TW202003009A - 組合物用於製備治療發育性視網膜血管疾病的藥物之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種組合物用於製備治療發育性視網膜血管疾病的藥物之用途，其中該組合物包含一有效劑量的金釵石斛(Dendrobium nobile Lindley)。

Description

組合物用於製備治療發育性視網膜血管疾病的藥物之用途

本發明提供一種組合物用於製備治療發育性視網膜血管疾病的藥物之用途，其特徵在於該組合物包含一金釵石斛，其能有效改善視網膜血管發育異常，進而避免因視網膜血管發育異常所造成的缺血性損傷。

諾里(Norrin)依賴性Wnt訊號路徑(Norrin-dependent Wnt signaling pathway)似乎會介導血管生成(vasculogenesis)(早期視網膜血管發育)的缺陷。諾里/捲曲受體-4(Frizzled-4)訊號在血管生成上扮演重要的角色，如諾里疾病(Norrie disease，ND)和家族性滲出性玻璃體視網膜病變(familial exudative vitreoretinopathy，FEVR)，最終可能會進展至視網膜缺血和新血管生成(neovascularization，NV)或是血管新生(angiogenesis)。除了ND和FEVR之外，還有其他發育性視網膜血管疾病，即柯氏症(Coats disease)和永存原始玻璃體增生症(persistent hyperplastic primary vitreous，PHPV)，其有共同類似的眼底圖片，即周邊視網膜無血管形成(peripheral retinal avascularization)和視網膜下滲出(subretinal exudation)。如上所述，這些玻璃體視網膜病變(vitreoretinopathy)也可能導致視網膜缺血而對患者 的視力產生類似的威脅，儘管它們並不像其他視網膜缺血性疾病(即中央視網膜動脈阻塞(central retinal artery occlusion，CRAO)、分支視網膜動脈阻塞(branch retinal artery occlusion，BRAO)、中央視網膜靜脈阻塞(central retinal vein occlusion，CRVO)、分支視網膜靜脈阻塞(branch retinal vein occlusion，BRVO)、青光眼、糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)或新生血管型老年性黃斑部病變(neovascular age-related macular degeneration，nvAMD))那樣常見。如先前文獻報導持續缺氧被推測為這些發育性視網膜血管疾病(如ND)的發展的主要動力之一。

位於內層視網膜的視網膜神經節細胞(Retinal ganglion cells，RGCs)和無軸突細胞(amacrine cells)是易受到缺血/再灌注(ischemia/reperfusion(I/R))的傷害。再者，在缺血後，繆氏細胞(Müller cells)中的波形蛋白(vimentin)和膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)之免疫標記會提高；而這與RGC數量減少有關。已知在缺血視網膜上，血管內皮生長因子(vascular endothelium growth factor，VEGF)、缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2，PKM2)和視網膜母細胞瘤結合蛋白2(retinoblastoma-binding protein 2，RBP2)會同時發生過度表現之現象，且進一步異常地新血管形成(NV)(後期新血管形成)可能導致因水腫和出血所引起的視覺功能障礙。而在諾里蛋白耗盡的視網膜也可以觀察到HIF-1α和VEGF的上調。除VEGF外，胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)被報導出在確認的視網膜/脈絡膜的血管系統疾病中會增加；因此，該因子的下調可 作為視覺功能的結果和治療之生物標誌。

金釵石斛(DNL)是蘭科(Orchidae)植物的家族成員之一，其屬於改善視力的草藥。DNL也被用作補品，並發現具有解熱/抗發炎的功效以及抗血管新生(anti-angiogenic)(如抗VEGF/HIF-1α)的性質。金釵石斛(DNL)具有多種與不同作用機制有關的活性成分，其包括生物鹼(alkaloids)(透過抑制p-p38 MAPK和NF-κB途徑使TNFR1過量表現)、黃酮醇配醣體(flavonol glycosides)(α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)抑制劑)、SG-168、多醣(polysaccharides)(抗氧化)。此外，抗血管新生或抗氧化的石斛酚(moscatilin)是金釵石斛的活性成分(聯芐)，且可能具有與上述成分不同的已知(抗VEGF/HIF-1α、．OH自由基清除劑、抗發炎和抗細胞凋亡)和未知的作用機制。

本發明藉由視網膜電圖(ERG)、免疫組織化學(視網膜神經節細胞、無軸突神經細胞、繆氏細胞)、組織病理學(視網膜厚度)、細胞存活率和蛋白質測量分析(PLGF、HIF-1α、VEGF-A、PKM2、RBP2和NDP)證實在視網膜或視網膜細胞中發生的各種缺血/缺氧(OGD)所造成的改變。本發明發現HIF-1α，VEGF，PKM2和RBP2的蛋白表現量在缺血性視網膜中顯著上調，但藉由施予金釵石斛後會顯著降低這些蛋白的上調現象。當預先施予VEGF捕獲(trap)/抗PLGF的采視明(Eylea)於缺血性視網膜時，缺血所誘發的PLGF上升也顯著減弱；而1.0g/Kg/天的DNL也有此功效。故其新穎性和臨床意義的在於DNL可能具有抗血管新生(angiogenesis)/ VEGF(PLGF)的捕獲效應。這與先前報導指出DNL的聯芐成分石斛酚(moscatilin)是透過抑制HIF-1α和VEGF而成為抗血管生成劑的結論並不一致。

缺血可能與發育性視網膜血管疾病(如FEVR或ND)有密切相關。而抗VEGF抗體雖能有效清除眼部出血和黃斑水腫；但令人失望的是，一些患者的視覺效果不佳。而諾里(Norrin)的Wnt訊號路徑在視網膜血管的早期正常發育和確定的發育性視網膜血管疾病的晚期進展都扮演著重要角色。而後者情況可能會進一步加重缺血/缺氧並形成新血管生成(NV)。一致的是，諾里疾病蛋白(Norrie disease protein，NDP)似乎透過調節諾里(Norrin)依賴性Wnt訊號路徑來保護眼睛免於異常的血管新生和視網膜疾病。此外，過量表現的NDP會透過活化諾里(norrin)依賴性Wnt訊號路徑來保護光感受器和RGC免於細胞死亡。本發明亦證實缺氧(OGD)會導致NDP表現量和細胞存活率顯著降低。但金釵石斛的聯芐成分的石斛酚(0.1μM)能夠顯著緩解缺氧/類缺血(OGD)所造成的損傷。故本發明證實金釵石斛和/或石斛酚能夠活化NDP依賴性Wnt訊號路徑，從而提供神經保護作用，並透過抑制VEGF-A/PLGF和上調NDP來抵抗視網膜缺血的症狀。

此外，在缺血性損傷和給予媒劑(Vehicle)後，視網膜內層厚度、RGC數量無軸突神經細胞上的ChAT免疫反應性顯著及明顯地下降。重要的是，本發明證實，在給予高劑量金釵石斛前及/或後(1g/kg/天)，這些缺血誘發的變化顯著及明顯鈍化。此外，在媒劑(Vehicle)給藥前/給藥 後的缺血性視網膜中，波形蛋白/GFAP免疫標記過量表現伴隨著b波下降。但本發明的結果顯示這些缺血性改變在1g/kg/天的金釵石斛給藥前/給藥後明顯及顯著地抵消，其在臨床上具有重要性。

本發明的結果顯示缺血/缺氧(缺血模擬OGD)顯著及明顯影響視網膜電生理、形態計量學、免疫組織化學和視網膜分子生物學/細胞存活率。臨床上重要的是，所有這些因缺血/OGD所發生的變化可透過用金釵石斛或其聯芐成分石斛酚進行預處理和/或後處理而有效減弱。故本發明認為這些保護性機制係透過抑制HIF-1α、VEGF-A、PKM2、RBP2以及最重要的是藉由PLGF的上調以及上調NDP的表現量來發揮作用(如圖9所示)。

總之，金釵石斛及/或石斛酚能夠保護或防止確定的視網膜缺血/類缺血的改變，並且藉由抑制PLGF和上調NDP來實現。金釵石斛(及/或石斛酚)的治療是能提供有用的方式，其允許預防及/或管理可能由於持續缺血/缺氧而發展的發育性視網膜血管疾病的患者。

本發明藉由視網膜電圖(繆氏細胞(müller cells)和雙極細胞上的b波變化)、免疫組織化學(螢光免疫標記的視網膜神經節細胞(RGC)、膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)免疫呈陽性之無軸突神經細胞、波形蛋白(vimentin)/膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)所染色的繆氏細胞)、組織病理學(視網膜厚度測量)、及/或西方墨點法(HIF-1α、VEGF、PKM2和RBP2)以觀察大鼠視網膜中各種缺血性的改變。重要的是，在缺血再灌注(I/R)前/後施予金釵石斛(DNL)可顯著調節所有這些被定義的缺血性相關特徵。 最重要的是，在視網膜缺血/類缺血(OGD)的狀況下，胎盤生長因子(PLGF)的蛋白質濃度上調(圖8)，且諾里疾病蛋白(NDP)的蛋白質濃度下調(圖2)，但以金釵石斛(DNL)/石斛酚(moscatilin)治療處理後會抵消上述這些改變。在臨床意義上，DNL可以藉由下調PLGF和上調NDP來預防或保護所定義的視網膜缺血/類缺血的改變。故金釵石斛/石斛酚可透過下調胎盤生長因子的表現量及上調諾里疾病蛋白的濃度來提供另一預防或管理患有持續缺氧/缺血相關的發育性血管疾病(如諾里疾病)的病程之病患的替代方法。

本文中的用語「一」或「一種」係用以敘述本發明之元件及成分。此術語僅為了敘述方便及給予本發明之基本觀念。此敘述應被理解為包括一種或至少一種，且除非明顯地另有所指，表示單數時亦包括複數。於申請專利範圍中和”包含”一詞一起使用時，該用語「一」可意謂一個或超過一個。

本文中的用語「或」其意同「及/或」。

本發明提供一種組合物用於製備治療發育性視網膜血管疾病(developmental retinal vascular disorder)的藥物之用途，其中該組合物包含一有效劑量的金釵石斛(Dendrobium nobile Lindley，DNL)。

於一具體實施例中，該金釵石斛的成分包含聯芐(bibenzyls)、生物鹼(alkaloids)、糖苷(glycosides)和多醣(polysaccharides)。於一較佳具體實施例中，該金釵石斛包含一聯芐化合物(bibenzyl compound)。於一更佳具體實施例中，該聯芐化合物包含一石斛酚 (moscatilin)。

於一具體實施例中，該石斛酚(moscatilin)的結構式為：

於一具體實施例中，其中該治療發育性視網膜血管疾病係藉由改善視網膜血管發育的缺陷所達成。視網膜血管發育分成兩個部分：(1)血管生成(vasculogenesis)：起始於懷孕的第18週左右，且在懷孕的第38-40週完成。因血管會組織成血管叢(vascular plexuses)的網路，其係藉由血管生成(vasculogenesis)和血管新生(angiogenesis)的組合而形成；血管生成是由內皮前驅細胞(endothelial precursor cell)，其聚集成索然後形成內腔，重新(de novo)形成的血管發育過程；及(2)血管新生(angiogenesis)：血管係藉由從已存在的血管發芽而形成。一般認為血管生成形成發育中的視網膜的大部分主要視網膜血管叢，而血管新生形成中央窩(fovea)周圍以及更深和周邊視網膜上的剩餘毛細血管層。於一較佳具體實施例中，其中該金釵石斛或石斛酚藉由改善血管生成(vasculogenesis)的缺陷以治療該發育性視網膜血管疾病。

如本文所使用之術語「治療」包括減輕發育性視網膜血管疾病之嚴重程度，延遲發育性視網膜血管疾病之發作，使發育性視網膜血管疾 病消退，緩解由發育性視網膜血管疾病引起之病狀或停止由發育性視網膜血管疾病產生之症狀。術語「治療」包括但不限於預防性及/或治療性治療。

於另一具體實施例中，該發育性視網膜血管疾病包含永存原始玻璃體增生症(persistent hyperplastic primary vitreous，PHPV)、諾里疾病(Norrie disease)、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(familial exudative vitreoretinopathy，FEVR)及柯氏症(Coats disease)。於一較佳具體實施例中，該發育性視網膜血管疾病包含諾里疾病和家族性滲出性玻璃體視網膜病變。於一更佳具體實施例中，該發育性視網膜血管疾病為諾里疾病。

由於該發育性視網膜血管疾病是一種視網膜血管發育異常的疾病，故會導致視網膜缺血和患者的視力受損。於另一具體實施例中，該發育性視網膜血管疾病的症狀包含視網膜血管發育異常、視網膜缺血和視力受損。

由於該發育性視網膜血管疾病會導致視網膜缺血，而視網膜缺血會造成視網膜缺血性損傷。於一具體實施例中，該視網膜缺血性損傷包含視網膜的厚度變薄、視網膜神經節細胞(RGC)的數量減少、以及相關因子(如缺氧誘導因子(HIF)、視網膜母細胞瘤結合蛋白2(RBP2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、血管內皮生長因子(VEGF))的表現量上升。於另一具體實施例中，該金釵石斛或該石斛酚治療該發育性視網膜血管疾病所造成的視網膜缺血性損傷。

該視網膜缺血性損傷會使視網膜的厚度變薄，故施予該金釵石斛或該石斛酚能避免視網膜厚度變薄的現象發生，即該金釵石斛或該石 斛酚能治療或增加視網膜的厚度。於一具體實施例中，該金釵石斛或該石斛酚治療該發育性視網膜血管疾病所造成的視網膜厚度變薄的情況。

該發育性視網膜血管疾病會導致視網膜缺血性損傷，進而造成視網膜神經節細胞(RGC)的數量減少，而施予該金釵石斛或石斛酚後能增加視網膜神經節細胞(RGC)的數量或保護視網膜神經節細胞免於細胞死亡，以治療該發育性視網膜血管疾病中視網膜的缺血性損傷。於一具體實施例中，該金釵石斛或該石斛酚增加視網膜神經節細胞(RGC)的數量。

此外，該發育性視網膜血管疾病導致視網膜缺血性損傷，進而促使視網膜中的缺氧誘導因子(HIF)、視網膜母細胞瘤結合蛋白2(RBP2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、血管內皮生長因子(VEGF)的表現量上升，而施予該金釵石斛或該石斛酚後能降低上述因子的表現量，以治療該發育性視網膜血管疾病上的視網膜缺血性損傷。於一具體實施例中，該金釵石斛或該石斛酚降低缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、視網膜母細胞瘤結合蛋白2(RBP2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)和血管內皮生長因子(VEGF)的表現量。

該發育性視網膜血管疾病會引起血管新生(angiogenesis)。故於另一具體實施例中，該金釵石斛或該石斛酚能捕獲血管內皮生長因子(VEGF)以抗血管新生(anti-angiogenesis)。

本文中「表現量」一詞包含但不限於DNA、RNA或蛋白質的表現量。

該發育性視網膜血管疾病所造成的視網膜缺血性損傷會上調胎盤生長因子(PLGF)的表現量以及下調諾里疾病蛋白(NDP)的表現量。而施予該金釵石斛或該石斛酚後能下調胎盤生長因子(PLGF)的表現量以及上調諾里疾病蛋白(NDP)的表現量，以治療該發育性視網膜血管疾病中因缺血/缺氧所造成的視網膜損傷。因諾里疾病蛋白(NDP)能透過調節諾里(norrin)依賴性Wnt訊號路徑來保護眼睛免於血管發育異常和其所導致的視網膜缺血性損傷。於一具體實施例中，該金釵石斛或石斛酚下調胎盤生長因子(PLGF)的表現量以及上調諾里疾病蛋白(NDP)的表現量。於一較佳具體實施例中，該金釵石斛或石斛酚上調諾里疾病蛋白(NDP)的表現量以調節諾里(Norrin)依賴性Wnt訊號路徑來改善視網膜血管發育異常。於一更佳具體實施例中，該金釵石斛或石斛酚上調諾里疾病蛋白(NDP)的表現量以調節諾里(Norrin)依賴性Wnt訊號路徑來改善視網膜缺血。

本文中「有效劑量」一詞為一治療劑量可在特定條件下可預防、降低、阻止或逆轉一個體的一症狀的發展，或部分、完全舒緩該個體開始接受治療時於特別情況下已存在的症狀。

於一具體實施例中，該金釵石斛的有效劑量範圍為0.01克/公斤體重至100克/公斤體重。於一較佳具體實施例中，該金釵石斛的有效劑量範圍為0.1克/公斤體重至50克/公斤體重。於一更佳具體實施例中，該金釵石斛的有效劑量範圍為0.5克/公斤體重至10克/公斤體重。於另一佳具體實施例中，該金釵石斛的有效劑量範圍為0.1克/公斤體重至5克/公斤體重。

於另一具體實施例中，該石斛酚的有效劑量範圍為0.01克/公斤體重至100克/公斤體重。於一較佳具體實施例中，該石斛酚的有效劑量範圍為0.1克/公斤體重至50克/公斤體重。於一更佳具體實施例中，該石斛酚的有效劑量範圍為0.5克/公斤體重至10克/公斤體重。於另一佳具體實施例中，該石斛酚的有效劑量範圍為0.1克/公斤體重至5克/公斤體重。

於一具體實施例中，該有效劑量每天以單次施予。於一較佳具體實施例中，該有效劑量每天以兩次或多次施予。

該藥物可在例行時間表下投予。於本文中使用之例行時間表係指預定之所指定時期。例行時間表可涵蓋一些時期，其係為相同，或其在長度上不同，只要時間表為預定即可。例如，例行時間表可涉及一天一次投藥，每天、每兩天、每三天、每四天、每五天、每六天、每週基礎、每月基礎或介於其間之任何設定天數或週數。或者，預定例行時間表可涉及以每日一次為基礎投藥，歷經第一週，接著以每日為基礎，歷經數個月等。在其他具體實施例中，本發明係提供藥物可以經口方式服用，且其時機係依賴或不依賴食物攝取而定。因此，例如藥物可於每個早晨及/或每個夜晚服用，而不管病患何時已進食或將進食。

本發明的藥物可進一步包含一醫藥上可接受的載體，在本發明相關領域下習知的治療方式中可透過許多不同途徑施用於一個體。在一些實施例中，該組合物(包含金釵石斛或石斛酚)及醫藥上可接受的載體會經由外用、靜脈、肌肉、皮下、局部、口服或吸入施用。該藥物將會透過消化及循環系統被傳遞到目標處。於一較佳具體實施例中，該藥物之給藥路徑 為口服給予。

於另一具體實施例中，該個體為動物，較佳為哺乳類，更佳為人類。

如本文所用術語「醫藥上可接受的載體」為透過特定組合施用及特定方法施用組合物所決定。如本文所用「載體」一詞包含但不局限任何及所有溶劑、分散介質、載具、包衣、稀釋劑、抗細菌和抗真菌劑等滲透和吸收延遲劑、緩衝劑、載體溶液、懸浮液、膠體等。用於藥物活性物質的這些介質和試劑在本領域中是公知的。除非任何常規介質或試劑與活性成分不相容，其用於治療的組合就需要被考慮。補充的活性成分也可摻入組合物中。術語「醫藥上可接受的」係指分子實體和組合物施用於受試者時不產生過敏或類似的不良反應。以蛋白質作為活性物質的水組合物製備在本領域中是習知的。通常，此組合物被製備為液體溶液、錠劑、膠囊或懸浮液注射劑；亦可製備為可用於注射劑之可溶解或懸浮液之固體形式。

該組合物(包含金釵石斛或石斛酚)及醫藥上可接受的載體的配製可能經由無菌的水溶液或分散體、水懸浮液、油乳化液、油包乳化液中的水、特定點的乳化液、長停留乳化液、黏性乳化液、微乳液、奈米乳液、微脂粒、微粒、微球、奈米球、奈米顆粒、微汞及數種可持續釋放的天然或合成聚合物。醫藥上可接受的載體及該金釵石斛(或石斛酚)也可配置成氣霧劑、片劑、丸劑、膠囊、無菌粉末、栓劑、洗劑、霜劑、軟膏劑、糊劑、凝膠、水凝膠，或其他可用於組合物輸送的製劑。

該組合物被製備成藥物時，每一單位藥物所含的金釵石斛或 石斛酚的單位劑量為0.5-50克(g)，較佳為0.1-10克(g)，更佳為0.01-1克(g)。

是以，本發明所提供的組合物(包含金釵石斛(DNL)或石斛酚)能治療發育性視網膜血管疾病，其包含但不限於修復/治療視網膜血管發育異常或血管發育的缺陷；此外，因視網膜血管發育異常，會造成視網膜缺血，故本發明的組合物能進一步改善缺血/缺氧對視網膜所造成的不良影響和損傷，即保護視網膜免於缺血/缺氧的損傷。

圖1中(a)至(e)為以光學顯微鏡觀察石斛酚(moscatilin，Mos)對氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation，OGD)處理之視網膜神經節細胞-5(retinal ganglion cell-5，RGC-5)的影響之細胞存活率研究。與正常對照組(細胞培養於DMEM培養基中且預先施予DMSO，DMSO+DMEM)相比，在預先施予二甲亞碸(DMSO)(媒劑(Vehicle))並接著OGD(DMSO+OGD)後，細胞數量較少且有一些會變形(如箭號所示)。藉由在OGD處理前1小時預先施予石斛酚(Pre-OGD Mos 0.1μM)會緩解OGD所誘發的改變。(f)為使用MTT分析法定量分析Mos對OGD處理的細胞之影響。**：正常對照組(DMSO+DMEM)和DMSO+OGD組之間具有顯著差異(P<0.01)。†：DMSO+OGD組和Pre-OGD Mos 0.1μM組之間具有顯著差異(P=0.04)。實驗結果以平均值±標準誤差(SEM)表示(數量為6)。比例尺為50μm。DMSO+DMEM：含有DMSO之DMEM培養基；DMSO+OGD：OGD處理前1小時施予DMSO，再接著OGD；Pre-OGD Mos 0.1μM：OGD處理前1小時施予0.1μM石斛酚(Mos)，再接著OGD；During OGD Mos 0.1μM：OGD期間施予0.1μM石斛酚(Mos)；及Post-OGD Mos 0.1μM：OGD處理後1小時施予0.1μM石斛酚(Mos)。N：數量。

圖2為石斛酚(moscatilin，Mos)在相對於β-肌動蛋白(β-actin)的諾里疾病蛋白(NDP)之蛋白質表現的影響。上圖：一系列免疫墨點的代表圖；下圖：柱狀圖。在正常對照組(DMSO+DMEM：視網膜神經節細胞-5(RGC-5)細胞培養在DMEM培養基中，且預先施予二甲亞碸(DMSO))中NDP對β-actin蛋白的表現量調整為100%。**：DMSO+DMEM組和DMSO+OGD組之間具有顯著差異(P<0.01)。†：DMSO+OGD組和Pre-OGD Mos 0.1μM組之間具有顯著差異(P=0.048)。實驗結果以平均值±標準誤差(SEM)表示(數量為3)。OGD：氧糖剝奪；RGC：視網膜神經節細胞。DMSO+DMEM：含有DMSO之DMEM培養基；DMSO+OGD：OGD處理前1小時施予DMSO，再接著OGD；Pre-OGD Mos 0.1μM：OGD處理前1小時施予0.1μM石斛酚(Mos)，再接著OGD；During OGD Mos 0.1μM：OGD期間施予0.1μM石斛酚(Mos)；及Post-OGD Mos 0.1μM：OGD處理後1小時施予0.1μM石斛酚(Mos)。

圖3為視網膜電圖(electroretinogram，ERG)分析。(a)和(b)：與對照組(sham)的視網膜相比，在高眼壓(high intraocular pressure，HIOP)誘發的視網膜缺血再灌注(ischemia plus reperfusion，I/R)前施予媒劑(vehicle)(a)或後施予媒劑(b)後，ERG的b波振幅急劇下降。而這種降低可藉由預先施予金釵石斛(DNL)(DNL1.0+I/R；DNL0.5+I/R，a) 或後施予金釵石斛(I/R+DNL1.0，b)會產生劑量依賴性地抵消。(c)：與對照組(sham)相比，在視網膜經缺血再灌注(I/R)後，Vehicle+I/R組中ERG的b波比率顯著地降低(**；P<0.01)。預先施予高劑量(DNL1.0+I/R)和低劑量(DNL0.5+I/R)的DNL呈現劑量反應且顯著地抵銷這種缺血性誘發的降低(††；P<0.01)。(d)：經I/R之視網膜並缺血後施予媒劑之後的第1、3、5或7天，ERG的b波振幅顯著降低(**；P<0.01)。藉由後施予DNL(I/R+DNL1.0)可顯著緩解ERG的b波振幅上的降低(†/††；P<0.05/0.01)。實驗結果以平均值±標準誤差(SEM)表示；實驗數量為10~12。Sham(對照組)：假程序手術實驗(數量為12)；Vehicle+I/R：視網膜缺血再灌注(I/R)前施予媒劑(vehicle)，再接著I/R手術(數量為12)；DNL0.5+I/R：視網膜缺血再灌注(I/R)前施予0.5g/kg/天的DNL，再接著I/R手術(數量為12)；DNL1.0+I/R：視網膜缺血再灌注(I/R)前施予1.0g/kg/天的DNL，再接著I/R手術(數量為12)；I/R+Vehicle D7：I/R手術後施予媒劑(vehicle)之後的第7天；I/R+DNL1.0 D7：I/R手術後施予1.0g/kg/天的DNL之後的第7天；I/R+Vehicle：I/R手術後施予媒劑(vehicle)(數量為10)；I/R+DNL1.0：I/R手術後施予1.0g/kg/天的DNL(數量為10)；Pre-ischemia：I/R手術前；Post-ischemia D1：I/R手術後的第1天；Post-ischemia D3：I/R手術後的第3天；Post-ischemia D5：I/R手術後的第5天；Post-ischemia D7：I/R手術後的第7天。

圖4為以甲苯酚紫(cresyl violet)標記的整個或內層視網膜之厚度分析。(a)、(b)和(e)分別為接受假程序(Sham)(a)、經缺血再 灌注(I/R)並預先施予媒劑(vehicle)(b)或後施予媒劑(e)的視網膜。(c)、(d)和(f)分別為缺血加再灌注並預先施予0.5g/kg/天(c，DNL0.5+I/R)、1.0g/kg/天(d，DNL1.0+I/R)或後施予1.0g/kg/天(f，I/R+DNL1.0)的金釵石斛(DNL)之視網膜切片。(g)和(h)為對相同偏心率(eccentricity)的內層及整個視網膜切片的厚度進行形態學分析。實驗結果以平均值±SEM表示，實驗數量為10~12。**：與假程序之視網膜有顯著性差異(P<0.01)。†或††：與vehicle+I/R或I/R+vehicle相比有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。ONL：外核層(outer nuclear layer)；OPL：外叢狀層(outer plexiform layer)；INL：內核層(inner nuclear layer)；IPL：內叢狀層(inner plexiform layer)；GCL：神經節細胞層(ganglion cell layer)。比例尺為50μm。

圖5為螢光金(Fluorogold)標記染色。顯微鏡照片顯示經假程序(a，Sham)、缺血前施予媒劑再缺血再灌注(I/R)(b，Vehicle+I/R)或於缺血前/後施予1.0g/kg/天的金釵石斛(DNL)加缺血再灌注(c，DNL1.0+I/R；d，I/R+DNL1.0)之視網膜神經節細胞(retinal ganglion cell，RGC)的密度。(e)為RGC密度的定量分析，其數量如每條柱狀體所示，實驗結果以平均值±標準誤差(SEM)表示(數量為4)。**：與假程序的視網膜有顯著差異(P<0.01；Sham組對Vehicle+I/R組)；††或†：與Vehicle+I/R組有顯著差異(P<0.01或P<0.05；Vehicle+I/R組對DNL1.0+I/R組或I/R+DNL1.0組)。比例尺為50μm。

圖6為膽鹼乙醯轉移酶(Choline acetyltransferase，ChAT； 紅色)之免疫組織化學實驗。(a)為經假程序的視網膜(Sham)，細胞核以4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(4,6-diamidine-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI；藍色)進行複染。無軸突神經細胞體(amacrine cell bodies)(Sham；短箭號)係位於內核層(INL)和神經節細胞層(GCL)中，並且它們的神經突出(neuronal processes)(長箭號)在內叢狀層(IPL)中顯示雙帶狀的態樣。(b)和(e)分別為經缺血再灌注(I/R)及於缺血前/後施予媒劑(Vehicle+I/R或I/R+Vehicle)的視網膜；而且可觀察到IPL內的免疫反應性伴隨著無軸突神經細胞體的數量大幅減少而顯著降低。(c)、(d)和(f)分別為經缺血再灌注(I/R)及預先施予0.5g/kg/天(c，DNL0.5+I/R)或1.0g/kg/天(d，DNL1.0+I/R)的金釵石斛(DNL)、或經缺血再灌注(I/R)及後施予1.0g/kg/天(f，I/R+DNL1.0)的金釵石斛之視網膜切片。在這些組別中，當預先施予0.5和1.0g/Kg/天的金釵石斛於缺血性視網膜時，這些缺血誘導的變化明顯呈劑量依賴性形式來降低。而後施予1.0g/Kg/天的金釵石斛也明顯減輕這些缺血引起的變化。比例尺為50μm。

圖7為波形蛋白(vimentin)之免疫組織化學染色。(b)為在進行假程序(Sham)後，繆氏細胞(müller cells)細胞的末端在神經節細胞層(GCL)中可觀察到抗波形蛋白(綠色)免疫反應性(箭頭；在(c)和(f)亦可觀察到)；並且繆氏細胞的突出(processes)在內叢狀層(IPL)(箭號；在(c)和(f)亦可觀察到)、內核層(INL)和外核層(ONL)也被免疫染色出來。(c)和(f)分別為與假程序的視網膜相比，在缺血前/後施予媒劑(Vehicle+I/R或I/R+Vehicle)，視網膜上的抗波形蛋白免疫標記顯 著增強。(d)、(e)和(g)分別為藉由預先施予0.5g/kg/天(DNL0.5+I/R)或1g/kg/天的金釵石斛(DNL)(DNL1.0+I/R)、或後施予1g/kg/天(I/R+DNL1.0)的金釵石斛會使上述增強現象明顯被減弱。(h)至(n)為膠質原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)的免疫組織化學染色。在假程序(Sham，i)之後，繆氏細胞的末端在神經節細胞層(GCL)顯示GFAP免疫反應性(箭頭；在(j)和(m)亦可觀察到)，並且繆氏細胞的突出(processes)在內叢狀層(IPL)(箭號；在(j)和(m)亦可觀察到)、內核層(INL)和外核層(ONL)亦顯示GFAP免疫反應性。和經假程序的視網膜相比，在經缺血和預先/後施予媒劑(Vehicle+I/R，j；I/R+Vehicle，m)後，抗GFAP免疫標記增強。透過預先施予0.5g/kg/天(DNL0.5+I/R，k)或1g/kg/天(DNL1.0+I/R，l)的金釵石斛(DNL)，或後施予1g/kg/天(I/R+DNL1.0，n)的金釵石斛，會將上述增強程度減少。(a)和(h)為4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)(藍色)用於在假程序之視網膜中複染細胞核。比例尺為25μm。

圖8：(a1)以西方墨點法(western blotting)分析下顯示β-肌動蛋白(β-actin)、缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、血管內皮生長因子(VEGF)、丙酮酸激酶M2(PKM2)和視網膜母細胞瘤結合蛋白2(RBP2)的表現量。欄位1或2分別為經假程序之視網膜(Sham)或預先施予媒劑的缺血性視網膜(Vehicle+I/R)。欄位3顯示接受缺血且在缺血前預先施予1g/kg/天的金釵石斛(DNL)(DNL1.0+I/R)的視網膜。欄位4、5和6分別為接受缺血且在缺血前預先施予10μM/5μl JIB-04(RBP2抑制劑)、4μM/5μl紫草 素(shikonin)(PKM2抑制劑)和125μg/5μl癌思停(avastin)(抗VEGF)的視網膜。(a2)中每一條顯示RBP2、HIF-1α、PKM2和VEGF相對β-actin的比例。**：經假程序之視網膜(Sham)與預先施予媒劑的缺血性視網膜(Vehicle+I/R)之間有顯著差異(P<0.01)。†或††：Vehicle+I/R組與預先施予DNL1、JIB-04、紫草素或癌思停的缺血性視網膜之間有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。實驗結果以平均值±標準誤差(SEM)表示(數量為4至10)。(b)為酵素免疫吸附分析法(ELISA)的分析結果。測量不同組別(即假程序(Sham)、Vehicle+I/R、DNL1.0+I/R或Eylea+I/R)中視網膜內的胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)的濃度。**：假程序之視網膜和Vehicle+I/R組之間有顯著差異(P<0.01)。†或††：Vehicle+I/R組與DNL1.0+I/R組或Eylea+I/R組之間有顯著差異(P<0.05或P<0.01)。實驗結果以平均值±標準誤差(SEM)表示(數量為4)。Sham(對照組)：假程序手術實驗(數量為10)；Vehicle+I/R：視網膜缺血再灌注(I/R)前玻璃體內施予媒劑(vehicle)，再接著I/R手術(數量為10)；DNL1.0+I/R：視網膜缺血再灌注(I/R)前玻璃體內施予1.0g/kg/天的金釵石斛，再接著I/R手術(數量為10)；JIB-04+I/R：視網膜缺血再灌注(I/R)前玻璃體內施予JIB-04，再接著I/R手術(數量為4)；Shikonin+I/R：視網膜缺血再灌注(I/R)前玻璃體內施予紫草素(shikonin)，再接著I/R手術(數量為7)；Avastin+I/R：視網膜缺血再灌注(I/R)前玻璃體內施予癌思停(avastin)，再接著I/R手術(數量為4)；Eylea+I/R：視網膜接受缺血再灌注(I/R)加上缺血前預先施予200μg/5μl的采視明(Eylea)(數量為4)。

圖9為金釵石斛(DNL)/石斛酚(moscatilin)治療視網膜缺血之路徑分析。NDP：諾里疾病蛋白；PKM2：丙酮酸激酶M2；RBP2：視網膜母細胞瘤結合蛋白2；HIF-1α：缺氧誘導因子-1α；VEGF-A：血管內皮生長因子-A；VEGF-B：血管內皮生長因子-B；PLGF：胎盤生長因子。

本發明包括但不限於上述與下開之說明。實施方式則如下範例所示。

方法：

化學品和藥物給予

金釵石斛(DNL)購自科達公司(台灣台北)，溶於水(ddH₂O)中。對於電生理學，免疫組織化學和分子生物學研究，藥物施予會進行7天並且涉及各種實驗所設計的組別，即缺血後給藥(每天1g/kg/天的高劑量金釵石斛(DNL)，I/R+DNL1.0)或缺血前預先給藥(每日高劑量DNL，DNL1.0+I/R；低劑量DNL 0.5g/kg/天，DNL0.5+I/R)。經過缺血的媒劑(vehicel)組中的大鼠會後施予(I/R+Vehicel)或者預先施予與DNL組類似體積的媒劑(Vehicel+I/R)。

與假程序組(sham)、媒劑加缺血組(vehicle+I/R)或DNL1.0+I/R組相比，其他組的缺血眼睛先以1%睫狀肌麻痺劑(tropicamide)和2.5%脫羥腎上腺素(phenylephrine)擴張瞳孔後，使用連接25μl注射筒的30號針頭進行玻璃體內注射(intravitreal injections)。具體而言，要進行 缺血手術的眼睛於缺血前1天施予各種抑製劑/抗體的玻璃體內，即10μM/5μl JIB-04(Sigma-Aldrich)、4μM/5μl紫草素(Shikonin)(S7576；Sigma-Aldrich)、100mg/5μl癌思停(Avastin)(Hoffmann-La Roche)或200μg/5μl采視明(eylea)(Regeneron Pharmaceuticals Inc.)。在視網膜經缺血再灌注(I/R)及施予相關化合物或在假程序(Sham)手術一天後，將動物犧牲。收集視網膜樣本，並透過西方墨點法(Western blot)分析或酵素連結免疫分析法(ELISA)分析以測量缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、視網膜母細胞瘤結合蛋白2(RBP2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)、血管內皮生長因子-A(VEGF-A)和胎盤生長因子(PLGF)的蛋白質表現量。

石斛酚(moscatilin)購自EMMX Biotechnology(EN10271，CA，USA)並溶解於DMSO(媒劑(vehicle))中。先前報導指出較高濃度的石斛酚(1.25~20μM)會以劑量和時間依賴性地降低24小時處理之IC₅₀分別具7.0和6.7μM的兩種細胞株之細胞活力；因此，目前選擇0.1μM來評估其對氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation，OGD)的保護作用。在OGD前1小時、OGD期間或OGD後1小時給予石斛酚(0.1μM)。藉由細胞活率分析(MTT assay)和西方墨點法(Western blot)評估其治療效果。

體外實驗

氧糖剝奪(oxygen glucose deprivation，OGD)和細胞處理

視網膜神經節細胞-5(retinal ganglion cell-5，RGC-5)並不會轉化成大鼠視網膜神經節細胞(RGC)，而是小鼠視網膜神經前體細胞(retinal neuronal precursor cell)。氧糖剝奪(OGD)的定義為在缺氧(類似 缺血)條件(即1%氧氣(藉由分析儀進行監測；Penguin Incubator：對照範圍1~89%；Astec Company，Kukuoka，Japan)，94%氮氣，5%二氧化碳)下，將細胞維持在37℃下無葡萄糖的DMEM培養基中。此實驗有不同的組別，包括(i)在DMEM培養基中的給予DMSO的細胞(對照組的細胞；DMSO+DMEM)；(ii)於OGD前1小時先給予DMSO，再接著OGD處理之細胞(DMSO+OGD)；(iii)於OGD前1小時先給予石斛酚(moscatilin，Mos)(於DMEM培養基中加入0.1μM)，再接著OGD處理之細胞(Pre-OGD Mos 0.1μM)；(iv)在OGD期間給予石斛酚之細胞(During OGD Mos 0.1μM)；和(v)OGD後1小時給予石斛酚之細胞(DMSO+OGD)(Post-OGD Mos 0.1μM)。在1天的OGD期間結束時，細胞培養物會再回到DMEM培養基中培養24小時。接著再進行細胞活率分析(針對細胞存活率)和西方墨點法分析(針對諾里疾病蛋白(NDP))。

MTT細胞存活率分析

粒線體菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate hydrogen，NADPH)依賴性氧化還原酵素能夠還原MTT以形成甲

(blue formazan)。因此，深紫色甲

的數量增加係對應於更高的細胞存活率。在37℃下，將MTT(0.5mg/mL；Sigma-Aldrich)加入至含有原始100μL細胞的96孔盤中3小時。然後藉由加入100μL DMSO溶解還原的MTT。攪動平板後，使用酵素連結免疫分析法(ELISA)讀取器(Synergy H1 Multi-Mode Reader BioTek Instruments)在562nm下測量溶解的甲

的光密度(OD)。細胞存活率以相對於對照組(100%)的OD值 作為表示。

體內實驗

動物

本發明使用6周齡的Wistar大鼠。

視網膜缺血(retinal ischemia)的建立

麻醉和安樂死

用100mg/kg的克他明(ketamine)(Pfizer)和5mg/kg甲苯噻嗪(xylazine)(Sigma-Aldrich)進行腹腔內注射以麻醉動物。此外，腹腔給予至少140mg/kg戊巴比妥(pentobarbital)(SCI Pharmtech)以人道的方式犧牲動物。

缺血誘發

將大鼠(200-250g)以上述麻醉劑進行麻醉並置於立體定位儀(stereotaxic frame)內。用一連接0.9%生理食鹽水瓶之30號的針頭穿刺進大鼠的眼睛之前房，以使眼球內壓(intraocular pressure，IOP)升高至120毫米水銀柱，並維持1小時。透過視網膜變白證實缺血性損傷的建立。進行上述缺血誘發過程的假程序，但並不升高連接到大鼠眼睛的鹽水瓶，以作為對照。將動物置於37℃的加熱墊上並在缺血和隨後的3小時再灌注的期間內保持正常體溫。

閃爍視網膜電位圖測量

在假程序或視網膜缺血再灌注(第0天)前，以及假程序或視網膜缺血/再灌注後及預先施予指定藥物一天後，記錄所有動物的閃爍視網膜電位圖(Flash electroretinogram，Flash ERG)。在後給藥組中，在缺血前(第0天)和缺血後(在缺血後施予適當的化合物以及缺血後第1、3、5或7天記錄ERG)記錄所有動物的ERG數據。老鼠需對黑暗適應8小時，然後麻醉以記錄瞳孔擴大時的ERG。於動物的眼睛前2公分放置一閃光燈(strobe)以誘發出0.5Hz的刺激。在10kHz時以每2秒的時間間隔內收集連續15次的記錄；並將其振幅最大化及藉由放大器P511/穩壓電源RPS107/刺激器PS22(Grass-Telefactor)計算以求平均值。為了進行不同組別之間的比較，計算一隻眼(假程序或缺血)對未處理的正常眼的b波振幅之比。

甲苯酚紫(Cresyl violet)染色

在所有組別，於犧牲大鼠後，以生理食鹽水進行心內灌注(intracardial perfusion)。在角膜的12點鐘方向以絲線縫合來標記眼球，然後進行眼球摘除，並在4%多聚甲醛(paraformaldehyde)中於4℃下固定24小時，透過一系列梯度設計的乙醇進行脫水，再包埋於石蠟(Tissue-Tek TEC 5)中。沿著垂直子午線(vertical meridian)切出5μm厚的切片。切片用甲苯酚紫標記，並在光學顯微鏡(Leica)下觀察。在相同放大倍數下拍攝視網膜切片，並從照片(Ilford Pan-F plus film，50ASA)測量不同層的視網膜厚度。為了量化視網膜缺血損傷程度，整個視網膜厚度(從內限界膜(inner limiting membrane，ILM)到視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium， RPE)層)，及內層視網膜厚度(從內限界膜到內核層(inner nuclear layer，INL))的厚度皆被測量。

視網膜神經節細胞逆行染色(RGC retrograde staining)

在動物於麻醉狀態下，在動物的頭皮上製造2cm的切口，並鑽出兩個小孔以深入頭蓋骨顱。此外，透過微量滴管將10μl的5%螢光金(fluorogold)(Sigma-Aldrich)注射入頭蓋骨下深度3.8、4.0和4.2mm的位置。在不同組別中，在動物犧牲前3天注射螢光金。以先前方式對視網膜樣本進行取出、固定、解剖和處理。視網膜神經節細胞(RGC)的密度為全部RGC的數量除以視網膜樣本的總面積之比例。

免疫螢光分析

動物犧牲後，對其心臟進行生理鹽水(w/v)灌注；然後，取出大鼠眼球，用4%(w/v)多聚甲醛固定45分鐘，並以先前方式進行脫水並包埋在石蠟中。在假程序或誘發視網膜缺血及缺血前/後施予DNL或媒劑的一天後進行取樣。將5μm視網膜切片與一級抗體(山羊抗乙醯膽鹼轉移酶(ChAT)多株抗體(1：100；AB144p；Chemicon)、小鼠抗波形蛋白單株抗體(1：100；V6630；Sigma-Aldrich)、或兔抗膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)多株抗體(Millipore))共同孵育過夜。接著，將視網膜切片與合適的二級抗體(羅丹明(rhodamine)共軛的兔抗山羊抗體(1：500；AP106R；Chemicon)、螢光異硫氰酸鹽(FITC)共軛的山羊抗小鼠IgG(1：500；AP124F；Millipore)/抗兔IgG(Millipore)。同時，細胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Molecular Probes)進行染色標記。最後，使用螢光顯微鏡(Olympus BX61， Göttingen，德國)觀察視網膜切片。為了比較不同組別之間切片視網膜之視網膜厚度(甲酚紫染色)或免疫反應性程度，研究人員在不知切片樣本是何條件下，測量視網膜厚度或評價不同組別對對照組(假程序)之免疫標記程度。

西方墨點法分析

取出的視網膜/細胞樣本進一步在裂解緩衝液(哺乳動物蛋白質提取試劑(MPER；HyCell))中進行超音波處理。在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺膠凝體電泳(SDS-PAGE；Bio-Rad)上處理等量的變性蛋白質(40μg/30μl/孔)。分離後，將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，且將PVDF膜進一步在4℃下浸入各種一級抗體(兔單株抗β-肌動蛋白抗體(AC-15；1：2000；ab6276)/抗HIF-1α抗體(1：200；H1alpha67-ChIP Grade；Abcam Inc.)，兔多株抗VEGF抗體(A-20；1：200；sc-152)/抗PKM2抗體(1：500；ab38237)，或兔單株抗RBP2單株抗體(ab177486；1：1000；Abcam Inc.)12小時。接下來將墨點浸入相關的二級抗體，即辣根過氧化酵素(HRP)共軛的山羊抗兔IgG(1：5,000；Santa Cruz Biotechnology Inc.)或羊抗老鼠IgG(1：5,000；sc-2005)，於37℃下1小時。以5%脫脂牛奶稀釋一級/二級抗體。最後，使用增強型化學發光分析系統(HyCell)進行對膜掃描，並且曝光在X射線膠片(Fujifilm)進行。然後，透過密度掃描以評估每個蛋白質的數量。

酵素免疫吸附分析法(ELISA)

使用ELISA測定胎盤生長因子(PLGF)的表現量。在缺血 一天後，將視網膜從摘除的眼杯(eye cup)中分離，並將其解離，然後透過與哺乳動物蛋白提取試劑(Sigma-Aldrich)孵育30分鐘進行裂解，然後再另以13,000rpm離心30分鐘。使用二金雞鈉酸蛋白試劑盒(bicinchoninic acid protein kit)(Thermo Fisher Scientific)測定每個樣本中全部蛋白。用PLGF的ELISA試劑盒(CSB-E07400；Cusabio Life Scince)測量上清液中的PLGF表現量。先將抗PLGF抗體塗布在微孔上。用200μL洗滌緩衝液對每一個微孔洗滌兩次且超過15分鐘後，將樣本中PLGF或PLGF標準蛋白的各種濃度(100μL)與塗佈於微孔中的抗體進行結合，於室溫下並在振盪器(75rpm)上搖晃2小時。用200μL洗滌緩衝液(含有0.05%土溫乳化劑(Tween 20)的磷酸緩衝鹽溶液(PBS)，PBST)對每一個微孔洗滌兩次後，將100μL生物素共軛的抗PLGF抗體(以測定緩衝液稀釋：PBST和0.5%牛血清蛋白(BSA))加入到每個微孔並搖晃(75rpm)1小時，以結合被塗佈的抗體所捕捉的PLGF。在兩次洗滌以去除未結合的生物素共軛的抗PLGF後，加入100μ1親合素(avidin)-辣根過氧化酵素(HRP；以測定緩衝液稀釋)並結合生物素共軛的抗VEGF-A抗體，最後於振盪器(75rpm)上搖晃。於振盪器上孵育1小時後，洗滌兩次後去除未結合的親和素-HRP。最後，將90μL 3,3'，5,5'-四甲基聯苯胺(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)(100μM)溶液(其可被HRP氧化)加入到每個微孔中20分鐘。然後加入50μL終止液(硫酸溶液，100μM)，使顏色變為黃色。用分光光度計(Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Reader，Biotek ELx800)立即檢測450nm處的最大吸光度(OD)。透過使用不同量的PLGF(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125和0pg/mL)建立標準曲線來確定每個樣本的PLGF濃度。用100μL樣品稀釋液(作為 空白)將儀器歸零。實驗結果以相對於對照組的OD值(標準化成100%)的OD值表示。

統計分析

兩組之間的比較使用非成對學生t檢定(unpaired Student’s t-tests)。進行單因子共變數分析(ANOVA)以比較3個或更多獨立組別。在單因子共變數分析後，利用Dunnett檢定比較對照組(例如媒劑處理的缺血性視網膜，Vehicle+I/R)與所有其他組(例如DNL處理的缺血性視網膜，DNL1.0+I/R)。實驗結果以平均值±標準誤差(standard error)表示。P<0.05代表有顯著差異。

結果：

(a)MTT細胞存活率測定

首先，在光學顯微鏡下檢查RGC-5細胞的細胞形態和數量的變化。細胞形態的改變可能暗指缺血性損傷的嚴重程度。培養於預先施予DMSO的DMEM培養基中(DMSO+DMEM；圖1a)的細胞表現出錐狀，並展露特徵性的神經元形態。與DMSO+DMEM組相比，經歷氧糖剝奪(OGD)並預先施予DMSO(DMSO+OGD)的細胞會有變形的現象(如白色箭號所指；圖1b)；此外，細胞數目亦顯著減少。施予石斛酚(moscatilin)(0.1至100μM)以治療遭受氧糖剝奪的細胞；此外，本發明證實OGD前預先施予石斛酚(moscatilin)於OGD的保護作用在0.1μM(62.65%±4.35%；數量為6)或1μM(66.36%±9.35%；數量為4)有較佳的細胞存活率；然 而，在10μM(15.43±3.09%；數量為4)和100μM(12.49%；數量為1)時卻會出現細胞毒性效應(細胞存活率降低)。故後者的濃度可能超出藥理保護程度。但此結果並不矛盾，因先前的研究亦指出石斛酚在時間依賴性(1~3天)和劑量依賴性(1.25~20μM)上具有細胞毒性作用，這可能與其在濃度為20或50μM且處理15小時後能誘導有絲分裂中G2期的阻滯之能力有關。然而，石斛酚的濃度在等於或小於1μM時被證明是無毒的，並且作為有效．OH自由基的清除劑。與DMSO+OGD組相比(圖1b)，在OGD前1小時(圖1c)、OGD期間(圖1d)和OGD後1小時(圖1e)施予0.1μM的石斛酚(moscatilin)評估細胞保護作用(cytoprotection)對抗OGD的程度。在OGD前1小時給0.1μM的石斛酚效果最大(圖1c)，在OGD期間給藥效果次之(圖1d)，最後是OGD後1小時就無給藥效果(圖1e)。

與DMSO+DMEM組(正常對照組：100%；數量為6)相比，預先施予DMSO並接受OGD，在DMSO+OGD組中細胞存活率顯著降低(53.66±2.67%)(P<0.001)(圖1f)。此外，與DMSO+OGD組相比，OGD前1小時施予0.1μM石斛酚會產生顯著的細胞保護作用以抵抗OGD(圖1f；62.65±4.35%；P=0.04)。然而，OGD期間(圖1f；56.03±4.08%；P=0.31)或OGD後1小時(圖1f；52.61±4.16%；P=0.41)施予0.1μM石斛酚並無顯著的細胞保護作用以抵抗OGD。

(b)石斛酚對體外相對β-肌動蛋白的NDP表現之影響

為了研究與血管生成(vasculogenesis)相關諾里疾病蛋白(NDP)的變化，代表性的免疫印跡圖像和分析條形圖分別在圖2的頂部 和底部示出。與DMSO+DMEM組(正常對照：100%；數量為3)相比，OGD處理前給予媒劑再接著OGD(DMSO+OGD；P<0.001)顯著降低NDP的量至44.54±3.15%。當DMSO+OGD組與pre-OGD Mos 0.1μM組相比時，NDP的數量顯著增加(108.38±29.33%)(P=0.048)。當在OGD前1小時施予石斛酚，此時的蛋白質表現量的升高是最大的；然後是在OGD後1小時施予(54.36±3.88%)，最後是在OGD期間施予(48.99±9.89%)。

(c)金釵石斛對ERG之b波的影響

本發明接著測試視網膜電生理功能。在接受假程序的視網膜(Sham，圖3)中，視網膜電位圖(ERG)的b波振幅測量為0.41mV。在視網膜缺血後，b波振幅劇烈地降低，且其不受缺血前或缺血後施予媒劑(vehicel)處理的影響(Vehicel+I/R：0.03mV，圖3a；I/R+Vehicel：0.07mV，圖3b)。然而，在缺血前(DNL0.5+I/R；DNL1.0+I/R，圖3a)或缺血後以金釵石斛(DNL)處理(I/R+DNL1.0 D7，圖3b)緩解缺血引起的b波下降，且振幅分別升高至0.18、0.22和0.15mV。此外，缺血前以DNL處理會呈劑量依賴性地減弱振幅降低的情況。

如圖3c所示(數量為12)，與對照組(Sham)(1.00±0.08)相比，Vehicle+I/R組的b波比率(0.10±0.03)顯著下降(P=0.002)。重要的是，缺血前以DNL處理會呈劑量反應的顯著減輕經I/R後缺血所引起的b波比率下降的情況(DNL1.0+I/R：0.57±0.06；DNL0.5+I/R：0.45±0.03(P<0.001))。

在圖3d(數量為10)中，與對照組(Sham)相比，在I/R+Vehicle 組(I/R缺血手術後施予媒劑(Vehicle))中，b波比率顯著降低(第1天：0.13±0.04；第3天：0.10±0.02；第5天：0.09±0.03；第7天：0.06±0.03)(P<0.001)。重要的是，缺血後施予金釵石斛(DNL)(1.0g/kg/天，I/R+DNL1.0)顯著減弱缺血所誘發的b波比率下降之情況(第1天：0.14±0.04；第3天：0.26±0.05(P=0.02)；第5天：0.34±0.05(P=0.003)；第7天：0.40±0.04(P<0.001))。缺血前(第0天)b波比率分別為1.00±0.09(I/R+Vehicle)和1.00±0.08(I/R+DNL1.0)。當對假程序(sham)的第0、1、3、5和7天之ERG的b波比率(0.99±0.06、0.97±0.07、0.98±0.06、1.02±0.01和0.99±0.07)進行彼此之間的相互比較後，並沒有發現任何明顯地不同。

(d)DNL對甲苯酚紫所標記的視網膜層厚度的影響

視網膜厚度的評估係基於對全部不同的組別在距離視盤的相同距離(1.5mm)所切出的視網膜樣本(數量為10~12，圖4)。與接受假程序的視網膜相比(Sham，圖4a和4g：整個視網膜(whole retina)為225.50±3.26μm，內層視網膜(innerretina)為112.08±2.58μm)，預先施予媒劑(Vehicle)且接受I/R的動物之視網膜厚度顯著降低(Vehicle+I/R，圖4b和4g：整個視網膜為110.83±1.85μm，內層視網膜為62.50±3.06μm)(P<0.001)。此外，當動物接受I/R且預先施予金釵石斛(DNL)，上述降低情況會呈劑量依賴性和顯著地抵銷(DNL1.0+I/R，圖4c和4g：整個視網膜為190.08±4.48μm，內層視網膜為94.92±2.27μm；DNL0.5+I/R，圖4d和4g：整個視網膜為148.58±2.80μm，內層視網膜為78.25±1.53μm)(P<0.001)。

與接受假程序的視網膜(Sham，圖4a)相比，接受I/R和後施予媒劑(vehicle)的大鼠之視網膜厚度顯著降低(I/R+vehicle，圖4e和4h：整個視網膜為115.00±2.04μm，內層視網膜為63.92±3.30μm)(P<0.001)。此外，後施予金釵石斛會使缺血所誘發的減少顯著降低(I/R+DNL1.0，圖4f和4h：整個視網膜為125.25±2.66μm(P=0.006)；內層視網膜為71.50±1.51μm(P=0.048))。

(e)DNL對逆行螢光金免疫標記的RGC密度的影響

圖5為視網膜神經節細胞(RGC)的密度分析(數量為4)，假程序組(Sham，圖5a和5e)中RGC的密度為363.23±2.84個細胞/視野(field)。與假程序組相比，在接受視網膜缺血和預先施予媒劑(Vehicle)的動物(Vehicle+I/R，圖5b和5e)中RGC密度顯著減少(192.06±23.53個細胞/視野)(P<0.001)。此外，當動物接受視網膜缺血和預先施予金釵石斛(DNL)(DNL1.0+I/R，圖5c和5e：295.15±7.14個細胞/視野)或缺血後施予金釵石斛(I/R+DNL1.0，圖5d和5e：256.26±9.46個細胞/視野)，上述減少現象顯著降低(P=0.006或0.045)。

(f)DNL對ChAT免疫反應性的影響

在接受假程序的視網膜(Sham，圖6a)之膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)免疫反應性顯示在內核層(INL)和神經節細胞層(GCL)中的無軸突神經細胞體(amacrine cell bodies)(短箭號)出現膽鹼乙醯轉移酶(ChAT)(紅色)的免疫標記；這也證實在內叢狀層(IPL)中有2個明顯的層(strata)(長箭號)。接受缺血和預先施予/後施予媒劑的視網膜 (Vehicle+I/R，圖6b；I/R+Vehicle，圖6e)中，ChAT免疫標記的無軸突神經細胞體的數量顯著減少；此外，無軸突神經細胞體在內叢狀層(IPL)的免疫標記顯著減少。而在臨床上重要的是，當於缺血性視網膜預先施予金釵石斛(DNL)(DNL0.5+I/R，圖6c；DNL1.0+I/R，圖6d)時，這些上述變化會呈劑量依賴性形式來降低。此外，後施予金釵石斛(I/R+DNL1.0，圖6f)也明顯減輕因缺血所引起的變化。在所有圖片中顯示ChAT免疫反應標記和以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)免疫標記所染的細胞核之合併圖像。

(g)DNL對波形蛋白和GFAP免疫反應性的影響

進行免疫組織化學研究以研究波形蛋白和GFAP免疫反應性。

波形蛋白的免疫組織化學染色

在對照視網膜(Sham，圖7b)中，繆氏細胞(müller cells)之突出(processes)被波形蛋白免疫標記出末端(箭頭，圖7c和7f)在神經節細胞層(GCL)上，且突出延伸到內叢狀層(IPL)、內核層(INL)和外核層(ONL)(箭號，圖7c和7f)。與對照視網膜(Sham，圖7b)相比，在接受I/R的視網膜且預先施予/後施予媒劑的抗波形蛋白免疫反應增強(Vehicle+I/R，圖7c；I/R+Vehicle，圖7f)。透過預先施予金釵石斛(DNL)，上述增強情況會顯著且呈劑量依賴性地減弱(DNL0.5+I/R，圖7d；DNL1.0+I/R，圖7e)。此外，後施予金釵石斛(I/R+DNL1.0，圖7g)顯著地消除因缺血所誘發的變化。

GFAP的免疫組織化學染色

與對照視網膜(Sham，圖7i)相比，觀察到抗膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)免疫標記在缺血性視網膜且預先/後施予媒劑有增加的現象(Vehicle+I/R，圖7j；I/R+Vehicle，圖7m)。此外，當缺血性視網膜預先施予金釵石斛，上述變化會明顯且呈劑量依賴性方式消除(DNL0.5+I/R，圖7k；DNL1.0+I/R，圖7l)。後施予金釵石斛也明顯消除上述因缺血所誘發的變化(I/R+DNL1.0，圖7n)。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(藍色；圖7a和7h)染色標記假程序之視網膜的細胞核。

(h)DNL1.0對大鼠視網膜中各種蛋白質表現量的影響

測量對照視網膜(Sham，數量為4~10)中各種蛋白質的表現量，結果如圖8a1和8a2所示(HIF-1α=51.17±5.14%；VEGF=59.72±6.94%；PKM2=52.93±7.01%；RBP2=12.81±0.55%)。相反的，當接受I/R且預先施予媒劑(Vehicle)後，觀察到HIF-1α、VEGF、PKM2和RBP2的表現量(標準化成100%)顯著上升(P

0.001)。此外，當缺血性視網膜預先施予1.0g/Kg天的金釵石斛(DNL)時，會顯著抑制這種上升現象(P<0.001；HIF-1α：56.08±6.76；VEGF：51.87±9.89；PKM2：71.99±3.05；RBP2：50.64±1.48)。另外，在預先施予各自的抑制劑/抗體：JIB-04(RBP2抑製劑)、紫草素(shikonin)(PKM2抑制劑)和癌思停(avastin)(VEGF抗體)後，其能顯著抵銷缺血所誘發的HIF-1α(JIB-04：53.98±2.29；shikonin：42.65±0.76；avastin：84.61±3.96(P=0.07))、VEGF(JIB-04：27.82±1.21；shikonin：57.55±9.40；avastin：5.38±2.51)、PKM2(JIB-04：60.36±7.59； shikonin：44.94±10.91；avastin：84.44±4.53(P=0.01))和RBP2(JIB-04：5.83±1.43；shikonin：3.40±0.23；avastin：78.35±3.29(P=0.02))；P<0.001)的表現量增加(P<0.002，除癌思停(avastin)組外)。

如圖8b所示(數量為4)，與對照視網膜(Sham：15.11±1.58pg/ml)相比，接受I/R且預先施予媒劑後，胎盤生長因子(PLGF)的表現量有顯著升高(Vehicle+I/R=39.53±5.25)(P=0.004)。此外，當預先施予金釵石斛(DNL)(DNL1.0+I/R=19.93±2.24)或抗PLGF抗體采視明(eylea)(Eylea+I/R=6.44±0.60)於缺血性視網膜時，這種升高顯著變差(P=0.01或P<0.001)。

本發明適當的描述可以在本文未具體公開的元素或限制下實施。已被用作描述的術語並不是限制。在使用這些術語和除此之外的任何等同物的表達和描述是沒有差別的，但應當認識到本發明內的權利是可能修改的。因此，雖然本發明已說明實施例和其他情況，本文中所公開的內容可以被本領域的技術人員進行修飾和變化，並且這樣的修改和變化被認為是在本發明的權利範圍之內。

Claims (10)

1. 一種組合物用於製備治療發育性視網膜血管疾病的藥物之用途，其中該組合物包含一有效劑量的金釵石斛(Dendrobium nobile Lindley)。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該發育性視網膜血管疾病包含永存原始玻璃體增生症(persistent hyperplastic primary vitreous，PHPV)、諾里疾病(Norrie)、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(familial exudative vitreoretinopathy，FEVR)及柯氏症(Coats disease)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該金釵石斛包含一石斛酚(Moscatilin)。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該金釵石斛或該石斛酚藉由改善血管生成(vasculogenesis)的缺陷以治療該發育性視網膜血管疾病。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該發育性視網膜血管疾病的症狀包含視網膜血管發育異常、視網膜缺血和視力受損。
6. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該金釵石斛或該石斛酚治療該發育性視網膜血管疾病所造成的視網膜缺血性損傷。
7. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該金釵石斛或該石斛酚治療該發育性視網膜血管疾病所造成的視網膜厚度變薄的情況。
8. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該金釵石斛或該石斛酚降低缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、視網膜母細胞瘤結合蛋白2(RBP2)、丙酮酸激酶M2(PKM2)和血管內皮生長因子(VEGF)的表現量。
9. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中該金釵石斛或該石斛酚下調胎盤生長因子(PLGF)的表現量以及上調諾里疾病蛋白(NDP)的表現量以治療該發育性視網膜血管疾病。
10. 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該金釵石斛或該石斛酚上調諾里疾病蛋白(NDP)的表現量以調節諾里(norrin)依賴性Wnt訊號路徑來改善視網膜血管發育異常以治療該發育性視網膜血管疾病。

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