TW202012441A

TW202012441A - Nk細胞接合抗體融合構築體

Info

Publication number: TW202012441A
Application number: TW108113068A
Authority: TW
Inventors: 麥可特薩爾; 克里斯提納艾爾汪格; 依薇卡福賽克; 烏維瑞爾斯奇; 索斯坦羅斯; 喬金寇區; 艾瑞奇瑞吉柯維克; 馬丁特瑞德
Original assignee: 德商安富美德有限公司
Priority date: 2018-04-13
Filing date: 2019-04-15
Publication date: 2020-04-01
Also published as: KR20200143436A; SG11202010064QA; WO2019198051A2; EP3774914A2; CL2023001085A1; CN113880952A; MA52227A; AU2019252970A1; IL277925A; US20240294647A1; CN112119097B; MX2020010728A; PH12020551664B1; US20200109202A1; CR20200549A; CO2020014167A2; RU2022105827A; CL2020002625A1; PH12020551664A1; CN113817066A

Abstract

本發明係關於藉由接合自然殺手(NK)細胞上表現之CD16A (FcγRIIIA)接合該等NK細胞以觸發NK細胞之細胞毒性的多特異性抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含至少兩個CD16A抗原結合部分及至少另一個靶抗原結合部分。該CD16A抗原結合部分包含依序連接於多肽鏈中之輕鏈及重鏈可變區且在包含該CD16A抗原結合部分之該多肽鏈的N末端處的該可變區係輕鏈可變區。

Description

NK細胞接合抗體融合構築體

本發明係關於藉由接合自然殺手(NK)細胞上表現之CD16A (FcγRIIIA)接合該等NK細胞以觸發NK細胞之細胞毒性的多特異性抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含至少兩個CD16A抗原結合部分及至少另一個靶抗原結合部分。

WO 2006/125668及Reusch等人 , MABS, 2014, 6:3:728-739描述用於接合CD16A之雙特異性串聯雙功能抗體及其用於NK細胞免疫療法之用途。

自然殺手(NK)細胞係有細胞毒性、產IFN-γ的固有淋巴細胞，其被認為構成抵禦病毒感染細胞及癌細胞之第一線(Cerwenka及Lanier,Nat Rev Immunol . 2001;1(1):41-9)。NK細胞之潛在細胞毒性可藉由將NK細胞溶解重新引導至腫瘤細胞並刺激NK細胞之細胞表面上表現的活化受體CD16A，又稱為FcγRIIIA，而用於癌症免疫療法中。

使用多特異性抗體引導NK細胞溶解腫瘤細胞被認為係具有低毒性及廣泛可接受之安全性特徵的強效免疫治療方法。

CD16A係觸發NK細胞之細胞毒性活性的一種活化受體。抗體對CD16A之親和力與其觸發NK細胞活化之能力直接相關，由此降低活化所需之抗體劑量。

藉由經多價結合至CD16A，例如二價結合至CD16A來增加親合力，可增加NK細胞之細胞毒性活性。

然而，針對CD16A之二價性及多價性可引起抗體介導的CD16A表現細胞交聯，該等CD16A表現細胞包括NK細胞、γδ T細胞以及單核球、巨噬細胞及樹突狀細胞亞群。預期此類相互作用可經由CD16A引起不合需要的細胞刺激。舉例而言，NK細胞與表現CD16A之免疫細胞交聯引起NK細胞活化、細胞介素釋放及細胞引導之細胞毒性的誘導，由此降低NK細胞活性並加速NK細胞耗竭，而此與所希望之抗腫瘤作用無關。因此，預期NK細胞與表現CD16A之免疫細胞交聯可降低NK細胞接合之治療功效。最重要的是，如先前在恆河猴及獠狨中使用對CD16A呈二價的抗CD16鼠類IgG抗體(3G8)所描述(Choi等人 , Immunology 2008;124:215-222；Yoshida等人 , Frontier in Microbiology (2010); 1:128)，兩個或兩個以上NK細胞經由與CD16A之二價或多價相互作用實現的交聯可引起NK細胞活化及誘導互相殘殺(fratricide)(NK-NK細胞溶解)，最終導致活體內高效NK細胞耗盡。因此，誘導NK溶解會減少可用於介導ADCC之效應細胞的數量並削弱治療性抗體之功效。

因此，需要能夠增進NK細胞接合的抗體，該接合不因互相殘殺(NK-NK細胞溶解)而減少。

本發明提供一種CD16A接合抗體，該抗體能夠至少與NK細胞上之CD16A二價相互作用並因此具有增加之結合親和力及細胞毒性效力，而且較佳地不能誘導NK-NK細胞溶解。

本發明係關於：一種多價多特異性抗原結合蛋白，其包含至少一個靶抗原結合部分及至少兩個CD16A抗原結合部分，其中該兩個CD16A抗原結合部分與恆定結構域，例如Fab片段或Fc部分融合。較佳地，該靶抗原結合部分亦與該Fab片段或該Fc部分融合。

舉例而言，該等抗原結合部分各自可選自由單鏈雙功能抗體(scDb)、雙功能抗體(Db)、單鏈Fv(scFv)或Fab片段組成之群。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分之輕鏈及重鏈可變區依序連接於多肽中，使得在該多肽鏈N末端處之可變區係輕鏈可變區，由此防止誘導互相殘殺(NK-NK細胞溶解)。

藉由將該等抗原結合部分在N末端或C末端與包含恆定結構域之各種單元，諸如F(ab)'、F(ab)₂ '、CH2-CH3、鉸鏈-CH2-CH3、Fc、CH1-鉸鏈-CH2-CH3或IgG融合可得到多種蛋白質架構。

在一些實施例中，該抗原結合蛋白包含沉默之Fc部分，其不結合至Fc-γR，但保持結合至FcRn，且視情況具有至少另一種Fc功能。

在一些實施例中，該抗原結合部分包含Fc部分，一方面，該Fc部分經沉默以使其不結合至Fc-γR，且另一方面，該Fc部分可包括另外的突變以增加或減弱其結合至FcRn之能力，此與基於進行胞吞轉送及再循環之不同能力的不同活體內藥物動力學相關。

在某些實施例中，該抗原結合蛋白包含至少一個HSA抗原結合部分。舉例而言，該抗原結合蛋白可包含2、3或4個HSA抗原結合部分。

在某些實施例中，該抗原結合蛋白包含至少兩個不同的靶抗原結合部分，亦即，第一及第二靶抗原結合部分。

在某些實施例中，應用對CD16A之親和力增加或減弱的CD16A抗原結合部分。

其中本發明之特徵在於： 1. 增強之NK細胞接合功能，此係因為 ● 兩個CD16A抗原結合部分與Fab片段或Fc部分融合，由此使細胞毒性效力因二價結合至CD16A而增加。 ● 利用以高親和力結合至CD16A之抗CD16A抗原結合部分。 ● 藉由以特定次序佈置CD16A抗原結合來避免誘導互相殘殺(NK-NK細胞溶解)，該次序不會誘導互相殘殺且由此防止NK細胞針對靶細胞之細胞毒性活性減弱。 ● 避免互相殘殺與CD16A抗原結合部分之結合親和力無關。 ● 使用沉默之Fc部分來避免與Fc-γR陽性單核球或其他表現Fc-γR之細胞的額外結合，同時維持與FcRn之結合且由此延長血清半衰期。 2. 此增強的NK細胞接合功能可歸於抗原結合部分模組化成多種蛋白質架構，由此實現可調諧之細胞毒性、靶親和力、CD16A功能、靶生物學、組織滲透及分佈、半衰期及暴露量。

使用本文具體描述之不同抗體形式及功能，包括改變之半衰期及不同暴露量，能夠針對具有高醫療需求之不同適應症定製新的治療方法，從而為各別情形提供靶向產品開發。

另外，NK細胞互相殘殺之缺乏對於高親和力、至少二價免疫細胞接合物形式而言係一個重要特徵，該等二價免疫細胞接合物形式係以較長細胞保留時間為特徵且將用於接合內源性NK細胞或將與NK細胞治療方法組合。該等NK細胞包括來源於不同來源之NK細胞，諸如來自臍帶血、健康供體之周圍血液、進行自體治療之患者或幹細胞的NK細胞。該等接合物可與該等NK細胞共輸注或預混合。

本文所提供之蛋白質形式還能夠藉由至少二價結合至靶來增加靶結合親和力及/或藉由用兩種不同的第一及第二靶抗原結合部分雙重靶向該靶來增加靶選擇性。

可將其他功能併入該抗原結合蛋白，諸如人血清白蛋白(HSA)結合部分中。

相關申請案之交叉引用

本申請案主張2018年4月13日提交之歐洲臨時專利申請案第EP18167384.9號、2018年4月13日提交之歐洲臨時專利申請案第EP18167385.6號、2018年8月24日提交之歐洲臨時專利申請案第EP18190661.1號、2018年8月24日提交之歐洲臨時專利申請案第EP18190662.9號，各案內容以全文引用之方式併入。序列表

本申請案含有以ASCII格式以電子方式提交之序列表且其特此以全文引用之方式併入。該ASCII副本於2019年4月10日創建，命名為087353_0101_SL.txt且大小為137,653位元組。 I. 定義

術語「多特異性」係指包含結合到至少兩個不同抗原決定基，特別是不同抗原之抗原決定基之抗原結合位點的抗原結合分子。「多特異性」包括但不限於雙特異性、三特異性及四特異性。

術語「價」表示在抗原結合蛋白中確定數量之抗原結合部分的存在。天然IgG具有兩個抗原結合部分且為二價的。根據本發明之抗原結合蛋白係至少三價的。四價、五價及六價抗原結合蛋白之實例在本文中有描述。

術語「多肽」係指藉由醯胺鍵連續地連接的胺基酸殘基之聚合物。在某些實施例中，術語「多肽」係指通常由超過30個胺基酸組成之一組分子。多肽可進一步形成多聚體，諸如二聚體、三聚體及更高級寡聚物，亦即，由超過一個多肽分子組成。形成此類二聚體、三聚體等之多肽分子可為相同或不同的。此類多聚體之相應高級結構因此稱為同二聚體或異二聚體、同三聚體或異三聚體等。異多聚體之實例係抗體分子，該分子係呈其天然存在之形式，由兩條相同輕鏈多肽及兩條相同重鏈多肽組成。術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」亦係指天然修飾之肽/多肽/蛋白質，其中該修飾例如受轉譯後修飾如糖基化、乙醯化、磷酸化及類似修飾影響。當在本文中提及時，「肽」、「多肽」或「蛋白質」亦可以化學方式修飾，諸如聚乙二醇化。此類修飾係此項技術中熟知的且在下文中有描述。

「Fv多肽」表示一種融合多肽，其中抗體可變(Fv)結構域係依序連接。該多肽可具有連續胺基酸殘基以及N末端及/或C末端序列延伸物。舉例而言，該多肽可含有標籤序列，較佳地在C末端處含有標籤序列，其可能適用於純化以及偵測該多肽。標籤序列之實例係組胺酸標籤，例如由六個His殘基組成之His標籤(SEQ ID NO:58)，或C標籤，例如EPEA四肽(SEQ ID NO:59)。對於多聚抗原結合分子，可對不同多肽使用不同標籤序列，例如異二聚分子之第一多肽使用His標籤且第二多肽使用C標籤。在某些實施例中，該多肽包含可變結構域，只要抗原結合位點及恆定結構域，例如C_L 、C_H 1C_H 及/或Fc部分(CH2-CH3)連接至該多肽。舉例而言，該等實施例包含Fv多肽與至少一個恆定抗體結構域，例如Fc部分之融合物。在其他實施例中，該多肽可連接至另一試劑，例如毒素、免疫調節劑或信號產生劑。

術語「Fc部分」係指包含免疫球蛋白H鏈之C末端部分且保持IgG區之Fc區的至少一種功能，特別是結合至FcRn之功能的多肽。抗體效應功能係由Fc區中之序列決定。Fc部分可包含CH2結構域、CH3結構域或CH2-CH3多肽鏈。CH2-CH3多肽鏈與另一個CH2-CH3多肽鏈組裝成兩個CH2-CH3多肽彼此組合之二聚體，其中二聚化係由在CH2結構域NC末端之鉸鏈區中的共價鍵聯促進。因此，在一些實施例中，Fc部分包含兩個CH2-CH3多肽鏈與鉸鏈區形成之二聚體。較佳地，Fc部分包含Ig類別，例如IgA、IgD、IgE、IgM，較佳地IgG1、IgG2、IgG2、IgG4之恆定結構域，特別是IgG1恆定結構域。輕鏈恆定區(CL)可選自κ、λ及σ，其中該人λ類別具有亞類λ1-4。

{\displaystyle \lambda }laa {\displaystyle \lambda }「鉸鏈」結構域可屬於與Fc部分或工程改造的非天然存在之鉸鏈結構域相同或不同之IgG類別。IgG鉸鏈區之實例具有如SEQ ID NO:23中所描繪之胺基酸序列。亦包括野生型鉸鏈區之變異體，諸如縮短之鉸鏈區，例如具有SEQ ID NO:24之胺基酸序列的稱為中間鉸鏈(middle.hinge)之鉸鏈。

術語「抗原結合蛋白」及「抗原結合分子」(具有不具有連字符)在本文中可互換使用，意思指具有抗原結合特性之免疫球蛋白衍生物；亦即，該結合蛋白係抗原結合分子。該結合蛋白包含能夠結合至靶抗原之免疫功能性免疫球蛋白部分。免疫功能性免疫球蛋白部分可包含免疫球蛋白或其部分、衍生自免疫球蛋白之融合肽或組合形成抗原結合位點之免疫球蛋白部分的結合物。每個抗原結合部分至少包含作為抗原結合部分來源之免疫球蛋白重鏈或輕鏈的CDR。術語「抗原結合蛋白」及「抗原結合分子」(具有不具有連字符)在本文中可互換使用，意思指對其抗原保持特異性及親和力的抗體片段、抗體衍生物或抗體樣結合蛋白，例如基於帶有額外恆定結構域之Fv結構域的IgG樣融合多肽。諸如Brinkmann及Kontermann, mAbs, 2017, 9(2):182-192或Spiess等人, Molecular Immunology 2015;67:95-106中所述，取決於所需特徵，諸如價態、多特異性、藥物動力學及藥效學特性，Fv及恆定結構域及/或額外功能性結構域以模組方式組裝成不同分子形式或蛋白質骨架。

在一些實施例中，抗原結合蛋白由單一多肽鏈組成。此類抗原結合蛋白係一種單體。在其他實施例中，抗原結合蛋白包含至少兩條多肽鏈。此類抗原結合蛋白係一種多聚體，例如二聚體、三聚體或四聚體。

較佳地，抗原結合蛋白係人類蛋白，最佳為完全人類蛋白。

術語「抗原結合部分」係指結合至，特別是特異性結合至抗原之抗原決定子(抗原決定基)的抗原結合蛋白之抗體-抗原組合位點或互補位。抗原結合位點係能夠識別抗原且特異性結合至抗原的抗原結合蛋白之結合部分。

如本文所述，「Fv」表示包含識別抗原，亦即，結合至抗原之抗原決定基的抗體之輕鏈(V_L )及重鏈(V_H )可變結構域的抗原結合部分。在某些實施例中，抗原結合位點可為單一結構域(sdAb)，例如來自駱駝V_H H片段或來自軟骨魚之V_NAR 片段。

每個抗原結合部分係由結合至同一抗原決定基之抗體(亦即，免疫球蛋白)可變重鏈結構域(V_H )及抗體可變輕鏈結構域(V_L )形成，而可變重鏈結構域(V_H )包含三個重鏈互補決定區(CDR)：HCDR1、HCDR2及HCDR3；且可變輕鏈結構域(V_L )包含三個輕鏈互補決定區(CDR)：LCDR1、LCDR2及LCDR3。抗原結合位點之可變重鏈及輕鏈結構域可例如藉由肽連接子彼此共價連接，或彼此非共價締合形成抗原結合位點。

「連接子」係指構成連接肽接合兩個毗鄰之可變結構域形成抗原結合部分的胺基酸序列，其中一個結構域之C末端連接至另一毗鄰結構域之N末端，或反之亦然。對於胺基酸組成，所選肽連接子序列不會干擾Fv，亦即V_H /V_L 、抗原結合及識別位點之形成，且不會干擾多聚化，例如多特異性抗原結合蛋白之多肽的二聚化。舉例而言，包含甘胺酸及絲胺酸殘基之連接子一般提供蛋白酶抗性。在一些實施例中，使用(G₂ S)_x 肽連接子，其中例如x = 1-20，例如(G₂ S)、(G₂ S)₂ 、(G₂ S)₃ 、(G₂ S)₄ 、(G₂ S)₅ 、(G₂ S)₆ 、(G₂ S)₇ 或(G₂ S)₈ ；或使用(G₃ S)_x 肽連接子，其中例如x = 1-15；或使用(G₄ S)_x 肽連接子，其中例如x = 1-10，較佳地為1-6。連接子之胺基酸序列可例如藉由噬菌體展示法優化以改良抗原結合位點之形成及多肽之生產率。

「連接體」係指將抗原結合部分接合至Fab片段、鉸鏈或Fc部分的肽。根據定義，連接體並非接合兩個可變結構域之肽。

連接子及連接體之長度可影響抗原結合部分之Fv多肽的摺疊及可撓性。Fv多肽之所需可撓性取決於靶抗原密度及靶抗原之可接近性，亦即，靶抗原上之抗原決定基。較長連接子或連接體可提供具有更靈活抗原結合位點的可撓性更高之Fv多肽。連接子長度對二聚抗原結合多肽形成之影響描述於例如Todorovska等人, Journal of Immunological Methods 2001;248:47-66；Perisic等人, Structure 1994;2:1217-1226；Le Gall等人, Protein Engineering 2004;17:357-366；及WO 94/13804中。

「單鏈可變抗體片段」或「scFv」包含由重鏈可變結構域(V_H )組成之抗原結合位點，V_H 視情況經由肽連接子與輕鏈可變結構域(V_L )融合。scFv可為多肽鏈：自該多肽鏈之N末端至C末端為V_L -連接子-V_H 或V_H -連接子-V_L (Huston等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85:5879-83)。在V_H 與V_L 結構域之間之連接子能夠形成實現抗原結合所需之結構。

「抗原結合(Fab)片段」或「Fab」包含由重鏈(H)源性序列及輕鏈(L)源性序列各自二聚化形成的一個恆定結構域(CH1、CL)及一個可變結構域(V_H 、V_L )，其中該等可變結構域V_H 及V_L 構成抗原結合位點。兩個Fab'片段在N末端經由鉸鏈區與Fc部分接合形成F(ab')₂ 片段。

「雙功能抗體」(Db)表示由兩對可變重鏈(V_H )及可變輕鏈(V_L )結構域，即第一對及第二對組成之二價Fv分子，該第一對及第二對締合成兩個V_L /V_H 抗原結合位點。每對可變結構域依序連接於多肽中。在某些實施例中，該二價Fv分子由第一對及第二對兩個毗鄰可變結構域組成，其中在每一對中，該兩個可變結構域經短肽連接子融合，由此防止經短連接子連接之可變結構域之間的分子內締合。迫使第一對可變結構域與第二對可變結構域交叉締合形成兩個Fv抗原結合位點。由此該兩個抗原結合部分各自係由第一對可變結構域之一個可變結構域與第二對可變結構域之一個可變結構域形成。因此，此類雙功能抗體包含至少一個由兩個可變結構域構成的抗原結合位點，該兩個可變結構域未經短連接子直接連接。就雙功能抗體而言，第一抗原結合部分之可變結構域係藉由連接子與第二抗原結合部分之可變結構域連接。舉例而言，第一抗原結合部分之V_H 係藉由第一連接子連接至第一多肽中第二抗原結合部分之V_L ，且第一抗原結合部分之V_L 係藉由第二連接子連接至第二多肽中第二抗原結合部分之V_H 。在每對毗鄰之可變結構域中，較短的第一或第二連接子將一個可變結構域之C末端與另一可變結構域之N末端連接在一起，或反之亦然。在每對中，可變結構域自N末端至C末端可呈V_L -V_H 、V_H -V_L 、V_H -V_H 及V_L -V_L 取向，其中該對之兩個可變結構域可具有不同抗原決定基特異性或相同抗原決定基特異性。在某些情況下，該兩個可變結構域在該對之一個可變結構域之C末端與另一可變結構域之N末端之間藉由肽鍵直接連接。連接雙功能抗體第一及第二對可變結構域各自中之兩個可變結構域的短肽連接子之長度使得防止由該連接子所連接之可變結構域之間的分子內締合。此類連接子「較短」，亦即，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或約12個胺基酸殘基組成。在0個胺基酸殘基情況下，連接子係肽鍵。此類短連接子有利於該兩對可變結構域之間正確二聚化及兩個Fv抗原結合位點之形成。將連接子縮短至約12個或更少胺基酸殘基大體上防止同一多肽鏈上之相鄰結構域彼此相互作用。在本發明之一個實施例中，該等連接子由約3至約12個，例如5至10個，特別是7至9個連續胺基酸殘基組成。可針對雙功能抗體之多肽內的特定結構域取向調整連接子長度。此外，原則上，在該對可變抗體結構域之間具有超過12個胺基酸殘基之連接子的兩個多肽可彼此正確地二聚化(參見例如Le Gall等人, Protein Engineering 2004;17:357-366)。

「單鏈雙功能抗體(scDb)」表示藉由添加另外的連接子融合第一及第二多肽而轉化成單一多肽鏈的雙功能抗體衍生物(Kontermann等人, Immunol. Methods, 1999;226: 179-188)。因此，該另外的連接子連接包含第一及第二抗原結合部分之可變結構域之第一多肽的C末端，該第一多肽藉由第一連接子與第二多肽之N末端連接，該第二多肽包含由第二連接子連接之第一及第二抗原結合部分之同源可變結構域。因此，scDb由單一多肽鏈，亦即Fv多肽組成，其中兩個抗原結合部分之四個可變結構域自N末端至C末端佈置如下： - VL-連接子1-VH-連接子3-VL-連接子2-VH，或 - VL-連接子1-VL-連接子3-VH-連接子2-VH，或 - VH-連接子1-VL-連接子3-VH-連接子2-VL，或 - VH-連接子1-VH-連接子3-VL-連接子2-VL。

雙功能抗體中所使用之連接子1及連接子2係「短」連接子，例如由少於13個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個胺基酸殘基組成。

如關於scFv所使用，連接子3係可撓性較強之連接子，其促進分子內向後摺疊及兩個抗原結合部分之兩個N末端可變結構域與兩個C末端可變結構域之締合。連接子3由13個或更多個胺基酸殘基，例如13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸殘基組成。在一些實施例中，連接子3係15至25個，較佳15至20個或13至18個胺基酸。

術語「串聯雙功能抗體」係指藉由在單基因構築體中連接至少四個可變結構域(兩個重鏈可變結構域(VH)及兩個輕鏈可變結構域(VL))，使兩個轉譯之多肽鏈同二聚化所構築的抗原結合分子。在此類串聯雙功能抗體中，連接子長度係使得其防止可變結構域之分子內配對，由此該分子無法自身向後摺疊形成單體單鏈分子，而是迫使其與另一條鏈之互補結構域配對。該等可變結構域之佈置亦使得相應可變結構域在此二聚化期間配對(Weichel等人, European Pharmaceutical Review 2015;20(1):27-32；Reusch等人, mAbs 2014;6:3, 728-739)。

「雙重親和力再靶向分子(Dual-affinity retargeting molecule，DART)」係指一種呈VL(A)-VH(B) + VL(B)-VH(A)佈置之蛋白質骨架，其中第一抗原結合部分之VH連接至第二多肽上第二抗原結合部分之VL，且該第二抗原結合部分之VH連接至第一多肽上之VL，其中引入鏈間二硫鍵以使該分子穩定。

術語「靶」或「靶抗原」係指由作為NK細胞之靶以誘導或觸發NK細胞之細胞毒性的一種類型細胞，亦即靶細胞，或病毒感染之細胞表現或與該種類型之細胞相關聯的抗原。靶抗原之實例可為腫瘤抗原或腫瘤相關抗原(TAA)。腫瘤抗原或TAA可在靶細胞表面上表現或由MHC複合物以MHC限制性肽形式展示。腫瘤抗原之實例包括但不限於CD5、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CCR4、CS-1、GD2、基質金屬蛋白酶1 (MMP1)、層黏連蛋白受體前驅蛋白、BCMA、EGFR、EGFRvIII、Ep-CAM、gpA33、AMHRII、PDGFRα、SLAMF7、PLAP、湯姆遜-弗雷德里希(Thomsen-Friedenreich，TF)抗原、MUC-1 (黏蛋白)、IGFR、IL4-Rα、IL13-R、HER2/neu、HER3、PSMA、CEA、TAG-72、HPV E6、HPV E7、BING-4、Cyclin-B₁ 、9D7、EphA2、EphA3、端粒酶、間皮素、SAP-1、存活素(Survivin)、癌症睾丸抗原(BAGE家族、CAGE家族、GAGE家族、MAGE家族、SAGE家族、XAGE家族)、NY-ESO-1/LAGE-1、PRAME、SSX-2、Melan-A/MART-1、Gp100/pmel17、酪胺酸酶、TRP-1/-2、MC1R、ß-鈣調蛋白、BRCA1/2、CDK4、CML66、MART-2、p53、Ras、TGF-ßRII及TCR (來自Categories of Tumor Antigens, Holland-Frei Cancer Medicine. 第6版, Kufe DW, Pollock RE, Weichselbaum RR.等人編輯, Hamilton (ON):Becker; 2003)。「靶」及「靶抗原」亦包括血清白蛋白，特別是人血清白蛋白(HSA)。在某些實施例中，該靶抗原係BCMA。

在其他實施例中，靶抗原可為感染物，諸如病毒或細菌病原體，例如來自登革病毒(dengue virus)、單純疱疹病毒、巨細胞病毒、肝炎病毒、人T淋巴細胞病毒、流感病毒、RSV、乳頭瘤病毒(包括除以上提及之E6及E7外的抗原)、流感病毒或HIV之病原體。亦包括由MHC複合物以MHC限制性肽展示之肽靶。

「CD16A」係指在NK細胞之細胞表面上表現之活化受體CD16A，又稱為FcγRIIIA。CD16A係觸發NK細胞之細胞毒性活性的活化受體。抗體對CD16A之親和力與其觸發NK細胞活化之能力直接相關，由此較高的針對CD16A之親和力降低活化所需之抗體劑量。抗原結合蛋白之抗原結合位點結合至CD16A，但不結合至CD16B。舉例而言，可藉由特異性結合至CD16A之抗原決定基的抗原結合位點提供結合至CD16A但不結合至CD16B的包含重鏈(VH)及輕鏈(VL)可變結構域之抗原結合位點，其包含CD16A之C末端序列SFFPPGYQ (SEQ ID NO:57)之胺基酸殘基及/或殘基G130及/或Y141 (SEQ ID NO:48)，該等胺基酸殘基不存在於CD16B中。

「骨髓瘤細胞」係由骨髓中之漿細胞，藉由致瘤性轉型得到的惡性(癌性)漿細胞。在骨髓瘤中，惡性漿細胞產生大量不能抵抗感染之異常抗體。該等異常抗體即所謂的單株蛋白，或M蛋白，其充當骨髓瘤之腫瘤標記物。骨髓瘤細胞具有表型CD19^- /CD38⁺ /CD138⁺ /BCMA⁺ 。因此，CD38、CD138及BCMA表示骨髓瘤細胞上表現之抗原。亦包括B細胞譜系中之惡性表型，該等表型對CD19/CD20/CD22/BCMA及其他抗原呈陽性(此應包括並非傳統上理解為漿細胞之表型，但可自記憶B細胞或前漿細胞譜系進化)。

「EGFR」係指表皮生長因子受體(EGFR；ErbB-1；人體中之HER1)，包括所描述的具有活化、突變及牽涉到病理生理學過程之所有同功型或變異體。EGFR抗原結合位點識別EGFR之細胞外結構域中的抗原決定基。在某些實施例中，該抗原結合位點特異性結合至人及食蟹獼猴EGFR。

表皮生長因子受體(EGFR)係HER受體酪胺酸激酶家族之成員且由四個成員組成：EGFR (ErbB1/HER1)、HER2/neu (ErbB2)、HER3 (ErbB3)及HER4 (ErbB4)。經由配體結合(例如EGF、TGFa、HB-EGF、神經調節蛋白、β細胞素、雙調蛋白(amphiregulin))刺激受體在細胞內結構域中經由酪胺酸磷酸化使固有受體酪胺酸激酶活化，並促進受體與HER家族成員之同二聚化或異二聚化。該等細胞內磷酸酪胺酸充當包括MAPK及PI(3)K/Akt在內之各種接頭蛋白或酶的對接位點，同時起始影響細胞增殖、血管生成、細胞凋亡抗性、侵入及轉移之許多信號傳導級聯。

「EGFRvIII」係指由跨EGFR編碼序列之外顯子2-7之鹼基對的同框缺失產生的EGFR之細胞外結構域突變體(Gan HK等人, FEBS 2013, 280:5350-5370)。

與本發明結合之術語「結合結構域」表徵(特異性)結合至靶分子(抗原，例如分別為CD16及靶細胞表面抗原)上之給定靶抗原決定基或給定靶側/與其相互作用/識別該給定靶抗原決定基或給定靶側的結構域。第一結合結構域(識別例如CD16)之結構及功能，以及較佳地，第二結合結構域(識別靶細胞表面抗原)之結構及/或功能係基於抗體，例如全長或完整免疫球蛋白分子之結構及/或功能，及/或由抗體或其片段之可變重鏈(V_H )及/或可變輕鏈(V_L )結構域得到。較佳地，該第一結合結構域係以存在三個輕鏈CDR (亦即，V_L 區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR (亦即，V_H 區之CDR1、CDR2及CDR3)為特徵。該第二結合結構域較佳地亦包含允許靶結合的抗體之最小結構要求。更佳地，該第二結合結構域包含至少三個輕鏈CDR (亦即，V_L 區之CDR1、CDR2及CDR3)及/或三個重鏈CDR (亦即，V_H 區之CDR1、CDR2及CDR3)。預期該第一及/或第二結構域係藉由噬菌體展示或文庫篩選方法而非藉由將來自預先存在(單株)之抗體的CDR序列移植至骨架中產生或可藉由該等方法獲得。

根據本發明，術語「(特異性)結合至」、「(特異性)識別」、「(特異性)針對」或「與……(特異性)反應」意謂，結合結構域與靶分子(抗原)，例如分別為CD16a及靶細胞表面抗原如BCMA上之給定抗原決定基或給定靶位點相互作用或特異性相互作用。

術語「基本上/大體上不結合」或「不能結合」意謂，本發明之結合結構域不結合除CD16a及靶細胞表面抗原外的蛋白質或抗原，亦即，與除CD16a及靶細胞表面抗原外的蛋白質或抗原不顯示超過約30%、較佳地不超過約20%、更佳地不超過約10%、尤佳地不超過約9%、約8%、約7%、約6%或約5%之反應性，由此分別結合至CD16a及靶細胞表面抗原係設定為約100%。

咸信特異性結合受結合結構域及抗原之胺基酸序列中特定基元影響。因此，結合之實現係由其一級、二級及/或三級結構以及由該等結構之二次修飾引起。抗原相互作用位點與其特定抗原之特異性相互作用可易於使該位點與該抗原結合。此外，抗原相互作用位點與其特定抗原之特異性相互作用可替代地或另外地例如因誘導該抗原之構象變化、該抗原之寡聚化等而起始信號。

術語「可變」係指抗體或免疫球蛋白結構域中展現其序列可變性且參與測定特定抗體之特異性及結合親和力的部分(亦即，「可變結構域」)。可變重鏈(V_H )與可變輕鏈(V_L )配對在一起形成單一抗原結合位點。

可變性並非均勻地分佈於抗體之整個可變結構域中；其集中在重鏈及輕鏈可變區各自之子結構域中。該等子結構域稱為「高變區」或「互補決定區」(CDR)。可變結構域中的較保守(亦即，非高變)部分稱為「構架」區(FRM或FR)並在三維空間中提供六個CDR之骨架以形成抗原結合表面。天然存在之重鏈及輕鏈的可變結構域各自包含經三個高變區連接的主要呈β片組態之四個FRM區(FR1、FR2、FR3及FR4)，該等高變區形成連接該β片結構且在一些情況下形成該β片結構之一部分的環。每條鏈中之高變區藉由FRM緊密保持在一起且與來自另一鏈之高變區一起促成抗體抗原結合側之形成(參見Kabat等人, 上述引文)。

術語「CDR/CDRs」係指互補決定區，三個互補決定區構成輕鏈可變區之結合特性(CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3)且三個構成重鏈可變區之結合特性(CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)。CDR含有負責抗體與抗原之特異性相互作用的大部分殘基且因此促成抗體分子之功能活性：其係抗原特異性之主要決定因素。

確切的限定性CDR邊界及長度受不同分類及編號系統影響。因此，CDR可藉由Kabat、Chothia、接觸或任何其他邊界定義，包括藉由本文所述之編號系統命名。儘管邊界不同，但該等系統各自具有一定程度之重疊，該重疊構成可變序列內所謂的「高變區」。因此，根據該等系統之CDR定義在長度及相對於相鄰構架區之邊界區域方面可能不同。參見例如Kabat (一種基於交叉物種序列可變性之方法)、Chothia (一種基於抗原-抗體複合物之結晶學研究的方法)、MacCallum、Honegger及IMGT (Wu及Kabat,J. Exp. Med. 1970;132:211-250；Chothia等人, J. Mol. Biol, 1987, 196: 901 -917；MacCallum等人, J. Mol. Biol, 1996, 262: 732；Lefranc等人,Dev. Comp. Immunol. 2003;27:55-77；Honegger等人, J. Mol. Bol. (2001);309:657-670)。用於表徵抗原結合側之又其他標準係Oxford Molecular之AbM抗體建模軟體所使用的AbM定義。參見例如Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (編輯: Duebel, S.及Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)。就有兩種殘基標識技術界定重疊之區域，而非一致區域而言，其可組合以界定混合CDR。然而，根據所謂Kabat系統進行編號係較佳的。在某些實施例中，本文所揭示之CDR係根據Kabat編號系統標識。在某些實施例中，本文所揭示之CDR係根據IMGT方法標識。在某些實施例中，本文所揭示之CDR係根據Honegger方法標識。

輕鏈CDR3且特別是重鏈之CDR3可構成輕鏈及重鏈可變區內抗原結合中之最重要決定子。在一些抗體構築體中，重鏈CDR3看來構成抗原與抗體之間接觸之主要區域。可以使用僅改變CDR3之活體外選擇方案改變抗體之結合特性或確定促成抗原結合之殘基。因此，CDR3典型地係抗體結合位點內分子多樣性的最大來源。舉例而言，H3可短至兩個胺基酸殘基或超過26個胺基酸。

在經典全長抗體或免疫球蛋白中，每條輕(L)鏈藉由一個共價二硫鍵連接至重(H)鏈，而兩個H鏈取決於H鏈同型而藉由一或多個二硫鍵彼此連接。將最接近VH的CH結構域通常稱為CH1。恆定(「C」)結構域不直接參與抗原結合，但展現各種效應功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性及補體活化。抗體之Fc區係包含在重鏈恆定結構域內且例如能夠與位於細胞表面之Fc受體相互作用。

亦涵蓋本文所描述的抗體結合分子之胺基酸序列修飾。舉例而言，可能需要改善抗體構築體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體構築體之胺基酸序列變異體係藉由將適當核苷酸變化引入抗體構築體核酸中或通過肽合成製備。以下描述之胺基酸序列修飾皆會產生仍保持所需的未修飾親本分子之生物活性(結合至CD16a及靶細胞表面抗原)的抗體構築體。

胺基酸修飾包括例如抗體結合分子之胺基酸序列內殘基的缺失及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代的任何組合以獲得最終分子，只要最終分子具有所需特徵即可。胺基酸變化亦可改變抗體結合分子之轉譯後加工，諸如改變糖基化位點之數目或位置。

舉例而言，各CDR中可有1、2、3、4、5或6個胺基酸之插入、取代或缺失(當然，視其長度而定)，而在各FR中可有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸之插入、取代或缺失。較佳地，抗體構築體中之胺基酸序列插入包括與含有數百個或更多殘基之多肽的長度在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個殘基範圍內之胺基及/或羧基末端融合物，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。亦可在本發明上下文中所定義之抗體構築體之第三個結構域內進行相應修飾。在本發明上下文中定義之抗體構築體的插入變異體包括酶之抗體結合分子的N末端或C末端融合物或與多肽之融合物。

最值得關注的取代性突變誘發位點包括(但不限於)重鏈及/或輕鏈CDR，特別是高變區，而且亦涵蓋重鏈及/或輕鏈中之FR變化。取代較佳地係如本文所述之保守取代。較佳地，取決於CDR或FR之長度，在CDR中可有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸取代，而在構架區(FR)中可有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或25個胺基酸取代。舉例而言，若CDR序列包含6個胺基酸，則預期該等胺基酸中有一個、兩個或三個經取代。類似地，若CDR序列包含15個胺基酸，則預期該等胺基酸中有一個、兩個三個、四個、五個或六個經取代。

一般而言，若重鏈及/或輕鏈CDR中之一個或多個或全部中的胺基酸經取代，則較佳地，如此獲得的「經取代」序列與「原始」CDR序列至少約60%或約65%、更佳地約70或約75%、甚至更佳地約80%或約85%且尤佳地約90%或約95%一致。這意味著CDR之長度決定其與「經取代」序列之一致性程度。舉例而言，具有5個胺基酸之CDR較佳地與經取代序列約80%一致，以便具有至少一個胺基酸經取代。因此，抗體構築體之CDR可與其經取代序列具有不同的一致性程度，例如CDRL1可具有約80%，而CDRL3可具有約90%一致性。

較佳之取代(或置換)係保守取代。然而，只要抗體構築體保持其經由第一結構域結合至CD16a及經由第二結構域結合至靶細胞表面抗原的能力及/或其CDR與該經取代序列具有一定一致性(與「原始」CDR序列至少約60%或約65%、更佳約70%或約75%、甚至更佳約80%或約85%且尤佳約90%或約95%一致)，就預期任何取代(包括非保守性取代或來自下表A中所列「例示性取代」中之一個或多個)。

保守取代顯示於表A中的標題「較佳取代」之下。若該等取代引起生物活性的變化，則可以引入更實質性的變化，在表A中命名為「例示性取代」，或如下文參照胺基酸類別進一步描述，並針對所需特徵篩選產物。表 A ：胺基酸取代

藉由選擇對維持(a)多肽主鏈在取代區域中的結構，例如片狀或螺旋構象；(b)分子在靶位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈之體積的影響顯著不同的取代來實現本發明之抗體構築體之生物特性的顯著修飾。天然存在之殘基基於常見側鏈特性分成以下各組：(1)疏水性：正白胺酸、met、ala、val、leu、ile；(2)中性親水性：cys、ser、thr、asn、gin；(3)酸性：asp、glu；(4)鹼性：his、lys、arg；(5)影響鏈取向之殘基：gly、pro；及(6)芳族：trp、tyr、phe。

非保守性取代將需要將該等類別之一之成員換成另一類別。不參與維持抗體構築體之適當構象的任何半胱胺酸殘基一般亦可經絲胺酸取代，以改善分子之氧化穩定性並防止異常交聯。反之，可以將半胱胺酸鍵添加至抗體中以改善其穩定性(特別是在抗體係抗體片段，諸如Fv片段的情況下)。

藉由使用此項技術中已知之標準技術，包括但不限於Smith及Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482之局部序列一致性算法；Needleman及Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443之序列一致性比對算法；Pearson及Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444之相似性搜索法；該等算法之電腦實施方案(在Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA；Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)；Devereux等人, 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395所描述之最佳擬合序列程式，較佳地使用預設設置；或藉由觀察來確定胺基酸序列之序列一致性及/或相似性。較佳地，藉由FastDB，基於以下參數計算一致性百分比：錯配罰分1；空位罰分1；空位尺寸罰分0.33；及連接罰分30；「Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,」 Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, 第127-149頁(1988), Alan R. Liss, Inc.。

有用算法之實例係PILEUP。PILEUP使用進行性逐對比對，由一組相關序列產生多個序列之比對。其亦可繪製樹狀圖，顯示用於產生比對之群集關係。PILEUP使用Feng及Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360之進行性比對方法的簡化形式；該方法類似於Higgins及Sharp, 1989, CABIOS 5:151 -153中所述的方法。有用的PILEUP參數包括預設空位權重3.00、預設空位長度權重0.10及加權末端空位。

有用算法之靈一個實例係BLAST算法，該算法描述於：Altschul等人, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410；Altschul等人, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389- 3402；及Karin等人, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787。特別有用的BLAST程式係WU-BLAST-2程式，其係自Altschul等人, 1996, Methods in Enzymology 266:460-480獲得。WU-BLAST-2使用若干搜索參數，大部分參數係設定成預設值。可調參數係用以下值設定：重疊跨度=1，重疊分數=0.125，字臨限值(T)=11。HSP S及HSP S2參數係動態值且由程式本身根據特定序列之組成及用於搜索所關注序列之特定資料庫的組成確定；不過，可調整該等值以增加靈敏度。

額外的有用算法係Altschul等人, 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402所報導的帶空位之BLAST。帶空位之BLAST使用BLOSUM-62取代分數；臨限值T參數設定為9；兩次命中(two-hit)方法觸發不帶空位之延伸，空位長度k附加10+k之價格；Xu設定為16，且Xg對於資料庫搜索階段設定為40且對於算法輸出階段設定為67。帶空位之比對係由對應於約22次命中之分數觸發。

一般而言，各個變異體CDR或V_H /V_L 序列與本文所描繪之序列之間的胺基酸同源性、相似性或一致性係至少約60%，且更典型地，較佳地增加同源性或一致性，為至少約65%至約70%、更佳至少約75%至約80%、甚至更佳至少約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%且接近約100%。以類似方式，關於本文所鑑別之結合蛋白之核酸序列的「核酸序列一致性百分比(%)」定義為候選序列中與抗體構築體編碼序列中之核苷酸殘基一致之核苷酸殘基的百分比。特定方法利用設定為預設參數的WU-BLAST-2之BLASTN模組，其中重疊跨度及重疊分數分別設定為1及0.125。

一般而言，編碼各個變異體CDR或V_H /V_L 序列之核苷酸序列與本文所描繪之核苷酸序列之間的核酸序列同源性、相似性或一致性係至少約60%，且更典型地，較佳地增加同源性或一致性，為至少約65%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%，且接近100%。因此，「變異體CDR」或「變異體V_H /V_L 區」係與本發明之上下文中所定義之親本CDR/VH/VL具有指定同源性、相似性或一致性且共有生物功能，包括但不限於，至少約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%之親本CDR或V_H /V_L 之特異性及/或活性者。

在一個實施例中，與根據本發明之抗體構築體的人類生殖系的一致性百分比≥ 約70%或≥ 約75%，更佳地≥ 約80%或≥ 約85%，甚至更佳地≥ 約90%，且最佳地 ≥ 約91%、≥ 約92%、≥ 約93%、≥ 約94%、≥ 約95%或甚至≥ 約96%。與人類抗體生殖系基因產物之一致係被認為係降低治療性蛋白質在治療期間引發針對患者體內藥物之免疫反應的一個重要特徵。Hwang及Foote (「Immunogenicity of engineered antibodies」; Methods 36 (2005) 3-10)展示，減少藥物抗體構築體中之非人類部分可降低在治療期間於患者體內誘導抗藥物抗體之風險。藉由比較窮盡數量的臨床上評價之抗體藥物與各別免疫原性資料顯示出以下趨勢：抗體V區之人類化使蛋白質之免疫原性(平均約5.1%患者)低於帶有未變化之非人類V區之抗體(平均約23.59%患者)。因此，基於V區的呈抗體構築體形式之蛋白質治療劑需要與人類序列具有較高一致性程度。出於該測定生殖系一致性的目的，可使用Vector NTI軟體將V_L 之V區與人類生殖系V區段及J區段之胺基酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)相比對且藉由用一致胺基酸殘基數量除以V_L 之胺基酸殘基總數，以百分比計算胺基酸序列。該方法亦可用於VH區段(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)，不過V_H CDR3可能因其較高多樣性及缺乏現有人類生殖系V_H CDR3比對搭配物而排除在外。接著，可使用重組技術增加與人類抗體生殖系基因之序列一致性。

術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所希望之抗原結合活性即可。

如本文所使用，術語「約」或「近似地」意謂在由熟習此項技術者所測定之特定值的可接受之誤差範圍內，此將部分取決於該值之量測或測定方法，亦即，量測系統之限制。舉例而言，「約」可意謂根據此項技術中之實踐，在3個或超過3個標準偏差範圍內。或者，「約」可意謂在給定值之至多20%、較佳地至多10%、更佳地至多5%且更佳地至多1%之範圍內。或者，特別是對於生物系統或方法，該術語可意謂在一個值之一個數量級範圍內，較佳地在5倍範圍內且更佳地在2倍範圍內。

除非上下文另作清楚規定，否則如本文所使用，單數形式「一個(種)」及「該」包括複數個(種)指示物。因此，例如，提及「一種試劑」包括一種或多種此類不同試劑且提及「該方法」包括提及普通熟習此項技術者已知之等效步驟及方法，該等步驟及方法可經修改或取代本文所述之方法。

除非另作指示，否則在一系列要素之前的術語「至少」應理解為係指該系列中之每一要素。熟習此項技術者將認識到，或能夠僅使用常規試驗確定本文所描述之本發明的具體實施例之許多等效內容。預期本發明涵蓋此類等效內容。

術語「及/或」無論在本文何處使用，均包括「及」、「或」以及「由該術語連接之全部要素或該等要素之任何其他組合」。

術語「小於」或「大於」包括具體數字。舉例而言，小於20意謂小於或等於。類似地，超過或大於分別意謂超過或等於，或者大於或等於。

在本說明書通篇及以下申請專利範圍中，除非上下文另作要求，否則「包含(comprise)」一詞以及其變化形式應理解為暗示包括所陳述之整數或步驟或者一組整數或步驟在內，但不排除任何其他整數或步驟或者一組整數或步驟。當在本文中使用時，術語「包含」可經術語「含有」或「包括」取代，或有時在本文中使用時經術語「具有」取代。

當在本文中使用時，「由……組成」不包括技術方案要素中未具體說明之任何要素、步驟或成分。當在本文中使用時，「基本上由……組成」不排除不會實質上影響該技術方案之基礎及新穎特徵的材料或步驟。

在本文中之各種情況中，術語「包含」、「基本上由……組成」及「由……組成」中之任一個可經該其他兩個術語置換。 II. CD16A 抗原結合蛋白

在第一態樣中，本發明提供用於基於自然殺手(NK)細胞之靶向方法的CD16A抗原結合蛋白，即：一種多特異性抗原結合蛋白，其包含 - 至少一個第一靶抗原結合部分； - 至少兩個CD16A抗原結合部分；及 - 至少一個抗體恆定結構域。

在一些實施例中，該恆定結構域係Fab片段或Fc部分之一部分。

在一些實施例中，該等CD16A抗原結合部分與恆定結構域融合，其中該恆定結構域可為Fab片段(CH1或CL)或Fc部分之一部分。

因此，在另一實施例中，該多特異性抗原結合蛋白包含： - 至少一個第一靶抗原結合部分； - 與恆定結構域，例如Fab片段或Fc部分之恆定結構域融合之至少兩個CD16A抗原結合部分。

該抗原結合蛋白接合NK細胞以重定向NK細胞介導的針對靶，例如腫瘤抗原陽性細胞、病毒感染細胞或病原體之細胞毒性。

歸因於兩個CD16A結合部分引起之二價結合，使得經由CD16A引起之NK細胞結合強度之親合力增加且NK細胞效應功能，諸如抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)相較於單株抗體或抗體片段有所增強。

NK細胞經由其CD16A受體被多特異性抗原結合蛋白接合，且由此朝向靶，例如表現腫瘤相關抗原(TAA)之靶細胞重定向。因此，此類多特異性抗原結合蛋白能夠選擇性重定向NK細胞並介導針對腫瘤細胞、病毒感染細胞或病原體之溶解。相比之下，IgG同型之全長抗體經由其Fc區結合至活化及抑制性Fcγ受體，包括CD16A、CD16B (FcγRIIIB)、CD32A (FcγRIIA)、CD32B (FcγRIIB)及CD64 (FcγRI)。然而，對CD16A具有特異性之抗原結合蛋白選擇性靶向活化亞型CD16A，亦即，在NK細胞及巨噬細胞上發現，但在嗜中性球上未發現之活化亞型CD16A。此外，接合抗原結合蛋白之NK細胞與CD16A發生二價相互作用，使親和力相較於常規抗體有約1000倍升高。

CD16A係觸發NK細胞之細胞毒性活性的活化受體。抗體對CD16A之親合力與其觸發NK細胞活化之能力直接相關。所提供之抗原結合蛋白二價結合至CD16A，亦即，與兩個抗原結合部分結合，由此因對CD16A之較高親合力而增加親和力。

此外，藉由將該抗原結合部分與Fc部分或能夠結合FcRn的基於IgG之抗體融合使血清半衰期相較於基於scFv之抗原結合骨架有所延長，使得在活體內之治療應用更為便利。因此，該Fc部分可經修飾以增加或減少與FcRn之結合，由此進一步調節血清半衰期及/或經結合IgG在整個細胞內之轉運。該細胞轉運亦描述為胞吞轉送(Dickinson等人, 1999)。

此外，可藉由抗原結合蛋白與人血清白蛋白(HSA)或HSA結合部分之融合延長血清半衰期。舉例而言，Fab片段之Fv區中的HSA結合部分可延長Fab片段之血清半衰期，而CD16A及靶抗原結合部分與Fab片段之C末端融合。或者，HSA結合部分可與Fab片段之C末端融合且Fab片段之Fv區可提供靶抗原或CD16A結合部分。

該等抗原結合部分可藉由許多方式與Fab片段或Fc部分融合且本文所述之抗原結合蛋白的模組式結構可得到多種骨架，其可取決於所需應用容易地設計及選擇。

較佳地，V_H 及V_L 可變區藉由肽連接子連接，使得該等可變區能夠締合成抗原結合所需之構象。包含四個額外可變結構域區之多肽藉由連接體與Fab片段之恆定結構域或Fc部分融合。

抗原結合部分係由抗原結合分子形式提供，該抗原結合分子形式包含一個或多個Fv多肽，例如單鏈Fv (scFv)、由兩個scFv連接成單一多肽組成之串聯單鏈Fv ((scFv)₂ )、雙功能抗體(Db)、單鏈雙功能抗體(scDb)、串聯雙功能抗體(TandAb®)、Fab、F(ab')₂ 或雙重親和力重靶向抗體(DART^TM )。對於CD16A抗原結合蛋白而言，scFv、Db或scDb尤佳。各scFv提供單一抗原結合部分，而二價Db、scDb及(scFv)₂ 提供該抗原結合蛋白之兩個抗原結合部分。較佳地，二價Db、scDb或(scFv)₂ 或兩個scFv係單特異性的並提供具有相同特異性之兩個抗原結合部分，亦即，CD16A或靶抗原。

各抗原結合部分藉由「連接體」或肽鍵接合至Fab之恆定結構域或Fc部分。較佳地，連接體係肽。具體言之，該連接體係由1至30個胺基酸殘基，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個胺基酸殘基構成之連續鏈組成的肽。更具體言之，該連接體由3至30個、6至20個、6至18個或6至15個胺基酸殘基組成。在一些實施例中，該連接體由G個及S個胺基酸殘基構成，例如該連接體係(G₂ S)_x 肽，其中x= 1-10；或(G₄ S)_y ，其中y = 1-6，例如具有如SEQ ID NO: 19、20、21或22中所描繪之胺基酸序列的連接體。

在某些實施例中，抗原結合部分係經由鉸鏈區與Fc部分之CH2結構域的N末端融合。鉸鏈區可屬於與Fc部分相同或不同IgG類別或係工程改造的非天然存在之鉸鏈結構域。IgG野生型鉸鏈區之實例具有如SEQ ID NO:23中所描繪之胺基酸序列。經修飾(縮短)之鉸鏈區(中間鉸鏈)的實例具有如SEQ ID NO:24中所描繪之胺基酸序列。

在一些實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分與Fc部分之N末端融合，而一個或兩個靶抗原結合部分與Fc部分之C末端融合；或兩個CD16A抗原結合部分與Fc部分之C末端融合且該一個或兩個靶抗原結合部分與Fc部分之N末端融合(例如KiH-scDb-Fc，圖3-6；Db-Fc，圖9-10；Bi-scFv-Fc，圖11-12；及KiH-scFv-Fc，圖15A及15B)。

在另一個實施例中，該等抗原結合部分與Ig抗體，例如IgG整合或融合。每個CD16A抗原結合部分可以scFv形式與Fc部分之C末端融合且靶抗原結合部分整合至兩個Fab臂之每一個中(scFv-IgAb，圖13)。或者，每個CD16A抗原結合部分可整合作為每個Fab臂中之Fv結構域形式，而一個或兩個抗原結合部分可與Fc部分之C末端融合(scFv-IgAb，圖16)。在某一實施例中，額外靶抗原結合部分可與各CL結構域之C末端融合(Bi-scFv-IgAb，圖14)。

在另一實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分及該等靶抗原結合部分與Fab之C末端融合，而Fab之Fv結構域提供第二或第三個靶抗原結合部分(scDb-TriBs(-scFv)，圖7及8)。或者，該等CD16A靶結合部分可與Fab之C末端融合且靶抗原結合部分整合至Fab之Fv結構域中。

抗原結合蛋白對於CD16A為至少二價，亦即，包含至少兩個CD16A抗原結合部分。

在一些實施例中，該抗原結合蛋白係四價雙特異性的，其包含針對同一抗原之至少兩個靶抗原結合部分及兩個CD16A抗原結合部分。

在另一個實施例中，該抗原結合部分係四價三特異性的，其包含第一及第二靶抗原結合部分及兩個CD16A抗原結合部分。此類抗原結合蛋白可用於共靶向或雙重靶向。舉例而言，此類抗原結合蛋白包含第一腫瘤抗原結合部分(TAA1)及第二腫瘤抗原結合部分(TAA2)以及兩個CD16A抗原結合部分，用於使NK細胞之細胞毒性重定向針對展示第一(TAA1)及第二(TAA2)腫瘤抗原之細胞。或者，可使用此類包含第一腫瘤抗原結合部分(TAA1)及第二腫瘤抗原結合部分(TAA2)以及兩個CD16A抗原結合部分的三特異性抗原結合蛋白使NK細胞之細胞毒性重定向於表型不同的表現第一(TAA1)或第二(TAA2)腫瘤抗原之細胞類型。

在某些實施例中，抗原結合蛋白可為三價雙特異性的、三價三特異性的、四價雙特異性的、四價三特異性的、四價四特異性的、六價三特異性的或六價雙特異性的。

在第二態樣中，本發明提供特定抗原結合蛋白形式，其具有至少兩個CD16A抗原結合部分且在CD16A抗原結合部分之多肽內具有確定之抗CD16A結構域佈置，由此防止NK細胞互相殘殺且實現高效NK細胞結合以及增強之免疫效應子功能，諸如增強之ADCC的募集。

當在達雷木單抗誘導超過50% NK溶解之檢定中，在高達30 µg/mL之抗體濃度下不存在或僅存在低於10%的可量測之最低溶解時，認為CD16A抗原結合蛋白對誘導NK-NK溶解呈陰性。

防止NK細胞互相殘殺之作用，以及NK細胞結合及增強之效應子功能的募集應與本文所述之抗原結合蛋白之特定3D結構的固有特性相關。

在本文所揭示之抗原結合蛋白(例如實例7中所述者) N末端處之CD16A接合引起之NK細胞互相殘殺大體上低於在C末端處之CD16A接合。然而，本揭示內容涵蓋在N末端或C末端處接合CD16A之抗原結合蛋白(例如關於在每一末端處接合之實例，參見實例7、8及9)。關於N末端CD16接合之詳情，如實例8中所揭示，使用基於Fab之CD16A接合觀察到更明顯之NK細胞耗盡。此外，藉由分析CD16 Fv之結構域次序，含有VL-VH結構域次序之抗體形式會誘導相較於含有VH-VL次序之抗體形式明顯減少的NK細胞互相殘殺發生。

在某些實施例中，藉由避免基於Fab之CD16A接合並集中在CD16結合Fv結構域之有益VL-VH次序，使NK細胞互相殘殺誘導性抗體之比率以及NK細胞殺滅之效力改善。

在某些實施例中，在CD16A抗原結合部分之多肽內的可變區須依序連接，以使得在該多肽，亦即，Fv多肽之N末端處定位輕鏈可變區(V_L )。緊接著定位於N末端處之V_L 的可變區可為V_L 或V_H 。值得關注的是，若CD16A抗原結合部分之可變區係定位成使得V_L 在CD16A抗原結合部分之多肽的N末端處，則可獨立於CD16A抗原結合部分置換結合親和力避免互相殘殺。

具體言之，若CD16A抗原結合部分係scFv，則該等可變區自該多肽之N末端至C末端如下定位：V_L -V_H 。

具體言之，若CD16A抗原結合部分係Db，則該等可變區自形成Db之兩個多肽各自之N末端至C末端如下定位：V_L -V_H 。

具體言之，若CD16A抗原結合部分係scDb，則該等可變區自該多肽之N末端至C末端如下定位：(i) V_L -V_H -V_L -V_H ，或(ii) V_L -V_L -V_H -V_H ，或(iii) V_H -V_H -V_L -V_L 。

具體言之，若CD16A抗原結合部分係(scFv)₂ ，則該等可變區自該多肽之N末端至C末端如下定位：V_L -V_H -V_L -V_H 。

該CD16A抗原結合部分，例如scFv、Db或scDb之這一多肽係經由連接體(i)在其C末端與Fc部分之CH2結構域的N末端融合或與鉸鏈/中間鉸鏈區融合；或(ii)在其N末端與Fc部分之CH3結構域的C末端融合或與CL或CH1結構域之C末端融合。

較佳地，兩個CD16A抗原結合部分係定位於該抗原結合蛋白之N末端或C末端。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分與Fc部分融合。較佳地，兩個CD16A抗原結合部分在N末端或C末端與Fc部分融合。Fc部分含有恆定去中保持IgG Fc區之至少一種功能的部分。「Fc部分」包括天然序列Fc區及變異體Fc區。

較佳地，Fc部分係「沉默的」。「沉默之Fc部分」係指本身不結合至Fcγ受體(FcγR)，包括CD16A (FcγRIIIA)，但保持結合至新生兒Fc受體(FcRn)之經修飾Fc部分。FcRn結合能夠跨上皮屏障胞吞轉送及再循環以防止IgG或含有FcRn結合Fc部分之融合蛋白發生溶酶體降解，使得血清半衰期延長並延長在循環中之持久性。抗原結合蛋白係設計成用於經由CD16A抗原結合部分特異性接合NK細胞上之CD16A且因此，在較佳實施例中，應防止Fc結合至其他Fcγ受體。因此，Fc-融合抗原結合蛋白之Fc部分中保持或增強FcRn結合之修飾係較佳的。

已描述與Fcγ受體之結合減弱或消失之IgG1 Fc部分的若干組突變或改變(稱為「沉默突變」或「少效應子突變」)，其係選自由以下組成之群的突變：C220S、C229S、E233P、L234A、L234V、L234F、L235A、L235E、P238S、D265A、N297A、N297Q、P331S；或用於產生與Fcγ受體之結合減弱之IgG2 Fc部分的突變，其可選自由以下組成之群：H268Q、V309L、A330S、A331S；或用於產生與Fcγ受體之結合減弱之IgG4 Fc部分的突變，其可選自由以下組成之群：L235A、G237A、E318A (Strohl W.,Current Opinion in Biotechnology (2009);20:1-7；Kaneko E及Niwa R,Biodrugs (2011);25(1):1-11；Baudino L.,J. Immunology (2008);181:6664-6669)。

此外，Fc部分可工程改造成用於調節，例如增加或縮短血清半衰期。已描述以下在IgG1 Fc部分中增加抗原結合蛋白之血清半衰期之突變：T250Q、M252Y、S254T、T256E、T307A、E380A、M428L、H433K、N434A、N434Y (Srohl W., Current Opinion in Biotechnology (2009);20:1-7；Borrok MJ等人, J. Pharmaceutical Sciences 2017;106(4): 1008-1017)。

在一些實施例中，IgG，特別是IgG1之Fc部分包含根據Kabat EU編號在位置234、235及265處之一組突變，具體言之，該組突變係選自L234F/V/A、L235A/E及D265A。包含該組突變L234F、L235E及D265A之IgG1 Fc部分尤佳。因此，在一些實施例中，抗原結合蛋白包含具有該組突變L234F、L235E及D265A的沉默之IgG1 Fc部分。所有所述突變皆對應於Kabat EU編號系統(Kabat, E.A.等人 , Sequences of proteins of immunological interest. 第5版 - US Department of Health and Human Services, NIH publication no 91-3242, 第662,680,689頁 (1991))。在某些實施例中，抗原結合蛋白包含具有該組突變L234F及L235E的沉默之IgG1 Fc部分。

在一些實施例中，CD16A抗原結合部分與包含兩個一致彼此組裝之CH2-CH3多肽的同二聚Fc部分融合，其中該共價二聚化因CH2結構域N末端之鉸鏈區而得到促進。

抗原結合部分可在N末端經由鉸鏈區與Fc部分融合或在C末端與CH3結構域融合。當CD16A抗原結合部分係在N末端融合時，第一靶抗原結合部分較佳在C末端與Fc區融合。

在一個特定實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分係融合成使得在Fc部分之N末端或C末端處藉由二聚化形成Db (Db-Fc)，其中CD16A抗原結合VL-VH-多肽經由連接體及鉸鏈區與CH2-CH3多肽在N末端處融合或與CH3之C末端融合且靶抗原結合部分以scFv形式與各別相對末端融合(圖9、10)。較佳地，該鉸鏈係中間鉸鏈(SEQ ID NO:24)。舉例而言，該抗原結合蛋白包含在Fc區中二聚化之兩個多肽鏈，其中每條多肽鏈自N末端至C末端包含： (i) V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶)-V_L (靶) (圖9)； (ii) V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (靶)-V_H (靶) (圖9)； (iii) V_L (靶)-V_H (靶)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A) (圖10)；或 (iv) V_H (靶)-V_L (靶)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A) (圖10)。

在另一個實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分以scFv形式與Fc部分融合(Bi-scFv-Fc)，其中具有第一特異性(靶結合或CD16A結合)之scFv與CH2-CH3多肽之一個末端融合，且具有第二特異性(CD16A結合或靶結合)之scFv與CH2-CH3多肽之另一個末端融合，形成二聚化Fc部分。由此該兩個靶抗原結合部分各自以scFv形式與該兩個CH2-CH3多肽各自之各別相對末端融合(圖11、12)。舉例而言，此類抗原結合蛋白包含在鉸鏈及Fc區中同二聚化之兩個多肽鏈，其中每條多肽鏈包含在N末端處scFv且在C末端處，CH2-CH3多肽及結構域各自由N末端至C末端如下定位： (i) V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶)-V_L (靶) (圖11)； (ii) V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (靶)-V_H (靶) (圖11)； (iii) V_L (靶)-V_H (靶)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A) (圖12)；或 (iv) V_H (靶)-V_L (靶)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A) (圖12)。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分與異二聚(不對稱)Fc部分融合。此類異二聚Fc部分包含Fc區兩個CH2-CH3多肽各自的促進該兩個多肽(異)二聚化之修飾。該等修飾包括在各多肽中彼此互補以促進該兩個CH2-CH3多肽組裝之獨立修飾。該等修飾可為核酸突變，其將轉譯成胺基酸取代。此類修飾稱為「孔中節」(KiH)且多種變異體之構築描述於例如Ridgway等人(Protein Engineering, 第9卷, 第7期, 第617-621頁, 1996)中：舉例而言，根據EU編號系統，在一個CH2-CH3多肽中之取代T366Y及在另一多肽中之取代Y407T (Kabat等人, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, NIH, 1991)。含有孔中節取代，即在第一個IgG1 CH2-CH3多肽中之T366Y及在第二個IgG1 CH2-CH3多肽中之Y407T取代的Fc部分之實例具有如SEQ ID NO:31、32中所描繪之胺基酸序列。此外，亦已開發出用於產生促進異二聚化之互補界面的其他策略(評述於Brinkmann及Kontermann, MABS 2017;9(2):182-212)。在另一實施例中，可併入二硫橋以進一步使異二聚體穩定並增加產率(Merchant等人, Nature Biotech. 1998;16: 677-681；Atwell等人; J. Mol. Biol. 270 (1997) 26-35)。

在一個特定實施例中，兩個CD16A抗原結合部分以scDb形式與異二聚Fc部分融合(KiH-scDb-Fc)，其中該scDb之單一多肽與第一個CH2-CH3多肽融合且單一靶抗原結合部分以scFv形式與該第一個CH2-CH3多肽或該第二個CH2-CH3多肽之各別相對末端融合(圖3、5)。舉例而言，該抗原結合蛋白包含在中間鉸鏈或鉸鏈及Fc區中異二聚化之兩個多肽鏈，其中第一個多肽鏈自N末端至C末端包含：V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3或V_L (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3，且該第二個多肽自N末端至C末端包含：鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶)-V_L (靶)或鉸鏈-CH2-CH3-V_L (靶)-V_H (靶) (圖3)；或第一個多肽鏈自N末端至C末端包含：鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)或鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_H (CD16A)，且該第二個多肽自N末端至C末端包含：V_H (靶)-V_L (靶)-鉸鏈-CH2-CH3或V_L (靶)-V_H (靶)-鉸鏈-CH2-CH3 (圖5)；或scDb之單一多肽與第一個CH2-CH3多肽融合且單一靶抗原結合部分以scFv形式與第二個CH2-CH3多肽之同一末端融合(圖4)。舉例而言，該抗原結合蛋白包含兩個多肽鏈，其中第一個多肽鏈自N末端至C末端包含：V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3或V_L (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3，且第二個多肽自N末端至C末端包含：V_H (靶)-V_L (靶)-鉸鏈-CH2-CH3或V_L (靶)-V_H (靶)-鉸鏈-CH2-CH3 (圖4)。

在另一個實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分以scDb形式與異二聚Fc部分融合且scDb之單一多肽與第一個CH2-CH3多肽融合且單個第一靶抗原結合部分(TAA1)以scFv形式與該第一個CH2-CH3多肽之各別相對末端融合且第二靶抗原結合部分(TAA2)以scFv形式與第二個CH2-CH3多肽在與該第一靶抗原結合部分相同之末端處融合(圖6)。舉例而言，該抗原結合蛋白包含在鉸鏈或中間鉸鏈及Fc區中異二聚化之兩個多肽鏈，其中第一個多肽鏈自N末端至C末端包含：V_H (靶1)-V_L (靶1)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)或V_H (靶1)-V_L (靶1)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_H (CD16A)或V_L (靶1)-V_H (靶1)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)或V_L (靶1)-V_H (靶1)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_H (CD16A)，且第二個多肽自N末端至C末端包含：V_H (靶2)-V_L (靶2)-鉸鏈-CH2-CH3或V_L (靶2)-V_H (靶2)-鉸鏈-CH2-CH3 (圖6)。

在另一個實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分各自以scFv形式與異二聚Fc部分融合(KiH-scFv-Fc)且該兩個scFv各自與該第一個及第二個CH2-CH3多肽之一融合，且單個第一靶抗原結合部分(TAA1)以scFv形式與第一個CH2-CH3多肽之各別相對末端融合，且第二靶抗原結合部分(TAA2)以scFv形式與第二個CH2-CH3多肽在與該第一靶抗原結合部分相同之末端融合(圖15)。舉例而言，該抗原結合蛋白包含在Fc區中異二聚化之兩個多肽鏈，其中第一個多肽鏈自N末端至C末端包含：V_H (靶1)-V_L (靶1)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)或V_L (靶1)-V_H (靶1)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)，且第二個多肽自N末端至C末端包含：V_H (靶2)-V_L (靶2)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)或V_L (靶2)-V_H (靶2)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A) (圖15b)；或者，該抗原結合蛋白包含在Fc區中異二聚化之兩個多肽鏈，其中第一個多肽鏈自N末端至C末端包含：V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶1)-V_L (靶1)或V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (靶1)-V_H (靶1)，且第二個多肽自N末端至C末端包含：V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶2)-V_L (靶2)或V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (靶2)-V_H (靶2) (圖15a)。

在另一個實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分以scDb形式與單體Fc部分融合(scDb-mFc，圖1、2)。該單體Fc部分(mFc)含有在CH3結構域中防止與另一個CH2-CH3多肽二聚化且不含鉸鏈區，但保持結合至FcRn受體且不結合至另一個FcγR的突變。該等突變描述於Ying等人 (MABS, 2014;6(5):1201-1210；或WO 2013/138643)中。此類單體Fc部分之實例具有如SEQ ID NO:30中所描繪之胺基酸序列。該抗原結合蛋白由單一多肽鏈組成，其中包含兩個CD16A抗原結合部分之scDb與單體Fc部分之一個末端融合且靶抗原結合部分與單體Fc部分之另一個末端融合。此類抗原結合蛋白由單一多肽鏈組成，該單體多肽鏈自N末端至C末端包含：V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-CH2-CH3-V_H (靶)-V_L (靶)，或V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-CH2-CH3-V_L (靶)-V_H (靶)，或V_L (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_H (CD16A)-CH2-CH3-V_H (靶)-V_L (靶)，或V_L (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_H (CD16A)-CH2-CH3-V_L (靶)-V_H (靶) (圖1)，或V_H (靶)-V_L (靶)-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)，或V_L (靶)-V_H (靶)-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)，或V_H (靶)-V_L (靶)-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_H (CD16A)，或V_L (靶)-V_H (靶)-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_H (CD16A) (圖2)。

在其他實施例中，抗原結合部分之多肽的N末端與Fab片段之C末端融合。舉例而言，包含兩個CD16A抗原結合部分之Db、scDb或兩個scFv與Fab片段之C末端融合且Fab片段之Fv包含靶抗原結合部分。

在其他實施例中，該抗原結合蛋白係三特異性的(scDb-TriBs(-scFv)，其中包含兩個CD16A抗原結合部分之scDb在C末端與Fab片段兩個多肽中之第一個融合，且第一靶抗原結合部分(TAA1)在C末端以scFv形式或以二價scDb形式與Fab片段之第二個多肽融合，且Fab片段之Fv提供第二靶抗原結合部分(TAA2)。在一個特定實施例中，Fv之第二靶抗原結合部分係人血清白蛋白(HSA)抗原結合部分。此類抗原結合蛋白包含與在Fab之C末端融合兩個scDb之Fab片段-融合物異二聚化的兩個多肽鏈，其中第一個多肽鏈自N末端至C末端包含：V_L (HSA)-CL-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)，第二個多肽自N末端至C末端包含：V_H (HSA)-CH1-V_H (靶1)-V_L (靶1)-V_H (靶1)-V_L (靶1) (圖7)。在另一個實施例中，包含兩個CD16A抗原結合部分之scDb及包含第一靶抗原結合部分之scFv在C末端與Fab片段融合，其中第一個多肽鏈自N末端至C末端包含：V_L (HSA)-CL-V_H (靶1)-V_L (靶1)，且第二個多肽鏈自N末端至C末端包含：V_H (HSA)-CH1-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A) (圖8)。

在另一個實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分在C末端與IgG融合，其中該IgG之兩個Fab臂提供兩個另外的抗原結合部分(scFv-IgAb，圖13)。在此類抗原結合蛋白中，包含CD16A抗原結合部分之第一個scFv在C末端與第一個H鏈之CH3融合且包含CD16A抗原結合部分之第二個scFv與第二個H鏈之CH3融合，且該兩個Fab臂將靶抗原結合部分提供給每個Fv。兩個Fv可具有相同靶抗原結合部分或兩個Fv可提供第一及第二靶抗原結合部分。舉例而言，該抗原結合蛋白包含兩個一致H鏈及兩個一致L鏈，其中該H鏈自N末端至C末端包含：V_H (靶)-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)，且該L鏈自N末端至C末端包含：V_L (靶)-CL (圖13)。

或者，包含兩個CD16A抗原結合部分之scFv-IgAb係由IgG Fab臂之兩個Fv提供且一個或兩個另外的抗原結合部分在C末端與IgG融合。在此類抗原結合蛋白中，該兩個Fab臂各自將一個CD16A抗原結合部分提供給每個Fv且包含靶抗原結合部分之第一個scFv在C末端與第一個H鏈之CH3融合，且視情況，包含另外的第一或第二靶抗原結合部分之第二個scFv與第二個H鏈之CH3融合。舉例而言，該抗原結合蛋白包含兩個一致H鏈及兩個一致L鏈，其中該H鏈自N末端至C末端包含：V_H (CD16A)-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (靶)-V_H (靶)且L鏈自N末端至C末端包含：V_L (CD16A)-CL (圖16)，或H鏈自N末端至C末端包含：V_H (CD16A)-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶)-V_L (靶)且L鏈自N末端至C末端包含：V_L (CD16A)-CL。

在另一個實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分在C末端與IgG融合，IgG之兩個Fab臂提供兩個第一靶抗原結合部分(TAA1)且另一個scFv第二靶抗原結合部分(TAA2)在C末端與兩個CL結構域中之每一個融合(Bi-scFv-IgAb，圖14)。在此類抗原結合蛋白中，包含CD16A抗原結合部分之第一個scFv在C末端與第一個H鏈之CH3融合且包含CD16A抗原結合部分之第二個scFv與第二個H鏈之CH3融合，該兩個Fab臂將第一靶抗原結合部分(TAA1)提供給每個Fv且兩個另外的第二靶抗原結合部分(TAA2)係由與CL結構域中之每一個融合的每個scFv第二靶抗原結合部分提供。舉例而言，該抗原結合蛋白包含兩個一致H鏈及兩個一致L鏈，其中該H鏈自N末端至C末端包含：V_H (靶1)-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)，且該L鏈自N末端至C末端包含：V_L (靶1)-CL-V_L (靶2)-V_H (靶2)或V_L (靶1)-CL-V_H (靶2)-V_L (靶2) (圖14)。

根據本發明，多特異性抗原結合蛋白包含特異性結合至CD16A及至少一個不同於CD16A之靶抗原(TA)的CD16A抗原結合部分。

在一些實施例中，該CD16A結合部分結合至人及食蟹獼猴CD16A。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分包含對CD16A具有特異性之重鏈及輕鏈可變結構域，其中(i)對CD16A具有特異性之重鏈可變結構域(V_H )包含具有SEQ ID NO:50中所述之胺基酸序列的重鏈CDR1；具有SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:56中所述之胺基酸序列的重鏈CDR2；具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列的重鏈CDR3；且對CD16A具有特異性之輕鏈可變結構域(V_L )包含具有SEQ ID NO:53中所述之胺基酸序列的輕鏈CDR1；具有SEQ ID NO:54中所述之胺基酸序列的輕鏈CDR2；及具有SEQ ID NO:55中所述之胺基酸序列的輕鏈CDR3；或 (ii) 對CD16A具有特異性之重鏈可變結構域(V_H )具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列；及/或 (iii) 對CD16A具有特異性之輕鏈可變結構域(V_L )具有SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分包含重鏈可變結構域(V_H )及輕鏈可變結構域(V_L )，其中(a)該V_H 包括含或具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3；及(b)該V_L 包括含或具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_H 包含或具有SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列。在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_L 包含或具有SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分包含V_H 及V_L ，其中(a)該V_H 包括含或具有SEQ ID NO:82中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:83中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列的CDR3；及(b)該V_L 包括含或具有SEQ ID NO:84中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:85中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:86中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_H 包含或具有SEQ ID NO:4中所述之胺基酸序列。在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_L 包含或具有SEQ ID NO:5中所述之胺基酸序列。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分包含V_H 及V_L ，其中(a)該V_H 包括含或具有SEQ ID NO:87中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:88中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列的CDR3；及(b)該V_L 包括含或具有SEQ ID NO:89中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:95中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:90中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_H 包含或具有SEQ ID NO:6中所述之胺基酸序列。在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_L 包含或具有SEQ ID NO:7中所述之胺基酸序列。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分包含V_H 及V_L ，其中(a)該V_H 包括含或具有SEQ ID NO:91中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:92中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列的CDR3；及(b)該V_L 包括含或具有SEQ ID NO:93中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:85中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:94中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_H 包含或具有SEQ ID NO:8中所述之胺基酸序列。在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_L 包含或具有SEQ ID NO:9中所述之胺基酸序列。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分包含V_H 及V_L ，其中(a)該V_H 包括含或具有SEQ ID NO:82中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:95中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列的CDR3；及(b)該V_L 包括含或具有SEQ ID NO:96中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:97中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:98中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_H 包含或具有SEQ ID NO:10中所述之胺基酸序列。在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_L 包含或具有SEQ ID NO:11中所述之胺基酸序列。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分包含V_H 及V_L ，其中(a)該V_H 包括含或具有SEQ ID NO:82中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:99中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列的CDR3；及(b)該V_L 包括含或具有SEQ ID NO:100中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:101中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:102中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_H 包含或具有SEQ ID NO:12中所述之胺基酸序列。在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_L 包含或具有SEQ ID NO:13中所述之胺基酸序列。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分包含V_H 及V_L ，其中(a)該V_H 包括含或具有SEQ ID NO:50中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:103中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列的CDR3；及(b)該V_L 包括含或具有SEQ ID NO:53中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:54中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:104中所述之胺基酸序列的CDR3。

在一些實施例中，該CD16A抗原結合部分包含V_H 及V_L ，其中(a)該V_H 包括含或具有SEQ ID NO:50中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:103中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列的CDR3；及(b)該V_L 包括含或具有SEQ ID NO:53中所述之胺基酸序列的CDR1、含或具有SEQ ID NO:54中所述之胺基酸序列的CDR2及含或具有SEQ ID NO:105中所述之胺基酸序列的CDR3。

該針對CD16A之CD16A抗原結合部分不結合至CD16B且以類似親和力結合至已知之CD16A異型F158及V158。在人CD16A中已鑑別出改變158位胺基酸之兩個等位基因單核苷酸多態性，此對於與IgG鉸鏈區相互作用至關重要。同型接合158 F/F及異型接合158 V/F等位基因之等位基因頻率在高加索人群中類似，範圍分別在35%與52%或38%與50%之間，而同型接合158 V/V等位基因僅在10-15%人群中發現(Lopez-Escamez JA等人; BMC Med Genet 2011;12:2)。因此，由於親和力類似，故在所有患者群中該抗CD16A結構域與NK細胞之接合及對NK細胞之活化作用係有利的。該CD16A抗原結合部分結合至人及食蟹獼猴CD16A。另外，包含結合至CD16A但不結合至CD16B之重鏈及輕鏈可變結構域的CD16A抗原結合部分描述於WO 2006/125668中。

在一些實施例中，多特異性抗原結合分子包含與CD16A之結合相較於具有SEQ ID NO:1及2之抗CD16A有所改善的抗CD16A Fv結構域，且其不結合至CD16B且以類似親和力識別已知之CD16A異型F158及V158。在某些實施例中，親和力改善之抗CD16A Fv結構域包含具有如SEQ ID NO: 53、54、55之序列的VCDR或由具有如SEQ ID NO:2中所描繪之序列的V_L 及在如SEQ ID NO:1中所描繪之序列中具有至少一個變化的V_H 組成。

此類改善之結合物可為親和力成熟之CD16A Fv抗原結合部分。

因此，在一些實施例中，若在ELISA中，在塗有0.16 µg/ml人CD16A (SEQ ID NO:48)之孔上測試，如在Biacore T200系統中用純化之scFv分子所量測，該CD16A抗原結合蛋白包含對人CD16A顯示之親和力(例如藉由親和力成熟改善)及/或選擇性高於具有SEQ ID NO:1及2之抗CD16A Fv的Fv結構域。舉例而言，該針對人CD16A之較高親和力可為超過2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150倍。舉例而言，在Biacore T200系統上量測之單價結合親和力可為K_D = 0.27 nM至1.91 nM，該親和力比所量測的SEQ ID NO:1及2與人CD16A之40.5 nM結合親和力高21至150倍。

較佳地，若在ELISA中，在塗有0.16 µg/ml食蟹獼猴CD16A (SEQ ID NO:49)之孔上測試，如在Biacore T200系統X100中用純化之scFv分子所量測，此類親和力成熟之Fv結構域對食蟹獼猴CD16A亦顯示類似地改善的親和力。舉例而言，該針對食蟹獼猴CD16A之較高親和力可為超過2、3、4、5、6、7、8、9、10、50、100、150、200、250、300、400、500、541倍。舉例而言，在Biacore T200系統上量測之單價結合親和力可為K_D = 0.24至3.63 nM，該親和力比所量測的SEQ ID NO:1、2與食蟹獼猴CD16A之132 nM結合親和力高36至541倍。

在具有SEQ ID NO:1、2之抗CD16 Fv中，已鑑別出某些序列位置(X37、X44、X46)，其中胺基酸取代有益於V_L 結構域(SEQ ID NO:2)中之特異性CD16A結合。參見表1。表 1 ：胺基酸取代之最強影響之概述。提供生殖系序列中與具有SEQ ID NO:1-2之參考序列中編碼的殘基供比較。

表1中所示之所有胺基酸取代對於結合至CD16A並非同等重要。在位置X44及X46中之取代可能較為重要，且較佳地，親和力成熟之純系保持SEQ ID NO:2之胺基酸。

在某些實施例中，負責CD16A結合之其他序列係LCDR3之序列，以及LCDR1之N末端殘基NI，或LCDR2中之QDX序列基元。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_L 包含相較於SEQ ID NO:53、54及55中所述之序列包含1、2、3、4或5個胺基酸取代的輕鏈CDR1、輕鏈CDR2及輕鏈CDR3，且該V_L 保持對CD16A之結合特異性。在某些實施例中，在SEQ ID NO:53之序列中的一個或多個取代係自位置3至6。在某些實施例中，在SEQ ID NO:54之序列中的取代係在3位中。在某些實施例中，在SEQ ID NO:55之序列中6位處之殘基Y及在8位處之V未經取代且。較佳地，LCDR3具有如SEQ ID NO:55中所描繪之序列。

在另一個實施例中，CD16A抗原結合部分之V_L 與SEQ ID NO:2之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%之序列一致性，其中SEQ ID NO:2中自位置23至27之殘基GGHNI、SEQ ID NO:2中自位置49至52之序列基元QDXK未經突變且該V_L 保持對CD16A之結合特異性。

在CD16A抗原結合部分之V_H 中，相較於SEQ ID NO:1之序列，在HCDR1中9位處及/或在HCDR2中11位處之取代有益於改善與CD16A之結合。具體言之，在HCDR1中9位處之殘基係Q及/或在HCDR2中11位處之殘基係V。

因此，在另一個實施例中，CD16A抗原結合部分之V_H 與SEQ ID NO:1之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%之序列一致性，在HCDR1中9位處之殘基係Q及/或在HCDR2中11位處之殘基係V。

因此，在某一實施例中，CD16A抗原結合部分包含V_L 及V_H ，其中該CD16A之V_L 與SEQ ID NO:2之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%之序列一致性，其中在SEQ ID NO:2中自位置23至27之殘基GGHNI、SEQ ID NO:2中自位置49至52之序列基元QDXK未經突變且該V_L 保持對CD16A之結合特異性，且CD16A抗原結合部分之V_H 與SEQ ID NO:1之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%或80%之序列一致性，在HCDR1中9位處之殘基係Q及/或在HCDR2中11位處之殘基係V。

在另一個實施例中，CD16A抗原結合部分之V_L 與SEQ ID NO:2之序列具有至少約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%、約89%、約88%、約87%、約86%、約85%、約84%、約83%、約82%、約81%或約80%之序列一致性，其中SEQ ID NO:2中自位置23至27之殘基GGHNI、SEQ ID NO:2中自位置49至52之序列基元QDXK未經突變且該V_L 保持對CD16A之結合特異性。

因此，在另一個實施例中，CD16A抗原結合部分之V_H 與SEQ ID NO:1之序列具有至少約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%、約89%、約88%、約87%、約86%、約85%、約84%、約83%、約82%、約81%或約80%之序列一致性，在HCDR1中9位處之殘基係Q及/或在HCDR2中11位處之殘基係V。

因此，在某些實施例中，CD16A抗原結合部分包含V_L 及V_H ，其中該CD16A抗原結合部分之V_L 與SEQ ID NO:2之序列具有至少約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%、約89%、約88%、約87%、約86%、約85%、約84%、約83%、約82%、約81%或約80%之序列一致性，其中在SEQ ID NO:2中自位置23至27之殘基GGHNI、SEQ ID NO:2中自位置49至52之序列基元QDXK未經突變且該V_L 保持對CD16A之結合特異性，且CD16A抗原結合部分之V_H 與SEQ ID NO:1之序列具有至少約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%、約89%、約88%、約87%、約86%、約85%、約84%、約83%、約82%、約81%或約80%之序列一致性，在HCDR1中9位處之殘基係Q及/或在HCDR2中11位處之殘基係V。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分之V_H 與SEQ ID NO:3中所述之序列具有至少約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%、約89%、約88%、約87%、約86%、約85%、約84%、約83%、約82%、約81%或約80%之序列一致性。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分包括含與SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列至少約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%、約89%、約88%、約87%、約86%、約85%、約84%、約83%、約82%、約81%或約80%一致或同源之胺基酸序列的V_H ，及含與SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列至少約99%、約98%、約97%、約96%、約95%、約94%、約93%、約92%、約91%、約90%、約89%、約88%、約87%、約86%、約85%、約84%、約83%、約82%、約81%或約80%一致或同源之胺基酸序列的V_L 。

在一個特定實施例中，CD16A抗原結合部分包含V_L 及V_H ，其中該V_L 係選自由具有SEQ ID NO:2、5、7、9、11及13之區域組成之群，且該V_H 係選自由SEQ ID NO:1、3、4、6、8、10及12組成之群。 III. 靶抗原結合部分

在某些實施例中，靶抗原結合部分之靶抗原係展示於骨髓瘤細胞或漿細胞上之抗原。骨髓瘤細胞係由骨髓中之漿細胞得到的惡性(癌性)漿細胞。在骨髓瘤中，惡性漿細胞產生大量不能抵抗感染之異常抗體。該等異常抗體係充當骨髓瘤之腫瘤標記物之單株蛋白，或M蛋白。骨髓瘤細胞具有表型CD19^- /CD38⁺ /CD138⁺ /BCMA⁺ 。因此，CD38、CD138及BCMA表示骨髓瘤細胞上表現之抗原。A. BCMA

B細胞成熟抗原(BCMA、CD269或TNFRSF17)係TNF受體超家族之蛋白質，該蛋白質經由其結合B細胞活化(BAFF)及一增殖誘導配體(APRIL)而對漿細胞之長期存活起作用(O'Connor, B.P.等人, BCMA is essential for the survival of long-lived bone marrow plasma cells. J. Exp. Med. 2004, 199, 91-96)。人BCMA係由54個胺基酸之細胞外結構域、23個胺基酸之跨膜結構域及107個胺基酸之細胞內結構域組成的一種184個胺基酸(aa)之蛋白質(Entrez基因ID：608 (人類) 102145399 (食蟹獼猴)；UniProt Q02223 (人類))。

BCMA在漿細胞長期細胞存活中起到作用(O’Connor, JEM 2004;199(1):91–98)。BCMA在正常漿細胞中表現且在多發性骨髓瘤中上調且具有高發生率。

在某些實施例中，靶抗原結合部分特異性結合至BCMA，例如BCMA之細胞外結構域。

較佳地，本發明之抗原結合蛋白中使用的該抗BCMA Fv以小於10^-7 M、較佳小於10^-8 M、小於10^-9 M，最佳小於10^-10 M之平衡解離常數(K_D ) (由Biacore量測)與BCMA相互作用。併入靶抗原結合部分中之該抗BCMA Fv結構域能夠重定向CD16A接合之NK細胞並在BCMA⁺ MM (多發性骨髓瘤)細胞存在下誘導ADCC。已報導有關在活體外及活體內針對BCMA⁺ 骨髓瘤細胞的經由CD3接合T細胞之雙特異性抗體的概念驗證(例如Hipp S.等人, Leukemia. 2017年8月;31(8):1743-1751. Epub 2016年12月27日)。在某些實施例中，靶抗原結合部分以介於約1 × 10^-9 M與約5 × 10^-9 M之間之K_D 結合至BCMA。在某些實施例中，靶抗原結合部分以約2 × 10^-9 M之K_D 結合至BCMA。

此類BCMA抗原結合部分可例如藉由如例如Ryan M.C等人, Antibody targeting of B-cell maturation antigen on malignant plasma cells.Mol CancerTher . (2007);6:3009-3018中所述的噬菌體或核糖體文庫篩選方法或用BCMA之細胞外結構域使非人類動物免疫來獲得。

Ryan等人描述具有細胞毒性活性的呈IgG形式或抗體藥物結合物形式之抗BCMA抗體之製造。以引用方式併入的Ryan M.C等人描述靶向腫瘤細胞之人BCMA選擇性抗體之產生。產生針對人BCMA細胞外結構域(ECD，胺基酸5-51；NP_001183)之抗體。該抗體在活體外誘導針對MM細胞之強效ADCC，該作用因具有增強CD16A結合之Fc突變而增加。藉由飽和結合測定，SG1針對H929細胞之結合親和力K_D 係51 nmol/L。該等抗體展示在活體外針對MM細胞株之抗腫瘤活性，且因此，可採用其Fv結構域作為根據本發明之抗原結合蛋白中的BCMA抗原結合部分。

另外，WO 02/066516描述與TACI具有交叉反應性之BCMA抗體。所描述之抗BCMA/TACI雙特異性抗體結合至BCMA之殘基1-48以及TACI之殘基30-67及68-154。其可變重鏈及輕鏈結構域可用作本發明之抗原結合蛋白中的BCMA抗原結合部分且以引用之方式併入。

以引用方式併入的Ramadoss等人, J. Am.Chem.Soc. 2015;137:5288-5291描述重定向T細胞以溶解惡性MM細胞之雙特異性(BiFab-BCMA)抗體。其中描述雙特異性抗體可用於治療MM，因為其靶向休眠癌症幹細胞以及較低數量的腫瘤相關抗原。

WO 2014/122144描述以雙特異性形式特異性結合至人BCMA及CD3之雙特異性抗體。所揭示之抗BCMA可變結構域適於根據本發明之BCMA抗原結合部分。

WO 2013/072406揭示在對CD3具有第二特異性之雙特異性單鏈抗體中命名為BCMA-1至BCMA-108之抗BCMA Fv結構域，其用於接合T細胞。已描述在人腫瘤異種移植物模型中該等BCMA/CD3雙特異性單鏈抗體之抗腫瘤功效且因此，該等抗BCMA Fv結構域可用於本發明之BCMA抗原結合部分中。

另外，在WO 2010/104949、WO 2012/163805、WO 2013/072415、WO 2014/140248及WO 2014/068079中已揭示可用於接合免疫效應細胞，諸如T細胞或NK細胞之雙特異性抗體中的抗BCMA抗體。此外，該等參考文獻描述以高親和力特異性靶向BCMA之抗BCMA Fv結構域以及誘導強效且有效骨髓瘤細胞溶解的採用此類抗BCMA Fv結構域之雙特異性抗體。因此，已顯示有關在用於重定向T細胞以溶解MM細胞之雙特異性抗體中的抗BCMA Fv結構域之概念驗證。

另外，結合至骨髓瘤細胞上表現之抗原，特別是BCMA的抗原結合部分可來源於其他已知或市售之抗體，或藉由此項技術中熟知之方法從頭產生。舉例而言，對BCMA具有特異性之可變結構域可藉由選擇對BCMA具有特異性之可變片段(Fv)獲得。此可例如藉由篩選單鏈Fv (scFv)噬菌體展示文庫或經由融合瘤技術實現。舉例而言，基於IgM的人scFv序列之噬菌體展示文庫可經歷數輪活體外選擇以富集對BCMA具有特異性之結合物(實例1)。可藉由親和力成熟進一步增加所選scFv之親和力。

在某些實施例中，BCMA靶向部分包括含SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、含SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、含SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、含SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、含SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及含SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的V_L CDR3。

在某些實施例中，BCMA靶向部分之V_H 包含與SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%同源或一致的胺基酸序列。

在某些實施例中，BCMA靶向部分之V_L 包含與SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%同源或一致的胺基酸序列。

在某些實施例中，BCMA靶向部分之V_H 包含或具有SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列。在某些實施例中，BCMA靶向部分之V_L 包含或具有SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列。

在某些實施例中，BCMA靶向部分之V_H 包含與SEQ ID NO:37中所述之胺基酸序列至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%同源或一致的胺基酸序列。

在某些實施例中，BCMA靶向部分之V_L 包含與SEQ ID NO:38中所述之胺基酸序列至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%同源或一致的胺基酸序列。

在某些實施例中，CD16A/BCMA結合抗體係具有圖13中所示之結構的scFv-IgAb抗原結合蛋白，其包含(a)以scFv形式與同二聚人IgG CH2-CH3 Fc部分之C末端以V_L -V_H 次序融合的兩個CD16A抗原結合部分及(b)由IgG之Fab臂中的每個Fv提供的兩個靶抗原結合部分，其中該等靶抗原結合部分結合至BCMA。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分各自包括含SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、含SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、含SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、含SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、含SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及含SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的V_L CDR3。在某些實施例中，CDR係根據Kabat編號系統標識。CD16A抗原結合部分各自包含具有SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的V_H ，及具有SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的V_L 。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分與Fc部分之C末端融合且經具有SEQ ID NO:22中所述之胺基酸序列之連接體按以下次序連接：V_L (CD16A)-連接子L3- V_L (CD16A)，其中連接子L3具有SEQ ID NO:18中所述之胺基酸序列。

在某些實施例中，BCMA靶向部分各自包括含SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、含SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、含SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、含SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、含SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及含SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的V_L CDR3。在某些實施例中，CDR係根據Kabat編號系統標識。BCMA靶向部分各自包含具有SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的V_H ，及具有SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的V_L 。

在某些實施例中，CD16A/BCMA抗體之Fc部分係沉默之Fc部分，該Fc部分包含人IgG1 CH2及CH3重鏈恆定結構域，其包含SED ID NO: 29中所述之胺基酸序列。CH2重鏈恆定結構域具有兩個沉默突變(又稱為「少效應子突變」)：L234F及L235E。CH2重鏈恆定結構域包含SED ID NO: 79中所述之胺基酸序列。CH3重鏈恆定結構域包含SED ID NO: 109中所述之胺基酸序列。連接至BCMA靶向部分之CH1重鏈恆定結構域包含SEQ ID NO: 33中所述之胺基酸序列。

在某些實施例中，CD16A/BCMA抗體I包含具有SED ID NO: 61中所述之胺基酸序列的多肽鏈1，及具有SEQ ID NO: 62中所述之胺基酸序列的多肽鏈2。

在某些實施例中，CD16A/BCMA抗體係具有圖5中所示之結構的KiH-scDb-Fc，其包含(a)以scDb形式與IgG CH2-CH3 Fc部分之C末端以V_L -V_H -V_L -V_H 次序融合的兩個CD16A抗原結合部分及(b)以scFv形式與Fc部分之N末端融合的單個靶抗原結合部分，其中該靶抗原結合部分結合至BCMA。

在某些實施例中，CD16A抗原結合部分與異二聚Fc部分融合且經具有SEQ ID NO:20中所述之胺基酸序列之連接體按以下次序連接：V_L (CD16A)-連接子L1-V_H (CD16A)-連接子L2-V_L (CD16A)-連接子L1-V_H (CD16A)，其中連接子L1具有SEQ ID NO:16中所述之胺基酸序列，且連接子L2具有SEQ ID NO:17中所述之胺基酸序列。

在某些實施例中，CD16A/BCMA抗體III之Fc部分係沉默之Fc部分，該Fc部分包含人IgG1 CH2及CH3重鏈恆定結構域，其具有SED ID NO: 31中所述之胺基酸序列。CH2重鏈恆定結構域具有兩個沉默突變或少效應子突變：L234F及L235E。CH2重鏈恆定結構域包含SED ID NO: 79中所述之胺基酸序列。CH3重鏈恆定結構域具有一個沉默突變或少效應子突變D265A。CH3重鏈恆定結構域包含SEQ ID NO: 81中所述之胺基酸序列。

在某些實施例中，CD16A/BCMA抗體包含具有SEQ ID NO: 63中所述之胺基酸序列的多肽鏈1，及具有SEQ ID NO: 64中所述之胺基酸序列的多肽鏈2。

在本發明之多特異性抗原結合蛋白的一個實施例中，該蛋白質係包含具有如SEQ ID NO: 61及62或SEQ ID NO: 63及64中所描繪之胺基酸序列之多肽的四聚體。B. EGFR

亦提供用於基於自然殺手(NK)細胞之EGFR靶向方法的EGFR/CD16A抗原結合蛋白。

在一些實施例中，針對本文所述之EGFR之抗原結合部分亦結合至EGFRvIII。因此，EGFR/CD16A抗原結合蛋白可用於治療EGFR表現性癌症及EGFRvIII表現性癌症。相對於EGFR，EGFRvIII僅在癌細胞上表現，但在健康組織上不表現。因此，可用本文所述之EGFR/CD16A抗原結合蛋白靶向多種EGFR陽性及/或EGFRvIII陽性腫瘤且因此靶向眾多患者群體。適於本文所述之抗原結合蛋白的EGFR結合結構域之實例包含SEQ ID NO:40中所描繪之胺基酸序列作為VH及SEQ ID NO:41中所描繪之胺基酸序列作為VL。 IV. 聚核苷酸

根據本文所述任一實施例之抗原結合蛋白可藉由表現編碼各個多肽鏈之聚核苷酸形成抗原結合分子來製造。因此，本發明之其他實施例係編碼上文所述之抗體分子之多肽的聚核苷酸，例如DNA或RNA。

該等聚核苷酸可藉由熟習此項技術者已知之方法，例如藉由將編碼以肽連接子隔開或經肽鏈之肽鍵直接連接之可變結構域的基因組合成可操作地連接至適合啟動子且視情況可操作地連接至適合轉錄終止子之基因構築體，並在細菌或其他適當表現系統，諸如CHO細胞中表現該基因構築體來構築。取決於所用載體系統及宿主，可以使用多種適合的轉錄及轉譯元件，包括組成性及誘導性啟動子。啟動子之選擇應使得其驅動聚核苷酸在各別宿主細胞中之表現。

聚核苷酸可插入載體，較佳地表現載體中，該等載體表示本發明之另一實施例中。

可利用多種表現載體/宿主系統包含並表現編碼本發明之多肽鏈的聚核苷酸。用於在大腸桿菌中表現之表現載體的實力係用於在哺乳動物細胞中表現之pSKK (LeGall等人, J Immunol Methods. (2004);285(1):111-27)或pcDNA5 (Invitrogen)。 V. 治療方法

本發明亦提供多特異性抗原結合蛋白，具體言之，包含如上文所述之多特異性抗原結合蛋白及至少一種其他組分的組成物。

本發明還提供用於基於NK細胞之免疫療法中的多特異性抗原結合蛋白或包含如上文所述之多特異性抗原結合蛋白的組成物。基於NK細胞之免疫療法包括基於活性NK細胞之療法，其中經由本發明之抗原結合分子活化內源性或過繼轉移之NK細胞。具體言之，NK細胞攻擊並殺滅異常細胞，諸如癌細胞之能力得到增強。

另外，當前免疫腫瘤學(IO)前景包括上市銷售之檢查點調節劑，諸如抗CTLA4抗體及抗PD-1抗體。即使該等藥劑已展示臨床功效(典型地在眾多適應症中20-30% ORR)，但仍存在醫療需求及機會。因此，儘管近來在治療中已取得此類進展，但仍需要新穎療法在眾多患者中達成增加之患者反應率及持久之緩解。舉例而言，NK細胞在針對MM之免疫反應方面起到關鍵作用且牽涉到包括IMiD、蛋白酶體抑制劑、近期批准之免疫療法及自體幹細胞移植(ASCT)在內之當前標準護理干預的臨床功效。現開發出多種策略來增強NK細胞針對骨髓瘤細胞之天然細胞毒性，NK細胞在MM中常常失調。方法包括經由細胞介素刺激或免疫檢查點靶向調節活性，以及適合ASCT之MM中培養擴增之NK細胞的過繼性轉移。儘管非常引人注目，但該等方法係非靶向的，因為其依賴於NK細胞之天然細胞毒性，且可得益於抗原特異性再靶向及效應子活化。

此外，IO中之合理組合應當基於能夠發揮最大免疫功效，同時在控制下保持安全性的藥劑。有前景之方法勝過獲得性免疫(大部分檢查點抗體僅在T細胞上有活性)且包括先天免疫性之活化，由此產生整合之免疫反應。基於延長之血清半衰期，本文所述之抗體形式非常適合該等目的且能夠類似於當前市售單株抗體便利的給藥，並且可以理想地與檢查點調節劑諸如抗LAG3抗體或抗PD1抗體組合。

在某些實施例中，本發明提供一種多特異性結合至CD16A及如上文所述的在骨髓瘤細胞或漿細胞上表現之抗原的多特異性抗原結合蛋白，該抗原選自由BCMA、CS-1、CD19、CD20、CD22、CD38及CD138組成之群，該多特異性抗原結合蛋白係用於治療多發性骨髓瘤，該治療包括投與該多特異性抗原結合蛋白之步驟。在某一實施例中，本發明提供一種用於NK細胞免疫療法中的特異性結合至靶細胞抗原(例如腫瘤抗原)及CD16A之多特異性抗原結合蛋白，其中該多特異性抗原結合蛋白與NK細胞離體混合並將NK細胞與該多特異性抗原結合分子之組成物投與患者。

在一個特定實施例中，腫瘤抗原係BCMA且該組成物係用於治療漿細胞病症或自體免疫疾病，特別是多發性骨髓瘤。

漿細胞病症包括多發性骨髓瘤、漿細胞瘤、漿細胞白血病、巨球蛋白血症、澱粉樣變性、瓦爾登斯特侖氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、孤立性骨漿細胞瘤、髓外漿細胞瘤、重鏈病、意義不明之單株γ球蛋白症(monoclonal gammopathy of undetermined significance，MGUS)及鬱積型骨髓瘤。

自體免疫性疾病係例如全身性紅斑狼瘡(SLE)或類風濕性關節炎(RA)。

因此，在某些實施例中，本文提供醫療用途及方法，其中將如上文所述的對BCMA及CD16A具有特異性之抗原結合蛋白，例如scDb-mFc、KiH-scDb-Fc、scDb-Trib(-scFv)、scFv-IgAb、Bi-scFv-IgAb、KiH-scFv-Fc、Db-Fc或Bi-scFv-Fc以有效劑量投與個體以治療BCMA⁺ 癌症或自體免疫性疾病，例如多發性骨髓瘤。

投與係藉由不同方式，例如藉由靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部或皮內投與實現。劑量將由主治醫師及其他臨床因素確定。用於任一個體之劑量取決於許多因素，包括患者之體重、體表面積、年齡、性別、打算投與之特定化合物、投與時間及途徑、療法類別、一般健康狀況及同時投與之其他藥物。「有效劑量」係指足以影響疾病之過程及嚴重程度，使此類病狀減輕或緩解之活性成分量。可用於治療及/或預防BCMA⁺ 疾病之「有效劑量」可使用已知方法確定。

此外，本發明提供用於治療或改善疾病之方法，該方法包括將本發明之多特異性抗原結合蛋白投與有需要個體之步驟。

在用於治療或改善疾病之方法的一個較佳實施例中，該疾病係多發性骨髓瘤。

本發明提供當前揭示之抗原結合分子，例如CD16A/BCMA抗原結合分子之用途，其係用於治療及/或預防癌症，例如多發性骨髓瘤。在某些實施例中，該方法包括將當前所揭示之抗原結合分子，例如CD16A/BCMA抗原結合分子，或包含該抗原結合分子之醫藥組成物投與罹患多發性骨髓瘤(「MM」)之個體。

在某些實施例中，接受抗原結合分子，例如CD16A/BCMA抗原結合分子，或包含該抗原結合分子之醫藥組成物治療的個體係復發性/難治性(「R/R」)多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，個體已接受達雷木單抗。在某些實施例中，個體係未用達雷木單抗治療的。在某些實施例中，個體係耐達雷木單抗的。在某些實施例中，個體係達雷木單抗難治的。在某些實施例中，個體係達雷木單抗復發性的。

在某些實施例中，接受抗原結合分子，例如CD16A/BCMA抗原結合分子，或包含該抗原結合分子之醫藥組成物治療的個體表現CD16A多形體。舉例而言但非限制，CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。參見實例8(例如圖31A及31B)。

在某些實施例中，本文所述之治療方法進一步包括投與第二療法，例如基於T細胞之療法或基於檢查點抑制劑之療法。該等第二療法包括但不限於，包括投與抗TIGIT抗體之療法、包括投與抗PD-1抗體(例如納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab))之療法、包括投與抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗(atezolizumab))之療法、包括投與抗VEGF抗體(例如貝伐單抗(bevacizumab))之療法及包括投與CD3雙特異性抗體(例如抗FcRH5/CD3抗體(包括但不限於PCT/US2016/037879中所揭示之該等抗體，該案以引用之方式併入本文中))之療法。

在某些實施例中，本文所述之治療方法進一步包括投與細胞介素療法。如本文所使用，「細胞介素療法」係指包含細胞介素、其任何衍生物或修飾(包括但不限於聚乙二醇化細胞介素及Fc融合細胞介素)之任何療法。可結合該等實施例使用之細胞介素的非限制性實例包括IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27及IL-6。在某些實施例中，該方法進一步包括投與IL-15。在某些實施例中，該方法進一步包括投與IL-2。如實例8中所示，IL-15及IL-2可增加當前揭示之CD16A/BCMA抗原結合分子之活性。

在某些實施例中，投與本文所揭示之抗原結合分子，例如CD16A/BCMA抗原結合分子，或包含該抗原結合分子之醫藥組成物將作為第一線(1L)治療。舉例而言但非限制，該第一線投藥將在展現CD16A多態性之個體中進行，展現CD16A多態性將指示經由基於Fc之MOA，例如達雷木單抗療法起作用之治療劑的效用降低。在某些實施例中，第一線投與本發明之抗原結合分子將在NK細胞互相殘殺治療不當之個體中進行。參見實例8(例如圖40A-40E)。在某些實施例中，第一線投與本發明之抗原結合分子將在需要避免CRS之個體中進行。

在某些實施例中，投與本文所揭示之抗原結合分子，例如CD16A/BCMA抗原結合分子，或包含該抗原結合分子之醫藥組成物將作為第二線(2L)或第三線(3L)治療。舉例而言但非限制，該第二線或第三線投藥將在已接受經由基於Fc之MOA，例如達雷木單抗治療起作用之治療劑的個體中進行。在某些實施例中，該第二線或第三線治療將在達雷木單抗難治性或耐達雷木單抗治療之個體中進行。

在某些實施例中，使用以下一個或多個標準選擇NK細胞接合物以用於治療多發性骨髓瘤： ● NK細胞接合物能夠結合至兩個靶：NK細胞上之CD16A，及在多發性骨髓瘤細胞上之BCMA， ● NK細胞接合物對於CD16A為至少二價，例如包含至少兩個CD16A抗原結合部分， ● NK細胞接合物係NK細胞雙特異性抗體，其不與CD16B交叉反應且較佳與非人類靈長類動物交叉反應， ● NK細胞接合物係強效且普遍使用的，且具有靶依賴性活體外BCMA⁺ 腫瘤細胞(例如以EC50 ≤ 5nM殺滅≥約60%細胞)及原發性骨髓瘤殺滅作用， ● NK細胞接合物不顯著殺滅NK細胞，例如減少或避免NK細胞互相殘殺， ● NK細胞接合物具有可接受之安全性特徵，例如具有優於其他T細胞接合物之活體外細胞介素釋放特徵(例如NK細胞接合物沒有CRS)，不良事件係可監測、可管理且可逆轉的， ● NK細胞接合物可經靜脈內投與多發性骨髓瘤個體，及 ● NK細胞接合物需要每週一次(QW)或更低之投藥頻率。

在某些實施例中，以下藥效學(PD)生物標記物可結合投與本發明之抗原結合蛋白使用：血清M蛋白及游離輕鏈(FLC)之濃度、單株漿細胞減少、治療後骨髓樣品中之NK細胞活化及募集，及周圍NK細胞活化。在某些實施例中，治療方法可包括BMCA依賴性診斷，不過基於多發性骨髓瘤中BMCA之高發生率，此類診斷並非必需的。 VI. 例示性實施例

在某些實施例中，本發明針對一種多特異性抗原結合蛋白，其包含(a)至少一個第一靶抗原結合部分，及(b)至少兩個CD16A抗原結合部分，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分與包含至少一個恆定結構域之Fab片段或Fc部分融合。在某些實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分中之至少一個係選自由單鏈Fv (scFv)、單鏈雙功能抗體(scDb)及雙功能抗體Db組成之群的抗原結合分子。在某些實施例中，該至少兩個CD16A抗原結合部分各自係scFv。在某些實施例中，該至少兩個CD16A抗原結合部分係呈scDb形式。在某些實施例中，該至少兩個CD16A抗原結合部分各自包含依序連接於多肽鏈中之輕鏈可變區(V_L )及重鏈可變區(V_H )，且在該多肽鏈之N末端的可變區係該V_L 。在某些實施例中，該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H 、V_L -V_L -V_H -V_H 或V_L -V_H -V_L -V_H 之次序安置。在某些實施例中，該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H 之次序安置。在某些實施例中，該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H -V_L -V_H 之次序安置。在某些實施例中，(i)該多肽鏈之C末端與Fc部分CH2結構域之N末端融合；或(ii)該多肽鏈之C末端與Fc部分之鉸鏈的N末端融合；(iii)該多肽鏈之N末端與Fc部分CH3結構域之C末端融合；或(iv)該多肽鏈之N末端與Fab片段之C末端融合。在某些實施例中，該多肽鏈之N末端係與該Fc部分CH3結構域之C末端融合。在某些實施例中，Fc部分係選自由單體CH2-CH3片段、異二聚Fc區及同二聚Fc區組成之群。在某些實施例中，Fc部分不結合至Fcγ受體，但保持結合至新生兒Fc受體。在某些實施例中，包含兩個CD16抗原結合部分之scDb或Db與Fab片段之一條鏈的C末端融合且該第一靶抗原結合部分與該Fab片段之另一條鏈的C末端融合。在某些實施例中，Fab片段在N末端包含HSA抗原結合Fv。

在某些實施例中，本文所述之抗原結合蛋白係四價的。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含至少兩個靶抗原結合部分。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含第一靶抗原結合部分、第二靶抗原結合部分及至少兩個CD16A抗原結合部分與二聚Fc部分之融合物。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含CD16A抗原結合部分與IgG每條重鏈之C末端的融合物，且其中該IgG在該兩個Fab之每一個中包含在N末端之第一靶抗原結合Fv部分且第二靶抗原結合蛋白在C末端與該等CL結構域中之每一個融合。

在某些實施例中，本文所述之CD16A抗原結合部分包含(i)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:50中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:51中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列的CDR3，及/或(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:53中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:54中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:55中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含CD16A抗原結合部分，其包含：(i)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3，及/或(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含CD16A抗原結合部分，其包含：(i)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含CD16A抗原結合部分，其包括(i)含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區，及/或(ii)含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白結合選自BCMA及EGFR之第一靶抗原。在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白結合第一靶抗原BCMA。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含具有SEQ ID NO:61或63中所述之胺基酸序列的第一多肽鏈，及具有SEQ ID NO:62或64中所述之胺基酸序列的第二多肽鏈。在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含四聚體，其包含選自以下之第一及第二多肽：(i)具有SEQ ID NO:61中所述之胺基酸序列的第一多肽及具有SEQ ID NO:62中所述之胺基酸序列的第二多肽；(ii)具有SEQ ID NO:61中所述之胺基酸序列的第一多肽及具有SEQ ID NO:64中所述之胺基酸序列的第二多肽；(iii)具有SEQ ID NO:63中所述之胺基酸序列的第一多肽及具有SEQ ID NO:62中所述之胺基酸序列的第二多肽；及(iv)具有SEQ ID NO:63中所述之胺基酸序列的第一多肽及具有SEQ ID NO:64中所述之胺基酸序列的第二多肽。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含BCMA抗原結合部分，其包含：(i)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3，及/或(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含BCMA抗原結合部分，其包含：(i)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含BCMA抗原結合部分，其包括：(i)含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列之重鏈可變區及/或(ii)含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列之輕鏈可變區。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白包含抗原結合部分，其包含：(i) CD16A抗原結合部分，其包含：(a)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3，及(b)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3；及(ii) BCMA抗原結合部分，其包含：(a)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3，及(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，本發明係針對包含本文所述之多特異性抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。

在某些實施例中，本文所述之多特異性抗原結合蛋白係描述用作藥劑。

在某些實施例中，本發明係針對一種用於治療或改善疾病之方法，該方法包括將本文所述之多特異性抗原結合蛋白或如本文所述之醫藥組成物投與有需要之個體。在某些實施例中，該疾病係癌症。在某些實施例中，該疾病係血液癌症。在某些實施例中，該疾病係多發性骨髓瘤。

在某些實施例中，本發明係針對治療及/或預防個體之疾病的方法，該方法包括將本文所述之雙特異性抗原結合蛋白或如本文所述之醫藥組成物投與有需要之個體。在某些實施例中，該多特異性抗原結合蛋白係經靜脈內投與。在某些實施例中，該多特異性抗原結合蛋白係經皮下投與。在某些實施例中，本文所揭示之方法包含投與第二療法。在某些實施例中，該第二療法係選自由以下組成之群：包含抗PD-1抗體之療法、包含抗PD-L1抗體之療法、包含CD3雙特異性抗體之療法、包含抗TIGIT抗體之療法、包含抗VEGF抗體之療法及包含抗FcRH5抗體之療法。在某些實施例中，該第二療法係細胞介素療法。在某些實施例中，該細胞介素療法包含投與選自由以下組成之群的細胞介素：IL-15、IL-2、IL-12、IL-21及IL6。在某些實施例中，該細胞介素療法包含投與IL-2。在某些實施例中，該細胞介素療法包含投與IL-15。

在某些實施例中，如本文所述之治療之個體係癌症患者。在某些實施例中，該個體係血液癌症患者。在某些實施例中，該個體係多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，該個體係復發性/難治性多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，個體已接受抗CD38療法。在某些實施例中，個體已接受達雷木單抗。在某些實施例中，該個體係未用達雷木單抗治療、耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。在某些實施例中，該個體係耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。在某些實施例中，該個體表現CD16A多態性。在某些實施例中，CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。

在某些實施例中，本發明針對一種雙特異性抗原結合蛋白，其包含(a)至少一個BCMA結合部分，及(b)至少兩個CD16A抗原結合部分，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分與包含至少一個恆定結構域之Fab片段或Fc部分融合。在某些實施例中，該兩個CD16A抗原結合部分中之至少一個係選自由單鏈Fv (scFv)、單鏈雙功能抗體(scDb)及雙功能抗體Db組成之群的抗原結合分子。在某些實施例中，該至少兩個CD16A抗原結合部分各自係scFv。在某些實施例中，該至少兩個CD16A抗原結合部分係呈scDb形式。在某些實施例中，該至少兩個CD16A抗原結合部分各自包含依序連接於多肽鏈中之輕鏈可變區(V_L )及重鏈可變區(V_H )，且在該多肽鏈之N末端的可變區係該V_L 。在某些實施例中，該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H 、V_L -V_L -V_H -V_H 或V_L -V_H -V_L -V_H 之次序安置。

在某些實施例中，該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H 之次序安置。在某些實施例中，該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H -V_L -V_H 之次序安置。

在某些實施例中，本發明係針對一種雙特異性抗原結合蛋白，其中：(i)該多肽鏈之C末端與Fc部分CH2結構域之N末端融合；或(ii)該多肽鏈之C末端與Fc部分之鉸鏈的N末端融合；(iii)該多肽鏈之N末端與Fc部分CH3結構域之C末端融合；或(iv)該多肽鏈之N末端與Fab片段之C末端融合。在某些實施例中，該多肽鏈之N末端係與該Fc部分CH3結構域之C末端融合。在某些實施例中，Fc部分係選自由單體CH2-CH3片段、異二聚Fc區及同二聚Fc區組成之群。在某些實施例中，Fc部分不結合至Fcγ受體，但保持結合至新生兒Fc受體。在某些實施例中，Fc部分包含至少一個少效應子突變。在某些實施例中，該至少一個少效應子突變係選自由以下組成之群：C220S、C229S、E233P、L234A、L234V、L234F、L235A、L235E、P238S、D265A、N297A、N297Q及P331S。在某些實施例中，該至少一個少效應子突變係選自由以下組成之群：L234A、L234V、L234F、L235A、L235E、P238S及D265A。在某些實施例中，該至少一個少效應子突變係選自由以下組成之群：L234F、L235E及D265A。在某些實施例中，該Fc部分具有兩個少效應子突變。在某些實施例中，該兩個少效應子突變係L234F及L235E。在某些實施例中，該Fc部分具有三個少效應子突變。在某些實施例中，該三個少效應子突變係L234F、L235E及D265A。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白包含與Fc部分融合之至少兩個CD16A抗原結合部分。在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白包含兩個BCMA靶向部分。在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分。在某些實施例中，兩個CD16A抗原結合部分各自與IgG每條重鏈之C末端融合，且兩個BCMA靶向部分各自與IgG之N末端融合。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白包含具有圖13中所示之結構的雙特異性抗原結合蛋白。在某些此類實施例中，該等雙特異性抗原結合蛋白包含一個BCMA靶向部分。在某些此類實施例中，該BCMA靶向部分與該Fc部分之N末端融合，該至少兩個CD16A抗原結合部分與該Fc部分融合。

在某些此類實施例中，該雙特異性抗原結合蛋白具有圖5中所示之結構。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白包含一個CD16A抗原結合部分，其包含：(i)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:50中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:51或56中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列的CDR3，及/或(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:53中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:54中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:55中所述之胺基酸序列的CDR3。在某些實施例中，該重鏈可變區CDR2具有SEQ ID NO: 51中所陳述之胺基酸序列。在某些實施例中，該重鏈可變區CDR2具有SEQ ID NO: 56中所陳述之胺基酸序列。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白包含一個CD16A抗原結合部分，其包含：(i)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3，及/或(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3。在某些實施例中，該CD16A抗原結合部分包含(i)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該CD16A抗原結合部分包括(i)含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區，及/或(ii)含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白包含一個BCMA抗原結合部分，其包含：(i)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3，及/或(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的CDR3。在某些實施例中，該BCMA抗原結合部分包含(i)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列。在某些實施例中，該BCMA抗原結合部分包括(i)含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區，及/或(ii)含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分，其中：(a)該等CD16A抗原結合部分各自包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的V_L CDR3；且(b)該等BCMA靶向部分各自包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3、具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的V_L CDR3。在某些實施例中，(a)該等CD16A抗原結合部分各自包括含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區；且(b)該等BCMA靶向部分各自包括含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區及(ii)含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白係包含具有SEQ ID NO:61中所述之胺基酸序列之第一多肽及具有SEQ ID NO:62中所述之胺基酸序列之第二多肽的四聚體。在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白係包含具有SEQ ID NO:63中所述之胺基酸序列之第一多肽及具有SEQ ID NO:64中所述之胺基酸序列之第二多肽的四聚體。

在某些實施例中，本發明之雙特異性抗原結合蛋白包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA抗原結合部分，其中：(i)該等CD16A抗原結合部分各自包含：(a)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3，及(b)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3；及(ii) BCMA抗原結合部分各自包含：(a)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3，及(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，本發明係針對包含本文所述之雙特異性抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。在某些實施例中，該醫藥組成物係用作藥劑。

在某些實施例中，本發明係針對一種治療及/或預防疾病之方法，該方法包括投與如本文所述之雙特異性抗原結合蛋白或醫藥組成物。在某些實施例中，該疾病係癌症。在某些實施例中，該疾病係血液癌症。在某些實施例中，該疾病係多發性骨髓瘤。在某些實施例中，該雙特異性抗原結合蛋白係經靜脈內投與。在某些實施例中，該雙特異性抗原結合蛋白係經皮下投與。在某些實施例中，該雙特異性抗原結合蛋白係與第二療法一起投與。在某些實施例中，該第二療法係選自由以下組成之群：包含抗PD-1抗體之療法、包含抗PD-L1抗體之療法、包含CD3雙特異性抗體之療法、包含抗TIGIT抗體之療法、包含抗VEGF抗體之療法及包含抗FcRH5抗體之療法。在某些實施例中，該第二療法係細胞介素療法。在某些實施例中，該細胞介素療法係投與選自由以下組成之群的細胞介素：IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27及IL-6。在某些實施例中，該細胞介素係IL-15。在某些實施例中，該細胞介素係IL-2。在某些實施例中，該個體係癌症患者。在某些實施例中，該個體係血液癌症患者。在某些實施例中，該個體係多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，該個體係復發性/難治性多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，個體已接受抗CD38療法。在某些實施例中，個體已接受達雷木單抗。在某些實施例中，該個體係未用達雷木單抗治療、耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。在某些實施例中，該個體係耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。在某些實施例中，該個體表現CD16A多態性。在某些實施例中，CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。

在某些實施例中，本發明係針對如本文所述之多特異性抗原結合蛋白或如本文所述之雙特異性抗原結合蛋白，其中該多特異性抗原結合蛋白或雙特異性抗原結合蛋白當投與該個體時基本上不會耗盡或減少個體之自然殺手(NK)細胞群。

在某些實施例中，本發明係針對一種治療具有耗盡或減少之NK細胞群之個體的方法，其包括投與如本文所述之多特異性抗原結合蛋白或如本文所述之雙特異性抗原結合蛋白。在某些實施例中，該個體已預先用抗cd38療法治療。在某些實施例中，該抗cd38療法係達雷木單抗療法。

在某些實施例中，本發明係針對一種包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分之雙特異性抗原結合蛋白，其中該兩個CD16A抗原結合部分各自與IgG之每條重鏈的C末端融合，且該兩個BCMA靶向部分各自與該IgG之每條重鏈的N末端融合，且其中：(i)該等CD16A抗原結合部分各自包含：(a)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3，及(b)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3；及(ii) BCMA抗原結合部分各自包含：(a)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3，及(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的CDR3。

在某些實施例中，本發明係針對治療個體之癌症的方法，其包括：向該個體投與包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分之雙特異性抗原結合蛋白，其中該兩個CD16A抗原結合部分各自與IgG之每條重鏈的C末端融合，且該兩個BCMA靶向部分各自與該IgG之每條重鏈的N末端融合，且其中：(i)該等CD16A抗原結合部分各自包含：(a)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3，及(b)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3；及(ii) BCMA抗原結合部分各自包含：(a)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3，及(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的CDR3。在某些實施例中，該癌症係多發性骨髓瘤。

在某些實施例中，本發明係針對一種結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白，其包含：(i)第一重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3；(ii)第一輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3；(iii)第二重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的CDR2及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3；及(iv)第二輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的CDR1、具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的CDR2及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的CDR3。舉例而言，在某些實施例中，該結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白包括：(i)含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的第一重鏈可變區；(ii)含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的第一輕鏈可變區；(iii)含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的第二重鏈可變區；(iv)含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的第二輕鏈可變區；(v)含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的第一重鏈可變區及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的第一輕鏈可變區；(vi)含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的第二重鏈可變區及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的第二輕鏈可變區；或(vii)含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的第一重鏈可變區；及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的第一輕鏈可變區；以及含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的第二重鏈可變區及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的第二輕鏈可變區。在某些實施例中，如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白不結合至CD16B。在某些實施例中，如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白當投與個體時基本上不會耗盡或減少個體之自然殺手(NK)細胞群。在某些實施例中，如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白結合人CD16A。在某些實施例中，如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白結合人BCMA。

在某些實施例中，本發明係針對一種醫藥組成物，其包含如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。

在某些實施例中，如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白係用作藥劑。

在某些實施例中，本發明係針對一種治療及/或預防疾病之方法，其中該方法包括向有需要之個體投與如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白，或包含如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白的醫藥組成物。在某些實施例中，該疾病係癌症。在某些實施例中，該疾病係血液癌症。在某些實施例中，該疾病係多發性骨髓瘤。在某些實施例中，該抗體或抗原結合蛋白係經靜脈內投與。在某些實施例中，該抗體或抗原結合蛋白係經皮下投與。在某些實施例中，治療及/或預防疾病包含投與第二療法，其中該方法包括投與如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白，或包含如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白的醫藥組成物。在某些實施例中，該第二療法係選自由以下組成之群：包含抗PD-1抗體之療法、包含抗PD-L1抗體之療法、包含CD3雙特異性抗體之療法、包含抗TIGIT抗體之療法、包含抗VEGF抗體之療法及包含抗FcRH5抗體之療法。在某些實施例中，該第二療法係細胞介素療法。在某些實施例中，該細胞介素療法係投與選自由以下組成之群的細胞介素：IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27及IL-6。在某些實施例中，該細胞介素係IL-15。在某些實施例中，該細胞介素係IL-2。在某些實施例中，該個體係癌症患者。在某些實施例中，該個體係血液癌症患者。在某些實施例中，該個體係多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，該個體係復發性/難治性多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，個體已接受抗CD38療法。在某些實施例中，個體已接受達雷木單抗。在某些實施例中，該個體係未用達雷木單抗治療、耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。在某些實施例中，該個體係耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。在某些實施例中，該個體表現CD16A多態性。在某些實施例中，CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。

在某些實施例中，本發明係針對一種治療具有耗盡或減少之NK細胞群之個體的方法，該方法包括投與如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白，或包含如本文所述的結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白的醫藥組成物。在某些實施例中，該個體已預先用抗CD38療法治療。在某些實施例中，該抗CD38療法係達雷木單抗療法。

在某些實施例中，本發明係針對一種抗體或抗原結合蛋白，其包含結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂及結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂，其中：(i)該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包含：(a)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3，及(b)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3；且(ii)該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂包含：(a)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3，及(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的CDR3。在某些此類實施例中，該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂不同於該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂。在某些此類實施例中：(i)該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包括含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區；(ii)該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包括含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(iii)該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂包括含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區；(iv)該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂包括含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(v)該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包括含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區；(vi)該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂包括含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或(vii)該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包括含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區；且該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂包括含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。在某些此類實施例中，該抗體或抗原結合蛋白不結合至CD16B。在某些此類實施例中，該抗體或抗原結合蛋白當投與該個體時基本上不會耗盡或減少個體之自然殺手(NK)細胞群。在某些此類實施例中，該抗體或抗原結合蛋白結合人CD16A。在某些此類實施例中，該抗體或抗原結合蛋白結合人BCMA。

在某些實施例中，本發明係針對一種包含如本文所揭示之抗體或抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物，該抗體或抗原結合蛋白包含結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂及結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂。

在某些實施例中，本發明係針對一種用作藥劑之抗體或抗原結合蛋白，其包含結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂及結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂。

在某些實施例中，本發明係針對一種治療及/或預防疾病之方法，該方法包括：向有需要之個體投與如本文所述之抗體或抗原結合蛋白或包含此類抗體或抗原結合蛋白之醫藥組成物，該抗體或抗原結合蛋白包含結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂及結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂。在某些實施例中，該疾病係癌症。在某些實施例中，該疾病係血液癌症。在某些實施例中，該疾病係多發性骨髓瘤。在某些實施例中，該抗體或抗原結合蛋白係經靜脈內投與。在某些實施例中，該抗體或抗原結合蛋白係經皮下投與。在某些實施例中，該治療及/或預防疾病之方法包括投與第二療法，該方法包括：向有需要之個體投與如本文所述之抗體或抗原結合蛋白或包含此類抗體或抗原結合蛋白之醫藥組成物，該抗體或抗原結合蛋白包含結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂及結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂。在某些實施例中，該第二療法係選自由以下組成之群：包含抗PD-1抗體之療法、包含抗PD-L1抗體之療法、包含CD3雙特異性抗體之療法、包含抗TIGIT抗體之療法、包含抗VEGF抗體之療法及包含抗FcRH5抗體之療法。在某些實施例中，該第二療法係細胞介素療法。在某些實施例中，該細胞介素療法係投與選自由以下組成之群的細胞介素：IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27及IL-6。在某些實施例中，該細胞介素係IL-15。在某些實施例中，該細胞介素係IL-2。在某些實施例中，該個體係癌症患者。在某些實施例中，該個體係血液癌症患者。在某些實施例中，該個體係多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，該個體係復發性/難治性多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，個體已接受抗CD38療法。在某些實施例中，個體已接受達雷木單抗。在某些實施例中，該個體係未用達雷木單抗治療、耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。在某些實施例中，該個體係耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。在某些實施例中，該個體表現CD16A多態性。在某些實施例中，CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。在某些實施例中，該方法包括治療具有耗盡或減少之NK細胞群的個體。在某些實施例中，該個體已預先用抗CD38療法治療。在某些實施例中，該抗CD38療法係達雷木單抗療法。

在某些實施例中，本發明係針對一種結合至或能夠結合至BCMA之抗體或抗原結合蛋白，其包含：(i)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3，及(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的CDR3。在某些實施例中，BCMA係人BCMA。在某些實施例中，該抗體或抗原結合蛋白包含結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂。在某些實施例中，CD16A係人CD16A。在某些此類實施例中，該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包含：(i)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3，及(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3。在某些此類實施例中，該結合至或能夠結合至BCMA之抗體或抗原結合蛋白包含：(i)含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的第一重鏈可變區；(ii)含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的第一輕鏈可變區；(iii)含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的第二重鏈可變區；(iv)含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的第二輕鏈可變區；(v)含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的第一重鏈可變區及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的第一輕鏈可變區；(vi)含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的第二重鏈可變區及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的第二輕鏈可變區；或(vii)含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的第一重鏈可變區、含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的第一輕鏈可變區；以及含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的第二重鏈可變區及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的第二輕鏈可變區。

在某些實施例中，本發明係針對一種醫藥組成物，其包含如本文所揭示的結合至或能夠結合至BCMA之抗體或抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。

在某些實施例中，本發明係針對如本文所揭示的結合至或能夠結合至BCMA之抗體或抗原結合蛋白。其係用作藥劑。

在某些實施例中，本發明係針對治療及/或預防疾病之方法，該方法包括向有需要之個體投與結合至或能夠結合至BCMA之抗體或抗原結合蛋白或包含其之醫藥組成物。在某些實施例中，該疾病係癌症。在某些實施例中，該疾病係血液癌症。在某些實施例中，該疾病係多發性骨髓瘤。在某些實施例中，該抗體或抗原結合蛋白係經靜脈內投與。在某些實施例中，該抗體或抗原結合蛋白係經皮下投與。在某些實施例中，治療及/或預防疾病之方法包括投與第二療法，該等方法包括向有需要之個體投與結合至或能夠結合至BCMA之抗體或抗原結合蛋白或包含其之醫藥組成物。在某些實施例中，該第二療法係選自由以下組成之群：包含抗PD-1抗體之療法、包含抗PD-L1抗體之療法、包含CD3雙特異性抗體之療法、包含抗TIGIT抗體之療法、包含抗VEGF抗體之療法及包含抗FcRH5抗體之療法。在某些實施例中，該第二療法係細胞介素療法。在某些實施例中，該細胞介素療法係投與選自由以下組成之群的細胞介素：IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27及IL-6。在某些實施例中，該細胞介素係IL-15。在某些實施例中，該細胞介素係IL-2。在某些實施例中，該個體係癌症患者。在某些實施例中，該個體係血液癌症患者。在某些實施例中，該個體係多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，該個體係復發性/難治性多發性骨髓瘤患者。在某些實施例中，個體已接受抗CD38療法。在某些實施例中，個體已接受達雷木單抗。在某些實施例中，該個體係未用達雷木單抗治療、耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。在某些實施例中，該個體係耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。在某些實施例中，該個體表現CD16A多態性。在某些實施例中，CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。在某些實施例中，該抗體或抗原結合蛋白係投與具有耗盡或減少之NK細胞群的個體。在某些實施例中，該個體已預先用抗CD38療法治療。在某些實施例中，該抗CD38療法係達雷木單抗療法。實例實例 1 ： BCMA 抗原結合部分之構築

對於構築抗原結合部分，如例如Smith GP (Science, 1985, 228: 1315-7)及Clackson等人(Nature, 1991, 352: 624-8)中所述，藉由在絲狀融合噬菌體上表現及展示單鏈Fv結構域(scFv)並針對重組靶抗原或靶抗原陽性細胞淘選來富集編碼展現靶結合之scFv的噬菌體粒子，自人類抗體文庫中分離出選擇性結合至所選靶抗原之抗體片段。為了分離結合BCMA之抗體片段，可在後續數輪淘選中使用重組人BCMA(1-54)-Fc、食蟹獼猴BCMA(1-53)-Fc及穩定表現細胞表面錨定之人BCMA(1-54)或食蟹獼猴BCMA(1-53)與人CD3ζ之跨膜區及細胞質結構域之融合物的CHO細胞儀富集結合噬菌體粒子。為此，將噬菌體粒子與重組Fc-融合抗原溶液一起例如在室溫下培育2小時，隨後用蛋白質G塗佈之珠粒捕捉並在PBS-Tween及PBS中洗滌以移除未結合之噬菌體。用甘胺酸溶離經結合噬菌體。為了結合噬菌體富集於靶抗原表現細胞上，將噬菌體與穩定轉染之CHO細胞一起例如在室溫下培育1小時，隨後用細胞培養基洗滌並用甘胺酸溶離經結合噬菌體。為了減少編碼選擇性結合之Fc或未轉染之CHO細胞之抗體片段的噬菌體粒子之富集，將噬菌體池與不相關Fc-融合抗原或靶抗原陰性CHO細胞一起培育。在每輪淘選及經結合噬菌體溶離之後，使用經溶離之噬菌體粒子感染大腸桿菌(XL1 Blue)並繁殖噬菌體及編碼scFv之DNA。在重複噬菌體淘選及繁殖富集之噬菌體純系後，自大腸桿菌中分離出DNA並使用標準分子生物學技術將其再選殖至細菌表現載體，例如pSKK2中，隨後在大腸桿菌中產生His標記(SEQ ID NO:59)之scFv抗體片段並繁殖細菌周質提取物。對含有scFv抗體片段之周質提取物執行篩選方法，諸如ELISA或流動式細胞測量術，以評估靶抗原結合。舉例而言，重組人BCMA(1-54)-Fc或食蟹獼猴BCMA(1-53)-Fc經塗於標準ELISA微孔盤中之抗人Fc抗體結合，隨後將其與細菌周質提取物一起培育並充分洗滌。使用抗His-HRP結合物偵測scFv結合。為了評估scFv與細胞表現之BCMA之結合，將細菌周質提取物與重組CHO細胞表現且細胞表面錨定之人或食蟹獼猴BCMA一起培育，隨後洗滌並使用抗His-R-PE，藉由流動式細胞測量術偵測經結合scFv。自各別細菌純系中分離出編碼選擇性結合至人及/或食蟹獼猴BCMA抗原之scFv抗體片段的質體並藉由DNA測序進行分析，以獲得編碼scFv之DNA序列。舉例而言，已獲得具有如SEQ ID NO:39中所描繪之胺基酸序列的BCMA抗原結合部分，其中VH係以SEQ ID NO:37描繪且VL係以SEQ ID NO:38描繪。實例 2 ： 產生不同抗原結合蛋白骨架 2.1 scDb-mFc (圖1及圖2)：

scDb-mFc係指一種單體抗原結合蛋白，且其包含呈scDb形式之二價CD16A抗原結合部分與單體Fc部分之融合物。由兩個CD16A抗原結合部分組成之scDb與由變異體CH2-CH3多肽組成之Fc部分的N末端融合且由單一靶抗原結合部分組成之scFv與Fc部分之C末端融合(圖1)，或由兩個CD16A抗原結合部分組成之scDb與由變異體CH2-CH3多肽組成之Fc部分的C末端融合且由單一靶抗原結合部分組成之scFv與Fc部分之N末端融合(圖2)。

對於CHO細胞中scDb-mFc抗原結合蛋白之表現，將該分子之編碼序列選殖至哺乳動物表現載體系統中。簡言之，由Thermo Fisher Scientific/Invitrogen GeneArt (Regensburg, Germany)合成由編碼呈scFv形式之短肽連接子(SEQ ID NO:16-18)之基因序列連接的編碼呈scFv形式之抗腫瘤相關抗原(T umora ssociatedA ntigen，TAA) Fv結構域及抗CD16A Fv結構域(SEQ ID NO:1-13)的基因序列。用相應引子產生不同可變結構域及含有沉默點突變之單體Fc部分(SEQ ID NO:30)之PCR擴增子。之後，在一個等溫反應中將不同重疊DNA片段及線性化主鏈載體組合在一起。scDb-mFc表現構築體係設計成含有N末端信號肽之編碼序列以便利抗體分泌且含有Fc部分之編碼序列以促進抗體分泌及純化。所有構築體之序列均在GATC (Köln, Germany)，使用訂製引子，由DNA測序確定。選殖scDb-mFc之表現卡匣以使得抗CD16A結構域定位於單體Fc部分之N末端或C末端且經由連接體序列(SEQ ID NO:19-22)按以下可能次序連接： 1.) VL(CD16A)-L1-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L1-VH(CD16A) 2.) VH(CD16A)-L1-VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)-L1-VL(CD16A) 3.) VL(CD16A)-L4-VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)-L4-VH(CD16A) 4.) VH(CD16A)-L4-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L4-VL(CD16A)

在對以下具有特異性之抗原結合蛋白scDb-mFc_01、scDb-mFc_02、scDb-mFc_05及scDb-mFc_06之結構中，SEQ ID N O:16係用於連接子L1，SEQ ID NO:17係用於連接子L2且SEQ ID NO:18係用於連接子L3。在抗原結合蛋白scDb-mFc_03、scDb-mFc_04、scDb-mFc_07及scDb-mFc_08之結構中，SEQ ID NO:60係用於連接子L4，SEQ ID NO:17係用於連接子L2且SEQ ID NO:18係用於連接子L3。 2.2 KiH-scDb-Fc (圖3-6)：

KiH-scDb-Fc抗原結合蛋白係一種異二聚體且包含呈scDb形式之二價CD16A抗原結合部分與異二聚(KiH) Fc部分之融合物。單一靶抗原結合部分係由scFv提供。

編碼KiH-scDb-Fc之DNA表現構築體係藉由將抗CD16A Fv結構域(SEQ ID NO: 1-13)之編碼序列選殖至含CMV控制之表現卡匣的經修飾之哺乳動物表現載體中以由該載體共表現兩個基因卡匣來產生，該等表現卡匣包括帶有Fc沉默及「孔中節」點突變之IgG1恆定結構域CH2及CH3 (SEQ ID NO:31、32)。「孔中節」突變允許產生異二聚三價雙特異性(圖3-5)或四價三特異性(圖6)Fc融合構築體。之後，用相應引子，由編碼抗腫瘤相關抗原(TAA)Fv結構域之基因序列產生PCR擴增子。將所得重疊DNA片段插入共表現載體中之相關位置處。所有所需的編碼可變結構域及含Fc沉默及「孔中節」點突變之恆定結構域的基因序列係由Thermo Fisher Scientific/Invitrogen GeneArt (Regensburg, Germany)合成。KiH-scDb-Fc表現構築體係設計成分別含有N末端信號肽、C標籤及/或His標籤(6×His)之編碼序列以便利抗體分泌及純化。所有構築體之序列均在GATC (Köln, Germany)，使用訂製引子，由DNA測序確定。選殖KiH-scDb-Fc構築體之表現卡匣以使得CD16A抗原結合部分位於異二聚Fc部分之N末端且經由連接體(SEQ ID NO:19-22)及鉸鏈(SEQ ID NO:23)或中間鉸鏈(SEQ ID NO:24)連接，或位於異二聚Fc部分之C末端且經由連接體(SEQ ID NO:19-22)連接，僅遵循以下可能次序： 1.) VL(CD16A)-L1-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L1-VH(CD16A) 2.) VH(CD16A)-L1-VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)-L1-VL(CD16A) 3.) VL(CD16A)-L4-VL(CD16A)-L3-VH(CD16A)-L4-VH(CD16A) 4.) VH(CD16A)-L4-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L4-VL(CD16A)

SEQ ID NO:16係用於連接子L1，SEQ ID NO:17係用於連接子L2，SEQ ID NO:18係用於連接子L3且SEQ ID NO:60係用於連接子L4。

此類抗原結合蛋白之實例係KiH-scDb-Fc_08及KiH-scDb-Fc_12，自N末端至C末端，其包含以下構築體：第一多肽鏈V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-中間鉸鏈-CH2-CH3及第二多肽鏈鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶)-V_L (靶) (圖3)；第一多肽鏈中間鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)及第二多肽鏈V_H (靶)-V_L (靶)-鉸鏈-CH2-CH3 (圖5)。 2.3 scDb-TriBs或scDb-TriBs-scFv

scDb-TriB係三特異性抗原結合蛋白，其係包含CD16A抗原結合部分、靶抗原結合部分及HSA抗原結合部分之異二聚Fab片段，其中該等抗原結合部分係由兩個scDb與Fab片段之C末端融合(圖7)或包含兩個CD16A抗原結合蛋白之scDb及包含靶抗原結合部分之scFv與Fab片段之C末端融合(圖8)提供。

藉由將抗HSA Fv結構域之編碼序列(SEQ ID NO:14、15)選殖至含有CMV控制之表現卡匣的經修飾哺乳動物表現載體中以由該載體共表現兩個基因卡匣產生編碼scDb-TriBs(-scFv)之DNA表現構築體，該等表現卡匣僅包括Fab部分重鏈及輕鏈恆定結構域(SEQ ID NO:33-35)及融合物。之後，利用相應引子，由編碼抗腫瘤相關抗原(TAA)Fv結構域及抗CD16A Fv結構域(SEQ ID NO:1-13)之基因序列產生PCR擴增子。將所得重疊DNA片段插入共表現載體中之相關位置處。由Thermo Fisher Scientific/Invitrogen GeneArt (Regensburg, Germany)合成所有所需的編碼可變結構域及Fab部分僅恆定結構域之基因序列。scDb-TriBs(-scFv)表現構築體係設計成分別含有N末端信號肽、C標籤及/或His標籤(6×His)之編碼序列以便利抗體分泌及純化。所有構築體之序列均在GATC (Köln, Germany)，使用訂製引子，由DNA測序確定。選殖scDb-TriBs(-scFv)構築體之表現卡匣以使得抗CD16A定位於Fab之CL或CH1的C末端且經由連接體(SEQ ID NO:19-22)按以下可能次序連接至Fab之重鏈或輕鏈： 1.) VL(CD16A)-L1-VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)-L1-VH(CD16A) 2.) VL(CD16A)-L1-VL(CD16A)-L2-VH(CD16A)-L1-VH(CD16A)

此類抗原結合蛋白之實例係scDb-TriB-scFv_01，自N末端至C末端，其包含以下結構：第一多肽鏈V_H (HSA)-CH1-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)及第二多肽鏈V_L (HSA)-CL-V_H (靶)-V_L (靶) (圖8)。SEQ ID NO:16用於連接子L1且SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:18用於連接子L2。 2.4 Db-Fc (圖9-10)：

Db-Fc係同二聚化抗原結合蛋白且包含呈Db形式之二價CD16A抗原結合部分在同二聚化Fc部分(CH2-CH3)之N末端與鉸鏈融合且呈scFv形式之兩個靶抗原結合部分與Fc部分之另一末端融合。對於CHO細胞中Db-Fc抗原結合蛋白之表現，將該分子之編碼序列選殖至哺乳動物表現載體系統中。簡言之，由Thermo Fisher Scientific/Invitrogen GeneArt (Regensburg, Germany)合成編碼由短肽連接子(SEQ ID NO:16)連接之抗腫瘤相關抗原(TAA) Fv結構域及抗CD16A Fv結構域(SEQ ID NO:1-13)的基因序列。用相應引子產生不同可變結構域及含有沉默點突變之Fc部分(SEQ ID NO:29)之PCR擴增子。之後，在一個等溫反應中將不同重疊DNA片段及線性化主鏈載體組合在一起。Db-Fc表現載體係設計成含有N末端信號肽之序列以促進抗體分泌。所有構築體之序列均在GATC (Köln, Germany)，使用訂製引子，由DNA測序確定。選殖Db-Fc之表現卡匣以使得抗CD16A結構域定位於同二聚化Fc部分(CH2-CH3)之N末端或C末端且經由連接體(SEQ ID NO: 19-22)連接至中間鉸鏈(SEQ ID NO:24)或經由連接體(SEQ ID NO: 19-22)連接至CH3之C末端，僅遵循以下可能的次序： 1.) VL(CD16A)-L1-VH(CD16A) 2.) VH(CD16A)-L1-VL(CD16A)

此類抗原結合蛋白之實例係Db-Fc_02及Db-Fc_04，自N末端至C末端，其包含：V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-中間鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶)-V_L (靶) (圖9)；或V_H (靶)-V_L (靶)-中間鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)(圖10)。SEQ ID NO:16係用於連接子L1。 2.5 Bi-scFv-Fc (圖11-12)：

Bi-scFv-Fc係同二聚化四價抗原結合蛋白，其包含分別呈scFv形式之兩個CD16A抗原結合部分及兩個靶抗原結合部分與Fc同二聚體之融合物。

對於CHO細胞中Bi-scFv-Fc抗原結合蛋白之表現，將該分子之編碼序列選殖至哺乳動物表現載體系統中。簡言之，由Thermo Fisher Scientific GeneArt (Regensburg, Germany)合成編碼由短肽連接子(SEQ ID NO:17-18)連接之抗腫瘤相關抗原(TAA) Fv結構域及抗CD16A Fv結構域(SEQ ID NO:1-13)的基因序列。用相應引子產生不同可變結構域以及含有沉默點突變之Fc部分(SEQ ID NO:29)或野生型Fc部分(SEQ ID NO:36)之PCR擴增子。之後，在一個等溫反應中將不同重疊DNA片段及線性化主鏈載體組合在一起。Bi-scFv-Fc表現構築體係設計成分別含有N末端信號肽及Fc部分之編碼序列以便利抗體分泌及純化。所有構築體之序列均在GATC (Köln, Germany)，使用訂製引子，由DNA測序確定。選殖Bi-scFv-Fc之表現卡匣以使得抗CD16A結構域定位於Fc部分之N末端且經由連接體(SEQ ID NO: 19-22)或鉸鏈(SEQ ID NO:23)連接，或定位於Fc部分之C末端且經由連接體(SEQ ID NO: 19-22)連接至CH3，僅遵循以下可能的次序： 1.) VL(CD16A)-L3-VH(CD16A) 2.) VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)

此類抗原結合蛋白之實例係Bi-scFv-Fc_27及Bi-scFv-Fc_26，自N末端至C末端，其包含以下構築體：V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶)-V_L (靶) (圖11)；或V_H (靶)-V_L (靶)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)(圖12)。SEQ ID NO:17用於連接子L2且SEQ ID NO:18用於連接子L3。 2.6 scFv-IgAb (圖13)：

scFv-IgAb抗原結合蛋白包含IgG抗體及呈scFv形式之兩個CD16A抗原結合部分，其中該等scFv CD16A抗原結合部分各自與一個H鏈之C末端融合且兩個靶抗原結合部分係由IgG Fab臂中之每一Fv提供。

編碼scFv-IgAb之DNA表現構築體係藉由將抗TAA Fv結構域之編碼序列選殖至含CMV控制之表現卡匣的經修飾之哺乳動物表現載體中以由該載體共表現兩個基因卡匣來產生，該等表現卡匣包括帶有Fc沉默點突變(SEQ ID NO:25、27-28)或野生型Fc部分(SEQ ID NO:26-28)之重鏈及輕鏈恆定結構域。之後，用相應引子，由編碼經短肽連接子(SEQ ID NO:17-18)隔開之抗CD16A Fv結構域(SEQ ID NO:1-13)的基因序列產生PCR擴增子。將所得重疊DNA片段插入共表現載體中之相關位置處。所有所需的編碼可變結構域及含Fc沉默點突變之恆定結構域的基因序列係由Thermo Fisher Scientific/Invitrogen GeneArt (Regensburg, Germany)合成。scFv-IgAb表現構築體係設計成分別含有N末端信號肽及Fc部分之編碼序列以便利抗體分泌及純化。所有構築體之序列均在GATC (Köln, Germany)，使用訂製引子，由DNA測序確定。選殖scFv-IgAb之表現卡匣以使得抗CD16A結構域定位於Fc部分之C末端且經由連接體序列(SEQ ID NO:19-22)按以下可能次序連接： 1.) VL(CD16A)-L3-VH(CD16A) 2.) VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)

此類抗原結合蛋白之實例係scFv-IgAb_30，自N末端至C末端，其包含以下結構：第一多肽鏈V_H (靶)-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)及第二多肽鏈V_L (靶)-CL (圖13)。SEQ ID NO:17用於連接子L2且SEQ ID NO:18用於連接子L3。 2.7 Bi-scFv-IgAb (圖14)：

Bi-scFv-IgAb抗原結合蛋白包含IgG抗體及與其融合之四個scFv抗原結合部分，其中呈scFv形式的兩個CD16A抗原結合部分各自與兩條H鏈之一的C末端融合且兩個靶抗原結合部分各自與兩個CL區之一的C末端融合。

編碼Bi-scFv-IgAb之DNA表現構築體係藉由將抗TAA Fv結構域之編碼序列選殖至含CMV控制之表現卡匣的經修飾之哺乳動物表現載體中以由該載體共表現兩個基因卡匣來產生，該等表現卡匣包括帶有Fc沉默點突變(SEQ ID NO:25、27-28)之重鏈及輕鏈恆定結構域。之後，用相應引子，由編碼經短肽連接子隔開之抗CD16A或靶抗原結合Fv結構域(SEQ ID NO:1-13)的基因序列產生PCR擴增子。將所得重疊DNA片段插入共表現載體中之相關位置處。所有所需的編碼可變結構域及含Fc沉默點突變之恆定結構域的基因序列係由Thermo Fisher Scientific/Invitrogen GeneArt (Regensburg, Germany)合成。Bi-scFv-IgAb表現構築體係設計成分別含有N末端信號肽及Fc部分之編碼序列以便利抗體分泌及純化。所有構築體之序列均在GATC (Köln, Germany)，使用訂製引子，由DNA測序確定。選殖Bi-scFv-IgAb之表現卡匣以使得抗CD16A結構域定位於Fc部分之C末端且經由連接體序列(SEQ ID NO:19-22)按以下可能次序連接： 1.) VL(CD16A)-L3-VH(CD16A) 2.) VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)

此類抗原結合蛋白之實例係Bi-scFv-IgAb_03，自N末端至C末端，其包含以下結構：第一多肽鏈V_H (靶1)-CH1-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)及第二多肽鏈V_L (靶1)-CL-V_L (靶2)-V_H (靶2) (圖14)。SEQ ID NO:17用於連接子L2且SEQ ID NO:18用於連接子L3。 2.8 KiH-scFv-Fc (圖15a及15b)：

KiH-scFv-Fc抗原結合蛋白包含四個scFv抗原結合部分與異二聚(KiH) Fc部分之融合物，其中兩個CD16A抗原結合部分在N末端或C末端與Fc部分融合。

編碼KiH-scFv-Fc之DNA表現構築體係藉由將抗CD16A Fv結構域(SEQ ID NO: 1-13)之編碼序列選殖至含CMV控制之表現卡匣的經修飾之哺乳動物表現載體中以由該載體共表現兩個基因卡匣來產生，該等表現卡匣包括帶有Fc沉默及「孔中節」點突變(SEQ ID NO:31-32)之IgG1恆定結構域CH2及CH3。「孔中節」突變允許產生雙特異性Fc融合構築體。之後，用相應引子，由編碼抗腫瘤相關抗原(TAA)Fv結構域之基因序列產生PCR擴增子。將所得重疊DNA片段插入共表現載體中之相關位置處。所有所需的編碼可變結構域及含Fc沉默及「孔中節」點突變之恆定結構域的基因序列係由Thermo Fisher Scientific/Invitrogen GeneArt (Regensburg, Germany)合成。KiH-scFv-Fc表現構築體係設計成分別含有N末端信號肽、Fc部分、C標籤及His標籤(6×His)之編碼序列以便利抗體分泌及純化。所有構築體之序列均在GATC (Köln, Germany)，使用訂製引子，由DNA測序確定。選殖KiH-scFv-Fc構築體之表現卡匣以使得抗CD16A結構域定位於異二聚Fc部分之N末端且經由連接體(SEQ ID NO: 19-22)及鉸鏈(SEQ ID NO:23)連接，或定位於Fc部分之C末端且經由連接體(SEQ ID NO: 19-22)連接，僅遵循以下可能的次序： 1.) VL(CD16A)-L3-VH(CD16A) 2) VH(CD16A)-L2-VL(CD16A)

此類抗原結合蛋白之實例係KiH-scFv-Fc_09及KiH-scFv-Fc_11，自N末端至C末端，其包含以下構築體：第一多肽鏈V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶1)-V_L (靶1)及第二多肽鏈V_L (CD16A)-V_H (CD16A)-鉸鏈-CH2-CH3-V_H (靶2)-V_L (靶2) (圖15a)；或第一多肽鏈V_H (靶1)-V_L (靶1)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A)及第二多肽鏈V_H (靶2)-V_L (靶2)-鉸鏈-CH2-CH3-V_L (CD16A)-V_H (CD16A) (圖15b)。SEQ ID NO:17用於連接子L2且SEQ ID NO:18用於連接子L3。實例 3 ： 使用穩定 CHO 細胞池產生 NK 細胞接合物抗體形式 宿主細胞培養

在補充有L-麩醯胺酸、10% FCS及100 µg/ml Zeocin之漢氏F-12營養混合物(Ham's F-12 Nutrient Mix)中培養Flp-In CHO細胞(Life Technologies)，其係CHO-K1中國倉鼠卵巢細胞(ATCC，CCL-61)之衍生物(Kao及Puck, 1968)。用0.25%胰蛋白酶-EDTA使黏附細胞脫離並根據Life Technologies提供之標準細胞培養方案傳代培養。

對於適於懸浮生長，使細胞自組織培養燒瓶脫離並將其放入無血清HyClone CDM4 CHO培養基中，隨後在37℃、5% CO₂ 及120 rpm下於搖瓶中培育。用於培養適於懸浮生長之Flp-In CHO宿主細胞的標準培養基係補充有L-麩醯胺酸、HT補充物、青黴素/鏈黴素及100 µg/ml Zeocin之HyClone CDM4 CHO。適於懸浮生長之細胞在含10% DMSO之培養基中低溫保藏並使用MycoAlert支原體偵測套組(Lonza)測試對支原體呈陰性。產生穩定轉染之細胞池

藉由轉染適於懸浮生長之宿主細胞產生穩定地表現分泌之重組抗體、Fc融合構築體或比較抗體的重組Flp-In CHO細胞株。為此，在使用聚乙烯亞胺(PEI)，用編碼所關注蛋白質(pcDNA5-FRT)及Flp重組酶(pOG44，Life Technologies)之表現質體(2.5 µg)共轉染前一天，將細胞放入不含Zeocin之標準培養基中。簡言之，將載體DNA及轉染試劑以1:3 (µg/µg)之DNA:PEI比率混合於總計100 µL OptiMEM I培養基中並培育10分鐘，隨後將其添加至懸浮於1 ml CHO-S-SFMII培養基(Life Technologies)中之2E+6 Flp-In CHO細胞中。在培育24-48小時後，藉由添加6-7 µg/mL二鹽酸嘌呤黴素，隨後在CHO-S-SFMII培養基中將培養物稀釋至0.2E+6個活細胞/毫升之密度，開始對穩定轉染之細胞的選擇。Flp重組酶經由位點特異性DNA重組介導基因組中整合FRT位點處Flp-In表現構築體之插入(O’ Gorman等人, 1991)。選擇期間，一週兩次量測活細胞密度，且對細胞離心並使其以0.2E+6個活細胞/毫升之最大密度再懸浮於新鮮選擇培養基中。在選擇2-3週(此時，細胞已轉移至搖瓶中之標準培養基中)後，回收穩定表現重組蛋白質產物之細胞池。藉由使用Criterion Stain-Free (Bio-Rad)技術(參見下文)對細胞培養物上清液進行蛋白質凝膠電泳，確定重組分泌之蛋白質的表現。在含7.5% DMSO中之培養基中低溫保藏穩定細胞池。在分批饋料 CHO 細胞懸浮培養中產生重組蛋白質

在穩定轉染之CHO細胞之10天或11天分批饋料培養物中，藉由分泌至細胞培養物上清液中產生重組蛋白質。為此，將穩定表現重組抗體、Fc融合抗原或比較抗體之細胞以6E+5個細胞/毫升之起始密度接種於帶有透氣蓋之聚碳酸酯Erlenmeyer燒瓶(Corning)中之標準培養基中並在140 rpm攪動下，在37℃及5% CO₂ 下培育。在分批饋料培養期間，在第0天(起始日)，培養基補充有40 mL/L ActiCHO饋料A (GE Healthcare)及4 mL/L ActiCHO饋料B(GE Healthcare)，且在第3天、第5天及第7天補充雙倍量。在10或11天後，在典型地＞75%之培養物活力下收集細胞培養物上清液。在饋料之前，每隔一天自製造培養基收集樣品，並評估細胞密度及活力。收集當天，藉由離心及真空過濾(0.22 µm)，使用Millipore Express PLUS膜過濾器(Millipore)使細胞培養物上清液變澄清待用。表現滴定度定量 ：

在製造培養物之第5天、第7天及第10天或第11天，藉由SDS-PAGE分析細胞培養物上清液(CSS)中之蛋白質表現滴定度及產物完整性。將樣品與SDS PAGE樣品緩衝液混合，隨後將其裝載至4-20% Criterion TGX Precast SDS PAGE凝膠(Biorad)上。使用Criterion Stain-free分子成像系統(Biorad)觀測凝膠中之總蛋白質。藉由與已知濃度之參考抗體相比較，半定量地測定產物滴定度。抗原結合蛋白之純化 1. 包含 Fc 部分之抗原結合蛋白 ( 如實例 2 中所描述之 scDb-mFc 、 Db-Fc 、 Bi-scFv-Fc 、 Bi-scFv-IgAb 、 scFv-Fc 、 scFv-IgAb)

遵循包含蛋白質A及製備型SEC之兩步驟程序，由澄清之CHO細胞培養物上清液純化出靶蛋白。對於蛋白質A，將澄清之上清液裝載於HiTrap MabSelectSuRe管柱(GE-Healthcare)上。在用磷酸鹽緩衝生理食鹽水pH 7.4及10 mM磷酸鈉pH 7.0洗滌之後，用50 mM乙酸鈉pH 3.5及10 mM甘胺酸/HCl pH 2.0，以兩步梯度溶離蛋白質。使用SE-HPLC及SDS-PAGE分析各溶離份之純度。彙集展現可接受之純度的溶離份並使用Superdex 200製備級管柱(GE-Healthcare)進行製備型凝膠過濾。彙集含有純化之靶分子的溶離液部分並使用Sephadex G-25管柱，用10 mM乙酸鈉、4.5%山梨糖醇pH 5.0進行緩衝液交換，並藉由超濾將其濃縮至約1 mg/ml濃度。該等構築體之典型濃度(由SE-HPLC量測)在87.6%至99.8%範圍內且均質性(在非還原性SDS-PAGE中)介於58.4%與100%之間。2. 含有 κ 輕鏈及 His 標籤的根據實例 2 之抗原結合蛋白 KiH-scDb-Fc 及 scDb- 三功能抗體 -scFv

遵循包含蛋白質L、IMAC及製備型SEC之三步驟程序，由澄清之CHO細胞培養物上清液純化出靶蛋白。對於蛋白質L，將澄清之上清液裝載於HiTrap蛋白質L管柱(GE-Healthcare)上。在用磷酸鹽緩衝生理食鹽水pH 7.4及10 mM磷酸鈉pH 7.0洗滌之後，用10 mM甘胺酸/HCl pH 3.0及10 mM甘胺酸/HCl pH 2.0，以兩步梯度溶離蛋白質。使用SE-HPLC及SDS-PAGE分析各溶離份之純度。彙集展現可接受之純度的溶離份並進行進一步IMAC純化。因此，用平衡緩衝液(50mM Tris/HCl、150mM氯化鈉pH7.5)稀釋(1:4)樣品並將其裝載至HisTrap FF管柱(GE Healthcare)上。用平衡緩衝液(50mM Tris/HCl、150mM氯化鈉pH7.5)洗滌之後，用7% / 30% / 100%溶離緩衝液(50 mM Tris/HCl、0.4 M精胺酸、500 mM咪唑pH7.5)以三步驟梯度溶離蛋白質。使用SE-HPLC及SDS-PAGE分析各溶離份之純度。彙集展現可接受之純度的溶離份並使用Superdex 200製備級管柱(GE-Healthcare)進行製備型凝膠過濾。彙集含有純化之靶分子的溶離液部分並使用Sephadex G-25管柱，用10 mM乙酸鈉、4.5%山梨糖醇pH 5.0進行緩衝液交換，並藉由超濾將其濃縮至約1 mg/ml濃度。該等構築體之典型濃度(由SE-HPLC量測)在95.9%至99.8%範圍內且均質性(在非還原性SDS-PAGE中)介於72.2%與99.0%之間。3) 在第一多肽上含有 C- 標籤且在第二多肽上含有 His 標籤之抗原結合蛋白分子 KiH-scFv-Fc 及 KiH-scDb-Fc

遵循包含C-標籤親和層析法、IMAC及製備型SEC之三步驟程序，由澄清之CHO細胞培養物上清液純化出靶蛋白。對於C-標籤親和層析法，將澄清之上清液裝載於CaptureSelect C標籤XL管柱(Thermo Scientific)上。在用磷酸鹽緩衝之生理食鹽水pH 7.4洗滌之後，用20 mM檸檬酸鈉pH 3.0溶離蛋白質。使用SE-HPLC及SDS-PAGE分析各溶離份之純度。彙集展現可接受之純度的溶離份並進行進一步IMAC純化。因此，用平衡緩衝液(50mM Tris/HCl、150mM氯化鈉pH7.5)稀釋(1:4)樣品並將其裝載至HisTrap FF管柱(GE Healthcare)上。用平衡緩衝液(50mM Tris/HCl、150mM氯化鈉pH7.5)洗滌之後，用7% / 30% / 100%溶離緩衝液(50 mM Tris/HCl、0.4 M精胺酸、500 mM咪唑pH7.5)以三步驟梯度溶離蛋白質。使用SE-HPLC及SDS-PAGE分析各溶離份之純度。彙集展現可接受之純度的溶離份並使用Superdex 200製備級管柱(GE-Healthcare)進行製備型凝膠過濾。彙集含有純化之靶分子的溶離液部分並使用Sephadex G-25管柱，用10 mM乙酸鈉、4.5%山梨糖醇pH 5.0進行緩衝液交換，並藉由超濾將其濃縮至約1 mg/ml濃度。該等構築體之典型濃度(由SE-HPLC量測)在94.8%至99.0%範圍內且均質性(在非還原性SDS-PAGE中)介於86.8%與100%之間。4) scDb-三功能抗體

遵循包含IMAC及製備型SEC之兩步驟程序，由澄清之CHO細胞培養物上清液純化出蛋白質。對於IMAC，將澄清之上清液及5mM咪唑pH 7.0裝載於HisTrap FF管柱(GE Healthcare)上。用平衡緩衝液(50mM Tris/HCl、150mM氯化鈉pH7.5)洗滌之後，用7% / 30% / 100%溶離緩衝液(50 mM Tris/HCl、0.4 M精胺酸、500 mM咪唑pH7.5)以三步驟梯度溶離蛋白質。使用SE-HPLC及SDS-PAGE分析各溶離份之純度。彙集展現可接受之純度的溶離份並使用Superdex 200製備級管柱(GE-Healthcare)進行製備型凝膠過濾。彙集含有純化之靶分子的溶離液部分並使用Sephadex G-25管柱，用10 mM乙酸鈉、4.5%山梨糖醇pH 5.0進行緩衝液交換，並藉由超濾將其濃縮至約1 mg/ml濃度。該等構築體之典型濃度(由SE-HPLC量測)在95.1%至100%範圍內且均質性(在非還原性SDS-PAGE中)高於85.8%。a) scDb- 三功能抗體 _09-10

遵循包含Fab/λ親和層析法及製備型SEC之兩步驟程序，由澄清之CHO細胞培養物上清液純化出蛋白質。對於Fab/λ親和層析法，將澄清之上清液裝載於Fab Select Lambda管柱(GE Healthcare)上。在用磷酸鹽緩衝之生理食鹽水pH 7.4洗滌之後，用100 mM乙酸鈉pH 3.5溶離蛋白質。使用SE-HPLC及SDS-PAGE分析各溶離份之純度。彙集展現可接受之純度的溶離份並使用Superdex 200製備級管柱(GE-Healthcare)進行製備型凝膠過濾。彙集含有純化之靶分子的溶離液部分並使用Sephadex G-25管柱，用10 mM乙酸鈉、4.5%山梨糖醇pH 5.0進行緩衝液交換，並藉由超濾將其濃縮至約1 mg/ml濃度。該等構築體之典型純度(由SE-HPLC量測)高於94.8%且均質性(在非還原性SDS-PAGE中)高於92.7%。蛋白質分析法

最終樣品之均質性係藉由SDS-PAGE，在還原及非還原性條件下評估。將樣品與非還原性2× SDS PAGE樣品緩衝液或含有二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑之還原性2× SDS-Page樣品緩衝液混合。在95℃下，將所有樣品加熱5分鐘，隨後將其裝載於4-20% Criterion TGX Precast SDS Page凝膠上。裝載2 µg純化蛋白質。為了在凝膠中分離蛋白質，在300 V下，以1× Tris/甘胺酸/SDS緩衝液中執行SDS-PAGE約22分鐘。使用Criterion Stain-free分子成像系統(Biorad)觀測凝膠中之總蛋白質。使用Page Ruler未染色蛋白質梯作為分子量標記物。將非還原性SDS-PAGE中產物譜帶之相對信號強度與可能的高分子量或低分子量物種相比較。

藉由分析型SE-HPLC，使用Superdex 200 Increase 10/300GL管柱(GE-Healthcare)評價蛋白質製劑之純度。

純化蛋白質以等分試樣在-80℃下儲存待用。實例 4 ：在 ELISA 中在 37℃ 下 CD16A 抗原結合蛋白與原代人 NK 細胞或與重組人 CD16A 可溶性抗原之結合 方法 自白血球層分離 PBMC 及富集人 NK 細胞

藉由密度梯度離心自白血球層(German Red Cross, Mannheim, Germany)分離出PBMC。用二至三倍體積之PBS (Invitrogen，目錄號：14190-169)稀釋白血球層樣品，使其在Lymphoprep墊(Stem Cell Technologies，目錄號：07861)上分層並在室溫下在無制動下以800 × g離心25分鐘。收集位於界面中之PBMC並用PBS洗滌3次，隨後在補充有10% FCS之完全RPMI 1640培養基中在無刺激下培養過夜。對於富集NK細胞，自過夜培養物收集PBMC並根據製造商之說明書，使用供免疫磁性分離未接觸之人NK細胞之EasySep™人NK細胞富集套組(Stem Cell Technologies，目錄號：19955)及Big Easy EasySep™磁鐵(Stem Cell Technologies，目錄號：18001)進行一輪陰性選擇。細胞結合檢定及流動式細胞測量分析

在37℃下，將富集之人NK細胞的等分試樣與100 µL指定CD16A AAF構築體於含2%熱滅活FCS (Invitrogen，目錄號：10270-106)、0.1%疊氮化鈉(Roth, Karlsruhe, Germany，目錄號：A1430.0100)之FACS緩衝液(PBS, Invitrogen，目錄號：14190-169)中的連續稀釋液一起培育45分鐘。用FACS緩衝液反復洗滌之後，用15 µg/mL FITC結合之山羊抗人IgG (Dianova，目錄號：109-095-098)偵測細胞結合之抗體。最後一個染色步驟後，再次洗滌細胞並使其再懸浮於0.2 mL含有2 µg/mL碘化丙錠 (PI) (Sigma，目錄號：P4170)的FACS緩衝液中以便排除死細胞。使用Millipore Guava EasyCyte流動式細胞測量儀(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)量測2-5 × 10³ 個活細胞之螢光度。使用Incyte軟體(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)計算細胞樣品之平均螢光強度。在減去用單獨二次試劑及三次試劑染色的細胞之螢光強度值後，使用該等值，使用GraphPad Prism軟體(用於Windows之GraphPad Prism 6.00版, GraphPad Software, La Jolla California USA)進行非線性回歸分析。為計算K_D ，使用單位點結合(雙曲線)方程。在 ELISA 中分析 CD16A 可溶性抗原結合

在4℃下，用含重組NK細胞接合物抗體形式或對照抗體之100 mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液塗佈96孔ELISA盤(Immuno MaxiSorp; Nunc)過夜。取決於分子量，塗佈對應於約20 nM之莫耳濃度的2.0 – 5.0 µg/mL濃度之抗體。在用溶解於PBS中之3% (w/v)脫脂乳粉(Merck)進行之阻斷步驟後，在室溫下，在該等盤上培育生物素化重組人CD16A(48R-158V)與人IgG1 Fc部分之融合物於含0.3% (w/v)脫脂乳粉之PBS中的連續稀釋液1.5小時。在用每孔300 µL含0.1% (v/v) Tween 20之PBS洗滌三次之後，將盤與以1:10000稀釋之偵測結合物抗生蛋白鏈菌素-HRP (Roche)一起在室溫下培育1小時。在用每孔300 µL含0.1% (v/v) Tween 20之PBS洗滌三次之後，將盤與四甲基聯苯胺(TMB)受質(Seramun)一起培育，直至清晰可見顏色顯現。經由添加每孔100 µL之0.5 M H₂ SO₄ 停止反應。使用多標記盤讀取器(Victor, Perkin Elmer)，在450 nm下量測吸光度。對吸光度值作圖並用GraphPad Prism 6.07版 (GraphPad Software, La Jolla California USA)，使用非線性回歸、s形劑量反應(可變斜率)、最小二乘法(常規)擬合進行分析。結果

在37℃下，在至少兩個獨立實驗中測定原代人NK細胞上指定CD16A抗原結合蛋白之表觀結合親和力。此外，在ELISA中分析CD16A抗原結合蛋白結合可溶性CD16A之能力。兩種方法展示，CD16A抗原結合蛋白對CD16A顯示特異性結合。歸因於二價CD16結合，獲得高親和力。在NK細胞結合中量測之KD值的絕對值與在ELISA中量測之EC50值的差異歸因於不同方法、試劑及檢定設置。結果示於表2中。表 2 – 藉由ELISA分析的在37℃下CD16A抗體構築體在原代人NK細胞上之表觀親和力(呈現獨立實驗之平均K_D )或CD16A抗原與經塗佈抗體構築體之表觀結合(呈現EC50值)。

n.t.，未測試實例 5 ： CD16A 抗原結合蛋白針對腫瘤靶細胞之細胞毒性活性 方法：細胞株培養

在標準條件下，在補充有10%熱滅活FCS、2 mM L-麩醯胺酸以及100 IU/mL青黴素G鈉及100 µg/mL硫酸鏈黴素之DMEM培養基(所有組分均來自Invitrogen)中培養A-431 (ATCC，目錄號：CRL-1555)。在補充有10%熱滅活FCS、2 mM L-麩醯胺酸以及100 IU/mL青黴素G鈉及100 µg/mL硫酸鏈黴素之RPMI 1640培養基中培養RPMI-8226 (DSMZ，目錄號：ACC402)及MM.1S (ATCC，目錄號：CRL2974)。在補充有20%熱滅活FCS、2 mM L-麩醯胺酸以及100 IU/mL青黴素G鈉及100 µg/mL硫酸鏈黴素之RPMI 1640培養基中培養SU-DHL-6 (DSMZ，目錄號：ACC572)。在補充有20%熱滅活FCS、2 mM L-麩醯胺酸以及100 IU/mL青黴素G鈉、100 µg/mL硫酸鏈黴素、1 mM丙酮酸鈉及50 µM巰基乙醇之RPMI 1640培養基(所有組分均來自Invitrogen)中培養NCI-H929 (DSMZ，目錄號：ACC163)。

在37℃下，使所有細胞株在含5% CO₂ 之潮濕氛圍中生長。自白血球層分離 PBMC 及富集人 NK 細胞

藉由密度梯度離心自白血球層(German Red Cross, Mannheim, Germany)分離出PBMC。用二至三倍體積之PBS (Invitrogen，目錄號：14190-169)稀釋白血球層樣品，使其在Lymphoprep墊(Stem Cell Technologies，目錄號：07861)上分層並在室溫下在無制動下以800 × g離心25分鐘。收集位於界面中之PBMC並用PBS洗滌3次，隨後在補充有10%熱滅活FCS、2 mM L-麩醯胺酸以及100 IU/mL青黴素G鈉及100 µg/mL硫酸鏈黴素之RPMI 1640培養基中在無刺激情況下培養過夜。對於富集NK細胞，自過夜培養物收集PBMC並根據製造商之說明書，使用供免疫磁性分離未接觸之人NK細胞之EasySep™人NK細胞富集套組(Stem Cell Technologies，目錄號：19055)及Big Easy EasySep™磁鐵(Stem Cell Technologies，目錄號：18001)進行一輪陰性選擇。4 小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定

對於鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定，自培養物收集指定靶細胞，用不含FCS之RPMI 1640培養基洗滌，並在37℃下，用含10 µM鈣黃綠素AM (Invitrogen/Molecular Probes，目錄號：C3100MP)且不含FCS之RPMI培養基標記30分鐘。輕柔洗滌之後，使經標記細胞再懸浮於完全RPMI培養基(補充有10%熱滅活FCS、4 mM L-麩醯胺酸、100 U/mL青黴素G鈉、100 µg/mL硫酸鏈黴素之RPMI 1640培養基)中達到每毫升1×10⁵ 個之密度。接著，一式兩份，將指定(效應子比靶)E:T比率(通常為5:1或2:1)的1×10⁴ 個靶細胞與富集之原代人NK細胞以及指定抗體一起接種於圓底96孔微量盤之各個孔中，總體積為每孔200 µL。一式四份，測定各盤上在無抗體存在下由效應子引起之自發釋放、最大釋放及靶殺滅。

在以200 g離心2分鐘後，通常在37℃下將該檢定於含5% CO₂ 之潮濕氛圍中培育4小時(如所指示，在一些檢定中培育3小時)。在培育結束前15分鐘，將20 µL含10% Triton X-100之RPMI培養基添加至含有靶細胞之孔中。將20 µL RPMI培養基添加至所有其他孔中。在以500 g再離心5分鐘後，自每個孔收集100 µL細胞培養物上清液，並使用螢光盤讀取器(Victor 3, Perkin Elmer)，在520 nm下量測所釋放之鈣黃綠素之螢光度。基於所量測之計數，根據下式計算特異性細胞溶解：[螢光度(樣品) – 螢光度(自發)] / [螢光度 (最大) – 螢光度(自發)] × 100%。螢光度(自發)表示在無效應細胞及抗體存在下靶細胞中之螢光計數且螢光度 (最大)表示由添加Triton X-100誘導之總細胞溶解。使用GraphPad Prism軟體(用於Windows之GraphPad Prism 6.00版, GraphPad Software, La Jolla California USA)，藉由非線性回歸/4參數邏輯斯蒂擬合(4-parameter logistic fit)計算s形劑量反應曲線及EC₅₀ 值。

抗原結合蛋白針對腫瘤靶細胞之細胞毒性活性之結果顯示於表3中。表3：在鈣黃綠素釋放檢定中，在指定E:T比率(5:1或2:1)下利用富集之人NK細胞作為效應細胞，在指定抗體構築體之連續稀釋液及3小時或4小時檢定培育存在下評估抗體介導的指定腫瘤細胞株之溶解。

使用s形劑量反應分析計算EC₅₀ [pM]值。呈現至少兩個獨立實驗之平均值。實例 6 ： 評估由 CD16A 抗原結合蛋白引起之 NK-NK 溶解方法：自白血球層分離 PBMC 及富集人 NK 細胞

藉由密度梯度離心自白血球層(German Red Cross, Mannheim, Germany)分離出PBMC。用二至三倍體積之PBS (Invitrogen，目錄號：14190-169)稀釋白血球層樣品，使其在Lymphoprep墊(Stem Cell Technologies，目錄號：07861)上分層並在室溫下在無制動下以800 × g離心25分鐘。收集位於界面中之PBMC並用PBS洗滌3次，隨後在補充有10% FCS之完全RPMI 1640培養基中在無刺激下培養過夜。對於富集NK細胞，自過夜培養物收集PBMC並根據製造商之說明書，使用供免疫磁性分離未接觸之人NK細胞之EasySep™人NK細胞富集套組(Stem Cell Technologies，目錄號：19055)及Big Easy EasySep™磁鐵(Stem Cell Technologies，目錄號：18001)進行一輪陰性選擇。4 小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定

在用於評估NK-NK細胞溶解之鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定中，用不含FCS之RPMI 1640培養基洗滌富集之未活化NK細胞之一半，並在37℃下，用含10 µM鈣黃綠素AM (Invitrogen/Molecular Probes，目錄號：C3100MP)且不含FCS之RPMI培養基標記30分鐘。輕柔洗滌之後，使經標記細胞再懸浮於完全RPMI培養基(補充有10%熱滅活FCS、4 mM L-麩醯胺酸、100 U/mL青黴素G鈉、100 µg/mL硫酸鏈黴素之RPMI 1640培養基)中。接著，一式兩份，將E:T比率為1:1的5×10⁴ 個靶細胞與來自同一供體之NK細胞以及指定抗體一起接種於圓底96孔微量盤之各個孔中，總體積為每孔200 µL。一式四份，測定各盤上在無抗體存在下由效應子引起之自發釋放、最大釋放及靶殺滅。

在以200 × g離心2分鐘後，在37℃下，在含5% CO₂ 之潮濕氛圍中將該檢定培育4小時。在培育結束前15分鐘，將20 µL含10% Triton X-100之RPMI培養基添加至含有靶細胞之孔中。將20 µL RPMI培養基添加至所有其他孔中。在以500 g再離心5分鐘後，自每個孔收集100 µL細胞培養物上清液，並使用螢光盤讀取器(Victor 3, Perkin Elmer)，在520 nm下量測所釋放之鈣黃綠素之螢光度。基於所量測之計數，根據下式計算特異性細胞溶解：[螢光度(樣品) – 螢光度(自發)] / [螢光度 (最大) – 螢光度(自發)] × 100%。螢光度(自發)表示在無效應細胞及抗體存在下靶細胞中之螢光計數且螢光度 (最大)表示由添加Triton X-100誘導之總細胞溶解。使用GraphPad Prism軟體(用於Windows之GraphPad Prism 6.00版, GraphPad Software, La Jolla California USA)，藉由非線性回歸/4參數邏輯斯蒂擬合計算s形劑量反應曲線並用於測定EC₅₀ [pM]及E_max [%]值。

當在達雷木單抗誘導超過50% NK溶解之檢定中，在高達30 µg/mL之抗體濃度下不存在或僅存在低於10%的可量測之最低溶解時，認為CD16A抗原結合蛋白對誘導NK-NK溶解呈陰性。結果：

在針對NK細胞介導之NK溶解的至少兩個獨立的4小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定中，測試各抗原結合蛋白。

表4及圖17A-17N中概述之結果清楚地展示，由CD16A抗原結合蛋白誘導之NK-NK溶解的效力(EC₅₀ )及功效(E_max )與該等蛋白質對重組CD16A抗原或NK細胞上之CD16A的表觀結合親和力(概述於表2中)不相關。此外，CD16A抗原結合蛋白用於溶解抗原陽性腫瘤細胞之效力(EC₅₀ )與其在介導NK-NK細胞方面之效力亦不相關。自該等發現可以得出結論，介導NK-NK溶解之傾向並非抗CD16A Fv結構域本身之特性且不會隨其表觀親和力而變化，而是隨該形式，特別是給定CD16A抗原結合蛋白之可變重鏈及輕鏈區段之結構域次序的特有特性變化。表 4 ：在4小時鈣黃綠素釋放檢定中，在指定抗體構築體之連續稀釋液存在下，以鈣黃綠素標記之NK細胞作為靶細胞及來自與效應細胞相同供體之未標記NK細胞，以1:1之E:T比率評估抗體介導之NK-NK細胞溶解。

使用s形劑量反應分析計算EC₅₀ [pM]及E_max [%]值。呈現兩個獨立實驗之平均值。N.t.，未測試；n.a.，不適用；no，無靶細胞溶解。

表4顯示，包含呈scDb、Db或scFv形式之兩個CD16A抗原結合部分與Fc部分或Fab區之融合物的抗原結合蛋白在可變區自N末端至C末端以scDb V_L -V_H -V_L -V_H 或scDb V_L -V_L -V_H -V_H 、Db V_L -V_H 或scFv V_L -V_H 佈置時不會誘導NK-NK溶解。由此，結果展示，NK-NK溶解與由EC50及Emax定義的該等抗原結合部分與重組CD16A或NK細胞上之CD16A的表觀結合親和力無關。另外，NK-NK溶解亦與靶抗原結合結構域無關。實例 7— 重定向優化細胞殺滅 ( ROCK^® ) ： 用於參與先天免疫性的高度通用之多特異性符合目的抗體平台 概述

已基於重定向優化細胞殺滅(Redirected Optimized Cell Killing，ROCK^® )平台開發出具有獨特特性之一系列免疫細胞接合物。該新穎的模組化平台使NK細胞接合具有優於經典單株抗體及其他接合物概念之優勢。考慮免疫效應細胞之分子設計、結合親和力、活化以及PK特性。ROCK^® 平台可用於產生旨在活化先天及獲得性免疫之新穎抗體。

在本實例中，提供一種新穎的完全模組化平台，稱為「重定向優化細胞殺滅」(ROCK^® )平台，其包括具有此類獨特抗CD16A結合結構域之眾多不同形式用於產生旨在活化先天及獲得性免疫之一類新穎NK細胞募集抗體。材料及方法 產生 ROCK^® 重組抗體、對照及抗原變異體

不同重組蛋白(抗原、抗體、對照)之基因序列係由Thermo Fisher Scientific/Invitrogen GeneArt (Regensburg, Germany)合成或利用PCR得到。藉由使用標準分子生物學技術將各別序列元件選殖至哺乳動物表現載體pcDNA5/FRT (Life Technologies)或其經修飾形式產生編碼該等重組蛋白之表現載體。可溶性重組抗原變異體係構築為ECD序列與單體Fc之融合蛋白形式(Ying等人 , J Biol Chem 2012; 287:19399-408)。對於細胞表面錨定之抗原變異體的表現，將ECD序列與人EGFR之跨膜結構域融合(Wang等人 , Blood 2011; 118:1255-63)或使用具有全長前肽序列之人CD16B內源序列，經由GPI錨定以進行GPI錨定之轉譯後加工及脂化。在一些表現構築體中，原始載體經修飾成含有兩個CMV啟動子控制之表現卡匣以共表現兩個抗體鏈。哺乳動物表現載體之進一步修飾係用嘌呤黴素抗性基因替代潮黴素抗性。此外，表現構築體係設計成含有N末端信號肽之編碼序列以便利分泌。對於重組融合構築體(例如具有IgG1 Fc部分之抗原)，使用延伸之引子對編碼融合搭配物之序列進行PCR擴增以構築相應連接子或連接體序列進行基因融合或限制性酶消化。使用Gibson組裝方法將所得重疊DNA片段插入共表現載體中相關位置處，以得到最終構築體(Gibson等人 , Nat Methods 2010; 7:901-3；Gibson等人 , Nat Methods 2009; 6:343-5)。所有構築體之序列均在GATC (Köln, Germany)，使用訂製引子，由Sanger測序確定。

如先前所述(Reusch等人 , Clin Cancer Res 2016; 22:5829-38)，在CHO中表現可溶性抗體或抗原或細胞表面錨定之抗原。取決於單體或多聚體(同二聚體、異二聚體或四聚體)產物形式及融合之親和標籤、κ-輕鏈或Fc部分之存在，使用一種或兩種標準親和層析方法(蛋白質A、蛋白質L、Capture Select C標籤或IMAC)，自細胞培養物上清液純化出靶蛋白質。經由尺寸排阻層析法進一步精製所有蛋白質製劑並使用SEC-MALS、SDS-PAGE及UV-Vis光譜法分析。點漬墨法、 SDS–PAGE 及西方墨點法

將純化之重組CD16抗原變異體點樣於硝酸纖維素膜上，或與樣品緩衝液混合並在4-20% Criterion TGX Precast凝膠(Bio-Rad)上分離。使用Bio-Rad Molecular Imager Gel Documentation系統使總蛋白質成像。使用Trans-Blot Turbo系統(Bio-Rad)，藉由西方墨點將蛋白質轉印至Trans-Blot Turbo system (Bio-Rad)膜上。用溶解於TBS中之3% (w/v)脫脂乳粉(Merck)阻斷膜30分鐘並將其與2-4 µg/mL抗CD16 scFv抗體一起培育1小時，隨後用TBST (含0.1% (v/v) Tween 20之TBS)洗滌並用TBS洗滌兩次。在室溫下，將膜與作為二次偵測結合物的以1:3000稀釋之抗Penta-His-HRP (QIAGEN)一起培育1小時。洗滌後，藉由添加新鮮製備的0.66 mg/mL DAB、0.02% CoCl₂ 、0.015% H₂ O₂ 於TBS中之混合物開始顯色並藉由在水中洗滌膜來停止顯色。將膜乾燥並拍照。在 ELISA 中分析 CD16A 抗原結合

在4℃下，用含抗原或不同NK細胞接合物抗體形式之100 mM碳酸鹽-碳酸氫鹽緩衝液塗佈96孔ELISA盤(Immuno MaxiSorp; Nunc)過夜。取決於分子質量，塗佈0.5-3 µg/mL抗原或2-5 µg/mL抗體形式，將經塗佈抗原之莫耳濃度平衡至約30 nM或將經塗佈抗體之莫耳濃度平衡至10-20 nM。在用溶解於PBS中之3% (w/v)脫脂乳粉(Merck)阻斷之後，在室溫下，分別在塗有抗原或抗體之盤上培育His標記之scFv抗體或生物素化CD16A-158V ECD-單體Fc-融合抗原於含0.3% (w/v)脫脂乳粉之PBS中的連續稀釋液培育1.5小時。為評估結合競爭，對scFv進行滴定並在盤上與1 nM或10 nM 3G8 mAb共培育。用每孔300 µL含0.1% (v/v) Tween 20之PBS洗滌三次之後，將盤與偵測結合物，即以1:3000稀釋之Penta-His-HRP (Qiagen)、抗生蛋白鏈菌素-HRP (Roche)或對於偵測競爭劑3G8，以1:10000稀釋之過氧化酶親和純山羊抗小鼠IgG (H+L) (Dianova)一起在室溫下培育1小時。洗滌後，將盤與四甲基聯苯胺(TMB)受質(Seramun)一起培育1-2分鐘或直至明顯可見顏色顯現。藉由添加0.5M H₂ SO₄ (每孔100 µL)停止反應。使用多孔盤讀取器(Victor, Perkin Elmer)量測在450nm (1s)下之吸光度。對吸光度值作圖並藉由使用GraphPad Prism 6.07版(GraphPad Software, La Jolla California USA)將非線性回歸模型與s形劑量反應曲線擬合(四參數邏輯斯蒂擬合)來測定EC₅₀ 值。細胞株及細胞培養

NCI-H929 (DSMZ，目錄號：ACC-163)、MC/CAR (ATCC，目錄號：CRL-8083)、MM.1S (ATCC，目錄號：CRL-2974)、RPMI-8226 (DSMZ，目錄號：ACC 402)、KARPAS-299 (DSMZ，目錄號：ACC 31)及SW-982 (ATCC，目錄號：HTB-93)係購得的，且A-431係由G. Moldenhauer博士(DKFZ Heidelberg)提供。在標準條件下，在37℃及含5% CO₂ 之潮濕氛圍中，在DMEM (目錄號：41965–039)、IMDM (目錄號：12440-053)或RPMI 1640 (目錄號：21875–034)中培養所有細胞，該培養基補充有10%熱滅活胎牛血清(FCS) (目錄號：10270–106)、100 U/mL青黴素G/100 mg/mL鏈黴素(目錄號：1540–122)及2 mM L-麩醯胺酸(目錄號：25030–024；皆來自Life Technologies)。人 NK 細胞之分離

如先前所描述(Fuss等人 , Curr Protoc Immunol 2009; 第7章:第7 1單元)，使用Lymphoprep (StemCell Technologies, 目錄號：07861)自健康志願者之白血球層(German Red Cross, Mannheim, Germany)分離出周圍血單核細胞(PBMC)。在37℃及5% CO₂ 下，在潮濕氛圍中，在補充有10%熱滅活FCS、2 mM L-麩醯胺酸及100 U/mL青黴素G鈉/100 µg/mL硫酸鏈黴素之RPMI 1640培養基中培養PBMC過夜，隨後根據製造商之說明書，藉由使用EasySEP™陰性NK細胞富集套組(StemCell Technologies, 目錄號：17955)富集NK細胞。藉由流動式細胞測量術測定NK細胞分離株之純度，並且展示通常＞80% CD56⁺ 細胞(資料未顯示)。細胞結合檢定及流動式細胞測量分析

在37℃下，將0.2-1 × 10⁶ 個富集之人NK細胞的等分試樣與100 µL指定構築體於含2%熱滅活FCS (Invitrogen，目錄號：10270-106)、0.1%疊氮化鈉(Roth, Karlsruhe, Germany，目錄號：A1430.0100)之FACS緩衝液(PBS, Invitrogen，目錄號：14190-169)中的連續稀釋液一起在不存在或(若指明)存在10 mg/mL多株人IgG (Gammanorm, Octapharma)情況下培育45分鐘。在用FACS緩衝液反復洗滌之後，依序用10 µg/mL抗His mAb 13/45/31-2 (Dianova, Hamburg, Germany, 目錄號：DIA910-1MG)及15 µg/mL FITC結合之山羊抗小鼠IgG (Dianova, 目錄號：115-095-062)偵測細胞結合且His標記之scFv、TandAb或TriFlex抗體。依序用可溶性His標記之BCMA、10 µg/mL抗His mAb 13/45/31-2、15 µg/mL FITC結合之山羊抗小鼠IgG偵測雙特異性BCMA/CD16A抗體構築體，並用15 µg/mL FITC結合之山羊抗人IgG (Dianova, 目錄號：109-095-098)偵測雙特異性含Fc EGFR/CD16A構築體。最後一個染色步驟後，再次洗滌細胞並使其再懸浮於0.2 mL含有2 µg/mL碘化丙錠 (PI) (Sigma，目錄號：P4170)的FACS緩衝液中以便排除死細胞。使用Millipore Guava EasyCyte流動式細胞測量儀(Merck Millipore, Schwalbach, Germany)或CytoFlex細胞測量儀(Beckman Coulter, Krefeld, Germany)量測2-5 × 10³ 個活細胞之螢光度並測定細胞樣品之中值螢光強度。在減去用單獨二次及/或三次試劑染色之細胞的螢光強度值後，使用該等值進行非線性回歸分析。使用單位點結合(雙曲線)擬合及GraphPad Prism軟體V6或V7 (GraphPad Software, La Jolla California USA)計算平衡解離常數(K_D )。細胞毒性檢定

對於鈣黃綠素釋放檢定，在37℃下，用含10 mM鈣黃綠素AM (Life Technologies, 目錄號：C3100MP)之RPMI培養基標記靶細胞30分鐘，並在遞增抗體濃度存在下，將1 × 10⁴ 個腫瘤靶細胞與效應細胞以指定效應子:靶(E:T)比率接種於96孔微量盤之各個孔中，總體積為200 µL。對於NK互相殘殺評估，在遞增抗體濃度存在下，將5 × 10⁴ 個鈣黃綠素標記之原代人NK細胞與自體NK細胞以1:1之E:T比率共培育。若未另外指示，否則在37℃下於含5% CO₂ 之潮濕氛圍中培育4小時後，藉由盤讀取器(Victor 3或EnSight, Perkin Elmer, Turku, Finland)量測在520 nm下釋放至上清液中的鈣黃綠素之螢光度(F)。特異性細胞溶解計算如下：[F(樣品) – F(自發)] / [F (最大) – F(自發釋放)] × 100%。F(自發)表示在無效應細胞及抗體存在下自靶細胞釋放之螢光度，且F(最大)表示在藉由添加Triton X-100 (Roth, 目錄號：3051.2)達到1%最終濃度誘導總細胞溶解之後釋放的螢光度。對特異性靶細胞溶解(%)之平均值及標準差(SD)作圖且藉由使用GraphPad Prism (v6及v7; GraphPad Software, La Jolla California USA)將非線性回歸模型與s形劑量反應曲線(可變斜率)擬合來測定活體外效力(EC₅₀ )。表面電漿共振

在Biacore T200儀器(GE Healthcare)上，在25℃下使用HBS-P+ (10 mM HEPES、150 mM NaCl、0.05% (w/v)聚山梨醇酯20，pH 7.4)作為操作緩衝液及用於稀釋，執行與CD16A之單價相互作用的動力學結合分析以及單價及二價抗CD16A結合分析物之定量解離階段比較。使用HBS-P+緩衝液預調節CAP感測器晶片(生物素捕捉套組(Biotin Capture Kit), GE Healthcare) 過夜。在預捕捉步驟中，在流槽1-4中用生物素捕捉試劑(Biotin CAPture reagent；GE Healthcare)以5 µL/min處理晶片表面100秒。

對於各種抗CD16A scFv之動力學結合分析，在HBS-P+中製備生物素化單Fc(沉默)-Avi標記之受體並捕捉(人CD16A-158V、人CD16A-158F，對於量測與scFv之相互作用係約40 RU且對於量測與IgG之相互作用係約10 RU)於流槽Fc 2及Fc 4中。在HBS-P+緩衝液中製備指定濃度系列之IgG及scFv並將其以40 µL/min之流動速率注射至參考表面 (Fc 1、Fc 3)及受體捕捉表面(Fc 2、Fc 4)(締合時間180秒、解離時間300秒)。在利用6 M鹽酸胍/250 mM NaOH以10 mL/min進行120秒再生循環後，使用Multi Cycle 動力學模式量測相互作用(製備所有抗體之4倍稀釋液系列：scFv-Ab16^mid 150 nM – 0.586 nM；scFv-Ab16^hi 50 nM – 0.195 nM；scFv-AB16^lo 500 nM - 1.953 nM；scFv-3G8且Fc增強之人IgG1 200 nM - 0.781 nM；人IgG1及Fc沉默之人IgG1 2000 nM – 7.813 nM)。藉由減去來自參考表面(Fc 2-1、Fc 4-3)之信號及零濃度(緩衝液對照)信號來校準資料。藉由使用Biacore T200評價軟體(v3.1)將資料擬合於1:1結合模型(Rmax及局部擬合之RI)來進行動力學評價。為定量比較感測圖，將單一濃度(312.5 nM)之scFv及IgG以增加之捕捉水準(人CD16A-158V 180 RU及人CD16A-158F 90 RU)注射至參考表面及受體捕捉表面上。針對每一曲線最大值使校準曲線正規化並覆蓋。對於經由單價及二價CD16A結合抗體或配體之定量解離階段比較研究受體保留，在HBS-P+中製備生物素化單Fc(沉默)-Avi標記之受體並將其捕捉(人CD16A-158V約160RU；食蟹獼猴CD16約320 RU)於流槽Fc 2及Fc 3中。在HBS-P+緩衝液中將併入Ab16^hi 結構域之所關注抗體(scFv-IgAb、Db-Fc、KiH-scDb-Fc、TandAb)及比較劑、增強之人IgG1 Fc (S239D / I332E)及單價結合scFv-Ab16^hi 稀釋至50 nM濃度並將其以30 µL/min之流動速率注射至參考表面(Fc 1)及受體捕捉表面(Fc 2、Fc 3)上(締合時間180秒、解離時間3小時)。用6 M鹽酸胍/ 250 mM NaOH以10mL/min使表面再生，保持120秒。藉由減去來自參考表面(Fc 2-1、Fc 4-3)之信號及零濃度(緩衝液對照)信號來校準資料。針對每一曲線最大值使校準曲線正規化並覆蓋。ROCK 接合物之藥物動力學研究

在CD-1 SWISS小鼠中評估不同ROCK^® 平台形式之基礎藥物動力學參數。存活階段係由Heidelberg Pharma GmbH進行。CD-1 SWISS雌性小鼠(例如n=24)接受靜脈內單次投與0.3 mg (約10 mg/kg體重)測試物。在不同時間點，收集血液，持續1至3週時間。自該血液獲取血清並利用確定之檢定，基於ELISA或MSD技術進行分析。代表性抽血時程涵蓋13個時間點，例如給藥前第-7天、5分鐘、30分鐘、30分鐘、1小時、4小時、8小時以及第1天、第2天、第3天、第4天、第7天、第14天及第21天。使用增強之化學發光(ECL)偵測，藉由ELISA在Tristar LB941 (Berthold instruments)上測定血清濃度。對於確定之檢定設置，測試作為捕捉及/或偵測器的不同血清抗原及/或單株抗體組合。該等檢定係關於其他關鍵參數，如檢定間/檢定內精確度及準確度、稀釋度線性及選擇性、Hook效應及基質效應表徵。NK 細胞活化檢定

在存在或不存在1 × 10⁴ 個RPMI-8226細胞情況下，將5 × 10⁵ 個人PBMC接種於平底96孔微量盤之各個孔中的含指定抗體濃度之完全RPMI 1640培養基中. 在37℃及5% CO₂ 下，在潮濕氛圍中培育22小時後，收集細胞，洗滌並將其再懸浮於FACS/hIgG緩衝液(補充有1 mg/mL多株人IgG之FACS緩衝液)中。接著，在冰上於暗處用含CD56-PC7及CD69-PC5之FACS/hIgG緩衝液對細胞染色15分鐘。用FACS緩衝液反復洗滌後，藉由流動式細胞測量術分析1 × 10³ – 1 × 10⁴ 個細胞並定量CD56⁺ NK細胞之CD69⁺ 細胞的百分比。細胞介素釋放檢定

在室溫下，用RPMI-1640/5% FCS阻斷平底96孔微量滴定盤2-4小時，隨後在存在或不存在10 µg/mL指定抗體情況下，接種5 × 10⁵ 個PBMC結合或不結合1 × 10⁴ 個NCI-H929腫瘤細胞，總體積為每孔200 µL。在37℃及5% CO₂ 下，在潮濕恆溫箱中培育盤24小時。收集細胞培養物上清液並在-80℃下儲存，直至在Bioassay GmbH (Heidelberg, Germany)，使用BD™細胞測量珠粒陣列(CBA) 人Th1/Th2細胞介素套組II (BD Bioscience)定量細胞介素。結果 產生抗 CD16A 抗體結構域之合理性

含有Fc部分之大多數經典治療抗體顯示較低的固有CD16A結合親和力(FcγRIIIA)結合親和力，採用在CD16A上之識別位點的免疫接合物亦為IgG抗體之Fc部分所結合(de Palazzo等人, Cancer Res. 1990;50:7123-8；de Palazzo等人, Cancer Res. 1992;52:5713-9)且須與血清IgG競爭結合CD16A，由此限制CD16A佔有率並增加治療抗體有效所需之劑量。與血漿IgG競爭在以高水準血漿IgG為特徵之疾病，諸如多發性骨髓瘤中甚至更明顯(Michallet等人 , Leukemia 2017)。此外，取決於患者之個別CD16A基因型，人體(Mahaweni等人, Sci. Rep 2018;8:15983)中具有在與IgG之結合親和力方面且因此在FcR功能如ADCC方面不同之最主要變異體CD16A-158V及CD16A-158F的CD16A多態性產生經典mAb療法之不同功效水準(Bowles等人, Blood 2006;108:2648-54；Burchard等人, Cancer Genetics 2013;206:130-4)。利用ROCK^® 平台，本發明人創建識別CD16A2上之獨特抗原決定基且實際上不受血漿IgG競爭及CD16A多態性影響的抗CD16A結構域。此外，其係設計用於與CD16A具有高親和力結合，介導高效ADCC且由此介導有效免疫監測。

為了滿足該等對CD16A具有高親和力及選擇性之抗體部分的上述標準，對來源於人PBMC之scFv文庫進行篩選。使用供陰性選擇之人CD16B變異體，可鑑別出最初對CD16A具有低親和力但具有高選擇性的抗體。使用不同親和力成熟方法(例如輕鏈該組、重鏈CDR中之合理突變)，可以使針對CD16A之親和力增加至少100倍達到2 nM之Kd (AB16hi，表5)。低親和力(Ab16^lo )、中等親和力(Ab16^mid )及高親和力結合scFv (Ab16^hi )抗體之CD16A結合特性係在SPR中表徵且與先前描述且充分表徵之泛CD16特異性抗體3G8 (Tamm等人 , J Immunol 1996; 157:1576-81)，以及IgG1 Fc或帶有CD16A結合及Fc介導之效應功能增強突變S239D / I332E (Lazar等人 , Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103:4005-10)或沉默突變L234F / L235E / D265A (Vidarsson等人 , Front Immunol 2014; 5:520；Baudino等人 , J Immunol 2008; 181:6664-9；Hezareh等人 , Journal of virology 2001; 75:12161-8)的基因修飾之Fc變異體相比較。Ab16^mid 及Ab16^hi 皆確定對CD16A之優良結合特性(圖18A及18B)。儘管野生型IgG1 Fc、增強之IgG1 Fc以及泛CD16特異性抗體3G8之CD16A結合動力學取決於CD16A多態性，但Ab16^hi 以及Ab16^mid 及Ab16^lo 顯示相當之動力學結合特性，不管對偶基因型CD16A-158V及CD16A-158F如何(表5、圖18A、18B及20)。另外，兩種抗體均顯示與食蟹獼猴CD16A之良好交叉反應性(圖19A、表6)。此外，由不同親和力成熟策略鑑別的抗CD16A結合物之表徵確定另一獨特的特徵：CD16A之接合係均一的且與CD16A基因型變化無關(表5、圖18A、18B及20)。表 5 ：不同CD16A結合scFv或Fc部分之SPR結合動力學。

顯示平均結合常數及標準誤差SE(締合速率常數k_a (M^-1 s^-1 )、解離速率常數(s^-1 )、平衡解離常數K_D (nM))。感測圖提供於圖20中。表 6 ：在ELISA中分析的不同抗CD16 scFv抗體與以1.5µg/mL (32nM)濃度塗佈之CD16抗原之結合的概述。

顯示在2個獨立檢定中量測的結合scFv之平均EC₅₀ [nM]及SD。CD16A 在血清 IgG 存在下特異性結合至不同抗原決定基

除顯示高度多態性之CD16A外，人CD16B (FcγRIIIB)之異型變異體的不同之處在於細胞外結構域(ECD)之五個胺基酸(圖21)，一些能夠進行額外糖基化，產生GPI錨定之CD16B顆粒球抗原的三個不同變異體，稱為NA1、NA2及SH。值得注意的是，僅兩個胺基酸位置在CD16A及B之成熟ECD中始終不同(圖21)。額外變異存在於具有不同膜錨定模式之CD16A及CD16B中。在成熟GPI錨定形式中裂解掉的CD16B之羧基末端前肽序列與將CD16A ECD連接至其跨膜結構域之序列具有高同源性(圖21)。為了研究決定嚴格地CD16A選擇性抗體之結合位點的CD16A/CD16B序列變異，產生一組重組CD16抗原變異體並表徵。CD16B(NA1) ECD係表現為成熟形式(缺乏前肽)(CD16B^mat )或含有前肽序列之前驅體形式(CD16B^pr )。此外，亦產生CD16B特異性胺基酸經CD16A之同源殘基置換的CD16B^pr ECD突變體並在結合檢定中測試：CD16B^pr,D129G 、CD16B^pr,H140Y 、CD16B^pr,S185F 。

所有測試CD16A及CD16B抗原變異體係藉由泛CD16特異性抗體3G8識別，確定其分子完整性(圖19A、19B、19C及表6)。ScFv抗體Ab16^mid 或親和力改善之Ab16^hi 識別CD16A抗原，但不識別成熟CD16B或其含前肽之ECD融合抗原。不過，若CD16B ECD在140位處之組胺酸(H)突變成酪胺酸(Y)，即在CD16A中相應位置處存在之胺基酸，則此CD16B突變形式(CD16B^pr,H140Y )係由親和力優化之scFv抗體Ab16^mid 及Ab16^hi 充分識別(圖19A-19C，表6)。如圖19A、19B及19C中所示，在140位之酪胺酸(Y)對於形成構象抗原決定基以及scFv抗體之CD16A特異性反應性至關重要。

兩種抗CD16 scFv維持與食蟹獼猴CD16之交叉反應性(圖19A、19B、19C及表6)，不過事實上，食蟹獼猴CD16 ECD序列與人CD16A有總計16個胺基酸差異(參見圖21中之比對)。使用具有不同CD16抗原變異體之轉殖基因表現的重組CHO細胞確定測試抗體Ab16^mid 及Ab16^hi 之結合選擇性以及在CD16 ECD中140位之酪胺酸(Y)對於CD16A特異性識別之重要性(圖19B)。相對於CD16B^pr 或CD16B^mat 抗原變異體，在對西方墨點上進行SDS-PAGE之後，使用該等scFv抗體亦識別CD16A或CD16B^pr,H140Y (圖19C且資料未顯示)。在經還原樣品之西方墨點上未獲得信號(資料未顯示)，表明構象抗原決定基，在Ab16^mid 及Ab16^hi 之情況下，該抗原決定基可由CD16之140位的酪胺酸確定。

IgG在CD16A上之結合位點係在鄰近該受體ECD之膜上的不連續結合區。先前已鑑別及描述CD16A與IgG之Fc部分低親和力相互作用之關鍵胺基酸(Ahmed等人 , J Struct Biol 2016; 194:78-89)。據報導，抗體3G8可結合CD16A及CD16B並阻斷IgG結合(Tamm等人 , J Immunol 1996; 157:1576-81)。未觀察到測試抗體與CD16A之結合的阻斷。儘管3G8 mAb與CD16A之結合在與遞增濃度的含3G8之相應可變結構域之scFv抗體之競爭中勝出，但抗CD16 scFv抗體Ab16^mid 及Ab16^hi 不阻斷或替代CD16A上之3G8 mAb且在競爭性3G8 mAb不存在或存在下，以類似親和力獨立地結合(圖22)(表8)。如表8中所示，3G8阻斷CD16上Fc之結合。由於已知CD16A上之3G8結合位點被佔據可阻斷IgG結合，故得出結論，測試抗CD16抗體在CD16A上之結合位點與IgG結合位點不同。因此，scFv抗體Ab16^hi 及Ab16^mid 之NK細胞結合K_D 值僅受到添加10 mg/mL人IgG之輕微影響，而在生理IgG濃度下，抗體3G8之CD16結合部分之結合親和力有超過20倍降低(表7)。因此，該等結果表明，測試抗CD16A結合抗體Ab16^hi 及Ab16^mid 提供高親和力結合至CD16A特異性抗原決定基之優勢，此結合不受競爭性IgG含量(例如在人血液中)影響或僅受到最小影響且接下來，在多價抗腫瘤NK細胞接合ROCK^® 抗體中研究其能力。表 7 ：抗CD16 scFv對原代人NK細胞之表觀親和力。

指定scFv之K_D 值係在37℃下在10 mg/mL多株人IgG存在或不存在下針對富集之原代人NK細胞進行的4個獨立實驗中測定。表 8 ：在作為競爭劑之等莫耳濃度泛CD16特異性抗體3G8 (10 nM)不存在或存在下以ELISA分析的不同抗CD16 scFv抗體與以0.5µg/mL (10nM)濃度塗佈之CD16抗原之結合及競爭的概述。

顯示在2個獨立檢定中量測的平均EC₅₀ [nM]加SD。ROCK^® 平台 ROCK^® 形式

為了展示抗CD16A結構域之通用性及研究其全部潛力，產生基於已知抗體形式之廣譜ROCK^® 架構(Spiess等人 , Mol Immunol 2015; 67:95-106)及其新設計之變異體。

ROCK^® 平台抗體係多價多特異性的且具有至少一個靶結合位點及兩個CD16A抗原結合部分，由此能夠二價結合。取決於所需特徵，諸如價態、多特異性、藥物動力學及藥效學特性，在存在或不存在恆定區情況下，由結合結構域模組化組裝該等構築體。ROCK^® 抗體形式可分成四個不同家族，其包含i)少Fc之ROCK^® 、ii) Fc融合ROCK^® 、iii) IgG樣ROCK^® 及iv)片段抗體結合結構域(Fab)融合ROCK^® 。家族成員ii)、iii)及iv) 之靶及效應細胞結合部分可呈單鏈Fv (scFv)、單鏈雙功能抗體(scDb)、雙功能抗體(Db)或Fab形式，由此實現多種功能。該等結構域係經由可撓性連接子與CH2/CH3恆定結構域之N末端及C末端融合，或者經由鉸鏈或較短中間鉸鏈與N末端融合(Merchant等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2013;110:E2987-96)。對於家族i)，該等結構域係藉由肽連接子連接且組裝為TandAb (McAleese等人 , Future Oncol 2012; 8:687-95)或aTriFlex分子(Gantke等人 , Protein Eng Des Sel 2017; 30:673-84)形式。為了確保NK細胞之高效接合及活化，設計出在所有家族中二價結合之抗CD16A部分。取決於所需結合強度及/或靶生物學，ROCK^® 接合物中之腫瘤靶結合結構域可為單價或二價的。另外，該平台之模組化有助於構築多價多特異性接合物用於共靶向超過一個腫瘤抗原。圖23顯示全部四個ROCK^® 家族(i-iv)、其相關形式。為了顯示ROCK^® 形式之通用性，選出不同靶結合部分，諸如BCMA、CD19、CD20、EGFR、HSA或RSV。

在本文所述之功能檢定中較詳細地表徵的ROCK^® 構築體之代表性實例靶向實體腫瘤靶EGFR或B細胞成熟抗原(BCMA)，即在多發性骨髓瘤中之靶(表9A、9B及9C)。表9A、9B及9C中之結構中所示的符號與圖23中所示之符號一致。所有ROCK^® 構築體均包含完全人抗體結構域且具有約102 – 250 kDa之近似分子量。在若干情況下，在C末端處添加標籤(C標籤及/或6×His標籤)以便能經由親和層析法選擇性純化異二聚抗體、分析不對稱產物中之兩種不同多肽且最終獲得高純度(＞ 90%)的所需產物物種。

少Fc之ROCK^® 家族(i)：該組少Fc構築體組合熟知之TandAb(其中若干產物已進入臨床開發)(Reusch等人 , MAbs 2014; 6:728-39；Reusch等人 , MAbs 2015; 7:584-604；Ellwanger等人 , Frontiers in Oncology 2017; 7；Reusch等人, Clin. Cancer Res. 2016;22:5829-38)及aTriFlex (Gantke等人 , Protein Eng Des Sel 2017; 30:673-84)分子。aTriFlex分子可工程改造成三特異性形式，採用兩種不同的scFv特異性以針對兩種不同之腫瘤相關抗原或靶抗原決定基或用於PK擴展。為此目的，使用抗人血清白蛋白(HSA)結合結構域延長其他短壽命少Fc抗體形式之血清半衰期。在本家族內之兩種形式藉由兩個獨立多肽鏈上相應重鏈及輕鏈可變結構域之相互作用組裝為二聚體形式，如頭-尾同二聚體(TandAb形式)或如呈頭-尾或頭-頭形式之異二聚體(aTriFlex)。本組之成員係功能性二聚體大小為105 kDa之近似質量的最小ROCK^® 雙特異性構築體且缺乏Fc部分及糖基化。

Fc融合ROCK^® 家族(ii)：本家族之含Fc抗體形式包含若干Fc變異體(Vidarsson等人 , Front Immunol 2014; 5:520；Baudino等人 , J Immunol 2008; 181:6664-9；Hezareh等人 , Journal of virology 2001; 75:12161-8)以避免Fcγ受體結合，但仍維持FcγRn結合以延長半衰期。因此，Fcγ受體結合僅由NK細胞結合結構域介導且侷限於CD16A。此外，本家族之Fc部分可為基於IgG1之同二聚體(Bi-scFv-Fc、Db-Fc)、異二聚體(KiH-scFv-Fc、KiH-scDb-Fc)或單體Fc (scDb-mFc)。為便於異二聚化，採用了利用經典Y407T (「孔」)及T366Y (「節」)突變之「孔中節」(KiH)技術(Ridgway等人 , Protein Eng 1996; 9:617-21)。如先前所公開(Ying等人, J. Biol. Chem. 2012;287:19399-408)，使用可撓性連接體工程改造單體Fc (mFc)部分以與靶及NK細胞結合部分融合。抗CD16A在N末端或C末端處與抗靶結合結構域相對定位或在N末端與其毗鄰，因為其已關於KiH-scDb-Fc構築體之一顯示。針對CD16A結合結構域之scDb形式適用於KiH-scDb-Fc及scDb-mFc構築體。Db-Fc形式係在C末端或N末端處展現雙功能抗體之同二聚體。此Db-Fc形式係由兩個VL/VH結構域組裝，該等結構域在C末端經由可撓性連接子或在N末端經由延長之鉸鏈區與恆定區融合。

IgG樣ROCK^® 家族(iii)：此雙特異性抗體組包含scFv-IgAb及Bi-scFv-IgAb，原則上其係兩個CD16A抗原結合部分與兩個Fab臂內可變片段(Fv)之C末端融合或位於其N末端的「擴展之人IgG1」分子(Coloma等人 , Nat Biotechnol 1997; 15:159-63)。位於相應相對端之腫瘤靶結合結構域正是此情形。Bi-scFv-IgAb分子展現六價三特異性IgG樣架構，具有另外兩對抗原結合scFv經由可撓性連接子與κ 或λ 恆定區及CH3之C末端融合。

Fab融合ROCK^® 家族(iv)：本組成員係「擴展之Fab」分子且可細分為scDb-TriB及scDb-TriB-scFv形式。兩種形式包括呈二價scDb形式之抗CD16A結合部分在scDb-TriB-scFv中與κ 或λ 恆定區或在scDb-TriB情況下與CH 1之C末端融合。對於PK擴展，在Fab片段N末端處之可變結構域提供HSA結合。腫瘤靶向係藉由單價(scDb-TriB-scFv)或二價(scDb-TriB)結合部分(scFv相對於 scDb)與各別游離C末端融合實現。表 9A – 功能性檢定中所用呈Fab或scFv-融合佈置的含CD16結合部分(以藍色描繪)之ROCK^® 實例的綜述。

表 9A ( 續 )

表 9B – 功能性檢定中所用呈雙功能抗體(Db)樣佈置的含CD16結合部分(以藍色描繪)之ROCK^® 實例的綜述。

#藉由突變L234F/L235E/D265A使Fc沉默；HSA^lo ：低親和力抗HSA結構域，HSA^hi ：高親和力抗HSA結構域表 9B ( 續 )

表 9C – 功能性檢定中所用對照抗體之綜述。

表 9C ( 續 )

*藉由突變S239D / I332E增強之Fc (以粗體+ 描繪)ROCK^® 接合物利用親合力使經由 CD16A 進行之 NK 細胞接合最大化

在SPR中研究多種ROCK^® 接合物形式之CD16A結合保持並藉由比較自人CD16A-158V或食蟹獼猴CD16之解離情況，與scFv Ab16^hi 以及增強與人CD16A之結合的工程改造之人IgG1 Fc (S239D / I332E)之單價結合相比較。測試抗體在3小時解離期間之相對結合信號清楚地顯示，相較於解離更快的IgG Fc (S239D / I332E) (10%)或單價結合scFv Ab16^hi (0% - 2.4%)，在人CD16A-158V (76.6% - 92.5%)及食蟹獼猴CD16 (84.9% - 97.9%)上所有測試ROCK^® 接合物之受體保持之優越性(圖24A-24C)。與藉由SPR得到的解離量測結果相符，ROCK^® 接合物，諸如TandAb及Ab16^hi Fv結構域展現在NK細胞表面上明顯長於具有野生型Fc結構域之經典IgG或在Fc中具有S239D / I332E突變之經增強IgG的保持時間(圖25)。

另外，含有針對CD16A之兩個結合位點的不同ROCK^® NK細胞接合物之表觀CD16結合強度取決於抗CD16可變結構域屬性(高親和力Ab16^hi 或中等親和力Ab16^mid )、抗體形式以及多特異性(包括但不限於雙特異性或三特異性)且多價(四價或六價)之ROCK^® NK細胞接合物中抗CD16部分之位置。與單價結合特性類似，含Ab16^hi 之ROCK^® 抗體的二價CD16A結合在ELISA中之表觀親和力高於含有Ab16^mid 結構域之相應ROCK^® 接合物。另外，在ROCK^® 接合物中抗CD16A結構域之不同位置實現逐漸親合力轉變：在Fc結構域N末端處含有CD16結合部分的ROCK^® 架構介導的針對CD16A之表觀結合親合力高於含抗CD16結構域與Fc之C末端的融合物之抗體(圖26A及26B)。可藉由在結合強度相較於兩個CD16結合scFv之融合物增強的Fc之N末端處使用基於Fab或雙功能抗體之結合模組，可精細調節結合親合力(圖26A及26B)。在Fc之C末端處含有scFv的ROCK^® 接合物中CD16結合強度之進一步調整可藉由改變連接體之長度實現，由此，較長的連接體促進高於較短連接體之表觀親合力的CD16結合(圖26C)。同樣，親合力以及空間態樣影響在該等設置中之表觀結合親合力，而經工程改造的針對CD16A結合之不同靶結合特異性的影響可忽略。

為了評估由ELISA量測之CD16A結合特性是否與NK細胞相關，在模擬人血清中之生理狀況的多株人IgG不存在或存在下，針對原代人NK細胞滴定含有Ab16^mid Fv結構域之一組選定的ROCK^® 接合物，並藉由非線性回歸測定表觀親和力(圖27A、27B及27C)。另外，在N末端Fab或scFv中具有抗CD16A結構域之構築體(scFv-IgAb_A及Bi-scFv-Fc_A)對NK細胞展現的親和力明顯高於在C末端scFv中具有抗CD16A結構域之相應構築體(scFv-IgAb_B及Bi-scFv-Fc_C)。值得關注的是，具有中心抗CD16A雙功能抗體之TandAb(表9B)顯示與具有N末端Fab或scFv之構築體類似的針對NK細胞之高親和力，而aTriFlex對NK細胞展示最低親合力，不過在該構築體之中心中有類似的抗CD16A雙功能抗體基元，而且可變結構域之次序不對稱。高IgG濃度對TandAb及在N末端Fab中具有抗CD16A結構域之scFv-IgAb構築體的表觀親和力無顯著影響，對含抗CD16A scFv之構築體(無論經N末端抑或經C末端與該構築體融合)的結合有中等影響(4-9倍)，且觀察到針對aTriflex之親和力的最強抑制作用。NK 細胞互相殘殺及 ROCK^® 形式之設計

抗體與CD16之多價高親和力結合有交聯多個NK細胞上之受體，引起CD16A介導的交聯細胞殺滅，由此耗盡NK細胞群的風險(Choi等人, Immunology 2008;124:215-22)。靶向NK細胞漿膜上之CD38的其他單株抗體如達雷木單抗已顯示此NK細胞互相殘殺(Casneuf等人, Blood Adv. 2017年10月24日;1(23):2105-2114)。據推測，減少主要效應細胞群會妨礙抗體介導之抗腫瘤反應的功效。為此原因，建立活體外檢定來監測由各種ROCK^® 形式所誘導的NK細胞互相殘殺之程度。在本文中，使用來自同一供體之原代人NK細胞作為效應細胞及靶細胞，由此允許如上文所述測定NK細胞溶解之效力。作為陽性對照，在檢定設置中包括達雷木單抗。本發明人利用僅含一個CD16A結合位點之抗體從未觀察到NK-NK互相殘殺，表明CD16A之二價性係NK細胞交聯且隨後互相殘殺的前提條件。值得關注的是，取決於ROCK^® 抗體形式或結構域次序，可調節NK細胞互相殘殺之發生以及NK細胞殺滅之效力(圖28)。

一般而言，所有分析之ROCK^® 抗體形式顯示相較於達雷木單抗改善的NK細胞互相殘殺特徵，達雷木單抗以158 pM之平均效力導致NK細胞引導的殺滅作用。所有測試ROCK^® 抗體形式誘導不太明顯之NK細胞殺滅或根本不誘導NK細胞殺滅。

CD16A經由ROCK^® 抗體中N末端融合之抗CD16A部分接合看來會比在C末端處CD16A接合更穩固地避免NK細胞互相殘殺。然而，詳細地瞭解N末端CD16接合，揭示使用基於Fab之CD16A接合有較明顯之NK細胞耗盡且平均效力值在1439與2389pM之間。

值得關注的是，藉由分析CD16 Fv之結構域次序，相對於含有VH-VL結構域次序之構築體均誘導NK細胞溶解，當結構域次序係VL-VH時，明顯較少數量之構築體誘導NK細胞互相殘殺。在該等在C末端或N末端含有CD16 Fv VL-VH結構域之ROCK^® 抗體中，僅極少構築體誘導NK細胞互相殘殺。

總體而言，藉由避免基於Fab之CD16A接合並關注CD16結合Fv結構域之有益VL-VH次序，可有效改善NK細胞互相殘殺誘導性抗體之比例以及NK細胞殺滅之效力。ROCK 接合物之優良活體外細胞毒性

在鈣黃綠素釋放檢定中評估靶向EGFR或BCMA之各種ROCK^® 接合物的活體外細胞毒性(圖29A、29B、29C、29D及29E)。針對在細胞表面上高水準(NCI-H929)、中等水準(MM.1S)或低水準(MC/CAR)表現BCMA之靶細胞，比較具有Ab16^hi Fv結構域之BCMA靶向接合物(TandAb_A、scFv-IgAb_D、Bi-scFv-Fc_B及KiH-scDb-Fc_A)與含Ab16^mid Fv之接合物scFv-IgAb_E及在Fc中帶有S239D / I332E突變的Fc增強之抗BCMA IgG1 (IgAb_C)(圖29A-29C)。例示性細胞毒性結果揭示，不同ROCK^® 接合物形式針對BCMA^high NCI-H929靶細胞之效力及功效僅有微小差異(EC₅₀ 範圍：9.5 pM – 52.7 pM)，針對BCMA^mid MM.1S靶細胞具有類似功效但較大的效力差異(EC₅₀ 範圍：1.8 pM – 29.1 pM)，且針對BCMA^low MAC/CAR靶細胞之功效及效力有明顯差異(EC₅₀ 範圍：59 pM – 859 pM)。BCMA靶向TandAb_A、KiH-scDb-Fc_A及scFv-IgAb_D產生較低EC₅₀ 值。該等結果表明，針對CD16A之兩個價態及針對NK細胞之表觀親和力有利於引發NK細胞介導的不太敏感之靶細胞及/或表現較低數量細胞表面靶抗原之靶細胞的溶解。值得注意的是，僅針對CD16A呈二價不足以介導NK細胞活化，因為抗體誘導的NK細胞活化標記物CD69之表現及人PBMC培養物中細胞介素之釋放嚴格地取決於靶細胞之存在(圖49A-49F)。此外，在人PBMC培養物中由NK細胞接合ROCK^® 抗體釋放之炎性細胞介素水準比由BCMA定向T細胞接合物釋放之水準低若干數量級(圖50)。

與利用BCMA靶向ROCK接合物所獲得的結果類似，當與在Fc中帶有S239D / I332E突變的Fc增強之抗EGFR IgG1 (IgAb_D)、經典EGFR靶向IgG1 (IgAb_B)或包含一致效應子及靶結合結構域的單價結合之雙特異性接合物(BiKE)相比較時，EGFR靶向ROCK^® 接合物在針對SW-982及A-431靶細胞進行之殺滅檢定中顯示出優良的效力，達到單數位pM之EC₅₀ 值(圖29D及圖51)。EGFR/CD16A aTriFlex_A儘管對於人NK細胞之表觀親和力明顯低於其他ROCK^® 接合物(圖27A-27C)，但展示與Fc增強之抗EGFR IgG1 (IgAb_D)類似之效力(圖51)。由於BCMA靶向scFv-IgAb_E未對EGFR陽性、BCMA陰性靶細胞株A-431顯示出殺滅活性，故可以排除非特異性殺滅作用(圖51)。

圖29E中顯示的各種BCMA/CD16A接合物之表觀親和力及在活體外細胞毒性檢定中之相應效力的分析表明針對NK細胞上CD16A之表觀親和力與效力存在相關性。該相關性不僅在2:1之E:T下針對RPMI-8226靶細胞之3小時細胞毒性檢定中觀察到，且在5:1之E:T比率下針對NCI-H929靶細胞之4小時檢定中亦觀察到，證實與NK細胞上CD16A之高親和力結合促成優良的細胞毒性效力。

當在生理含量之競爭IgG存在下進行活體外細胞毒性檢定時，ROCK^® CD30/CD16A靶向TandAb相對於習知及Fc工程改造之抗CD30抗體的優越性甚至更明顯。補充10 mg/mL多株IgG使所有培養物中之背景溶解明顯增加(圖52B)，此很可能歸因於血清IgG誘導的NK細胞脫粒(Jacobi等人, Clin. Immunol. 2009;133:393-401)。不過，與單株IgG (圖52C)或Fc工程改造之IgG (圖52D)競爭完全地阻斷習知抗體之活性或明顯地減弱該等抗體之效力及功效。ROCK CD30/CD16A TandAb抗體在所有測試條件下顯示出最大的細胞毒性效力及功效，甚至在生理濃度之競爭IgG存在下亦如此(圖52A-52D，表10)。表 10 – 在競爭多株IgG、單株IgG或Fc增強之IgG存在或不存在下，在活體外細胞毒性檢定中不同抗CD30抗體之效力(EC50)及功效(Emax)的概述。

在CD30/CD16A TandAb、抗CD30 IgG1 (IgAb)或Fc增強之抗CD30 IgG1 (IgAb (Fc增強))之連續稀釋液存在下，利用E:T比率為5:1的鈣黃綠素標記之CD30+ KARPAS-299靶細胞與作為效應細胞之原代人NK細胞進行之4小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定。檢定係在單獨RPMI 1640培養基或補充有10 mg/mL多株人IgG、10 mg/mL單株人抗EGFR IgG1 (IgAb_B)或10 mg/mL Fc增強之抗EGFR IgG1 (IgAb_D (Fc增強))的RPMI 1640培養基中進行。PK 之調節

治療性抗體之另一重要參數係其血清半衰期。對於高細胞毒性抗體，短半衰期可能係較佳的，實現快速清除率。相比之下，對於具有良好安全性特徵之抗體，較長半衰期可能有利於藉由避免頻繁給藥或對連續輸注之需求而增加患者便利性。

在CD-1 SWISS小鼠中分析一組選定之ROCK^® 平台形式的基礎藥物動力學參數。對於IgG樣ROCK^® 接合物家族，選擇在N末端Fab中含有抗CD16部分或呈scFv與CH3之C末端融合形式的兩種代表性scFv-IgAb抗體(scFv-IgAb_A及scFv-IgAb_D)。對於Fc融合ROCK^® 接合物家族，分析對稱Bi-scFv-Fc_A及含scDb之不對稱KiH-scDb-Fc_A抗體。最後，對於Fab融合和少Fc家族，選擇TandAb_B、aTriFlex_A、aTriFlex_B及scDb-Trib_A抗體進行PK分析。後兩者採用相較於TriFlex_A中之高親和力HSA結合結構域具有低親和力的HSA結合部分進行PK擴展。選定ROCK^® 接合物中之腫瘤靶向結構域對人EGFR或BCMA具有特異性。當靶結合部分及CD16A結合部分不與相應小鼠類似物交叉反應(資料未示出)時，可假定無靶相關藥效學作用。在不同時間點收集來自接受單次靜脈內投與之0.3 mg (約10 mg/kg體重)不同測試物之動物的血清樣品，持續1或3週時間，並用所確定的基於ELISA或MSD技術之檢定進行分析。藉由非房室藥物動力學分析測定基礎藥物動力學參數(表11)。表11中之結構中所示的符號與圖23中所示之符號一致。在靜脈內投與不同ROCK^® 形式後，血清濃度以雙指數方式下降(圖30)。經顯示，兩種IgG樣形式之半衰期分別在329.2小時及364.3小時範圍內，且與標準IgG分子相當⁶³ 。測得Fc融合形式Bi-scFv-Fc_A及KiH-scDb-Fc_A分別有95.8小時或74.3小時之較短半衰期。該等形式之血清半衰期係介於IgG樣與少Fc及Fab融合ROCK^® 形式之間。不過，相較於該兩種scFv-IgAb形式之3週觀察期，Bi-scFv-Fc_A之觀察期僅為1週。因此，該值可能被低估。測得少Fc及Fab融合ROCK^® 形式具有較短半衰期。含高親和力抗HSA結合部分之aTriFlex_A的平均表觀終末半衰期為37.4小時且TandAb之平均表觀終末半衰期為18.0小時。scDb-Trib_A中具有低親和力抗HSA結構域無法延長此構築體之半衰期(14.0小時)。基於平均滯留時間(MRT)可執行類似分級，MRT確定在循環中未變化之藥物。IgG樣及Fc融合測試物顯示528.5至110.6小時之最高MRT，隨後以TandAb、aTriFlex及scDb-Trib為代表之少Fc及Fab融合形式分別顯示61.6至28.5小時之相對較短MRT值。範圍介於0.006至1.228 mL/h之間的清除率(C)亦符合此分級，其中不含Fc亦不含抗HSA結構域之TandAb構築體獲得最大值。曲線下面積(AUC)亦決定一個重要參數，AUC確定隨時間生物體中分子之最大量或暴露量。正如預期，利用含Fc形式獲得最高AUC值。較小的少Fc形式量測到減小僅10倍的值。TandAb再一次展示相較於長壽命測試物最低之暴露量及AUC之100倍差異。確定藥物均一地分佈於全身時得到體內總量所需的表觀體積的穩態分佈體積(V_ss )對於TandAb (4.8 mL)係最高的，隨後為兩種IgG樣抗體(分別為3.3 mL及3.1 mL)、Fc融合物(2.2 mL)、aTriFlex (2.2 mL)及scDb三功能抗體(1.5 mL)。scDb三功能抗體之較低V_ss 值表明，大部分分子保持在血液隔室(血液)中。最後，不同ROCK^® 形式在CD-1小鼠中顯示不同的PK譜且半衰期在14至364小時範圍內。表 11 ：在小鼠PK研究中分析之ROCK^® 形式

C_max ：峰值血漿濃度；t_max ：達到C_max 之時間；AUC ：曲線下面積；t_half ：分子之半衰期。MRT ：平均滯留時間；V_ss ：穩態分佈體積；^# 藉由突變L234F / L235E / D265A使Fc沉默表 11 ( 續 )

C_max ：峰值血漿濃度；t_max ：達到C_max 之時間；AUC ：曲線下面積；t_half ：分子之半衰期。MRT ：平均滯留時間；V_ss ：穩態分佈體積；^# 藉由突變L234F / L235E / D265A使Fc沉默實例 8—CD16A/BCMA 結合抗體之活性 8.1. CD16A/BCMA 結合抗體

在本實例中，提供有關CD16A/BCMA結合抗體之研究：CD16A/BCMA抗體I、CD16A/BCMA抗體II及CD16A/BCMA抗體III。

如本實例中所示資料所展示，CD16A/BCMA抗體I係以與ADCC類似之機制治療多發性骨髓瘤的NK細胞接合物且具有獲得顯著活性及有利安全性特徵之潛力。此外，經顯示，CD16A/BCMA抗體I具有治療耐達雷木單抗(抗CD38抗體)性及達雷木單抗難治性多發性骨髓瘤患者的潛力。此外，CD16A/BCMA抗體I可與另一多發性骨髓瘤治療，例如包含抗體(包括但不限於抗TIGIT抗體、抗PD1抗體、抗PD-L1抗體及抗VEGF抗體)之治療及包括細胞介素(例如IL-12、IL-2等)之治療組合。 8.1.1. CD16A/BCMA抗體I

CD16A/BCMA抗體I係具有圖13中所示之結構的scFv-IgAb抗原結合蛋白，其包含(a)以scFv形式與同二聚人IgG CH2-CH3 Fc部分之C末端以V_L -V_H 次序融合的兩個CD16A抗原結合部分及(b)由IgG之Fab臂中的每個Fv提供的兩個靶抗原結合部分，其中該等靶抗原結合部分結合至BCMA。

CD16A抗原結合部分各自包括含SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、含SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、含SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、含SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、含SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及含SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的V_L CDR3。CDR係根據Kabat編號系統標識。CD16A抗原結合部分各自包含具有SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的V_H ，及具有SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的V_L 。

CD16A/BCMA抗體I之CD16A抗原結合部分與該分子Fc部分之C末端融合且經由連接體(具有SEQ ID NO:22中所述之胺基酸序列)按以下次序連接：V_L (CD16A)-連接子L3- V_L (CD16A)。連接子L3具有SEQ ID NO:18中所述之胺基酸序列。

BCMA靶向部分各自包括含SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、含SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、含SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、含SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、含SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及含SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的V_L CDR3。CDR係根據Kabat編號系統標識。BCMA靶向部分各自包含具有SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的V_H ，及具有SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的V_L 。

CD16A/BCMA抗體I包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分，其中(a)該兩個CD16A抗原結合部分各自包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的V_L CDR3；且(b)該兩個BCMA靶向部分各自包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的V_L CDR3。

關於CD16A/BCMA抗體I中CD16A 抗原結合部分及BCMA靶向部分之CDR序列的概述顯示於圖53A及53C中。

CD16A/BCMA抗體I包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分，其中(a)該兩個CD16A抗原結合部分各自包括含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的V_H 及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的V_L ；及(b)該兩個BCMA靶向部分各自包括含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的V_H 及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的V_L 。

關於CD16A/BCMA抗體I中CD16A 抗原結合部分及BCMA靶向部分之V_H 及V_L 序列的概述顯示於圖53B及53D中。CD16A/BCMA抗體I之Fc部分係沉默之Fc部分，該Fc部分包含人IgG1 CH2及CH3重鏈恆定結構域，其包含SED ID NO: 29中所述之胺基酸序列。CH2重鏈恆定結構域具有兩個沉默突變(又稱為「少效應子突變」)：L234F及L235E。CH2重鏈恆定結構域包含SED ID NO: 79中所述之胺基酸序列。CH3重鏈恆定結構域包含SED ID NO: 109中所述之胺基酸序列。連接至BCMA靶向部分之CH1重鏈恆定結構域包含SEQ ID NO: 33中所述之胺基酸序列。

CD16A/BCMA抗體I包含多肽鏈1，其包含一個CD16A抗原結合部分、同二聚人IgG CH2-CH3 Fc部分、BCMA靶向部分之V_H ，其中該多肽鏈1具有SEQ ID NO: 61中所述之胺基酸序列。CD16A/BCMA抗體I包含多肽鏈2，其包含BCMA靶向部分之V_L ，其中該多肽鏈2具有SEQ ID NO: 62中所述之胺基酸序列。 8.1.2. CD16A/BCMA抗體II

CD16A/BCMA抗體II係具有圖23中所示之結構的少Fc之TandAb (參見「TandAb」之結構)，其包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個靶抗原結合部分，其中該CD16A抗原結合部分係以scFv形式提供且定位於靶抗原結合部分之V_H 與VL之間。

CD16A抗原結合部分按以下次序與靶抗原結合部分融合： V_H BCMA-連接子L5-V_L CD16A-連接子L6-V_H CD16A-連接子L5-V_L BCMA

連接子L5具有SEQ ID NO:129中所述之胺基酸序列。連接子L5具有SEQ ID NO:130中所述之胺基酸序列。

CD16A/BCMA抗體II包含兩個多肽，其各自具有SEQ ID NO:126中所述之胺基酸序列。 8.1.3. CD16A/BCMA抗體III

CD16A/BCMA抗體III係具有圖5中所示之結構的KiH-scDb-Fc，其包含(a)以scDb形式與IgG CH2-CH3 Fc部分之C末端以V_L -V_H -V_L -V_H 次序融合的兩個CD16A抗原結合部分及(b)以scFv形式與Fc部分之N末端融合的單個靶抗原結合部分，其中該靶抗原結合部分結合至BCMA。

CD16A抗原結合部分與異二聚Fc部分融合且經具有SEQ ID NO:20中所述之胺基酸序列之連接體按以下次序連接：V_L (CD16A)-連接子L1-V_H (CD16A)-連接子L2-V_L (CD16A)-連接子L1-V_H (CD16A)。連接子L1具有SEQ ID NO:16中所述之胺基酸序列，且連接子L2具有SEQ ID NO:17中所述之胺基酸序列。

BCMA靶向部分包括含SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、含SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、含SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、含SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、含SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及含SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的V_L CDR3。CDR係根據Kabat編號系統標識。BCMA靶向部分各自包含具有SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的V_H ，及具有SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的V_L 。

CD16A/BCMA抗體III包含兩個CD16A抗原結合部分及一個BCMA靶向部分，其中(a)該兩個CD16A抗原結合部分各自包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的V_L CDR3；且(b)該BCMA靶向部分包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的V_L CDR3。

CD16A/BCMA抗體III之Fc部分係沉默之Fc部分，該Fc部分包含人IgG1 CH2及CH3重鏈恆定結構域，其具有SED ID NO: 31中所述之胺基酸序列。CH2重鏈恆定結構域具有兩個沉默突變(「少效應子」突變)：L234F及L235E。CH2重鏈恆定結構域包含SED ID NO: 79中所述之胺基酸序列。CH3重鏈恆定結構域具有一個沉默突變(少效應子突變)D265A。CH3重鏈恆定結構域包含SED ID NO: 81中所述之胺基酸序列。

CD16A/BCMA抗體III包含多肽鏈1，其包含兩個CD16A抗原結合部分及IgG CH2-CH3 Fc部分，其中該多肽鏈1具有SEQ ID NO: 63中所述之胺基酸序列。CD16A/BCMA抗體III包含多肽鏈2，其包含一個BCMA靶向部分，其中該多肽鏈2具有SEQ ID NO: 64中所述之胺基酸序列。 8.2. 結合特徵

CD16A/BCMA抗體I及CD16A/BCMA抗體III特異性結合至CD16A，但不結合至CD16B。CD16A/BCMA抗體I對CD16A及BCMA具有高結合親和力，例如該抗體以約16 nM之K_D 結合至CD16A且以約2 nM之K_D 結合至BCMA。

如由ELISA所證實，CD16A/BCMA抗體I缺乏FcγR結合。由於CD16A/BCMA抗體I不經由Fc區結合至CD16A，故其結合至CD16A與CD16A多態性無關。舉例而言，在同一天，用CD16A-158V/V健康供體及CD16A-158F/F健康供體評估CD16A/BCMA抗體I針對多發性骨髓瘤細胞株之細胞毒性。結果顯示於圖31A及31B中。相較於CD16A-158V/V，CD16A/BCMA抗體I在CD16A-158F/F存在下未展現改變或展現甚至增加之活性。相比之下，經由Fc區結合至CD16a之達雷木單抗在CD16A-158F/F存在下顯示相較於CD16A-158V/V降低之活性。利用CD16A-158V/F健康供體評估CD16A/BCMA抗體I針對多發性骨髓瘤細胞株之細胞毒性，其細胞毒性係大致在關於CD16A-158F/F及CD16A-158V/V所觀察的細胞毒性之間(資料未顯示)。 8.3 多發性骨髓瘤靶細胞之活體外細胞毒性 8.3.1.使用鈣黃綠素 AM 細胞毒性檢定評估細胞毒性

使用人NK細胞作為效應細胞且以多發性骨髓瘤細胞株作為靶細胞進行鈣黃綠素AM細胞毒性檢定。簡言之，用10 uM鈣黃綠素AM (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA)新鮮標記靶細胞，在37℃下且在無血清培養基存在下保持30分鐘。藉由離心洗滌兩次後，使細胞再懸浮於檢定培養基(補充有10%熱滅活胎牛血清之RPMI 1640)中並以1 × 10⁴ 個細胞/孔密度分配至96孔U形底組織培養盤中。接著，將新鮮製備的效應細胞以5 × 10⁴ 個細胞/孔密度添加至各孔中。培育30分鐘後，將測試樣品之連續稀釋液(0.64、3.2、16、80、400及2000 pm)添加至盤中並在37℃下於含5% CO₂ 之潮濕恆溫箱中再培育4小時。培育後，以300 × g離心各盤10分鐘。將上清液轉移至黑色不透明96孔微量盤(OptiPlate-96; PerkinElmer; Waltham, MA)中並使用Infinite M1000 PRO盤讀取器(Tecan Trading AG; Männedorf, Switzerland)在495/515 nm之激發/發射下量測螢光信號，以相對螢光單元(RFU)為單位。來自僅含靶細胞之孔的信號呈現自經標記細胞自發釋放鈣黃綠素，而含在10% Triton X-100 (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)存在下溶解之靶細胞的孔呈現最大釋放。在含靶細胞及效應細胞且未添加測試樣品之孔中量測非特異性效應細胞介導之細胞毒性。特異性細胞毒性之程度計算如下：細胞毒性% = 100 * (實驗性釋放 – 非特異性釋放) / (最大釋放 – 自發釋放)

藉由使用GraphPad Prism 6軟體(GraphPad Software; San Diego, CA)擬合至四參數非線性回歸模型分析資料並作圖。

結果示於表12中。表 12 – CD16A/BCMA 抗體 I 之細胞毒性效力

* SABC代表特異性抗體結合能力，在此情況下係由抗BCMA mAb ANC3B1及QIFIKIT(Agilent)測定。8.3.2. 使用 FACS 評估細胞毒性

自健康人血液供體A分離人PBMC及分離之NK細胞並冷凍以待稍後實驗。解凍後，藉由錐蟲藍染色測定PBMC係約85%活力且稍後藉由FACS，利用7AAD確定。將PBMC與BCMA⁺ 多發性骨髓瘤腫瘤細胞株以約0.4或約4-5之E:T比率一起共培養並使其暴露於自0.1 – 3000pM之3倍連續稀釋之測試物，在37℃及5% CO₂ 下保持約20小時。使用抗體染色及FACS測定MM腫瘤細胞上之BCMA表現並監測多發性骨髓瘤靶細胞之細胞毒性。利用軟體程式FlowJo及GraphPad Prism 6分析資料。結果示於圖32A-32E、33A-33C及34A-34C中。圖32A-32E顯示，CD16A/BCMA抗體I在約0.4之E:T比率下有效(由一組多發性骨髓瘤患者測定)。圖33A-33C及34A-34C顯示，暴露於CD16A/BCMA抗體I之人NK細胞特異性靶向且耗盡BCMA⁺ 靶細胞。

兩種方法評估展示，CD16A/BCMA抗體I在多種靶表現量內在活體外有效。觀察到的功效與E:T比率不相關，且與BCMA表現不相關。此外，CD16A/BCMA抗體I針對多發性骨髓瘤細胞株顯示出與達雷木單抗類似的效力。參見圖33A-33C。 8.4. 針對低 BCMA 表現腫瘤細胞之活體外細胞毒性

藉由鈣黃綠素釋放檢定及FACS評估CD16A/BCMA抗體I針對低BCMA表現Raji腫瘤細胞株之活體外細胞毒性。在本研究中使用了如上文所述的用於評估針對多發性骨髓瘤靶細胞之活體外細胞毒性之鈣黃綠素釋放檢定。新鮮製備之NK細胞與Raji伯基特氏淋巴瘤腫瘤細胞株之E:T比率係約5。結果顯示於圖35A-35D中。關於CD16A/BCMA抗體I、CD16A/BCMA抗體II及CD16A/BCMA抗體III觀察到BCMA+靶細胞之活體外溶解，不過幾乎不能偵測到BCMA表面表現。

對於FACS檢定，自健康人血液供體分離人NK細胞。在檢定方案前，將NK及Raji細胞分別與0.5 mg/ml低內毒素hIgG一起預培育至少1小時。將NK細胞與Raji伯基特氏淋巴瘤腫瘤細胞株以約5之E:T比率共培養，且使其暴露於自10 – 1000pM的3倍連續稀釋之測試物，在37℃及5% CO₂ 下保持約20小時。使用抗體染色及FACS監測RAJI靶細胞之細胞毒性。利用軟體程式FlowJo及GraphPad Prism 6分析資料。結果顯示於圖36A-36C中。如圖36C中所示，CD16A/BCMA抗體I針對低BCMA表現Raji腫瘤細胞株展現活體外細胞毒性。 8.5. 針對自體 BCMA⁺ 正常人漿細胞之活體外活性

藉由FACS評估CD16A/BCMA抗體I針對自體BCMA⁺ 正常人漿細胞之活體外活性。自健康人血液供體之周圍血液分離人NK。使用來自同一人類供體之骨髓分離人漿細胞。在檢定方案前，將NK、漿細胞及NCI-H929細胞分別與0.5 mg/ml低內毒素hIgG一起預培育至少1小時。同種異體：將NK細胞與NCI-H929腫瘤細胞株以約3之E:T比率共培養，且同時使其暴露於範圍自3 – 3000pM的3倍連續稀釋之測試物，在37℃及5% CO2下保持約20小時。自體：將NK細胞與人漿細胞以約23之E:T比率共培養並與如上文所描述之測試物一起培育。使用以抗CD56 E-450及CD138-APC進行之抗體染色，隨後使用FACS監測H929及漿細胞之細胞毒性。利用軟體程式FlowJo及GraphPad Prism 6分析資料。

結果顯示於圖37A及37B中。CD16A/BCMA抗體I針對自體BCMA⁺ 正常人漿細胞展現出活體外活性。 8.6. 在無 BCMA⁺ 靶細胞存在下 CD16A 活化之缺乏

本發明人亦研究CD16A/BCMA抗體I是否能在無BCMA⁺ 靶細胞存在下活化NK細胞。首先，研究在BCMA⁺ 靶細胞存在下CD16之活化及NK細胞上CD16含量之維持。NK細胞係來源於兩個獨立的健康人血液供體。將NK細胞與MM.1S BCMA⁺ 靶細胞共培養並使其暴露於0、0.03或0.1 nM抗BCMA/CD16A抗體I或Ab-1 (陰性對照/CD16a)或抗CD38 (DARA陽性對照)，在37℃下保持20小時。使用抗體染色及FACS測定存活CD56^dim /CD16⁺ 細胞及CD56^dim /CD16⁺ /CD69⁺ /CD25⁺ 細胞之數量，分別示於圖34A及34B中。BCMA⁺ 靶細胞之耗盡示於圖34C中。利用軟體程式FlowJo及GraphPad Prism 6分析資料。結果顯示於圖38A-38C中。CD16A/BCMA抗體I在BCMA⁺ 靶細胞存在下活化並維持NK細胞上之CD16含量。

接下來，研究在無BCMA⁺ 靶細胞存在下CD16之活化及NK細胞上CD16含量之維持。NK細胞係來源於兩個獨立的健康人血液供體。單獨培養NK細胞並使其暴露於0、0.03或0.1 nM抗BCMA/CD16a抗體I或Ab-1 (陰性對照/CD16a)或抗CD38 (DARA陽性對照)，在37℃下保持20小時。使用針對CD標記物(CD56、CD16、CD69及CD25)之抗體染色及FACS測定存活CD56^dim /CD16⁺ 細胞及CD56^dim /CD16⁺ /CD69⁺ /CD25⁺ 細胞之數量，分別示於圖32A及32B中。利用軟體程式FlowJo及GraphPad Prism 6分析資料。結果顯示於圖39A-39C中。如圖39A-39C中所示，CD16A/BCMA抗體I在無BCMA⁺ 靶細胞存在下既不活化也不降低NK細胞上之CD16含量。相較於達雷木單抗，CD16A/BCMA抗體I顯示NK細胞上CD16⁺ 數量及表現之最小降低且在無BCMA⁺ 靶細胞存在下展現明顯較少數量的CD69⁺ 25⁺ NK細胞(例如約100倍 (n = 2個供體；單一實驗))。在BCMA⁺ 靶細胞存在下，CD16A/BCMA抗體I顯示與達雷木單抗類似之活性。參見圖38C。 8.7. 在血清 Ig 存在下之活性

研究CD16A/BCMA抗體I與NK細胞之結合以及在血清或Ig存在下CD16A/BCMA抗體I之細胞毒性及NK存活率。

自健康人血液供體分離出人NK細胞。在檢定方案之前，將NK細胞及NCI-H929細胞或MM.1S細胞分別與10 mg/mL血清Ig、50%人自體血清或100%人血清一起預培育2小時。將NK細胞與NCI-H929或MM.1S細胞以約5之E:T比率共培養，且使其暴露於自0.1 – 100nM的10倍連續稀釋之測試物，在37℃及5% CO₂ 下保持約20小時。用CD138及CD56對抗體染色，隨後使用FACS監測MM.1S或NCI-H929靶細胞之細胞毒性及NK存活率。利用軟體程式FlowJo及GraphPad Prism 6分析資料。

如圖40A中所示，CD16A/BCMA抗體I在10 mg/mL Ig或血清存在下能夠以相較於無Ig或血清存在之情形降低之親和力結合至NK細胞。如圖40B中所示，CD16A/BCMA抗體I在血清存在下能夠以相較於無Ig或血清存在之情形降低之效力殺滅BCMA⁺ 靶細胞。如圖40C及40D中所示，在50%自體人血清存在下，CD16A/BCMA抗體I耗盡BCMA⁺ 靶細胞，且無NK細胞損失。如圖40D及40E中所示，CD16A/BCMA抗體I不耗盡NK細胞，而達雷木單抗可以。因此，人Ig不會干擾CD16A/BCMA抗體I之NK活性。

在無BCMA⁺ 靶細胞存在下，血清影響CD16A表現及NK細胞之活化。參見圖41A及41B。如圖41A中所示，血清降低CD16A表現。如圖41B中所示，血清增加非靶向介導之NK細胞活化。因此，在血清存在下之低CD16表現表明非CD16A介導之NK細胞活化。 8.8. 利用細胞介素之組合療法

達雷木單抗及埃羅妥珠單抗(elotuzumab)有效地與免疫調節藥物(IMiD)及蛋白酶體抑制劑組合。預期組合活性之機制可適用於NK細胞接合物。舉例而言，IMiD影響TNF-𝛼、IL-12及IL-6之產生且刺激T細胞分泌IL-2及IFN-𝛾，由此間接地增加NK細胞數目及功能(Liu等人, Jour. Of Leukocyte. (2018);103(5):821-828)。蛋白酶抑制劑減少I類MH之表現。CD16A/BCMA抗體I與iMiD組合之合理性包括以下：IL-15經由增殖增加NK細胞數量，抗TIGIT抗體係針對CD8+ T細胞及NK細胞之檢查點抑制劑，且抗FcRH5/CD3抗體使用NK細胞實現其細胞毒性潛力且驅動額外T細胞浸潤至腫瘤中。

為了研究細胞介素治療是否能影響CD16A/BCMA抗體之活性，將IL-15添加至CD16A/BCMA抗體I治療中。如圖42A及42B中所示，IL-15增加CD16A/BCMA抗體I在MM細胞中之活性。在添加IL-15情況下，關於CD16A/BCMA抗體I觀察到MM耗盡之增加，但達雷木單抗則不然。 8.9. 使用 CD16A/BCMA 抗體 I 治療達雷木單抗 R/R 多發性骨髓瘤患者

CD16A/BCMA抗體不同於達雷木單抗(又稱為「Dara」)。舉例而言，達雷木單抗在多發性骨髓瘤(又稱為「MM」)中具有補體依賴性細胞毒性活性(de Weers, M.等人,J. immun. 2011, 186(3):1840–1848)且能夠藉由經CD38交聯進行信號傳導來誘導細胞凋亡(Overdijk, M.B.等人,Journal of immunology 2016;197(3):807–813)。然而，CD16A/BCMA抗體I不具有該等活性。

不同於達雷木單抗，CD16A/BCMA抗體I之活性不受CD16A多態性影響，CD16A多態性會降低Fc介導之藥物的活性。參見圖31A及31B。此外，不同於CD38療法(例如達雷木單抗)，CD16A/BCMA抗體I不會耗盡NK細胞。參見圖40A、40B、40C、40D及40E。此外，IL-15治療增加CD16A/BCMA抗體I之活性，但達雷木單抗不然。參見圖42A及42B。

鑒於使本文所揭示之抗BCMA/CD16A抗體，例如CD16A/BCMA抗體I有別於達雷木單抗之特徵，該等抗BCMA/CD16A抗體，例如CD16A/BCMA抗體I係用於治療復發性/難治性(「R/R」) MM患者(例如達雷木單抗R/R多發性骨髓瘤患者)之候選物。達雷木單抗難治性表型看來係由CD38下調及補體抑制性蛋白質之上調介導(Nijhof等人, Leukemia (2015);29(10);2039-2049；Nijhof等人, Blood (2016);128(7): 959-970)。此類CD38表現損失以及NK細胞互相殘殺亦促成耐達雷木單抗性。本文所揭示之抗BCMA/CD16A抗體的作用機制指示，此類抗BCMA/CD16A抗體可用於治療達雷木單抗R/R多發性骨髓瘤患者。

達雷木單抗難治性患者在周圍血液中具有較低NK含量(Casneuf等人, Blood Adv. (2017); 24;1(23):2105-2114)。Steward等人, Blood Cancer J. (2019);9(2):17揭示作為與單甲基奧瑞他汀E(MMAE)之抗FcRH5抗體-藥物結合物的DFRF4539A用於治療R/R MM之I期研究。比較在DFRF4539A之I期研究中未用Dara治療之MM患者，Dara難治性MM患者及R/R MM患者之周圍血液中之NK細胞數量且結果顯示於圖43中。

在DFRF4539A之I期研究中R/R MM患者骨髓中之NK/腫瘤E:T比率顯示於圖44中。圖45A及45B中所示CD16A/BCMA抗體I之活體外細胞株殺滅資料指示，CD16A/BCMA抗體I在DFRF4539A之I期群中所見之E:T比率下有效。 8.10. 新鮮 NK 細胞影響細胞毒性

將CD16A/BCMA抗體I及CD16A/BCMA抗體II針對新鮮NK細胞之細胞毒性與第二天NK細胞相比較。新鮮NK細胞係在同一天自新鮮分離之PBMC純化之NK細胞。第二(2)天NK細胞表示自在第一天分離之PBMC純化並在RPMI培養基中培養過夜的NK細胞。結果顯示於圖46A、46B、46C及46D中。如圖46A、46B、46C及46D中所示，新鮮NK細胞顯示出比第二天NK細胞高的細胞毒性。實例 9 — 使用 CD16A/BCMA 結合抗體治療多發性骨髓瘤

多發性骨髓瘤(「MM」)係漿細胞惡性腫瘤。在美國及歐洲，每年診斷出約56,000例新增MM病例。儘管總體存活率有改善，但仍有眾多較高未滿足之需求，包括：可用療法復發性/難治性者及展現高風險第一線(「1L」)疾病者。三種治療類別已轉化成MM療法且形成當前標準護理(「SOC」)之基礎，在某些情況下包括多線治療中所採用的類別：(1)免疫調節劑(「IMiD」，來那度胺(lenalidomide))—多潛能MOA，包括抗增殖作用、增強適應性及先天性免疫系統；(2)蛋白酶體抑制劑(例如硼替佐米(bortezomib))；及(3)達雷木單抗(一種抗CD38抗體，其ADCC、CDC及細胞凋亡作用係由交聯CD38引發)。

NK細胞已廣泛用於免疫療法中。活化受體與抑制受體信號之平衡調控NK細胞活化及細胞毒性，例如抑制信號在正常健康組織中佔優勢。NK細胞已成為多發性骨髓瘤中Fc介導之癌症療法的關鍵效應子，例如達雷木單抗及埃羅妥珠單抗(一種抗SLAMF7抗體)。NK細胞活化及腫瘤殺滅可經由以下作用機制(「MOA」)發生：(a)腫瘤細胞上I類MHC損失(例如以避免T細胞反應)；(b)受損細胞連接活化NK細胞受體(NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46及DNAM-1)引起之應激配體的過度表現；及(c)腫瘤相關抗原(TAA)特異性治療抗體經由其Fc區結合至活化受體CD16A (FcγRIIIa)引起之NK細胞活化。NK細胞接合物模擬MOA (c)，又如本文所論述，採用與達雷木單抗不同之MOA。無法經由習知Fc-CD16A相互作用募集NK細胞的本發明之NK接合物可與SOC組合治療MM患者，尤其是第二線(「2L」)患者。此外，預期一大群2L及第三線(「3L」)患者在復發時係達雷木單抗難治的，又預期其對本文所揭示之NK細胞接合物，例如CD16A/BCMA抗體I及III起反應(歸因於MOA之差異)。

本發明揭示之CD16A抗原結合蛋白(CD16A/BCMA抗體I及III)係結合CD16A之NK細胞接合物。CD16A在約95%之NK細胞及巨噬細胞上組成性表現且為NK細胞活化受體。

CD16A/BCMA抗體I、II及III結合至B細胞成熟抗原(BCMA)。如本文所論述，BCMA係TNF受體超家族之成員且在漿細胞長期細胞存活中起到作用(O’Connor, JEM 2004;199(1):91–98)。BCMA在正常漿細胞中表現且在多發性骨髓瘤中上調且具有高發生率。BCMA係得到充分驗證的R/R多發性骨髓瘤免疫療法，包括BCMA靶向嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法及BCMA抗體-藥物結合物(ADC)療法之靶。

量測冷凍原發性骨髓瘤骨髓單核細胞(BMMC)中BCMA、CD38及FcRH5之表現量且結果顯示於圖47中。如圖47中所示，評估來自20位供體及對照(骨髓瘤細胞株MOLP-2)的冷凍之原發性骨髓瘤骨髓單核細胞(BMMC)中FcRH5、BCMA (Biolegend 19F2)、CD38細胞表面之表現。簡言之，解凍BMMC，用無菌PBS洗滌，接著使其再懸浮達到1×10^6個細胞/毫升之最終濃度。用活力及骨髓瘤標記物(CD45、CD319、CD138、CD38、BCMA、FcRH5)對BMMC染色。在固定細胞並洗滌之後，在Canto II上讀取細胞。在FlowJo中，藉由選擇存活/單峰/CD45-/CD319+細胞(骨髓瘤細胞)來分析FcRH5、BCMA及CD38。在統計繪圖軟體Prism中標繪FcRH5、BCMA及CD38之MESF (Log10)值。

如圖48A及48B中所示，BCMA在正常人漿細胞中表現(圖48A)，且在MM中上調且發現高發生率(圖48B)。圖48B中所示實驗中使用的原發性MM細胞係冷凍的原發性骨髓瘤BMMC，根據上文關於圖47所述之方案對其染色並選通且在FlowJo中標繪最大值百分比。圖48B中灰色陰影之峰係螢光補償(FMO)對照且另一個峰係BCMA表現。CD16A/BCMA抗體I展現與所測試的抗BCMA抗體類似的結果。

儘管BCMA靶向CAR-T細胞療法及CD3/BCMA雙特異性抗體已顯示令人注目之抗MM活性，但其亦伴隨顯著的細胞介素釋放症候群(「CRS」)情況。作為NK接合物的本發明揭示之CD16A抗原結合蛋白(例如CD16A/BCMA抗體I)之MOA能夠有別於此類CRS相關療法。舉例而言，有利的安全性特徵及CRS之不存在使本發明揭示之CD16A抗原結合蛋白(例如CD16A/BCMA抗體I)能夠與SOC或其他MM免疫療法組合(例如本文所顯示之細胞介素(例如IL-15及IL-12)，參見例如圖42A及42B)。本文所揭示的基於NK細胞之方法亦可與T細胞療法及檢查點抑制劑療法(例如CD3雙特異性抗體、抗PD-1抗體(例如納武單抗、派姆單抗)、抗TIGIT抗體、抗PD-L1抗體(例如阿特珠單抗)、抗VEGF抗體(例如貝伐單抗)、FcRH5/CD3雙特異性抗體等)協同作用。

鑒於前述，使用以下一個或多個標準選擇NK細胞接合物以用於治療多發性骨髓瘤： ● NK細胞接合物能夠結合至兩個靶：NK細胞上之CD16A，及在多發性骨髓瘤細胞上之BCMA， ● NK細胞接合物對於CD16A為至少二價，例如包含至少兩個CD16A抗原結合部分， ● NK細胞接合物係NK細胞雙特異性抗體，其不與CD16B交叉反應，但可與來自非人類靈長類動物之CD16A交叉反應， ● NK細胞接合物係強效且普遍使用的，且具有靶依賴性活體外BCMA⁺ 腫瘤細胞及原發性骨髓瘤殺滅作用(例如殺滅≥約60%細胞且EC₅₀ ≤ 5nM)， ● NK細胞接合物不顯著殺滅NK細胞，例如減少或避免NK細胞互相殘殺， ● NK細胞接合物具有可接受之安全性特徵，例如具有優於其他T細胞接合物之活體外細胞介素釋放特徵(例如NK細胞接合物沒有CRS)，不良事件係可監測、可管理且可逆轉的， ● NK細胞接合物可經靜脈內投與多發性骨髓瘤個體，及 ● NK細胞接合物需要每週一次(QW)或更低之投藥頻率。

結合剛剛描述之選擇策略，可使用以下藥效學(PD)生物標記物：血清M蛋白及游離輕鏈(FLC)、單株漿細胞減少、治療後骨髓樣品中之NK細胞活化及募集，及周圍NK細胞活化。儘管剛剛描述之選擇策略可包括診斷劑，但基於多發性骨髓裡中BMCA之高發生率，診斷劑並非必需的。

某些CD16A/BCMA抗原結合蛋白(例如CD16A/BCMA抗體I及CD16A/BCMA抗體III)滿足上述標準。

總體而言，本發明揭示之CD16A/BCMA抗原結合蛋白(例如CD16A/BCMA抗體I及CD16A/BCMA抗體III)可用於治療多發性骨髓瘤以實現持久緩解以及有利的安全性特徵。

雖然已出於清楚理解之目的，藉助於說明及實例略為詳細地描述了前述本發明所揭示之主題內容，但不應將該等描述及實例解釋為限制本發明所揭示之主題內容的範圍。本文引用的所有專利及科學文獻之揭示內容皆以全文引用的方式清楚地併入本文中。序列概述：

圖 1-2 顯示scDb-mFc抗原結合蛋白，其係單體且包含呈scDb形式之二價CD16A抗原結合部分與單體Fc部分融合，其中在圖1中，由兩個CD16A抗原結合部分組成之scDb與由變異體CH2-CH3多肽組成的Fc部分之N末端融合且包含單一靶抗原結合部分之scFv與Fc部分之C末端融合，且在圖2中，由兩個CD16A抗原結合部分組成之scDb與由變異體CH2-CH3多肽組成的Fc部分之C末端融合且包含單一靶抗原結合部分之scFv與Fc部分之N末端融合。該靶係腫瘤相關靶。

圖 3-6 顯示KiH-scDb-Fc抗原結合蛋白，其係異二聚體且包含呈scDb形式之二價CD16A抗原結合部分與異二聚(KiH) Fc部分融合，其中在圖3中，由兩個CD16A抗原結合部分組成之scDb與在由CH2-CH3異二聚體組成之Fc部分之N末端處的鉸鏈或中間鉸鏈融合，且包含單一靶抗原結合部分之scFv與Fc部分之C末端融合；在圖4中，由兩個CD16A抗原結合部分組成之scDb與在由CH2-CH3異二聚體組成之Fc部分的兩個多肽之一之N末端處的鉸鏈或中間鉸鏈融合，且包含單一靶抗原結合部分之scFv與在CH2-CH3異二聚(KiH) Fc部分之另一個多肽之N末端處的鉸鏈融合；在圖5中，由兩個CD16A抗原結合部分組成之scDb與由CH2-CH3異二聚體組成之Fc部分的C末端融合，且包含單一靶抗原結合部分之scFv與在CH2-CH3異二聚(KiH) Fc部分之另一個多肽之N末端處的鉸鏈或中間鉸鏈融合；且在圖6中，由兩個CD16A抗原結合部分組成之scDb與由CH2-CH3異二聚體組成之Fc部分之C末端融合且包含第一靶抗原結合部分之第一scFv與在Fc部分N末端處之鉸鏈或中間鉸鏈融合，且包含第二(且不同於第一)靶抗原結合部分之scFv與在CH2-CH3異二聚(KiH) Fc部分之另一個多肽之N末端處的鉸鏈或中間鉸鏈融合。第一靶及第二靶係兩種不同的腫瘤相關靶。

圖 7-8 顯示三特異性scDb-TriB抗原結合蛋白，其係包含CD16A、靶及HSA抗原結合部分之異二聚Fab片段-scDb融合物，其中在圖7中，由兩個CD16A抗原結合部分組成之二價scDb與Fab片段之兩個多肽之一的C末端融合，且由兩個靶抗原結合部分組成之二價scDb與Fab片段之另一個多肽的C末端融合，且在Fab片段N末端處的Fv提供HSA抗原結合部分；且在圖8中，由兩個CD16A抗原結合部分組成之二價scDb與Fab片段之兩個多肽之一的C末端融合，且由單一靶抗原結合部分組成之scFv與Fab片段之另一個多肽的C末端融合，且在Fab片段N末端處的Fv提供HSA抗原結合部分。該靶係腫瘤相關靶。

圖 9-10 顯示Db-Fc抗原結合蛋白，其係同二聚體且包含呈Db形式之二價CD16A抗原結合部分與在同二聚Fc部分N末端處之中間鉸鏈或與該同二聚Fc部分之C末端及呈scFv形式之兩個靶抗原結合部分融合，其中在圖9中，scFv與同二聚化CH2-CH3多肽之C末端融合且構成Db之多肽與在CH2-CH3多肽N末端處之中間鉸鏈融合，其中Db之兩個多肽與包含兩個CD16A抗原結合部分之Db非共價締合。該靶係腫瘤相關靶，且在圖10中，scFv靶抗原結合部分與在同二聚化CH2-CH3多肽N末端處之中間鉸鏈融合且構成包含兩個CD16A抗原結合部分之Db的多肽與Fc同二聚體之C末端融合。該靶係腫瘤相關靶。

圖 11-12 顯示Bi-scFv-Fc抗原結合蛋白，其係包含各自呈scFv形式的兩個CD16A抗原結合部分及兩個靶抗原結合部分與Fc同二聚體融合之同二聚體且為四價的，其中在圖11中，兩個CD16A抗原結合scFv與在CH2-CH3多肽之一之N末端處的鉸鏈融合且兩個靶抗原結合scFv與CH2-CH3多肽之C末端融合；且在圖12中，CD16A抗原結合部分係C末端與Fc同二聚體融合之scFv，而靶抗原結合scFv與在Fc同二聚體N末端處之鉸鏈融合。該靶係腫瘤相關靶。

圖 13 顯示scFv-IgAb抗原結合蛋白，其包含具有呈scFv形式之兩個CD16A抗原結合部分與H鏈C末端融合之IgG抗體融合物，而兩個靶抗原結合部分係由IgG之Fab臂中的每個Fv提供。該靶係腫瘤相關靶。

圖 14 顯示Bi-scFv-IgAb抗原結合蛋白，其包含四個scFv抗原結合部分與其融合之IgG抗體融合物，其中呈scFv形式的兩個CD16A抗原結合部分各自與H鏈之C末端融合，而結合至第一靶之兩個抗原結合部分係由IgG之Fab臂中的各Fv提供且結合至第二靶之兩個抗原結合部分各自與兩個CL鏈之C末端融合。

圖 15A 及 15B 顯示KiH-scFv-Fc抗原結合蛋白，其中四個抗原結合scFv與異二聚(KiH) Fc部分融合，其中兩個CD16A抗原結合部分在N末端或C末端與Fc部分融合。圖15A顯示KiH-scFv-Fc，其具有兩個CD16A抗原結合部分各自與在CH2-CH3多肽之一之N末端處之鉸鏈融合，且包含第一靶抗原結合部分之scFv與CH2-CH3多肽之一之C末端融合，且包含第二靶抗原結合部分之另一scFv與另一CH2-CH3多肽之C末端融合。圖15B顯示KiH-scFv-Fc，其具有兩個CD16A抗原結合部分各自與CH2-CH3多肽之一之C末端融合，且包含第一靶抗原結合部分之scFv與在CH2-CH3多肽之一之N末端處的鉸鏈融合，且包含第二靶抗原結合部分之另一scFv與在另一CH2-CH3多肽之N末端處的鉸鏈融合。

圖 16 顯示scFv-IgAb抗原結合蛋白，其包含具有呈scFv形式之兩個靶抗原結合部分與H鏈C末端融合之IgG抗體融合物，而兩個CD16A抗原結合部分係由IgG之Fab臂中的每個Fv提供。該靶係腫瘤相關靶。

圖 17A-17N 顯示實例6中抗體介導之NK-NK細胞溶解結果。圖17A顯示如圖1中所示的呈雙功能抗體(scDb)形式之兩個抗CD16A部分與單體Fc在N末端處融合(且靶向TAA之scFv融合至C末端)。圖17B顯示如圖2中所示的呈雙功能抗體(scDb)形式之兩個抗CD16A部分與單體Fc在C末端處融合(且靶向TAA之scFv融合至N末端)。圖17C顯示如圖3中所示的呈雙功能抗體(scDb)形式之兩個抗CD16A部分在N末端處與不對稱Fc融合(且靶向TAA之scFv融合至C末端)。圖17D顯示如圖4中所示的呈雙功能抗體(scDb)形式之兩個抗CD16A部分與不對稱Fc在N末端處融合(且靶向TAA之scFv融合至N末端)。圖17E顯示如圖5中所示的呈雙功能抗體(scDb)形式之兩個抗CD16A部分與不對稱Fc在C末端處融合(且靶向TAA之scFv融合至N末端)。圖17F顯示如圖7中所示的呈雙功能抗體(scDb)形式之兩個抗CD16A部分與Fab在CL之C末端處融合(且靶向TAA之scDb融合至CH1之C末端)。圖17G顯示如圖8中所示的呈雙功能抗體(scDb)形式之兩個抗CD16A部分與Fab在CH1之C末端處融合(且靶向TAA之scDb融合至CL之C末端)。圖17H顯示如圖9中所示的呈雙功能抗體(Db)形式之兩個抗CD16A部分與Fc在N末端處融合(且靶向TAA之scFv融合至C末端)。圖17I顯示如圖10中所示的呈雙功能抗體(Db)形式之兩個抗CD16A部分與Fc在C末端處融合(且靶向TAA之scFv融合至N末端)。圖17J顯示如圖11中所示的呈scFv形式之兩個抗CD16A部分與Fc在N末端處融合(且靶向TAA之scFv融合至C末端)。圖17K顯示如圖12中所示的呈scFv形式之兩個抗CD16A部分與Fc在C末端處融合(且靶向TAA之scFv融合至N末端)。圖17L顯示如圖13中所示的呈scFv形式之兩個抗CD16A部分與Fc在C末端處融合(且靶向TAA之Fab融合至N末端)。圖17M顯示如圖15a及15b中所示的呈scFv形式之兩個抗CD16A部分與不對稱Fc在N末端處融合(且靶向2個TAA之2個scFv在C末端處)且呈scFv形式之兩個抗CD16A部分與不對稱Fc在C末端處融合(且靶向2個TAA之2個scFv在N末端處)。圖17N顯示靶向TAA之兩個scFV與Fc在C末端處融合的在IgG之Fab臂中的兩個抗CD16A部分(如圖16中所示)與呈scFv形式之兩個抗CD16A部分與Fc在C末端處融合(且靶向TAA之Fab臂在N末端處；如圖13中所示)的比較。

圖 18A 及 18B 不同抗CD16 scFv之SPR分析。抗CD16結合scFv抗體(Ab16^hi 、Ab16^mid 、3G8、Ab16^lo )相較於野生型IgG1及工程改造之人IgG1 Fc (S239D/I332E)之正規化相對結合信號之SPR感測圖。圖18A顯示與人CD16A-158V之結合增強。圖18B顯示與人CD16A-158F之結合。量測312.5 nM之單種濃度的分析物。

圖19A-19C 顯示在140位之酪胺酸(Y)對於形成構象抗原決定基以及scFv抗體之CD16A特異性反應性至關重要。分析表現為ECD序列與單體Fc或膜錨之融合蛋白形式的不同重組CD16變異體。圖19A顯示測試在硝基纖維素膜上含有確定之CD16抗原變異體的蛋白質斑點與指定CD16結合scFv之反應性。圖19B顯示藉由抗體染色及流動式細胞測量術分析不同抗CD16 scFv、對照scFv或mAb與在CHO細胞上表現的經由與EGFR跨膜結構域或GPI融合錨定之CD16抗原變異體或EGFR抗原的反應性。圖19C顯示在藉由SDS-PAGE及西方墨點法(Western blotting)分離後，不同抗CD16抗體與CD16抗原變異體之結合。

圖 20 顯示抗CD16結合結構域(Ab16lo、Ab16mid、Ab16hi、3G8)相較於人IgG1 Fc野生型、增強之人IgG1 Fc(S239D/I332E)、沉默之人IgG1 Fc (L234F/L235E/D265A)與人CD16A-158V及人CD16A-158F之結合的SPR感測圖。KD值係使用1:1結合模型計算且顯示於表5中。橫坐標：反應(RU)，縱坐標：時間[秒]。

圖 21 顯示在本文所述之某些實驗中以重組抗原形式使用的人及食蟹獼猴CD16A及人CD16B變異體之ECD序列的序列比對。人CD16A或CD16B中具有多態性之位置分別用細箭頭及粗箭頭標記。符號『#』標記人CD16B連接至GPI膜錨之位置，標記『d』之位置係自成熟CD16B抗原序列裂解。食蟹獼猴CD16A ECD序列之變化以粗體表示。在人CD16A與人CD16B之間具有序列變化的位置係以括號表示(對於測試抗CD16抗體之CD16A特異性結合至關重要)。使用CLUSTAL O(1.2.4)多重序列比對工具進行比對。

圖 22 顯示在ELISA中不同抗CD16 scFv抗體與mAb 3G8競爭結合至CD16A。塗有CD16A-158V ECD-Fc融合抗原之盤與1 nM mAb 3G8及在指定濃度範圍內的不同抗CD16 scFv之連續稀釋液一起培育。用過氧化酶結合山羊抗小鼠IgG(H+L)偵測CD16A結合之mAb 3G8。在450 nm (Ext (450nm))下量測TMB受質反應，作圖並分析。

圖 23 顯示ROCK®平台概述。

圖 24A-24C 顯示不同CD16A二價結合ROCK^® 接合物之正規化箱底結合解離期的SPR感測圖。將含二價抗CD16A結構域之scFv-IgAb_C、Db-Fc_A、scFv-IgAb_D、KiH-scDb-Fc_A、TandAb_C與在固定之人CD16A-158V及食蟹獼猴CD16上之IgAb_E (Fc增強；S239D/I332E)及單價抗CD16A片段scFv Ab16^hi 相比較。圖24A顯示在固定之人CD16A-158V上得到之SPR感測圖。圖24B顯示在食蟹獼猴CD16上得到之SPR感測圖。圖24C顯示在解離3小時後保留在受體上之抗體的圖例及百分比。量測50 nM之單種濃度的分析物。

圖 25 顯示ROCK^® 抗體與IgG在NK細胞上之細胞表面保持力的比較。用100 µg/mL TandAb或400 µg/mL IgG預裝載富集之原代人NK細胞，在冰上保持45分鐘，洗滌並在37℃下培育指定時間段以允許解離。在洗滌後，藉由His標記之可溶性BCMA，隨後10 µg/mL mAb抗His及15 µg/mL FITC結合之山羊抗小鼠IgG偵測殘留抗體。自時間點0起之平均螢光強度設定為100%且使用非線性回歸標繪殘留抗體之百分比。

圖 26A-26C 顯示呈ROCK^® 形式之CD16A表觀親和力可藉由可變結構域、定位及連接體長度調諧。在ELISA中分析可溶性CD16抗原與以不同位置(N：在Fc之N末端處的抗CD16 Fv，C：在Fc之C末端處的抗CD16 Fv)、抗體形式及不同結構域次序含有不同CD16結合Fv (Ab16^mid 、Ab16^hi )之ROCK^® 抗體的結合。在每一組下顯示以虛線符號描繪的CD16結合Fv之代表性象形圖。圖26A顯示藉由基於Fab或scFv之CD16接合得到的CD16A表觀親和力之概述。圖26B顯示藉由基於雙功能抗體(Db)之CD16接合得到的CD16A表觀親和力之概述。圖26C顯示藉由包含不同連接體長度(10aa或30aa)及結構域次序之抗CD16 Fv (HL：scFv結構域次序VH-VL，LH：scFv結構域次序VL-VH)的基於C末端scFv之CD16結合得到的CD16A表觀親和力之概述。所有分析抗體含有沉默之Fc或在與Fab之C末端融合情況下缺乏Fc。以黑色或陰影描繪之結合親和力包含靶向BCMA、CD19、CD20、EGFR、HSA或RSV之抗體結構域。

圖 27A-27C 顯示在人IgG存在或不存在下ROCK^® 抗體與原代人NK細胞之結合。圖27A顯示在37℃下，在10 mg/mL多株人IgG存在或不存在下，用遞增濃度之指定少Fc ROCK^® 對原代人NK細胞染色。圖27B顯示在37℃下，在10 mg/mL多株人IgG存在或不存在下，用遞增濃度之指定Fc融合物ROCK^® 對原代人NK細胞染色。圖27C顯示在37℃下，在10 mg/mL多株人IgG存在或不存在下，用遞增濃度之指定IgG樣ROCK^® 構築體對原代人NK細胞染色。藉由流動式細胞測量術偵測細胞結合之抗體，並使用平均螢光強度(MFI)，藉由非線性回歸計算表觀親和力(K_D )。

圖 28 顯示在活體外有關NK互相殘殺之各種ROCK^® 抗體形式之比較分析。在1:1之E:T下共培育4小時後，在針對自體NK細胞之不同ROCK^® 抗體形式存在下富集原代人NK細胞之活體外鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定。概述若干獨立實驗之平均EC₅₀ 值且以各個點標繪。ROCK^® 抗體形式係基於抗CD16結構域之位置及形式/結構域次序歸類。圖中僅包括含有高親和力抗CD16結構域及沉默之Fc的構築體。HL：scFv結構域次序VH-VL，LH：scFv結構域次序VL-VH。N-term. =N末端，C-term. = C末端。

圖 29A-29E 顯示在針對表現相應腫瘤靶之細胞株的若干ROCK^® 抗體存在下富集之原代人NK細胞質活體外細胞毒性。圖29A顯示如藉由SABC值(≥3次檢定之平均值)所指示的在利用5:1之E:T比率的NK細胞及表現不同水準BCMA之靶細胞株NCI-H929之4小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定中指定BCMA靶向性ROCK^® 抗體的代表性s形劑量反應曲線。圖29B顯示如藉由SABC值(≥3次檢定之平均值)所指示的在利用5:1之E:T比率的NK細胞及表現不同水準BCMA之靶細胞株MM.1S之4小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定中指定BCMA靶向性ROCK^® 抗體的代表性s形劑量反應曲線。圖29C顯示如藉由SABC值(≥3次檢定之平均值)所指示的在利用5:1之E:T比率的NK細胞及表現不同水準BCMA之靶細胞株MC/CAR之4小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定中指定BCMA靶向性ROCK^® 抗體的代表性s形劑量反應曲線。圖29D顯示在利用5:1之E:T比率之NK細胞及SW-982靶細胞之4小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定中指定EGFR靶向性ROCK^® 抗體、比較劑或單價結合之對照的代表性s形劑量反應曲線。圖29E顯示ROCK^® 抗體與針對活體外腫瘤靶細胞之NK細胞結合親和力及細胞毒性效力的相關性。顯示ROCK^® 抗體形式針對原代人NK細胞之表觀親和力(K_D )。該等ROCK^® 抗體之EC₅₀ 值係在利用2:1之E:T比率之NK細胞及BCMA表現性RPMI-8226靶細胞之3小時鈣黃綠素釋放細胞毒性量測(左圖)中或在利用5:1之E:T比率之NK細胞及BCMA表現性NCI-H929靶細胞之4小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定(右圖)中測定。SABC：特異性抗體結合能力。

圖 30 顯示在單次靜脈內投與300 µg測試物之後不同ROCK^® 接合物形式:抗體濃度的藥物動力學隨時間變化(1週或3週觀察期)之比較。

圖 31A-31B 顯示CD16A/BCMA抗體I針對CD16A-158V/V健康供體(實線)及CD16A-158F/F (虛線)之細胞毒性。圖31A顯示NCI-H929細胞株之結果。圖31B顯示MM.1S細胞株之結果。

圖 32A-32E 顯示CD16A/BCMA抗體I針對多發性骨髓瘤細胞株之活體外細胞毒性。每165K個PBMC之CD56+CD3e- NK細胞的近似數量係約8000個細胞，因此NK:腫瘤比率係約0.4(類似於估算MM患者NK與腫瘤細胞比率之臨床資料；資料未顯示)。圖32A顯示自健康人血液供體分離並冷凍以待實驗之人PBMC。解凍後，藉由錐蟲藍(trypan blue)染色測定PBMC係約85%活力且稍後藉由FACS，利用7AAD確定。將PBMC (約165K)與BCMA+多發性骨髓瘤細胞株(約20K)一起共培養並使其暴露於自0.1 – 3000pM之3倍連續稀釋之測試物，在37℃及5% CO₂ 下保持約20小時。每165K個PBMC之CD56⁺ CD3e- NK細胞的近似數量係約8000個細胞，因此NK:腫瘤比率係約0.4 (類似於估算MM患者NK與腫瘤細胞比率之臨床資料；資料未顯示)。如圖32B-32E中所示，使用抗體染色及FACS測定MM腫瘤細胞上之BCMA表現並監測多發性骨髓瘤靶細胞之細胞毒性。利用軟體程式FlowJo及GraphPad Prism 6分析資料：圖32B顯示NCI-H929細胞株，圖32C顯示RPMI-8226細胞株，圖32D顯示MM.1S細胞株，且圖32E顯示MOLP-2細胞株。非BCMA靶向性/CD16a陰性對照係以空心符號顯示。CD16A/BCMA抗體I係以實心符號顯示。

圖 33A-33C 顯示CD16A/BCMA抗體I針對多發性骨髓瘤細胞株之活體外細胞毒性。圖33A顯示NCI-H929細胞株，圖33B顯示RPMI-8226細胞株，且圖33C顯示MM.15細胞株。非BCMA靶向性/CD16a陰性對照係以空心方形顯示。CD16A/BCMA抗體I係以實心圓形顯示。達雷木單抗(「Dara」)係以實心方形顯示。

圖 34A-34C 顯示CD16A/BCMA抗體I針對多發性骨髓瘤細胞株之活體外細胞毒性。NK細胞與BCMA+多發性骨髓瘤腫瘤細胞株以約4-5之E:T共培養。在添加NK細胞及測試物之前，將供體A – NK及腫瘤細胞與0.5 mg/ml低內毒素hIgG一起預培育至少30分鐘。供體B-無預培育步驟。圖34A顯示供體A耗盡BCMA⁺ 靶細胞。圖34B顯示供體B耗盡SK-MM-2。圖34C顯示供體B耗盡MOLP-2。在圖34B及34C中，非BCMA靶向性/CD16a陰性對照係以空心符號顯示，且CD16A/BCMA抗體I係以實心符號顯示。

圖 35A-35D 顯示CD16A/BCMA抗體I、CD16A/BCMA抗體II及CD16A/BCMA抗體III針對低BCMA表現性Raji腫瘤細胞株之活體外細胞毒性。在活體外觀察到BCMA+靶細胞溶解，不過幾乎無法偵測到BCMA表面表現。該活體外細胞毒性檢定係使用富集之原代人NK細胞之4小時鈣黃綠素釋放檢定進行，E:T 5:1。圖35A顯示Raji細胞株溶解。圖35B顯示Raji細胞株之細胞毒性。圖35C顯示藉由市售抗BCMA抗體及同型偵測之BCMA表現。圖35D顯示藉由CD16A/BCMA抗體I、CD16A/BCMA抗體II、CD16A/BCMA抗體III、BCMA (Fc沉默)及同型偵測之BCMA表現。

圖 36A-36C 顯示CD16A/BCMA抗體I針對低BCMA表現性Raji腫瘤細胞株之活體外細胞毒性。圖36A顯示Raji細胞上之BCMA表現。圖36B顯示在NCI-H929 (MM陽性對照)細胞之BCMA表現。在(A)及(B)中，使用市售抗BCMA與APC之結合物定量Raji及NCI-H929 (MM陽性對照)細胞上之BCMA表現。(C) Raji細胞及H929細胞之細胞毒性。CD16A/BCMA抗體I係以實心符號顯示，且非BCMA靶向性/CD16a陰性對照係以空心符號顯示。

圖 37A 及 37B 顯示CD16A/BCMA抗體I針對自體BCMA⁺ 正常人血漿細胞之活體外活性。圖37A顯示作為陽性對照之同種異體細胞。圖37B顯示自體BCMA+正常人血漿細胞。CD16A/BCMA抗體I係以實心符號顯示，且非BCMA靶向性/CD16a陰性對照係以空心符號顯示。

圖 38A-38C 顯示在BCMA⁺ 靶細胞存在下CD16A/BCMA抗體I對NK細胞上CD16之活化。圖38A顯示NK-CD16⁺ 細胞之數量。圖38B顯示NKCD69⁺ CD25⁺ 細胞之數量。圖38C顯示靶細胞之數量。

圖 39A 及 39B 顯示在無BCMA⁺ 靶細胞存在下CD16A/BCMA抗體I對NK細胞上CD16之活化。圖39A顯示NK-CD16⁺ 細胞之數量。圖39B顯示NKCD69⁺ CD25⁺ 細胞之數量。

圖 40A-40E 顯示CD16A/BCMA抗體I與NK細胞之結合及在血清存在下CD16A/BCMA抗體I之細胞毒性。圖40A顯示在外源性人Ig存在下抗BCMA/CD16a之結合。在37℃下，在存在及不存在10 mg/mL SCIG (Hizentra)下，將新鮮製備之人NK細胞預培育1小時，隨後用指定濃度的標記DyLight650之抗AFM26/CD16a染色。圖40B顯示在100%自體人血清存在下，抗BCMA/CD16誘導之靶細胞溶解。使用新鮮製備之人NK細胞作為效應細胞，用指定濃度之CD16A/BCMA抗體I處理多發性骨髓瘤細胞株NCI-H929。在添加CD16A/BCMA抗體I之前，在37℃下將細胞與來自同一健康供體之熱滅活自體人血清一起預培育半小時。圖40C及40D顯示，在50%自體人血清存在下，抗BCMA/CD16a耗盡BCMA+靶細胞，且無NK細胞損失。在圖40C及40D中，使用CD16A/BCMA抗體I作為實例。在圖40C及40D中，自健康人血液供體分離出人NK細胞。在實行檢定方案之前，在50%自體人血清中分別預培育NK(圖40D)及MM.1S細胞(圖40C) 2小時。NK細胞與MM.1S腫瘤細胞株以約5之E:T比率共培養，且使其暴露於自0.1 – 100nM的10倍連續稀釋之測試物，在37℃及5% CO₂ 下保持約20小時。用CD138及CD56對抗體染色，隨後使用FACS監測MM.1S靶向之細胞毒性及NK存活率。利用軟體程式FlowJo及GraphPad Prism 6分析資料。Ab-1，即非BCMA靶向性/CD16a陰性對照係以空心符號顯示。BCMA/CD16a抗體I係以實心符號顯示。圖40E顯示，第二細胞株R/R MM係用抗BCMA/CD16A抗體治療之靶適應症。在本實例中，使用BCMA/CD16A抗體I作為實例。具體言之，本圖中之資料顯示，抗BCMA/CD16A抗體(BCMA/CD16A抗體I用於例示性目的)不同於抗CD38抗體(達雷木單抗)。達雷木單抗在MM中具有補體依賴性細胞毒性活性(de Weers, M.等人, 2011. J. Immun. 186(3):1840-1848)且能夠藉由經CD38交聯進行信號傳導來誘導細胞凋亡(Overdijk, M.B.等人, 2016 J. Immun. 197(3):807-813)，而BCMA/CD16A抗體I不具有該等活性。另外，如圖41A及41B中所示，與達雷木單抗不同，BCMA/CD16A抗體I之活性不受CD16A多態性影響，該等CD16A多態性降低Fc介導之藥物的活性。總體而言，圖40E顯示，BCMA/CD16A抗體I不會耗盡NK細胞(呈CD38陽性)，但達雷木單抗則會。

圖 41A 及 41B 顯示血清對CD16A表現及在無BCMA⁺ 靶細胞存在下NK細胞活化之影響。此外，在血清存在下之低CD16表現表明非CD1A介導之NK細胞活化。圖41A顯示利用血清偵測到較少CD16A。圖41B顯示利用血清偵測到較高非靶介導之活化。

圖 42A-42C 顯示IL-15處理使抗CD16A/BCMA抗體針對MM細胞之活性增加。圖42A顯示在以下情況下腫瘤細胞之溶解百分比：a)無抗體處理、b)陰性對照1處理、c)陰性對照2處理、d) BCMA/CD16A抗體I處理、e)抗BCMA/CD19抗體處理及f)達雷木單抗處理。圖42B顯示在以下情況下腫瘤細胞之溶解百分比：a)無抗體+IL-15處理、b)陰性對照1+ IL-15處理、c)陰性對照2+ IL-15處理、d) BCMA/CD16A抗體I+ IL-15處理、e)抗BCMA/CD19抗體+ IL-15處理及f)達雷木單抗+ IL-15處理。圖42C顯示圖42A及42B中所示之陰性對照#1、陰性對照#2及BCMA/CD19之結構。

圖 43 顯示在未用達雷木單抗治療之患者、達雷木單抗難治性患者之周圍血液中NK細胞之數量。圖43顯示在阿特珠單抗(atezolizumab)試驗中在基線下周圍血液(絕對計數/uL)中之NK流式資料。NK細胞係以CD56/CD16+淋巴細胞:低CD45×SSC群選通(標準選通)，接著次選通至CD56/CD16+群中。在阿特珠單抗中，達雷木單抗難治性患者體內之NK水準低於未用達雷木單抗治療者且低於健康供體範圍(虛線之間之面積)。

圖 44 顯示R/R MM患者骨髓中之NK/腫瘤比率。

圖 45A 及 45B 顯示利用CD16A/BCMA抗體I活體外殺滅細胞株。CD16A/BCMA抗體I係以實心圓形顯示，達雷木單抗(「Dara」)係以實心方形顯示，且NTx16a，即非靶向性抗CD16A雙特異性抗體係以空心方形顯示。在圖45A中，E:T係0.05。在圖45B中，E:T係0.5。

圖 46A-46D 顯示新鮮NK細胞對CD16A/BCMA抗體I及CD16A/BCMA抗體II之細胞毒性的影響。「新鮮製備之NK細胞」表示自在同一天新鮮分離之PBMC純化之NK細胞。「第2天NK細胞」表示自在第一天分離之PBMC純化並在RPMI培養基中培養過夜的NK細胞。圖46A顯示新鮮製備之NK細胞針對NCI-H929細胞之細胞毒性。圖46B顯示新鮮製備之NK細胞針對MM.1S細胞之細胞毒性。圖46C顯示第2天NK細胞針對NCI-H929細胞之細胞毒性。圖46D顯示第2天NK細胞針對MM.1S細胞之細胞毒性。

圖 47 顯示在冷凍之原發性骨髓瘤骨髓單核細胞(BMMC)中FcRH5、BCMA及CD38之表現。評估來自20位供體及對照(骨髓瘤細胞株MOLP-2)的冷凍之原發性骨髓瘤骨髓單核細胞(BMMC)中之FcRH5、BCMA (Biolegend 19F2)、CD38細胞表面表現。簡言之，解凍BMMC，用無菌PBS洗滌，接著使其再懸浮達到1×10^6個細胞/毫升之最終濃度。用活力及骨髓瘤標記物(CD45、CD319、CD138、CD38、BCMA、FcRH5)對BMMC染色。在固定細胞並洗滌之後，在Canto II上讀取細胞。在FlowJo中，藉由選擇存活/單峰/CD45-/CD319+細胞(骨髓瘤細胞)來分析FcRH5、BCMA及CD38。在統計繪圖軟體Prism中標繪FcRH5、BCMA及CD38之MESF (Log10)值。

圖 48A 及 48B 顯示正常人血漿細胞及原代MM細胞上BCMA之表現。圖48A顯示正常人血漿細胞上BCMA之表現。圖48B顯示冷凍原發性骨髓瘤BMMC中BCMA之表現的實例。在圖48A及48B中，根據以上圖47中所述之方案，利用BCMA對細胞染色並選通，接著在FlowJo中標繪最大百分比。灰色陰影之峰係螢光補償(Fluorescence Minus One，FMO)對照且紅色峰係BCMA表現。

圖 49A-49F 顯示NK細胞活化且ROCK接合物誘導IFN-γ釋放嚴格地依賴於靶細胞之存在。圖49A-49C顯示在BCMA+ RPMI-8226靶細胞存在及不存在下，在遞增濃度之BCMA/CD16A ROCK接合物TandAb_A、scFv-IgAb_D及KiH-scDb-Fc_A下PBMC培養物中CD69+ NK細胞之百分含量。圖49A係針對TandAb_A，圖49B係針對scFv-IgAb_D，且圖49C係針對KiH-scDb-Fc_A。在遞增濃度抗體存在下(方形)或在無抗體存在下(三角形)，將人PBMC與(實心符號)或不與(空心符號)RPMI-8226靶細胞(E:T比率：50:1)一起培養。在22小時培育後，藉由流動式細胞測量術分析CD56+ NK細胞上之CD69表面表現。圖49D-49F顯示在10µg/mL TandAb_A、scFv-IgAb_D或KiH-scDb-Fc_A存在或不存在下，在BCMA+ NCI-H929細胞存在或不存在下以50:1之E:T比率培養新鮮分離之人PBMC。圖49D係針對TandAb_A，圖49E係針對scFv-IgAb_D，且圖49F係針對KiH-scDb-Fc_A。在24小時培育後，定量上清液中之IFN-γ濃度。*：低於偵測下限。

圖 50 顯示由針對BCMA之T細胞接合物與ROCK接合物誘導之人PBMC培養物中炎性細胞介素釋放的比較。在遞增濃度之BCMA/CD3 BiTE、或接合NK細胞之ROCK接合物scFv-IgAb_D或KiH-scDb-Fc_A存在或不存在下，將新鮮分離之人PBMC與BCMA+細胞株NCI-H929 (E:T比率50:1)一起共培養。在培育24小時後，定量上清液中細胞介素之濃度。對照：未添加抗體。

圖 51 顯示在若干ROCK^® 抗體形式存在下，富集之原代人NK細胞針對A-431細胞之活體外細胞毒性。在5:1之E:T比率下4小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定中指定EGFR靶向性ROCK抗體之代表性s形劑量反應曲線。SABC：特異性抗體結合能力(≥3次檢定之平均值)。

圖 52A-52D 顯示在競爭性多株、單株或Fc增強之IgG存在或不存在下，活體外細胞毒性檢定中ROCK^® 與IgG抗體之比較。在CD30/CD16A TandAb、抗CD30 IgG1 (IgAb)或具有Fc介導的增強突變S239D/I332E之效應功能的抗CD30 IgG1 (IgAb (Fc增強))之連續稀釋液存在下，利用E:T比率為5:1的鈣黃綠素標記之CD30+ KARPAS-299靶細胞與作為效應細胞之原代人NK細胞進行之4小時鈣黃綠素釋放細胞毒性檢定。在RPMI 1640培養基或補充有10 mg/mL多株人IgG、10 mg/mL單株人抗EGFR IgG1 (IgAb)或10 mg/mL Fc增強之單株人抗EGFR IgG1 (IgAb (Fc增強))的培養基中進行檢定。圖52A顯示RPMI 1640培養基。圖52B顯示補充有10 mg/mL多株人IgG之培養基。圖52C顯示10 mg/mL單株人抗EGFR IgG1。圖52D顯示10 mg/mL Fc增強之單株人抗EGFR IgG1。

圖 53A-53D 顯示CD16A/BCMA抗體I之BCMA靶向部分及CD16A抗原結合部分之序列。圖53A顯示CD16A/BCMA抗體I之BCMA靶向部分之CDR序列。圖53B顯示CD16A/BCMA抗體I之BCMA靶向部分之重鏈及輕鏈可變區序列。圖53C顯示CD16A/BCMA抗體I之CD16A抗原結合部分之CDR序列。圖53D顯示CD16A/BCMA抗體I之CD16A抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區序列。

Claims

一種多特異性抗原結合蛋白，其包含 (a) 至少一個第一靶抗原結合部分，及 (b) 至少兩個CD16A抗原結合部分，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分與包含至少一個恆定結構域或Fc部分之Fab片段融合。
如請求項1之多特異性抗原結合蛋白，其中該兩個CD16A抗原結合部分中之至少一個係選自由單鏈Fv (scFv)、單鏈雙功能抗體(scDb)及雙功能抗體Db組成之群的抗原結合分子。
如請求項1或2之多特異性抗原結合蛋白，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分各自係scFv。
如請求項1或2之多特異性抗原結合蛋白，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分係呈scDb形式。
如請求項1至4中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分各自包含依序連接於多肽鏈中之輕鏈可變區(V_L )及重鏈可變區(V_H )，且在該多肽鏈之N末端的可變區係該V_L 。
如請求項5之多特異性抗原結合蛋白，其中該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H 、V_L -V_L -V_H -V_H 或V_L -V_H -V_L -V_H 之次序安置。
如請求項5或6之多特異性抗原結合蛋白，其中該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H 之次序安置。
如請求項5或6之多特異性抗原結合蛋白，其中該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H -V_L -V_H 之次序安置。
如請求項5至8中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中： (i) 該多肽鏈之C末端係與該Fc部分之CH2結構域的N末端融合；或 (ii) 該多肽鏈之C末端係與該Fc部分之鉸鏈區的N末端融合； (iii) 該多肽鏈之N末端係與該Fc部分之CH3結構域的C末端融合；或 (iv) 該多肽鏈之N末端係與Fab片段之C末端融合。
如請求項5至9中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中該多肽鏈之N末端與該Fc部分之CH3結構域的C末端融合。
如請求項1至10中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中該Fc部分係選自由單體CH2-CH3片段、異二聚Fc區及同二聚Fc區組成之群。
如請求項1至11中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中該Fc部分不結合至Fc-γ受體，但保持結合至新生兒Fc受體。
如請求項12之多特異性抗原結合蛋白，其中包含兩個CD16抗原結合部分之scDb或Db與該Fab片段之一條鏈的C末端融合且該第一靶抗原結合部分與該Fab片段之另一條鏈的C末端融合。
如請求項13之多特異性抗原結合蛋白，其中該Fab片段在N末端包含HSA抗原結合Fv。
如請求項1至14中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白係四價的。
如請求項15之多特異性抗原結合蛋白，其包含至少兩個靶抗原結合部分。
如請求項16之多特異性抗原結合蛋白，其包含第一靶抗原結合部分、第二靶抗原結合部分及至少兩個CD16A抗原結合部分與二聚Fc部分之融合物。
如請求項1之多特異性抗原結合蛋白，其中CD16A抗原結合部分與IgG每條重鏈之C末端融合，該IgG在該兩個Fab之每一個中包含在N末端之第一靶抗原結合Fv部分且第二靶抗原結合蛋白在C末端與該等CL結構域中之每一個融合。
如請求項1至18中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中該CD16A抗原結合部分包含： (i) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:50中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:51中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列之CDR3，及/或 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:53中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:54中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:55中所述之胺基酸序列之CDR3。
如請求項1至18中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中該CD16A抗原結合部分包含： (i) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列之CDR3，及/或 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列之CDR3。
如請求項1至20中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中該CD16A抗原結合部分包含：(i)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列。
如請求項1至21中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中該CD16A抗原結合部分包括(i)含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區，及/或(ii)含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項1至15中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其中該第一靶抗原係選自BCMA及EGFR。
如請求項23之多特異性抗原結合蛋白，其中該第一靶抗原係BCMA。
如請求項24之多特異性抗原結合蛋白，其中該蛋白質係四聚體，其包含具有SEQ ID NO:61或63中所述之胺基酸序列的第一多肽鏈，及具有SEQ ID NO:62或64中所述之胺基酸序列的第二多肽鏈。
如請求項25之多特異性抗原結合蛋白，其中該蛋白質係四聚體，其包含選自以下之第一多肽及第二多肽： (i) 具有SEQ ID NO:61中所述之胺基酸序列的第一多肽及具有SEQ ID NO:62中所述之胺基酸序列的第二多肽； (ii) 具有SEQ ID NO:61中所述之胺基酸序列的第一多肽及具有SEQ ID NO:64中所述之胺基酸序列的第二多肽； (iii) 具有SEQ ID NO:63中所述之胺基酸序列的第一多肽及具有SEQ ID NO:62中所述之胺基酸序列的第二多肽；及 (iv) 具有SEQ ID NO:63中所述之胺基酸序列的第一多肽及具有SEQ ID NO:64中所述之胺基酸序列的第二多肽。
如請求項24之多特異性抗原結合蛋白，其中該BCMA抗原結合部分包含： (i) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列之CDR3，及/或 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列之CDR3。
如請求項24之多特異性抗原結合蛋白，其中該BCMA抗原結合部分包含： (i) 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列，及/或 (ii) 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列。
如請求項24之多特異性抗原結合蛋白，其中該BCMA抗原結合部分包括： (i) 含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區，及/或 (ii) 含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項24之多特異性抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白包含： (i) CD16A抗原結合部分，其包含： (a) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (b) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (ii) BCMA抗原結合部分，其包含： (a) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列之CDR3。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至30中任一項之多特異性抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項1至30中任一項之多特異性抗原結合蛋白，其係用作藥物。
如請求項31之醫藥組成物，其用作藥物。
一種用於治療或改善疾病之方法，該方法包括向有需要之個體投與如請求項1至30中任一項之多特異性抗原結合蛋白或如請求項31之醫藥組成物。
如請求項34之方法，其中該疾病係癌症。
如請求項34或35之方法，其中該疾病係血液癌症。
如請求項34至36中任一項之方法，其中該疾病係多發性骨髓瘤。
一種治療及/或預防個體之疾病的方法，該方法包括向有需要之個體投與如請求項1至30中任一項之雙特異性抗原結合蛋白或如請求項31之醫藥組成物。
如請求項38之方法，其包括靜脈內投與該雙特異性抗原結合蛋白。
如請求項38之方法，其包括皮下投與該雙特異性抗原結合蛋白。
如請求項38至40中任一項之方法，其包括投與第二療法。
如請求項41之方法，其中該第二療法係選自由以下組成之群：包含抗PD-1抗體之療法、包含抗PD-L1抗體之療法、包含CD3雙特異性抗體之療法、包含抗TIGIT抗體之療法、包含抗VEGF抗體之療法及包含抗FcRH5抗體之療法。
如請求項41之方法，其中該第二療法係細胞介素療法。
如請求項43之方法，其中該細胞介素療法包含投與選自由以下組成之群的細胞介素：IL-15、IL-2、IL-12、IL-21及IL-6。
如請求項44之方法，其中該細胞介素療法包含投與IL-2。
如請求項44之方法，其中該細胞介素療法包含投與IL-15。
如請求項34至46中任一項之方法，其中該個體係癌症患者。
如請求項34至46中任一項之方法，其中該個體係血液癌症患者。
如請求項34至48中任一項之方法，其中該個體係多發性骨髓瘤患者。
如請求項34至49中任一項之方法，其中該個體係復發性/難治性多發性骨髓瘤患者。
如請求項34至50中任一項之方法，其中該個體已接受抗CD38療法。
如請求項34至51中任一項之方法，其中該個體已接受達雷木單抗(daratumumab)。
如請求項34至52中任一項之方法，其中該個體係未用達雷木單抗治療、耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。
如請求項53之方法，其中該個體係耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。
如請求項34至54中任一項之方法，其中該個體表現CD16A多態性。
如請求項55之方法，其中該CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。
一種雙特異性抗原結合蛋白，其包含 (a) 至少一個BCMA結合部分，及 (b) 至少兩個CD16A抗原結合部分，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分與包含至少一個恆定結構域或Fc部分之Fab片段融合。
如請求項57之雙特異性抗原結合蛋白，其中該兩個CD16A抗原結合部分中之至少一個係選自由單鏈Fv (scFv)、單鏈雙功能抗體(scDb)及雙功能抗體Db組成之群的抗原結合分子。
如請求項57或58之雙特異性抗原結合蛋白，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分各自係scFv。
如請求項57至59中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分係呈scDb形式。
如請求項57至59中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分各自包含依序連接於多肽鏈中之輕鏈可變區(V_L )及重鏈可變區(V_H )，且在該多肽鏈之N末端的可變區係該V_L 。
如請求項61之雙特異性抗原結合蛋白，其中該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H 、V_L -V_L -V_H -V_H 或V_L -V_H -V_L -V_H 之次序安置。
如請求項61或62之雙特異性抗原結合蛋白，其中該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H 之次序安置。
如請求項61或62之雙特異性抗原結合蛋白，其中該多肽鏈中該至少兩個CD16A抗原結合部分的可變區自N末端至C末端係以V_L -V_H -V_L -V_H 之次序安置。
如請求項61至64中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中： (i) 該多肽鏈之C末端係與該Fc部分之CH2結構域的N末端融合；或 (ii) 該多肽鏈之C末端係與該Fc部分之鉸鏈區的N末端融合； (iii) 該多肽鏈之N末端係與該Fc部分之CH3結構域的C末端融合；或 (iv) 該多肽鏈之N末端係與Fab片段之C末端融合。
如請求項61至64中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該多肽鏈之N末端與該Fc部分之CH3結構域的C末端融合。
如請求項57至66中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該Fc部分係選自由單體CH2-CH3片段、異二聚Fc區及同二聚Fc區組成之群。
如請求項57至67中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該Fc部分不結合至Fc-γ受體，但保持結合至新生兒Fc受體。
如請求項57至67中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該Fc部分包含至少一個少效應子突變。
如請求項69之雙特異性抗原結合蛋白，其中該至少一個少效應子突變係選自由以下組成之群：C220S、C229S、E233P、L234A、L234V、L234F、L235A、L235E、P238S、D265A、N297A、N297Q及P331S。
如請求項69或70之雙特異性抗原結合蛋白，其中該至少一個少效應子突變係選自由以下組成之群：L234A、L234V、L234F、L235A、L235E、P238S及D265A。
如請求項69至71中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該至少一個少效應子突變係選自由L234F、L235E及D265A組成之群。
如請求項69至72中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該Fc部分具有兩個少效應子突變。
如請求項73之雙特異性抗原結合蛋白，其中該兩個少效應子突變係L234F及L235E。
如請求項69至72中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該Fc部分具有三個少效應子突變。
如請求項75之雙特異性抗原結合蛋白，其中該三個少效應子突變係L234F、L235E及D265A。
如請求項57至77中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該至少兩個CD16A抗原結合部分係與Fc部分融合。
如請求項57至77中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其包含兩個BCMA靶向部分。
如請求項57至78中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分。
如請求項79之雙特異性抗原結合蛋白，其中該兩個CD16A抗原結合部分各自與IgG之每條重鏈的C末端融合，且該兩個BCMA靶向部分各自與該IgG之N末端融合。
如請求項77至80中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其具有圖13中所示之結構。
如請求項57至77中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其包含一個BCMA靶向部分。
如請求項82之雙特異性抗原結合蛋白，其中該BCMA靶向部分與該Fc部分之N末端融合，該至少兩個CD16A抗原結合部分與該Fc部分融合。
如請求項82或83之雙特異性抗原結合蛋白，其具有圖5中所示之結構。
如請求項57至84中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該CD16A抗原結合部分包含： (i) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:50中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:51或56中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:52中所述之胺基酸序列之CDR3，及/或 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:53中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:54中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:55中所述之胺基酸序列之CDR3。
如請求項84之雙特異性抗原結合蛋白，其中該重鏈可變區CDR2具有SEQ ID NO:51中所述之胺基酸序列。
如請求項85之雙特異性抗原結合蛋白，其中該重鏈可變區CDR2具有SEQ ID NO:56中所述之胺基酸序列。
如請求項57至85中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該CD16A抗原結合部分包含： (i) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列之CDR3，及/或 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列之CDR3。
如請求項57至88中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該CD16A抗原結合部分包含：(i)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列。
如請求項57至89中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該CD16A抗原結合部分包括(i)含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區，及/或(ii)含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項57至90中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該BCMA抗原結合部分包含： (i) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列之CDR3，及/或 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列之CDR3。
如請求項57至91中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該BCMA抗原結合部分包含：(i)重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列；及/或(ii)輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列至少約80%同源或一致之胺基酸序列。
如請求項57至92中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該BCMA抗原結合部分包括(i)含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區，及/或(ii)含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項57至74、77至81及85至93中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分，其中： (a) 該等CD16A抗原結合部分各自包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的V_L CDR3；且 (b) 該等BCMA靶向部分各自包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的V_H CDR1、具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的V_H CDR2、具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的V_H CDR3、具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的V_L CDR1、具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的V_L CDR2及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的V_L CDR3。
如請求項57至74、77至81及85至94中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分，其中： (a) 該等CD16A抗原結合部分各自包括含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區，及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區；且 (b) 該等BCMA靶向部分各自包括含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區，及(ii)含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項57至74、77至81及85至95中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其係包含具有SEQ ID NO:61中所述之胺基酸序列之第一多肽及具有SEQ ID NO:62中所述之胺基酸序列之第二多肽的四聚體。
如請求項57至93中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其係包含具有SEQ ID NO:63中所述之胺基酸序列之第一多肽及具有SEQ ID NO:64中所述之胺基酸序列之第二多肽的四聚體。
如請求項81之雙特異性抗原結合蛋白，其中： (i) 該等CD16A抗原結合部分各自包含： (a) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (b) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列之CDR3，且 (ii) 該等BCMA抗原結合部分各自包含： (a) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列之CDR3。
一種醫藥組成物，其包含如請求項57至98中任一項之雙特異性抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項57至98中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其係用作藥物。
如請求項99之醫藥組成物，其用作藥物。
一種治療及/或預防疾病之方法，該方法包括向有需要之個體投與如請求項57至98中任一項之雙特異性抗原結合蛋白或如請求項99之醫藥組成物。
如請求項102之方法，其中該疾病係癌症。
如請求項102或103之方法，其中該疾病係血液癌症。
如請求項102至104中任一項之方法，其中該疾病係多發性骨髓瘤。
如請求項102至105中任一項之方法，其包括靜脈內投與該雙特異性抗原結合蛋白。
如請求項102至105中任一項之方法，其包括皮下投與該雙特異性抗原結合蛋白。
如請求項102至107中任一項之方法，其包括投與第二療法。
如請求項108之方法，其中該第二療法係選自由以下組成之群：包含抗PD-1抗體之療法、包含抗PD-L1抗體之療法、包含CD3雙特異性抗體之療法、包含抗TIGIT抗體之療法、包含抗VEGF抗體之療法及包含抗FcRH5抗體之療法。
如請求項108之方法，其中該第二療法係細胞介素療法。
如請求項110之方法，其中該細胞介素療法係投與選自由以下組成之群的細胞介素：IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27及IL-6。
如請求項111之方法，其中該細胞介素係IL-15。
如請求項111之方法，其中該細胞介素係IL-2。
如請求項102至113中任一項之方法，其中該個體係癌症患者。
如請求項102至114中任一項之方法，其中該個體係血液癌症患者。
如請求項102至115中任一項之方法，其中該個體係多發性骨髓瘤患者。
如請求項102至116中任一項之方法，其中該個體係復發性/難治性多發性骨髓瘤患者。
如請求項102至117中任一項之方法，其中該個體已接受抗CD38療法。
如請求項102至118中任一項之方法，其中該個體已接受達雷木單抗。
如請求項102至119中任一項之方法，其中該個體係未用達雷木單抗治療、耐達雷木單抗性、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。
如請求項120之方法，其中該個體係耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。
如請求項102至121中任一項之方法，其中該個體表現CD16A多態性。
如請求項122之方法，其中該CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。
如請求項1至30中任一項之多特異性抗原結合蛋白或如請求項57至98中任一項之雙特異性抗原結合蛋白，其中該多特異性抗原結合蛋白或該雙特異性抗原結合蛋白當投與該個體時基本上不會耗盡或減少個體之自然殺手(NK)細胞群。
一種治療具有耗盡或減少之NK細胞群之個體的方法，其包括投與如請求項1至30中任一項之多特異性抗原結合蛋白或如請求項57至98中任一項之雙特異性抗原結合蛋白。
如請求項125之方法，其中該個體先前曾用抗CD38療法治療。
如請求項126之方法，其中該抗CD38療法係達雷木單抗療法。
一種雙特異性抗原結合蛋白，其包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分，其中該兩個CD16A抗原結合部分各自與IgG之每條重鏈的C末端融合，且該兩個BCMA靶向部分各自與該IgG之每條重鏈的N末端融合，且其中： (i) 該等CD16A抗原結合部分各自包含： (a) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (b) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列之CDR3，且 (ii) 該等BCMA抗原結合部分各自包含： (a) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列之CDR3。
一種治療個體之癌症的方法，其包括：向該個體投與包含兩個CD16A抗原結合部分及兩個BCMA靶向部分之雙特異性抗原結合蛋白，其中該兩個CD16A抗原結合部分各自與IgG之每條重鏈的C末端融合，且該兩個BCMA靶向部分各自與該IgG之每條重鏈的N末端融合，且其中： (i) 該等CD16A抗原結合部分各自包含： (a) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (b) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列之CDR3，且 (ii) 該等BCMA抗原結合部分各自包含： (a) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列之CDR3。
如請求項129之方法，其中該癌症係多發性骨髓瘤。
一種結合至或能夠結合至CD16A及BCMA之抗體或抗原結合蛋白，其包含： (i) 第一重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列之CDR3， (ii) 第一輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列之CDR3； (iii) 第二重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列之CDR3，以及 (iv) 第二輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列之CDR3。
如請求項131之抗體或抗原結合蛋白，其中： (i) 該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列； (ii) 該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列； (iii) 該第二重鏈可變區包含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列； (iv) 該第二輕鏈可變區包含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列； (v) 該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列，且該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列； (vi) 該第二重鏈可變區包含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列，且該第二輕鏈可變區包含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列；或 (vii) 該第一重鏈可變區包含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列且該第一輕鏈可變區包含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列；以及該第二重鏈可變區包含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列且該第二輕鏈可變區包含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列。
如請求項131或132之抗體或抗原結合蛋白，其不結合至CD16B。
如請求項131至133中任一項之抗體或抗原結合蛋白，當將其投與個體時，其基本上不會耗盡或減少該個體之自然殺手(NK)細胞群。
如請求項131至134中任一項之抗體或抗原結合蛋白，其中該CD16A係人CD16A。
如請求項131至135中任一項之抗體或抗原結合蛋白，其中該BCMA係人BCMA。
一種醫藥組成物，其包含如請求項131至136中任一項之抗體或抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項131至136中任一項之抗體或抗原結合蛋白，其係用作藥物。
如請求項137之醫藥組成物，其用作藥物。
一種治療及/或預防疾病之方法，該方法包括向有需要之個體投與如請求項131至136中任一項之雙特異性抗原結合蛋白或如請求項137之醫藥組成物。
如請求項140之方法，其中該疾病係癌症。
如請求項140或141之方法，其中該疾病係血液癌症。
如請求項140至142中任一項之方法，其中該疾病係多發性骨髓瘤。
如請求項140至143中任一項之方法，其包括靜脈內或皮下投與該抗體或抗原結合蛋白。
如請求項140至144中任一項之方法，其包括投與第二療法。
如請求項145之方法，其中該第二療法係選自由以下組成之群：包含抗PD-1抗體之療法、包含抗PD-L1抗體之療法、包含CD3雙特異性抗體之療法、包含抗TIGIT抗體之療法、包含抗VEGF抗體之療法及包含抗FcRH5抗體之療法。
如請求項145之方法，其中該第二療法係細胞介素療法。
如請求項147之方法，其中該細胞介素療法係投與選自由以下組成之群的細胞介素：IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27及IL-6。
如請求項148之方法，其中該細胞介素係IL-15。
如請求項148之方法，其中該細胞介素係IL-2。
如請求項140至150中任一項之方法，其中該個體係癌症患者。
如請求項140至151中任一項之方法，其中該個體係血液癌症患者。
如請求項140至152中任一項之方法，其中該個體係多發性骨髓瘤患者。
如請求項140至153中任一項之方法，其中該個體係復發性/難治性多發性骨髓瘤患者。
如請求項140至154中任一項之方法，其中該個體已接受抗CD38療法。
如請求項140至155中任一項之方法，其中該個體已接受達雷木單抗。
如請求項140至156中任一項之方法，其中該個體係未用達雷木單抗治療、耐達雷木單抗性、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。
如請求項157之方法，其中該個體係耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。
如請求項140至158中任一項之方法，其中該個體表現CD16A多態性。
如請求項159之方法，其中該CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。
一種治療具有耗盡或減少之NK細胞群之個體的方法，其包括投與如請求項131至136中任一項之抗體或抗原結合蛋白或如請求項137之醫藥組成物。
如請求項161之方法，其中該個體先前曾用抗CD38療法治療。
如請求項162之方法，其中該抗CD38療法係達雷木單抗療法。
一種抗體或抗原結合蛋白，其包含結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂及結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂，其中： (i) 該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包含： (a) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (b) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (ii) 該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂包含： (a) 重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列之CDR3，及 (ii) 輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列之CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列之CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列之CDR3。
如請求項164之抗體或抗原結合蛋白，其中該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂不同於該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂。
如請求項164或165之抗體或抗原結合蛋白，其中： (i) 該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包括含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區； (ii) 該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包括含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區； (iii) 該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂包括含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區； (iv) 該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂包括含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區； (v) 該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包括含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區； (vi) 該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂包括含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區；或 (vii) 該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包括含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區；且該結合至或能夠結合至BCMA之至少一個臂包括含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列的重鏈可變區及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區。
如請求項164至166中任一項之抗體或抗原結合蛋白，其不結合至CD16B。
如請求項164至167中任一項之抗體或抗原結合蛋白，當將其投與個體時，其基本上不會耗盡或減少該個體之自然殺手(NK)細胞群。
如請求項164至168中任一項之抗體或抗原結合蛋白，其中該CD16A係人CD16A。
如請求項164至169中任一項之抗體或抗原結合蛋白，其中該BCMA係人BCMA。
一種醫藥組成物，其包含如請求項164至170中任一項之抗體或抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項164至170中任一項之抗體或抗原結合蛋白，其係用作藥物。
如請求項172之醫藥組成物，其用作藥物。
一種治療及/或預防疾病之方法，該方法包括向有需要之個體投與如請求項164至170中任一項之抗體或抗原結合蛋白或如請求項171之醫藥組成物。
如請求項174之方法，其中該疾病係癌症。
如請求項174或175之方法，其中該疾病係血液癌症。
如請求項174至176中任一項之方法，其中該疾病係多發性骨髓瘤。
如請求項174至177中任一項之方法，其包括靜脈內或皮下投與該抗體或抗原結合蛋白。
如請求項174至178中任一項之方法，其包括投與第二療法。
如請求項179之方法，其中該第二療法係選自由以下組成之群：包含抗PD-1抗體之療法、包含抗PD-L1抗體之療法、包含CD3雙特異性抗體之療法、包含抗TIGIT抗體之療法、包含抗VEGF抗體之療法及包含抗FcRH5抗體之療法。
如請求項179之方法，其中該第二療法係細胞介素療法。
如請求項181之方法，其中該細胞介素療法係投與選自由以下組成之群的細胞介素：IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27及IL-6。
如請求項182之方法，其中該細胞介素係IL-15。
如請求項182之方法，其中該細胞介素係IL-2。
如請求項174至184中任一項之方法，其中該個體係癌症患者。
如請求項174至185中任一項之方法，其中該個體係血液癌症患者。
如請求項174至186中任一項之方法，其中該個體係多發性骨髓瘤患者。
如請求項174至187中任一項之方法，其中該個體係復發性/難治性多發性骨髓瘤患者。
如請求項174至188中任一項之方法，其中該個體已接受抗CD38療法。
如請求項174至189中任一項之方法，其中該個體已接受達雷木單抗。
如請求項174至190中任一項之方法，其中該個體係未用達雷木單抗治療、耐達雷木單抗性、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。
如請求項191之方法，其中該個體係耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。
如請求項174至192中任一項之方法，其中該個體表現CD16A多態性。
如請求項193之方法，其中該CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。
一種治療具有耗盡或減少之NK細胞群之個體的方法，其包括投與如請求項164至170中任一項之抗體或抗原結合蛋白或如請求項171之組成物。
如請求項195之方法，其中該個體先前曾用抗CD38療法治療。
如請求項196之方法，其中該抗CD38療法係達雷木單抗療法。
一種結合至或能夠結合至BCMA之抗體或抗原結合蛋白，其包含(i)重鏈可變區，該重鏈可變區包含具有SEQ ID NO:67中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:68中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:69中所述之胺基酸序列的CDR3，及(ii)輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO:70中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:71中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:72中所述之胺基酸序列的CDR3。
如請求項198之抗體或抗原結合蛋白，其中該BCMA係人BCMA。
如請求項198或199之抗體或抗原結合蛋白，其另外包含結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂。
如請求項200之抗體或抗原結合蛋白，其中該CD16A係人CD16A。
如請求項200或201之抗體或抗原結合蛋白，其中該結合至或能夠結合至CD16A之至少一個臂包含(i)重鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:73中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:74中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:75中所述之胺基酸序列的CDR3，及(ii)輕鏈可變區，其包含具有SEQ ID NO:76中所述之胺基酸序列的CDR1；具有SEQ ID NO:77中所述之胺基酸序列的CDR2；及具有SEQ ID NO:78中所述之胺基酸序列的CDR3。
如請求項198至202中任一項之抗體或抗原結合蛋白，其包括： (i) 含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列之重鏈可變區； (ii) 含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區； (iii) 含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列之重鏈可變區； (iv) 含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列的輕鏈可變區； (v) 含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列之重鏈可變區及含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列之輕鏈可變區； (vi) 含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列之重鏈可變區及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列之輕鏈可變區；或 (vii) 含SEQ ID NO:3中所述之胺基酸序列之第一重鏈可變區、含SEQ ID NO:2中所述之胺基酸序列之第一輕鏈可變區；以及含SEQ ID NO:65中所述之胺基酸序列之第二重鏈可變區及含SEQ ID NO:66中所述之胺基酸序列之第二輕鏈可變區。
一種醫藥組成物，其包含如請求項198至203中任一項之抗體或抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
如請求項198至203中任一項之抗體或抗原結合蛋白，其係用作藥物。
如請求項207之醫藥組成物，其用作藥物。
一種治療及/或預防疾病之方法，該方法包括向有需要之個體投與如請求項198至203中任一項之雙特異性抗原結合蛋白或如請求項204之醫藥組成物。
如請求項207之方法，其中該疾病係癌症。
如請求項207或208之方法，其中該疾病係血液癌症。
如請求項207至209中任一項之方法，其中該疾病係多發性骨髓瘤。
如請求項207至210中任一項之方法，其包括靜脈內或皮下投與該抗體或抗原結合蛋白。
如請求項207至211中任一項之方法，其包括投與第二療法。
如請求項212之方法，其中該第二療法係選自由以下組成之群：包含抗PD-1抗體之療法、包含抗PD-L1抗體之療法、包含CD3雙特異性抗體之療法、包含抗TIGIT抗體之療法、包含抗VEGF抗體之療法及包含抗FcRH5抗體之療法。
如請求項212之方法，其中該第二療法係細胞介素療法。
如請求項214之方法，其中該細胞介素療法係投與選自由以下組成之群的細胞介素：IL-15、IL-2、IL-12、IL-21、IL-17、IL-18、IL-23、IL-27及IL-6。
如請求項215之方法，其中該細胞介素係IL-15。
如請求項215之方法，其中該細胞介素係IL-2。
如請求項207至217中任一項之方法，其中該個體係癌症患者。
如請求項207至218中任一項之方法，其中該個體係血液癌症患者。
如請求項207至219中任一項之方法，其中該個體係多發性骨髓瘤患者。
如請求項207至220中任一項之方法，其中該個體係復發性/難治性多發性骨髓瘤患者。
如請求項207至221中任一項之方法，其中該個體已接受抗CD38療法。
如請求項207至222中任一項之方法，其中該個體已接受達雷木單抗。
如請求項207至223中任一項之方法，其中該個體係未用達雷木單抗治療、耐達雷木單抗性、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。
如請求項224之方法，其中該個體係耐達雷木單抗、達雷木單抗難治性或達雷木單抗復發性的。
如請求項207至225中任一項之方法，其中該個體表現CD16A多態性。
如請求項226之方法，其中該CD16A多態性係CD16A-158V/F多態性。
一種治療具有耗盡或減少之NK細胞群之個體的方法，其包括投與如請求項198至203中任一項之抗體或抗原結合蛋白或如請求項204之組成物。
如請求項228之方法，其中該個體先前曾用抗CD38療法治療。
如請求項229之方法，其中該抗CD38療法係達雷木單抗療法。