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KR20160107304A - 이중특이적 cd3 및 cd19 항원 결합 작제물 - Google Patents

이중특이적 cd3 및 cd19 항원 결합 작제물 Download PDF

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KR20160107304A
KR20160107304A KR1020167022004A KR20167022004A KR20160107304A KR 20160107304 A KR20160107304 A KR 20160107304A KR 1020167022004 A KR1020167022004 A KR 1020167022004A KR 20167022004 A KR20167022004 A KR 20167022004A KR 20160107304 A KR20160107304 A KR 20160107304A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
antigen
gly
val
thr
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020167022004A
Other languages
English (en)
Inventor
고든 유 곤 엔지
토마스 슈프레테르 폰 크로이덴슈타인
레오날드 지. 프레스타
Original Assignee
자임워크스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2014/046436 external-priority patent/WO2015006749A2/en
Application filed by 자임워크스 인코포레이티드 filed Critical 자임워크스 인코포레이티드
Publication of KR20160107304A publication Critical patent/KR20160107304A/ko
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Abstract

CD3 및 CD19에 결합하는 항원 결합 작제물, 예컨대 항체 및 사용 방법이 개시된다.

Description

이중특이적 CD3 및 CD19 항원 결합 작제물{BI-SPECIFIC CD3 AND CD19 ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS}
관련 출원의 교차 참조
본원은 미국 가출원 번호 61/927,877 (2014년 1월 15일 출원) 및 미국 가출원 번호 61/978,719 (2014년 4월 11일 출원) 및 미국 가출원 번호 62/025,932 (2014년 7월 17일 출원)의 이점을 주장한다. 본 출원은 또한 국제 출원 번호 PCT/US2014/046436 (2014년 7월 11일 출원)의 우선권을 주장한다. 이러한 출원 각각은 그 전체가 참고로 본원에 편입되어 있다.
서열목록
본 출원은 EFS-웹을 통하여 제출된 서열 목록을 함유하고, 이의 전문은 본원에 참조로 인용된다. 2015년 XX월에 생성된 상기한 ASCII 복사본은 XXXXX_CRF_sequencelisting.txt로 지칭되고, 크기는 XXX,XXX 바이트이다.
발명의 분야
본 발명의 분야는 이중특이적 항원 결합 작제물, 예컨대 항체에 관한 것이며, 이는 하기를 포함한다: CD3 항원 결합 폴리펩티드 작제물, 예컨대 CD3 결합 도메인 및 CD19 항원 결합 폴리펩티드 작제물, 예컨대 CD19 결합 도메인.
치료적 단백질의 분야에서, 다가 표적 결합 특질을 갖는 항체는 약물 후보의 설계를 위한 우수한 골격이다. 이들 특질이 더욱 진전되면서, 설계된 이중특이적 항체 및 기타 융합된 다중특이적 치료제는 이중 또는 복수 표적 특이성 및 신규한 작용 양식을 갖는 약물을 창출하는 기회를 나타낸다. 우호적인 약물동력학과 기능적 활성을 갖는 이런 다가 및 다중특이적 치료적 단백질의 개발은 힘든 과제이다.
T 세포를 종양 세포에 표적화할 수 있는 이중특이적 항체가 동정되었으며, 암 치료에서 이들의 효능에 대해 실험되었다. 블리나투모맙은, B-세포 질환, 예컨대 재발된 B-세포 비-호지킨성 림프종 및 만성 림프성 백혈병의 치료에 대해 동정되었던 일명 BiTETM (이중특이적 T-세포 인게이저(Engager)) 형식에서의 이중특이적 항-CD3-CD19 항체의 예시이다 (Baeuerle et al (2009)12:4941-4944). BiTETM 양식은 2개의 상이한 항체로부터 유도된 가변 도메인을 연결하는 이중특이적 단일쇄 항체 작제물이다. 블리나투모맙은, 그러나, 생체 내에서 불량한 반감기를 갖고, 생산성 및 안전성 관점에서 제조하기에 어려움이 있다. 따라서, 종양 세포에 T 세포를 표적화하고 개선된 제조가능성을 가질 수 있는 개선된 이중특이적 항체에 대한 필요성이 존재한다.
항원 결합 작제물은 하기에 기술된다: 국제 출원 번호 PCT/US2013/050411 (2013년 7월 13일 출원, 및 명칭 "항-CD3 작제물을 포함하는 이중특이적 비대칭 이종이량체"); 국제 특허 출원 PCT/US2014/046436 (2014년 7월 11일 출원, 명칭 "이중특이적 CD3 및 CD19 항원 결합 작제물").
발명의 요약
본원에 항원 결합 작제물이 기술되며, 이는 각각 제1 항원 결합 폴리펩티드 작제물, 제2 항원 결합 폴리펩티드 작제물, 및 이종이량체 Fc를 포함한다. 제1 scFv은 제1 VL, 제1 scFv 링커, 및 제1 VH를 포함한다. 제1 scFv는 CD19 항원에 1가로, 그리고 특이적으로 결합한다. 제1 scFv는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된다: 항-CD19 항체 HD37 scFv, 변형된 HD37 scFv, HD37 차단 항체 scFv, 및 변형된 HD37 차단 항체 scFv, 여기서 상기 HD37 차단 항체는 50% 이상의 CD19 항원에 대한 HD37의 결합을 차단한다.
제2 항원 결합 폴리펩티드 작제물은 제2 VL, 제2 scFv 링커, 및 제2 VH를 포함하는 제2 scFv를 포함한다. 제2 scFv는 CD3 항원의 엡실론 하부단위에 1가로, 그리고 특이적으로 결합한다. 제2 scFv는 하기로 구성된 그룹으로부터 선택된다: OKT3 scFv, 변형된 OKT3 scFv, OKT3 차단 항체 scFv, 및 변형된 OKT3 차단 항체 scFv, 여기서 상기 OKT3 차단 항체는 50% 이상의 CD3 항원의 엡실론 하부단위에 대한 OKT3의 결합을 차단한다.
이종이량체 Fc는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하고, 이는 각각 이량체화된 CH3 도메인을 형성할 수 있는 변형된 CH3 서열을 포함하고, 여기서 각각의 변형된 CH3 서열은 이종이량체 Fc의 형성을 촉진하는 비대칭 아미노산 변형을 포함하고, 상기 이량체화된 CH3 도메인은 약 68°C 이상의 용융 온도(Tm)를 갖는다. 제1 Fc 폴리펩티드는 제1 힌지 링커를 갖는 제1 항원 결합 폴리펩티드 작제물로 연결되고, 제2 Fc 폴리펩티드는 제2 힌지 링커를 갖는 제2 항원 결합 폴리펩티드 작제물로 연결된다.
또한 항원 결합 작제물 및 벡터 및 세포를 암호화하는 항원 결합 작제물 폴리펩티드 서열 및 CDR 서열, 핵산이 기술된다. 또한 항원 결합 작제물을 포함하는 약제학적 조성물 및 본원에 기술된 항원 결합 작제물을 사용한 장애, 예컨대 암을 치료하는 방법이 기술된다.
도 1은 항원 결합 작제물 설계의 도식적 묘사를 도시한다. 도 1a는 효과기 기능을 매개할 수 있는 Fc를 갖는 예시적인 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 묘사를 나타낸다. 항원 결합 작제물의 항원 결합 도메인 둘 다는 scFv이며, 여기서 각 scFv의 VH 및 VL 영역은 폴리펩티드 링커와 연결된다. 각 scFv는 또한 힌지 폴리펩티드 링커를 갖는 이종이량체 Fc의 하나의 폴리펩티드 쇄에 연결된다. 항원 결합 작제물의 2개 폴리펩티드 쇄는 이황화 결합을 통하여 함께 공유적으로 연결된다 (단속선으로 묘사됨). 도 1b는 Fc 녹아웃을 갖는 예시적인 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 묘사를 도시한다. 이러한 유형의 항원 결합 작제물은 도 1a에 나타난 그것과 유사하며, 예외로, 이는 FcγR 결합 ("X"로 나타냄)을 제거하는 Fc의 CH2 영역에 대한 변형을 포함한다.
도 2는 선택된 변이체에 대한 정제 절차의 분석을 나타낸다. 도 2a에서의 상부 패널은 변이체 10149에 대한 단백질 A 정제 후의 분취 겔 여과 (GFC) 프로파일을 도시하며, 한편 하부 패널은 풀링된 GFC 분획의 분석적 SEC 프로파일을 나타낸다. 도 2b에서의 상부 패널은 변이체 1661에 대한 단백질 A 정제 후의 분취 겔 여과 (GFC) 프로파일을 나타내며, 한편 하부 패널은 1661에 대한 풀링된 GFC 분획의 분석적 SEC 프로파일을 나타낸다. 도 2c는 변이체 875, 1661, 1653, 1666, 10149, 및 12043의 생물리학 특성의 요약을 제공한다.
도 3은 위족(pseudopodia)의 형성으로 B 세포 및 T 세포를 가교하는 변이체 875 및 1661의 능력을 도시한다. 좌측 표는 FACS 가교 분석 및 가교 현미경으로 측정시 이러한 변이체에 대한 B:T 세포 가교 분석의 요약을 제공하고; 우측 이미지는 가교 현미경으로 측정시 변이체 875에 대한 위족 형성을 나타낸다.
도 4는 300 nM에서 IL2-활성화된 정제된 CD8+ T 세포에서 K562 세포를 발현하는 비-CD19 상의 변이체 875의 오프-타겟(off-target) 세포독성을 도시한다 (평균 4개 공여체).
도 5는 ADCC 또는 CDC를 매개하는 v1661의 감소되거나 제거된 능력을 도시한다. 도 5a는 리툭시맙 대조군과 비교하여 라지(Raji) 세포의 ADCC를 매개하는 변이체 1661의 능력을 도시한다. 도 5b는 라지 (Raji) 세포 대 리툭시맙 대조군의 CDC를 매개하는 변이체 1661의 능력을 도시한다.
도 6은 전혈 검정에서 자가 B 세포 감손을 매개하는 선택된 변이체의 능력을 도시한다. CD20+ B 세포의 존재를 IL2 활성화된 인간 전혈에서의 이식으로부터 48시간 후 측정하였다 (2개 공여체의 평균, n=4).
도 7은 10:1의 E:T 비율에서 48시간 후 IL-2 활성화된 인간 전혈 내에서의, 농도-의존적 방식으로 (EC50 <0.01 nM), v1661에 의한 용량-의존적 자가 B-세포 감손을 도시한다.
도 8은 휴지 조건 하에서 용량-의존적 방식으로 전혈 내에서 자가 B 세포를 감손시키는 변이체 1661 및 10149의 능력에 대한 비교를 도시한다.
도 9는 1차 환자 인간 전혈 내에서의 v1661에 의한 자가 B 세포 감손을 도시한다. 도 9a는 MCL 환자로부터의 혈액 내에서의 v1661의 효과를 나타낸다. 도 9b는 2명의 CLL 환자로부터의 혈액 내에서의 v1661의 효과를 나타낸다. 잔여 악성 B 세포의 수는 배지 대조군에 대한 CD20+/CD5+ B 세포 정규화의 백분율로서 나타난다.
도 10은 인간 PBMC에서 T 세포 증식을 자극하는 v875, 1380 및 대조군의 능력을 도시한다 (4일 이식, 4개 공여체의 평균).
도 11은 100nM에서의 인간 PBMC, 변이체에서의 표적 B 세포 의존적 T 세포 증식을 도시한다 (4일 이식, 4개 공여체의 평균).
도 12는 인간 G2 ALL 종양 세포주에 결합하는 선택된 변이체의 능력을 도시한다.
도 13은 생체내 마우스 백혈병 모델에서의 대조군과 비교한, 변이체 875의 효능을 도시한다. 도 13a는 복와위(prone position)로의 전신 내의 생물발광의 양을 나타내며; 도 13b는 앙아위(supine position)로의 전신 내의 생물발광의 양을 나타내며; 도 13c는 제18일에서의 단리된 비장 내의 생물발광의 양을 나타낸다.
도 14는 생체 내 마우스 백혈병 모델에서의 대조군과 비교한, 변이체 1661 (FcγR 녹아웃 변이체)의 효능을 도시한다. 도 14a는 복와위(prone position)로의 전신 내의 생물발광의 양을 나타내며; 도 14b는 앙아위(supine position)로의 전신 내의 생물발광의 양을 나타내며; 도 14c는 전신 생물발광의 이미지이고; 그리고 도 14d는 제18일에서의 단리된 비장 내에서 검출된 생물발광의 양을 나타낸다.
도 15는 생체 내 마우스 백혈병 모델에서의 3mg/kg IV 주사로부터 24시간 후 이중특이적 항-CD3-CD19 변이체의 혈청 농도 분석을 도시한다.
도 16은 마우스 HD37 VL 및 VH 서열을 기반으로 한 인간화된 CD19 VL 및 VH 서열을 묘사한다. 3개 인간화된 VL 서열은 하기를 제공하였다: hVL2, hVL2 (D-E), 및 hVL2 (D-S). hVL2 (D-E)는 CDR L1에서의 D 및 E 간의 치환을 함유하며, 한편 hVL2 (D-S)는 CDR L1에서의 D 및 S 간의 치환을 함유한다. 2개 인간화된 VH 서열은 하기를 제공하였다: hVH2, 및 hVH3. CDR 서열은 박스 기호로 동정된다. 이러한 도면에서 동정된 CDR는 단지 예시적인 것이다. 본 분야에서 알려져 있듯이, CDR의 동정은 이들을 동정하는데 사용되는 방법에 따라 달라질 수 있다. 항-CD19 VL 및 VH 서열에 대한 대안적인 CDR 정의는 표 S1에 나타난다. 야생형 마우스 HD37 항체 서열에 관한 이러한 서열을 인간화하는 변형은 밑줄로서 표시된다.
도 17은 항-CD19 HD37 항체를 기반으로 한, 항 CD19 VH 및 VL 서열에 대한 카밧(Kabat)에 따른 수를 나타내는 표를 도시한다.
CD3 및 CD19 (CD3-CD19 항원 결합 작제물)에 결합하는 이중특이적 항원 결합 작제물 (예를 들어, 항체)이 본원에 기술된다. 이러한 CD3-CD19 항원 결합 작제물은 CD3 엡실론 하부단위에 1가로 결합하는 항원 결합 도메인, CD19에 1가로 결합하는 항원 결합 도메인, 및 이종이량체 Fc 영역을 포함한다. 항원 결합 도메인 둘 다는 scFv 양식에 존재하고, 이는, 표준 항체 제조 프로토콜을 사용하여 발현되고 정제될 경우, 항체의 산출량, 순도, 및 안정성으로 측정시, 제조가능성을 개선하기 위하여 조작되었다.
본원에 기술된 치료 항체 또는 항원 결합 작제물의 성공적인 발전을 위하여, 작제물은 충분히 높은 역가로 생성되어야 하며, 발현된 생성물은 실질적으로 순수해야 한다. 항체 또는 scFv 작제물의 정제-후 역가는 적어도 부분적으로 하기에 의하여 측정된다: 발현 숙주 세포 내의 단백질 접힘 및 처리, 및 응집체 및 단백질 저하를 최소화하기 위한 정제 절차 동안, 작제물의 안정성.
본원의 다른 부분에서 기술된 바와 같이, 항원 결합 작제물은 접힘, 발현, 및 안정성의 특이적 양태를 최적화하기 위한 몇몇의 변형을 포함한다. 이러한 변형은, 예를 들어 하기를 포함한다: 단백질 접힘 및 발현을 개선하기 위한 링커 및 VHVL 배향의 최적화; 발현 및 정제 동안 오접힘된 응집체의 형성을 감소시키기 위한 VHVL의 이황화 설계; 및 접힘, 발현, 뿐만 아니라 정제 과정 중의 안정성을 최적화하기 위한 알려진 안정한 프레임워크에 대한 CDR 이식.
본원에 기술된 이중특이적 항원 결합 작제물은, 면역학적 시냅스의 형성으로 CD3-발현 T 세포 및 CD19-발현 B 세포를 가교할 수 있다. 항원 결합 작제물은 시험관 내 및 체외 검정으로 측정 시, 그리고 질환의 생체내 모델에서 평가시, T 세포 지시된 B 세포 감손을 매개할 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 이중특이적 항원 결합 작제물은 질환, 예컨대 림프종 및 백혈병의 치료에 유용하며, 이는 환자 내에서 순환 B 세포의 수를 감소시키는데 이점이 있다.
또한, 항-CD19 HD37 항체의 VL 및 VH 서열을 기반으로, 인간화된 항-CD19 VL 및 VH (항-CD19 huVLVH) 서열이 본원에 기술된다. 이러한 항-CD19 huVLVH 서열은, 본원에 기술된 이중특이적 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 항-CD19 항원 결합 도메인에서 사용될 수 있다.
이중특이적 항원 결합 작제물
본원에서 이중특이적 항원 결합 작제물, 예컨대 CD3 및 CD19에 결합하는 항체가 제공된다. 이중특이적 항원 결합 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩티드 작제물, 예컨대 항원 결합 도메인을 포함하며, 각각은 scFv이며, CD3 또는 CD19에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 작제물은 알려진 항체 또는 항원 결합 작제물로부터 유도된다. 하기에 더 상세하게 기술된 바와 같이, 항원 결합 폴리펩티드 작제물은 scFv (단일쇄 Fv)이며, Fc를 포함한다.
용어 "항원 결합 작제물"은 임의의 제제, 예컨대 항원에 결합할 수 있는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 복합체를 지칭한다. 일부 양태에서, 항원 결합 작제물은 관심 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드이다. 항원 결합 작제물은, 하기일 수 있다: 단량체, 이량체, 다량체, 단백질, 펩티드, 또는 단백질 또는 펩티드 복합체; 항체, 항체 단편, 또는 이의 항원 결합 단편; scFv 등. 항원 결합 작제물은 단일특이적, 이중특이적, 또는 다중특이적인 폴리펩티드 작제물일 수 있다. 일부 양태에서, 항원 결합 작제물은 예컨대, 하나 이상의 Fc에 연결된 하나 이상의 항원 결합 성분 (예컨대, Fab 또는 scFv)를 포함한다. 항원 결합 작제물의 추가적인 예시는 하기에 기술되며, 실시예에 제공된다.
용어 "이중특이적"은 임의의 제제, 예컨대 각각이 특별한 결합 특이성을 갖는 2개의 항원 결합 모이어티 (예를 들어, 항원 결합 폴리펩티드 작제물)을 갖는 항원 결합 작제물을 포함하도록 의도된다. 예를 들어, 제1 항원 결합 모이어티는 제1 항원 상의 에피토프와 결합하고, 제2 항원 결합 모이어티는 제2 항원 상의 에피토프와 결합하고, 여기서 상기 제1 항원은 상기 제2 항원과 상이하다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 이중특이적 제제는 하기에 결합하거나, 또는 이들과 상호작용할 수 있다: (a) 세포 표면 표적 분자 및 (b) 효과기 세포의 표면 상에서 Fc 수용체. 또 다른 구현예에서, 제제는 하기에 결합하거나, 또는 이들과 상호작용할 수 있다: (a) 제1 세포 표면 표적 분자 및 (b) 상기 제1 세포 표면 표적 분자와 상이한 제2 세포 표면 표적 분자. 또 다른 구현예에서, 제제는 하기에 결합하거나, 또는 2개 세포를 가교, 즉, 이들과 상호작용할 수 있다: (a) 제1 세포 상의 제1 세포 표면 표적 분자 및 (b) 상기 제1 세포 표면 표적 분자와 상이한, 제2 세포 상의 제2 세포 표면 표적 분자.
일부 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 작제물은 면역학적 시냅스의 형성 및/또는 T 세포 지시된 B 세포 감손의 매개로 CD3-발현 T 세포 및 CD19-발현 B 세포를 가교한다.
단일특이적 항원 결합 작제물은 단일 결합 특이성을 갖는 항원 결합 작제물을 지칭한다. 환언하면, 항원 결합 모이어티 둘 모두는 상동한 항원 상의 상동한 에피토프에 결합한다. 단일특이적 항원 결합 작제물의 예시는 예를 들어 항-CD19 항체 HD37 및 항-CD3 항체 OKT3를 포함한다.
항원 결합 작제물은 항체 또는 이의 항원 결합부일 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "항체" 또는 "면역글로불린"은 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들에 의해 실질적으로 암호화된 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 지칭하고, 이것은 피분석물 (예컨대, 항원)에 특이적으로 결합하고 이를 인식한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론과 뮤 불변 영역 유전자뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 항체 또는 면역글로불린의 "부류"는 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 면역글로불린에는 5 개의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 있으며, 이들 중 몇몇은 하위 부류(이소형), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가 구분될 수 있다. 상이한 클래스의 면역글로불린에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 2쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되고, 각 쌍은 1개의 "가벼운" 사슬 (약 25 kD) 및 1개의 "무거운" 사슬 (약 50-70 kD)을 갖는다. 각 사슬의 N-말단 도메인은 항원 인식을 1차적으로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄 (VL)와 가변 중쇄 (VH)는 각각, 이들 경쇄와 중쇄 도메인을 지칭한다.
IgG1 중쇄는 N 말단에서부터 C-말단으로 각각, VH, CH1, CH2와 CH3 도메인으로 구성된다. 경쇄는 N 말단에서부터 C-말단으로 VL과 CL 도메인을 포함한다. IgG1 중쇄는 CH1과 CH2 도메인 사이에 힌지를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역", 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 정의된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체-가변 도메인 영역을 나타낸다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6 개의 HVR; VH에 3 개(H1, H2, H3), 및 VL에 3 개(L1, L2, L3)를 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역 (CDR) 유래의 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 중 후자는 가장 높은 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 관여한다. VH 내의 CDR1을 예외로 하여, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 영역 (HVR)은 또한 "상보성 결정 영역" (CDR)로 지칭되며, 본원에 사용된 이러한 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 영역의 부분과 관련하여 상호교환가능하게 사용된다. 이러한 특정 영역은 하기에 의하여 기술된다: Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983); 및 Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), 여기에서의 정의에는 서로에 대해 비교시 아미노산 잔기의 중복(overlapping) 또는 서브세트가 포함된다. 그러나, 항체의 CDR 또는 이의 변이체를 지칭하는 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있는 것으로 의도된다. 특정의 CDR을 포괄하는 정확한 잔기 번호는 CDR의 서열 및 크기에 따라서 변화될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 항체의 가변 영역 아미노산 서열을 고려하여 잔기가 특정 CDR을 포함하는지에 대해 일상적으로 결정할 수 있다.
항체의 CDR 영역은, 비제한적으로 항체, scFv, 디아바디 등을 포함하는 결합 단백질을 작제하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은, 항체로부터의 CDR 영역 중 적어도 하나 또는 모두를 포함할 것이다. CDR 서열은 항체 골격, 또는 이의 단편 상에서 사용될 수 있으며, 마찬가지로 인간화된 항체, 또는 인간화된 서열을 함유하는 항체를 포함할 수 있다.　항체의 CDR 부분을 동정하는 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다. 참고: Shirai, H., Kidera, A., and Nakamura, H., H3-rules: Identification of CDR-H3 structures in antibodies, FEBS Lett.,　455(1):188-197, 1999; 및 Almagro J C, Fransson, J. Front Biosci. 13:1619-33 (2008).
항원 결합 폴리펩티드 작제물 -- 형식
이중특이적 항원 결합 작제물은 2개의 항원 결합 폴리펩티드 작제물, 예컨대 항원 결합 도메인을 포함한다. 항원 결합 폴리펩티드 작제물의 양식은 이중특이적 항원 결합 작제물의 기능적 특징을 결정한다. 일 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 작제물은, scFv-scFv 양식을 갖고, 이는 즉, 항원 결합 폴리펩티드 작제물 둘 모두가 scFv라는 것이다.
"단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하며, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재한다. 일부 구현예에서, scFv 폴리펩티드는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv에 대한 검토에 대하여서는, 다음을 참조한다: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
기타 항원 결합 폴리펩티드 작제물 형식은 Fab 단편 또는 sdAb를 포함한다.
"Fab 단편" (또한 단편 항원 결합으로 지칭됨)은, 경쇄 및 중쇄 각각에서의 가변 도메인 VL 및 VH에 따라서, 경쇄의 불변 도메인 (CL) 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. 가변 도메인은, 항원 결합에 관여하는, 상보성 결정 루프 (CDR, 또한 초가변 영역으로 지칭됨)를 포함한다. Fab' 단편은 항체-힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카복시 말단에서 소수 잔기의 부가에 의하여 Fab 단편과 상이하다.
"단일 도메인 항체" 또는 "sdAb" 형식은 개별 면역글로불린 도메인이다. "sdab"은 상당한 정도로 안정하며, 항체의 Fc 쇄를 갖는 융합 상대로서 발현되기에 용이하다 (Harmsen MM, De Haard HJ (2007). "Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments". Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22).
양식 scFv
본원에 기술된 항원 결합 작제물은 이중특이적이며, 예를 들어, 이들은 각각 개별 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 2개의 항원 결합 폴리펩티드 작제물을 포함한다. 각각의 항원 결합 폴리펩티드 작제물은 scFv 형식이다. (즉, 폴리펩티드 링커에 연결된, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인으로 구성된 항원 결합 도메인). 일 구현예에서, 상기 scFv은 인간이다. 또 다른 구현예에서, 상기 scFv 분자는 인간화된다. scFv는 단백질 발현에 대해 최적화되고, 하기 기술된 변형에 의하여 산출된다.
scFv는 상기 scFv 내의 가변 도메인 VL 및 VH의 순서를 변경함으로써 최적화될 수 있다. 본원에 기술된 항원 결합 작제물에서의 scFv의 일부 구현예에서, 경쇄 가변 영역의 C-말단은 중쇄 가변 영역의 N-말단에 연결될 수 있거나, 중쇄 가변 영역의 C-말단은 경쇄 가변 영역의 N-말단에 연결될 수 있다.
가변 영역은, 기능적 항원 결합 모이어티의 형성을 가능케하는, 링커 펩티드 또는 scFv 링커를 통하여 연결될 수 있다. scFv는 scFv 링커 폴리펩티드의 조성 및/또는 길이를 변화시킴으로써 단백질 발현 및 산출을 위하여 최적화될 수 있다. 전형적인 펩티드 링커는 약 2-20개의 아미노산을 포함하고, 본원에 기술되거나 본 분야에 알려져 있다. 적절한, 비-변역원성 링커 펩티드는, 예를 들어, 하기를 포함한다: (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n, G4(SG4)n 또는 G2(SG2)n 링커 펩티드, 여기서 n은 일반적으로 1 내지 10 사이의 수, 전형적으로 2 내지 4 사이의 수이다.
일부 구현예에서, scFv 링커는 하기 표로부터 선택된다:
표 B: scFv 링커 폴리펩티드 서열
Figure pct00001
scFv 분자는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 사이의 이황화 가교를 안정화하는 것을 포함함으로써 단백질 발현 및 산출을 위하여 최적화될 수 있다 (예를 들어, 하기 기술된 바와 같음: Reiter et al. (Nat Biotechnol 14, 1239-1245 (1996)). 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 scFv 분자를 포함하며, 중쇄 가변 도메인에서의 아미노산 및 경쇄 가변 도메인에서의 아미노산은 시스테인으로 대체되어, 이로써 이황화 가교는 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 사이에서 형성될 수 있다. 특정 구현예에서, 경쇄 가변 도메인의 아미노산 (위치 44) 및 중쇄 가변 도메인의 아미노산 (위치 100)은 시스테인으로 대체된다 (카밧 넘버링).
본 분야에 알려진 바와 같이, scFv는 또한 CDR 서열의 돌연변이에 의하여 안정화될 수 있다 (하기 기술된 바와 같음: Miller et al., Protein Eng Des Sel. 2010 Jul;23(7):549-57; Igawa et al., MAbs. 2011 May-Jun;3(3):243-5; Perchiacca & Tessier, Annu Rev Chem Biomol Eng. 2012;3:263-86.].
인간화된 CD19 VH 및 VL
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물을 추가로 안정화하기 위하여, HD37 항-CD19 항체의 야생형 서열은 인간화된 VH 및 VL 폴리펩티드 서열을 형성하기 위하여 변형될 수 있다. 프레임워크 영역 및 CDR 둘 모두에 대한 변형은, 항원 결합 작제물의 CD19-결합 scFv 내에서 사용될 VH 및 VL 폴리펩티드 서열을 수득하기 위하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 변형은 도 16에 도시된 것들이며, 변형된 CDR의 서열, VH 및 VL 폴리펩티드 서열은 표 S2 및 S3에 나타낸 것들이다.
scFv의 양식 및 서열에 대한 상기 표시된 변형 중 하나 이상은 항원 결합 작제물의 scFv에 적용될 수 있다.
항원 결합 폴리펩티드 작제물 -- 항원
본원에 기술된 항원 결합 작제물은 CD3 항원 및 CD19 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "항원 결정인자"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이고, 그리고 항원 결합 모이어티가 결합하여, 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상에서 부위 (예컨대, 아미노산의 인접한 연신부 또는 비-인접한 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 입체형태적 배열)를 지칭한다. 에피토프는 독특한 공간 구성에서 통상적으로 적어도 3개, 더 일반적으로, 적어도 5개 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프는 하기를 포함할 수 있다: 결합에 직접적으로 관여하는 아미노산 잔기 및 결합에 직접적으로 관여하지 않는 기타 아미노산 잔기, 예컨대 특이적 항원 결합 펩티드에 의하여 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기; 환언하면, 상기 아미노산 잔기는 특이적 항원 결합 펩티드의 풋프린트(footprint) 내에 있다. 상동한 에피토프를 인식하는 항체는, 표적 항원에 대하여 또 다른 항체의 결합을 차단하는 하나의 항체의 능력을 나타내는 단순 면역검정에서 확인될 수 있다.
"특이적으로 결합한다", "특이적 결합", 또는 "선택적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고 원치 않는 또는 비-특이적 상호작용으로부터 구별될 수 있다는 것을 의미한다. 특이적인 항원 결정인자에 결합하는 항원 결합 작제물의 능력은 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 또는 당업자에게 익숙한 기타 기술, 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 기술 (BIAcore 기구에서 분석됨) (Liljeblad et al, Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적인 결합 검정 (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 계량될 수 있다. 일 구현예에서, 관련 없는 단백질에 항원 결합 모이어티의 결합의 정도는 예로서, SPR에 의해 측정 시, 항원에 대한 항원 결합 작제물의 결합의 약 10% 미만이다.
특정 구현예에서, 항원 결합 모이어티를 포함하는, 항원 또는 항원 결합 분자에 결합하는 항원 결합 작제물은 하기의 해리 상수 (KD)를 갖는다: < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, 또는 < 0.001 nM (예를 들어, 10~ 8 M 이하, 예컨대 10~ 8 M 내지 10"13 M, 예컨대, 10"9 M 내지 10"13 M).
"친화성"은 분자 (예컨대, 수용체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 상대 (예컨대, 리간드) 사이에 비-공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화도"은 결합 쌍의 구성원 (예컨대, 항원 결합 모이어티와 항원, 또는 수용체와 이의 리간드) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도을 지칭한다. 상대 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리와 결합 속도 상수 (각각, k0ff와 kon)의 비율인 해리 상수 (KD)에 의해 표시될 수 있다. 따라서 동등한 친화성은 이들 속도 상수의 비율이 동일하기만 하면, 상이한 속도 상수를 포함할 수도 있다. 친화성은 본원에서 기술된 것들을 비롯하여, 당분야에 공지된 널리 확립된 방법에 의해 계량될 수 있다. 친화성을 계량하기 위한 특정 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR), 또는 관심 항원을 발현하는 세포로의 전체 세포 결합 검정이다.
"감소된 결합", 예를 들면, Fc 수용체에 감소된 결합은 예로서, SPR에 의해 계량될 때, 개별 상호작용에 대한 친화성에서 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 또한, 제로 (또는 분석 방법의 검출 한계 미만), 다시 말하면, 상호작용의 완전한 소멸까지 친화성의 감소를 포함한다. 반대로, "증가된 결합"은 개별 상호작용에 대한 결합 친화도에서 증가를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, "활성화 T 세포 항원"은 T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 표면 상에서 발현된 항원 결정인자를 지칭하고, 이것은 항원 결합 분자와의 상호작용 시에 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 구체적으로, 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원의 상호작용은 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 촉발함으로써 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정 구현예에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3이다.
본원에서 이용된 바와 같이, "T 세포 활성화"는 하기에서 선택되는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 지칭한다: 활성화 마커의 증식, 분화, 시토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 발현. 본 발명의 T 세포 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 측정하기 위한 적절한 검정은 본원에 기술된 분야에 알려져 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "표적 세포 항원"은 종양, 예를 들면, 암 세포 또는 종양 간질의 세포에서 표적 세포, 예를 들면, B 세포의 표면 상에 제시된 항원 결정인자를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 항원 결합 모이어티 등에 대하여 용어 "제1" 및 "제2"는 한 가지 이상의 각 유형의 모이어티가 존재할 때, 동정의 편의를 위해 이용된다. 이들 용어의 이용은 명시되지 않으면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정한 순서 또는 방향을 부여하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "교차-종 결합" 또는 "종간 결합"은 인간 및 다른 생물체, 예를 들면, 하지만 제한 없이 비-침팬지 영장류에서 동일한 표적 분자에 본원에서 기술된 결합 도메인의 결합을 의미한다. 따라서 "교차-종 결합" 또는 "종간 결합"은 상이한 종에서 발현된 동일한 분자 "X" (즉, 동족체)에 종간 반응성, 하지만 "X" 이외의 분자에 종간 반응성 없음으로 이해된다. 예컨대 인간 CD3 엡실론을, 비-침팬지 영장류 CD3 엡실론, 예컨대 마카크(macaque) CD3 엡실론으로 인식하는 단클론성 항체의 교차종 특이성은, 예를 들어, FACS 분석에 의하여 측정될 수 있다. FACS 분석은 개별 단클론성 항체가 상기 인간과 비-침팬지 영장류 CD3 엡실론 항원을 각각 발현하는 인간과 비-침팬지 영장류 세포, 예를 들면, 마카크 세포에 결합에 대해 조사되는 방식으로 수행된다. 적절한 검정법은 하기 실시예에서 제시된다. 상기 언급한 요부는 CD19에 대한 필요한 부분만 수정하여 적용된다. FACS 분석은 개별 단클론성 항체가 인간과 비-침팬지 영장류 CD3 또는 CD19 엡실론 항원을 발현하는 인간과 비-침팬지 영장류 세포, 예를 들면, 마카크 세포에 결합에 대해 시험되는 방식으로 수행된다.
CD3
본원에 기술된 항원 결합 작제물은 CD3 항원에 특이적으로 결합한다.
본원에 기술된 "CD3" 또는 "CD3 복합체"는 서로 및 T-세포 수용체와 비-공유적으로 결합된 성숙 T-림프구에서 적어도 5개 막-결합된 폴리펩티드의 복합체이다. CD3 복합체는 감마, 델타, 엡실론, 및 제타 쇄 (하부단위로 또한 지칭됨)를 포함한다. 뮤린 항체 OKT3, SP34, UCHT1 또는 64.1에 의해 예시되는 바와 같은 비-인간 단클론성 항체가 이들 사슬 중에서 일부에 대해 개발되었다. (참조: 예를 들면, June, et al., J. Immunol. 136:3945-3952 (1986); Yang, et al., J. Immunol. 137:1097-1100 (1986); 및 Hayward, et al., Immunol. 64:87-92 (1988)). 예를 들어, 항-CD3-항체를 고정화함으써 T 세포 상에서의 CD3의 군집화는 T 세포 수용체의 계합과 유사하나, 이의 클론 전형 특이성과는 독립적인 T 세포 활성화를 야기한다. 대부분의 항-CD3-항체는 CD3ε-쇄를 인식한다.
일부 구현예에서, 항-CD3 scFv는 알려진 항-CD3 항체의 scFV이거나, 이로부터 유래된, 예를 들어 알려진 항-CD3 항체의 scFV의 변형된 형태이다. 본원에 기술된 이중특이적 항원 결합 작제물에 이용될 가변 영역 (VH 및 VL)을 제공하는 인간 CD3에 지시된 항체는 본 분야에 알려져 있고, OKT3 (ORTHOCLONE-OKT3™ (무로모납-CD3)를 포함한다. 추가의 항-CD3 항체는 CD3 항원의 엡실론 하부단위에 대한 OKT3의 결합의 50% 이상을 차단하는 "OKT3 차단 항체"를 포함한다. 예시는 비제한적으로 하기를 포함한다: 테플리주맙 ™(MGA031, Eli Lilly); UCHT1 (Pollard et al. 1987 J Histochem Cytochem. 35(11):1329-38); NI0401 (WO2007/033230); 및 비실리주맙 (US25834597).
일 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 작제물은 CD3 항원에 1가로, 그리고 특이적으로 결합하는 CD3 항원 결합 폴리펩티드 작제물을 포함하고, 상기 CD3 항원 결합 폴리펩티드 작제물은 OKT3 (ORTHOCLONE-OKT3™ (무로모납-CD3)로부터 유래된다. 일 구현예에서, 이중특이적 항원 결합 작제물은 CD3 항원에 1가로, 그리고 특이적으로 결합하는 CD3 항원 결합 폴리펩티드 작제물을 포함하고, 상기 CD3 항원 결합 폴리펩티드의 VH 및 VL 영역은 CD3 엡실론-특이적 항체 OKT3로부터 유래된다.
일부 구현예에서, CD19에 대한 제1 scFv의 결합 친화도는 약 0.1 nM 내지 약 5 nM, 또는 5.0, 4.0, 3.0, 2.0, 1.0, 0.9, .09, 0.9, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3 미만, 또는 0.2 nM 미만이다.
OKT3 항체가 결합하는 CD3 엡실론 하부단위 상에서의 에피토프는 CD3 엡실론에 결합하는 OKT3의 결정 구조의 분석에 의하여 동정된다 (Kjer-Nielsen L. et al., (2004) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101: 7675-7680). CD3 엡실론의 폴리펩티드 서열은 하기 표에 제공된다.
표 F: CD3 엡실론 서열
Figure pct00002
이러한 구조의 분석은, 표 F에서의 서열에 대한, OKT3 항체의 CDR가 잔기 56-57 (SE), 68-70 (GDE), 및 101-107 (RGSKPED)에서 인간 CD3 엡실론에 접촉한다는 것을 나타낸다. 이러한 잔기에서의 결합 빈발 영역은 밑줄로 표시되었다. 이러한 잔기는 OKT3가 결합하는 에피토프인 것으로 고려된다. 따라서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은 이러한 에피토프에 특이적으로 결합하는 항원 결합 폴리펩티드 작제물을 포함한다.
적어도 하나의 CD3 발현 세포 상에서의 CD3 복합체에 결합하는 적어도 하나의 CD3 결합 폴리펩티드 작제물을 포함하는 항원 결합 작제물이 본원에 제공되며, 여기서 CD3 발현 세포는 T 세포이다. 특정 구현예에서, 세포를 발현하는 CD3은 인간 세포이다. 일부 구현예에서, CD3 발현 세포는 비-인간, 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 구현예에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이다.
본원에서 제공된 항원 결합 작제물의 일부 구현예에서, 상기 작제물은 표적 세포, 예컨대 B 세포에 대한 T 세포의 세포독성 활성을 활성화하고 전향시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 전향은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 독립적이다.
CD19
본원에 기술된 항원 결합 작제물은 CD19 항원 (항-CD19 scFv)에 결합하는 항원 결합 폴리펩티드 작제물을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-CD19 scFv는 알려진 항-CD19 항체의 scFV이거나, 이로부터 유래된, 예를 들어 알려진 항-CD19 항체의 scFV의 변형된 형태이다. 본원에 기술된 이중특이적 항원 결합 작제물에 이용될 가변 영역 (VH 및 VL)을 제공하는 인간 CD19에 지시된 항체는 본 분야에 알려져 있고, HD37 하이브리도마에 의하여 제공된 HD37를 포함한다 (Pezzutto (1997), J. Immunol. 138, 2793-9). 추가의 항-CD19 항체는 CD19 항원의 엡실론 하부단위에 대한 HD37의 결합의 50% 이상을 차단하는 "HD37 차단 항체"를 포함한다. 예시는 비제한적으로 하기를 포함한다: HD237 (IgG2b) (Fourth International Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Vienna, Austria, 1989; and Pezzutto et al., J. Immunol., 138(9):2793-2799 (1987)); 4G7 (Meecker (1984) Hybridoma 3, 305-20); B4 (Freedman (1987) Blood 70, 418-27); B43 (Bejcek (1995) Cancer Res. 55, 2346-51) 및 Mor-208 (Hammer (2012) Mabs4:5, 571-577).
일 구현예에서, 상기 VH(CD19) 및 VL(CD19) 영역 (또는 이의 부분, 예컨대 CDR)은 HD37 하이브리도마에 의하여 제공된 항-CD19 항체 HD37로부터 유도된다 (Pezzutto (1997), J. Immunol. 138, 2793-9).
일부 구현예에서, CD3의 엡실론 하부단위에 대한 제2 scFv의 결합 친화도는 약 1 nM 내지 약 100 nM, 또는 약 20 nM 내지 약 100 nM, 또는 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 nM 초과 또는 90 nM 초과이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 항원 결합 폴리펩티드 작제물은 B 세포 상의 CD19에 결합하는 scFv 작제물이다. 일부 구현예에서, 상기 scFv 작제물은 포유동물의 것이다. 일 구현예에서, 상기 scFv 작제물은 인간의 것이다. 또 다른 구현예에서, 상기 scFv 작제물은 인간화된 것이다. 또 다른 구현예에서, 상기 scFv 작제물은 인간 중쇄와 경쇄 가변 영역 중에서 적어도 하나를 포함한다.
특정 구현예에서, 항원 결합 폴리펩티드 작제물은 B 세포의 표면 상에서 발현된 적어도 하나의 항원에 교차-종 결합을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물의 항원 결합 폴리펩티드 작제물은 적어도 하나의 포유동물 CD19에 결합한다. 특정 구현예에서, CD19 항원 결합 폴리펩티드 작제물은 인간 CD19에 결합한다.
항원 결합 작제물의 Fc
본원에 기술된 항원 결합 작제물은 Fc, 예컨대 이량체 Fc를 포함한다. 이종이량체 Fc는 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하고, 이는 각각 변형된 CH3 서열을 포함하고, 여기서 각각의 변형된 CH3 서열은 이종이량체 Fc의 형성을 촉진하는 비대칭 아미노산 변형을 포함하고, 이량체화된 CH3 도메인은 약 68°C 이상의 용융 온도(Tm)를 갖고, 상기 제1 Fc 폴리펩티드는 제1 힌지 링커와 함께 상기 제1 항원 결합 폴리펩티드 작제물에 연결되고, 상기 제2 Fc 폴리펩티드는 제2 힌지 링커와 함께 상기 제2 항원 결합 폴리펩티드 작제물에 연결된다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 이용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 본원에서 달리 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역 내에 아미노산 잔기의 넘버링은 하기에서 설명된 바와 같이, EU 인덱스로 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다: Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. 본원에서 이용된 바와 같이, 이량체 Fc의 "Fc 폴리펩티드"는 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드, 다시 말하면, 안정된 자가-결합을 할 수 있는, 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드 중 하나를 지칭한다. 예를 들어, 이량체 IgG Fc의 Fc 폴리펩티드는 IgG CH2와 IgG CH3 불변 도메인 서열을 포함한다.
Fc 도메인은 CH3 도메인 또는 CH3 및 CH2 도메인을 포함한다. CH3 도메인은 2개의 CH3 서열을 포함하고, 이중 하나는 이량체 Fc의 2개의 Fc 폴리펩티드 중 각각으로부터 유래된다. CH2 도메인은 2개의 CH2 서열을 포함하고, 이중 하나는 이량체 Fc의 2개의 Fc 폴리펩티드 중 각각으로부터 유래된다.
일부 양태에서, Fc는 적어도 1개 또는 2개의 CH3 서열을 포함한다. 일부 양태에서, Fc는, 하나 이상의 링커의 존재 또는 부재 하에서, 제1 항원 결합 작제물 및/또는 제2 항원 결합 작제물에 결합한다. 일부 양태에서, Fc는 인간 Fc이다. 일부 양태에서, Fc는 인간 IgG 또는 IgG1 Fc이다. 일부 양태에서, Fc는 이종이량체 Fc이다. 일부 양태에서, Fc는 적어도 1개 또는 2개의 CH2 서열을 포함한다.
일부 양태에서, Fc는 CH3 서열의 적어도 하나에서 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 CH2 서열의 적어도 하나에서 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 단일 폴리펩티드이다. 일부 양태에서, Fc는 다중 펩티드, 예컨대 2개의 폴리펩티드이다.
일부 양태에서, Fc는 하기에 기술된 Fc이다: 특허 출원 PCT/CA2011/001238 (2011년 11월 4일 출원) 또는 PCT/CA2012/050780 (2012년 11월 2일 출원) (이의 전체 개시내용은 본원에 그 전체가 참고로 다목적으로 본원에 편입됨).
변형된 CH3 도메인
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은 비대칭적으로 변형된 CH3 도메인을 포함하는 이종이량체 Fc를 포함한다. 이종이량체 Fc는 2개의 중쇄 불변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 제1 Fc 폴리펩티드 및 제2 Fc 폴리펩티드는 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 단, Fc는 하나의 제1 Fc 폴리펩티드 및 하나의 제2 Fc 폴리펩티드를 포함한다. 일반적으로, 제1 Fc 폴리펩티드는 제1 CH3 서열을 포함하고, 제2 Fc 폴리펩티드는 제2 CH3 서열을 포함한다.
비대칭 방식으로 도입된 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 2개의 CH3 서열은 일반적으로, 2개 CH3 서열이 이량체화 될 경우, 동종이량체보다는 이종이량체 Fc를 결과로 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비대칭 아미노산 변형"은, 제1 CH3 서열 상의 특정 위치에서의 아미노산이 상동한 위치에서의 제2 CH3 서열 상의 아미노산과 상이하고, 그리고 상기 제1 및 제2 CH3 서열이 동종이량체보다는 이종이량체를 형성하도록 우선적으로 쌍을 이루는 임의의 변형을 지칭한다. 이러한 이종이량체화는, 각 서열 상에서의 상동한 각각의 아미노산 위치에서의 2개 아미노산 중 오직 하나의 변형; 또는 제1 및 제2 CH3 서열 상에서의 상동한 각각의 위치에서의 각각의 서열 상의 아미노산 둘 다의 변형의 결과일 수 있다. 이종이량체 Fc의 제1 및 제2 CH3 서열은 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
표 A는 전장 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 231 내지 447에 상응한, 인간 IgG1 Fc 서열의 아미노산 서열을 제공한다. 아미노산 231-238은 또한 더 낮은 힌지로 지칭된다. CH3 서열은 전장 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 341-447을 포함한다.
전형적으로, Fc는 이량체화할 수 있는 2개의 인접 중쇄 서열 (A 및 B)를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 항원 결합 작제물에 관하여, 일부 구현예에서, 제1 scFv는 이종이량체 Fc의 쇄 A와 연결되고, 제2 scFv는 이종이량체 Fc의 쇄 B와 연결된다.　일부 구현예에서, 제2 scFv는 이종이량체 Fc의 쇄 A와 연결되고, 제1 scFv는 이종이량체 Fc의 쇄 B와 연결된다.
　일부 양태에서, Fc의 하나 또는 둘 모두의 서열은 하기에서의 하나 이상의 돌연변이 또는 변형을 포함한다: L351, F405, Y407, T366, K392, T394, T350, S400, 및/또는 N390 (EU 넘버링 사용). 일부 양태에서, Fc는 표 X에 나타난 돌연변이체 서열을 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 변이체 1 A-B의 돌연변이체를 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 변이체 2 A-B의 돌연변이체를 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 변이체 3 A-B의 돌연변이체를 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 변이체 4 A-B의 돌연변이체를 포함한다. 일부 양태에서, Fc는 변이체 5 A-B의 돌연변이체를 포함한다.
표 A: IgG1 Fc 서열 및 변이체
Figure pct00003
제1 및 제2 CH3 서열은, 전장 인간 IgG1 중쇄의 아미노산 231 내지 447에 대하여, 본원에 기술된 아미노산 돌연변이체를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 이종이량체 Fc는 위치 F405 및 Y407에서의 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열 및 위치 T394에서의 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함한다. 일 구현예에서, 이종이량체 Fc는 L351Y, F405A, 및 Y407V으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열 및 T366L, T366I, K392L, K392M, 및 T394W으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함한다.
일 구현예에서, 이종이량체 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서의 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열 및 위치 T366, K392, 및 T394에서의 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 CH3 서열 중 하나는 추가로 위치 Q347에서의 아미노산 변형을 포함하고, 다른 CH3 서열은 추가로 위치 K360에서의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이종이량체 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서의 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열 및 위치 T366, K392, 및 T394에서의 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 CH3 서열 중 하나는 추가로 위치 Q347에서의 아미노산 변형을 포함하고, 다른 CH3 서열은 추가로 위치 K360에서의 아미노산 변형을 포함하고, 그리고 상기 CH3 서열 중 하나 또는 둘 모두는 추가로 아미노산 변형 T350V을 포함한다.
일 구현예에서, 이종이량체 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서의 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열 및 위치 T366, K392, 및 T394에서의 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 CH3 서열 중 하나는 추가로 D399R 또는 D399K의 아미노산 변형을 포함하고, 다른 CH3 서열은 추가로 T411E, T411D, K409E, K409D, K392E 및 K392D 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 이종이량체 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서의 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열 및 위치 T366, K392, 및 T394에서의 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 상기 제1 또는 제2 CH3 서열 중 하나는 추가로 D399R 또는 D399K의 아미노산 변형을 포함하고, 다른 CH3 서열은 추가로 T411E, T411D, K409E, K409D, K392E 및 K392D 중 하나 이상을 포함하고, 그리고 상기 CH3 서열 중 하나 또는 둘 모두는 추가로 아미노산 변형 T350V을 포함한다.
일 구현예에서, 이종이량체 Fc는 위치 L351, F405 및 Y407에서의 아미노산 변형을 갖는 제1 CH3 서열 및 위치 T366, K392, 및 T394에서의 아미노산 변형을 갖는 제2 CH3 서열을 갖는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 상기 CH3 서열 중 하나 또는 둘 모두는 추가로 아미노산 변형 T350V을 포함한다.
일 구현예에서, 이종이량체 Fc는 하기 아미노산 변형을 포함하는 변형된 CH3 도메인을 포함하고, 여기서 "A"는 제1 CH3 서열에 대한 아미노산 변형을 나타내고, 그리고 "B"는 제2 CH3 서열에 대한 아미노산 변형을 나타낸다: A:L351Y_F405A_Y407V, B:T366L_K392M_T394W, A:L351Y_F405A_Y407V, B:T366L_K392L_T394W, A:T350V_L351Y_F405A_Y407V, B:T350V_T366L_K392L_T394W, A:T350V_L351Y_F405A_Y407V, B:T350V_T366L_K392M_T394W, A:T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V, 및/또는 B:T350V_T366L_N390R_K392M_T394W.
하나 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이종이량체 Fc의 형성을 촉진할 수 있으며, 여기서 이종이량체 CH3 도메인은 야생형 동종이량체 CH3 도메인과 비교가능한 안정성을 갖는다. 일 구현예에서, 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진할 수 있으며, 여기서 이종이량체 Fc 도메인은 야생형 동종이량체 Fc 도메인과 비교가능한 안정성을 갖는다. 일 구현예에서, 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형은 이종이량체 Fc 도메인의 형성을 촉진할 수 있으며, 여기서 이종이량체 Fc 도메인은 시차 주사 열량 측정 연구에서의 용융 온도 (Tm)를 통하여 관찰된 안정성을 갖고, 상기 용융 온도는 상응하는 대칭 야생형 동종이량체 Fc 도메인에 대해 관찰된 것의 4°C 이내에 있다. 일부 양태에서, Fc는 야생형 동종이량체 Fc와 비교가능한 안정성을 갖는 이종이량체 Fc의 형성을 촉진하는 CH3 서열 중 적어도 하나에서의 하나 이상의 변형을 포함한다.
일 구현예에서, CH3 도메인의 안정성은 CH3 도메인의 용융 온도를 측정함으로써, 예를 들어 시차 주사 열량측정 (DSC)에 의하여 평가될 수 있다. 따라서, 추가 구현예에서, CH3 도메인은 약 68°C 이상의 용융 온도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, CH3 도메인은 약 70°C 이상의 용융 온도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, CH3 도메인은 약 72°C 이상의 용융 온도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, CH3 도메인은 약 73°C 이상의 용융 온도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, CH3 도메인은 약 75°C 이상의 용융 온도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, CH3 도메인은 약 78°C 이상의 용융 온도를 갖는다. 일부 양태에서, 이량체화된 CH3 서열은 약 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77.5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 또는 85°C 또는 그 이상의 용융 온도 (Tm)를 갖는다.
일부 구현예에서, 변형된 CH3 서열을 포함하는 이종이량체 Fc는 발현된 생성물에서의 동종이량체 Fc와 비교하여 적어도 약 75%의 순도로 형성될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 이종이량체 Fc는 약 80% 초과의 순도로 형성된다. 또 다른 구현예에서, 이종이량체 Fc는 약 85% 초과의 순도로 형성된다. 또 다른 구현예에서, 이종이량체 Fc는 약 90% 초과의 순도로 형성된다. 또 다른 구현예에서, 이종이량체 Fc는 약 95% 초과의 순도로 형성된다. 또 다른 구현예에서, 이종이량체 Fc는 약 97% 초과의 순도로 형성된다. 일부 양태에서, Fc는, 발현될 때, 약 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 초과의 순도로 형성된 이종이량체이다. 일부 양태에서, Fc는, 단일 세포를 통하여 발현될 때, 약 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99% 초과의 순도로 형성된 이종이량체이다.
이종이량체 Fc 형성을 촉진하는 단량체 Fc 폴리펩티드를 변형하기 위한 추가 방법은 하기에 기술된다: 국제 출원 공보 번호 WO 96/027011 (knobs into holes), Gunasekaran et al. (Gunasekaran K. et al. (2010) J Biol Chem. 285, 19637-46, electrostatic design to achieve selective heterodimerization), Davis et al. (Davis, JH. et al. (2010) Prot Eng Des Sel ;23(4): 195-202, strand exchange engineered domain (SEED) technology), 및 Labrijn et al [Efficient generation of stable bi-specific IgG1 by controlled Fab-arm exchange. Labrijn AF, Meesters JI, de Goeij BE, van den Bremer ET, Neijssen J, van Kampen MD, Strumane K, Verploegen S, Kundu A, Gramer MJ, van Berkel PH, van de Winkel JG, Schuurman J, Parren PW. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 26;110(13):5145-50.
CH2 도메인
상기 지시된 바와 같이, 일부 구현예에서, 항원 결합 작제물의 Fc는, CH3 도메인에 부가하여, CH2 도메인을 포함한다. 예로서, IgG1 Fc의 CH2 도메인의 아미노산 서열은 표 A에 나타난 서열의 아미노산 239-340로 동정된다. Fc의 CH2 도메인은 Fc 수용체 및 보체에 결합하고, 따라서 효과기 세포 기능을 매개하는데 관여한다.
용어 "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기술하는데 사용되며, Fc 감마 수용체 (FcγR) 및 신생아(neonatal) 수용체 FcRn를 포함한다.
일반적으로, FcγR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, 이러한 수용체의 대립형질 변이체 및 대안적으로 스플라이싱 형태를 포함하는, 인간에서의 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이는 이의 세포질 도메인 내에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 기타 이소형의 면역글로불린은 또한 특정 FcR에 의해 결합될 수 있다(예를 들어, 참고: Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999)). 활성화 수용체 FcγRIIA는 세포질 도메인 내에서의 면역수용체 티로신계 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 세포질 도메인 내에서의 면역수용체 티로신계 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (하기에서 검토됨:
Figure pct00004
, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcR는 하기에서 검토된다: Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). 미래에 동정될 것인 것들을 포함한, 기타 FcγR는, 본원에 용어 "FcR"로서 포괄된다. FcyR은 또한 다른 유기체 (비제한적으로 마우스, 래트, 토끼, 및 원숭이를 포함)에서 발견된다. 마우스 FcγR은 비제한적으로 하기를 포함한다: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD 16), 및 FcγRIII-2 (CD 16-2). FcγR은 효과기 세포, 예컨대 NK 세포 또는 B 세포에 의하여 발현된다.
보체 활성에는 항원-항체 복합체에 대한 보체 단백질 C1q의 결합이 요구된다. Fc의 CH2 도메인 내의 잔기는 C1q 및 Fc 사이의 상호작용에 관여한다.
본원에 기술된 항원 결합 작제물은 FcRn에 결합할 수 있다. 본 분야에 알려진 바와 같이, FcRn로의 결합은 엔도좀으로부터 세포내이입된 항체를 다시 혈류로 재순환시킨다 (Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766). 이러한 과정은, 전장 분자의 큰 크기로 인한 신장 여과의 억제와 결합되어, 1 내지 3주 범위의 양호한 항체 혈청 반감기를 초래한다. FcRn에 대한 Fc의 결합은 또한 항체 수송에 있어 중요한 역할을 한다. FcRn는 태아로의 모체 IgG의 이동에 원인으로 작용한다 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976); 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). IgG로의 FcRn의 결합은 Fc의 CH2 및 CH3 도메인 내의 잔기를 포함한다.
CH2 도메인에서의 변형은 Fc에 대한 FcR의 결합에 영향을 미칠 수 있다. 상기 지시된 바와 같이, Fc의 CH2 도메인은 2개의 CH2 서열을 포함하고, 이중 하나는 상기 이량체 Fc의 상기 2개의 Fc 폴리펩티드 각각에 위치한다. 전형적으로, CH2 도메인에서의 변형은 대칭적이며, 따라서 Fc 폴리펩티드의 CH2 서열 둘 모두에서 동일하다. 그러나, 비대칭 돌연변이체가 또한 이종이량체화를 개선하는 CH3 도메인 상의 돌연변이체의 존재 하에서 가능하다. 일 구현예에서, CH2 도메인은 FcγR 또는 C1q 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키기 위한 변형을 포함한다.
효과기 기능을 감소시키기 위한 변형:
FcγR 및/또는 보체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 변형은 본 분야에 알려져 있다. 최근 공보는 감소되거나 사일런싱된 효과기 활성을 갖는 항체를 조작하도록 사용되었던 전략을 기술한다 (참고: Strohl, WR (2009), Curr Opin Biotech 20:685-691, and Strohl, WR and Strohl LM, "Antibody Fc engineering for optimal antibody performance" In Therapeutic Antibody Engineering, Cambridge: Woodhead Publishing (2012), pp 225-249). 이러한 전략은, Fc의 힌지 또는 CH2 영역 내에서의 돌연변이체의 도입, 글리코실화의 변형, 또는 IgG2/IgG4 스캐폴드의 사용을 통한 효과기 기능의 감소를 포함한다. 예를 들어, 미국 공보 번호 2011/0212087 (Strohl), 국제 특허 공보 번호 WO 2006/105338 (Xencor), 미국 특허 공보 번호 2012/0225058 (Xencor), 미국 특허 공보 번호 2012/0251531 (Genentech), 및 Strop et al ((2012) J. Mol. Biol. 420: 204-219)는 FcγR 또는 Fc에 대한 보체 결합을 감소시키기 위한 특정 변형을 기술한다.
FcγR 또는 Fc에 대한 보체 결합을 감소시키기 위한 알려진 대칭적 아미노산 변형의 특정의, 비제한적인 예시는 하기 표에 동정된 것들을 포함한다:
표 C: FcγR 또는 Fc에 대한 보체 결합을 감소시키기 위한 변형
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일 구현예에서, Fc는 상기 표에 동정된 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc는 L234, L235, 또는 D265 중 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc는 L234, L235, 및 D265 중 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함한다. 또 다른 구현예에서, Fc는 아미노산 변형 L234A, L235A 및 D265S을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc는, 하기에서 기술된 바와 같이, Fc의 하부 힌지 영역 내의 하나 이상의 비대칭 아미노산 변형을 포함한다: 국제 특허 번호 PCT/CA2014/050507. FcγR 결합을 감소시키는, 그러한 비대칭 아미노산 변형의 예시는 표 D에 나타난다.
표 D: FcγR 결합을 감소시키는 비대칭 돌연변이체
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힌지 링커
본원에 기술된 항원 결합 작제물에서, 제1 Fc 폴리펩티드는 제1 힌지 링커를 갖는 제1 항원 결합 폴리펩티드 작제물로 연결되고, 제2 Fc 폴리펩티드는 제2 힌지 링커를 갖는 제2 항원 결합 폴리펩티드 작제물로 연결된다. 힌지 링커 서열의 예시는 본 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 본원에 기술된 항원 결합 작제물에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 알려진 힌지 링커의 변형된 형태가 사용될 수 있다.
힌지 링커 폴리펩티드는, 이들이 항원 결합 작제물의 기능적 활성을 유지 또는 최적화하도록 선택된다. 적절한 링커 폴리펩티드는 IgG 힌지 영역, 예컨대 예를 들어, 상부 힌지 서열 및 코어 힌지 서열을 포함하는, IgG1, IgG2, 또는 IgG4로부터 유래된 것들을 포함한다. 상부 힌지 서열 및 코어 힌지 서열에 상응하는 아미노산 잔기는, IgG 유형에 따라 달라지며, 본 분야에 알려진 바와 같이, 본 분야의 숙련가는 주어진 IgG 유형에 대해 그러한 서열을 용이하게 동정할 수 있을 것이다. 이러한 예시적인 링커의 변형된 형태가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, IgG4 힌지의 안정성을 개선하기 위한 변형은 본 분야에 알려져 있다 (참고: 예를 들어, Labrijn et al. (2009) Nature Biotechnology 27, 767 - 771). 힌지 링커 서열의 예시는 하기 표에서 발견된다.
표 E: 힌지 링커 폴리펩티드 서열 (서열 번호:351 -360)
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Figure pct00008
해리 상수 (K D ) 및 최대 결합 ( Bmax )
일부 구현예에서, 항원 결합 작제물은 비제한적으로 해리 상수 및 최대 결합을 포함하는 기능적 특성에 의하여 기술된다.
본원에 사용된 용어 "해리 상수 (KD)"는 특정 리간드-단백질 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭하도록 의도된다. 본원에 사용된 바와 같이, 리간드-단백질 상호작용은, 비제한적으로 단백질-단백질 상호작용 또는 항체-항원 상호작용을 지칭한다. KD는 2개 단백질의 경향 (예를 들어, AB)를 측정하여 더 작은 성분(A+B)으로 역해리하고, 이는 해리 속도 (또는 "오프-레이트(koff)"로 지칭됨) 대 결합 속도 (또는 "온-레이트(kon)"로 지칭됨)의 비로서 정의된다. 따라서, KD는 koff/kon이며, 몰 농도 (M)로서 표시된다. 이는, KD가 더 작을 수록, 결합 친화도가 더 강하다는 것을 나타낸다. 따라서, 1 mM의 KD는 1 nM의 KD와 비교하여, 약한 결합 친화도를 나타낸다. 항원 결합 작제물에 대한 KD 값은 본 분야에 잘 정립된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 항원 결합 작제물의 KD를 측정하기 위한 일 방법은 표면 플라스몬 공명 (SPR), 전형적으로는 바이오센서 시스템, 예컨대 바이아코어(Biacore)® 시스템을 사용하는 것에 의한 것이다. 등온 적정 열량측정 (ITC)은 측정하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법이다.
용어 "Bmax" 또는 최대 결합은 항원 결합 작제물의 포화 농도에서 세포 상의 최대 항원 결합 작제물 결합 수준을 지칭한다. 이러한 파라미터는, 상대적 비교를 위하여, 비표준화 단위 MFI로 보고되거나, 표준 곡선의 사용과 함께, 세포에 결합된 항원 결합 작제물의 수에 상응하여, 절대값으로 변환된다.
항원 결합 작제물의 결합 특성은 다양한 기술에 의하여 측정될 수 있다. 이중 하나는 유동 세포측정 (FACS, 형광-활성화 세포 분류)에 의하여 항원을 발현하는 세포를 표적화하는 결합을 측정하는 것이다. 전형적으로, 이러한 실험에서, 관심 항원을 발현하는 표적 세포는 상이한 농도에서 항원 결합 작제물로 배양되고, 세정되고, 상기 항원 결합 작제물을 검출하기 위한 2차 제제로 배양되고, 세정되고, 그리고 유동세포 측정으로 분석되어 세포 상의 검출 신호 세기를 나타내는 평균 형광 강도 (MFI)를 측정하며, 이는 차례로 세포에 결합된 항원 결합 작제물에 수와 연관된다. 항원 결합 작제물 농도 대 MFI 데이터는 포화 결합 등식에 이후 피팅되어, 2개의 중요 결합 파라미터, Bmax 및 겉보기 KD를 산출한다.
겉보기 KD, 또는 겉보기 평형 해리 상수는, 절반 최대 세포 결합이 관찰되는 항원 결합 작제물 농도를 나타낸다. 명백하게, KD 값이 작을수록, 최대 세포 결합에 도달하도록 요구되는 항원 결합 작제물 농도가 더 작아지며, 따라서 항원 결합 작제물의 친화도가 더 높아진다. 겉보기 KD는 세포 상에 발현된 상이한 수용체 수준과 같은 세포 결합 실험 조건에 의존적이며, 따라서 겉보기 KD는 일반적으로 무세포 분자 실험, 예컨대 SPR 및 ITC로부터 측정된 KD 값과 상이하다. 그러나, 일반적으로 상이한 방법 사이에 양호한 일치가 발견된다.
항원 결합 작제물의 제조 방법
본원에 기술된 항원 결합 작제물은 예를 들어, 특허 번호 4,816,567에 기술된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물을 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 그러한 핵산은 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예컨대, 항원 결합 작제물의 경쇄 및/또는 중쇄)을 포함하는 아미노산 서열을 암호화할 수 있다. 추가 구현예에서, 그러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 일 구현예에서, 핵산은 다중시스트론성 벡터에서 제공된다. 추가 구현예에서, 그러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 그러한 일 구현예에서, 숙주 세포는 하기를 포함한다 (예를 들어, 하기로 변형되었다): (1) 항원 결합 작제물의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항원 결합 폴리펩티드 작제물의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 또는 (2) 항원 결합 폴리펩티드 작제물의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항원 결합 폴리펩티드 작제물의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 일 구현예에서, 숙주 세포는 진행 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 인간 진핵 신장 (HEK) 세포 또는 림프 세포 (예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, 항원 결합 작제물의 제조 방법이 제공되며, 상기 방법은, 상기 제공된 바와 같은, 항원 결합 작제물을 항원 결합 작제물의 발현을 위하여 적절한 조건 하에서 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 임의로 상기 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터의 항원 결합 작제물을 회수하는 단계를 포함한다.
항원 결합 작제물의 재조합 생성을 위하여, 항원 결합 작제물, 예컨대 상기 제공된 바와 같은 것을 암호화하는 핵산은 단리되고, 숙주 세포 내의 추가적인 클로닝 및/또는 발현을 위하여 하나 이상의 벡터로 삽입된다. 그러한 핵산은 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 단리 및 시퀀싱될 수 있다 (예컨대, 항원 결합 작제물의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써).
항원 결합 작제물-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 본원에 기술된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다.
"재조합 숙주 세포" 또는 "숙주 세포"는, 삽입, 예를 들어, 직접적인 취입, 형질도입, f-메이팅(f-mating)에 사용되기 위한 방법, 또는 재조합 숙주 세포를 창조하기 위한 본 분야에 알려진 기타 방법에 관계 없이, 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 지칭한다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 비-통합(nonintegrated)된 벡터, 예를 들면, 플라스미드로서 유지될 수 있으며, 대안적으로, 숙주 게놈으로 통합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "진핵체"는 계통발생 도메인 진핵생물계(Eucarya), 예컨대 동물 (비제한적으로 포유동물, 곤충, 파충류, 조류 등), 섬모충류, 식물 (비제한적으로 외떡잎 식물, 쌍떡잎식물, 조류(algae) 등), 진균류, 효모, 편모충류, 미포자충류, 원생 생물 등에 속하는 유기체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "원핵생물"은 원핵 유기체를 지칭한다. 예를 들면, 비-진핵 유기체는 하기에 속할 수 있다: 진정박테리아 (비제한적으로 하기를 포함: 에스케리치아 콜리, 테르무스 테모필러스, 바실러스 스테아로테모필루스, 슈도모나스 플루오레스센스, 슈도모나스 에어루기노사, 슈도모나스 푸티다, 등) 계통발생적 도메인, 또는 고세균 (비제한적으로 하기를 포함: 메타노코커스 얀나쉬이, 메타노박테리움 테르모오토트로피쿰, 할로박테리움 예컨대 할로페락스 볼카니 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아차에오글로버스 풀기더스, 파이로코쿠스 푸리오서스, 파이로코쿠스 호리코쉬이, 애우로피룸(Aeuropyrum) 페르닉스, 등) 계통발생적 도메인.
예를 들어, 항원 결합 작제물은, 박테리아에서, 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 경우, 생성될 수 있다. 박테리아 내의 항원 결합 작제물 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해서는, 예를 들어 하기를 참조한다: 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523. (또한 참고: Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 　248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254, (이. 콜라이 내의 항체 단편의 발현을 기술). 발현 후, 항원 결합 작제물은 용해성 분획 내에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다.
원핵 생물에 부가하여, 진핵 미생물 예컨대 섬사상 진균류 또는 효모는 항원 결합 작제물-암호화 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 이는 글리코실화 경로가 인간화된 진균류 및 효모 균주를 포함하며, 부분적으로 또는 전부의 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항원 결합 작제물의 생성을 초래한다. 참고: Gerngross, Nat. Biotech. 　22:1409-1414 (2004), and Li et al.,　Nat. Biotech. 　24:210-215 (2006).
글리코실화된 항원 결합 작제물의 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 또한 다세포성 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예시는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 조합하여, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위하여 사용될 수 있는, 수많은 바큐로바이러스 균주가 동정되었다.
식물 세포 배양물은 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 다음을 참고한다: 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (형질전환 식물에서의 항원 결합 작제물을 생성하기 위한 PLANTIBODIES™ 기술을 기술함).
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁제에서 성장하도록 조정된 포유동물 세포주는 유용할 수 있다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 하기이다: SV40 (COS-7)에 의하여 변형된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면 하기에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포: Graham et al.,　J. Gen Virol . 36:59 (1977)); 어린 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들면, 하기에 기재된 TM4 세포: Mather, Biol . Reprod . 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 갯과(canine) 신장 세포 (MDCK; 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유선 종양 (MMT 060562); 예를 들면, 하기에 기재된 TRI 세포: Mather et al.,　Annals N.Y . Acad . Sci. 383:44-68 (1982); MRC 5 세포; 및 FS4 세포. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 하기를 포함한다: DHFR- CHO 세포를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub et al.,　Proc . Natl . Acad . Sci . USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0. 항원 결합 작제물 생성에 적절한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는, 예를 들어 하기를 참고한다: Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003).
일 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은 하기 단계를 포함하는 방법에 의하여 안정된 포유동물 세포에서 생성된다: 적어도 하나의 안정된 포유동물 세포를 소정의 비율로 항원 결합 작제물을 암호화하는 핵산으로 형질감염시키는 단계; 및 적어도 하나의 포유동물 세포에서 핵산을 발현하는 단계. 일부 구현예에서, 핵산의 소정의 비율은, 발현된 생성물 내에서의 항원 결합 작제물의 가장 높은 백분율을 초래하는 입력 핵산의 상대적인 비율을 측정하는 일시적 형질감염 실험에서 측정된다.
필요 시, 항원 결합 작제물은 발현 후 정제 또는 단리될 수 있다. 단백질은 당해분야의 숙련가에게 알려진 다양한 방법으로 단리 또는 정제될 수 있다. 표준 정제 방법은 크로마토그래피 기술을 포함하고, 이는 이온 교환, 소수성 상호작용, 친화도, 사이징, 또는 겔 여과 및 역상을 포함하며, FPLC 및 HPLC와 같은 시스템을 사용하여 대기 압력에서, 또는 높은 압력에서 수행된다. 정제 방법은 또한 전기영동, 면역학적, 침전, 투과, 및 크로마토초점맞춤(chromatofocusing) 기술을 포함할 수 있다. 단백질 농도에 관련하여, 한외여과 및 정용여과 기술이 또한 유용하다. 본 분야에 잘 알려진 바와 같이, 천연 단백질은 Fc 및 항체에 결합하고, 이러한 단백질은 항원 결합 작제물의 정제를 위하여 본 발명에서 용도를 발견할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 단백질 A 및 G는 Fc 영역에 결합한다. 마찬가지로, 박테리아 단백질 L은 일부 항체의 Fab 영역에 결합한다. 정제는 종종 특정 융합 상대에 의하여 가능해질 수 있다. 예를 들어, 항체는 글루타티온 수지 (GST 융합이 이용될 경우), Ni+2 친화도 크로마토그래피 (His-태그가 이용될 경우), 또는 고정화된 항-플래그 항체 (플래그-태그가 이용될 경우)를 사용하여 정제될 수 있다. 적절한 정제 기술에 대한 일반적인 안내사항은 예를 들어 전체가 참조로 편입된 하기를 참조한다: Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994 (참고로 그 전체가 편입됨). 필요한 정제의 정도는 항원 결합 작제물의 사용에 따라 달라질 것이다. 일부 경우에서, 정제는 필요하지 않다.
특정 구현예에서, 항원 결합 작제물은 Q-세파로오스, DEAE 세파로오스, 포로스(poros) HQ, 포로스 DEAF, 토요펄(Toyopearl) Q, 토요펄 QAE, 토요펄 DEAE, 자원/공급원 Q와 DEAE, 프락토겔(Fractogel) Q 및 DEAE 칼럼 상에서 크로마토그래피가 포함되지만 이에 국한되지 않는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제된다.
특정 구현예에서, 본원에서 기술된 단백질은 SP-세파로오스, CM 세파로오스, 포로스 HS, 포로스 CM, 토요펄 SP, 토요펄 CM, 자원/공급원 S와 CM, 프락토겔 S와 CM 칼럼 및 이들의 등가물과 동등물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 정제된다.
이에 더하여, 본원에서 기술된 항원 결합 작제물은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다 (예를 들어, 참고: Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N.Y 및 Hunkapiller et al., Nature, 310:105-111 (1984)). 예를 들어, 폴리펩티드의 단편에 상응하는 폴리펩티드는 펩티드 합성장치의 이용에 의해 합성될 수 있다. 게다가, 원하는 경우에, 비고전적인 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 치환 또는 부가로서 폴리펩티드 서열 내로 도입될 수 있다. 비-고전적인 아미노산은 비제한적으로, 통상적인 아미노산의 D-이성질체, 2,4디아미노부티르산, 알파-아미노 이소부티르산, 4아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, g-Abu, e-Ahx, 6아미노 헥사노익산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, -알라닌, 플루오로-아미노산, 설계자 아미노산, 예를 들면, -메틸아미노산, C-메틸아미노산, N-메틸아미노산, 그리고 전체적으로 아미노산 유사체를 포함한다. 게다가, 아미노산은 D (우선성) 또는 L (좌선성)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은 실질적으로 정제된다. 용어 "실질적으로 정제된"은, 특정 구현예에서, 오염 단백질의 (건조 중량으로) 약 30% 미만, 약 25% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 또는 약 1% 미만을 갖는 단백질의 제조물을 포함하는 세포성 물질이 실질적으로 없는, 재조합 생성된 항원 결합 작제물의 경우, 이의 천연 발생 환경, 즉 천연 세포 또는 숙주 세포에서 발견된 단백질과 일반적으로 동반하거나 상호작용하는 성분이 실질적으로 또는 필수적으로 없을 수 있는 본원에 기술된 작제물 또는 이의 변이체를 지칭한다. 항원 결합 작제물 또는 이의 변이체가 숙주 세포에 의하여 재조합으로 생성될 경우, 특정 구현예에서 단백질은 세포의 (건조 중량으로) 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 또는 그 미만으로 존재한다. 항원 결합 작제물 또는 이의 변이체가 숙주 세포에 의하여 재조합으로 생성될 경우, 특정 구현예에서 단백질은 세포의 (건조 중량으로) 약 5 g/L, 약 4 g/L, 약 3 g/L, 약 2 g/L, 약 1 g/L, 약 750 mg/L, 약 500 mg/L, 약 250 mg/L, 약 100 mg/L, 약 50 mg/L, 약 10 mg/L, 또는 약 1 mg/L 또는 그 미만으로 배양 배지 내에 존재한다. 어떤 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 의하여 생성된 "실질적으로 정제된" 항원 결합 작제물은 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%의 순도 수준, 구체적으로는, 적어도 약 75%, 80%, 85%의 순도 수준, 그리고 더 구체적으로는 적어도 약 90%의 순도 수준, 적어도 약 95%의 순도 수준, 적어도 약 99% 이상의 순도 수준을 갖는다 (적절한 방법 예컨대 SDS/PAGE 분석, RP-HPLC, SEC, 및 모세관 전기영동에 의하여 측정시).
번역후 변형:
특정 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은 번역 동안 또는 번역 후에 차별적으로 변형된다.
본원에 사용된 용어 "변형된"은 소정의 폴리펩티드에 대해 행해진 임의의 변화, 예컨대 폴리펩티드의 길이, 아미노산 서열, 화학 구조, 폴리펩티드의 공-번역 변형 또는 번역-후 변형에 대한 변화를 지칭한다. 형태 "(변형된)" 용어는 검토된 폴리펩티드가 임의로 변형되었다는 것, 즉, 검토 하의 폴리펩티드가 변형 또는 비변형될 수 있다는 것을 의미한다.
용어 "번역-후 변형된"은 폴리펩티드 쇄에 편입된 후 아미노산에 발생하는 천연 또는 비-천연 아미노산의 임의의 변형이다. 용어는, 오직 예시로서, 하기를 포함한다: 공-번역 생체내 변형, 공-번역 시험관내 변형 (예컨대 무세포 번역 시스템), 번역-후 생체내 변형, 및 번역-후 시험관내 변형.
일부 구현예에서, 변형은 하기 중 적어도 하나이다: 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호/차단기에 의한 유도체화, 단백분해성 절단, 항체 분자 또는 항원 결합 작제물 또는 기타 세포성 리간드로의 연결. 일부 구현예에서, 항원 결합 작제물은 브롬화시안, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4에 의한 특이적인 화학적 절단; 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원; 및 튜니카마이신의 존재에서 대사 합성을 비제한적으로 포함하는 알려진 기술에 의해 화학적으로 변형된다.
본원에서 설명된 항원 결합 작제물의 추가의 번역후 변형에는 예로서, N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 사슬, N-말단 또는 C-말단 단부의 처리, 아미노산 골격에 화학적 모이어티의 부착, N-연결된 또는 O-연결된 탄수화물 사슬의 화학적 변형, 그리고 원핵생물 숙주 세포 발현의 결과로서 N-말단 메티오닌 잔기의 부가 또는 결실이 포함된다. 본원에서 설명된 항원 결합 작제물은 단백질의 검출과 단리를 가능하게 하는 검출가능한 표지, 예를 들면, 효소 표지, 형광 표지, 동위원소 표지 또는 친화성 표지로 변형된다. 특정 구현예에서, 적절한 효소 표지의 실례에는 양고추냉이 과산화효소, 알칼리성 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 또는 아세틸콜린에스테라아제가 포함되고; 적절한 보결 원자단 복합체의 실례에는 스트렙타비딘 비오틴과 아비딘/비오틴이 포함되고; 적절한 형광 물질의 실례에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시안산염, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 염화물 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 실례에는 루미놀이 포함되고; 생물발광 물질의 실례에는 루시페라아제, 루시페린, 그리고 에쿼린이 포함되고; 그리고 적절한 방사성 물질의 실례에는 요오드, 탄소, 황, 트리튬, 인듐, 테크네튬, 탈륨, 갈륨, 팔라듐, 몰리브덴, 크세논, 불소가 포함된다.
일부 구현예에서, 본원에서 기술된 항원 결합 작제물은 방사선금속 이온과 결합하는 대환식 킬레이터에 부착된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은 천연적 과정, 예컨대 번역-후 처리에 의하여, 또는 본원에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의하여 변형된다. 특정 구현예에서, 변형의 상동한 유형은 소정의 폴리펩티드에서의 몇몇의 부위에서의 상동한 또는 다양한 정도로 존재할 수 있다. 특정 구현예에서, 본원에서 기술된 항원 결합 작제물로부터의 폴리펩티드는 예로서, 유비퀴틴화의 결과로서 분지화되고, 그리고 일부 구현예에서, 분지형성 (branching)이 있거나 없는 환식이다. 환식, 분지된, 그리고 분지된 환식 폴리펩티드는 번역후 자연 과정으로부터 결과이거나 또는 합성 방법에 의해 만들어진다. 변형에는 아세틸화, 아실화, ADP-리보실화, 아미드화, 플라빈의 공유 부착, 헴 (heme) 모이어티의 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교-연결, 고리화, 이황화 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교-연결의 형성, 시스테인의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 요오드화, 메틸화, 미리스틸화, 산화, 페길화, 단백분해 처리, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 아미노산의 전이-RNA 매개된 부가, 예를 들면, 아르기닐화, 그리고 유비퀴틴화가 포함된다. (예를 들어, 참고: PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993); POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 663:48-62 (1992)).
특정 구현예에서, 본원에서 기술된 항원 결합 작제물은 고형 지지체에 부착되는데, 이들은 본원에서 기술된 단백질에 의해 결합되는, 이들에 결합하는, 또는 이들과 연합하는 폴리펩티드의 면역학적검정 또는 정제에 특히 유용하다. 이런 고형 지지체에는 유리, 셀룰로오스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 염화물 또는 폴리프로필렌이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
항원 결합 작제물의 기능적 활성 검정
본원에서 기술된 항원 결합 작제물은 당분야에 공지된 검정뿐만 아니라 본원에서 기술된 검정을 이용하거나 또는 일과적으로 변경하여, 기능적 활성 (예를 들어, 생물학적 활성)에 대해 검정될 수 있다.
본원에 기술된 항원 결합 작제물의 생물학적 활성을 시험하는 방법은 실시예에서 기술된 다양한 검정에 의하여 측정될 수 있다. 그러한 방법은 인간 전혈 또는 PBMC를 포함하는, 표적 CD19+ B 세포의 T-세포-매개된 사멸을 측정하는 시험관내 검정을 포함한다. 그러한 검정은 또한 정제된 T 세포 배양 및 자가 표적 B 세포 또는 종양 B 세포를 사용하여 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은, FACS 및/또는 현미경관찰로 검정 시, CD19+ 라지 (Raji) B 세포 및 주르카트 (Jurkat) T 세포 사이의 시냅스 형성 및 가교가 가능하다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은 인간 전혈에서 CD20+ B 세포의 T-세포 지시된 사멸을 매개한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은, v875 및/또는 v1661과 비교하여, 개선된 생물리학 특성을 나타내고/내거나; v875 및/또는 v1661과 비교하여, 개선된 산출량 (예컨대 SEC (크기 배제 크로마토그래피) 후 10 mg/L 초과에서 발현됨)을 나타내고/내거나; 이형이량체 순도, 예컨대 95% 초과를 나타낸다. 일 구현예에서, 상기 검정은 하기 실시예에서 기술된 것들이다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 이중특이적 항원 결합 작제물의 기능적 특성은 참조 항원 결합 작제물의 그것과 비교된다. 참조 항원 결합 작제물의 동일성(identity)은 측정된 기능적 특성 또는 제조 차이에 따라 달라진다. 예를 들어, 예시적인 이중특이적 항원 결합 작제물의 기능적 특성을 비교시, 참조 항원 결합 작제물은 항 CD19 항체 HD37 및/또는 항 CD3 항체 OKT3일 수 있다. 다른 구현예에서, 참조 항원 결합 작제물은, 예컨대 v v875 및 v1661와 같은 본원에 기술된 작제물이다.
항체가 OKT3 또는 HD37에 대한 결합을 차단하는 정도는, 시험 항체가 OKT3 또는 HD37 항체 (참조 항체)의 이의 표적 항원으로의 특이적 결합을 억제 또는 차단할 수 있는 경쟁 검정을 사용하여 평가될 수 있다 (예를 들어, 참고: Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990; Fendly et al. Cancer Research 50: 1550-1558; US 6,949,245 (검정의 예시로서)).　시험 항체는, 시험 항체의 과잉 (예컨대, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x, 또는 100x)이 참조 항체의 결합을 예컨대, 경쟁적 결합 검정에서 측정 시, 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 억제 또는 차단할 경우, 참조 항체와 경쟁한다.　경쟁 검정에 의해 동정된 시험 항체 (차단 항체)는 참조 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 및 입체 장애가 일어나기 위해 참조 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 가까운 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
예컨대, 항원에 결합하거나 또는 항원에 결합에 대해 다른 폴리펩티드와 경쟁하거나, 또는 Fc 수용체 및/또는 항-알부민 항체에 결합하는 본원에서 기술된 항원 결합 작제물의 능력에 대해 검정하는 일 구현예에서, 방사성면역학적검정, ELISA (효소 연결된 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역학적검정, 면역방사계측 검정, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 검정, 원위치 면역학적검정 (예로서, 콜로이드 금, 효소 또는 방사성동위원소 표지 이용), 웨스턴 블롯, 침전 반응, 응집 검정 (예컨대, 겔 응집 검정, 적혈구응집 검정), 보체 고정 검정, 면역형광 검정, 단백질 A 검정, 그리고 면역전기영동 검정 등과 같은 기술을 이용한 경쟁적 검정 시스템과 비-경쟁적 검정 시스템이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당분야에 공지된 다양한 면역학적검정이 이용될 수 있다. 일 구현예에서, 항체 결합은 1차 항체 상에서 표지을 검출함으로써 검출된다. 다른 구현예에서, 1차 항체는 1차 항체에 2차 항체 또는 시약의 결합을 검출함으로써 검출된다. 추가의 구현예에서, 2차 항체는 표지화된다. 면역학적검정에서 결합을 검출하기 위한 많은 수단이 당분야에 공지되어 있고, 그리고 본 발명의 범위 내에 있다.
특정 구현예에서, 결합 상대 (예컨대, 수용체 또는 리간드)가 본원에서 기술된 항원 결합 작제물에 의해 포함되는 항원 결합 도메인에 대해 확인된 경우에, 본원에서 기술된 항원 결합 작제물에 의한 상기 결합 상대에 결합은 예로서, 당분야에 널리 공지된 수단, 예를 들면, 예컨대 환원과 비-환원 겔 크로마토그래피, 단백질 친화성 크로마토그래피, 그리고 친화성 블롯팅에 의해 검정된다. 전체적으로, 다음을 참고한다: Phizicky et al., Microbiol. Rev. 59:94-123 (1995). 다른 구현예에서, 본원에서 기술된 항원 결합 작제물의 항원 결합 폴리펩티드 작제물의 기질(들)에 결합하는 항원 결합 작제물 단백질의 생리학적 상관관계의 능력은 당분야에 공지된 기술을 이용하여 일과적으로 검정될 수 있다.
항원 결합 작제물 및 항체 약물 콘주게이트 ( ADC )
특정 구현예에서, 본원에서 기술된 항원 결합 작제물은 약물, 예컨대 독소, 화학치료적 제제, 면역 조절제 또는 방사성 동위원소에 콘주게이트된다. ADC (항체 약물 콘주게이트 또는 항원 결합 작제물 약물 콘주게이트)를 제조하는 몇몇 방법은 본 분야에 잘 알려져 있으며, 하기에 기재된다: 예를 들어, 미국 특허 번호 8,624,003 (포트(pot) 방법), 8,163,888 (1-단계), 및 5,208,020 (2-단계 방법).
일부 구현예에서, 약물은 메이탄신, 오리스타틴, 칼리키아마이신, 또는 이의 유도체로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 약물은 DM1 및 DM4로부터 선택된 메이탄신이다.
일부 구현예에서, 약물은 SMCC 링커 (DM1), 또는 SPDB 링커 (DM4)를 갖는 항원 결합 작제물에 콘주게이트된다.
일부 구현예에서, 항원 결합 작제물은 세포독성 제제에 콘주게이트된다. 본원에 사용된 용어 "세포독성 제제"는 세포의 기능을 억제 또는 예방하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 상기 용어 하기를 포함하도록 유도된다: 방사성 동위원소 (예를 들면 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, 및 Lu177), 화학치료제, 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 (이의 단편 및/또는 변이체 포함)의 독소 예컨대 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소.
콘주게이트 링커
일부 구현예에서, 약물은 링커에 의하여 항원 결합 작제물, 예를 들어 항체에 연결된다. 항체로의 링커의 부착은 다양한 방법, 예컨대 표면 리신, 산화 탄수화물에 대한 환원성-결합을 통하여, 그리고 쇄간 이황화물 결합을 감소시킴으로써 비제약화(liberated)된 시스테인 잔기를 통하여 달성될 수 있다. ADC 연결 시스템의 다양성은 본 분야에 알려져 있으며, 이는 하이드라존-, 디설파이드-, 및 펩티드-계 연결을 포함한다.
적절한 링커는, 예를 들어 절단가능한 링커 및 비-절단가능한 링커를 포함한다. 절단가능한 링커는 세포내 조건 하에서의 절단에 대해 전형적으로 민감하다. 적절한 절단 링커는 예를 들어, 세포내 프로테아제로 절단가능한 펩티드 링커, 예컨대 리소좀 프로테아제 또는 엔도좀 프로테아제를 포함한다. 링커, 예컨대 MC 링커 등은 상기 항체가 약물이 방출되기 위하여 새포내로 분해되어야만 하는 정도까지 항체와 공유결합 할 수 있다.
약제학적 조성물
본원에 기술된 항원 결합 작제물을 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 제공된다. 약제학적 조성물은 작제물 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다.
용어 "약제학적으로 허용가능한"은, 동물에서, 그리고 더 구체적으로는 인간에서의 사용에 대해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인지된 약전에 열거되어 있거나, 주 또는 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인됨을 의미한다. 용어 "담체"는, 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체들은 땅콩 오일, 콩 오일, 미네랄 오일, 참깨 오일, 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성적 기원의 액체들을 포함하는, 물 및 오일들과 같은 무균의 액체들일 수 있다. 일부 양태에서, 담체는 천연에서 발견되지 않는 인공 담체이다. 물은 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우 담체로서 사용될 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서, 특히 주사가능한 용액을 위해 사용될 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 가루, 백악, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올, 등을 포함한다. 조성물은, 바람직한 경우, 또한 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 서방형 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 트리글리세라이드와 같은 전통적인 결합제 및 담체로 좌제로서 제형화될 수 있다. 경구 제제는 표준 담체, 예를 들면, 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적절한 약제학적 담체의 예시는 하기에 기술된다: "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. 이런 조성물은 환자에 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위한 적절한 양의 담체와 함께, 가급적 정제된 형태에서 화합물의 치료적 유효량을 함유할 것이다. 제형은 투여 방식이 적합해야 한다.
특정 구현예에서, 상기 작제물을 포함하는 조성물은 인간에 정맥내 투여를 위하여 조정된 약제학적 조성물로서 일과적인 절차에 따라 조제된다. 전형적으로, 정맥내 투여를 위한 조성물은 무균 등장성 수성 완충액에서 용액이다. 필요한 경우에, 조성물은 또한, 용해화제 및 주사의 부위에서 통증을 경감하기 위한 국부 마취제, 예를 들면, 리그노카인을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이들 성분은 개별적으로 제공되거나 또는 예로서, 밀봉 차단된 용기, 예를 들면, 활성 성분의 양을 표시하는 앰풀 또는 봉지에서 건성 냉동건조된 분말 또는 물 없는 농축물로서 단위 제형에서 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우에, 이것은 무균 약제학적 등급 물 또는 염수를 함유하는 주입 병을 이용하여 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 무균 주사용수 또는 염수의 앰풀은 이들 성분이 투여에 앞서 혼합되도록 제공될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 기술된 조성물은 중성 또는 염 형태로서 조제된다. 약제학적으로 허용가능한 염에는 음이온으로 형성된 것들, 예를 들면, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 주석산 등으로부터 유래된 것들, 그리고 양이온으로 형성된 것들, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것들이 포함된다.
치료 방법
질환 또는 장애의 치료 방법이 본원에 개시되며, 이는 그러한 치료, 예방, 또는 개선을 원하는 대상체에 본원에 기술된 항원 결합 작제물을 상기 질환 또는 장애가 치료, 예방, 또는 개선되기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함한다.
장애 및 질환은 상호 교환적으로 사용되며, 본원에 기술된 항원 결합 작제물 또는 방법으로 치료에 의하여 이점을 제공받을 임의의 병태를 지칭한다. 이는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다 (포유동물에 상기 장애에 대한 의심 소인이 있는 병리학적 조건을 포함). 일부 구현예에서, 장애는 암이다.
용어 "대상체"는 치료, 관찰, 또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. 동물은, 인간, 비-인간 영장류, 반려 동물(예컨대, 개, 고양이 등), 농장 동물 (예컨대, 소, 양, 돼지, 말 등) 또는 실험 동물 (예컨대, 래트, 마우스, 기니피그 등)을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "포유동물"은 비제한적으로 하기를 포함한다: 인간, 비-인간 영장류, 고양잇과, 뮤린, 소, 말, 및 돼지.
"치료"는 치료받는 개체 또는 세포의 자연스러운 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 나타내며, 예방을 위해 또는 임상 병리 경과 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 하기를 포함한다: 질환 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리 결과의 약화, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 또는 향상된 예후. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물 및 방법은 질환 또는 장애의 발전을 지연시키는데 사용된다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물 및 방법은 종양 퇴행에 영향을 미친다. 일 구현예에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물 및 방법은 종양/암 성장의 억제에 영향을 미친다.
바람직한 치료 효과는 비제한적으로 하기를 포함한다: 질환 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리 결과의 약화, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 또는 향상된 예후. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 작제물들은 질환의 발달을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추는데 이용된다.
본원에 사용된 용어 "유효량"은, 투여되는 작제물의 양을 지칭하는데, 이것은 예컨대 치료될 질환, 병태 또는 장애의 증상 중 하나 이상을 어느 정도 경감시키는 것과 같은 인용된 방법의 목적을 성취할 것이다. 치료적 단백질의 일탈적인 발현 및/또는 활성과 연관된 질환 또는 장애의 치료, 억제와 예방에서 효과적인 본원에서 기술된 조성물의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 이에 더하여, 최적 용량 범위를 확인하는데 도움이 되는 시험관내 검정이 임의로 이용될 수 있다. 조제에서 이용되는 정확한 투여량은 또한, 투여의 루트, 그리고 질환 또는 장애의 심각도에 의존할 것이고, 그리고 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 효과적인 투여량은 시험관내 또는 동물 모델 검사 시스템으로부터 도출된 용량-반응 곡선으로부터 외삽된다.
치료적 용도:
일 양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은 항체-기반 요법에서 사용되며, 이는 하나 이상의 질환, 장애, 또는 병태의 치료를 위하여 항원 결합 작제물, 또는 항원 결합 작제물을 암호화하는 핵산을 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 암의 예방, 치료, 또는 개선을 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 본원에 기술된 항원 결합 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 그러한 예방, 치료 또는 개선을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 치료가 필요한 포유동물에서 암을 치료하는 방법이 제시되고, 상기 방법은 임의로 다른 약제학적으로 활성 분자와 함께 본원에서 기술된 약제학적 조성물의 유효량을 포함하는 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 암은 림프종 또는 백혈병이다.
일 구현예에서, 암은 림프종 또는 백혈병 또는 B 세포 악성 종양, 또는 CD19를 발현하는 암, 또는 비-호지킨성 림프종 (NHL) 또는 외투 세포 림프종 (MCL) 또는 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 리툭시맙- 또는 CHOP (사이톡산TM/아드리아마이신TM빈크리스틴/프레드시논 요법)-내성 B 세포 암이다.
추가 양태에서, 본원에 기술된 항원 결합 작제물은, 약제의 생산 또는 제조에서의 사용을 위한 것이다. 일 구현예에서, 약제는 암의 치료를 위한 것이다. 특정 구현예에서, 약제는 림프종 또는 백혈병의 치료를 위한 것이다. 다른 구현예에서, 약제는 상기 기술된 암의 치료를 위한 것이다. 또 하나의 구현예에서, 상기 약제는 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 것이며, 이는 암을 갖는 환자에게 상기 약제의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기술된 방법 및 용도는 환자에게 하기 중 적어도 하나의 추가 치료제의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함한다: 예를 들면, 세포독성 약물, 화학치료제, 사이토카인, 성장 억제된 제제, 키나제 억제제, 항-혈관형성제, 심장보호제, 면역자극제성 제제, 면역억제성 제제, 단백질 티로신 키나제 (PTK) 억제제, 다른 항체, Fc 융합, 또는 면역글로불린, 또는 다른 치료제.
특정 구현예에서, 추가 치료제는 암의 예방 및/또는 치료를 위한 것이다. 이러한 병용 요법은 합동된 투여 (여기서 2가지 또는 그 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 제형 내에 포함된다), 및 별개의 투여를 포괄하고, 이런 경우에, 본원에서 설명된 항원 결합 작제물의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 이전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 이후에 일어날 수 있다.
본원에 기술된 항원 결합 작제물은 단독으로, 또는 다른 유형의 치료 (예를 들면, 방사선 요법, 화학요법, 호르몬 요법, 면역요법 및 항종양 제제)와 병용하여 투여될 수 있다.
치료적 또는 예방적 활성의 예증:
본원에서 설명된 항원 결합 작제물 또는 약제학적 조성물은 인간에서 이용에 앞서, 원하는 치료적 또는 예방적 활성에 대해 시험관내에서, 그리고 이후 생체내에서 조사된다. 예를 들어, 화합물 또는 약제학적 조성물의 치료적 또는 예방적 유용성을 예증하는 시험관내 검정은 세포주 또는 환자 조직 시료에 대한 화합물의 효과를 포함한다. 세포주 및/또는 조직 시료에 대한 화합물 또는 조성물의 효과는 로제트(rosette) 형성 검정과 세포 용해 검정이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당업자에게 공지된 기술을 활용하여 결정될 수 있다.
치료적/예방적 투여 및 조성물:
대상체에 본원에서 설명된 항원 결합 작제물 또는 약제학적 조성물의 유효량의 투여에 의한 치료, 억제와 예방의 방법이 제시된다. 일 구현예에서, 항원 결합 작제물은 실질적으로 정제된다 (가령, 이의 효과를 제한하거나 또는 원치 않는 부작용을 유발하는 물질이 실질적으로 없다). 특정 구현예에서, 대상체는 소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개 등과 같은 동물, 그리고 특정 구현예에서, 포유동물, 그리고 가장 바람직하게는 인간이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 동물이다.
다양한 전달 시스템, 예를 들면, 리포좀 내에 피포(encapsulation), 마이크로입자, 마이크로캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 세포내섭취 (예로서, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 핵산의 작제 등은 알려져 있고 본원에서 설명된 항원 결합 작제물를 투여하는데 이용될 수 있다. 도입방법은 경피, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 및 경구 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 항원 결합 작제물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면, 주입 또는 일시 주사에 의해, 상피 또는 점막피부 내층 (가령, 구강 점막, 직장과 장 점막 등)을 통합 흡수에 의해 투여될 수 있고, 그리고 기타 치료학적 제제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국부적일 수 있다. 투여의 적절한 경로는 심실내와 척수강내 주사를 포함하고; 심실내 주사는 예로서, 저장고, 예를 들면, 옴마야(Ommaya) 저장고에 부착된 심실내 카테터에 의해 가능해질 수 있다. 폐 투여 역시, 예로서 흡입기 또는 분무기의 이용, 그리고 에어로졸화제를 이용한 조제에 의해 활용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에서 설명된 항원 결합 작제물 또는 조성물을 치료가 필요한 구역에 국부적으로 투여하는 것이 바람직하며; 이것은 예로서, 그리고 제한 없이, 수술 동안 국부적 주입에 의해, 예로서 수술후 상처 드레싱과 함께 국소 적용에 의해, 주사에 의해, 카테터에 의해, 좌약에 의해, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있고, 상기 이식물은 막, 예를 들면, 실라스틱 막, 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비-다공성, 또는 아교질 물질이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 비롯한 단백질을 투여할 때, 상기 단백질이 흡수되지 않는 물질을 이용하도록 주의해야 한다.
다른 구현예에서, 항원 결합 작제물 또는 조성물은 소포, 특히 리포좀에 담겨 전달될 수 있다 (참조: Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; 전술한 문헌의 일반 내용 참고.)
또 다른 구현예에서, 항원 결합 작제물 또는 조성물은 서방성(controlled release) 시스템에 담겨 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 이용될 수 있다 (참고: Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). 또 다른 구현예에서, 폴리머 물질이 사용될 수 있다 (참고: Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); 또한 참고: Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). 또 다른 구현예에서, 제어된 방출 시스템은 치료적 표적, 예를 들면, 뇌의 인근에 배치될 수 있고, 따라서 전신 투여량 중에서 단지 소량을 필요로 한다 (예를 들어, 참고: Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
다른 서방성 시스템은 Langer (Science 249:1527-1533 (1990))에 의한 평론에서 논의된다.
키트 및 제조 물품
또한 본원에 기술된 하나 이상의 항원 결합 작제물을 포함하는 키트가 본원에 기술된다. 키트의 개별 성분은 개별 용기 내에, 그리고 그러한 용기와 연합하여 패키징될 수 있으며, 의약품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의하여 규정된 형식으로의 공지가 있을 수 있으며, 상기 공지는 상기 기관의 제조, 사용, 또는 판매에 대한 승인을 반영한다. 키트는 임의로 항원 결합 작제물에 대한 사용 방법 또는 투여 레지멘을 개괄하는 설명서 또는 지침을 함유할 수 있다.
키트의 하나 이상의 성분이, 용액, 예컨대 수성 용액 또는 멸균 수성 용액으로 제공될 경우, 용기 수단은 그 자체가 상기 용액이 대상체에 투여될 수 있거나 상기 키트의 기타 성분에 적용 및 혼합될 수 있는 흡입제, 주사기, 피펫, 점안기, 또는 그와 같은 장치일 수 있다.
키트의 성분은 또한 건조 또는 냉동건조된 형태로 제공될 수 있으며, 상기 키트는 냉동건조된 성분의 재구성을 위하여 적절한 용매를 추가적으로 함유할 수 있다. 용기의 수 또는 유형과 상관 없이, 본원에 기술된 키트는 환자로의 조성물의 투여를 보조하기 위한 기구를 또한 포함할 수 있다. 그러한 기구는 흡입제, 비강 스프레이 장치, 주사기, 피펫, 겸자, 측정 스푼, 점안기 또는 유사한 의학적으로 승인된 전달 비히클일 수 있다.
본원에 기술된 또 다른 양태에서, 전술한 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제시된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 이와 연관된 표지 또는 포장내 삽입물을 포함한다. 적절한 용기에는 예로서, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하고, 예방하고 및/또는 진단하는데 효과적인 다른 조성물과 합동되는 조성물을 보유하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (예컨대, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통되는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 상기 조성물 내의 적어도 하나의 활성 제제는 본원에 기술된 T 세포 활성화 항원 결합 작제물이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 질환을 치료하는데 이용된다는 것을 표시한다. 게다가, 제조 물품은 (a) 조성물이 내부에 포함된 첫 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 본원에서 기술된 항원 결합 작제물을 포함한다); 및 (b) 조성물이 내부에 포함된 두 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 추가의 세포독성제 또는 만약 그렇지 않으면, 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본원에 기술된 이러한 구현예에서, 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는데 이용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 더욱 포함할 수도 있다. 대안으로, 또는 부가적으로, 제조 물품은 약제학적으로 허용가능한 완충액, 예를 들면, 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 (또는 세 번째) 용기를 더욱 포함할 수도 있다. 이는 또한 상업적 및 사용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질, 예컨대 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드
본원에 기술된 항원 결합 작제물은 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 기술된 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 기술된다. 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 단리된다.
본원에 사용된 바와 같이, "단리된"은, 천연 세포 배양 환경의 성분으로부터 동정되었고, 분리되고/되거나 회수된 제제 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드)를 의미한다. 천연 환경의 오염물질 성분은 항원 결합 작제물에 대해 진단성 또는 치료성 사용을 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. "단리된"은 또한 예를 들어, 인간 개입(intervention)을 통하여 합성 생성된 제제를 지칭한다.
상기 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 다시 말하면, 폴리펩티드에 관한 설명은 펩티드의 설명 및 단백질의 설명에 동등하게 적용되고, 그리고 그 반대로도 그렇다. 이들 용어는 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 비-자연적으로 암호화된 아미노산인 아미노산 중합체에 적용된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 이들 용어는 전장 단백질을 비롯한 임의의 길이의 아미노산 사슬을 포괄하고, 여기서 아미노산 잔기는 공유 펩티드 결합에 의해 연결된다.
상기 용어 "아미노산"은 천연 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모사체 뿐만 아니라 천연-발생 및 비천연-발생 아미노산을 지칭한다. 자연적으로 암호화된 아미노산은 20개 공통 아미노산 (알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 그리고 발린) 및 피롤리신과 셀레노시스테인이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 다시 말하면, 수소에 결합된 탄소, 카르복실 기, 아미노 기, 그리고 R 기를 갖는 화합물, 예를 들면, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이런 유사체는 변형된 R 기 (예컨대, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산에 대한 참조는 예로서, 자연 발생 단백질생성 L-아미노산; D-아미노산, 화학적으로 변형된 아미노산, 예를 들면, 아미노산 변이체와 유도체; 자연 발생 비-단백질생성 아미노산, 예를 들면, β-알라닌, 오르니틴 등; 그리고 아미노산에 특징적인 것으로 당분야에 알려진 성질을 갖는 화학적으로 합성된 화합물을 포함한다. 비-자연 발생 아미노산의 실례에는 α-메틸아미노산 (예컨대, α-메틸알라닌), D-아미노산, 히스티딘-유사 아미노산 (예컨대, 2-아미노-히스티딘, β-히드록시-히스티딘, 호모히스티딘), 측쇄 내에 추가의 메틸렌을 갖는 아미노산 ("호모" 아미노산), 그리고 측쇄 내에 카르복실산 작용기가 술폰산 기로 대체되는 아미노산 (가령, 시스테인산)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 단백질 내로 합성 비-천연 아미노산, 치환된 아미노산, 또는 하나 이상의 D-아미노산을 비롯한 비-자연 아미노산의 함입은 다수의 상이한 방식으로 유리할 수 있다. D-아미노산-함유 펩티드 등은 L-아미노산-함유 대응물과 비교하여 시험관내에서 또는 생체내에서 증가된 안정성을 보인다. 따라서 D-아미노산을 함입하는 펩티드 등의 작제는 더욱 큰 세포내 안정성이 요망되거나 또는 요구될 때, 특히 유용할 수 있다. 더욱 구체적으로, D-펩티드 등은 내인성 펩티드분해효소와 프로테아제에 내성이고, 따라서 분자의 향상된 생체이용률, 그리고 생체내에서 연장된 수명을 이런 성질이 바람직할 때 제공한다. 부가적으로, D-펩티드 등은 T 보조 세포에 주요 조직적합성 복합체 클래스 II-국한된 제시를 위해 효율적으로 처리될 수 없고, 따라서 전체 생물체에서 체액성 면역 반응을 유도할 가능성이 더욱 낮다.
아미노산은 본원에서 기관[IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission]에 의해 추천되는 이들의 통상적으로 공지된 3문자 심볼 또는 1문자 심볼에 의해 지칭될 수 있다. 마찬가지로 뉴클레오티드는 이들의 통상적으로 수용되는 1문자 코드에 의해 지칭될 수 있다.
항원 결합 작제물의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본원에 기술된다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 2개 이상의 뉴클레오티드 분자의 연속적 연신부(stretch)를 표시하는 것으로 의도된다. 뉴클레오티드 서열은 게놈, cDNA, RNA, 반합성 또는 합성 기원, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
용어 "핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는다면, 상기 용어는 참조 핵산으로서의 유사한 결합 특성을 갖고 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사작용하는 천연 뉴클레오티드의 알려진 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 구체적으로 제한되지 않는다면, 상기 용어는 또한 안티센스 기술에 사용되는, PNA (펩티드핵산(peptidonucleic acid)), DNA 유사체 (포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트, 등)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 유사체를 지칭한다. 달리 지정되지 않는 경우, 특정 핵산 서열은 또한 함축적으로 명백하게 지적된 서열 뿐만 아니라 보존적으로 변형된 이의 변이체(축퇴성 코돈 치환을 비제한적으로 포함) 및 상보적 서열을 포괄한다. 특이적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 3번째 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기들로 치환된 서열을 합성함에 의해 성취될 수 있다(참고: Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
"보존적으로 변형된 변이체"는 아미노산 및 핵산 서열 둘다에 적용된다. 특정 핵산 서열과 관련하여, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나 필수적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 지칭하거나 상기 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우, 필수적으로 동일한 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 축퇴성 때문에, 대다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 소정의 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 상기 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU 모두는 아미노산 알라닌을 암호화한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정된 모든 위치에서, 상기 코돈은 암호화된 폴리펩티드를 변형시키는 것 없이 기재된 상응하는 임의의 코돈으로 변화될 수 있다. 상기 핵산 변형은 보존적으로 변형된 변형의 한 종류인 "사일런트 변형"이다. 본원에서 폴리펩티드를 암호화하는 모든 핵산 서열은 또한 모든 가능한 핵산의 사일런트 변형을 기재한다. 당업자는 핵산 내에 각 코돈 (통상적으로, 메티오닌에 대한 유일 코돈인 AUG, 그리고 통상적으로, 트립토판에 대한 유일 코돈인 TGG 제외)이 기능적으로 동일한 분자를 산출하기 위해 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 각 침묵 변이는 각 설명된 서열에서 잠재한다.
아미노산 서열에 관하여, 당업자는 암호화된 서열 내에 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실하는 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질 서열에 개별 치환, 결실 또는 부가가 이런 변경이 아미노산의 결실, 아미노산의 부가, 또는 화학적으로 유사한 아미노산으로 아미노산의 치환을 유발하는 경우에, "보존성으로 변형된 변이체"라는 것을 인지할 것이다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당업자에게 알려져 있다. 상기 보존적으로 변형된 변이체는 또한 본원에 기술된 다형성 변이체, 종간 동족체 및 대립유전자를 부가하며, 그리고 이들을 배제하지 않는다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존성 치환 표는 당업자에게 알려져 있다. 하기의 8개 그룹은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 글라이신 (G); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); 7) 세린 (S), 트레오닌 (T); 및 [0139] 8) 시스테인 (C), 메티오닌 (M) (참고: 예를 들어, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition (December 1993)
2개 또는 그 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은 동일한 2개 또는 그 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 서열은 하기 서열 비교 알고리즘 (또는 당업자에게 가용한 기타 알고리즘) 중에서 한 가지를 이용한 계량에서 또는 수동 정렬과 육안 검사에 의해 비교 윈도우 또는 지정된 영역 위에서 최대 상응성을 위해 비교되고 정렬될 때, 그들이 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 백분율 (즉, 특정된 영역 위에서 약 60% 동일성, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95% 동일성)을 가지면 "실질적으로 동일하다". 이러한 정의는 또한, 검사 서열의 보체를 지칭한다. 동일성은 길이에서 적어도 약 50개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역 위에서, 또는 길이에서 75-100개 아미노산 또는 뉴클레오티드인 영역 위에서, 또는 특정되지 않는 경우에, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 인간 이외의 종으로부터 동족체를 비롯하여, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 라이브러리를 엄격한 혼성화 조건 하에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 갖는 표지화된 프로브로 스크리닝하고, 그리고 상기 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 전장 cDNA와 게놈 클론을 단리하는 것를 포함하는 공정에 의해 수득될 수 있다. 이런 혼성화 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 표준 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용하는 경우, 시험 및 표준 서열은 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 서브서열 코디네이트를 지정하고 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나 대안적인 파라미터가 지정될 수 있다. 이어서 상기 서열 비교 알고리즘은 프로그램 파라미터를 기준으로 표준 서열에 상대적인 시험 서열에 대한 % 서열 동일성을 계산한다.
본원에 사용된 바와 같은 "비교 창"은 서열이 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접 위치들의 표준 서열과 비교될 수 있는 20 내지 600개, 일반적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 다수의 인접 위치들 중 어느 하나의 분절에 대한 지칭을 포함한다. 비교를 위한 서열의 정렬 방법은 당업계에 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 예를 들어, 하기를 비제한적으로 포함하여 수행될 수 있다: 하기 문헌의 국소 상동성 알고리즘: Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, 하기 문헌의 국소 상동성 알고리즘: Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, 하기 문헌의 유사성 방법에 대한 탐색: Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, 이러한 알고리즘의 컴퓨터화된 실행 (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), 또는 수동 정렬 및 육안 검사 (예를 들어, 다음을 참고: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)).
서열 동일성(%) 및 서열 유사성을 측정하는 데 적합한 알고리즘의 한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 문헌 [Altschul et al., (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 및 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기술되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 웹사이트 World Wide Web at ncbi.nlm.nih.gov.에서 수득가능한 기관[National Center for Biotechnology Information]을 통해 대중에게 가용하다. 상기 BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램 (뉴클레오티드 서열에 대한)은 디폴트로서 11의 단어길이(W), 10의 예상치(E), M=5, N=4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 단어길이 및 10의 예상치(E) 및 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (참고: Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) 50의 정렬(B), 10의 예상치(E), M=5, N=-4, 및 양 가닥의 비교를 사용한다. BLAST 알고리즘은 전형적으로 "낮은 복합성" 필터를 비활성화한 채로 수행된다.
BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다 (예를 들면, 참고: Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). BLAST 알고리즘에 의하여 제공된 유사성의 일 측정은 최소 총합 확률 (P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 핵산은, 만약 참조 핵산에 대한 시험 핵산의 비교에서의 최소 총합 확률이 약 0.2 미만, 또는 약 0.01 미만, 또는 약 0.001 미만일 때, 참조 서열과 유사한 것으로 고려된다.
관용구 "선별적으로 (또는 특이적으로) 혼성화하는"은 서열이 복합 혼합물 (전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA가 포함되지만 이들에 국한되지 않음) 내에 존재할 때, 엄격한 혼성화 조건 하에 단지 특정 뉴클레오티드 서열에 분자의 결합, 이중나선화, 또는 혼성화를 지칭한다.
관용구 "엄격한 혼성화 조건"은 당분야에 공지된 바와 같은 낮은 이온 강도와 높은 온도의 조건 하에 DNA, RNA, 또는 기타 핵산, 또는 이들의 조합의 서열의 혼성화를 지칭한다. 전형적으로, 엄격한 조건 하에 프로브는 핵산의 복합 혼합물 (전체 세포 또는 라이브러리 DNA 또는 RNA가 포함되지만 이들에 국한되지 않음) 내에 표적 하위서열에 혼성화하지만 복합 혼합물 내에 다른 서열에 혼성화하지 않는다. 엄중 조건은 서열 의존적이고 상이한 상황에서 상이할 것이다. 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화화한다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내사항은 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)에서 발견된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "조작한다, 조작된, 조작"은 펩티드 골격의 임의의 조작 또는 자연 발생 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 번역후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작(engineering)은 아미노산 서열의 변형, 글리코실화 패턴의 변형, 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형뿐만 아니라 이들 접근법의 조합을 포함한다. 조작된 단백질은 표준 분자 생물학 기술에 의해 발현되고 생산된다.
"단리된 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드"는 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA인 것으로 의도된다. 예컨대, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드에 대한 추가적인 예로는 이종 숙주 세포에 유지되는 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 단리된 폴리뉴클레오티드에는 폴리뉴클레오티드 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자가 포함되지만, 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자에는 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체뿐만 아니라 양성과 음성 가닥 형태, 그리고 이중 가닥 형태가 포함된다. 본원에서 기술된 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에는 합성으로, 예를 들어 PCR 또는 화학 합성을 통하여 생산된 그러한 분자를 추가로 포함한다. 이에 더하여, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 특정 구현예에서, 조절 요소, 예를 들면, 프로모터, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결인자를 포함한다.
용어 "중합효소 사슬 반응" 또는 "PCR"은 일반적으로, 예로서 하기에서 설명된 바와 같이, 시험관내에서 원하는 뉴클레오티드 서열의 증폭을 위한 방법을 지칭한다: 특허 번호 4,683,195. 일반적으로, PCR 방법은 주형 핵산에 우선적으로 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용한 프라이머 신장(extension) 합성의 반복 주기를 수반한다.
예로서, 본 발명의 참고 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 서열이 참고 뉴클레오티드 서열의 각 100개 뉴클레오티드마다 최대 5개까지의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참고 서열과 동일하다는 것을 의도한다. 다시 말하면, 참고 뉴클레오티드 서열에 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 획득하기 위해, 참고 서열 내에 뉴클레오티드 중에서 최대 5%까지 결실되거나 또는 다른 뉴클레오티드로 치환되고, 또는 참고 서열 내에 전체 뉴클레오티드 중에서 최대 5%까지의 숫자의 뉴클레오티드가 참고 서열 내로 삽입될 수 있다. 참고 서열의 이들 변형은 참고 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서, 또는 참고 서열에서 또는 참고 서열 내에 하나 이상의 인접한 기에서 잔기 사이에 개별적으로 산재된, 이들 말단 위치 사이의 임의의 장소에서 발생할 수 있다. 실질적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 지는 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, 폴리펩티드의 경우에 전술한 것들 (예컨대, ALIGN-2)을 이용하여 관례적으로 측정될 수 있다.
폴리펩티드의 유도체, 또는 변이체는 유도체 또는 변이체의 아미노산 서열이 본래 펩티드로부터 100개 아미노산 서열과 적어도 50% 동일성을 가지면, "상동성"을 공유하거나 또는 본래 펩티드와 "상동한" 것으로 일컬어진다. 특정 구현예에서, 유도체 또는 변이체는 펩티드, 또는 유도체와 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 상기 펩티드의 단편과 적어도 75% 동일하다. 특정 구현예에서, 유도체 또는 변이체는 펩티드, 또는 유도체와 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 상기 펩티드의 단편과 적어도 85% 동일하다. 특정 구현예에서, 유도체의 아미노산 서열은 펩티드, 또는 유도체와 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 상기 펩티드의 단편과 적어도 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 유도체의 아미노산 서열은 펩티드, 또는 유도체와 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 상기 펩티드의 단편과 적어도 95% 동일하다. 특정 구현예에서, 유도체 또는 변이체는 펩티드, 또는 유도체와 동일한 숫자의 아미노산 잔기를 갖는 상기 펩티드의 단편과 적어도 99% 동일하다.
본원에 사용된 용어 "변형"은 소정의 폴리펩티드에 대해 행해진 임의의 변화, 예컨대 폴리펩티드의 길이, 아미노산 서열, 화학 구조, 폴리펩티드의 공-번역 변형 또는 번역-후 변형에 대한 변화를 지칭한다. 형태 "(변형된)" 용어는 검토된 폴리펩티드가 임의로 변형되었다는 것, 즉, 검토 하의 폴리펩티드가 변형 또는 비변형될 수 있다는 것을 의미한다.
일부 양태에서, 항원 결합 작제물은 본원에서 검토된 표(들) 또는 승인 번호에서 제시된 관련 아미노산 서열 또는 이의 단편과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상동한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 단리된 항원 결합 작제물은 본원에서 검토된 표(들) 또는 승인 번호에서 제시된 관련 뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 상동한 폴리뉴클레오티드에 의하여 암호화된 아미노산 서열을 포함한다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 청구된 요부가 속하는 당해 분야의 평균적 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 용어에 대한 복수의 정의가 있는 경우에, 본 섹션에 있는 것들이 우선한다. URL 또는 다른 이와 같은 식별자 또는 주소가 참조되는 경우에, 이런 식별자는 변할 수 있고, 그리고 인터넷 상에서 특정 정보는 변천할 수 있지만, 동등한 정보가 인터넷을 검색함으로써 발견될 수 있는 것으로 이해된다. 이에 대한 참조는 이런 정보의 가용성과 배포를 증거한다. 항체 기술의 분야의 당업자에 의해 이해되는 용어는 각각, 본원에서 명시적으로 달리 정의되지 않으면, 당분야에서 획득된 의미가 부여된다.
상기의 일반적 설명과 하기의 상세한 설명은 예시적이고 단지 설명을 위한 것이고 첨부된 임의의 요부를 한정하지 않는 것으로 이해된다.
본 출원에서, 단수의 이용은 달리 특정되지 않으면, 복수를 포함한다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 지시되지 않으면, 언급된 범위 내에 임의의 정수의 값 및 적절하면, 이의 분율 (예컨대, 정수의 10분 1과 100분의 1)을 포함하는 것으로 이해된다. 본원에서 이용된 바와 같이, "약"은 달리 지시되지 않으면, 지시된 범위, 값, 순서, 또는 구조의 ± 10%를 의미한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 하나 ("a"와 "an")는 달리 지시되거나 또는 문맥에 의해 지시되지 않으면, 열거된 성분 중에서 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안 (예를 들면, "또는")의 사용은 상기 대안 중 하나, 둘, 또는 이의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "함유한다"와 "포함한다"는 동의어로서 이용된다. 이에 더하여, 본원에서 기술된 구조와 치환체의 다양한 조합으로부터 유래된 개별 단일쇄 폴리펩티드 또는 면역글로불린 작제물은 마치 각 단일쇄 폴리펩티드 또는 이종이량체가 개별적으로 진술되는 것과 동일한 정도로 본 출원에 의해 개시된 것으로 이해되어야 한다. 따라서 개별 단일쇄 폴리펩티드 또는 이종이량체를 형성하기 위한 특정 성분의 선별은 본 발명의 범위 내에 있다.
본 명세서에서 사용된 섹션 제목들은 단지 조직적 목적을 위한 것이며, 기술된 요지를 제한하는 것으로 해석되지는 않는다.
본원에서 기술된 방법과 조성물은 본원에서 기술된 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 작제물, 그리고 시약에 한정되지 않고, 따라서 변할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 본원에서 이용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이고, 그리고 본원에서 기술된 방법과 조성물의 범위를 한정하는 것으로 의도되지 않으며, 상기 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 한정되는 것으로 이해된다.
특허, 특허 출원, 논문, 서적, 매뉴얼, 그리고 조약이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 본 출원에서 인용된 모든 문서, 또는 문서의 일부분은 본원에 전체적으로 참조로서 명시적으로 편입된다. 본원에 언급된 모든 공보 및 특허들은, 예를 들면, 본원에 기술된 방법, 조성물 및 화합물과 함께 사용될 수도 있는, 공보에 기술된 작제물 및 방법론을 기술 및 기재할 목적으로 본원에 참고로 그 전체가 포함된다. 본원에서 논의된 공보들은 본원의 출원일 이전에 그것의 개시내용에 대해 단독으로 제공된다. 본원에서 어느 것도 본원에서 기술된 발명자들이 선행 발명에 의해서 또는 임의의 다른 이유로 이런 개시에 앞서는 권리가 없음을 시인하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
실시예
하기의 특정적이고 비제한적 실시예는 단시 예시하는 것으로 간주되고, 그리고 본 발명을 결코 한정하지 않는다. 추가의 상술 없이, 당업자는 본원의 설명에 기초하여, 본 발명을 충분하게 이용할 수 있는 것으로 생각된다. 본원에서 언급된 모든 간행물은 본원에 전체적으로 참조로서 편입된다. URL 또는 다른 이와 같은 식별자 또는 주소가 참조되는 경우에, 이런 식별자는 변할 수 있고, 그리고 인터넷 상에서 특정 정보는 변천할 수 있지만, 동등한 정보가 인터넷을 검색함으로써 발견될 수 있는 것으로 이해된다. 이에 대한 참조는 이런 정보의 가용성과 배포를 증거한다.
본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 설명을 목적으로 하고 이의 관점에서 다양한 변형 및 변화는 당업자에게 시사되고 본원의 취지 및 관점 및 첨부된 청구항의 범위내에 포함되어야 하는 것으로 이해된다.
실시예 1. 항원 결합 작제물 및 대조군의 설계, 발현 및 정제.
도 1은 항원 결합 작제물 설계의 도식적 묘사를 도시한다. 도 1a는 효과기 기능을 매개할 수 있는 Fc를 갖는 예시적인 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 묘사를 나타낸다. 항원 결합 작제물의 항원 결합 도메인 둘 다는 scFv이며, 여기서 각 scFv의 VH 및 VL 영역은 폴리펩티드 링커와 연결된다. 각 scFv는 또한 힌지 폴리펩티드를 갖는 이종이량체 Fc의 하나의 폴리펩티드 쇄에 연결된다. 항원 결합 작제물의 2개 폴리펩티드 쇄는 이황화 결합을 통하여 함께 공유적으로 연결된다 (단속선으로 묘사됨). 도 1b는 Fc 녹아웃을 갖는 예시적인 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 묘사를 도시한다. 이러한 유형의 항원 결합 작제물은 도 1a에 나타난 그것과 유사하며, 예외로, 이는 FcγR 결합을 제거하는 Fc의 CH2 영역에 대한 변형을 포함한다. 이러한 작제물은 따라서 치료적 관련 농도에서 Fc 효과기 기능을 매개할 수 없다.
다수의 이중특이적 항-CD3-CD19 항체를 표 1에서 기술된 바와 같이 제조하였다. 항-CD3 또는 항-CD19 scFv의 설명이 BiTE에 대한 참조를 포함하는 경우에, 이것은 항-CD3 또는 항-CD19 scFv가 하기에 지시된 바와 같은 가변 중쇄와 경쇄 배향 (예컨대, VH-VL)에 대한 변형과 함께 또는 변형 없이 항-CD3 항-CD19 BiTETM 분자 (블리나투모맙)의 VH 또는 VL의 서열에 동일한 아미노산 서열을 갖는다는 것을 나타낸다. 달리 지시되지 않는다면, αCD19_HD37 scFv 및 αCD3_OKT3 scFv에 대하여, N-말단 내지 C-말단으로부터의 VL 및 VH의 순서는 VLVH이다.
표 1 변이체 , 쇄 A, 쇄 B, Fc
Figure pct00009
Figure pct00010
-Het Fc 1 = 쇄 A: L351Y_F405A_Y407V; 쇄 B: T366L_K392M_T394W (IgG1 Fc에 대한 EU 넘버링 시스템)
-Het Fc 2 = 쇄 A: T350V_L351Y_F405A_Y407V; 쇄 B: T350V_T366L_K392L_T394W
-FcγR KO 1= 쇄 A: L234A_L235A; 쇄 B: L234A_L235A
-FcγR KO 2 = 쇄 A: D265S_L234A_L235A; 쇄 B: D265S_L234A_L235A
가변 영역의 -αCD19_HD37 scFv - N 내지 C-말단 순서는, 다르게 언급되지 않으면, VL/VH이다.
가변 영역의 -αCD3_OKT3 scFv - N 내지 C-말단 순서는, 다르게 언급되지 않으면, VL/VH이다. VLVH는 (GGGGS)3 링커에 의하여 연결된다.
가변 영역의 -αCD3_BiTE scFv - N- 내지 C-말단 순서는 VL/VH이며, 링커 및 조성은 블리나투모맙과 상동하다.
-(VLVH SS) 또는 (VHVL SS)는, scFv의 VH 및 VL 사이의 이황화 연결을 도입하기 위한, 카밧 넘버링 시스템에 따라, 공보된 위치 VH 44 및 VL 100를 이용한 이황화 안정된 scFv를 나타낸다 [참고: Reiter et al., Nat. Biotechnol. 14:1239-1245 (1996)].
-(CDR C->S) -는 하기 참조된 바와 같은, OKT3의 H3 CDR에 대한 돌연변이를 나타낸다.
-(VHVL 링커) -는 링커 SSTGGGGSGGGG에 의하여 연결된 VH 및 VL를 나타낸다.
SGGGGSDI.
Fc 넘버링은 EU 항체의 넘버링을 언급하는 카밧에서의 EU 지수에 따르며 (Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85); Fab 또는 가변 도메인 넘버링은 카밧에 따른다 (Kabat and Wu, 1991; Kabat et al, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication no. 91-3242, p 647 (1991)).
표 1에 기술된 변이체는 변이체 875, 최초 설계를 포함하며, 이는 개선된 산출량 및 생체물리학적 특성을 갖는 항원 결합 작제물을 생성하기 위한 개시점으로서 사용되었다. 변형은 VLVH 이황화 조작에 의한 scFv의 안정화 및/또는 안정화 CDR 돌연변이체의 부가를 포함한다. 모든 변이체는 이종이량체 Fc (Het Fc 1 또는 Het Fc 2)를 포함하고, CH2 도메인 (FcγR KO 1 또는 FcγR KO 2) 내에서 돌연변이의 존재 또는 부재 하에 발현되어 Fc 효과기 활성을 제거할 수 있다. Fc에 대한 이러한 변형을 포함하는 변이체는 Fc 녹아웃 또는 Fc KO를 갖는 것으로 지칭된다.
변이체 875, 1661, 1653, 1662, 1660, 1666, 1801, 및 1380는 개발된 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 초기 설계이며, 한편 변이체 6747, 10149, 및 12043는 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 산출량 및 생체물리학적 특성을 추가로 개선하기 위하여 설계된 변형을 포함하는 설계를 예시한다. 변이체 N1, N3 및 N10를 또한 설계하였으며, 이러한 변이체의 생체물리학적 및 기능적 특성이 본원에 제공된 데이터로부터 예측될 수 있다.
CD3 및 CD19 scFv 둘 모두에 대한 VHVL 이황화 설계 전략은 공보된 위치 VH 44 및 VL 100를, scFv의 VH 및 VL 사이의 이황화 연결을 도입하기 위한, 카밧 넘버링 시스템에 따라 이용하였다 [Reiter et al., Nat. Biotechnol. 14:1239-1245 (1996)]. αCD3 OKT3 scFv의 H3 CDR 내에서의 C 내지 S의 돌연변이를, 하기 기술된 바와 같이 생성하였다: Kipryanov et al., in Protein Engineering 10: 445-453 (1997).
표 1로부터의 선택된 변이체를 제조하고, 이러한 변이체의 상응하는 서열 조성을 표 2에 나타내었다.
표 2: 이중특이적 CD3-CD19 항원 결합 작제물 및 대조군의 서열 조성
Figure pct00011
Figure pct00012
클로닝 및 발현
이들 항체와 항체 대조군을 하기와 같이 클로닝하고 발현하였다. 항체 중쇄와 경쇄를 암호화하는 유전자를 인간/포유동물 발현을 위해 최적화된 코돈을 이용한 유전자 합성에 의해 작제하였다. scFv-Fc 서열을 알려진 항-CD3 및 CD19 scFv BiTETM 항체 (Kipriyanov et. al., 1998, Int. J Cancer: 77,763-772), 항-CD3 단클론성 항체 OKT3 (드러그 뱅크(Drug Bank) 참조번호: DB00075)로부터 생성하였다.
최종 유전자 산물을 포유동물 발현 벡터 pTT5 (NRC-BRI, Canada) 내로 서브-클로닝하고 CHO 세포에서 발현하였다 (Durocher, Y., Perret, S. & Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing CHO cells. Nucleic acids research 30, E9 (2002)).
CHO 세포를 기하급수적 성장 단계 (1.5 내지 2백만 세포/mL)에서 2.5:1의 PEI:DNA 비율에서 수성 1mg/mL 25kDa 폴리에틸렌이민 (PEI, Polysciences)으로 형질감염하였다 (Raymond C. et al. A simplified polyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications. Methods. 55(1):44-51 (2011)). 이종이량체를 형성하기 위한 최적 농도 범위를 측정하기 위해, DNA를 이종이량체 형성을 가능하게 하는 중쇄 A (HC-A), 중쇄 (HC-B)의 최적 DNA 비율에서 형질감염시켰다 (예컨대, HC-A/HC-B/ 비율 = 50:50%). 형질감염된 세포를 4000rpm에서 원심분리후 수집하고, 0.45μm 필터를 이용하여 맑아진 배양 배지에서 5-6일 후 수확하였다.
맑아진 배양 배지를 MabSelect SuRe (GE Healthcare) 단백질-A 칼럼 위에 적하하고, pH 7.2에서 PBS 완충액의 10 칼럼 부피로 세척하였다. 항체를 pH 3.6에서 시트레이트 완충액의 10 칼럼 부피로 용리하고, 항체를 함유하는 풀링된 분획물을 pH 11에서 TRIS로 중화하였다. 단백질을 Econo-Pac 10DG 칼럼 (Bio-Rad)을 이용하여 최종적으로 탈염하였다.
일부 경우에, 단백질을 겔 여과에 의해 추가로 정제하고, 3.5 mg의 항체 혼합물을 1.5mL로 농축하고, 그리고 1 mL/분의 유속에서 AKTA Express FPLC를 거쳐 Superdex 200 HiLoad 16/600 200pg 칼럼 (GE Healthcare) 위에 적하하였다. pH 7.4에서 PBS 완충액을 1mL/분의 유속에서 이용하였다. 정제된 항체에 상응하는 분획물을 수집하고, ~1mg/mL로 농축하고, 그리고 -80oC에서 보관하였다.
단백질 정제 후 단백질 L 크로마토그래피를 사용한 추가의 정제 단계가 하기와 같은 방법에 의하여 수행될 수 있다. Capto L 수지를 PBS로 평형화시키고, 변이체를 상기 수지에 부가하고, 실온에서 30분 동안 배양하였다. 수지를 PBS로 세척하고, 결합된 단백질을 0.5 ml 0.1 M 글리신, pH 3으로 용리하였다. 추가의 단계는 도 2c에서의 결과를 생성하는데 사용되는 생성 방법에 포함되지 않았다.
최종 생성물의 순도 및 산출량을 하기 기술된 LC/MS 및 UPLC-SEC에 의하여 추산하였다.
이종이량체 순도에 대한 LC-MS 분석.
정제된 시료를 37°C에서 6시간 동안 PNGase F로 탈-글리코실화하였다. MS 분석에 앞서, 시료를 Poros R2 칼럼 상에 주입하고 20-90% ACN, 0.1% FA로 3분 동안 구배 용리하여, 하나의 단일 피크가 발생하였다.
LC 칼럼의 피크는 하기 설정을 이용하여 LTQ-Orbitrap XL 질량 분광계로 분석하였다: 콘 전압: 50 V' 튜브 렌즈: 215 V; FT 해상력: 7,500. 질량 스펙트럼을 분자량 프로필을 산출하기 위해, 소프트웨어 Promass 또는 Max Ent.로 통합하였다.
UPLC -SEC 분석
UPLC-SEC 분석을 0.4 ml/분에서 30℃로 설정된 워터스(Waters) BEH200 SEC 칼럼 (2.5 mL, 4.6 x 150 mm, 스테인리스강, 1.7 μm 입자)을 이용하여 수행하였다. 실행 시간을 7분으로 구성하고, 25 mM 인산나트륨, 150 mM 아세트산나트륨, pH 7.1, 및 150 mM 인산나트륨, pH 6.4-7.1의 구동 완충액(running buffer)으로 주입당 2.8 mL의 전체 부피로 구성하였다. 흡광도에 의한 검출은 190-400 nm에서, 그리고 280 nm에서의 여기(excitation) 및 300-360 nm로부터의 집산된 방출을 갖는 형광에 의하여 촉진되었다. 피크 통합을 Empower 3 소프트웨어에 의해 분석하였다.
모든 변이체를 발현시키고, 오염 동종이량체 없이 >95% 이종이량체 순도로 정제하였다.
변이체 875, 1661, 1653, 1666, 10149, 및 12043의 산출량 및 이종이합체 순도가 도 2c에 나타난다.
도 2a에서의 상부 패널은 변이체 10149에 대한 단백질 A 정제 후의 겔 여과 (GFC) 프로파일을 도시하며, 한편 하부 패널은 풀링된 GFC 분획의 SEC 프로파일을 나타낸다. 도 2b에서의 상부 패널은 변이체 1661에 대한 단백질 A 정제 후의 겔 여과 (GFC) 프로파일을 나타내며, 한편 하부 패널은 1661에 대한 풀링된 GFC 분획의 SEC 프로파일을 나타낸다. 도 2c는 1661과 비교하여, 10149의 개선된 산출량 및 이종이량체 순도를 나타낸다.
시차 주사 열량측정법에 의한 안정성 측정
CD3-CD19 항원 결합 작제물의 안정성은 시차 주사 열량측정 (DSC)으로, 용융 온도(Tm)를 측정함으로써, 측정될 수 있다. 모든 DSC 실험은 GE VP-Capillary 기구를 이용하여 수행되었다. 단백질을 PBS (pH 7.4)로 완충액-교환하고, 시료 세포 내로 적하된 0.137mL로 0.3 내지 0.7mg/mL까지 희석하고, 그리고 20 내지 100oC까지 1oC/분의 주사 속도 (scan rate)로 계량하였다. 데이터를 Origin 소프트웨어 (GE Healthcare)를 이용하여 분석하고, PBS 완충액 기준점(background)을 감산하였다.
변이체 875, 1661, 1666, 10149, 및 12043에 대한 결과가 도 2c에 나타난다.
초기 변이체 1661은, GFC 포스트(post) pA 프로파일 (도 2b 및 2c)에서 명백히 드러난 바와 같이, 낮은 발현 및 포스트(post) 단백질 A 산출량, 및 다량의 고분자량 응집체를 나타내었다. 고분자량 응집체의 낮은 발현 및 경향은 다양한 방법을 사용하여 scFv 안전성 조작에 의하여 최적화되고, 이는 링커 최적화, VHVL 배향, CDR 이식에 의한 이황화 조작 및 scFv 안정화 (scFv 발현 및 안정성의 상이한 양태를 나타냄)를 포함한다.　
변이체 1666 및 1380에서 예시된 scFv 링커 및 VHVL 배향의 변화는 발현 및 산출량에서 유의미한 개선을 산출하지 않았다. 이황화 조작에 의한 scFv의 안정화는 발현 및 포스트(post) 단백질 A 산출량을 개선하지 않았으며, 변이체 10149 (도 2b 및 2c)에 대한 GFC 프로파일에 나타난 바와 같이 고분자량 응집체의 양을 감소시키고, 최종 산출량을 증가시켰다.
CDR 이식에 의한 안정화 및 CD19 scFv의 인간화는 전체적으로 개선된 발현 및 포스트(post) 단백질 A 역가 및 scFv 열안정성을 산출하였으며, 이는 도 2c에 나타난 변이체 12043에 대한 데이터에 의하여 나타난다.
초기 변이체 1661은, GFC 포스트(post) pA 프로파일 (도 2b 및 2c)에서 명백히 드러난 바와 같이, 낮은 발현 및 포스트(post) 단백질 A 산출량, 및 다량의 고분자량 응집체를 나타내었다. 고분자량 응집체의 낮은 발현 및 경향은 다양한 방법을 사용하여 scFv 안전성 조작에 의하여 최적화되고, 이는 링커 최적화, VHVL 배향, CDR 이식에 의한 이황화 조작 및 scFv 안정화 (scFv 발현 및 안정성의 상이한 양태를 나타냄)를 포함한다.　
변이체 1666 및 1380에서 예시된 scFv 링커 및 VHVL 배향의 변화는 발현 및 산출량에서 유의미한 개선을 산출하지 않았다. 이황화 조작에 의한 scFv의 안정화는 발현 및 포스트(post) 단백질 A 산출량을 개선하지 않았으며, 변이체 10149 (도 2b 및 2c)에 대한 GFC 프로파일에 나타난 바와 같이 고분자량 응집체의 양을 감소시키고, 최종 산출량을 증가시켰다.
CDR 이식에 의한 안정화 및 CD19 scFv의 인간화는 전체적으로 개선된 발현 및 포스트(post) 단백질 A 역가 및 scFv 열안정성을 산출하였으며, 이는 도 2c에 나타난 변이체 12043에 대한 데이터에 의하여 나타난다.
도 2c에 요약된 바와 같은 scFv의 후 정제 산출, 이종이량체 순도 및 열 안정성은, 이황화 조작 (v10149)에 의한 안정화 및 CD19 scFv (v12043)의 안정화가 산출량 및 열 안정성에 있어서 유의미한 개선을 산출하였으며, 한편 이는 VL-VH 배향 및 링커 조성을 변화시키는데 영향이 없었다.
실시예 2: 라지 (Raji) 및 주르카트 ( Jurkat ) 세포로의 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 결합
CD19- 및 CD3 발현 세포에 결합하는 이중특이적 변이체 875 및 1661의 능력을 하기에 기술된 FACS에 의하여 측정하였다.
FACS 프로토콜에 의한 전체 세포 결합:
2x106 세포/ml 세포 (> 80% 생존력)를 L10+GS1 배지에서 재현탁하고, 항체 희석액과 혼합하고, 그리고 얼음 위에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 빙랭된 R-2 완충액 10ml를 부가함으로써 세정하고, 4°C에서 10분간 233xg로 원심분리하였다. 세포 펠릿을 100 μl (L10+GS1 배지에서 1/100 희석도)의 형광 표지화된 항-마우스 또는 항-인간 IgG로 재현탁하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세포를 상기 기술한 바와 같이 10ml의 차가운 R-2를 첨가함으로써 세척하고, 세포 펠릿을 400 μl의 차가운 L-2로 재현탁하고, 시료를 Nitex를 통해 여과하고 4 μl의 프로피디움 요오드화물을 함유하는 튜브에 첨가하였다.
시료를 유세포분석법에 의해 분석하였다.
표 3은 결과의 요약을 제공하며, 이는 이러한 검정에서 시험된 모든 변이체가 비교가능한 친화도로 CD19+ 라지 (Raji) B 세포에 결합하고, 비교가능한 친화도로 CD3+ 주르카트 T 세포에 결합한다는 것을 나타낸다. 모든 변이체는 라지 (Raji) B 세포에 고친화도로 결합하고, 주르카트 T 세포에 저친화도로 결합한다. 저 T 세포 친화도는 일련의 TCR 유발 과정에 매우 중요할 것이며, 이는 하나의 T 세포가 다중 표적 세포를 사멸하는 것을 가능하도록 한다.
실시예 3: T 세포 및 B 세포 가교의 분석 및 FACS 및 현미경관찰에 의한 시냅스 ( 위족 (pseudopodia)) 형성
T 세포 시냅스 및 위족의 형성을 매개하기 위한 예시적인 변이체의 능력을 하기와 같이 측정하였다. 이러한 검정에서 시험된 변이체는 875 및 1661를 포함하였다.
FACS에 의한 전체 세포 가교화 :
RPMI에서 현탁된 1 x 106 세포/ml를 0.3 μM의 적절한 CellTrace 표지로 표지화하고, 혼합하고, 그리고 37에서 수조에서 25분 동안 배양하였다.
펠릿을 2 ml의 L10 + GS1 + NaN3에서 최종 농도 5x x106 세포/ml까지 재현탁하였다. 세포 현탁액을 적절한 세포 표지화와 레이저 세팅을 확증하기 위해 유세포분석법에 의해 분석하였다 (1/5 희석도). 유동-체크(flow-check)와 유동-세트(flow-set) 플루오로스피어를 기구 표준화, 광학적 정렬 및 유체공학을 확증하는데 이용하였다. 유세포분석법 검증 후, 그리고 가교화에 앞서, 각 세포주를 원하는 비율에서, 1x106 세포/ml의 최종 농도에서 함께 혼합하였다. T:B 가교화를 주르카트-바이올렛 + 라지-원적색으로 사정하였다.
항체를 실온에서 L10+GS1+NaN3에서 2x로 희석하고, 이후 세포에 첨가하고, 그 이후에 부드럽게 혼합하고 30분간 배양하였다. 30분 배양 이후에, 2 μl의 프로피디움 요오드화물을 첨가하고, 천천히 혼합하고, 그리고 유세포분석법에 의해 즉시 분석하였다. 가교화 % B:T를 동시에 표지화된 바이올렛과 원적색인 사건의 백분율로서 산출하였고, 기준에 대한 배수를 배지 단독의 가교된 %로서 변이체의 가교된 비율%로 산출하였다.
현미경관찰에 의한 시냅스 ( 위족 ) 형성 분석
표지된 라지 B 세포 및 표지된 주르카트 T 세포를 실온에서 30분 동안 3 nM의 인간 IgG 또는 변이체와 함께 배양하였다. 세포 현탁액을 원심분리로 농축하고, 이후 180 μl의 상청액을 제거하였다.　세포를 나머지 부피에서 재현탁하고 200x와 400X에서 영상화하였다.　현미경관찰 이미지 (200 X)를 수득하고, 가착색(pseudo colored)하고, 오버레이하고, Openlab 소프트웨어를 사용하여 TIFF로 변환하였다. 세포를 이후 Image J 소프트웨어에서 세포 계수기를 사용하여 계수하고, 하기 5개의 상이한 집단으로 비닝(binned)하였다:
1. T 단독 (또한 T:T를 포함)
2. B와 연관된 T (위족 없음)
3. B와 연관된 T (위족 있음, 즉 초승달형 구조를 나타내는 T 세포) 4. B 단독 (또한 B:B를 포함)
5. T와 연관된 B
일부 세포에 대하여, Openlab 소프트웨어에서의 원래 이미지 및 상 이미지의 검토가 적절한 비닝(binning)을 위하여 필요하다. 이후, B 세포와 연관된 총 T 세포의 %, 위족을 갖는 B 세포와 연관된 총 T 세포의 %, 위족을 갖는 B 세포와 연관된 T 세포의 %, T 세포 및 전체 B:T (%)와 연관된 B 세포의 %가 측정될 수 있다.　
결과는 도 3에 나타나고, 이는 3nM에서 변이체 875 및 1661이 1:1 화학 양론에서 T 세포 시냅스 (위족)의 형성으로 CD19+ 라지 B 세포 및 주르카트 T 세포를 가교할 수 있다는 것을 예증한다. 80% 초과의 가교된 T:B 세포가 시냅스 형성에 표지가 되는 위족을 보여준다. 이러한 데이터는, 변이체 875 및 1661이 라지 림프종 B 세포 및 주르카트 T 세포를 가교하고, T 세포 매개된 표적 세포 용해의 전제조건 및 지표로서 T:B 세포 시냅스를 유발할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4: CD3 -CD19 항원 결합 작제물의 존재 하에서의 활성화된 인간 CD8+ T-세포의 오프 타겟 세포독성의 측정
CD3-CD19 항원 결합 작제물의 존재 하에서의 활성화된 인간 CD8+ T-세포의 오프 타겟 세포독성을 CD19 또는 CD3를 발현하지 않는 표적 세포주 K562에 대항하여 측정하였다. 이러한 경우에서 변이체 875를 시험하였고, 검정을 하기와 같이 수행하였다.
개별 연구에 대한 인간 혈액 (120-140 mL)을 선택된 공여체로부터 수집하였다. PBMC를 림프구 구배 분리를 사용하여 공여체로부터 새로 단리하였으며 (Cedarlane, Cat No. CL5020), IL2 활성화를 위하여, PBMC를 밤새 배양하여 1000-3000 단위/mL의 IL-2로 활성화하였다. 휴지 및 IL-2 활성화된 PBMC를 CD4+ 및 CD8+ 강화에 대한 EasySep (STEMCELL Technologies Inc.) 칼럼에 통과시켰다. 15:1의 E:T 비율에서, IL-2 활성화된 CD8+를 효과기 세포로서, K562 적백혈병 세포를 표적 세포로서 사용하였다. 세포를 검사 물품과 함께 20-26시간 동안 배양한 후, 50 μL의 세포 배양액 상청액을 Promega LDH 효소 키트를 이용한 LDH 분석을 위해 수집하였다. 490 nm에서 광학적 밀도 (OD)가 Molecular Devices Emax를 이용하여 각 웰에 대해 측정하였다. 데이터 분석은 LibreOffice Calc 소프트웨어를 이용하여 수행하였다.
결과는 표 3 및 도 4에 나타낸다. 표 3은 제0일에 정제된 CD8+ T 세포에서의 활성화된 T 세포의 백분율을 나타낸다. 도 4는 IL-2 활성화된 인간 CD8+ T 세포를 갖는 K562 적백혈병 세포의 감손이 300nM 및 15:1의 E:T 비율에서 관찰되지 않았다는 것을 나타낸다. 따라서, IL-2 활성화된 인간 CD8+ T 세포를 갖는 K562 적백혈병의 오프-타겟 방관자 세포독성 중 어떤 것도 포화 농도 및 높은 표적 대 효과기 세포 비율에서 발견되지 않았다.
표 3: 제0일에서의 정제된 CD8+ T 세포 내에서의 활성화된 T 세포 백분율
Figure pct00013
실시예 5: 라지 세포에서 용량-의존적 ADCC 및 CDC를 매개하는 변이체 1661의 능력
실시예 1에 기술된 바와 같이, 변이체 1661은 Fc 매개된 효과기 활성을 제거하는 CH2 돌연변이체를 갖는 Fc를 포함한다 (Fc KO). 이러한 변이체에 대한 효과기 기능의 부족을 확인하기 위하여, 이를 하기 기술된 ADCC 및 CDC 검정에서 시험하였다.
용량-반응 연구를 1000-0.01 nM의 항체 농도 범위에서 수행하였다. 리툭시맙을 양성 대조군으로서 사용하였다. ADCC 검정을 하기와 같이 수행하였다. 표적 라지 세포를 30분간 시험 항체와 사전-배양하고, 이후 5:1의 NK 효과기 세포 대 표적 세포 비율로 효과기 세포를 부가하고, 배양을 6시간 동안 37℃에서 5% CO2 배양기에서 계속하였다. LDH 방출 및 표적 용해 %를 LDH 검정 키트를 사용하여 측정하였다. CDC 검정을 위하여, 10% 최종 농도에서 정상 인간 혈청 (NHS)을 라지 표적 세포 및 각 항체로 2시간 동안 37℃에서 5% CO2 배양기에서 배양하였다. LDH 방출 및 표적 용해 %를 LDH 검정 키트를 사용하여 측정하였다.
결과를 도 5에 도시하였다. 도 5a는 변이체 1661이 예상대로 10 μM 이하의 농도에서 ADCC를 매개할 수 없다는 것을 나타낸다. 비교로, 양성 대조군 리툭시맙은 ADCC를 매개하였다. 도 5b는 변이체 1661이, 또한 예상대로, 관찰된 500nM 초과의 EC50을 갖는 CDC를 유도함에 있어 리툭시맙보다 10배 넘게 더 적은 효력을 보였다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는, 1661이 최대 표적 B 세포 사멸을 매개하는 농도에서 ADCC 및 CDC를 매개하지 않을 것이라는 것을 나타낸다 (참고: 후속 실시예).
실시예 6: 인간 전혈에서의 자가 B 세포 감손
이중특이적 항-CD19-CD3 이중특이적 항원 결합 작제물을, IL2 활성화 하에서 인간 전혈 1차 세포 배양 내에서의 자가 B 세포를 감손하는 그들의 능력에 대해 분석하였다. 이러한 검정에서 시험된 변이체는 875, 1661, 및 10149이었다. 비특이적 대조군으로서, Fab 결합 아암 (Fc 블록) 없는 동종이량체 Fc를 사용하였다.
간략하게, 변이체를 2일 동안 IL2의 존재 하에서 헤파린처리된 인간 전혈 내에서 이식하였다. 4벌의 웰을 각 대조군 및 실험 조건에 대해 플레이팅하고, 배양물을 5% CO2, 37°C에서 배양하고, 48시간동안 중지시켰다. 적혈구 세포를 배양물의 수거 후 용해시키고, 수집된 1차 세포를 CD45, CD20 및 7-AAD FACS 검출을 위하여 염색하였다. CD45+, CD45+/CD20+ 및 CD45+/CD20+/7AAD+/- 집단의 FACS 분석을 하기와 같이 InCyte/FlowJo로 수행하였다: FSC/SSC 및 보상(compensation) 웰에 대한 5000개 사건 및 실험적 웰에 대한 30,000개 사건을 세포계측법으로 분석함. 역치는 파편 및 RBC를 스킵(skip)하도록 설정하였다. 계폐 (Gating)를 림프구, CD45+, CD20+, 및 7AAD+ 세포 상에서 수행하였다.
도 6은, IL2 활성화 하에서 인간 전혈 내의 자가 B 세포 농도 상에서의 변이체 875 및 1661의 세포독성 효과를 나타낸다. 변이체 둘 모두는 이러한 검정 내에서 CD20+ B 세포에 감손시킬 수 있었다. 최대 시험관내 효능을 0.1 nM 미만에서 관찰하였고, 약 0.001 nM의 EC50를 갖는 강력한 농도-의존적 효과가 있었다.
도 7은 변이체 1661이 10:1의 E:T 비율에서 48시간 후 IL-2 활성화된 인간 전혈 내에서의, 농도-의존적 방식으로 (EC50 <0.01 nM), 용량-의존적 자가 B-세포 감손을 매개할 수 있었다는 것을 나타낸다. 결과는 배지 대조군에 정규화된 CD20+ B 세포의 %로서 나타난다. 도 8은 휴지 조건 하에서 (즉, IL2 자극의 부재 하에서) 변이체 1661 및 10149 사이의 비교를 나타내며, 이는 상기 변이체 둘 모두가 용량-의존적 방식으로 B 세포를 감손시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 이황화 안정화된 변이체 10149는 휴지 전혈 내에서 친계 변이체 v1661에 대해 동등한 효력을 나타냈다.
실시예 7: 1차 CLL (만성 림프구성 백혈병 및 MCL (외투 세포 림프종) 환자 시료에서의 자가 B 세포를 감손시키기 위한 예시적인 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 능력
1차 CLL 및 MCL 환자 전혈 시료 내에서의 자가 B 세포 감손을 위한 변이체 1661의 능력을 하기와 같이 측정하였다.
1차 환자 혈액 시료를 3명의 환자로부터 수집하였다. 혈액 시료를 하기와 같이 혈액 수집 당일에 처리하였다: 변이체를 헤파린처리한 환자 전혈 내에 직접 이식하였다. 4벌의 웰을 각 대조군 및 실험 조건에 대해 플레이팅하고, 배양물을 5% CO2, 37°C에서 배양하고, 제4일에 중지시켰다. 적혈구 세포를 배양물의 수거 후 용해시키고, 수집된 1차 세포를 CD45, CD20, CD5, CD3, CD19 및 7-AAD FACS 검출을 위하여 염색하였다. FACS 분석을 InCyte/FlowJo에서 수행하였다. 검정을 수행하기 전에, 각 환자에 대한 기초 림프구 계수를 CD45, CD20, CD5, CD3, CD19 및 7-AAD에 대한 염색에 의해 또한 측정하였다. 기초 림프구 계수는 하기 표 4에서 나타난다. 도 9a 및 9b는 감손 검정의 결과를 나타낸다. 결과는 배지 대조군에 정규화된 CD20+/CD5+ B 세포의 %로서 나타난다.
표 4: 기초 림프구 계수: Z34 KO 이식 전 환자 전혈 내의 T세포 및 B 세포의 백분율
Figure pct00014
*시료링 시 표준 리툭산에 더하여 프레드니손 치료를 수용한 환자
$ RAI: CLL의 단계화 및 분석을 위한 국제 RAI 시스템
MCL 환자 전혈 내에서의 E:T 비율은 1:1.3 (T 세포 대 B 세포)였다. CCL 환자 전혈 내의 E:T 비율은 1:1 내지 1:5 (T 세포 대 B 세포)였다. 변이체 1661은 4일의 배양 후 CD69+ T 세포의 상승된 수준으로 나타난, CLL 1차 환자 전혈에서의 T 세포를 활성화할 수 있었다 (데이터 비도시). 도 9b는 변이체 1661이 농도-의존적 방식으로, 그리고 비처리 및 리툭산 사전처리된 1차 환자 전혈 시료의 치료에서 비교 가능한 수준까지 CLL B 세포를 감손하였다는 것을 나타낸다. 도 9a는 변이체 1661이 치료-비처리 1차 환자 전혈 시료에서의 농도-의존적 MCL B 세포 감손을 예증한다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 예시적인 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 존재 하에서의 인간 PBMC 내의 자가 T 세포 증식의 평가
인간 PBMC 내의 자가 T 세포 증식을 자극하기 위한 예시적인 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 능력을 평가하였다. 시험된 변이체는 875 및 1380 (Fc KO를 갖고, 변이체 1661과 유사함)이었다. 시험된 대조군은 야생형 OKT3 항체, 인간 IgG, 및 블리나투모맙 (변이체 891)이었다. 검정을 하기에 기술된 바와 같이 수행하였다.
세포 증식 검정: 제1일에서, 혈액을 4개 공여체 각각으로부터 수집하고, PBMC를 새로 단리하였다. 공여체 림프구 프로파일을 실시예 6에 기술된 바와 같이 FACS로 측정하였다. 4개의 공여체의 공여체 프로파일을 하기 표 5에 나타내었다.
표 5: 공여체 PBMC 프로파일
Figure pct00015
증식 검정을 위하여, 검사 물품은 0.3과 100 nM의 최종 농도로 제조하고; PBMC로 조합하고, 그리고 250,000개 세포/웰에서 플레이팅하였다. 혼합물을 3일간 배양하였고, 그 후 삼중수소 티미딘을 0.5 μCi 티미딘/웰의 최종 농도로 세포-함유 웰에 첨가하였고; 플레이트를 추가의 18시간 동안 배양하였고, 그 후 플레이트를 동결하였다. 총 배양 시간은 4일이었다. 플레이트를 여과하고, β-계수기를 이용하여 계수(CPM)하였다. 평균으로부터, 자극 지수 (SI)는 다음과 같이 계산되고, 그리고 데이터는 하기와 같이 표로 작성되었다: 검사 물품의 평균 CPM / 배지 단독의 평균 CPM. 본 검정의 결과는 도 10에 도시되고, 이는 OKT3가 하기 내림차순 순서로 0.3nM에서 최대 T 세포 증식을 매개하였다는 것을 나타낸다: v891 (블리나투모맙) > v875 및 v1380. 환자 혈청 내의 0.3 nM 농도에서, OKT3 및 블리나투모맙은 부작용과 연관된다 [Bargou et Science (2008); Klinger et al. Blood (2010)]. v1380는 OKT3 및 블리나투모맙보다 현저히 더 낮은 정도로 T 세포 증식을 유도하였다. Fc 효과기 기능을 매개하지 않는 변이체 V1380는, 변이체 1661과 유사하게, 최대 B 세포 감손을 위하여 충분한 T 세포 증식 (그러나 기준점보다 훨씬 더 낮은 수준에서) 충분한 T 세포 증식을 유도할 수 있다 (실시예 5 및 6 참고).
실시예 9: 예시적인 CD3-CD19 항원 결합 작제물에 의하여 매개된 인간 PBMC에서의 T 세포 증식을 위한 표적 B 세포 의존성의 측정
CD3-CD19 항원 결합 작제물에 의하여 매개된 T 세포 증식이 표적 B 세포의 존재에 의존적이라는 확인은, B 세포 및/또는 NK 효과기 세포의 부재 또는 존재 하에서 PBMC에서의 T 세포 증식을 자극하기 위한 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 능력을 측정함으로써 수득되었다. 상기 검정은 하기에 기술된 바와 같이, 변이체 1380, 대조군 블리나투모맙(v891), 및 인간 IgG를 사용하여 수행되었다.
세포 증식 검정: PBMC 유래된 하위집단에는 PBMC, B 세포 없는 PBMC (PBMC - B), NK 세포 없는 PBMC (PBMC - NK), NK와 B 세포 없는 PBMC (PBMC-NK-B)이 포함되었다. 제1일에, 약 135 mL의 혈액을 4개 공여체 각각으로부터 수집하였다. PBMC를 새로 단리하고, 그리고 PMBC를 CD19 및/또는 CD56 감손에 대해 양성 선별 (제1일)에 의해, EasySep 칼럼 (STEMCELL Technologies Inc.)에 통과시켰다. PBMC 림프구 프로파일을 실시예 6에 기술된 바와 같이 FACS로 측정하였다. PBMC 프로파일은 표 6에 나타난다.
표 6: PBMC 프로파일.
Figure pct00016
T 세포 증식 검정을 하기와 같이 수행하였다. 검사 물품을 100 nM의 최종 농도로 제조하고; PBMC로 조합하고, 그리고 250,000개 세포/웰에서 플레이팅하였다. 혼합물을 3일간 배양하였고, 그 후 삼중수소 티미딘을 0.5 μCi 티미딘/웰의 최종으로 세포-함유 웰에 첨가하였고; 플레이트를 추가의 18시간 동안 배양하였고, 그 후 플레이트를 동결하였다. 총 배양 시간은 4일이었다. 플레이트를 여과하고, β-계수기를 이용하여 계수(CPM)하였다. 평균으로부터, 자극 지수 (SI)는 다음과 같이 계산되고, 그리고 데이터는 하기와 같이 표로 작성되었다: 검사 물품의 평균 CPM / 배지 단독의 평균 CPM.
결과를 도 11에 도시하였다. 건강한 공여체로부터의 인간 PBMC에서의 평균 E:T 비율은 ~10:1 (CD3+ T 세포 대 CD19+ B 세포)이었다 (데이터 비도시).
도 11은 변이체 1380이 PBMC, 및 PBMC-NK 세포 (PBMC 마이너스 NK 세포)에서의 T 세포 증식을 나타내었으나, B 세포 부재의 PBMC 및 B 세포 및 NK 세포 부재의 PBMC에서의 T 세포 증식은 거의 없거나 아예 없는 것을 나타내었으며, 이는 표적 B 세포 의존성을 나타낸다. 블리나투모맙은 T 세포 활성화에 대한 유사한 표적 B 세포 의존성을 나타내었으나, 1380보다 더 높은 T 세포 증식을 유도하였다.
이러한 결과는, 변이체 1380이 농도 매개 최대 B 세포 감손에서 엄격한 표적-의존적 T 세포 증식을 나타낸다는 것을 보여준다 (실시예 5 및 6 참고). 이러한 결과는 또한 변이체 1380 및 효과기 기능을 매개할 수 없는 Fc를 갖는 기타 CD3-CD19 항원 결합 작제물이 블리나투모맙에 비하여 더 높은 치료적 지수를 가질 것이라는 것을 나타낸다. 1380은 1661과 상동한 CDR 서열 및 상동한 T 및 B 세포 친화도를 갖고, 오직 항-CD3 scFv VH-VL 배향 및 scFv 링커에 있어서 1661과 상이하다 (표 1 참고).
실시예 10: IL2 활성화된 인간 PBMC 및 G2 백혈병 세포로 이식된 NSG 마우스에서의 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 생체내 효능
생체내 마우스 백혈병에서의 예시적인 CD3-CD19 항원 결합 작제물의 효능을 측정하였다. 이러한 모델에서, PBMC 인간화된 NSG (NOD scid 감마) 마우스에 화학물질 내성 G2 ALL (급성 림프구성 백혈병) 세포를 이식하였고, G2 백혈병 세포 이식 수준에서의 CD3-CD19 항원 결합 작제물 875 및 1661의 효과를 관찰하였다. 이러한 모델은 하기에 기술된다: Ishii et al. Leukemia 9(1):175-84 (1995), 및 Nervi et al, Exp Hematol 35: 1823-1838 (2007).
초기 실험으로서, G2 백혈병 세포주와 결합하는 선택된 변이체의 능력을 시험하였다.
인간 G2 ALL 종양 세포주로의 시험관내 FACS 결합:
사전-냉각된 G2 세포 (1 x 106 생존 세포/튜브)를, CO2 부재 하에서, 2시간 동안 빙상에서, 빙랭된 이중특이적 시약 huCD3 x huCD19으로, 200 μL/튜브의 최종 용적으로 10% 열 비활성 태아 소 혈청 및 1% 염소 혈청 (L-10+GS1)을 함유하는 Leibovitz L15 완충액에서의 0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 및 100nM의 농도로 3벌로 배양하였다. 배양 후, 세포를 빙랭된 Leibovitz L15의 4 ml로 세정하고, 펠렛을 100μL 빙랭된 Alexa fluor 488-태깅된 항-인간 항체 (Jackson Immunoresearch)에 재현탁시키고, L-10+GS1 중에 1/100로 희석하였다. 암중에서 15분 이상이 지난 후, 4 ml의 Leibovitz L15를 첨가하고, 세포를 펠릿화하고, 이후 유동 세포측정에 의한 분석 전에 2ug/ml 7AAD를 함유하는 200μL 빙랭된 유동 세포측정 구동 완충액에서 재현탁하였다. 평균 형광 강도를, Kd가 각 세포주에 대한 각각의 이중특이적 시약에 대해 측정된 결합 곡선을 확립하는데 사용하였다.
도 12는, 예시적인 변이체 875 및 1661이 875에 대해, 1.9 nM의 Kd, 그리고 1661에 대해 2.6 nM의 Kd로 G2 ALL 세포에 결합할 수 있었다는 것을 나타낸다.
IL2 활성화된 인간 PBMC 및 G2 백혈병 세포로 이식된 NSG 마우스에서의 생체내 효능:
NOD/SCID/c 눌 (null) (NSG) 마우스 (n=5/그룹)에, 마우스의 모든 그룹에 대해 세포 공급원으로서의 단일 공여체를 사용하여 3 x 106 활성화된 (항-CD3/항CD28 s [1 비드/CD3+ 세포]+ 50 U IL2 /ml (5d에 대해)) 인간 PBMC와 혼합된 1 x 105 G2-CBRluc/eGFP 세포를 정맥내 이식하였다. 인간 T 세포: G2 B 세포의 비율은 10:1이었다. 유동 세포계측법을 T 세포의 활성화 상태 (CD3, CD4, CD8, CD25, CD69, CD45RO, CD62L, 및 CCR7) 및 생존력 (7AAD)을 측정하기 위하여 사용하였다.
PBMC 및 G2 이식으로부터 1시간 후 마우스에 이중특이적 변이체의 제1 용량 (n-5/그룹)을, 제0, 2, 및 4일에 3 mg/kg로 투여하고, 제5일에 종료하도록 투여하였다. 종양은, 마우스에 D-루시페린 (150 μg/체중(g)) 주입, 이후 기준선에서 10분 후, 그리고 이식 후 제9, 14, 및 18일에서의 전신 생물발광 이미지화 (BLI) 후 진행되었다. 제18일에서, 동물을 폐사시키고, 비장을 체외 BLI (생물발광 이미지화)를 위하여 수거하였다. 결과는 도 13와 14에 도시된다. '블랭크(blank)'는 G2 이식(engraftment) 없는 대조군 그룹을 가리킨다.
또한, 혈액 시료를, 평균 혈청 농도를 mL 당 μg으로 측정하기 위하여 제1 3 mg/kg의 정맥내(i.v.) 투여로부터 24시간 후 코호트 당 2마리의 동물에 대해 수집하였다. 결과를 도 15에 도시하였다.
도 13a는 복와위(prone position)로 측정시 변이체 875에 대한 전신 BLI를 나타내고, 한편 도 13b는 앙아위(supine position)로 18일 초과 동안 상동한 변이체에 대한 전신 BLI를 나타낸다. 도 13c는 제18일에서의 변이체 875 및 대조군에 대한 비장 BLI를 나타낸다.
도 14a는 복와위(prone position)로 측정시 변이체 1661에 대한 전신 BLI를 나타내고, 한편 도 14b는 앙아위(supine position)로 18일 초과 동안 상동한 변이체에 대한 전신 BLI를 나타낸다. 도 14c는 IgG 처리된 대조군 그룹 및 v1661로 처리된 그룹으로부터 2마리의 대표 마우스의 전신 스캔 이미지를 나타낸다. 상기 도면은 v1661 처리된 동물에 대한 G2 이식의 부재 및 IgG 처리된 그룹에서의 높은 이식 및 ALL 질환 진행을 나타낸다. 도 14d는 제18일에서의 변이체 1661 및 대조군에 대한 비장 BLI를 나타낸다.
도 15는 3 mg/kg의 정맥내(i.v.) 투여로부터 24시간 후 달성된 변이체 875 및 1661의 평균 혈청 농도를 나타낸다.
이러한 결과는 Fc 녹아웃 변이체 1661이 G2 ALL 세포의 완전한 감손 및 유의미하지 않은 G2 이식을 나타낸다느 것을 보여준다. 이러한 조건 하에서, 활성 Fc를 함유한 변이체 875는, 변이체 1661과 비교하여, 유사한, 그러나 감소된 수준의 G2 감손을 나타낸다.
표 S1: CDR 서열 CD3 및 CD19 항원 결합 작제물 (289-386)
Figure pct00017
Figure pct00018
표 S2: CD19 인간화된 VL 서열 (서열 번호: 337, 338)
Figure pct00019
표 S3: CD19 인간화된 VH 서열 (서열 번호: 339-342)
Figure pct00020
Figure pct00021
표 S4: 변이체 및 클론
Figure pct00022
표 S5: 서열 번호 (1- 288)에 의한 클론의 서열 ( Desc . = 기재사항)
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
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Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
SEQUENCE LISTING <110> ZYMEWORKS INC. <120> BI-SPECIFIC CD3 AND CD19 ANTIGEN-BINDING CONSTRUCTS <130> 30712-28515/PCT <140> PCT/US2015/011664 <141> 2015-01-15 <150> 62/025,932 <151> 2014-07-17 <150> PCT/US2014/046436 <151> 2014-07-11 <150> 61/978,719 <151> 2014-04-11 <150> 61/927,877 <151> 2014-01-15 <160> 373 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly 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cagtgtgaaa 420 atgtcatgca aggccagcgg ctacacattc actcggtata ccatgcattg ggtgaaacag 480 agaccaggac agtgtctgga gtggatcggc tacattaatc ccagcagggg gtacacaaac 540 tacaaccaga agtttaaaga caaggcaacc ctgaccaccg ataagtctag ttcaacagct 600 tatatgcagc tgagctccct gacttcagaa gacagcgctg tgtactattg cgcacgctac 660 tatgacgatc actactgtct ggattattgg gggcagggaa ctaccctgac cgtgtctagt 720 gcagccgagc ctaaatcaag cgacaagacc catacatgcc ccccttgtcc ggcgccagaa 780 gctgcaggcg gaccaagcgt gttcctgttt ccacccaaac ctaaggatac tctgatgatt 840 agccgaactc ctgaggtcac ctgcgtggtc gtgagcgtgt cccacgagga cccagaagtc 900 aagttcaact ggtacgtgga tggggtcgaa gtgcataatg ccaaaaccaa gcccagggag 960 gaacagtaca actccactta tcgcgtcgtg tctgtcctga ccgtgctgca ccaggactgg 1020 ctgaatggca aggagtacaa atgtaaggtc tcaaataagg ctctgcccgc ccctatcgaa 1080 aaaactatct caaaggcaaa aggccagcct cgcgaaccac aggtctacgt gctgccccct 1140 agccgcgacg aactgactaa aaatcaggtc tctctgctgt gtctggtcaa aggattctac 1200 ccttccgaca tcgccgtgga gtgggaaagt aacggccagc ccgagaacaa ttacctgacc 1260 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cccctggaga aaaggtcact 60 atgacttgtt ccgcctctag ttccgtctcc tacatgaact ggtatcagca gaaatctgga 120 acaagtccca agcgatggat ctacgacact tccaagctgg catctggagt gcctgcccac 180 ttccgaggca gcggctctgg gacaagttat tcactgacta tttctggcat ggaggccgaa 240 gatgccgcta catactattg ccagcagtgg agctccaacc cattcacctt tggatgtggc 300 acaaagctgg agatcaat 318 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 20 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 20 ggcggaggag gctccggagg aggagggtct ggaggaggag gaagt 45 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 23 Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 24 gcagccgagc ctaaatcaag cgacaagacc catacatgcc ccccttgtcc g 51 <210> 25 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 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gtctagtaat ccactgactt ttggggcagg aaccaaactg 720 gagctgaagg cagccgaacc caaatcaagc gacaagactc acacctgccc accttgtcca 780 gcaccagaag ctgcaggagg acctagcgtg ttcctgtttc cacccaaacc aaaggataca 840 ctgatgatca gccggacacc tgaggtcact tgcgtggtcg tggacgtgag ccacgaggac 900 cccgaagtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtcgaag tgcataatgc caaaaccaag 960 cctagggagg aacagtacaa tagtacatat agagtcgtgt cagtgctgac cgtcctgcat 1020 caggattggc tgaacgggaa ggagtacaaa tgcaaggtgt ccaacaaggc actgcctgcc 1080 ccaatcgaga agaccatttc taaagcaaag ggccagcccc gagaacctca ggtctatgtg 1140 ctgcctccat cccgggacga gctgacaaaa aaccaggtct ctctgctgtg tctggtgaag 1200 gggttctacc catctgatat tgctgtggag tgggaaagta atggacagcc cgagaacaat 1260 tatctgacat ggccccctgt gctggactcc gatggatctt tctttctgta cagcaaactg 1320 actgtggaca agtccagatg gcagcagggc aacgtcttta gttgttcagt gatgcacgag 1380 gccctgcaca atcattacac ccagaaaagc ctgtccctgt ctcccggcaa g 1431 <210> 31 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 32 gacatcaaac tgcagcagag cggagcagag ctggctcgac caggagccag tgtgaaaatg 60 tcatgcaaga ccagcggcta cacattcact cggtatacaa tgcactgggt gaagcagaga 120 ccaggacagg gactggaatg gatcggatat attaaccctt cccgaggcta cacaaactac 180 aaccagaagt ttaaagacaa ggcaactctg accacagata agagctcctc taccgcctac 240 atgcagctga gttcactgac aagtgaggac tcagccgtgt actattgcgc taggtactat 300 gacgatcatt actgtctgga ttattgggga cagggcacta ccctgactgt cagctcc 357 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 33 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 ggagggagcg gaggctccgg aggatctggc gggagtggag gc 42 <210> 35 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 35 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 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ccaaatcaag cgacaagact cacacctgcc caccttgtcc a 51 <210> 39 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 39 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 40 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 40 gcaccagaag ctgcaggagg acctagcgtg ttcctgtttc cacccaaacc aaaggataca 60 ctgatgatca gccggacacc tgaggtcact tgcgtggtcg tggacgtgag ccacgaggac 120 cccgaagtca agttcaactg 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gagaacctca ggtctatgtg ctgcctccat cccgggacga gctgacaaaa 60 aaccaggtct ctctgctgtg tctggtgaag gggttctacc catctgatat tgctgtggag 120 tgggaaagta atggacagcc cgagaacaat tatctgacat ggccccctgt gctggactcc 180 gatggatctt tctttctgta cagcaaactg actgtggaca agtccagatg gcagcagggc 240 aacgtcttta gttgttcagt gatgcacgag gccctgcaca atcattacac ccagaaaagc 300 ctgtccctgt ctcccggc 318 <210> 43 <211> 483 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 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60 atttcatgca aagcctcaca gagcgtggac tatgatggag acagctatct gaactggtac 120 cagcagatcc caggccagcc ccctaaactg ctgatctacg acgccagcaa tctggtgtcc 180 ggcatcccac ccaggttcag tggatcaggc agcgggaccg attttacact gaacattcac 240 cctgtcgaga aggtggacgc cgctacctac cattgccagc agtccacaga ggacccctgg 300 actttcggat gtggcaccaa actggaaatc aagggcgggg gaggctcagg aggaggaggg 360 agcggaggag gaggcagcca ggtgcagctg cagcagagcg gagcagaact ggtccgacct 420 ggaagctccg tgaaaatttc ttgcaaggcc agtggctatg ctttttctag ttactggatg 480 aattgggtga agcagcgacc aggacagtgt ctggagtgga tcgggcagat ttggcctggg 540 gatggagaca ccaactataa tggaaagttc aaaggcaagg caactctgac cgccgacgaa 600 tcaagctcca cagcttatat gcagctgtct agtctggcta gtgaggattc agcagtgtac 660 ttttgcgccc ggagagaaac cacaactgtg ggcagatact attacgcaat ggactactgg 720 ggccagggga ccacagtcac cgtgtcaagc gcagccgagc ccaaatcctc tgataagaca 780 cacacttgcc ctccatgtcc ggcgccagaa gctgcaggcg gaccttccgt gttcctgttt 840 ccccctaaac caaaggacac tctgatgatc tctcgcactc cagaggtcac ctgcgtggtc 900 gtgtccgtgt ctcacgagga ccccgaagtc aaattcaact ggtatgtgga cggggtcgaa 960 gtgcataatg ccaaaacaaa gcctagggag gaacagtata actctacata ccgcgtcgtg 1020 agtgtcctga ctgtgctgca tcaggattgg ctgaatggca aggagtacaa atgtaaggtg 1080 agcaacaaag cactgcccgc ccctatcgaa aaaactatta gcaaagcaaa aggacagcct 1140 cgcgaaccac aggtctacgt ctacccccca tcaagagatg aactgacaaa aaatcaggtc 1200 tctctgacat gcctggtcaa aggattctac ccttccgaca tcgccgtgga gtgggaaagt 1260 aacggccagc ccgagaacaa ttacaagacc acaccccctg tcctggactc tgatgggagt 1320 ttcgctctgg tgtcaaagct gaccgtcgat aaaagccggt ggcagcaggg caatgtgttt 1380 agctgctccg tcatgcacga agccctgcac aatcactaca cacagaagtc cctgagcctg 1440 agccctggc 1449 <210> 45 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 46 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 46 gacatccagc tgacacagag ccccgcaagc ctggccgtga gcctgggaca gagagccact 60 atttcatgca aagcctcaca gagcgtggac tatgatggag acagctatct gaactggtac 120 cagcagatcc caggccagcc ccctaaactg ctgatctacg acgccagcaa tctggtgtcc 180 ggcatcccac ccaggttcag tggatcaggc agcgggaccg attttacact gaacattcac 240 cctgtcgaga aggtggacgc cgctacctac cattgccagc agtccacaga ggacccctgg 300 actttcggat gtggcaccaa actggaaatc aag 333 <210> 47 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 47 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 48 ggcgggggag gctcaggagg aggagggagc ggaggaggag gcagc 45 <210> 49 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 49 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 50 caggtgcagc tgcagcagag cggagcagaa ctggtccgac ctggaagctc cgtgaaaatt 60 tcttgcaagg ccagtggcta tgctttttct agttactgga tgaattgggt gaagcagcga 120 ccaggacagt gtctggagtg gatcgggcag atttggcctg gggatggaga caccaactat 180 aatggaaagt tcaaaggcaa ggcaactctg accgccgacg aatcaagctc cacagcttat 240 atgcagctgt ctagtctggc tagtgaggat tcagcagtgt acttttgcgc ccggagagaa 300 accacaactg tgggcagata ctattacgca atggactact ggggccaggg gaccacagtc 360 accgtgtcaa gc 372 <210> 51 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 52 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 52 gcagccgagc ccaaatcctc tgataagaca cacacttgcc ctccatgtcc g 51 <210> 53 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 54 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 54 gcgccagaag ctgcaggcgg accttccgtg ttcctgtttc cccctaaacc aaaggacact 60 ctgatgatct ctcgcactcc agaggtcacc tgcgtggtcg tgtccgtgtc tcacgaggac 120 cccgaagtca aattcaactg gtatgtggac ggggtcgaag tgcataatgc caaaacaaag 180 cctagggagg aacagtataa ctctacatac cgcgtcgtga gtgtcctgac tgtgctgcat 240 caggattggc tgaatggcaa ggagtacaaa tgtaaggtga gcaacaaagc actgcccgcc 300 cctatcgaaa aaactattag caaagcaaaa 330 <210> 55 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 56 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 56 ggacagcctc gcgaaccaca ggtctacgtc taccccccat caagagatga actgacaaaa 60 aatcaggtct ctctgacatg cctggtcaaa ggattctacc cttccgacat cgccgtggag 120 tgggaaagta acggccagcc cgagaacaat tacaagacca caccccctgt cctggactct 180 gatgggagtt tcgctctggt gtcaaagctg accgtcgata aaagccggtg gcagcagggc 240 aatgtgttta gctgctccgt catgcacgaa gccctgcaca atcactacac acagaagtcc 300 ctgagcctga gccctggc 318 <210> 57 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 57 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 115 120 125 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val 130 135 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cacgattcag cggcagcggc tctgggactg attttaccct gaacattcac 240 ccagtcgaga aggtggacgc cgctacctac cattgccagc agtctaccga ggacccctgg 300 acattcggcg ggggaactaa actggaaatc aagggaggag gaggcagtgg cggaggaggg 360 tcaggaggag gaggaagcca ggtgcagctg cagcagagcg gagcagagct ggtcagacca 420 ggaagctccg tgaaaatttc ctgtaaggct tctggctatg cattttctag ttactggatg 480 aattgggtga agcagaggcc aggacagggc ctggaatgga tcgggcagat ttggcccggg 540 gatggagaca ccaactataa tggaaagttc aaaggcaagg ccacactgac tgctgacgag 600 tcaagctcca cagcctatat gcagctgtct agtctggcaa gcgaggattc cgccgtgtac 660 ttttgcgctc ggagagaaac cacaactgtg ggcaggtact attacgctat ggactactgg 720 ggccagggga ccacagtcac cgtgtcaagc gcagccgaac ccaaatcctc tgataagacc 780 cacacatgcc ctccatgtcc agctcctgag gctgcaggag gaccaagcgt gttcctgttt 840 ccccctaaac ctaaggacac actgatgatc tctcggacac ccgaagtcac ttgtgtggtc 900 gtgagcgtga gccacgagga ccctgaagtc aaattcaact ggtacgtgga tggcgtcgag 960 gtgcataatg ccaaaactaa gcctagggag gaacagtata actccactta ccgcgtcgtg 1020 tctgtcctga ccgtgctgca tcaggactgg ctgaacggaa aggagtacaa atgcaaggtg 1080 agcaacaagg cactgccagc ccccatcgag aagacaattt ccaaagcaaa gggccagcct 1140 cgagaaccac aggtctatgt gtacccaccc agccgggacg agctgaccaa aaaccaggtc 1200 tccctgacat gtctggtgaa gggattttat ccttctgata ttgccgtgga gtgggaaagt 1260 aatggccagc cagaaaacaa ttacaagact acccctccag tgctggattc tgacgggagt 1320 ttcgctctgg tcagtaaact gactgtggat aagtcacggt ggcagcaggg aaacgtcttt 1380 agttgttcag tgatgcacga ggcactgcac aatcattaca cccagaaaag cctgtccctg 1440 tctcccggca ag 1452 <210> 59 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro 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62 ggaggaggag gcagtggcgg aggagggtca ggaggaggag gaagc 45 <210> 63 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 63 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 64 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 64 caggtgcagc tgcagcagag cggagcagag ctggtcagac caggaagctc cgtgaaaatt 60 tcctgtaagg cttctggcta tgcattttct agttactgga tgaattgggt gaagcagagg 120 ccaggacagg gcctggaatg gatcgggcag atttggcccg gggatggaga caccaactat 180 aatggaaagt tcaaaggcaa ggccacactg actgctgacg agtcaagctc cacagcctat 240 atgcagctgt ctagtctggc aagcgaggat tccgccgtgt acttttgcgc tcggagagaa 300 accacaactg tgggcaggta ctattacgct atggactact ggggccaggg gaccacagtc 360 accgtgtcaa gc 372 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 66 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 66 gcagccgaac ccaaatcctc tgataagacc cacacatgcc ctccatgtcc a 51 <210> 67 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 70 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 70 ggccagcctc gagaaccaca ggtctatgtg tacccaccca gccgggacga gctgaccaaa 60 aaccaggtct ccctgacatg tctggtgaag ggattttatc cttctgatat tgccgtggag 120 tgggaaagta atggccagcc agaaaacaat tacaagacta cccctccagt gctggattct 180 gacgggagtt tcgctctggt cagtaaactg actgtggata agtcacggtg gcagcaggga 240 aacgtcttta gttgttcagt gatgcacgag gcactgcaca atcattacac ccagaaaagc 300 ctgtccctgt ctcccggc 318 <210> 71 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 115 120 125 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val 130 135 140 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met 145 150 155 160 Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 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atacccaccc agccgggacg agctgaccaa aaaccaggtc 1200 tccctgacat gtctggtgaa gggattttat ccttctgata ttgccgtgga gtgggaaagt 1260 aatggccagc cagaaaacaa ttacaagact acccctccag tgctggattc tgacgggagt 1320 ttcgcactgg tcagtaaact gacagtggat aagtcacggt ggcagcaggg aaacgtcttt 1380 agttgttcag tgatgcacga ggccctgcac aatcattaca ctcagaaaag cctgtccctg 1440 tctcccggca ag 1452 <210> 73 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 78 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 78 caggtgcagc tgcagcagag cggagcagag ctggtcagac caggaagctc cgtgaaaatt 60 tcctgtaagg catctggcta tgccttttct agttactgga tgaattgggt gaagcagagg 120 ccaggacagg gcctggaatg gatcgggcag atttggcccg gggatggaga cactaactat 180 aatggaaagt tcaaaggcaa 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Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 115 120 125 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val 130 135 140 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met 145 150 155 160 Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln 165 170 175 Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser 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gatattcagc tgacccagag tcctgcatca ctggctgtga gcctgggaca gcgagcaaca 60 atctcctgca aagccagtca gtcagtggac tatgatggcg actcctatct gaactggtac 120 cagcagatcc cagggcagcc ccctaagctg ctgatctacg acgcttcaaa tctggtgagc 180 ggcatcccac cacgattcag cggcagcggc tctggaaccg attttacact gaacattcac 240 ccagtcgaga aggtggacgc cgctacctac cattgccagc agtctacaga ggacccctgg 300 actttcggcg ggggaaccaa actggaaatc aag 333 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 89 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 90 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 90 ggaggaggag gcagtggcgg aggagggtca ggaggaggag gaagc 45 <210> 91 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 91 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys 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tatatgcagc tgagttcact gacatctgag gacagtgccg tgtactattg cgctaggtac 660 tatgacgatc actactgtct ggattattgg ggccagggga ctaccctgac cgtgagctcc 720 gcagccgaac ctaaatctag tgacaagact catacctgcc ccccttgtcc agcaccagag 780 ctgctgggag gaccttccgt gttcctgttt ccacccaaac caaaggatac tctgatgatc 840 tcccggacac ctgaagtcac ttgcgtggtc gtggacgtgt ctcacgagga ccccgaagtc 900 aagtttaact ggtacgtgga cggcgtcgag gtgcataatg ccaaaaccaa gcccagggag 960 gaacagtaca actccacata tcgcgtcgtg tctgtcctga ctgtgctgca ccaggattgg 1020 ctgaacggca aggagtacaa atgcaaggtg agcaacaagg ccctgcctgc tccaatcgag 1080 aagacaatta gcaaagccaa ggggcagccc cgagaacctc aggtgtacac tctgcctcca 1140 tctcgggacg agctgaccaa aaaccaggtc agtctgctgt gtctggtgaa gggcttctat 1200 ccaagcgata ttgctgtgga gtgggaatcc aatgggcagc ccgaaaacaa ttacatgaca 1260 tggccccctg tcctggactc agatgggagc ttctttctgt atagtaaact gactgtggac 1320 aagtcacggt ggcagcaggg aaacgtcttt agctgttccg tgatgcatga ggccctgcac 1380 aatcattaca cccagaaatc tctgagtctg tcacccggca ag 1422 <210> 101 <211> 106 <212> PRT 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 117 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 118 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 118 ggaggaggag gcagtggagg aggagggtca ggcggaggag gaagc 45 <210> 119 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 119 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 <210> 120 <211> 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 123 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 124 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 124 gctccagaag ctgcaggagg accttccgtg ttcctgtttc cacccaaacc aaaggataca 60 ctgatgatta gccgcacccc tgaggtcaca tgcgtggtcg tgagcgtgag ccacgaggac 120 cccgaagtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtcgaag tgcataatgc caaaaccaag 180 cctagggagg aacagtacaa cagtacatat agagtcgtgt cagtgctgac cgtcctgcac 240 caggattggc tgaacggcaa 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aaattaatgg cggaggaggc tccggaggag gagggtctgg aggaggagga 360 agtcaggtgc agctgcagca gtccggagct gagctggcac gaccaggagc aagtgtgaaa 420 atgtcatgca aggccagcgg ctacaccttc acacggtata ccatgcattg ggtgaaacag 480 agacccggac agtgtctgga atggatcggc tacattaatc cttctcgagg gtacacaaac 540 tacaaccaga agtttaaaga caaggctact ctgaccacag ataagagctc ctctaccgca 600 tatatgcagc tgagttcact gacatctgag gacagtgccg tgtactattg cgctaggtac 660 tatgacgatc actactgtct ggattattgg gggcagggaa ctaccctgac agtgagctcc 720 gcagccgaac ctaaatctag tgacaagact catacctgcc ccccttgtcc agcaccagag 780 ctgctgggag gacctagcgt gttcctgttt ccacccaaac caaaggatac tctgatgatc 840 tcccggacac ctgaagtcac ttgcgtggtc gtggacgtgt ctcacgagga ccccgaagtc 900 aagtttaact ggtacgtgga cggcgtcgag gtgcataatg ccaaaaccaa gcccagggag 960 gaacagtaca actccacata tcgcgtcgtg tctgtcctga ctgtgctgca ccaggattgg 1020 ctgaacggaa aggagtacaa atgcaaggtg agcaacaagg ccctgcctgc tccaatcgag 1080 aagacaatta gcaaagccaa gggccagccc cgagaacctc aggtctacgt gctgcctcca 1140 tctcgggacg agctgactaa aaaccaggtc agtctgctgt gtctggtgaa gggattctat 1200 ccaagcgata ttgctgtgga gtgggaatcc aatggccagc ccgaaaacaa ttacctgact 1260 tggccccctg tcctggactc agatggcagc ttctttctgt atagtaaact gaccgtggac 1320 aagtcacggt ggcagcaggg gaacgtcttt agctgttccg tgatgcatga ggccctgcac 1380 aatcattaca cccagaaatc tctgagtctg tcacccggca ag 1422 <210> 143 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 143 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 <210> 144 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 144 cagatcgtcc tgacacagtc cccagcaatc atgtcagcca gccccgggga gaaagtcaca 60 atgacttgct cagcaagctc ctctgtgagc tacatgaact ggtatcagca gaaaagcggg 120 acctccccca agagatggat ctacgacaca tccaagctgg cttctggagt gcctgcacac 180 ttcaggggca gcggctctgg gaccagttat tcactgacaa ttagcggcat ggaggctgaa 240 gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agttcaaacc cattcacttt tggatgtggc 300 accaagctgg aaattaat 318 <210> 145 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 145 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 146 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 146 ggcggaggag gctccggagg aggagggtct ggaggaggag gaagt 45 <210> 147 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 147 Gln Val Gln Leu 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actattgcgc taggtactat 300 gacgatcact actgtctgga ttattggggg cagggaacta ccctgacagt gagctcc 357 <210> 149 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 149 Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 150 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 gcagccgaac ctaaatctag tgacaagact catacctgcc ccccttgtcc a 51 <210> 151 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 151 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 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caaggctact ctgaccacag ataagagctc ctctaccgca 600 tatatgcagc tgagttcact gacatctgag gacagtgccg tgtactattg cgctaggtac 660 tatgacgatc actactccct ggattattgg gggcagggaa ctaccctgac agtgagctcc 720 gcagccgaac ctaaatctag tgacaagact catacctgcc caccttgtcc agcaccagag 780 ctgctgggcg ggccttctgt gttcctgttt ccacccaaac caaaggatac tctgatgatc 840 tcccggacac ctgaagtcac ttgtgtggtc gtggacgtgt ctcacgagga ccccgaagtc 900 aagtttaact ggtacgtgga cggcgtcgag gtgcataatg ccaaaaccaa gcccagggag 960 gaacagtaca actccacata tcgcgtcgtg tctgtcctga ctgtgctgca ccaggattgg 1020 ctgaacggaa aggagtacaa atgcaaggtg agcaacaagg ccctgcctgc tccaatcgag 1080 aagacaatta gcaaagccaa gggccagccc cgagaacctc aggtctacgt gctgcctcca 1140 tctcgggacg agctgactaa aaaccaggtc agtctgctgt gtctggtgaa gggattctat 1200 ccaagcgata ttgctgtgga gtgggaatcc aatggccagc ccgaaaacaa ttacctgact 1260 tggccccctg tcctggactc agatggcagc ttctttctgt atagtaaact gaccgtggac 1320 aagtcacggt ggcagcaggg gaacgtcttt agctgttccg tgatgcatga ggccctgcac 1380 aatcattaca cccagaaatc tctgagtctg tcacccggca ag 1422 <210> 157 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 157 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105 <210> 158 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 158 cagatcgtcc tgacacagag cccagcaatc atgtcagcca gccccgggga gaaagtcaca 60 atgacttgct cagcaagctc ctctgtgagc tacatgaact ggtatcagca gaaaagcggg 120 acctccccca agagatggat ctacgacaca tccaagctgg cttctggagt gcctgcacac 180 ttcaggggca gcggctctgg gaccagttat tcactgacaa tttccggcat ggaggctgaa 240 gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agttcaaacc cattcacttt tggatgtggc 300 accaagctgg aaattaat 318 <210> 159 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 159 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 160 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 160 ggcggaggag gctccggagg aggagggtct ggaggaggag gaagt 45 <210> 161 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 161 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys 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gcaccagagc tgctgggcgg gccttctgtg ttcctgtttc cacccaaacc aaaggatact 60 ctgatgatct cccggacacc tgaagtcact tgtgtggtcg tggacgtgtc tcacgaggac 120 cccgaagtca agtttaactg gtacgtggac ggcgtcgagg tgcataatgc caaaaccaag 180 cccagggagg aacagtacaa ctccacatat cgcgtcgtgt ctgtcctgac tgtgctgcac 240 caggattggc tgaacggaaa ggagtacaaa tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcctgct 300 ccaatcgaga agacaattag caaagccaag 330 <210> 167 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 167 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 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ggccgctact attacgccat ggactactgg 720 ggccagggga ccacagtgac agtctcaagc ggcgggggag gctccgatat caagctgcag 780 cagtctggag cagagctggc tcgaccagga gccagtgtga agatgtcatg taaaaccagc 840 ggctatactt tcaccaggta cacaatgcac tgggtgaaac agcgcccagg acagggcctg 900 gaatggatcg gatacattaa cccctccagg ggctatacca actacaatca gaagttcaag 960 gataaagcca ctctgactac cgacaagtcc tctagtaccg cttatatgca gctgtcaagc 1020 ctgacatccg aggactctgc agtgtattac tgcgcccgct attacgacga tcattattgt 1080 ctggattact gggggcaggg aacaactctg actgtgtcct ctgtcgaagg gggaagtgga 1140 gggtcaggag gcagcggagg cagcggaggg gtggacgata tccagctgac ccagtcccct 1200 gccattatga gcgcttcccc aggcgagaag gtgacaatga cttgcagggc tagttcaagc 1260 gtctcttata tgaattggta tcagcagaag tctggcacta gtcctaaacg atggatctat 1320 gacacctcca aagtggcatc tggggtccca taccggttct ctggcagtgg gtcaggaact 1380 agctattccc tgaccatttc ctctatggag gcagaagatg cagccaccta ttactgtcag 1440 cagtggagtt caaatcccct gacatttggc gccgggacta agctggagct gaaacaccat 1500 caccatcacc at 1512 <210> 171 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 171 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 172 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 172 gatattcagc tgacacagtc tccagctagt ctggcagtga gcctgggcca gcgggctact 60 atcagctgca aggcaagcca gtccgtcgac tacgatgggg acagctatct gaactggtac 120 cagcagatcc ccggacagcc ccctaaactg ctgatctacg acgcctcaaa tctggtgagc 180 ggcatcccac ccagattctc tggaagtggc tcagggaccg attttacact gaacattcac 240 cccgtggaga aggtcgacgc cgctacctac cattgccagc agtccactga ggacccctgg 300 accttcggag gaggaacaaa gctggaaatc aaa 333 <210> 173 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 173 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 174 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 174 ggcggaggag gcagtggagg aggagggagc ggaggaggag gaagc 45 <210> 175 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 175 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr 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tgacaagact catacctgcc ccccttgtcc agcaccagag 780 ctgctgggag gacctagcgt gttcctgttt ccacccaaac caaaggatac tctgatgatc 840 tcccggacac ctgaagtcac ttgtgtggtc gtggacgtgt ctcacgagga ccccgaagtc 900 aagtttaact ggtacgtgga cggcgtcgag gtgcataatg ccaaaaccaa gcccagggag 960 gaacagtaca actccacata tcgcgtcgtg tctgtcctga ctgtgctgca ccaggattgg 1020 ctgaacggca aggagtacaa atgcaaggtg agcaacaagg ccctgcctgc tccaatcgag 1080 aagacaatta gcaaagccaa ggggcagccc cgagaacctc aggtctacgt gctgcctcca 1140 tctcgggacg agctgactaa aaaccaggtc agtctgctgt gtctggtgaa gggcttctat 1200 ccaagcgata ttgctgtgga gtgggaatcc aatgggcagc ccgaaaacaa ttacctgact 1260 tggccccctg tcctggactc agatgggagc ttctttctgt atagtaaact gaccgtggac 1320 aagtcacggt ggcagcaggg aaacgtcttt agctgttccg tgatgcatga ggccctgcac 1380 aatcattaca cccagaaatc tctgagtctg tcacccggca ag 1422 <210> 185 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 185 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser 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aacagtacaa ctccacatat cgcgtcgtgt ctgtcctgac tgtgctgcac 240 caggattggc tgaacggcaa ggagtacaaa tgcaaggtga gcaacaaggc cctgcctgct 300 ccaatcgaga agacaattag caaagccaag 330 <210> 195 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 195 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 196 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 196 gggcagcccc gagaacctca ggtctacgtg ctgcctccat ctcgggacga gctgactaaa 60 aaccaggtca gtctgctgtg tctggtgaag ggcttctatc caagcgatat tgctgtggag 120 tgggaatcca atgggcagcc cgaaaacaat tacctgactt ggccccctgt cctggactca 180 gatgggagct tctttctgta tagtaaactg accgtggaca agtcacggtg gcagcaggga 240 aacgtcttta gctgttccgt gatgcatgag gccctgcaca atcattacac ccagaaatct 300 ctgagtctgt cacccggc 318 <210> 197 <211> 474 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 197 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 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Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 370 375 380 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 198 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 198 cagatcgtcc tgacacagag cccagctatc atgtcagcaa gccccggcga gaaagtcaca 60 atgacttgct cagccagctc ctctgtgagc tacatgaact ggtatcagca gaaaagcgga 120 acctccccca agagatggat ctacgacaca tccaagctgg cctctggagt gcctgctcac 180 ttcaggggca gcggctctgg gaccagttat tcactgacaa tttccggcat ggaggccgaa 240 gatgccgcta cctactattg ccagcagtgg agttcaaacc cattcacttt tggatctggc 300 accaagctgg aaattaatgg cggaggaggc tccggaggag gagggtctgg aggaggagga 360 agtcaggtgc agctgcagca gagcggagca gagctggctc gaccaggagc tagtgtgaaa 420 atgtcctgta aggcaagcgg ctacaccttc acacggtata ccatgcattg ggtgaaacag 480 agacccgggc agggactgga atggatcggg tacattaatc cttcccgagg atacacaaac 540 tacaaccaga agtttaaaga caaggccact ctgaccacag ataagagctc ctctaccgct 600 tatatgcagc tgagttcact gacatctgag gacagtgcag tgtactattg cgccaggtac 660 tatgacgatc actactccct ggattattgg ggccagggga ctaccctgac agtgagctcc 720 gcagccgaac ctaaatctag tgacaagact catacctgcc ccccttgtcc agcaccagag 780 gctgcaggag gacctagcgt gttcctgttt ccacccaaac caaaggatac tctgatgatc 840 tcccggacac ctgaagtcac ttgtgtggtc gtgagcgtgt ctcacgagga ccccgaagtc 900 aagtttaact ggtacgtgga cggcgtcgag gtgcataatg ccaaaaccaa gcccagggag 960 gaacagtaca actccacata tcgcgtcgtg tctgtcctga ctgtgctgca ccaggattgg 1020 ctgaacggca aggagtacaa atgcaaggtg agcaacaagg cactgcctgc cccaatcgag 1080 aagacaatta gcaaagcaaa ggggcagccc cgagaacctc aggtctacgt gctgcctcca 1140 tctcgggacg agctgactaa aaaccaggtc agtctgctgt gtctggtgaa gggcttctat 1200 ccaagcgata ttgctgtgga gtgggaatcc aatgggcagc ccgaaaacaa ttacctgact 1260 tggccccctg tcctggactc agatgggagc ttctttctgt atagtaaact gaccgtggac 1320 aagtcacggt ggcagcaggg aaacgtcttt agctgttccg tgatgcatga ggccctgcac 1380 aatcattaca cccagaaatc tctgagtctg tcacccggca ag 1422 <210> 199 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 199 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu 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ggcggaggag gctccggagg aggagggtct ggaggaggag gaagt 45 <210> 203 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 203 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 204 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 204 caggtgcagc tgcagcagag cggagcagag ctggctcgac caggagctag tgtgaaaatg 60 tcctgtaagg caagcggcta caccttcaca cggtatacca tgcattgggt gaaacagaga 120 cccgggcagg gactggaatg gatcgggtac attaatcctt cccgaggata cacaaactac 180 aaccagaagt ttaaagacaa ggccactctg accacagata agagctcctc taccgcttat 240 atgcagctga gttcactgac atctgaggac agtgcagtgt actattgcgc caggtactat 300 gacgatcact actccctgga ttattggggc caggggacta ccctgacagt gagctcc 357 <210> 205 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 205 Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 206 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 gcagccgaac ctaaatctag tgacaagact catacctgcc ccccttgtcc a 51 <210> 207 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 207 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 208 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 208 gcaccagagg ctgcaggagg acctagcgtg ttcctgtttc cacccaaacc aaaggatact 60 ctgatgatct cccggacacc tgaagtcact tgtgtggtcg tgagcgtgtc tcacgaggac 120 cccgaagtca agtttaactg gtacgtggac ggcgtcgagg tgcataatgc caaaaccaag 180 cccagggagg aacagtacaa ctccacatat cgcgtcgtgt ctgtcctgac tgtgctgcac 240 caggattggc tgaacggcaa ggagtacaaa tgcaaggtga gcaacaaggc actgcctgcc 300 ccaatcgaga agacaattag caaagcaaag 330 <210> 209 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 209 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 210 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 210 gggcagcccc gagaacctca ggtctacgtg ctgcctccat ctcgggacga gctgactaaa 60 aaccaggtca gtctgctgtg tctggtgaag ggcttctatc caagcgatat tgctgtggag 120 tgggaatcca atgggcagcc cgaaaacaat tacctgactt ggccccctgt cctggactca 180 gatgggagct tctttctgta tagtaaactg accgtggaca agtcacggtg gcagcaggga 240 aacgtcttta gctgttccgt gatgcatgag gccctgcaca atcattacac ccagaaatct 300 ctgagtctgt cacccggc 318 <210> 211 <211> 484 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 211 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 115 120 125 Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser Ser Val 130 135 140 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met 145 150 155 160 Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Gln 165 170 175 Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Gly 180 185 190 Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 195 200 205 Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 210 215 220 Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Glu Pro Lys Ser 245 250 255 Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 260 265 270 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 275 280 285 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 290 295 300 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 305 310 315 320 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 325 330 335 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 340 345 350 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 355 360 365 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 370 375 380 Val Tyr Val Tyr 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gaggcagtgg cggaggaggg 360 tcaggaggag gaggaagcca ggtgcagctg cagcagagcg gagcagagct ggtcagacca 420 ggaagctccg tgaaaatttc ctgtaaggct tctggctatg cattttctag ttactggatg 480 aattgggtga agcagaggcc aggacagggc ctggaatgga tcgggcagat ttggcccggg 540 gatggagaca ccaactataa tggaaagttc aaaggcaagg ccacactgac tgctgacgag 600 tcaagctcca cagcctatat gcagctgtct agtctggcaa gcgaggattc cgccgtgtac 660 ttttgcgctc ggagagaaac cacaactgtg ggcaggtact attacgctat ggactactgg 720 ggccagggga ccacagtcac cgtgtcaagc gcagccgaac ccaaatcctc tgataagacc 780 cacacatgcc ctccatgtcc agctcctgag gctgcaggag gaccaagcgt gttcctgttt 840 ccccctaaac ctaaggacac actgatgatc tctcggacac ccgaagtcac ttgtgtggtc 900 gtggatgtga gccacgagga ccctgaagtc aaattcaact ggtacgtgga tggcgtcgag 960 gtgcataatg ccaaaactaa gcctagggag gaacagtata actccactta ccgcgtcgtg 1020 tctgtcctga ccgtgctgca tcaggactgg ctgaacggaa aggagtacaa atgcaaggtg 1080 agcaacaagg cactgccagc ccccatcgag aagacaattt ccaaagcaaa gggccagcct 1140 cgagaaccac aggtctatgt gtacccaccc agccgggacg agctgaccaa aaaccaggtc 1200 tccctgacat gtctggtgaa gggattttat ccttctgata ttgccgtgga gtgggaaagt 1260 aatggccagc cagaaaacaa ttacaagact acccctccag tgctggattc tgacgggagt 1320 ttcgctctgg tcagtaaact gactgtggat aagtcacggt ggcagcaggg aaacgtcttt 1380 agttgttcag tgatgcacga ggcactgcac aatcattaca cccagaaaag cctgtccctg 1440 tctcccggca ag 1452 <210> 213 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 213 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 214 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 214 gatattcagc tgacacagag tcctgcatca ctggctgtga gcctgggaca gcgagcaact 60 atctcctgca aagccagtca gtcagtggac tatgatggcg actcctatct gaactggtac 120 cagcagatcc cagggcagcc ccctaagctg ctgatctacg acgcctcaaa tctggtgagc 180 ggcatcccac cacgattcag cggcagcggc tctgggactg attttaccct gaacattcac 240 ccagtcgaga aggtggacgc cgctacctac cattgccagc agtctaccga ggacccctgg 300 acattcggcg ggggaactaa actggaaatc aag 333 <210> 215 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 215 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 216 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 ggaggaggag gcagtggcgg aggagggtca ggaggaggag gaagc 45 <210> 217 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 217 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 218 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 218 caggtgcagc tgcagcagag cggagcagag ctggtcagac caggaagctc cgtgaaaatt 60 tcctgtaagg cttctggcta tgcattttct agttactgga tgaattgggt gaagcagagg 120 ccaggacagg gcctggaatg gatcgggcag atttggcccg gggatggaga caccaactat 180 aatggaaagt tcaaaggcaa ggccacactg actgctgacg agtcaagctc cacagcctat 240 atgcagctgt ctagtctggc aagcgaggat tccgccgtgt acttttgcgc tcggagagaa 300 accacaactg tgggcaggta ctattacgct atggactact ggggccaggg gaccacagtc 360 accgtgtcaa gc 372 <210> 219 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 219 Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 220 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 gcagccgaac ccaaatcctc tgataagacc cacacatgcc ctccatgtcc a 51 <210> 221 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 221 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 225 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val 115 120 125 Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140 Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met 145 150 155 160 Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile Gly Gln 165 170 175 Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly 180 185 190 Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 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gcaccagaac tgctgggagg accttccgtg ttcctgtttc cacccaaacc aaaggataca 60 ctgatgatta gccgcacccc tgaggtcaca tgcgtggtcg tggacgtgag ccacgaggac 120 cccgaagtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtcgaag tgcataatgc caaaaccaag 180 cctagggagg aacagtacaa cagtacatat agagtcgtgt cagtgctgac cgtcctgcac 240 caggattggc tgaacggcaa ggagtacaaa tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgct 300 ccaatcgaga agaccatttc taaagcaaag 330 <210> 259 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 259 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Tyr Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Ala Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 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Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 262 gacattcagc tgacccagag tcctgcttca ctggcagtga gcctgggaca gcgagcaaca 60 atctcctgca aagctagtca gtcagtggac tatgatggcg actcctatct gaactggtac 120 cagcagatcc cagggcagcc ccctaagctg ctgatctacg acgcctcaaa tctggtgagc 180 ggcatcccac cacgattcag cggcagcggc tctggaaccg attttacact gaacattcac 240 ccagtcgaga aggtggacgc cgctacctac cattgccagc agtctacaga ggacccctgg 300 actttcggcg ggggaaccaa actggaaatc aagggaggag gaggcagtgg cggaggaggg 360 tcaggaggag gaggaagcca ggtgcagctg cagcagagcg gagcagagct ggtcagacca 420 ggaagctccg tgaaaatttc ctgtaaggca tctggctatg ccttttctag ttactggatg 480 aattgggtga agcagaggcc aggacagggc ctggaatgga tcgggcagat ttggcccggg 540 gatggagaca caaactataa tggaaagttc aaaggcaagg ctactctgac cgcagacgag 600 tcaagctcca ctgcatatat gcagctgtct agtctggcca gcgaggattc cgctgtctac 660 ttttgcgcac ggagagaaac cacaactgtg ggcaggtact attacgccat ggactactgg 720 ggccagggga ccacagtcac cgtgtcaagc gcagccgaac ccaaatcctc tgataagaca 780 cacacttgcc ctccatgtcc agctcctgag ctgctgggag gaccaagcgt gttcctgttt 840 ccacctaaac ctaaggacac tctgatgatc tctcggactc ccgaagtcac ctgtgtggtc 900 gtggatgtga gccacgagga ccctgaagtc aaattcaact ggtacgtgga tggcgtcgag 960 gtgcataatg ccaaaacaaa gcctagggag gaacagtata actccacata ccgcgtcgtg 1020 tctgtcctga ctgtgctgca tcaggactgg ctgaacggaa aggagtacaa atgcaaggtg 1080 agcaacaagg ccctgccagc tcccatcgag aagaccattt ccaaagctaa gggccagcct 1140 cgagaaccac aggtctatgt gctgccaccc agccgggacg agctgacaaa aaaccaggtc 1200 tccctgctgt gtctggtgaa gggattctac ccttctgata ttgcagtgga gtgggaaagt 1260 aatggccagc cagaaaacaa ttatctgact tggcctccag tgctggattc tgacgggagt 1320 ttctttctgt acagtaaact gaccgtggat aagtcacggt ggcagcaggg aaacgtcttt 1380 agttgttcag tgatgcacga ggccctgcac aatcattaca cccagaaaag cctgtccctg 1440 tctcccggca ag 1452 <210> 263 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 263 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val 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oligonucleotide <400> 270 gcagccgaac ccaaatcctc tgataagaca cacacttgcc ctccatgtcc a 51 <210> 271 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 271 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 100 105 110 <210> 272 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 272 gctcctgagc tgctgggagg accaagcgtg ttcctgtttc cacctaaacc taaggacact 60 ctgatgatct ctcggactcc cgaagtcacc tgtgtggtcg tggatgtgag ccacgaggac 120 cctgaagtca aattcaactg gtacgtggat ggcgtcgagg tgcataatgc caaaacaaag 180 cctagggagg aacagtataa ctccacatac cgcgtcgtgt ctgtcctgac tgtgctgcat 240 caggactggc tgaacggaaa ggagtacaaa tgcaaggtga gcaacaaggc cctgccagct 300 cccatcgaga agaccatttc caaagctaag 330 <210> 273 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 273 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp 1 5 10 15 Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 35 40 45 Asn Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 85 90 95 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 100 105 <210> 274 <211> 318 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 274 ggccagcctc gagaaccaca ggtctatgtg ctgccaccca gccgggacga gctgacaaaa 60 aaccaggtct ccctgctgtg tctggtgaag ggattctacc cttctgatat tgcagtggag 120 tgggaaagta atggccagcc agaaaacaat tatctgactt ggcctccagt gctggattct 180 gacgggagtt tctttctgta cagtaaactg accgtggata agtcacggtg gcagcaggga 240 aacgtcttta gttgttcagt gatgcacgag gccctgcaca atcattacac ccagaaaagc 300 ctgtccctgt ctcccggc 318 <210> 275 <211> 473 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 275 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser 115 120 125 Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln 145 150 155 160 Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg 165 170 175 Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr 180 185 190 Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr 195 200 205 Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His 210 215 220 Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Val Val Val Ser Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 325 330 335 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 370 375 380 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Leu Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Leu Thr Trp Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 435 440 445 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 465 470 <210> 276 <211> 1419 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 276 cagatcgtcc tgactcagag ccccgctatt atgtccgcaa gccctggaga gaaagtgact 60 atgacctgtt ccgcatctag ttccgtgtcc tacatgaact ggtatcagca gaaatctgga 120 acaagtccca agcgatggat ctacgacact tccaagctgg catctggagt gcctgcccac 180 ttccgaggca gcggctctgg gacaagttat tcactgacta ttagcggcat ggaggccgaa 240 gatgccgcta catactattg ccagcagtgg agctccaacc cattcacctt tggatgtggc 300 acaaagctgg agatcaatgg cggaggaggc tccggaggag gagggtctgg aggaggagga 360 agtcaggtcc agctgcagca gtccggagca gaactggcta gaccaggagc cagtgtgaaa 420 atgtcatgca aggccagcgg ctacacattc actcggtata ccatgcattg ggtgaaacag 480 agaccaggac agtgtctgga gtggatcggc tacattaatc ccagcagggg gtacacaaac 540 tacaaccaga agtttaaaga caaggcaacc ctgaccaccg ataagtctag ttcaacagct 600 tatatgcagc tgagctccct gacttcagaa gacagcgctg tgtactattg cgcacgctac 660 tatgacgatc actactccct ggattattgg gggcagggaa ctaccctgac cgtgtctagt 720 gcagccgagc ctaaatcaag cgacaagacc catacatgcc ccccttgtcc ggcgccagaa 780 gctgcaggcg gaccaagtgt gttcctgttt ccacccaaac ctaaggatac tctgatgatt 840 tctcgaactc ctgaggtcac ctgcgtggtc gtgagcgtgt cccacgagga cccagaagtc 900 aagttcaact ggtacgtgga tggggtcgaa gtgcataatg ccaaaaccaa gcccagggag 960 gaacagtaca actcaactta tcgcgtcgtg tctgtcctga ccgtgctgca ccaggactgg 1020 ctgaatggca aggagtacaa atgtaaggtc tcaaataagg ctctgcccgc ccctatcgaa 1080 aaaactatct ctaaggcaaa aggacagcct cgcgaaccac aggtctacgt gctgccccct 1140 agccgcgacg aactgactaa aaatcaggtc tctctgctgt gtctggtcaa aggattctac 1200 ccttccgaca tcgccgtgga gtgggaaagt aacggccagc ccgagaacaa ttacctgacc 1260 tggccccctg tgctggactc tgatgggagt ttctttctgt attcaaagct gacagtcgat 1320 aaaagccggt ggcagcaggg caatgtgttc agctgctccg tcatgcacga agcactgcac 1380 aaccattaca ctcagaagtc cctgtccctg tcacctggc 1419 <210> 277 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 277 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 280 ggcggaggag gctccggagg aggagggtct ggaggaggag gaagt 45 <210> 281 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 281 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 282 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 282 caggtccagc tgcagcagtc cggagcagaa ctggctagac caggagccag tgtgaaaatg 60 tcatgcaagg ccagcggcta cacattcact cggtatacca tgcattgggt gaaacagaga 120 ccaggacagt gtctggagtg gatcggctac attaatccca gcagggggta cacaaactac 180 aaccagaagt ttaaagacaa ggcaaccctg accaccgata agtctagttc aacagcttat 240 atgcagctga gctccctgac ttcagaagac agcgctgtgt actattgcgc acgctactat 300 gacgatcact actccctgga ttattggggg cagggaacta ccctgaccgt gtctagt 357 <210> 283 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 283 Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 284 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 284 gcagccgagc ctaaatcaag cgacaagacc catacatgcc ccccttgtcc g 51 <210> 285 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 285 Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 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aaagccggtg gcagcagggc 240 aatgtgttca gctgctccgt catgcacgaa gcactgcaca accattacac tcagaagtcc 300 ctgtccctgt cacctggc 318 <210> 289 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 289 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 290 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 290 Asp Thr Ser 1 <210> 291 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 291 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro 1 5 <210> 292 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 292 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 293 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 293 Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr 1 5 <210> 294 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 294 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 295 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 295 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 296 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 296 Asp Thr Ser 1 <210> 297 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 297 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro 1 5 <210> 298 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 298 Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr 1 5 <210> 299 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 299 Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr 1 5 <210> 300 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 300 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 301 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 301 Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Leu 1 5 10 <210> 302 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 302 Asp Ala Ser 1 <210> 303 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 303 Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 304 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 304 Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 305 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 305 Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr 1 5 <210> 306 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 306 Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 307 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 307 Gln Ser Val Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Tyr Leu 1 5 10 <210> 308 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 308 Asp Ala Ser 1 <210> 309 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 309 Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 310 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 310 Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 311 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 311 Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr 1 5 <210> 312 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 312 Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 313 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 313 Gln Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Leu 1 5 10 <210> 314 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 314 Asp Ala Ser 1 <210> 315 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 315 Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 316 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 316 Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp 1 5 <210> 317 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 317 Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr 1 5 <210> 318 <211> 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Synthetic peptide <400> 323 Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn 1 5 10 <210> 324 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 324 Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 325 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 325 Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Tyr Leu 1 5 10 <210> 326 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 326 Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser 1 5 <210> 327 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 327 Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 328 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 328 Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 10 <210> 329 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 329 Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn 1 5 10 <210> 330 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 330 Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 331 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 331 Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ser Gly Asp Ser Tyr Leu 1 5 10 <210> 332 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 332 Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser 1 5 <210> 333 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 333 Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 334 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 334 Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 10 <210> 335 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 335 Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn 1 5 10 <210> 336 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 336 Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 337 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 337 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 338 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 338 gatattcagc tgacccagag cccaagctcc ctgtctgcca gtgtggggga tagggctaca 60 atcacttgcc gcgcatcaca gagcgtggac tatgagggcg attcctatct gaactggtac 120 cagcagaagc cagggaaagc acccaagctg ctgatctacg acgcctctaa tctggtgagt 180 ggcattccct caaggttctc cggatctggc agtgggactg actttaccct gacaatctct 240 agtgtgcagc ccgaggatgc cgctacctac tattgccagc agtctacaga agacccttgg 300 actttcggat gtggcaccaa actggagatt aag 333 <210> 339 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 339 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 340 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 340 caggtccagc tggtgcagag cggagcagag gtcaagaaac ccggagccag cgtgaaaatt 60 tcctgcaagg cctctggcta tgctttctca agctactgga tgaactgggt gaggcaggca 120 ccaggacagt gtctggaatg gatcggacag atttggcctg gggacggaga taccaattat 180 gctcagaagt ttcagggacg cgcaactctg accgccgata catcaacaag cactgcatac 240 atggagctgt cctctctgcg ctccgaagac acagccgtgt actattgcgc acggagagaa 300 accacaactg tgggccgata ctattacgca atggattact ggggccaggg gaccacagtc 360 actgtgagtt ca 372 <210> 341 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 341 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 342 <211> 372 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 342 caggtccagc tggtgcagag cggagcagag gtcaagaaac ccggagccag cgtgaaaatt 60 tcctgcaagg cctctggcta tgctttctca agctactgga tgaactgggt gaggcaggca 120 ccaggacagt gtctggaatg gatcggacag atttggcctg gggacggaga taccaattat 180 gctcagaagt ttcagggacg cgcaactctg accgccgatg agtcaacaag cactgcatac 240 atggagctgt cctctctgcg ctccgaagac acagccgtgt actattgcgc acggagagaa 300 accacaactg tgggccgata ctattacgca atggattact ggggccaggg gaccacagtc 360 actgtgagtt ca 372 <210> 343 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 343 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 344 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 344 Ser Ser Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Asp Ile 20 <210> 345 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 345 Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Val Asp <210> 346 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 346 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 347 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 347 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 348 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 348 Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ser <210> 349 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 349 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 350 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 350 Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 50 55 60 Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 65 70 75 80 His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 85 90 95 Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 100 105 110 Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 115 120 125 Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 165 170 175 Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 180 185 190 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205 <210> 351 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 351 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 352 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 352 gagcccaaga gctgtgataa gacccacacc tgccctccct gtcca 45 <210> 353 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 353 Ala Ala Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 354 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 354 gcagccgaac ccaaatcctc tgataagacc cacacatgcc ctccatgtcc a 51 <210> 355 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 355 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 356 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 356 gagcctaaaa gctccgacaa gacccacaca tgcccacctt gtccg 45 <210> 357 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 357 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 358 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 358 gacaagaccc acacatgccc accttgtccg 30 <210> 359 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 359 Gly Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 360 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 360 ggcacatgcc ctccatgtcc a 21 <210> 361 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 361 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 362 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 362 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 363 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 363 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 364 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 364 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 35 40 45 Gly Gly 50 <210> 365 <211> 54 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 365 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 <210> 366 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 366 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 <210> 367 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 367 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 368 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 368 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 369 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 369 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 370 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 370 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Ser 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Val Gln Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 371 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 371 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 372 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 372 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 373 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 373 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (40)

  1. 항원 결합 작제물로서,
    제1 VL, 제1 scFv 링커, 및 제1 VH를 포함하는 제1 scFv를 포함하는 제1 항원 결합 폴리펩티드 작제물로서, 상기 제1 scFv은 CD19 항원에 1가로, 그리고 특이적으로 결합하고, 상기 제1 scFv는 항-CD19 항체 HD37 scFv, 변형된 HD37 scFv, HD37 차단 항체 scFv, 및 변형된 HD37 차단 항체 scFv로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 상기 HD37 차단 항체는 상기 CD19 항원으로의 HD37의 결합의 50% 이상을 차단하는, 상기 제1 항원 결합 폴리펩티드 작제물;
    제2 VL, 제2 scFv 링커, 및 제2 VH를 포함하는 제2 scFv를 포함하는 제2 항원 결합 폴리펩티드 작제물로서, 상기 제2 scFv은 CD3 항원의 엡실론 하부단위에 1가로, 그리고 특이적으로 결합하고, 상기 제2 scFv는 상기 OKT3 scFv, 변형된 OKT3 scFv, OKT3 차단 항체 scFv, 및 변형된 OKT3 차단 항체 scFv로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 상기 OKT3 차단 항체는 상기 CD3 항원의 엡실론 하부단위로의 OKT3의 결합의 50% 이상을 차단하는, 상기 제2 항원 결합 폴리펩티드 작제물;
    이량체화된 CH3 도메인을 형성할 수 있는 변형된 CH3 서열을 각각 포함하는, 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드를 포함하는, 이종이량체 Fc로서, 각각의 변형된 CH3 서열은 이종이량체 Fc의 형성을 촉진하는 비대칭 아미노산 변형을 포함하고, 상기 이량체화된 CH3 도메인은 약 68°C 이상의 용융 온도(Tm)를 갖고, 상기 제1 Fc 폴리펩티드는 제1 힌지 링커와 함께 상기 제1 항원 결합 폴리펩티드 작제물에 연결되고, 상기 제2 Fc 폴리펩티드는 제2 힌지 링커와 함께 상기 제2 항원 결합 폴리펩티드 작제물에 연결되는, 상기 이종이량체 Fc를 포함하는, 항원 결합 작제물.
  2. 제1항에 있어서, v12043, v10149, 또는 v1661로 이루어진, 항원 결합 작제물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 scFv는 하기로부터 선택된 CDR 서열 세트와 100% 상동한 CDR 서열을 포함하는, 항원 결합 작제물:
    a) L1: QSVDYDGDSYL (서열 번호:), L2: DAS (서열 번호:), L3: QQSTEDPWT (서열 번호:), H1: GYAFSSYW (서열 번호:), H2: IWPGDGDT (서열 번호:), H3: RETTTVGRYYYAMDY (서열 번호:);
    b) L1: QSVDYEGDSYL (서열 번호:), L2: DAS (서열 번호:), L3: QQSTEDPWT (서열 번호:), H1: GYAFSSYW (서열 번호:), H2: IWPGDGDT (서열 번호:), H3: RETTTVGRYYYAMDY (서열 번호:);
    c) L1: QSVDYSGDSYL (서열 번호:), L2: DAS (서열 번호:), L3: QQSTEDPWT (서열 번호:), H1: GYAFSSYW (서열 번호:), H2: IWPGDGDT (서열 번호:), H3: RETTTVGRYYYAMDY (서열 번호:)
    d) L1: KASQSVDYDGDSYL (서열 번호:), L2: DASNLVS (서열 번호:), L3: QQSTEDPWT (서열 번호:), H1: GYAFSSYWMN (서열 번호:), H2: QIWPGDGDTN (서열 번호:), H3: RETTTVGRYYYAMDY (서열 번호:)
    e) L1: RASQSVDYEGDSYL (서열 번호:), L2: DASNLVS (서열 번호:), L3: QQSTEDPWT (서열 번호:), H1: GYAFSSYWMN (서열 번호:), H2: QIWPGDGDTN (서열 번호:), H3: RETTTVGRYYYAMDY (서열 번호:) 및
    f) L1: RASQSVDYSGDSYL (서열 번호:), L2: DASNLVS (서열 번호:), L3: QQSTEDPWT (서열 번호:), H1: GYAFSSYWMN (서열 번호:), H2: QIWPGDGDTN (서열 번호:), H3: RETTTVGRYYYAMDY (서열 번호:).
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 scFv는 제3항의 CDR 서열 세트와 95% 상동한 CDR 서열을 포함하는, 항원 결합 작제물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 VH 폴리펩티드 서열은 야생형 HD37 VH 폴리펩티드 서열, hVH2 폴리펩티드 서열, 및 hVH3 폴리펩티드 서열로부터 선택되고, 상기 제1 VL 폴리펩티드 서열은 야생형 HD37 VL 폴리펩티드 서열, 및 hVL2 폴리펩티드 서열로부터 선택되는, 항원 결합 작제물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1 VH 폴리펩티드 서열은 야생형 HD37 VH 폴리펩티드 서열, hVH2 폴리펩티드 서열, 및 hVH3 폴리펩티드 서열과 95% 상동하고, 상기 제1 VL 폴리펩티드 서열은 야생형 HD37 VL 폴리펩티드 서열, 또는 hVL2 폴리펩티드 서열과 95% 상동한, 항원 결합 작제물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 HD37 차단 항체는 4G7, B4, B3, HD237, 및 Mor-208으로부터 선택되는, 항원 결합 작제물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제2 scFv는 하기로부터 선택된 CDR 세트를 포함하는, 항원 결합 작제물:
    a) L1: SSVSY (서열 번호:), L2: DTS (서열 번호:), L3: QQWSSNP (서열 번호:), H1: GYTFTRYT (서열 번호:), H2: INPSRGYT (서열 번호:), H3: ARYYDDHYCLDY (서열 번호:) 및
    b) L1: SSVSY (서열 번호:), L2: DTS (서열 번호:), L3: QQWSSNP (서열 번호:), H1: GYTFTRYT (서열 번호:), H2: INPSRGYT (서열 번호:), H3: ARYYDDHYSLDY (서열 번호:)
  9. 제1항에 있어서, 상기 제2 scFv는 제8항의 CDR 서열 세트와 적어도 95% 상동한 CDR 세트를 포함하는, 항원 결합 작제물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제2 VH 폴리펩티드 서열은 야생형 OKT3 VH 폴리펩티드 서열, 또는 야생형 OKT3 VH 폴리펩티드 서열과 95% 상동한 폴리펩티드 서열이고, 상기 제2 VL 폴리펩티드 서열은 야생형 OKT3 VL 폴리펩티드 서열, 또는 야생형 OKT3 VL 폴리펩티드 서열과 95% 상동한 폴리펩티드 서열인, 항원 결합 작제물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 OKT3 차단 항체는 테플리주맙(Teplizumab) ™, UCHT1, 및 비실리주맙으로부터 선택되는, 항원 결합 작제물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 제2 scFv는 상기 OKT3 CD3 에피토프에 결합하는, 항원 결합 작제물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VL, 제1 scFv 링커 폴리펩티드 서열 및 제1 VH 폴리펩티드 서열은 VL-링커-VH로서 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되는, 항원 결합 작제물.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 VL, 제1 scFv 링커 폴리펩티드 서열 및 제1 VH 폴리펩티드 서열은 VH-링커-VL로서 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되는, 항원 결합 작제물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 VL, 제2 scFv 링커 폴리펩티드 서열 및 제2 VH 폴리펩티드 서열은 VL-링커-VH로서 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되는, 항원 결합 작제물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 VL, 제2 scFv 링커 폴리펩티드 서열 및 제2 VH 폴리펩티드 서열은 VH-링커-VL로서 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되는, 항원 결합 작제물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, scFv 중 하나 또는 둘 모두가 VL 및 VH 폴리펩티드 서열 사이의 이황화 결합을 포함하는, 항원 결합 작제물.
  18. 제1항 및 제3항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 scFv 링커는 표 B로부터 선택되는, 항원 결합 작제물.
  19. 제1항 및 제3항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 힌지 폴리펩티드 링커는 표 E로부터 선택되는, 항원 결합 작제물.
  20. 제1항에 있어서, 상기 제1 VL, scFv 링커 및 VH 폴리펩티드 서열은 상기 제1 VL 및 VH 폴리펩티드 서열 사이에서의 이황화(disulphide) 결합을 포함하는 VL-링커-VH로서 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되고, 상기 제2 VL, scFv 링커 및 VH 폴리펩티드 서열은 상기 제2 VL 및 VH 폴리펩티드 서열 사이에서의 이황화(disulphide) 결합을 포함하는 VH-링커-VL로서 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되는, 항원 결합 작제물.
  21. 제1항에 있어서, 상기 제1 VL, scFv 링커 및 VH 폴리펩티드 서열은 상기 VL 및 VH 폴리펩티드 서열 사이에서의 이황화(disulphide) 결합을 포함하는 VL-링커-VH로서 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되고, 상기 제2 VL, scFv 링커 및 VH 폴리펩티드 서열은 상기 VL 및 VH 폴리펩티드 서열 사이에서의 이황화(disulphide) 결합 및 VL-링커-VH로서 N-말단으로부터 C-말단까지 배열되는, 항원 결합 작제물.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 이종이량체 Fc는 FcγR 또는 보체에 결합하는 이종이량체 Fc의 능력을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 적어도 하나의 CH2 도메인을 포함하는, 항원 결합 작제물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CD19에 대한 상기 제1 scFv의 결합 친화도는 약 0.1 nM 내지 약 5 nM이고, 상기 CD3의 엡실론 하부단위에 대한 상기 제2 scFv의 결합 친화도는 약 1 nM 내지 약 100 nM인, 항원 결합 작제물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종이량체 Fc는 하기인, 항원 결합 작제물:
    a. 인간 Fc임; 및/또는
    b. 인간 IgG1 Fc임; 및/또는
    c. 표 A에 기재된 상기 CH3 도메인 중 적어도 하나에서의 하나 이상의 변형을 포함함; 및/또는
    d. 적어도 하나의 CH2 도메인을 추가로 포함함; 및/또는
    e.하나 이상의 변형을 포함하는 적어도 하나의 CH2 도메인을 추가로 포함함; 및/또는
    f. 표 B에 기술된 상기 CH2 도메인 중 적어도 하나에서의 하나 이상의 변형을 포함하는 적어도 하나의 CH2 도메인을 추가로 포함함; 및/또는
    g. 표 C에 기술된 FcγR 또는 보체에 결합하는 이종이량체 Fc의 능력을 감소시키기 위한 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 적어도 하나의 CH2 도메인을 추가로 포함함; 및/또는
    h. 아미노산 치환 N297A 또는 L234A_L235A, 또는 L234A_L235A_D265S를 포함하는 적어도 하나의 CH2 도메인을 추가로 포함함.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이량체화된 CH3 도메인은 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77.5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 또는 85°C 또는 그 이상의 용융 온도 (Tm)를 갖는, 항원 결합 작제물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 작제물은 하기인, 항원 결합 작제물:
    a) FACS 및/또는 현미경관찰로 검정 시, CD19+ 라지(Raji) B 세포 및 주르카트 (Jurkat) T 세포 사이의 시냅스 형성 및 가교가 가능함; 및/또는
    b) 인간 전혈 또는 PBMC 내의 CD19-발현 B 세포의 T 세포 지시된 사멸을 매개함; 및/또는
    c) v875 또는 v1661와 비교한 향상된 생체물리학적 특성을 나타냄; 및/또는
    d) v875 및/또는 v1661과 비교하여, 유사한 조건 하에서 발현 및 정제 시, 개선된 단백질 발현 및 산출량(yield)을 나타냄 (예를 들어, SEC (크기 배제 크로마토그래피) 후 4 내지 10 mg/L 초과에서 발현됨); 및/또는
    e) 이종이량체 순도, 예를 들면, 95% 초과를 나타냄.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 작제물은 약물에 콘주게이트되는, 항원 결합 작제물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항원 결합 작제물 및 약제학적 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 상기 담체는 완충제, 항산화제, 저분자량 분자, 약물, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 지질, 킬레이트제, 안정제 또는 부형제를 포함하는, 약제학적 조성물.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항원 결합 작제물을 포함하는 약제에서 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  31. 암치료에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항원 결합 작제물을 포함하는, 약제학적 조성물.
  32. 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서,
    상기 대상체에게 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항원 결합 작제물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 암은 림프종 또는 백혈병 또는 B 세포 악성 종양, 또는 CD19를 발현하는 암, 또는 비-호지킨성 림프종 (NHL) 또는 외투 세포(mantle cell) 림프종 (MCL) 또는 급성 림프구성 백혈병 (ALL) 또는 만성 림프구성 백혈병 (CLL) 또는 리툭시맙- 또는 CHOP (사이톡산(cytoxan)TM/아드리아마이신(Adriamycin)TM빈크리스틴/프레드시논 요법) -내성 B 세포 암인, 방법.
  35. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항원 결합 작제물의 제조방법으로서,
    상기 항원 결합 작제물을 발현시키기에 적합한 조건 하에서 숙주 세포를 배양시키는 단계; 및
    상기 항원 결합 작제물을 정제하는 단계를 포함하고,
    상기 숙주 세포는 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항원 결합 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항원 결합 작제물의 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 단리된 폴리뉴클레오티드의 세트.
  37. 제36항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트는 cDNA인, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 단리된 폴리뉴클레오티드의 세트.
  38. 플라스미드, 바이러스 벡터, 비-에피솜(non-episomal) 포유동물 벡터, 발현 벡터 및 재조합 발현 벡터로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된, 제36항의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트 중 하나 이상을 포함하는, 벡터 또는 벡터의 세트.
  39. 하이브리도마(hybridoma), 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포 또는 HEK293 세포로부터 임의로 선택된, 제36항의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 세트, 또는 제38항의 벡터 또는 벡터의 세트를 포함하는, 단리된 세포.
  40. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항의 항원 결합 작제물 및 사용을 위한 설명서를 포함하는, 키트.
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