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TW202015703A - 包含內含吉西他濱之脂質體組成物及免疫檢查點抑制劑之組合醫藥 - Google Patents

包含內含吉西他濱之脂質體組成物及免疫檢查點抑制劑之組合醫藥 Download PDF

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TW202015703A
TW202015703A TW108121529A TW108121529A TW202015703A TW 202015703 A TW202015703 A TW 202015703A TW 108121529 A TW108121529 A TW 108121529A TW 108121529 A TW108121529 A TW 108121529A TW 202015703 A TW202015703 A TW 202015703A
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泉泰之
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Abstract

本發明的課題為提供一種將脂質體內含溶解狀態的吉西他濱 (gemcitabine)之脂質體組成物及免疫檢查點抑制劑組合而得到之醫藥。依本發明，可提供一種將(A)脂質體組成物及(B)免疫檢查點抑制劑組合而同時或依次之醫藥，該(A)脂質體組成物係含有具有內水相之脂質體和構成外水相之分散脂質體之水溶液之脂質體組成物，其中脂質體內含溶解狀態的吉西他濱。

Description

包含內含吉西他濱之脂質體組成物及免疫檢查點抑制劑 之組合醫藥
本發明係關於一種將免疫檢查點抑制劑及內含吉西他濱(gemcitabine)之脂質體組成物組合而同時或依次投予之醫藥。
近年來習知癌利用迴避免疫監視機制之系統。癌免疫療法係作用於癌患者所具有之免疫監視機制而增強對癌的免疫力，藉此抑制癌的進展或治療癌之療法。作為該種迴避系統中所利用之分子，習知CTLA-4、PD-1或作為其配位子(ligand)之PD-L1等免疫檢查點分子(專利文獻1及2)。
又，記載有如下內容：人抗PD-1或其抗原結合部分與化學療法劑的共同投予(co-administration)中，賦予以不同機制發揮作用之兩種抗癌劑，該等對人腫瘤細胞帶來細胞毒性效果(專利文獻1及2)。但是，在專利文獻1及2中，在人抗PD-1或其抗原結合部分與化學療法劑的共同投予中，關於使用脂質體之抗癌劑並沒有進行記載。
又，在Opdivo Q&A的網站中，針對可否與化學療法劑併用之提問，由於與癌化學療法劑併用時之有效性和安全性並未確立，因此有無法併用之揭示(非專利文獻1)。
另一方面，在化學療法中，存在對癌細胞的攻擊受到藥物的 曝露時間的很大影響者。例如，如抑制DNA合成之代謝拮抗劑之類的藥物僅攻擊處於DNA合成期之一部分細胞，因此若曝露時間短，則得不到有效的殺細胞性。在該種藥物中，若投予後的體內代謝快，則無法得到腫瘤中之充分的曝露時間，得不到所期待之藥效之情況多(專利文獻3及4)。
習知藉由在脂質體的內水相中以溶解狀態內含藥物並將脂質體組成物設為高滲的條件來促進藥物從脂質體組成物中之釋放，能夠實現更適當的藥物遞輸(專利文獻3及4)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2006/121168號
[專利文獻2]日本特開2006-340714號公報
[專利文獻3]國際公開第2015/166985號
[專利文獻4]國際公開第2015/166986號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]“ONO ONCOLOGY Opdivo Q&A可否與化學療法劑併用？”、[online]、掲載年月日不明、ONO PHARMACEUTICAL CO.,LTD.、[2018年5月2日檢索]、因特網<URL：https：//www.ono-oncology.jp/contents/patient/opdivo_faq/11.html>
本發明的課題為提供一種將免疫檢查點抑制劑和內含抗癌劑之脂質體組成物組合而得到之組合醫藥及其投予方法。又，本發明的課 題為提供一種將免疫檢查點抑制劑和內含抗癌劑之脂質體組成物組合而得到之組合醫藥及使用該組合醫藥之治療方法。
本發明人等反覆進行了深入探討，其結果發現了將(A)脂質體組成物及(B)免疫檢查點抑制劑組合而同時或依次投予之醫藥解決上述課題，並完成了本發明，該(A)脂質體組成物係含有具有內水相之脂質體和構成外水相之分散脂質體之水溶液之脂質體組成物，其中脂質體內含溶解狀態的吉西他濱。
本發明提供以下。
一種醫藥，其係將(A)脂質體組成物及(B)免疫檢查點抑制劑組合而同時或依次投予，該(A)脂質體組成物係含有具有內水相之脂質體和構成外水相之分散脂質體之水溶液之脂質體組成物，其中脂質體內含溶解狀態的吉西他濱。
如前述[1]所述之醫藥，其中前述脂質體組成物係如下脂質體組成物：脂質體的內水相的浸透壓相對於外水相的浸透壓為2倍以上且8倍以下，吉西他濱從脂質體中的釋放速度在人血漿中於37℃下為10質量%/24hr以上且70質量%/24hr以下。
如前述[1]所述之醫藥，其中前述脂質體組成物係如下脂質體組成物：相對於脂質體組成物的脂質成分的合計量，膽固醇類的含有率為10mol%以上且35mol%以下，內水相的浸透壓相對於外水相的浸透壓為2倍以上且8倍以下。
如前述[1]至[3]中任一項所述之醫藥，其中前述免疫檢查點抑制劑包 含選自PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4的抑制劑中之至少一種。
如前述[4]所述之醫藥，其中前述免疫檢查點抑制劑包含選自PD-1、PD-L1及CTLA-4的抑制劑中之至少一種。
如前述[1]至前述[5]中任一項所述之醫藥，其中前述投予係在治療上顯示出協同作用之有效投予量及投予期間。
如前述[1]至前述[6]中任一項所述之醫藥，其中前述投予的對象對吉西他濱具有耐性。
[8]一種治療方法，其係患癌之對象的治療方法，其中在治療上顯示出協同作用之有效投予量及投予期間內，
將(A)脂質體組成物及(B)免疫檢查點抑制劑組合而同時或依次投予，該(A)脂質體組成物係含有具有內水相之脂質體和構成外水相之分散脂質體之水溶液之脂質體組成物，其中脂質體內含溶解狀態的吉西他濱。
如前述[8]所述之治療方法，其中前述脂質體組成物係如下脂質體組成物：脂質體的內水相的浸透壓相對於外水相的浸透壓為2倍以上且8倍以下，吉西他濱從脂質體中之釋放速度在人血漿中於37℃下為10質量%/24hr以上且70質量%/24hr以下。
如前述[8]所述之治療方法，其中前述脂質體組成物係如下脂質體組成物：相對於脂質體組成物的脂質成分的合計量，膽固醇類的含有率為10mol%以上且35mol%以下，內水相的浸透壓相對於外水相的浸透壓為2倍以上且8倍以下。
如前述[8]至[10]中任一項所述之治療方法，其中前述免疫檢查點抑 制劑包含選自PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4的抑制劑中之至少一種。
如前述[11]所述之治療方法，其中前述免疫檢查點抑制劑包含選自PD-1、PD-L1及CTLA-4的抑制劑中之至少一種。
如前述[8]至前述[12]中任一項所述之治療方法，其中前述投予的對象對吉西他濱具有耐性。
一種醫藥，其用於前述[8]至前述[12]中任一項所述之治療方法，該醫藥包含脂質體內含溶解狀態的吉西他濱之脂質體組成物，該脂質體組成物用於與免疫檢查點抑制劑組合而投予且含有具有內水相之脂質體和構成外水相之分散脂質體之水溶液。
本發明的醫藥作為將脂質體內含溶解狀態的吉西他濱之脂質體組成物及免疫檢查點抑制劑組合而同時或依次投予之醫藥，具有對癌的治療或預防中的至少一種效果。
又，本發明的醫藥可維持內含溶解狀態的吉西他濱之脂質體組成物所具有之長的血中半衰期和即使少量亦具有強的抗腫瘤活性這樣的優異之性質，且藉由將免疫檢查點抑制劑組合而同時或依次投予，具有相較於基於脂質體內含溶解狀態的吉西他濱之脂質體組成物或免疫檢查點抑制劑單劑之效果高的顯著且意想不到的腫瘤增殖抑制效果。
另外，本發明的醫藥即使為低投予量亦具有腫瘤增殖抑制效果，因此對於包含患者之對象而言，能夠進行安全性高而且身體的負担少且便利性亦高這樣的理想的治療。
圖1表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之體重的變化。
圖2表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之腫瘤體積的變化。
圖3表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖4表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖5表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖6表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖7表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖8表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖9表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖10表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體 的腫瘤體積的變化。
圖11表示將腫瘤體積超過體重的10%之檢體安樂死時之存活率(Tumor Free Survival %)及基於卡本-麥爾(Kaplan-Meier)法之存活曲線的結果。
圖12表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之腫瘤體積的變化。
圖13表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖14表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖15表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖16表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖17表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖18表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖19表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖20表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖21表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖22表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖23表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖24表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖25表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖26表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖27表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖28表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各個個體的腫瘤體積的變化。
圖29表示將腫瘤體積超過體重的10%之檢體安樂死時之存活率(Tumor Free Survival %)及基於卡本-麥爾法之存活曲線的結果。
圖30表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各群的CD8陽性T細胞的比例的平均值。
圖31表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各群的 M1細胞的比例的平均值。
圖32表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之藥效試驗中之各群的M2細胞的比例的平均值。
圖33表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之對CD8陽性T細胞的影響驗證試驗中之對照群的各個個體的腫瘤體積的變化。
圖34表示使用EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠之對CD8陽性T細胞的影響驗證試驗中之抗CD8抗體投予群的各個個體的腫瘤體積的變化。
圖35表示人的循環血中及腫瘤中的免疫細胞構成變化驗證試驗中之循環血中的從被驗物質投予前起算之CD8陽性T細胞中的Ki67陽性細胞的比例變化。
圖36表示人的循環血中及腫瘤中的免疫細胞構成變化驗證試驗中之循環血中的從被驗物質投予前起算之Treg中的Ki67陽性Treg的比例變化。
圖37表示人的循環血中及腫瘤中的免疫細胞構成變化驗證試驗中之循環血中的從被驗物質投予前起算之Total MDSC中的M-MDSC的比例變化。
圖38表示在被驗物質投予前和第2次投予後15天後之間比較人的循環血中及腫瘤中的免疫細胞構成變化驗證試驗中之腫瘤中的Total MDSC中的M-MDSC細胞的比例之值。
以下，對本發明詳細說明。
本說明書中，使用沒有特別指定，則%表示質量百分比。本說明書中， 關於組成物中的各成分的量，當在組成物中存在複數種對應於各成分之物質時，只要沒有特別指定，則指存在於組成物中之對應之複數種物質的合計量。
本說明書中，只要沒有特別指定，則各術語具有如下含義。
“~”表示將其前後所記載之數值分別作為最小值及最大值而包含之範圍。
對象包含人及人以外的哺乳動物。作為人以外的哺乳動物，例如可以舉出猴子、狗、貓、牛、馬、小鼠、大鼠等。
處置可以為實現所期望之治療效果、例如狀態進展的抑制或延遲之任意的處置及療法即可，包含進展速度的降低、進展速度的停止、狀態的好轉、狀態的治癒或減緩(不論局部減緩或完全減緩均可)、狀態中的1個或複數個症狀和/或徵兆的預防、延遲、減輕或停止、或者對象或對象的存活在未進行處置下比預測的壽命得到延長。
處置還包含預防。例如，藉由對癌容易發作或復發或者有發作或復發之風險之對象進行處置，能夠預防或能夠延遲對象中之癌的發作或復發。
處置能夠包含包括癌的完全減緩在內之癌生長的抑制和/或癌轉移的抑制。癌的生長係指癌變為更發達之形態。作為用於測定癌生長的抑制之指標，可以舉出癌細胞存活的減少、腫瘤體積或形態的減小(例如，使用電腦斷層攝影(CT)、超音波檢查或其他圖像診斷方法來確定)、腫瘤生長的延遲、腫瘤脈管結構的破壞、延遲型過敏症皮膚試驗成績的改 善、細胞溶解性T-淋巴球活性的增加及腫瘤特異性抗原水平的降低等。
本發明中，將腫瘤、惡性腫瘤、癌、惡性新生物、癌瘤、肉瘤等統稱並表現為“腫瘤”或“癌”。又，“腫瘤”或“癌”包含癌的治療後復發者。“腫瘤”包含惡性或良性的所有新生物細胞生長及增殖、以及癌前性及癌性細胞及組織。
“有效量”係為了達成所期望之治療的或預防結果而所需要之投予量，包含投予之時間、量。本發明的醫藥的“有效量”可根據對象(或個體)的疾病狀態、年齡、性別及體重以及在對象(或個體)中引起所期望之反應之醫藥的能力等而有所變動。
“同時投予”係指以約10分鐘、約5分鐘或約1分鐘以內中的任一個等約15分鐘以內的時間間隔投予組合療法中之第1療法和第2療法。當同時投予第1療法和第2療法時，既能夠將第1療法及第2療法含於相同之組成物(例如，包含第1療法及第2療法這兩者之組成物)中，亦能夠含於個別的組成物中(例如，將第1療法含於1個組成物中且將第2療法含於另一組成物中)。
“依次投予”這一術語係指以約20分鐘、約30分鐘、約40分鐘、約50分鐘、約60分鐘或比其長的時間(1天、2天、3天、1週、2週、3週等)中的任一個等超過約15分鐘之時間間隔投予組合療法中之第1療法及第2療法。本發明中，依次投予既能夠首先投予第1療法，亦包含首先投予第2療法之情形。又，本發明中，依次投予還包含在實施第1療法之後(既定的時間之後(例如，1週後))實施第2療法之情形。既能夠 將第1療法和第2療法含於個別的組成物中，亦能夠將該等含於相同之包裝(package)或試劑盒(kit)中，亦能夠含於不同之包裝或試劑盒中。
(本發明的醫藥)
本發明的醫藥係如下醫藥：其係將(A)脂質體組成物及(B)免疫檢查點抑制劑組合而同時或依次，該(A)脂質體組成物係含有具有內水相之脂質體和構成外水相之分散脂質體之水溶液之脂質體組成物，其中脂質體內含溶解狀態的吉西他濱。
((A)脂質體組成物)
脂質體係由使用脂質之脂質雙層膜形成之閉鎖小胞體，在該閉鎖小胞的空間內具有水相(內水相)。內水相中包含水等。脂質體通常以分散於閉鎖小胞體外的水溶液(外水相)之狀態存在。本發明中，脂質體組成物係指包含脂質體及脂質體外所包含之水溶液、成分等之組成物。脂質體可以為單一層狀物(single lamellar)(亦被稱為單層層狀物(single layer lamellar)或單層狀物(unilamellar)，係雙層膜為一層的結構。)，亦可以為多層層狀物(multilayer lamellar)(亦被稱為多層狀物(multilamellar)，係洋蔥狀形狀的複數個雙層膜的結構，各個層由水樣層隔開。)，但本發明中，從醫藥用途中之安全性及穩定性的觀點而言，較佳為單一層狀物的脂質體。“內含”係指對於脂質體而言，藥物呈包含於內水相中之形態。
脂質體的大小(平均粒徑)並不受特別限定，為2~200nm，較佳為5~150nm，更佳為5~120nm，進一步較佳為5~100nm。
當期待以下敘述之EPR效果(Enhanced permeation and retention effect (滲透性增強和滯留效果))時，關於脂質體的大小(平均粒徑)，實質上直徑較佳為50~200nm，實質上直徑更佳為50~150nm，實質上直徑進一步較佳為50~100nm。“實質上”這一術語係指脂質體的個數的至少75%在指定之直徑的範圍內。前述至少75%更佳為至少80%，進一步較佳為至少90%。
另外，本發明中，“平均粒徑”只要沒有特別指定，則指使用動態光散射法測定之平均粒徑(較佳為累積(cumulant)平均粒徑)。“平均粒徑”能夠使用藉由光散射法能夠測定平均粒徑之裝置來進行測定。
作為構成脂質體的脂質雙層之成分(膜成分)，包含脂質。作為脂質，能夠任意地使用溶解於水溶性有機溶劑及酯系有機溶劑的混合溶劑中者。作為脂質，可以舉出磷脂、磷脂以外的脂質、膽固醇類及該等的衍生物等。該等成分可以由單一種或複數種成分構成。
作為磷脂，可以舉出磷脂醯膽鹼(卵磷脂)、磷脂醯甘油、磷脂酸、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲胺酸、磷脂酸肌醇、鞘磷脂、心磷脂等天然或合成的磷脂、或者對該等進行氫化而成者(例如，氫化大豆磷脂醯膽鹼(HSPC))等。在該等之中，磷脂較佳為氫化大豆磷脂醯膽鹼等經氫化之磷脂、鞘磷脂等，更佳為氫化大豆磷脂醯膽鹼。另外，本發明中，“磷脂”還包含對磷脂施加修飾而成之磷脂衍生物。
作為磷脂以外的脂質，可以舉出不包含磷酸之脂質，並不受限定，可以舉出在其分子內不具有磷酸部分之甘油脂質(glycerolipid)、在其分子內不具有磷酸部分之神經脂質(sphingolipid)等。另外，本發明中， “磷脂以外的脂質”還包含對磷脂以外的脂質施加修飾而成之磷脂以外的脂質的衍生物。
當磷脂以外的脂質包含鹼性官能基時，例如為脂質中結合有具有鹼性官能基之化合物之物質時，脂質被稱為陽離子化脂質。陽離子化脂質例如能夠修飾脂質體的膜，能夠提高與標的部位的細胞的黏接性等。
作為膽固醇類，能夠舉出膽固醇。為了填平由脂質所引起之膜的應變，添加膽固醇等為有效。期待在脂質體組成物中膽固醇類的添加藉由填平脂質體的膜的間隙等來起到降低脂質體的膜的流動性之作用。
本發明中，發現了藉由在脂質體組成物的高的浸透壓條件下將膽固醇類的量控制在最佳的範圍能夠調節哺乳動物中之藥物釋放率這樣的意想不到的效果。
本發明中，脂質體組成物的脂質成分的合計(脂質體組成物中所包含之總脂質)mol中，膽固醇類的含有率為10~35mol%，較佳為15~25mol%，更佳為17~21mol%。
在脂質體中除了上述成分以外，為了改善血中滯留性而還可以添加親水性高分子等、作為膜結構的穩定劑之脂肪酸、二乙醯磷酸酯等、作為抗氧化劑之α-生育酚等。另外，本發明中，較佳為不包含在醫藥用途中以靜脈注射用途的使用未被認可之分散助劑等添加劑例如界面活性劑等。
本發明的脂質體中，作為磷脂、磷脂以外的脂質、膽固醇類及該等的衍生物，較佳為含有由親水性高分子修飾磷脂、磷脂以外的脂質、 膽固醇類而成者。
作為親水性高分子並不受特別限定，可以舉出聚乙二醇類、聚甘油類、聚丙二醇類、聚乙烯醇、苯乙烯-順丁烯二酸酐交替共聚物、聚乙烯吡咯啶酮、合成聚胺基酸等。上述親水性高分子分別能夠單獨使用或者組合使用2種以上。在該等之中，從製劑的血中滯留性的觀點而言，較佳為聚乙二醇類、聚甘油類、聚丙二醇類，更佳為聚乙二醇(PEG)、聚甘油(PG)、聚丙二醇(PPG)，通用聚乙二醇(PEG)，其具有提高血中滯留性之效果，因此為較佳。
PEG的分子量並不受特別限定，PEG的分子量為500~10,000道耳頓，較佳為1,000~7,000道耳頓，更佳為2,000~5,000道耳頓。
在本發明的脂質體中，較佳為與脂質包體中所包含之主要的脂質一同使用由PEG修飾之脂質(PEG修飾脂質)。
作為PEG修飾脂質，可以舉出1,2-二硬脂醯基-3-磷脂醯乙醇胺-PEG2000(Nippon Oil & Fats GmbH製造)、1,2-二硬脂醯基-3-磷脂醯乙醇胺-PEG5000(Nippon Oil & Fats GmbH製造)及二硬脂醯甘油-PEG2000(Nippon Oil & Fats GmbH製造)等1,2-二硬脂醯基-3-磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇。
該等PEG修飾脂質只要以相對於總脂質量含有0.3~50質量%、較佳為0.5~30質量%、更佳為1~20質量%之方式添加即可。
在本發明的脂質體中，較佳為氫化大豆磷脂醯膽鹼(脂質體中所包含之主要的脂質)、1,2-二硬脂醯基-3-磷脂醯乙醇胺-聚乙二醇(與主 要的脂質併用之脂質)及膽固醇的脂質的組合。
在本發明的脂質體組成物中，較佳為不包含陰離子聚合物(聚陰離子)。
對適用於本發明的醫藥中之吉西他濱進行說明。吉西他濱的化學名為(+)-2'-脫氧-2',2'-二氟胞苷，係具有代謝拮抗作用之抗癌劑。本發明中，吉西他濱可以為吉西他濱其本身，亦可以為作為醫藥品而可接受之鹽，亦可以為在活體內使吉西他濱游離之前藥。本發明中，較佳為使用吉西他濱鹽酸鹽。
內含於本發明的脂質體中之吉西他濱在脂質體的內水相中以溶解狀態存在。在此，所謂溶解狀態，當相對於脂質體的體積，所填充之藥物的量為其內水相的組成液中之藥物的飽和溶解度以下時，視為以溶解狀態內含者。
又，即使在飽和溶解度以上時，在Cryo-TEM中觀察不到藥物晶體、在XRD測定中觀察不到起因於晶格之衍射圖案時，視為吉西他濱以溶解狀態內含者。
(脂質體組成物的製造方法)
本發明的脂質體的製造方法只要為能夠製造脂質體內含溶解狀態的吉西他濱之脂質體組成物之方法，則並不受特別限定。以下詳細敘述之脂質體組成物的製造方法的各製程例如能夠參閱國際公開第2015/166985號、國際公開第2015/166986號來實施。
本發明中，較佳為具有如下製程之脂質體組成物的製造方法： 乳化製程，不經乾燥固化製程而將溶解於有機溶劑中之脂質進行乳化而形成脂質體；藥物負載(loading)製程，使水溶性藥物內含於在乳化製程中所得到之脂質體中；及浸透壓調整製程，將脂質體的內水相的浸透壓調整為相對於外水相的浸透壓為2倍以上且8倍以下。
脂質體組成物的製造方法根據需要可以包含使在乳化製程中所使用之有機溶劑蒸發之蒸發製程等其他製程。
在不經乾燥固化製程而藉由將溶解於有機溶劑中之脂質進行乳化而形成脂質體之乳化製程中，只要為乳化之製程，則並不受限定，但較佳為施加高剪切而在包含有機溶劑之乳化製程中進行微粒化之製程。根據需要，能夠藉由使在乳化製程中所使用之有機溶劑蒸發(進行去溶劑)來形成脂質體。
(乳化製程)
在乳化製程中，混合至少一種的脂質溶解於有機溶劑中之油相和水相並攪拌包含脂質之水溶液來進行乳化。藉由混合脂質溶解於有機溶劑中之油相及水相並進行攪拌來進行乳化，可製備油相及水相以O/W型乳化之乳化液。混合後，藉由後述之蒸發製程來去除源自油相之有機溶劑的一部分或全部，從而形成脂質體。或者，油相中的有機溶劑的一部分或全部在攪拌/乳化的過程中蒸發而形成脂質體。
作為攪拌之方法，為了粒子微細化而使用超音波或機械剪切力。又，為了粒徑的均勻化，能夠進行通過一定孔徑的過濾器之擠壓機處理或微細流體均質機(microfluidizer)處理。若使用擠壓機等，則能夠將次 生形成之多囊脂質體(multivesicular liposome)分解而製成單囊脂質體。
本發明中，從製造製程的簡化的觀點而言，較佳為將未負載藥物之狀態的脂質體不進行擠壓處理而用於下一個製程。
(油相)
作為用作油相之有機溶劑，使用水溶性有機溶劑及酯系有機溶劑的混合溶劑。本發明中，作為有機溶劑，較佳為實質上不使用如氯仿、二氯甲烷、己烷或环己烷之類的有機溶劑，更佳為完全不使用該等有機溶劑。
水溶性有機溶劑並不受特別限定，但較佳為具有能夠與水任意地混合之性質之有機溶劑。具體而言，水溶性有機溶劑可以舉出甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、第三丁醇等醇類、甘油、乙二醇、丙二醇等二醇類、聚乙二醇等聚伸烷基二醇類等。在該等之中，較佳為醇類。
酯系有機溶劑並不受特別限定，但較佳為由有機酸及醇的反應得到之酯。具體而言，酯系有機溶劑較佳為選自乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸異丙酯、乙酸第三丁酯及丙酸甲酯中之至少一種。
脂質的濃度並不受特別限定，能夠適當地進行調整，作為將水溶性有機溶劑與酯系有機溶劑的混合液作為溶劑之溶液，為40g/L~250g/L，較佳為100g/L~200g/L即可。
(水相)
水相係指外水相及內水相。本發明中之外水相係指分散脂質體之水溶液。例如在注射劑的情況下，經小玻璃瓶(vial)或預填充式注射器(Prefilled syringe)包裝而保管之脂質體的分散液中佔據脂質體的外側之溶液成為外水相。又，關於在利用所附帶之分散用液或其他溶解液投予時使用時分散而成之液體，亦同樣地，脂質體的分散液中佔據脂質體的外側之溶液成為外水相。
本發明中之內水相係指將脂質雙層膜隔開之閉鎖小胞內的水相。在製造脂質體時，作為分散脂質體之水溶液(外水相)，可以較佳地使用水(蒸餾水、注射用水等)、生理鹽水、各種緩衝液、糖類的水溶液及該等的混合物(水性溶劑)。
作為緩衝液，並不限定於有機系、無機系，可以較佳地使用在接近體液之氫離子濃度附近具有緩衝作用之緩衝液，可以舉出磷酸緩衝液、托立斯緩衝液(tris buffer)、檸檬酸緩衝液、乙酸緩衝液、古德氏緩衝液(Good's buffer)等。水相的pH並不受特別限定，為5~9，較佳為7~8即可。例如，較佳為使用磷酸緩衝液(例如，pH=7.4)。脂質體的內水相可以為在製造脂質體時分散脂質體之水溶液，亦可以為新添加之水、生理鹽水、各種緩衝液、糖類的水溶液及該等的混合物。用作外水相或內水相之水較佳為不包含雜質(塵土、化學物質等)。生理鹽水係指被調整為與人體等滲之無機鹽溶液，可以進一步具有緩衝功能。作為生理鹽水，可以舉出含有0.9w/v%的氯化鈉之鹽水、磷酸緩衝生理鹽水(以下，亦稱為PBS)及托立斯緩衝生理鹽水等。
(蒸發製程)
本發明中，根據需要可以設置蒸發製程。在蒸發製程中，使有機溶劑 從包含在乳化製程中所得到之脂質體之水溶液中蒸發。蒸發製程係包含將源自油相之有機溶劑的一部分或全部在蒸發製程中強制性地去除之製程及油相中的有機溶劑的一部分或全部在攪拌/乳化的過程中自然蒸發之製程中的至少一個。
為了去除未曾包含於脂質體中之成分或者調整濃度或浸透壓，包含經乳化製程而製備之脂質體之水溶液可以利用離心分離、超濾、透析、凝膠過濾、冷凍乾燥等方法進行後處理。所得到之脂質體能夠使用透析法、過濾法、擠壓處理等而使粒徑變得均勻。在本發明的脂質體組成物的製造方法中，較佳為不進行擠壓處理而製備未負載藥物之狀態的空的脂質體。
(擠壓處理)
擠壓處理係指藉由使脂質體通過具有細孔之過濾器而實施物理剪切力來進行微粒化之製程。在使脂質體通過時，藉由將脂質體分散液及過濾器保溫為構成脂質體之膜的相轉移溫度以上的溫度，能夠迅速地進行微粒化。
(藥物負載製程)
在本發明的藥物負載製程中，當將水溶性藥物囊封於脂質體中時，能夠將藥物溶解於使藥物水合、膨潤之水性媒體中，並藉由相轉移溫度以上的加熱、超音波處理或擠壓等方法使藥物內含於脂質體的內水相中。又，亦能夠使藥物溶解於脂質乳化時之水相中而使其內含於內水相中。
(浸透壓調整製程)
本發明中，藉由浸透壓調整製程，使脂質體的內水相成為高滲(壓力差)，藉此藥物變得容易釋放。藉由設定浸透壓，能夠控制釋放速度。作為浸透壓調整製程並不受特別限定，在藥物負載製程之後能夠採用透析等方法。浸透壓調整製程能夠參閱國際公開第2015/166985號或國際公開第2015/166986號。
本發明中，藉由進行釋放(release)的控制，例如，當使用本發明的脂質體組成物作為藥物遞輸系統時，在作為標的之患部，能夠將所需要之藥物釋放所需要之量。但是，高滲的脂質體容易釋放藥物，而在保管時亦變得容易漏出等難以與保管穩定性兼顧。依本發明的脂質體組成物，對於由經乳化之脂質得到之具有內水相之脂質體，以內水相的浸透壓相對於外水相的浸透壓為2倍以上且8倍以下的方式進行設定，藉此具有能夠兼顧藥物的易釋放性和保管穩定性這樣的意想不到的效果。
在本發明的脂質體組成物中，內水相的浸透壓相對於外水相的浸透壓為2倍以上且8倍以下，較佳為2.5倍~6倍，更佳為3倍~5倍。一般習知，藉由設為2倍以上，脂質體的脂質雙層膜顯示出雙層膜結構或交叉指結構等結構。若內水相的浸透壓相對於外水相成為2倍以上，則脂質體由雙層膜結構開始變為交叉指結構。本發明中，為了採用較佳的交叉指結構，設定各種脂質的條件即可，但較佳為藉由膽固醇比率的調整來進行控制。其結果，可得到能夠兼顧藥物的易釋放性和保管穩定性之脂質體組成物。
最終的藥物負載製程之後所得到之溶液中，外水相和內水相 的溶質已被均勻化，將此時的浸透壓能夠定義為完成之脂質體組成物的內水相的浸透壓。但是，限於在其後的基於外水相的透析之置換/浸透壓調整製程中加熱操作被抑制為脂質的相轉移以下等內水相的溶質充分被保持之情況。又，外水相的浸透壓能夠以最終的透析製程中所使用之透析液的浸透壓來定義。但是，限於利用透析液能夠充分置換之情況。又，對於脂質體組成物的完成液，利用離心分離或超濾對外水相的溶質的組成濃度和內水相的溶質的組成濃度進行定量，並測量該組成液的浸透壓，藉此亦能夠得到內水相及外水相的浸透壓。
浸透壓的測量按照第十六改正日本藥典中所記載之浸透壓測定法進行即可。具體而言，能夠藉由水的凝固點(冰點)下降度測定來求出滲莫(osmole)濃度。又，水的凝固點下降度係以溶質莫耳濃度定義者，由溶質莫耳濃度亦能夠求出滲莫濃度。
本發明中之外水相所具有之浸透壓在投予時對活體帶來重要的影響。當從體液的浸透壓大幅脫離時，產生以各組織中之水分的移動為原因之溶血或疼痛。因此，本發明中之外水相的浸透壓較佳為200~400mOsmol/L，更佳為250~350mOsmol/L，最佳為與體液等滲。
(無菌過濾)
藉由本發明的脂質體組成物的製造方法而得到之包含脂質體之水溶液較佳為進行無菌過濾。作為過濾的方法，能夠使用中空絲膜、逆滲透膜、薄膜過濾器(較佳為0.2μm的過濾滅菌過濾器)等從包含脂質體之水溶液中去除不需要的物質。
(本發明的脂質體組成物的添加劑等)
關於本發明的脂質體組成物，為了投予給對象，能夠藉由添加包括藥學上可接受之水溶液等媒體、鹽、保存劑、緩衝劑等在內之添加劑來進行製作。作為水性載體，可以舉出水、醇/水溶液、生理鹽水、非經口媒體，例如氯化鈉、葡萄糖等。作為靜脈內媒體，可以舉出水分及營養補充液。作為保存劑，可以舉出抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑及非活性氣體。脂質體組成物的pH及各種成分的濃度能夠調整為所期望之值。
本發明的脂質體組成物的投予方法較佳為非經口投予。例如，能夠選擇點滴等靜脈內注射(靜注)、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射、眼內注射、髓腔內注射。作為脂質體組成物的具體的投予方法，可以舉出基於注射器、點滴之投予。當本發明的脂質體組成物與本發明的免疫檢查點抑制劑組合而同時或依次投予時，能夠以在治療上顯示出協同作用之方式選擇有效投予量及投予期間。但是，本發明中，並不限於該等投予量。
(本發明的脂質體組成物的容器)
本發明的脂質體組成物的容器並不受特別限定，但較佳為氧透過性低的材質。例如，可以舉出塑膠容器、玻璃容器、由將鋁箔、鋁蒸鍍膜、氧化鋁蒸鍍膜、氧化矽蒸鍍膜、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚對苯二甲酸乙二酯、聚萘二甲酸乙二酯、聚偏二氯乙烯等作為阻氣層而具有之積層膜所形成之袋子等，根據需要，亦能夠藉由採用使用著色玻璃、鋁箔或鋁蒸鍍膜等之袋子等來遮光。為了防止由存在於容器內的空間部之氧所引起之氧化，較佳為由氮等非活性氣體來置換容器空間部及藥液中的氣體。例 如，可以舉出對注射液進行氮鼓泡(bubbling)並在氮氛圍下向容器中進行填充。
(釋放速度)
釋放速度係指每單位時間內向脂質體的外部滲出之藥劑量(在此為吉西他濱)。本發明中，釋放速度在血漿中於37℃下較佳為10質量%/24hr以上且70質量%/24hr以下，更佳為20質量%/24hr以上且60質量%/24hr以下，進一步較佳為20質量%/24hr以上且50質量%/24hr以下。
釋放速度依賴於溫度，因此較佳為在恆溫條件下進行測定。例如，在人的情況下，溫度並不受特別限定，但較佳為在體溫(35℃以上且38℃以下)的範圍內進行測定。
若釋放速度小於10質量%/24hr，則作為抗癌劑無法得到充分的在體內之曝露時間，得不到所期待之藥效之情況多，又，根據情況，包含抗癌劑之脂質體在體內不必要地殘留長時間，因此，存在藉由積蓄在皮膚等原本難以分佈之組織中而顯現意想不到的毒性之情況。又，若大於70質量%/24hr，則每單位時間的曝露之藥物量變多，因此最高血中濃度變高，藉此毒性變大，又，漏出之藥劑分佈於腫瘤部以外的組織或受到快速的代謝而血中滯留性降低，因此為不佳。
(腫瘤體積)
本發明中，為了測定腫瘤體積，對成為模型之動物(較佳為小鼠或大鼠)移植腫瘤。腫瘤體積的增殖抑制依賴於所使用之藥物、構成脂質體之脂質等的組合及有效量。腫瘤體積的增殖抑制係指能夠抑制腫瘤生長、或 者能夠達成腫瘤靜止及實質上或完全的腫瘤退縮中的至少一個。
當將本發明的脂質體組成物投予給哺乳動物等對象時，對於模型動物，分配為處置組及對照組(control group)，在腫瘤細胞移植的例如腫瘤細胞生長為100~1000mm以使腫瘤細胞固定之後能夠開始投予。
例如，當模型動物為小鼠時，作為本發明的脂質體組成物的評價，能夠對各組的小鼠，整體上每天測定體重，直至達到最低體重。能夠用游標卡尺(vernier)等測定腫瘤，直至採樣時的最終屠宰、直至腫瘤達到2000mm3或動物死亡。哺乳動物對象中的腫瘤體積能夠使用任意的在該領域中認可之方法來進行測定。例如，能夠藉由游標卡尺的測定，使用式：(a×b2)×0.5(式中，“a”為最大直徑，“b”為短徑的長度)來評價腫瘤體積。又，在人的情況下，能夠藉由如電腦斷層攝影法(CT)掃描、磁共振造影(MRI)掃描之類的圖像診斷等方法來測定腫瘤體積。
適用於本發明的醫藥之腫瘤並不受特別限定，能夠廣泛地適用於乳癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、直腸結腸癌、非何傑金氏淋巴瘤(NHL)、腎細胞癌、前列腺癌、肝細胞癌、胃癌、胰髒癌、軟組織肉瘤、卡波西(Kpasi)肉瘤、類癌瘤、頭部及頸部的癌、黑色素瘤、卵巢癌、膽管癌、中皮瘤及多發性骨髓瘤等一般的癌治療。本發明的醫藥較佳為用於使用吉西他濱之療法為有效之腫瘤疾病的治療，更佳為用於對吉西他濱具有耐性之腫瘤疾病的治療。
耐性係癌細胞對抗癌劑顯示出抵抗性(耐性)，其指從治療一開始抗癌劑就沒有效果之自然耐性和在持續治療之期間最初有效果之抗 癌劑顯示不出效果或效果減弱之狀態。具體而言，表示初期對抗癌劑有反應，但在其後的治療中顯示出反應性的降低，或者在細胞在使用抗癌劑之治療的過程中繼續增殖之觀點上對抗癌劑顯示不出適當的反應之性質。
((B)免疫檢查點抑制劑)
“免疫檢查點抑制劑”係指藉由抑制免疫檢查點與其配位子的結合而抑制基於該免疫檢查點之訊號傳遞之藥劑。作為免疫檢查點抑制劑，例如可以舉出在T細胞的表面上呈現之免疫檢查點及其配位子，具體而言，包含PD-1、CTLA-4、TIM3、LAG3、PD-L1、PD-L2、BTNL2、B7-H3、B7-H4、CD48、CD80、2B4、BTLA、CD160、CD60、CD86、或VISTA等分子，但本發明並不限定於該等。本發明中，免疫檢查點抑制劑較佳為抑制選自程序性細胞死亡蛋白1(PD-1)或對其之配位子的PD-L1、PD-L2等及細胞毒性T淋巴球抗原4(CTLA-4)中之至少一個之藥劑。PD-1(Programmed death(程序性死亡)-1，CD279)係屬於對淋巴球的活性化訊號的亢進和/或抑制起作用之CD28/CTLA-4家族之50~55kDa的I型膜蛋白。又，PD-L1(別名：B7-H1、CD274)及PD-L2(別名：B7-DC、CD273)係在抗原呈現細胞的表面上表達之PD-1的配位子。
免疫檢查點抑制劑只要為能夠結合於在T細胞的表面上呈現之免疫檢查點及其配位子之物質即可，能夠使用公知的抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體及抗CTLA-4抗體等中的至少一種。抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體等能夠從Bio X Cell公司的等購入。具體而言，免疫檢查點抑制劑可以舉出尼沃單抗(nivolumab)、派立珠單抗 ((pembrolizumab)、伊派利單抗(Ipilimumab)、阿替珠單抗(atezolizumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、阿維魯單抗(avelumab)、曲美目單抗(tremelimumab)、阿巴西普(abatacept)等，但並不限定於該等。又，作為免疫檢查點抑制劑，亦能夠併用抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體及抗PD-L2抗體中的至少1個和抗CTLA-4抗體。
本發明的免疫檢查點抑制劑能夠藉由經口或非經口投予而投予給對象，但較佳為非經口投予。具體而言，投予方法可以舉出注射投予、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。注射投予例如可以舉出靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射等。又，能夠根據對象的年齡、症狀適當地選擇投予方法。作為投予量，例如每一次投予時，對象的體重每1kg能夠在0.0001mg至1000mg的範圍選擇投予量。或者，每個患者能夠在0.001mg/body至100000mg/body的範圍選擇投予量。當本發明的免疫檢查點抑制劑與本發明的脂質體組成物組合而同時或依次投予時，能夠以在治療上顯現出協同作用之方式選擇有效投予量及投予期間。但是，本發明中，並不限於該等投予量。
(免疫檢查點抑制劑的添加劑等)
關於本發明的免疫檢查點抑制劑，為了投予給對象，能夠藉由除了添加抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗PD-L2抗體、抗CTLA-4抗體等以外，還添加包括藥學上可接受之水溶液等媒體、鹽、保存劑、緩衝劑等在內之添加劑來進行製作。詳細而言，同樣能夠適用上述本發明的脂質體組成物的添加劑等。
本發明的醫藥能夠用於治療具有對基於免疫檢查點抑制劑之治療呈不應性的癌之對象。例如，能夠對藉由免疫檢查點抑制劑的投予未出現所期望之藥效之對象進行基於本發明的醫藥之治療。
本發明的醫藥的作用機制雖然不明，但如下推測，但本發明並不限定於此。推測內含溶解狀態的吉西他濱之脂質體透過構成存在於腫瘤周圍之新生血管之內皮細胞的間隙，並聚集在腫瘤組織中，藉由滯留之EPR效果(Enhanced permeation and retention effect)而對腫瘤細胞具有優異之增殖抑制效果。
又，推測免疫檢查點抑制劑抑制與PD-1或其配位子的PD-L1、CTLA-4等免疫檢查點分子的相互作用，藉此增強對癌之免疫力，從而能夠抑制癌的進展或治療癌。
另外，本發明的醫藥將內含溶解狀態的吉西他濱之脂質體組成物及免疫檢查點抑制劑組合而同時或依次投予，藉此即使吉西他濱為少量亦具有強的抗腫瘤活性。又，具有相較於脂質體組成物或免疫檢查點抑制劑的單劑的治療，腫瘤增殖抑制效果高，或者，如實施例所示，在小鼠中之適用例中8例中的2例達到了完全減緩這樣的顯著且意想不到的效果。
[實施例]
以下，舉出實施例對本發明進行具體的說明，但本發明並不受該等的任何限定。可理解本發明能夠由本領域技術人員進行各種變更或修飾。該種變更或修飾只要不脫離本發明的範圍，則該等包含於本發明中。只要沒有特別記載，實施例中所使用之各種試劑使用了市售品。
(吉西他濱內含脂質體組成物(以下，亦稱為本發明的脂質體組成物或Lipo)的組成)
吉西他濱鹽酸鹽 0.57mg/mL
HSPC(注1) 11.3mg/mL
MPEG-DSPE(注2) 2.91mg/mL
膽固醇 1.39mg/mL
蔗糖 94mg/mL
L-組胺酸 1.55mg/mL
氯化鈉 0.188mg/mL
pH調節劑 適量
(注1)Hydrogenated Soy Phosphatidylcholine(氫化大豆磷脂醯膽鹼)
(注2)N(-Carbonyl-methoxypolyethylene glycol2000)-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine sodium salt(N(-羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸二醇胺鈉鹽)
吉西他濱鹽酸鹽從Teva Active Pharmaceutical Ingredients獲得。HSPC及MPEG-DSPE從NOF CORPORATION獲得。其他試劑使用了遵照美國藥典之市售品。
(吉西他濱內含脂質體組成物的物性值)
脂質體的內水相的浸透壓相對於外水相的浸透壓為3.8倍。
吉西他濱從脂質體中之釋放速度在人血漿中於37℃下為25%/24hr，相對於脂質體組成物的脂質成分的合計量，膽固醇類的含有率為18.9mol%， 平均粒徑為77nm。
抗PD-1抗體使用了(Bio X Cell公司的BE0146)。抗PD-L1抗體使用了(Bio X Cell公司的BE0101)。Isotype control抗體使用了(Bio X Cell公司的BE0090)。5%葡萄糖注射液(5%Glu)係葡萄糖為5g/100mL的水溶液。EMT6腫瘤細胞(ATCC公司，CRL-2755)的來源為小鼠乳腺，係具有吉西他濱耐性之腫瘤細胞。
(實施例1)
EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠中基於PD-L1併用之藥效試驗
作為被檢物質，使用了抗PD-L1抗體(以下，亦稱為PD-L1)、吉西他濱(以下，亦稱為Gem)及吉西他濱內含脂質體組成物(以下，本發明的脂質體組成物)。Gem使用了將吉西他濱鹽酸鹽(TEVA公司製造)溶解於生理鹽水而得到者。本發明的脂質體組成物使用了稀釋為5%葡萄糖注射液(以下，5%Glu；0.05g/mL)之物。
將作為小鼠乳癌細胞株之EMT6細胞3×106個移植到雌性Balb小鼠的側腹部皮下而形成了皮下腫瘤。將腫瘤體積作為指標，評價了PD-L1及Gem的併用投予、PD-L1及本發明的脂質體組成物的併用投予時之皮下腫瘤的抑制效果。
PD-L1及其Isotype control抗體(以下，亦稱為Iso抗體)腹腔內投予一週2次、共計3週，關於Gem、本發明的脂質體組成物及其溶劑(5%Glu)，尾靜脈投予了一週1次、共計3週。
3週的投予結束之後設為停藥狀態，繼續進行了2週腫瘤體 積的測定。腫瘤體積超過體重的10%之檢體在試驗中途安樂死，根據存活率(Tumor Free Survival %)進行了藥效分析。
作為群構成，群1設為5%Glu和Iso抗體(10mg/kg)的併用，群2設為5%Glu和PD-L1(10mg/kg)的併用，群3設為Gem(240mg/kg)和Iso抗體(10mg/kg)的併用，群4設為Gem(240mg/kg)和PD-L1(10mg/kg)的併用，群5設為本發明的脂質體組成物(1mg/kg)和Iso抗體(10mg/kg)的併用，群6設為本發明的脂質體組成物(1mg/kg)和PD-L1(10mg/kg)的併用，群7設為本發明的脂質體組成物(4mg/kg)和Iso抗體(10mg/kg)的併用，群8設為本發明的脂質體組成物(4mg/kg)和PD-L1(10mg/kg)的併用。
群1~5、7為比較例，群6、8為實施例。另外，關於各藥劑的投予量上限，將體重減少率不超過20%之量推定為MTD(最大耐用量)，並設定為未達到最低體重之用量。將群構成及投予量示於表1。在表1中，投予量表示作為活性體的吉西他濱之量，2次/3W表示一週2次投予3週，1次/3W表示一週1次投予3週，腹表示腹腔內投予，尾表示尾靜脈投予，Lipo表示本發明的脂質體組成物。又，Lipo(1)、Lipo(4)表示將本發明的脂質體組成物以1mg/kg、4mg/kg投予給對象。
[表1]
Figure 108121529-A0202-12-0032-51
將體重的變化示於圖1。將腫瘤體積的變化示於圖2(平均值)及圖3~10(各個個體)。將移植後第41天為止完全減緩之檢體數(腫瘤體積成為0之檢體)、群內的檢體數、完全減緩率(%)示於表2。
[表2]
Figure 108121529-A0202-12-0032-52
在群1、群2、群3、群4、群5及群6中，在投藥期間中無法阻止腫瘤增大而在移植後第41天的試驗結束日為止所有檢體成為安樂死的對象。在群7中顯示出優異之增殖抑制效果，但停藥後因再次增大而所有檢體成為安樂死的對象。在群8中顯示出優異之增殖抑制效果，停藥後 亦能夠確認腫瘤增大抑制作用，8例中2例達到了完全減緩。
求出腫瘤體積超過體重的10%之檢體安樂死時之存活率(Tumor Free Survival %)，並將基於卡本-麥爾法之存活曲線的結果示於圖11。在圖11中，數字表示群1~群8。作為存活時間延長效果的統計學分析，實施對數秩測試(Log-rank Test)，將群之間P值小於5%判定為統計學上有顯著差異。根據基於卡本-麥爾(Kaplan-Meier)法之存活曲線求出之中位數存活時間(Median survival)的計算或統計學分析處理中使用了Graghpad Prism version 5.03。將基於卡本-麥爾法之存活曲線的分析結果示於表3。
在表3的Log-rank Test中，a表示P<0.05者，b表示P<0.01者，c表示P<0.0001者，ns表示無顯著差異者。Undefined表示在Median survival分析中存活率不低於50%而無法分析者。
[表3]
Figure 108121529-A0202-12-0033-53
在群2或群3中，與群1相比，未觀察到顯著的存活時間的延長，PD-L1或Gem無法顯示出效果。另一方面，在群5或群7中，相對於群1觀察到統計學上顯著的存活時間延長效果。在併用效果的驗證中， 與群3相比，群4無法確認顯著的存活時間延長效果的變化，在群6中，相對於群5顯著增強了存活時間延長效果。另外，與群7相比，群8顯示出顯著的存活時間延長效果的增強，在移植後第41天的試驗結束日為止8例中7例存活。
根據以上結果，本發明的脂質體組成物在與PD-L1併用時，對於對Gem或PD-L1的效果具有抵抗性之EMT6腫瘤細胞，具有優異之增殖抑制效果，該增殖抑制效果顯示出相較於Gem和PD-L1的併用高。
(實施例2)
EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠中基於PD-1併用之藥效試驗
被檢物質使用了與實施例1相同之物。將作為小鼠乳癌細胞株之EMT6細胞3×106個移植到雌性Balb小鼠的側腹部皮下而形成了皮下腫瘤。將腫瘤體積作為指標，評價了PD-1及Gem的併用投予、PD-1及Lipo的併用投予時之皮下腫瘤的抑制效果。就被檢物質而言，關於PD-1及其溶劑(PBS；磷酸緩衝生理鹽水)腹腔內投予一週2次、共計3週，關於Gem、本發明的脂質體組成物及其溶劑(5%Glu)，尾靜脈投予了一週1次、共計3週。3週的投予結束之後設為停藥狀態，繼續進行了2週腫瘤體積的測定。
作為群構成，群1設為5%Glu和PBS的併用，群2設為5%Glu和PD-L1(10mg/kg)的併用，群3設為Gem(240mg/kg)和Iso抗體(10mg/kg)的併用，群4設為Gem(240mg/kg)和PD-1(10mg/kg)的併用，群5設為Lipo(2mg/kg)和PBS的併用，群6設為Lipo(2mg/kg)和PD-1(10mg/kg)的併用，群7設為Lipo(4mg/kg)和PBS的併用，群 8設為Lipo(4mg/kg)和PD-1(10mg/kg)的併用。群1~5、7為比較例，群6、8為實施例。另外，關於各藥劑的投予量上限，將體重減少率不超過20%之量設為MTD(最大耐用量)，並設定為未達到最低體重之用量。將群構成及投予量示於表4。在表4中，投予量表示作為活性體的吉西他濱之量，2次/3W表示一週2次投予3週，1次/3W表示一週1次投予3週，腹表示腹腔內投予，尾表示尾靜脈投予，Lipo表示本發明的脂質體組成物。又，Lipo(2)、Lipo(4)表示將本發明的脂質體組成物以2mg/kg、4mg/kg投予給對象。
[表4]
Figure 108121529-A0202-12-0035-54
將腫瘤體積的變化示於圖12(平均值)及圖13~20(各個個體)。將移植後第41天為止完全減緩(腫瘤體積為0)之檢體數、群內的檢體數、完全減緩率(%)、移植後第~天的腫瘤體積平均值示於表5，將移植後第~天的腫瘤體積標準誤差示於表6。在表5及表6中，完全減緩檢體數係指腫瘤體積成為0之情況。另外，作為對併用效果之統計學分析， 實施龐費洛尼多重比較測試(Bonferroni multiple comparisons test)，將相對於各移植後經時天數，群之間P值小於5%判定為統計學上有顯著差異。資料的處理中使用了Graghpad Prism version 5.03。
[表5]
Figure 108121529-A0202-12-0036-55
[表6]
Figure 108121529-A0202-12-0036-56
在表7中，a表示P<0.05者，b表示P<0.0001者，ns表示無顯著差異者。
[表7]
Figure 108121529-A0202-12-0037-57
在群1、群2、群3、群4及群5中，在投藥期間中無法阻止腫瘤增大而在移植後第41天的試驗結束日為止全隻成為安樂死的對象。在群7中顯示出優異之增殖抑制效果，但停藥後因再次增大而全隻成為安樂死的對象。在群6或群8中不僅顯示出優異之增殖抑制效果，停藥後亦能夠確認腫瘤增大抑制作用，8例中1例達到了完全減緩。
在併用效果的驗證中，在群4中，相對於群3無法顯示出基於PD-1併用之作用的增強。另一方面，在群6或群8中，在移植後第23天能夠顯示出基於併用之顯著的作用增強。
根據以上結果，可知本發明的脂質體組成物在與PD-1併用時，對於對Gem或PD-1的效果具有抵抗性之EMT6腫瘤細胞，具有優異之增殖抑制效果，該增殖抑制效果顯示出相較於Gem和PD-1的併用高的顯著且意想不到的效果。
(實施例3)
EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠中基於抗CTLA-4抗體併用之藥效試驗
作為被檢物質，使用了抗CTLA-4抗體(以下，亦稱為CTLA-4)、Ge m及本發明的脂質體組成物。Gem使用了將吉西他濱鹽酸鹽(TEVA公司製造)溶解於生理鹽水而得到者。本發明的脂質體組成物使用了稀釋為5%Glu之物。
將作為小鼠乳癌細胞株之EMT6細胞1.7×106個移植到雌性Balb/c小鼠的側腹部皮下而形成了皮下腫瘤。將腫瘤體積作為指標，評價了CTLA-4及Gem的併用投予、CTLA-4及本發明的脂質體組成物的併用投予時之皮下腫瘤的抑制效果。
CTLA-4及其溶劑(PBS)腹腔內投予一週2次、共計3週，關於Gem、本發明的脂質體組成物及其溶劑(5%Glu)，尾靜脈投予了一週1次、共計3週。
3週的投予結束之後設為停藥狀態，繼續進行了4週腫瘤體積的測定。腫瘤體積超過體重的10%之檢體在試驗中途安樂死，根據存活率(Tumor Free Survival %)進行了藥效分析。
作為群構成，群1設為5%Glu和PBS的併用，群2設為5%Glu和CTLA-4(10mg/kg)的併用，群3設為Gem(240mg/kg)和PBS的併用，群4設為Gem(240mg/kg)和CTLA-4(10mg/kg)的併用，群5設為本發明的脂質體組成物(1mg/kg)和PBS的併用，群6設為本發明的脂質體組成物(1mg/kg)和CTLA-4(10mg/kg)的併用，群7設為本發明的脂質體組成物(4mg/kg)和PBS的併用，群8設為本發明的脂質體組成物(4mg/kg)和CTLA-4(10mg/kg)的併用。
群1~5、7為比較例，群6、8為實施例。將群構成及投予 量示於表8。在表1中，投予量表示作為活性體的吉西他濱之量，2次/3W表示一週2次投予3週，1次/3W表示一週1次投予3週，腹表示腹腔內投予，尾表示尾靜脈投予，Lipo表示本發明的脂質體組成物。又，Lipo(1)、Lipo(4)表示將本發明的脂質體組成物以1mg/kg、4mg/kg投予給對象。
[表8]
Figure 108121529-A0202-12-0039-58
將各群中之每個個體的腫瘤體積的變化示於圖21~28。將移植後第52天為止完全減緩之檢體數(腫瘤體積成為0之檢體)、群內的檢體數、完全減緩率(%)示於表9。
[表9]
Figure 108121529-A0202-12-0039-59
在群1、群2、群3、群4、群5及群6中，在投藥期間中無法阻止腫瘤增大而在移植後第52天的試驗結束日為止，在群1、群3、群5中所有檢體成為安樂死的對象，在群2、群4、群6中8例中7例成為安樂死的對象。在群7中顯示出優異之增殖抑制效果，但投藥期間後觀察到腫瘤的增大，所有檢體成為安樂死的對象。在群8中顯示出優異之增殖抑制效果，即使在投藥期間後亦能夠確認腫瘤增大抑制作用，8例中7例達到了完全減緩。
求出腫瘤體積超過體重的10%之檢體安樂死時之存活率(Tumor Free Survival %)，並將基於卡本-麥爾法之存活曲線的結果示於圖29。在圖29中，Group 1~Group 8表示群1~群8。作為存活時間延長效果的統計學分析，實施對數秩測試(Log-rank Test)，將群之間P值小於5%判定為統計學上有顯著差異。根據基於卡本-麥爾(Kaplan-Meier)法之存活曲線求出之中位數存活時間(Median survival)的計算或統計學分析處理中使用了Graghpad Prism version 5.03。將基於卡本-麥爾法之存活曲線的分析結果示於表10。
在表10的Log-rank Test中，a表示P<0.05者，b表示P<0.001者，c表示P<0.0001者，ns表示無顯著差異者。Undefined表示在Median survival分析中存活率不低於50%而無法分析者。
[表10]
Figure 108121529-A0202-12-0041-60
在群2或群5中，與群1相比，觀察不到顯著的存活時間的延長，在群3或群7中，相對於群1觀察到統計學上顯著的存活時間延長效果。在併用效果的驗證中，與群3相比，群4無法確認顯著的存活時間延長效果的變化，在群6中，相對於群5顯著增強了存活時間延長效果。另外，與群7相比，群8顯示出顯著的存活時間延長效果的增強，在移植後第52天的試驗結束日為止8例中7例存活。
根據以上結果，本發明的脂質體組成物在與CTLA-4併用時，對於對Gem或CTLA-4的效果具有抵抗性之EMT6腫瘤細胞，具有優異之增殖抑制效果，該增殖抑制效果顯示出相較於Gem和CTLA-4的併用高。
(實施例4)
EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠中的腫瘤內免疫細胞構成變化
在腫瘤內浸潤有各種免疫細胞，其對腫瘤增殖帶來影響。該等免疫細胞中混合存在承擔抗腫瘤活性的中心之細胞毒性CD8陽性T細胞、NK細胞或以M1型巨噬細胞為中心之抗腫瘤型的免疫細胞、抑制該等免疫細胞之控制性T細胞(Treg)或以M2型巨噬細胞為中心之腫瘤增殖型的免疫細胞。
巨噬細胞中存在2種亞群(subset)(M1、M2)。M1型巨噬 細胞顯示出抗菌或抗細菌、抗腫瘤活性。M2型巨噬細胞顯示出組織修復、血管新生、腫瘤增殖的促進、免疫抑制的作用。認為隨著腫瘤的進展，浸潤於腫瘤組織中之巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAM；腫瘤相關巨噬細胞)從M1型巨噬細胞轉移(shift)到M2型巨噬細胞。據此，認為M1型巨噬細胞佔優勢對抗腫瘤作用非常重要，改變M1型巨噬細胞及M2型巨噬細胞的平衡有可能成為新的治療法。
承擔腫瘤免疫的主要功能之細胞毒性CD8陽性T細胞係藉由未敏化CD8陽性T細胞因抗原刺激等被敏化而分化、增殖者，承擔去除細菌感染細胞或癌細胞等之作用。藉由CD8陽性T細胞而被視為非己(no nself)之癌細胞被誘導為細胞死亡。另一方面，習知癌細胞藉由將Treg或M2型巨噬細胞之類的免疫抑制性的細胞吸引到周邊而抑制來自CD8陽性T細胞之攻擊，從免疫監視機制逃脫(參考文獻：Immunology.2013；138(2)：105-115.)。
若腫瘤內的CD8陽性T細胞的比例高且相較於M2型巨噬細胞，M1型巨噬細胞的比例高，則被稱為成為抗腫瘤環境(參考文獻：J Clin Invest.2012；122(3)；787-95)。因此，關於抗CTLA-4抗體及Gem的併用投予、抗CTLA-4抗體及本發明的脂質體組成物的併用投予時之腫瘤內免疫細胞的狀態，以CD8陽性T細胞的比例及顯示出抗腫瘤活性之M1型巨噬細胞、顯示出腫瘤增殖促進活性之M2型巨噬細胞的比例為指標來評價了是抗腫瘤環境還是腫瘤增殖環境。
將作為小鼠乳癌細胞株之EMT6細胞3.0×106個移植到雌性 Balb/c小鼠的側腹部皮下而形成了皮下腫瘤。
作為被檢物質，使用了抗CTLA-4抗體(以下，亦稱為CTLA-4)、Gem及本發明的脂質體組成物。Gem使用了將吉西他濱鹽酸鹽(TEVA公司製造)溶解於生理鹽水而得到者。本發明的脂質體組成物使用了稀釋為5%Glu之物。使用了如下個體：CTLA-4及其溶劑(PBS)腹腔內投予一週2次、共計3次，關於Gem、本發明的脂質體組成物及其溶劑(5%Glu)，尾靜脈投予了一週1次、共計3次。在投予開始第16、17天摘除腫瘤，將其用於腫瘤內免疫細胞的分析。
使用Tumor Dissociation Kit,mouse(目錄編號130-096-730，Miltenyi Biotec公司製造)將摘除之腫瘤設為細胞分散狀態，利用CD45(TIL)MicroBeads(目錄編號130-110-618，Miltenyi Biotec公司製造)分離出腫瘤內的免疫細胞。利用LIVE/DEAD(商標)Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit(目錄編號L34968，Invitrogen公司製造)對死細胞進行染色，使用以下熒光標記抗體對各種免疫細胞標記進行了染色。CD3使用了CD3 Antibody,Alexa Fluor(註冊商標)700(目錄編號56-0032-82，eBioscience公司製造)，CD8使用了CD8a-PE-Vio770,mouse(目錄編號130-102-358，Miltenyi Biotec公司製造)，CD11b使用了CD11b Monoclonal Antibody(M1/70)、eFluor 450(目錄編號48-0112-82，eBioscience公司製造)，F4/80使用了F4/80-APC,mouse(目錄編號130-102-379，Miltenyi Biotec公司製造)，MHC Class II使用了MHC Class II-APC-Vio770,mouse(目錄編號130-112-233，Miltenyi Biotec公司製造)，CD206使用了PE/Cy7 a nti-mouse CD206(MMR)Antibody(目錄編號141720，Biolegend公司製造)。樣品使用流動式細胞測量儀(Attune NxT，Invitrogen公司製造)進行了分析。對CD8陽性T細胞(CD3陽性、CD8陽性)、M1型巨噬細胞(CD11b陽性、F4/80陽性、MHC Class II陽性、CD206陰性)及M2型巨噬細胞(CD11b陽性、F4/80陽性、MHC Class II陰性、CD206陽性)進行鑒定，並計算出各細胞的比例。
作為群構成，群1設為5%Glu和PBS的併用，群2設為Gem(240mg/kg)和PBS的併用，群3設為本發明的脂質體組成物(4mg/kg)和PBS的併用，群4設為Gem(240mg/kg)和CTLA-4(10mg/kg)的併用，群5設為本發明的脂質體組成物(4mg/kg)和CTLA-4(10mg/kg)的併用。
群1、2及4為比較例，群3、5為實施例。將群構成及投予量示於表11。
在表11中，投予量表示作為活性體的吉西他濱之量，5次表示投予一週2次、共計5次，3次表示投予一週1次且投予共計3次，腹表示腹腔內投予，尾表示尾靜脈投予，Lipo表示本發明的脂質體組成物。又，Lipo(4)表示將本發明的脂質體組成物以4mg/kg投予給對象。
[表11]
Figure 108121529-A0202-12-0045-61
將各群中之各個體的比例及各群的平均值示於圖30(CD8陽性T細胞)、圖31(M1型巨噬細胞)及圖32(M2型巨噬細胞)。
在群1、群2、群3及群4中，腫瘤內的CD8 T細胞的比例沒有變化，但在群5中CD8陽性T細胞的浸潤顯著增加。又，若比較M1型巨噬細胞、M2型巨噬細胞的比例，則在群5中M1型巨噬細胞顯著增加，M2型巨噬細胞顯著減少。
根據以上結果，暗示著本發明的脂質體組成物在與CTLA-4併用時，使腫瘤內的M1型巨噬細胞與M2型巨噬細胞的平衡傾向於炎症狀態，藉由誘導CD8陽性T細胞的浸潤，可實現抗腫瘤效果。
(實施例5)
EMT6皮下移植荷瘤模型小鼠中CD8陽性T細胞對抗CTLA-4抗體併用效果的影響驗證
作為被檢物質，使用了抗CTLA-4抗體(以下，亦稱為CTLA-4)、抗CD8抗體及本發明的脂質體組成物。本發明的脂質體組成物使用了稀釋為5%Glu之物。
將作為小鼠乳癌細胞株之EMT6細胞0.5×106個移植到雌性Balb/c小鼠的側腹部皮下而形成了皮下腫瘤。以腫瘤體積為指標，藉由利用抗CD8抗體去除CD8陽性T細胞而評價了CTLA-4及本發明的脂質體組成物的併用投予時對抗腫瘤效果的影響。
抗CD8抗體、CTLA-4及其溶劑(PBS)腹腔內投予一週2次、共計6次，關於本發明的脂質體組成物及其溶劑(5%Glu)，尾靜脈投予了一週1次、共計3次。
作為群構成，群1設為CTLA-4及本發明的脂質體組成物的併用投予，群2設為抗CD8抗體、CTLA-4及本發明的脂質體組成物的併用。
將各群中之各個體的腫瘤體積示於圖33(群1)、圖34(群2)。
在群1中觀察到之抗腫瘤效果，在群2中藉由去除CD8 T細胞而完全消失。
根據以上結果，暗示著在本發明的脂質體組成物和CTLA-4的併用效果中，腫瘤內的CD8陽性T細胞的浸潤作為抗腫瘤效果的主要狀態而發揮作用。
(參考例)
人的循環血中及腫瘤中的免疫細胞構成變化
報道有在癌患者的末梢血液中，Treg或免疫抑制性的骨髓來源抑制細胞(MDSC；Myeloid-derived suppressor cells)增加，這與惡性度等有關聯。 控制性T細胞(Treg)對於迴避對自己之免疫反應之“免疫耐受性(immune tolerance)”發揮重要的作用，其另一方面，還參與癌細胞的“免疫逃脫(immune escape)”而抑制抗腫瘤免疫反應(參考文獻：J Transl Med.2016；14；282)。MDSC係顆粒球、樹狀細胞、巨噬細胞等前驅細胞，且係對細胞介素等腫瘤產生因子作出反應而被誘導，且分化度亦多種多樣的非常多樣的細胞集團。習知最重要的功能為免疫反應的抑制，且其抑制機制亦非常多樣。據此，MDSC係與控制性T細胞同時為對癌患者的免疫抑制狀態發揮重要作用之細胞，近年來作為成為癌免疫療法的障礙之細胞而備受矚目(參考文獻：日本耳鼻咽喉科免疫過敏學會(JJIAO)2013；30(4)：271-278.)。
因此，在本發明的脂質體組成物的第1相試驗中，評價了投予了本發明的脂質體組成物之癌患者中之循環血中的CD8陽性T細胞、免疫抑制性的Treg、MDSC、以及腫瘤中的MDSC細胞的變化。
作為被檢物質，使用了本發明的脂質體組成物。投予量及日程如表12所示。
[表12]
Figure 108121529-A0202-12-0047-62
末梢血液中的免疫細胞的分析在被驗物質投予前(C1D1)、第1次投予7天後(C1D8)、第1次投予14天後(C1D15)、第2次投予14天後(C2D1)進行了測定，1個細胞分析在被驗物質投予前(pre-dose)、第2次投予15天後(C2D2)進行了測定。
將作為增殖指標之Ki67陽性CD8陽性T細胞相對於患者的循環血中Total CD8陽性T細胞(CD3陽性、CD8陽性)的比例從C1D1的變化示於圖35。將Ki67陽性Treg相對於循環血中Total Treg(CD3陽性、CD25陽性、CD127陰性、foxp3陽性)的從C1D1的變化示於圖36。將M-MDSC(CD14陽性、CD15陰性的MDSC)相對於循環血中Total MDSC(CD3陰性、CD19陰性、CD56陰性、HLA-DR陰性、CD11b陽性、CD33陽性)的從C1D1的變化示於圖37。
將投予前與C2D2之間比較了Cohort1-3中得到了腫瘤樣品之5例的患者中之腫瘤中M-MDSC細胞相對於Total MDSC的值示於圖38。
在圖35中，在Cohort 3的群中觀察到Ki67陽性CD8 T細胞的增加。
在圖36中，在Cohort 3的群中觀察到Ki67陽性Treg的降低。
在圖37中，在Cohort 3的群中觀察到M-MDSC細胞的比例的降低。
在圖38中，在Cohort 3的群中觀察到M-MDSC細胞的比例的降低。
根據以上結果，暗示著本發明的脂質體組成物具有免疫抑制性的Ki67陽性Treg及M-MDSC細胞的減少作用，且具有持有抗腫瘤效果的Ki67陽性CD8 T細胞的增加作用。根據該等作用，藉由單劑及免疫檢 查點抑制劑的併用，能夠成為經免疫活性化作用之新規治療法。
[產業上之可利用性]
本發明的醫藥作為用於對癌的預防或治療之醫藥而有用。本發明的投予方法作為用於對癌的預防或治療之醫藥的投予方法而有用。另外，本發明的治療方法作為用於對癌的預防或治療之治療方法而有用。

Claims (8)

  1. 一種醫藥，其係將(A)脂質體組成物及(B)免疫檢查點抑制劑組合而同時或依次投予，該(A)脂質體組成物係含有具有內水相之脂質體和構成外水相之分散脂質體之水溶液之脂質體組成物，其中脂質體內含溶解狀態的吉西他濱(gemcitabine)。
  2. 如請求項1之醫藥，其中
    該脂質體組成物係如下脂質體組成物：脂質體的內水相的浸透壓相對於外水相的浸透壓為2倍以上且8倍以下，吉西他濱從脂質體中之釋放速度在人血漿中於37℃下為10質量%/24hr以上且70質量%/24hr以下。
  3. 如請求項1之醫藥，其中
    該脂質體組成物係如下脂質體組成物：相對於脂質體組成物的脂質成分的合計量，膽固醇類的含有率為10mol%以上且35mol%以下，內水相的浸透壓相對於外水相的浸透壓為2倍以上且8倍以下。
  4. 如請求項1至3中任一項之醫藥，其中
    該免疫檢查點抑制劑包含選自PD-1、PD-L1、PD-L2及CTLA-4的抑制劑中之至少一種。
  5. 如請求項4之醫藥，其中
    該免疫檢查點抑制劑包含選自PD-1、PD-L1及CTLA-4的抑制劑中之至少一種。
  6. 如請求項1至3中任一項之醫藥，其中
    該投予係治療上顯示出協同作用之投予量及投予期間。
  7. 如請求項1至3中任一項之醫藥，其中
    該投予的對象對吉西他濱具有耐性。
  8. 如請求項4之醫藥，其中
    該投予的對象對吉西他濱具有耐性。
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