中，該疾病為細胞增殖性疾病；在一些實施方式中，該細胞增殖性疾病為腫瘤；在一些實施方式中，該腫瘤為乳腺癌、神經膠質瘤、膀胱癌、結腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、甲狀腺癌、食道癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、淋巴瘤、前列腺癌或胃癌；在一些實施方式中，該腫瘤為轉移性腫瘤。
在一些實施方式中，本公開公開一種用於治療或預防疾病(例如細胞增殖性疾病)的抗CD73抗體或其抗原結合片段、或含有其的醫藥組成物、或編碼其的核酸分子，該治療或預防包括向受試者施用藥物有效量的前述任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段、或醫藥組成物、或核酸分子。在一些實施方式中，該細胞增殖性疾病為腫瘤，在一些實施方式中，該腫瘤為乳腺癌、神經膠質瘤、膀胱癌、結腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、甲狀腺癌、食道癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、淋巴瘤、前列腺癌或胃癌；在一些實施方式中，該腫瘤為轉移性腫瘤。
在一些實施方式中，本公開公開一種用作藥物的前述的抗CD73抗體或其抗原結合片段、編碼其的核酸分子或包含其的醫藥組成物；較佳的，該藥物可用於治療或預防與人CD73相關的疾病或病症；更佳，該藥物可用於治療細胞增殖性疾病，較佳為腫瘤，更佳為乳腺癌、神經膠質瘤、膀胱癌、結腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、甲狀腺癌、食道癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、淋巴瘤、前列腺癌或胃癌。
第1圖為抗CD73抗體結合人CD73蛋白的ELISA實驗結果；
第2圖為抗CD73抗體結合食蟹猴CD73蛋白的ELISA實驗結果；
第3圖為抗CD73抗體與MDA-MB-231細胞的結合實驗結果；
第4圖為抗CD73抗體對MDA-MB-231細胞酶活性抑制的實驗結果；
第5圖為抗CD73抗體誘導CD4+ T細胞體外增殖的實驗結果；
第6圖為抗CD73抗體對MDA-MB-231荷瘤小鼠移植瘤的腫瘤體積影響；
第7圖為抗CD73抗體對MDA-MB-231-Luc肺轉移的抑制實驗，縱坐標顯示腫瘤細胞在肺中的生物發光值；
第8圖為抗CD73抗體對MDA-MB-231-Luc肺轉移的抑制實驗，縱坐標顯示肺腫瘤的相對生物發光值。
雖然目前已見相關文獻報導有關抗CD73抗體，但尚無上市的CD73抗體產品用於臨床。本申請的發明人經過大量的試驗，開發了具有良好生物活性的新的抗CD73抗體或其抗原結合片段。
為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中該。
本公開所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本公開中，本公開所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本公開中，本公開所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區和4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公開所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR1-3)。
術語“互補決定區”、“CDR”或“高變區”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。通常，每個重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各種公知方案中的任何一種來確定CDR的胺基酸序列邊界，包括“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則(參見Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003)等。例如，對於經典格式，遵循Kabat規則，該重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia規則，VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且VL中的胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。藉由組合Kabat和Chothia兩者的CDR定義，CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)構成。遵循IMGT規則，VH中的CDR胺基酸殘基編號大致為26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT規則，抗體的CDR區可以使用程序IMGT/DomainGap Align確定。
本公開的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，選較佳人源化抗體。
術語“鼠源抗體”在本公開中為根據本領域知識和技能製備的對人CD73的單株抗體。製備時用CD73抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本公開一個選較佳的實施方案中，該鼠源CD73抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將某物種(如鼠)的抗體的可變區與另一物種(如人)抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因；再根據需要選殖人抗體的恆定區基因；將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。在本公開一個較佳的實施方案中，該CD73嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。該CD73嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG1、IgG2、IgG3、IgG4變體的重鏈恆定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變(如YTE或S228P等)的IgG1、IgG2或IgG4變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，包括CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的
種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。為避免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變(回復突變，即將人抗體來源的FR區胺基酸殘基突變成原始來源抗體對應位置的胺基酸殘基)，以保持活性。
CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基而導致產生的CD73抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人CD73抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查鼠單株抗體可變區序列和結構來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數的鼠序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中發揮重要作用。
術語“胺基酸突變”是指相較於原蛋白質或多肽，變體蛋白質或多肽存在胺基酸的改變或突變，包括在原蛋白質或多肽的基礎上发生1個或數個胺基酸的插入、缺失或替換。例如“具有不超過3個胺基酸突變的變體”，是指與原蛋白質或多肽相比，具有3個、2個、1個或0個胺基的插入、缺失或替換。
術語抗體的“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，CD73)的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的
片段來實現抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，藉由鉸鏈區上的二硫桥連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(iv)單結構域或dAb片段((Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；(v)dsFv，由VH和VL經鏈間二硫鍵形成的穩定的抗原結合片段；和(vi)包含scFv、dsFv、Fab等片段的雙抗體、雙特異性抗體和多特異性抗體。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能够產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv))；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。
本公開的抗原結合片段包括Fab、F(ab')2、Fab'、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)等。
Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子，在所獲得的片段中具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。
本公開的Fab可以藉由用木瓜蛋白酶處理本公開的特異性識別人CD73並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由將編碼該抗體的Fab的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab來生產該Fab。
F(ab')2是藉由胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量約100,000並具有抗原結合活性的抗體片段，其所包含的兩個Fab區在鉸鏈位置相連。
本公開的F(ab')2可以藉由用胃蛋白酶處理本公開的特異性識別人CD73並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由用硫醚鍵或二硫鍵連接下面描述的Fab'來生產該F(ab')2。
Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。本公開的Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理本公開的特異性識別CD73並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的F(ab')2來生產。
此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含通過接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合适的現有技術接頭由重復的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重復的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-
6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
本公開的scFv可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別人CD73並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達scFv。
雙抗體是其中scFv被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。
本公開的雙抗體可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別人CD73並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA以使肽接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。
dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering,7,697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。
本公開的dsFv可以藉由以下步驟來生產：獲得本公開的特異性識別人CD73並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的
編碼cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。
本公開的包含CDR的肽可以藉由以下步驟來生產：構建本公開的特異性識別人CD73並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的CDR的編碼DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達該肽。也可以藉由化學合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法來生產該包含CDR的肽。
本文中使用的術語“抗體框架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作该可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，框架區是不具有CDR的可變結構域。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位(例如，CD73分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大约小於10-7M，例如大约小於10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或更小的親和力(KD)結合。
術語"KD"或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本公開的抗體以小於大约10-7M，例如小於大约10-8M、10-9M或10-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合CD73，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中測定的。
當術語“競爭”用於競爭相同表位的抗原結合蛋白(例如中和性抗原結合蛋白或中和性抗體)的情況中時，意指在抗原結合蛋白之間競爭，其藉由以下測定法來測定：在該測定法中，待檢測的抗原結合蛋白(例如抗體或其學功能片段)防止或抑制(例如降低)參考抗原結合蛋白(例如配體或參考抗體)與共同抗原(例如CD73抗原或其片段)的特異性結合。眾多類型的競爭性結合測定可用於確定一種抗原結合蛋白是否與另一種競爭，這些測定例如：固相直接或間接放射免疫測定(RIA)、固相直接或間接酶免疫測定(EIA)、夾心競爭測定(參見例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619；Cheung，等，1990，Virology176：546-552)、固相直接標記測定、固相直接標記夾心測定(參見例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗體，實驗室手冊)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125標記物的固相直接標記RIA(參見例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-親和素EIA(參見例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接標記的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)。通常該測定法涉及使用能與帶有未標記的檢測抗原結合蛋白及標記的參考抗原結合蛋白結合的純化抗原(該抗原在固態表面或細胞表面)。在待測抗原結合蛋白存在下，測量結合於固態表面或細胞的標記的量，來測量競爭性抑制。通常，待測抗原結合蛋白是過量存在的。由競爭性測定(競爭抗原結合蛋白)鑒定的抗原結合蛋白包括：結合與參考抗原結合蛋白同一表位的抗原結合蛋白；和結合充分接近參考抗原結合蛋白的結合表位的鄰近表位的抗原結合蛋白，該兩個表位在空間上互相妨礙發生結合。在本文實施例中提供關於用於測定競爭性結合的方法的其它詳細資料。通常當競爭的抗原結合蛋
白過量存在時，其將抑制(例如降低)至少40-45%、45-50%、50-55%、55-60%、60-65%、65-70%、70-75%或更多參考抗原結合蛋白與共同抗原的特異性結合。在某些情況下，結合被抑制至少80-85%、85-90%、90-95%、95-97%或更多。
本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增强子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增强子有效地連接至該編碼序列。
術語“載體”是指能够運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環状雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能够在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人CD73或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明該的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，將編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人CD73特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、
藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本公開的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Ktuskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第
224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破環生物學活性。示例性保守取代於下表中陳述。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。
本公開所述的“突變序列”是指對核苷酸序列或胺基酸序列進行適當的替換、插入或缺失等突變修飾情況下，得到的與本公開的核苷酸序列和胺基酸序列具有不同百分比序列同一性程度的核苷酸序列和胺基酸序列。本公開中所述的序列同一性可以至少為85%、90%或95%，非限制性實施例包括85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%。
“同源性”、“同一性”、“一致性”在本文中可以互換，是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的同一個位置都被相同的鹼基佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的全部位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。本公開的一些具體實施例中，抗體序列具有至少85%序列同一性，在
另外一些具體實施例中，其具有至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列一致性，在另外一些具體實施例中，其具有90%、95%或99%以上序列同一性，在另外一些具體實施例中，其具有至少95%序列一致性，上述含有特定百分比同一性的胺基酸序列可以是藉由一個或者多個胺基酸缺失、插入或替換突變獲得。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程序或技術。一般來說，需要獲得來自目標區域末端或之外的序列信息，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增模板的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文該抗體或其抗原結合片段與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
本文所用“預防”包括延緩與疾病有關的症狀的發展和/或減輕該疾病將要或預期發展的這些症狀的嚴重程度。該術語還包括減緩已有症狀、防止另外的症狀和減緩或防止這些症狀的潛在原因。因此，該術語表示業已將有益結果賦予患有疾病的脊椎動物對象。
此外，本公開包括用於治療與CD73相關的疾病的藥劑，該藥劑包含本公開的單株抗體或其抗體片段作為活性成分。
對與CD73相關的疾病沒有限制，只要它是與CD73相關的疾病即可(如表達CD73，或由CD73的異常表達的細胞引起的疾病)，例如利用本公開的分子結合人類CD73然後阻遏細胞增殖性疾病，在一些實施方式中，該細胞增殖性疾病為腫瘤，在一些實施方式中，該腫瘤為乳腺癌、神經膠質瘤、膀胱癌、結腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、甲狀腺癌、食道癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、淋巴瘤、前列腺癌或胃癌；在一些實施方式中，該腫瘤為轉移性腫瘤。
此外，本公開涉及用於免疫檢測或測定CD73的方法、用於免疫檢測或測定CD73的試劑、用於免疫檢測或測定表達CD73的細胞的方法和用於
診斷與CD73相關的疾病的診斷劑，其包含本公開的特異性識別人CD73結合的抗體或抗體片段作為活性成分。
在本公開中，用於檢測或測定CD73的量的方法可以是任何已知方法。例如，免疫檢測或測定方法。
免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。
上述與CD73相關的疾病可以藉由用本公開的抗體或抗體片段檢測或測定表達CD73的細胞來診斷。
為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，例如使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。
在本公開中，對用於檢測或測定CD73的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表達CD73的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
根據所需的診斷方法，含有本公開的抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別該單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與該標記對應的受質等。
本公開實施例提供的抗CD73抗體或抗原結合片段對CD73具有特異性且與人CD73的親和力很高，其中人源化的抗CD73抗體或抗原結合片段免疫原性大大降低，同時完全保留了鼠源抗體的特異性，具備較高的親和力和優異的體內外活性。
本公開實施例提供的抗CD73抗體或抗原結合片段具有良好的代謝動力學特性，具備良好的生物利用度。
以下結合實施例進一步描述本公開，但這些實施例並非限制著本公開的範圍。本公開實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊、分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1、CD73抗原的製備
一、抗原設計及表達
以人CD73蛋白(Uniprot號：P21589)作為本公開CD73的模板，設計本公開涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列，可選的在CD73蛋白上融合不同的標簽，分別選殖到pTT5載體上或pTarget載體上，在293細胞瞬轉表達或CHO細胞穩定表達，獲得本公開抗原及檢測用蛋白。以下CD73抗原未特殊說明的均指人CD73。
人CD73全長序列，可用於構建CD73過表達細胞株，用於免疫和檢測，具體序列見SEQ ID NO：1：
(備註：單下劃線為信號肽，斜體為人CD73胞外區，雙下劃線為前肽。)
CD73-3Flag(CD73成熟蛋白胞外區與3個Flag標簽的融合蛋白)，可用於免疫，具體序列見SEQ ID NO：2：
(備註：單下劃線為信號肽，斜體為人CD73胞外區，雙下劃線為3個Flag標簽。)
CD73-Myc-His(CD73成熟蛋白胞外區與Myc標簽和His標簽的融合蛋白)，可用於檢測，具體序列見SEQ ID NO：3：
(備註：單下劃線為信號肽，斜體為人CD73胞外區，雙下劃線為Myc-His標簽。)
另外，食蟹猴CD73/NT5E蛋白(His標簽)，購自Sino Biological(貨號：90192-C08H-50)。
二、CD73相關重組蛋白的純化，以及抗人CD73融合瘤抗體、重組抗體的純化
1. ProteinG親和層析分離純化融合瘤上清
小鼠融合瘤上清純化首選ProteinG進行親和層析，將培養所得融合瘤離心取上清，根據上清體積加入10-15%體積的1M Tris-HCl(pH8.0-8.5)調節上清pH至中性。ProteinG管柱利用6M鹽酸胍洗3-5倍管柱體積，然後利用純水清洗3-5倍管柱體積；利用如1×PBS(pH7.4)緩衝體系作為平衡緩衝液對層析管柱平衡
3-5倍管柱體積；細胞上清利用低流速上樣結合，控制流速使保留時間約1min或更長時間；利用1×PBS(pH7.4)洗滌層析管柱3-5倍管柱體積至紫外吸收回落至基線；利用0.1M醋酸/醋酸鈉(pH3.0)緩衝液進行樣品沖提，根據紫外檢測收集沖提峰，沖提產物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速調節pH至5-6暫存。對於沖提產物可以利用本領域技術人員熟知的方法進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻如G-25脫鹽替換成所需的緩衝體系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻管柱去除沖提產物中的聚體成分以提高樣品純度。
2. Protein A親和層析純化抗體
首先將表達抗體的細胞培養上清進行高速離心收取上清。ProteinA親和管柱利用6M鹽酸胍洗3-5倍管柱體積，然後利用純水清洗3-5倍管柱體積。利用1×PBS(pH7.4)緩衝體系作為平衡緩衝液對層析管柱平衡3-5倍管柱體積。細胞上清利用低流速上樣，控制流速使保留時間約1min或更長時間，結合完畢後利用1×PBS(pH7.4)洗滌層析管柱3-5倍管柱體積至紫外吸收回落至基線。利用0.1M醋酸/醋酸鈉(pH3.0-3.5)緩衝液進行樣品沖提，根據紫外檢測收集沖提峰，沖提產物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速調節pH至5-6暫存。對於沖提產物可以利用本領域技術人員熟知的方法進行溶液置換，如利用超濾管進行超濾濃縮及溶液置換至所需的緩衝體系，或者利用分子排阻如G-25脫鹽替換成所需的緩衝體系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻管柱去除沖提產物中的聚體成分以提高樣品純度。
3.鎳管柱純化人CD73、CD73-Myc-His、CD73-3Flag等CD73相關重組蛋白
將細胞表達上清樣品高速離心去除雜質，並將緩衝液置換為PBS，加入咪唑至終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳管柱，沖洗2-5倍管柱體積。將置換後的上清樣品上管柱結合，介質可以選擇不同公司的鎳管柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗管柱子，至A280讀數降至基線。後用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱，除去非特異結合的雜蛋白，並收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液沖提目的蛋白，並收集沖提峰。
收集的沖提產物濃縮後可用凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，流動相為PBS，去除聚體及雜蛋白峰，收集目的產物沖提峰。所得到的蛋白經電泳，肽圖，LC-MS鑒定為正確後分裝備用。
實施例2、抗人CD73單株抗體的製備
一、免疫
抗人CD73單株抗體藉由免疫小鼠產生。實驗用SJL白小鼠，雌性，6-8週齡(北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK(京)2012-0001)。飼養環境：SPF級。小鼠購進後，實驗室環境飼養1週，12/12小時光/暗週期調節，溫度20-25℃；濕度40-60%。將已適應環境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原為過表達CD73的CHO細胞(SEQ ID NO：1)。
免疫方案：用CD73過表達的CHO細胞株進行小鼠免疫，1×107細胞/隻/次，腹腔內注射。細胞收集後用PBS稀釋為1×108/ml，第0天腹膜內(IP)注射100μl/隻，之後每14天進行一次加強免疫。於第21、35、49、63天取血，用ELISA方法確定小鼠血清中的抗體效價。在7-9免疫以後，選擇血清中抗體效價高並且效價趨於平臺的小鼠進行脾細胞融合。在進行脾細胞融合前3天加強免疫，腹膜內(IP)注射50μg/隻的生理鹽水配製的CD73-3Flag抗原溶液。
二、脾細胞融合
採用優化的PEG介導的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0(ATCC® CRL-8287TM)進行融合得到融合瘤細胞。融合好的融合瘤細胞以0.5-1×106細胞/ml的密度用完全培養基(含20% FBS、1×HAT、1×OPI的DMEM培養基)重新懸浮，100μl/孔種於96孔板中，37℃，5%CO2孵育3-4天後，補充HAT完全培養基100μl/孔，繼續培養3-4天至形成針尖般純株。去除上清，加入200μl/孔的HT完全培養基(含20%FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培養基)，37℃，5%CO2培養3天後進行ELISA檢測。
三、融合瘤細胞篩選
根據融合瘤細胞生長密度，用結合ELISA方法進行融合瘤培養上清檢測(見實施例3)。並將結合ELISA檢測的陽性孔細胞上清進行MDA-MB-231細胞結合實驗和細胞酶活性抑制實驗(見實施例4)。對MDA-MB-231細胞結合實驗和細胞酶活性抑制實驗均為陽性的孔細胞及時進行擴增凍存保種及2到3次亞選殖直至獲得單細胞純株。
每次亞選殖細胞也均需進行CD73結合ELISA、MDA-MB-231細胞結合實驗、MDA-MB-231細胞酶活性抑制實驗。藉由以上實驗篩選得到融合瘤純株，用無血清細胞培養法進一步製備抗體，按純化實例純化抗體，供在檢測例中使用。
四、融合瘤陽性純株序列測定
從陽性融合瘤中選殖序列過程如下。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,Cat No.15596-018)按照試劑盒說明書步驟提取RNA，用PrimeScriptTM Reverse Transcriptase試劑盒反轉錄(Takara,Cat No.2680A)。將反轉錄得到的
cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen,TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後送測序公司測序。經測序得到鼠源抗CD73抗體：mab108、mab110、mab127的可變區胺基酸序列如下：
mab108 HCVR胺基酸序列如SEQ ID NO：4所示，
mab108 LCVR胺基酸序列如SEQ ID NO：5所示，DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTC RASQDIGDRLN WLQQEPDGTIKRLIY ATSSLDS GVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYC LQYAQSWT FGGGTKLEIK
mab110 HCVR胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示，
mab110 LCVR胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示，DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTC RASQDIGNSLN WLQQEPDGTIKRLIY ATFRLDS GVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYC QQYASFPWT FGGGTKLEIK
mab127 HCVR胺基酸序列如SEQ ID NO：8所示，
mab127 LCVR胺基酸序列如SEQ ID NO：9所示，
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTC RASQDIGDSLN WLQQAPDGTLKRLIY ATSSLDS GVPRRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYC LQYASFPWT FGGGTKLEIK
上述mab108、mab110、mab127抗體可變區序列中，斜體為FR序列，下劃線為根據Kabat編號規則確定的CDR序列，序列順序依次為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
表1 抗CD73抗體重鏈及輕鏈CDR區胺基酸序列表
本公開所得的mab108、mab110、mab127抗體的輕鏈CDR區很相似，僅個別胺基酸不同，可用通式表示為：抗體輕鏈LCDR1如SEQ ID NO：27所示：RASQDIGX1X2LN，其中，X1選自D或N，X2選自R或S；LCDR2如SEQ ID NO：28所示：ATX3X4LDS，其中，X3選自F或S，X4選自R或S；LCDR3如SEQ ID NO：29所示：X5QYAX6X7X8WT，其中，X5選自L或Q，X6選自S或G，X7選自F或空缺，X8選自S或P。
五、人IgG1嵌合抗體製備
將上述融合瘤篩選獲得的mab108、mab110、mab127候選分子經過擴增測序可得到可變區編碼基因序列，以測序所得序列設計首尾引子，以測序基因為模板，經過PCR搭建各抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及hIgG1/hkappa恆定區基因(CH1-Fc/CL)片段)進行同源重組，構建重組嵌合抗體全長表達質粒VH-CH1-Fc-pHr/VL-CL-pHr，形成CH108、CH110和CH127三個嵌合抗體。
六、鼠源抗人CD73抗體的人源化
藉由比對IMGT(http：//imgt.cines.fr)人類抗體重輕鏈可變區種系基因數據庫和MOE(Molecular Operating Environment，分子操作環境)軟體，分別挑選與鼠源抗體同源性高的人種系重鏈和輕鏈可變區基因作為模板，將鼠源抗體的CDR分別移植到相應的人源模板中，形成次序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可變區序列。根據需要，將骨架序列中胺基酸回復突變為鼠源抗體對應的胺基酸，即得到人源化抗CD73單株抗體。
1. mab108的人源化
1.1 mab108構架選擇
鼠源抗體mab108的人源化輕鏈模板為IGKV1-17*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV2-26*01和hjh4.1，將鼠源抗體mab108的CDR分別移植到其人源模板中，即獲得mab108的人源化抗體Hab108，其可變區序列如下：
Hab108 HCVR(也稱VH-CDR graft)胺基酸序列如SEQ ID NO：30所示：
Hab108 LCVR(也稱VL-CDR graft)胺基酸序列如SEQ ID NO：31所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDRLN WYQQKPGKAPKRLIY ATSSLDS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC LQYAGSWT FGGGTKVEIK註：上述Hab108抗體序列中，斜體為FR序列，下劃線為根據Kabat編號系統確定的CDR序列，順序依次為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
1.2mab 108的人源化抗體的回復突變設計：
根據需要，將mab 108的人源化抗體的FR區序列中胺基酸進行回復突變為鼠源抗體對應的胺基酸，具體回復突變設計見表2。
表2：mab 108的人源化抗體回復突變設計
1.3mAb 108人源化抗體：
對上述表2的mab108的人源化抗體回復突變後得到的可變區進行組合，最終獲得多種mab 108人源化抗體，各抗體的可變區胺基酸序列如下：
表3：mab108人源化抗體可變區對應胺基酸序列
mAb108人源化抗體可變區具體序列如下：
Hab108.VL1胺基酸序列如SEQ ID NO：31所示(同Hab108 LCVR)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDRLN WYQQKPGKAPKRLIY ATSSLDS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC LQYAGSWT FGGGTKVEIK
Hab108.VL2胺基酸序列如SEQ ID NO：32所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDRLN WLQQKPGKAIKRLIY ATSSLDS GVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC LQYAGSWT FGGGTKVEIK
Hab108.VL3胺基酸序列如SEQ ID NO：33所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDRLN WLQQKPGGAIKRLIY ATSSLDS GVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC LQYAGSWT FGGGTKVEIK
Hab108.VL4胺基酸序列如SEQ ID NO：34所示：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASCDIGDRLN WLQQKPGGAIKRLIY ATSSLDS GVPSRFSGSGSGSEYTLTISSLQPEDFADYYC LQYAGSWT FGGGTKVEIK
Hab108.VL5胺基酸序列如SEQ ID NO：35所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDRLN WLQQKPGKAIKRLIY ATSSLDS GVPKRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC LQYAGSWT FGGGTKVEIK
Hab108.VL6胺基酸序列如SEQ ID NO：36所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDRLN WLQQKPGGAIKRLIY ATSSLDS GVPKRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC LQYAGSWT FGGGTKVEIK
Hab108.VH1胺基酸序列如SEQ ID NO：30所示(同Hab108 HCVR)：
Hab108.VH2胺基酸序列如SEQ ID NO：37所示：
Hab108.VH3胺基酸序列如SEQ ID NO：38所示：
Hab108.VH4胺基酸序列如SEQ ID NO：39所示：
Hab108.VH5胺基酸序列如SEQ ID NO：40所示：
2、mab110的人源化
2.1mab110構架選擇
鼠源抗體mab110的人源化輕鏈模板為IGKV1-17*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV1-3*01和hjh6.1，將鼠源抗體mab110的CDR分別移植到其人源模板中，即獲得mab110的人源化抗體Hab110，其可變區序列如下：
Hab110HCVR(也稱VH-CDR graft)胺基酸序列如SEQ ID NO：41所示：
Hab110 LCVR(也稱VL-CDR graft)胺基酸序列如SEQ ID NO：42所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGNSLN WYQQKPGKAPKRLIY ATFRLDS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC QQYASFPWT FGGGTKVEIK註：上述Hab110抗體序列中，斜體為FR序列，下劃線為CDR序列，順序依次為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
2.2mAb 110回復突變設計
根據需要，將mab 110的人源化抗體的FR區序列中胺基酸進行回復突變為鼠源抗體對應的胺基酸，具體回復突變設計見表4。
表4：mab 110的人源化抗體回復突變設計
2.3mAb 110人源化抗體
表5：mab110人源化抗體可變區對應胺基酸序列
mab110人源化抗體可變區具體序列如下：
Hab110.VL1胺基酸序列如SEQ ID NO：42所示(同Hab110 LCVR)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGNSLN WYQQKPGKAPKRLIY ATFRLDS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC QQYASFPWT FGGGTKVEIK
Hab110.VL2胺基酸序列如SEQ ID NO：43所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGNSLN WLQQKPGKAIKRLIY ATFRLDS GVPSRFSGSRSGTEYTLTISSLQPEDFATYYC QQYASFPWT FGGGTKVEIK
Hab110.VL3胺基酸序列如SEQ ID NO：44所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGNSLN WLQQKPGGAIKRLIY ATFRLDS GVPSRFSGSRSGTEYTLTISSLQPEDFADYYC QQYASFPWT FGGGTKVEIK
Hab110.VH1胺基酸序列如SEQ ID NO：41所示(同Hab110 HCVR)：
Hab110.VH2胺基酸序列如SEQ ID NO：45所示：
Hab110.VH3胺基酸序列如SEQ ID NO：46所示：
Hab110.VH4胺基酸序列如SEQ ID NO：47所示：
Hab110.VH5胺基酸序列如SEQ ID NO：48所示：
3、mab127的人源化
3.1 mab127構架選擇
鼠源抗體mab127的人源化輕鏈模板為IGKV1-17*01和hjk4.1，人源化重鏈模板為IGHV1-46*01和hjh6.1，將鼠源抗體mab127的CDR分別移植到其人源模板中，即獲得mab127的人源化抗體Hab127，其可變區序列如下：
Hab127 HCVR(也稱VH-CDR graft)胺基酸序列如SEQ ID NO：49所示：
Hab127 LCVR(也稱VL-CDR graft)胺基酸序列如SEQ ID NO：50所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDSLN WYQQKPGKAPKRLIY ATSSLDS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC LQYASFPWT FGGGTKVEIK註：上述Hab127抗體序列中，斜體為FR序列，下劃線為CDR序列(根據Kabat編號系統確定並註釋)，順序依次為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
3.2mab 127回復突變設計
根據需要，將mab 127的人源化抗體的FR區序列中胺基酸進行回復突變為鼠源抗體對應的胺基酸，具體回復突變設計見表6：
表6：mab 127的人源化抗體回復突變設計
3.3mAb 127人源化抗體
表7：mab127人源化抗體可變區對應胺基酸序列
mab127人源化抗體具體序列如下：
Hab127.VL1胺基酸序列如SEQ ID NO：50所示(同Hab127 LCVR)：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDSLN WYQQKPGKAPKRLIY ATSSLDS GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYC LQYASFPWT FGGGTKVEIK
Hab127.VL2胺基酸序列如SEQ ID NO：51所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDSLN WLQQKPGKAPKRLIY ATSSLDS GVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASFPWTFGGGTKVEIK
Hab127.VL3胺基酸序列如SEQ ID NO：52所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDSLN WLQQKPGGALKRLIY ATSSLDS GVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASFPWTFGGGTKVEIK
Hab127.VL4胺基酸序列如SEQ ID NO：53所示：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASQDIGDSLN WLQQKPGGALKRLIY ATSSLDS GVPSRFSGSGSGSDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYASFPWTFGGGTKVEIK
Hab127.VH1胺基酸序列如SEQ ID NO：54所示：
Hab127.VH2胺基酸序列如SEQ ID NO：55所示：
Hab127.VH3胺基酸序列如SEQ ID NO：56所示：
Hab127.VH4胺基酸序列如SEQ ID NO：57所示：
3.4mab127人源化抗體的熱點突變：
用計算機模擬的方式基於mab127重鏈HCDR2抗體結構對NNG進行胺基酸突變，在其中一個較佳實施例中，我們對Hab127.VH1的HCDR2的NNG進行胺基酸突變，Hab127.VH1突變後序列如下：
Hab127.VH1a胺基酸序列如SEQ ID NO：58所示：
Hab127.VH1b胺基酸序列如SEQ ID NO：59所示：
Hab127.VH1c胺基酸序列如SEQ ID NO：60所示：
Hab127.VH1d胺基酸序列如SEQ ID NO：61所示：
Hab127.VH1e胺基酸序列如SEQ ID NO：62所示：
Hab127.VH1f胺基酸序列如SEQ ID NO：63所示：
Hab127.VH1g胺基酸序列如SEQ ID NO：64所示：
Hab127.VH1h胺基酸序列如SEQ ID NO：65所示：
Hab127.VH1i胺基酸序列如SEQ ID NO：66所示：
mab127人源化抗體熱點突變後HCDR2胺基酸序列通式如SEQ ID NO：67所示：RIYHX9X10X11DTFYSQKFKG，其中，X9選自N、Q、L或H，X10選自N、Q、L、T、K、E或H，X11選自V或G；較佳地，該mab127人源化抗體熱點突變後HCDR2胺基酸序列如SEQ ID NO：68-76所示：
SEQ ID NO：68：RIYHNQGDTFYSQKFKG；
SEQ ID NO：69：RIYHNLGDTFYSQKFKG；
SEQ ID NO：70：RIYHNTGDTFYSQKFKG；
SEQ ID NO：71：RIYHNKGDTFYSQKFKG；
SEQ ID NO：72：RIYHNEGDTFYSQKFKG；
SEQ ID NO：73：RIYHNHGDTFYSQKFKG；
SEQ ID NO：74：RIYHQNVDTFYSQKFKG；
SEQ ID NO：75：RIYHLNVDTFYSQKFKG；
SEQ ID NO：76：RIYHHNVDTFYSQKFKG。
表8：mab127人源化抗體熱點突變抗體對應的可變區
4、抗人CD73人源化抗體構建和表達
設計引子PCR搭建各人源化抗體VH/VK基因片段，再與表達載體pHr(帶信號肽及恆定區基因(CH1-FC/CL)片段)進行同源重組，構建抗體全長表達載體VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。該人源化抗體恆定區可選自人κ、λ鏈輕鏈恆定區
或其變體，以及選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，非限制性實施例包括對人IgG1、IgG2、IgG4的恆定區進行優化設計，改善抗體功能，如恆定區的D265A、N297A、L234A/L235A或L234F/L235E等位點突變可以降低抗體的ADCC，P331S或附近的突變可降低抗體CDC，以及S228P、F234A和L235A等恆定區突變體。
示例性的抗人CD73人源化抗體恆定區序列如下：
重鏈恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示：
抗人CD73人源化抗體輕鏈恆定區胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示：
示例性的抗人CD73人源化抗體全長胺基酸序列如下：
Hab108.64抗體重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：79所示：
Hab108.64抗體輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：80所示：
Hab110.21抗體重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：81所示：
Hab110.21抗體輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：82所示：
Hab127.31d抗體重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：83所示：
Hab127.31d抗體輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：84所示：
實施例3、抗CD73抗體結合活性檢測
一、抗CD73抗體結合人CD73蛋白的ELISA實驗
抗CD73抗體的結合力藉由抗體與人CD73蛋白的ELISA實驗來檢測。用生物素化的CD73融合蛋白藉由與包被在酶標板中的Streptavidin結合從而固定
到96孔酶標板中，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和CD73的結合活性。具體實驗方法如下：
用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)緩衝液將Streptavidin(Sigma，Cat No.S4762-5MG)稀釋至3μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，於37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶(BD skim milk,Cat No.232100)封閉液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液(PH7.4 PBS含0.05% tweeen-20)洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液(pH7.4 PBS含1%BSA)稀釋至0.5μg/ml的生物素化的CD73-myc-his融合蛋白(東仁化學，Cat No.LK03，生物素化的方法參考試劑盒說明書)，置37℃孵育箱孵育1小時或4℃放置過夜。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(融合瘤純化抗體或人源化抗體)，放於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板5次，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育5-10min，加入50μl/孔1M H2SO4終止反應，用酶標儀(Molecular Devices,VERSA max)在波長450nm處讀取吸收值，用GraphPad Prism 5分析數據，計算抗CD73抗體對人CD73蛋白的結合EC50值。實驗結果見第1圖及表9所示。
表9：抗CD73抗體結合人CD73蛋白ELISA實驗結果
實驗結果顯示，本公開的抗CD73抗體Hab110.21、Hab127.31d、Hab108.64均與人CD73蛋白有很好的結合作用，該三種抗CD73抗體對人CD73蛋白的結合EC50值均比陽性對照抗體CPX006(參見專利WO2018013611中CPX-006抗體)低。
二、抗CD73抗體結合食蟹猴CD73蛋白的ELISA實驗
抗CD73抗體的猴交叉結合力藉由抗體與食蟹猴(cynomolgus)CD73蛋白的ELISA實驗來檢測。將食蟹猴CD73融合蛋白直接包被到96孔酶標板中，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和食蟹猴CD73的結合活性。具體實驗方法如下：
用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)緩衝液將食蟹猴CD73(Sino Biological，Cat No.90192-C08H)稀釋至2μg/ml濃度，以50μl/孔的體積加入96孔酶標板中，於37℃孵育箱中放置2小時。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶封閉液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小時或4℃放置過夜(16-18小時)進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體(融合瘤純化抗體或人源化抗體)，放於
37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板5次，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育5-10min，加入50μl/孔1M H2SO4終止反應，用酶標儀(Molecular Devices,VERSA max)在波長450nm處讀取吸收值，用GraphPad Prism 5分析數據，計算抗CD73抗體對猴CD73的結合EC50值。實驗結果見第2圖及表10所示。
表10：抗CD73抗體結合食蟹猴CD73蛋白的ELISA實驗結果
實驗結果表明，本公開的抗CD73抗體Hab110.21、Hab127.31d、Hab108.64均與猴CD73蛋白有很好的結合作用。
三、抗CD73抗體與MDA-MB-231細胞的結合實驗
抗CD73抗體的結合力藉由抗體與高表達人CD73的腫瘤細胞系MDA-MB-231的ELISA實驗來檢測。將MDA-MB-231細胞直接包被到96孔培養板中，抗體加入後信號的強弱被用於判斷抗體和MDA-MB-231細胞的結合活性。具體實驗方法如下：
將MDA-MB-231細胞(ATCC,Cat No HTB-26)以6×105/ml密度，100μl/孔接種於96孔板(Corning，Cat No.CLS3599-100EA)中過夜培養。棄上清，用PBS洗三遍後，加入100μl/孔的細胞免疫固定液(Beyotime，Cat No.P0098)室溫固定半小時，PBS洗四遍。棄去液體後，加入用PBS稀釋的5%脫脂牛奶封閉液250μl/孔，37℃孵育箱孵育3小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板5次後，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體，放於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板5次，加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小時。用PBST洗板5次後，加入50μl/孔TMB顯色受質(KPL，Cat No.52-00-03)，於室溫孵育5-15min，加入50μl/孔1M H2SO4終止反應，用酶標儀(Molecular Devices,VERSA max)在波長450nm處讀取吸收值，用GraphPad Prism 5分析數據，計算抗CD73抗體對CD73過表達MDA-MB-231細胞的結合EC50值。實驗結果見第3圖及表11所示。
表11：抗CD73抗體與MDA-MB-231細胞結合實驗結果
實驗結果表明，本公開的抗CD73抗體Hab110.21、Hab127.31d、Hab108.64均與腫瘤細胞系MDA-MB-231有很好的結合作用。
四、抗CD73抗體的Biacore測定
該實驗用Biacore儀器測定待測人源化抗CD73抗體與人CD73(huCD73)、猴CD73(cynoCD73)的親和力。
分別用Protein A生物傳感芯片(Cat.# 29127556,GE)親和捕獲一定量的待測抗體，然後於芯片表面流經一定濃度的人、猴CD73抗原，利用Biacore儀器(Biacore T200，GE)實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，pH1.5的甘胺酸-鹽酸再生溶液(Cat.# BR-1003-54,GE)將生物芯片洗淨再生。實驗運行緩衝液為1×HBS-EP緩衝溶液(Cat.# BR-1001-88，GE)。
實驗得到的數據用GE Biacore T200 Evaluation version 3.0軟體以(1：1)Langmuir模型進行擬合，得出親和力數值，具體見表12、表13所示。
表12：抗CD73抗體與huCD73蛋白的反應親和力
表13、抗CD73抗體與cynoCD73蛋白的反應親和力
實驗結果表明，本公開的抗CD73抗體Hab110.21、Hab127.31d和Hab108.64均能與人CD73和猴CD73以高親和力結合。
實施例4、抗CD73抗體的酶活性抑制活性實驗
抗CD73抗體的酶活性抑制作用藉由將抗體對高表達人CD73的MDA-MB-231細胞酶活性實驗的化學發光法檢測。抗體加入MDA-MB-231細胞中，藉由檢測CD73的酶活性受質的剩餘量來判斷對CD73酶活性的抑制作用。具體實驗方法如下：
將MDA-MB-231細胞(ATCC,HTB-26)以2×105/ml密度，100μl/孔接種於96孔板中過夜培養。棄上清，用PBS洗一遍後，加入50μl/孔用細胞培養基(RPMI-1640，Hyclone，Cat No SH30809.01)稀釋的不同濃度待測抗體(融合瘤純化抗體
或人源化抗體)，放於37℃的CO2孵育箱孵育0.5小時。然後加入50μl/孔用細胞培養基稀釋的腺苷-5’-單磷酸(Sigma,Cat No A1752-5MG)，放於37℃的CO2孵育箱孵育3小時。孵育結束後，轉25μl/孔的反應液到新的96孔板(PerkinElmer，Cat No 6005290)，加入25μl/孔用細胞培養基稀釋的5’-三磷酸腺苷(Sigma,Cat No A7699-5MG)，最後加入50μl/孔的CellTiter Glo(Promega,Cat No G7573)，用Cytation5(Biotek)讀化學發光，用GraphPad Prism5分析數據，計算抗CD73抗體對MDA-MB-231細胞酶活性抑制的IC50值。
表14：抗CD73抗體對MDA-MB-231細胞酶活性抑制實驗結果
實驗結果顯示，本公開的抗CD73抗體Hab110.21、Hab127.31d、Hab108.64均能顯著抑制腫瘤細胞MDA-MB-231上表達的CD73對其受質的酶解活性，且最大酶解抑制活性高於MEDI9447(參見專利WO2016075099中MEDI9447抗體)陽性對照抗體(見第4圖)，酶解IC50值顯著小於CPX006陽性對照抗體(見表14)，說明本公開中的抗CD73抗體抑制CD73酶活性的能力顯著優於MEDI9447和CPX006這兩個陽性對照抗體。
實施例5、抗CD73抗體誘導CD4+ T細胞體外增殖實驗
CD4+ T細胞是藉由使用CD4 Microbeads(CD4微球，Miltenyi Biotec,Cat# 130-045-101)從人全血製備出的PBMC中分離純化獲得。將CD4+ T細胞用Cell Proliferation Dye eFluorTM 670(invitrogen，Cat#65-0840)進行染色。在染色後的CD4+ T細胞中加入人CD3/CD28 Dynabeads(CD3/CD28免疫磁珠，Gibco，Cat#11131D)和150U/ml重組人IL-2(PeproTech，Cat#200-02)進行激活，然後將每孔50000個細胞(80μl每孔)加入圓底96孔板中，置於37℃，5% CO2培養箱孵育1小時。然後每孔分別加入10μl的CD73抗體或其對照分子(包括MEDI9447、CPX006陽性對照，培養基空白對照，同型人IgG陰性對照)，終濃度為100ng/ml、10ng/ml、1ng/ml和0.1ng/ml，置於37℃，5% CO2培養箱中預孵育1小時，最後再在每孔加入10μl的AMP(腺苷-5’-單磷酸鈉鹽，SIGMA，Cat#A1752-1G)，終濃度為400μM，在37℃，5% CO2培養箱中培養4天。培養CD4+ T細胞時使用的培養基為X-VIVOTM 15無血清培養基(Lonza，Cat#04-418QCN)。4天後將細胞用流式緩衝液(含2.5%FBS的PBS)洗一遍，用流式細胞儀檢測細胞中的APC螢光值。
實驗結果見第5圖，結果表明，未激活的CD4+ T細胞不發生增殖，激活的細胞中，只有培養基的空白對照孔中約有80%的CD4+ T細胞發生增殖，而400μM AMP顯著抑制CD4+ T細胞增殖，只有約5%的細胞發生增殖。抗CD73抗體Hab110.21，Hab127.31d和Hab108.64能夠不同程度地逆轉AMP抑制CD4+ T細胞增殖的作用。
實施例6：抗CD73抗體的動物體內生物學活性
一、抗CD73抗體對MDA-MB-231皮下移植瘤抑制實驗
實驗方法：將MDA-MB-231(ATCC庫)細胞(2.0×106個)100μl接種於50隻NSG(B-NDG®小鼠，購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司)小鼠右肋部皮下，待成瘤後(~160mm3)去除體重、腫瘤過大和過小的小鼠，按腫瘤體積將小鼠隨機分為6組，每組6隻，如表15所示。分離2個志願者血液中的PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血單核細胞)細胞，將未刺激的2個志願者的PBMC按1：1混合，以0.715×107/100μl量注射到腹腔。第二天開始藉由腹腔注射本公開的抗CD73抗體和對照分子(包括同型人IgG空白對照、MEDI9447陽性對照、CPX006陽性對照)，每週注射2次，共3週。每週測2次瘤體積，稱體重，記錄數據。分組及給藥情況見表15。
表15：試驗分組及給藥情況
使用Excel統計軟體：平均值以avg(Average，平均值)計算；SD(Standard diviation，標准偏差)值以STDEV計算；SEM(Standard Error of Mean，
樣本均數的標準差)值以STDEV/SQRT(Square root，開平方根)(每組動物數)計算；GraphPad Prism軟體作圖，採用Two-way ANOVA(雙因素方差分析)或One-way ANOVA(單因素方差分析)對數據進行統計學分析。
腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×L長×L短 2
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的空白對照組(Vehicle)及實驗組的相對腫瘤體積。
實驗結果：
D1-20天，每週皮下注射給藥2次，檢測抗CD73抗體對MDA-MB-231腫瘤的生長抑制作用。試驗結果見表16和第6圖所示。各組小鼠體重沒有明顯變化，與同型人IgG的空白對照組相比，MEDI9447、CPX006、Hab110.21、Hab127.31d、Hab108.64組抑瘤率分別為16%、18%、36%、33%、25%，Hab110.21、Hab127.31d、Hab108.64組均能夠顯著抑制MDA-MB-231腫瘤的生長(p<0.01)。
表16：抗CD73抗體對MDA-MB-231小鼠移植瘤的抑制實驗結果
二、抗CD73抗體對MDA-MB-231-Luc肺轉移的抑制實驗
實驗方法：
培養MDA-MB-231-LUC細胞(美國Caliper公司)，在接種細胞前用同型人IgG或CD73抗體孵育細胞2小時，抗體終濃度為10μg/ml，然後以每隻(2.5×105個)200μl註射入NSG小鼠尾靜脈。把小鼠分為4組，每組5-7隻，如表17所示。分離2個志願者血液中的PBMC(Peripheral Blood Mononuclear Cell，外周血單核細胞)細胞，將未刺激2個志願者的PBMCs按1：1混合，以0.57×107/100μl量註射到腹腔。第二天開始藉由腹腔注射抗體，每週注射2次，共3週。每週測2次體內生物發光值，稱體重，記錄數據。分組及給藥情況見表17。
表17：試驗分組及給藥情況
使用Excel統計軟體：各組動物體重、腫瘤生物發光值ROI(region of interest，感興趣區域；單位p/s(photons per second，動物體表單位時間發出的光子數))值均用平均值±標準差(Mean±SEM)表示，並用GraphPad Prism軟體作圖，採用Two-way ANOVA對數據進行統計學分析。
肺相對生物發光值：相對ROI(R-ROI)=ROIT/ROI0，ROIT為實驗結束時肺生物發光值，ROI0為實驗開始時肺生物發光值。
抑瘤率(%)=(TR-ROI-CR-ROI)/CR-ROI(%)
其中TR-ROI、CR-ROI分別為實驗結束時的給藥組的肺相對生物發光值和對照組的相對生物發光值。
實驗結果：
D1-18天，每週皮下注射給藥2次，檢測抗CD73抗體對MDA-MB-231-Luc肺轉移的抑制作用。試驗結果見表18和第7圖、第8圖，與同型人IgG的空白對照組相比，Hab110.21、Hab127.31d、Hab108.64組抑瘤率分別為61%(p<0.001)、
60%(p<0.001)、78%(p<0.001)，均能夠顯著抑制MDA-MB-231-LUC細胞的肺轉移和生長。
表18：抗CD73抗體對接種MDA-MB-231-LUC小鼠肺轉移的療效
實施例7：抗CD73抗體小鼠體內藥物代謝動力學實驗
C57小鼠18隻，雌性，購自西普爾-必凱實驗動物有限公司。飼養期間自由攝取飼料和水，實驗室環境適應性飼養4天，12/12小時光/暗週期調節，溫度16-26℃，相對濕度40-70%，給藥開始時體重範圍18~22g。實驗當天，小鼠平均分為6組，其中三組尾靜脈注射(IV)受試藥物Hab108.64、Hab110.21、Hab127.31d，另外三組皮下注射(SC)受試藥物Hab108.64、Hab110.21、Hab127.31d，給藥劑量均為3mg/kg，給藥體積為10mL/kg。
於給藥前及給藥後5min、8h、1 d、2 d、4 d、7 d、10d、14 d、21d、28d各時間點採血。每隻動物取全血約0.1ml，不加抗凝劑，取血後在4℃放置30min，1000g離心15min，取上層血清置於EP管中，-80℃保存。
採用ELISA方法檢測血清中的抗體濃度，採用Winnolin軟體計算受試藥物的藥物動力學參數。試驗結果見表19，結果表明，本公開的Hab108.64,Hab110.21,Hab127.31d體內穩定性良好且具備較高的生物利用度，且適於皮下注射。
表19：抗CD73抗體在小鼠體內的藥物動力學試驗結果
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 上海恆瑞醫藥有限公司
<120> 抗CD73抗體、其抗原结合片段及應用
<130> 719090CPCT
<160> 84
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VL2胺基酸序列
<400> 51
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VL3胺基酸序列
<400> 52
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VL4胺基酸序列
<400> 53
<210> 54
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH1胺基酸序列
<400> 54
<210> 55
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH2胺基酸序列
<400> 55
<210> 56
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH3胺基酸序列
<400> 56
<210> 57
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH4胺基酸序列
<400> 57
<210> 58
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH1a胺基酸序列
<400> 58
<210> 59
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH1b胺基酸序列
<400> 59
<210> 60
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH1c胺基酸序列
<400> 60
<210> 61
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH1d胺基酸序列
<400> 61
<210> 62
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH1e胺基酸序列
<400> 62
<210> 63
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH1f胺基酸序列
<400> 63
<210> 64
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH1g胺基酸序列
<400> 64
<210> 65
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH1h胺基酸序列
<400> 65
<210> 66
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.VH1i胺基酸序列
<400> 66
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> mab127人源化抗體热点突变后HCDR2胺基酸序列通式
<220>
<221> 結構域
<222> (5)..(5)
<223> Xaa選自Asn、Gln、Leu或His
<220>
<221> 結構域
<222> (6)..(6)
<223> Xaa選自Asn、Gln、Leu、Thr、Lys、Glu或His
<220>
<221> 結構域
<222> (7)..(7)
<223> Xaa選自Val或Gly
<400> 67
<210> 68
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> mab127人源化抗體熱點突變a的HCDR2胺基酸序列
<400> 68
<210> 69
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> mab127人源化抗體熱點突變b的HCDR2胺基酸序列
<400> 69
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> mab127人源化抗體熱點突變c的HCDR2胺基酸序列
<400> 70
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> mab127人源化抗體熱點突變d的HCDR2胺基酸序列
<400> 71
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> mab127人源化抗體熱點突變e的HCDR2胺基酸序列
<400> 72
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> mab127人源化抗體熱點突變f的HCDR2胺基酸序列
<400> 73
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> mab127人源化抗體熱點突變g的HCDR2胺基酸序列
<400> 74
<210> 75
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> mab127人源化抗體熱點突變h的HCDR2胺基酸序列
<400> 75
<210> 76
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> mab127人源化抗體熱點突變i的HCDR2胺基酸序列
<400> 76
<210> 77
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> 抗CD73人源化抗體重鏈恆定區胺基酸序列
<400> 77
<210> 78
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> 抗CD73人源化抗體輕鏈恆定區胺基酸序列
<400> 78
<210> 79
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab108.64抗體重鏈胺基酸序列
<400> 79
<210> 80
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab108.64抗體輕鏈胺基酸序列
<400> 80
<210> 81
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab110.21抗體重鏈胺基酸序列
<400> 81
<210> 82
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab110.21抗體輕鏈胺基酸序列
<400> 82
<210> 83
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.31d抗體重鏈胺基酸序列
<400> 83
<210> 84
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> Hab127.31d抗體輕鏈胺基酸序列
<400> 84
Claims (36)
- 一種與人CD73特異性結合的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗CD73抗體或其抗原結合片段包含輕鏈可變區和重鏈可變區，其中：該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：27、28和29所示的輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3或包含與如SEQ ID NO：27、28和29所示的序列分別具有不超過3個胺基酸突變的LCDR變體；該重鏈可變區包含：i)分別如SEQ ID NO：10、11、12所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3或與如SEQ ID NO：10、11、12所示的序列分別具有不超過3個胺基酸突變的HCDR變體；或ii)分別如SEQ ID NO：16、17、18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3或與如SEQ ID NO：16、17、18所示的序列分別具有不超過3個胺基酸突變的HCDR變體；或iii)包含分別如SEQ ID NO：22、67和24所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3或與如SEQ ID NO：22、67和24所示的序列分別具有不超過3個胺基酸突變的HCDR變體。
- 如申請專利範圍第1項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗CD73抗體或其抗原結合片段以等於或小於10-9M解離平衡常數與人CD73結合。
- 如申請專利範圍第1或2項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗CD73抗體或其抗原結合片段包含：iv)分別如SEQ ID NO：10、11、12、13、14和15所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；或v)分別如SEQ ID NO：16、17、18、19、20和21所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3；或vi)如SEQ ID NO：23、68、69、70、71、72、73、74、75或76所示的HCDR2和分別如SEQ ID NO：22、24、25、14和26所示的HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體為鼠源抗體、嵌合抗體或人源化抗體。
- 如申請專利範圍第4項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其為鼠源或嵌合抗體或其抗原結合片段，其選自以下A-C中任一項：(A)包含如SEQ ID NO：4所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：5所示的輕鏈可變區的抗CD73抗體或其抗原結合片段；(B)包含如SEQ ID NO：6所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：7所示的輕鏈可變區的抗CD73抗體或其抗原結合片段；和(C)包含如SEQ ID NO：8所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：9所示的輕鏈可變區的抗CD73抗體或其抗原結合片段。
- 如申請專利範圍第4項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體為人源化抗體，該抗體的輕鏈框架區(FR)和重鏈框架區(FR)分別來源於人種系輕鏈和重鏈或其突變序列
- 如申請專利範圍第6項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該人源化抗體包含選自以下D-F中的任一項：D)分別如SEQ ID NO：10、11、12、13、14和15所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及重鏈框架區和輕鏈框架區；且該重鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：6Q、10G、30K、37V、44G、49G和94G；該輕鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：36L、42G、44I、60K、69S、71Y和85D；(E)分別如SEQ ID NO：16、17、18、19、20和21所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及重鏈框架區和輕鏈框架區；且該重鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：38K、44G、48I、66K、67A、69L和71A；該輕鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：36L、42G、44I、66R、71Y和85D；和(F)如SEQ ID NO：23、68、69、70、71、72、73、74、75或76所示的HCDR2和分別如SEQ ID NO：22、24、25、14和26所示的HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及重鏈框架區和輕鏈框架區；且該重鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：38M、44S、48I、67A、69L、71V、73K、82A R和94T；該輕鏈框架區包含選自以下一個或更多個的回復突變：36L、42G、44L、69S、70D和71Y；其中，該回復突變的位點根據Kabat編號規則編號。
- 如申請專利範圍第6或7項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該人源化抗體包含如SEQ ID NO：30、41或49所示的重鏈可變區或其變體。
- 如申請專利範圍第8項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈可變區變體是在SEQ ID NO：30、41或49所示的重鏈可變區的FR區上具有1-10個氨基酸的回復突變。
- 如申請專利範圍第9項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該重鏈可變區變體選自以下G-I中的任一項：(G)在如SEQ ID NO：30所示的重鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：E6Q、V10G、S30K、I37V、L44G、A49G和R94G；(H)在如SEQ ID NO：41所示的重鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：R38K、R44G、M48I、R66K、V67A、I69L和R71A；和(I)在如SEQ ID NO：49所示的重鏈可變區上中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：R38M、G44S、M48I、V67A、M69L、R71V、T73K、S82A R和R94T。
- 如申請專利範圍第6至10項中任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體包含選自以下J-L中任一項所述的重鏈可變區：(J)如SEQ ID NO：30、37、38、39或40所示的重鏈可變區；(K)如SEQ ID NO：41、45、46、47或48所示的重鏈可變區；和(L)如SEQ ID NO：49、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66所示的重鏈可變區。
- 如申請專利範圍第6或7項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體包含如SEQ ID NO：31、42或50所示的輕鏈可變區或其變體。
- 如申請專利範圍第12項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該輕鏈可變區變體是在SEQ ID NO：31、42或50所示的輕鏈可變區中的FR區具有1-10個胺基酸的回復突變。
- 如申請專利範圍第13項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該輕鏈可變區變體選自以下M-O任一項：(M)在如SEQ ID NO：31所示的輕鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：Y36L、K42G、P44I、S60K、T69S、F71Y和T85D；(N)在如SEQ ID NO：42所示的輕鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：Y36L、K42G、P44I、G66R、F71Y和T85D；和(O)在如SEQ ID NO：50所示的輕鏈可變區中的框架區上具有選自以下一個或更多個回復突變：Y36L、K42G、P44L、T69S、E70D和F71Y。
- 如申請專利範圍第6、7、12至14項中任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體包含選自以下P-R中的任一項所述的輕鏈可變區：(P)如SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36所示的輕鏈可變區；(Q)如SEQ ID NO：42、43或44所示的輕鏈可變區；和(R)如SEQ ID NO：50、51、52或53所示的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第6至15項中任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段包含選自以下S-U中的任一項所述的重鏈可變區和輕鏈可變區：(S)重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：30、37、38、39或40所示或與SEQ ID NO：30、37、38、39或40具有至少95%序列同一性，且輕鏈可變區胺基酸 序列如SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36所示或與SEQ ID NO：31、32、33、34、35或36具有至少95%序列同一性；(T)重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：41、45、46、47或48所示或與SEQ ID NO：41、45、46、47或48具有至少95%序列同一性，且輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：42、43或44所示或與SEQ ID NO：42、43或44具有至少95%序列同一性；和(U)重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：49、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66所示或與SEQ ID NO：49、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65或66具有至少95%序列同一性，且輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：50、51、52或53所示或與SEQ ID NO：50、51、52或53具有至少95%序列同一性。
- 如申請專利範圍第16項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段包含選自以下V-X中的任一項：(V)如SEQ ID NO：39所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：36所示的輕鏈可變區；(W)如SEQ ID NO：41所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：43所示的輕鏈可變區；和(X)如SEQ ID NO：61所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：52所示的輕鏈可變區。
- 如申請專利範圍第1至17項中任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體包含恆定區。
- 如申請專利範圍第18項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體重鏈恆定區來源於人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的突變序列，輕鏈恆定區來源於人源κ、λ鏈或其突變序列。
- 如申請專利範圍第19項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體重鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：77所示或與SEQ ID NO：77具有至少85%序列同一性，該輕鏈恆定區的胺基酸序列如SEQ ID NO：78所示或與SEQ ID NO：78具有至少85%序列同一性。
- 如申請專利範圍第18至20項中任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體選自以下iv)-vi)中的任一項：iv)包含如SEQ ID NO：79所示或與SEQ ID NO：79具有至少85%序列同一性的重鏈和如SEQ ID NO：80所示或與SEQ ID NO：80具有至少85%序列同一性的輕鏈的抗CD73抗體；v)包含如SEQ ID NO：81所示或與SEQ ID NO：81具有至少85%序列同一性的重鏈和如SEQ ID NO：82所示或與SEQ ID NO：82具有至少85%序列同一性的輕鏈的抗CD73抗體；和vi)包含如SEQ ID NO：83所示或與SEQ ID NO：83具有至少85%序列同一性的重鏈和如SEQ ID NO：84所示或與SEQ ID NO：84具有至少85%序列同一性的輕鏈的抗CD73抗體。
- 如申請專利範圍第1至21項中任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段，其中，該抗原結合片段為選自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、雙抗體和dsFv。
- 一種分離的單株抗體或其抗原結合片段，其中，該抗體或其抗原結合片段與申請專利範圍第1至22項中中任一項所述的抗體或其抗原結合片段競爭性結合人CD73。
- 一種核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至23項中任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段。
- 一種載體，其包含如申請專利範圍第24項所述的核酸分子。
- 一種宿主細胞，其由申請專利範圍第25項所述的載體轉化獲得。
- 如申請專利範圍第26項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
- 如申請專利範圍第27項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為真核細胞。
- 如申請專利範圍第28項所述的宿主細胞，其中，該宿主細胞為哺乳動物細胞。
- 一種製備如申請專利範圍第1至23項中任一項所述抗CD73抗體或其抗原結合片段的方法，所述方法包括以下步驟：在適合的培養基中、在適於生長的條件下培養申請專利範圍第26至29項中任一項所述的宿主細胞，然後從該培養基中純化並回收宿主細胞表達的抗CD73抗體或其抗原結合片段。
- 一種醫藥組成物，其含有如申請專利範圍第1至23項中任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段或申請專利範圍第24項所述的核酸分子，以及一種或多種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。
- 一種用於體外檢測待測樣本中人CD73的方法，該方法包括：使用如申請專利範圍第1至23項中任一項所述抗CD73抗體或其抗原結合片段，或如申請專利範圍第31項所述醫藥組成物接觸待測樣本；確定所述待測樣本中人CD73的存在或水平。
- 如申請專利範圍第1至23項中任一項所述的抗CD73抗體或其抗原結合片段、或如申請專利範圍第24項所述的核酸分子、或如申請專利範圍第31項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備用於治療或預防疾病或病症的藥物。
- 如申請專利範圍第33項所述的用途，其中，該疾病或病症與人CD73相關。
- 如申請專利範圍第33或34項所述的用途，其中，該疾病或病症是腫瘤。
- 如申請專利範圍第35項所述的用途，其中，該疾病或病症是乳腺癌、神經膠質瘤、膀胱癌、結腸癌、黑色素瘤、卵巢癌、甲狀腺癌、食道癌、肺癌、腎癌、胰腺癌、淋巴瘤、前列腺癌或胃癌。
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