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TW201927314A - 具有記憶功能之t細胞或b細胞之增強劑、惡性腫瘤復發抑制劑、及對t細胞或b細胞誘導記憶功能之誘導劑 - Google Patents

具有記憶功能之t細胞或b細胞之增強劑、惡性腫瘤復發抑制劑、及對t細胞或b細胞誘導記憶功能之誘導劑 Download PDF

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TW201927314A
TW201927314A TW107135776A TW107135776A TW201927314A TW 201927314 A TW201927314 A TW 201927314A TW 107135776 A TW107135776 A TW 107135776A TW 107135776 A TW107135776 A TW 107135776A TW 201927314 A TW201927314 A TW 201927314A
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TW
Taiwan
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nucleic acid
cell
malignant tumor
ccl19
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TW107135776A
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TWI838348B (zh
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玉田耕治
佐古田幸美
安達圭志
中村貴史
Original Assignee
國立大學法人山口大學
國立大學法人鳥取大學
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Publication date
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Abstract

本發明之目的在於為了長期持續排斥惡性腫瘤而提供一種具有記憶功能之內源性之T細胞或B細胞之增強劑及惡性腫瘤復發抑制劑。
本發明製作一種投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑、或對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑，其包含核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸。又，本發明製作一種惡性腫瘤復發抑制劑，其包含核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼CCL19之核酸。

Description

具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑、惡性腫瘤復發抑制劑、及對T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑
本發明係關於一種包含核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7，Interleukin-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19，chemokine(C-C motif) ligand 19)之核酸的投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑、惡性腫瘤復發抑制劑、及對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑。
惡性腫瘤係於全世界存在大量罹患者之疾病，通常廣泛地進行有化學療法、輻射療法、或外科療法。然而，有產生副作用、或喪失一部分之功能、或無法對復發或轉移進行治療等各種問題。因此，為了更高地維持患者之生活品質(QOL)，近年來，進行免疫細胞療法之開發。該免疫細胞療法係自患者採集免疫活性細胞，以提高該免疫活性細胞之免疫功能之方式進行處理使其擴增，並再次移入至患者的療法。具體而言，已知有自患者採集T細胞，向該T細胞中導入編碼CAR(Chimeric antigen receptor，嵌合抗原受體)之核酸進行擴增，並再次移入至患者的療法(參照非專利文獻1)。該療法目前正於全世界進行臨床試驗，且獲得對白血病或淋巴瘤等造血器官惡性腫瘤等顯示出有效性之結果。
又，作為T細胞等免疫活性細胞之免疫功能控制因子，已知有細胞介素、趨化介素、訊號控制蛋白等至少數百種因子。其中已知介白素7(IL-7)為T細胞之生存所必需之細胞介素，係由骨髓、胸腺、淋巴器官/組織之基質細胞等非造血細胞所產生。作為利用該IL-7之功能之T細胞，揭示融合有IL-7與IL-7Rα之表現嵌合細胞介素受體之T細胞(參照專利文獻1)。然而，該T細胞中之嵌合細胞介素受體只不過作為一種融合蛋白僅限於在所導入之T細胞之膜表面表現，僅對自身之細胞不依存於配體地傳遞IL-7R等之細胞介素訊號，無法提高未導入上述受體之T細胞之功能。
又，揭示CCL19或CCL21、IL-7之表現降低導致SIRPα(Signal regulatory protein α，訊號調節蛋白α)變異小鼠之脾臟中之T細胞區域之維持缺損(參照非專利文獻2)，CCL19或CCL21、IL-7具有於二次淋巴組織(脾臟或淋巴結)中維持T細胞之恆定性之作用(參照非專利文獻3)。然而，上述非專利文獻2、3係顯示出對於恆定地存在於二次淋巴組織之T細胞區域之非活化T細胞之作用者，並非顯示出與抗腫瘤免疫應答之直接之關係性者。進而，上述非專利文獻2、3中之表現CCL19或CCL21、IL-7之細胞並非T細胞，而係存在於二次淋巴組織中之網狀內皮系統之細胞。
另一方面，本發明者等人提出了藉由同時表現IL-7與CCL19，而顯著地抑制實質癌之免疫細胞療法(參照專利文獻2、3)。藉由該方法，可提高宿主(接受者)中之內源性之免疫活性細胞之活化或向腫瘤細胞之積聚能力，但尚不明確藉由該免疫細胞療法是否可長期防止復發等，持續排斥惡性腫瘤。
先前技術文獻
專利文獻
專利文獻1：國際公開第2013/123061號說明書
專利文獻2：國際公開第2016/056228號說明書
專利文獻3：國際公開第2017/159736號說明書
非專利文獻
非專利文獻1：中澤洋三 信州醫志 61 (4): 197～203 (2013)
非專利文獻2：SATO-HASHIMOTO M. et al., J. Immunol., 2011, vol. 187, no. 1,291-7
非專利文獻3：SIEGERT S. et al., Front. Immunol., 2012, vol. 3, article 285
[發明所欲解決之問題]
如上所述，開發出同時表現IL-7與CCL19之表現CAR之T細胞或表現TCR(T cell receptor，T細胞受體)之T細胞等免疫細胞療法，且進行可顯著地提高免疫活性細胞之增殖能力、生存能力、或宿主之免疫活性細胞之積聚能力，適用於先前藉由免疫細胞療法未見充分之治療效果之實質癌的技術之開發。然而，惡性腫瘤多數情況下會復發，即便藉由上述免疫細胞療法可暫時地治療惡性腫瘤，亦不明確是否長期持續排斥惡性腫瘤，又，亦未研究針對復發之預防對策。因此，本發明之課題在於為了長期持續排斥惡性腫瘤而提供一種具有記憶功能之內源性之T細胞或B細胞之增強劑、惡性腫瘤復發抑制劑、及對內源性之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑。
[解決問題之技術手段]
本發明者等人於研究此前自己開發之表現CAR、IL-7及CCL19之T細胞之進一步之可能性之過程中，發現若向對象投予該T細胞，則不僅於所投予之T細胞中，亦於對象(宿主)中之內源性之T細胞中誘導記憶功能而增加具有記憶功能之細胞之絕對數；且於惡性腫瘤之復發模型實驗中，對不具有CAR所識別之抗原之細胞抑制惡性腫瘤形成。進而發現，於使用TCR代替CAR之情形時，或於使用病毒代替T細胞之情形時亦存在同樣之效果，從而完成本發明。
即，本發明係如下所述。
(1)一種投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其包含核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸。
(2)如上述(1)所記載之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其特徵在於：核酸傳遞介質係選自免疫活性細胞、病毒、厭氧性菌、脂質體、間葉系幹細胞(MSC，Mesenchymal stem cell)、奈米粒子之至少1種以上。
(3)如上述(1)或(2)所記載之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其特徵在於：核酸傳遞介質具有向惡性腫瘤細胞之積聚能力、或於惡性腫瘤細胞中之特異之增殖能力。
(4)如上述(1)至(3)中任一項所記載之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其特徵在於：核酸傳遞介質具有惡性腫瘤細胞毒殺能力。
(5)如上述(1)至(4)中任一項所記載之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其特徵在於：核酸傳遞介質為免疫活性細胞，且該免疫活性細胞具有識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子。
(6)如上述(5)所記載之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其特徵在於：識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子為嵌合抗原受體(CAR，Chimeric antigen receptor)或T細胞受體(TCR，T-Cell Receptor)。
(7)如上述(5)或(6)所記載之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其特徵在於：免疫活性細胞為T細胞。
(8)如上述(1)至(7)中任一項所記載之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其特徵在於：具有記憶功能之T細胞或B細胞為中央記憶T細胞。
(9)一種醫藥組合物，其含有如上述(1)至(8)中任一項所記載之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑與藥學上所容許之添加劑。
(10)一種惡性腫瘤復發抑制劑，其包含核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸。
(11)如上述(10)所記載之惡性腫瘤復發抑制劑，其特徵在於：核酸傳遞介質係選自免疫活性細胞、病毒、厭氧性菌、脂質體、間葉系幹細胞(MSC)、奈米粒子之至少1種以上。
(12)如上述(10)或(11)所記載之惡性腫瘤復發抑制劑，其特徵在於：核酸傳遞介質具有向惡性腫瘤細胞之積聚能力、或於惡性腫瘤細胞中之特異之增殖能力。
(13)如上述(10)至(12)中任一項所記載之惡性腫瘤復發抑制劑，其特徵在於：核酸傳遞介質具有惡性腫瘤細胞毒殺能力。
(14)如上述(10)至(13)中任一項所記載之惡性腫瘤復發抑制劑，其特徵在於：核酸傳遞介質為免疫活性細胞，且該免疫活性細胞具有識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子。
(15)如上述(14)所記載之惡性腫瘤復發抑制劑，其特徵在於：核酸傳遞介質係具有識別惡性腫瘤細胞抗原之細胞表面分子之免疫活性細胞，惡性腫瘤復發係由不具有該細胞表面分子特異性地識別之惡性腫瘤抗原之惡性腫瘤細胞引起之惡性腫瘤復發。
(16)如上述(14)或(15)所記載之惡性腫瘤復發抑制劑，其特徵在於：識別惡性腫瘤細胞抗原之細胞表面分子為嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
(17)如上述(14)至(16)中任一項所記載之惡性腫瘤復發抑制劑，其特徵在於：免疫活性細胞為T細胞。
(18)如上述(11)所記載之惡性腫瘤復發抑制劑，其特徵在於：核酸傳遞介質為腫瘤溶解性病毒。
(19)一種醫藥組合物，其含有如上述(10)至(18)中任一項所記載之惡性腫瘤復發抑制劑與藥學上所容許之添加劑。
(20)一種對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑，其包含核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸。
又，作為本發明之另一態樣，係如下所述。
1)一種核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸之用途，其係用於製備投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑；
2)一種具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強方法，其中向對象投予核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸；
3)一種核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸之用途，其係用於製備惡性腫瘤復發抑制劑；
4)一種惡性腫瘤復發之抑制方法，其中向對象投予核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸；
5)一種核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸之用途，其係用於製備對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑；
6)一種對T細胞或B細胞之記憶功能之誘導方法，其中向對象投予核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸；
7)如上述(20)所記載之對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑，其特徵在於：核酸傳遞介質係選自免疫活性細胞、病毒、厭氧性菌、脂質體、間葉系幹細胞(MSC)、奈米粒子之至少1種以上。
8)如上述(20)或7)所記載之對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑，其特徵在於：核酸傳遞介質具有向惡性腫瘤細胞之積聚能力、或於惡性腫瘤細胞中之特異之增殖能力。
9)如上述(20)、7)或8)中任一項所記載之對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑，其特徵在於：核酸傳遞介質具有惡性腫瘤細胞毒殺能力。
10)如上述(20)、7)至9)中任一項所記載之對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑，其特徵在於：核酸傳遞介質為免疫活性細胞，且該免疫活性細胞具有識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子。
11)如上述10)所記載之對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑，其特徵在於：識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子為嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
12)如上述10)或11)所記載之對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑，其特徵在於：免疫活性細胞為T細胞。
[發明之效果]
若使用本發明之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，則可增強投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞。進而，若使用本發明之惡性腫瘤復發抑制劑，則可抑制惡性腫瘤治療後之復發。又，若使用本發明之對T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑，則可對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能。
作為本說明書中之「具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑」，只要包含核酸傳遞介質、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，則並無特別限制，利用該增強劑，可增強具有記憶功能之T細胞或B細胞。又，作為本說明書中之「對T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑」，只要包含核酸傳遞介質、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，則並無特別限制，利用該誘導劑，可對T細胞或B細胞誘導記憶功能。再者，以下，於本說明書中，亦將上述「具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑」或上述「對T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑」合稱為「本案增強劑或誘導劑」。
作為本說明書中之「惡性腫瘤復發抑制劑」，只要包含核酸傳遞介質、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，則並無特別限制，利用該惡性腫瘤復發抑制劑，可抑制惡性腫瘤復發。再者，以下，於本說明書中，亦將上述「惡性腫瘤復發抑制劑」稱為「本案惡性腫瘤復發抑制劑」。
作為編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，可適當地列舉源自人之核酸。上述各核酸可根據所導入之細胞之種類適當選擇，該各核酸之序列資訊可檢索公知之文獻或NCBI(National Center of Biotechnology Information，美國國家生物技術信息中心)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)等資料庫而適當地獲取。作為編碼IL-7之核酸，可列舉編碼序列編號1所表示之胺基酸序列之鹼基序列，只要具有IL-7中之細胞增殖率或細胞生存率之亢進作用即可，可為編碼與序列編號1所表示之胺基酸序列具有80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進而較佳為95%以上、最佳為98%以上之序列同一性之胺基酸之鹼基序列。作為編碼CCL19之核酸，可列舉編碼序列編號2所表示之胺基酸序列之鹼基序列，只要具有CCL19中之細胞之趨化作用即可，可使用編碼與序列編號2所表示之胺基酸序列具有80%以上、較佳為85%以上、更佳為90%以上、進而較佳為95%以上、最佳為98%以上之序列同一性之胺基酸之鹼基序列。再者，上述IL-7中之細胞增殖率或細胞生存率之亢進作用或CCL19中之細胞之趨化作用可藉由上述專利文獻2中所記載之方法而加以確認。
於本說明書中，用語「同一性」係指多肽或聚核苷酸序列近似性之程度(其係由查詢序列與其他較佳為同一型之序列(核酸或蛋白質序列)之匹配而決定)。作為計算及決定「同一性」之較佳之電腦程式法，例如可列舉：GCG BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本局部比對搜尋工具)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990, 215: 403-410; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3389-3402; Devereux et al., Nucleic Acid Res. 1984, 12: 387)、以及BLASTN 2.0(Gish W., http://blast.Wustl.edu, 1996-2002)、以及FASTA(Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85: 2444-2448)、以及決定及排序最長地重複之一對重疊序列之GCG GelMerge(Wibur及Lipman, SIAM J. Appl. Math. 1984, 44: 557-567; Needleman及Wunsch, J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453)。
上述編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸可組入至含有啟動子或終止子等控制序列、或抗藥性基因、報導基因等選擇標記序列之載體中。進而，可於載體內含有編碼自殺基因之核酸、或編碼2A肽或IRES(internal ribosome entry site，內部核糖體進入位點)之核酸。關於上述載體、編碼自殺基因之核酸、或編碼2A肽或IRES之核酸，可將上述專利文獻2、3作為參照而獲取或製作。作為上述啟動子，例如可列舉：巨細胞病毒(CMV)之IE(Immediate early，即刻早期)基因之啟動子、SV40(Simian vacuolating virus 40，猿猴空泡形成病毒40)之初始啟動子、反轉錄病毒之啟動子、金屬硫蛋白啟動子、熱休克啟動子、SRα啟動子、NFAT(Nuclear Factor Of Activated T Cells，活化T細胞核因子)啟動子、HIF(Hypoxia Inducible Factor，缺氧誘導因子)啟動子等。又，作為上述載體，例如可列舉：pMSGV載體(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002))或pMSCV載體(TAKARA BIO公司製造)等反轉錄病毒載體或源自該載體者。
又，可含有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸以及編碼IL-15、CCL21、IL-2、IL-4、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IP-10、CCL4、Flt3(FMS-like tyrosine kinase 3，類FMS酪胺酸激酶3)、干擾素(interferon)-γ、MIP-1α、GM-CSF(Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor，顆粒球巨噬細胞群落刺激因子)、M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor，巨噬細胞群落刺激因子)、TGF(Transforming Growth Factor，轉化生長因子)-β、TNF(Tumor Necrosis Factor，腫瘤壞死因子)-α、檢測點抑制抗體或其片段等其他免疫功能控制因子之核酸。其中，本案增強劑或誘導劑或本案惡性腫瘤復發抑制劑只要至少含有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸作為編碼免疫功能控制因子之核酸，則即便不含上述編碼其他免疫功能控制因子之核酸，亦可充分地發揮出作為本案增強劑或誘導劑或本案惡性腫瘤復發抑制劑之效果。
上述所謂「記憶功能」，係指於具有過去受到腫瘤抗原之刺激之經驗，且再次與惡性腫瘤細胞接觸之情形時，與過去未受到腫瘤抗原之刺激之初始T細胞相比迅速且強力地活化，發揮出對於惡性腫瘤細胞之較高之免疫功能之功能。又，作為具有記憶功能之T細胞或B細胞，可列舉：中央記憶T細胞、記憶B細胞。該具有記憶功能之T細胞或B細胞可藉由對CD44、CD62L、CD127(IL-7R)等之各自之陽性/陰性(+/-)或表現強度綜合地進行評價而加以確認，可根據人、小鼠等對象而適當地選擇測定何種CD。再者，於本案中，以下，有時亦將陽性記載為「+」，將陰性記載為「-」。
上述所謂「具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強」，係指於包含具有記憶功能之T細胞或B細胞之細胞群中，具有記憶功能之T細胞或B細胞之比率增加、或具有記憶功能之T細胞或B細胞之絕對數增加、或具有記憶功能之T細胞或B細胞之每一細胞之記憶功能增強。
上述所謂「對T細胞或B細胞誘導記憶功能」係指於包含初始T細胞或初始B細胞之細胞群中，藉由該初始T細胞或初始B細胞受到腫瘤抗原之刺激而獲得免疫記憶，以具有記憶功能之方式進行誘導，或於已具有記憶功能之T細胞或B細胞中，以其記憶功能進一步提高之方式進行誘導，或增加已具有記憶功能之T細胞或B細胞於體內之數量。具體而言，例如可列舉將初始T細胞誘導為中央記憶T細胞。
作為上述投予對象，可適當地列舉哺乳動物或哺乳動物細胞，該哺乳動物之中，可更適當地列舉人、小鼠、狗、大鼠、豚鼠、兔、鳥、綿羊、豬、牛、馬、貓、猴、黑猩猩，可尤其適當地列舉人。
作為上述「核酸傳遞介質」，只要為選自免疫活性細胞、病毒、厭氧性菌、脂質體、間葉系幹細胞(MSC)、奈米粒子之至少1種以上即可，可混合複數種而使用。
此處，作為上述免疫活性細胞，只要係參與免疫應答，且藉由導入編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸可表現IL-7及CCL19之細胞，則並無特別限制，較佳為自活體分離(採集)之免疫活性細胞，可列舉T細胞、自然殺手細胞(NK細胞)、B細胞等淋巴細胞系細胞、或單核細胞、巨噬細胞、樹狀細胞等抗原呈現細胞、或嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球、肥胖細胞等為粒細胞且經分離者，可適當地列舉自人、狗、貓、豬、小鼠等哺乳動物分離之T細胞、較佳為自人分離之T細胞。再者，作為上述所分離之T細胞，除T細胞以外亦可含有其他細胞，只要以50%以上、較佳為60%以上、更佳為70%以上、進而較佳為80%以上、最佳為90%之比率包含T細胞即可。又，T細胞可自浸潤於血液、骨腦脊髓液等體液、或脾臟、胸腺、淋巴結等組織、或原發腫瘤、轉移性腫瘤、癌性腹水等癌組織中之免疫細胞中分離出包含免疫活性細胞之細胞群而獲得。為了提高上述細胞群中所含之T細胞之比率，視需要亦可對所分離之上述細胞群依據慣例進而進行單離或純化而獲得。又，亦可使用利用ES細胞(embryonic stem cells，胚胎幹細胞)或iPS細胞(induced pluripotent stem cells，誘導性多功能幹細胞)而製作者。作為該T細胞，可列舉：α/β-T細胞、γ/Δ-T細胞、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、腫瘤浸潤T細胞、記憶T細胞、初始T細胞、NKT細胞。再者，免疫活性細胞之來源與投予對象可相同亦可不同，較佳為相同。進而，於投予對象為人之情形時，作為免疫活性細胞，可使用自作為投予對象之患者本人採集之自體細胞，亦可使用自他人採集之異體細胞。即，供體與接受者可一致亦可不一致，較佳為一致。
作為上述病毒，只要為可封入編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，且可於惡性腫瘤細胞中感染之病毒，則並無特別限制，較佳為腫瘤溶解性病毒。上述所謂腫瘤溶解性病毒(oncolytic virus)，係指具有即便於正常細胞中感染亦幾乎未增殖，但若於惡性腫瘤細胞中感染則進行增殖，且殺滅惡性腫瘤細胞(惡性腫瘤細胞毒殺)之能力之病毒，例如於Molecular Therapy、第18卷、第2號、2010年2月、233～234頁中進行了綜述。作為該腫瘤溶解性病毒，只要具有於惡性腫瘤細胞中感染並殺滅惡性腫瘤細胞之能力，則並無特別限定，可列舉：腫瘤溶解性痘瘡病毒、腫瘤溶解性腺病毒、腫瘤溶解性疱疹單純型病毒、腫瘤溶解性里奧病毒、腫瘤溶解性麻疹病毒、腫瘤溶解性新城雞瘟病毒、腫瘤溶解性痘瘡病毒、腫瘤溶解性腮腺炎病毒、腫瘤溶解性柯薩奇病毒等。又，作為上述腫瘤溶解性痘瘡病毒，可使用於Kim MK et al. Science Translational Medicine. 2013 May 15; 5 (185): 185ra63、Heo J, et al. Nature Medicine, 2013 (3): 329-36. doi: 10.1038/nm. 3089. Epub 2013 Feb 10.、國際公開第2012/094386號說明書中所記載者，但並不限定於此。又，作為上述腫瘤溶解性腺病毒，可使用於Tedcastle A et al. Mol Ther. 2016; 24: 796-804, Marinon, Illingworth S, Kodialbail P, Patel A, Calderon H, Lear R, Fisher KD, Champion BR, Brown ACN. PLoS One 2017; 12 (5): e0177810、Freedman JD, et al. EMBO Mol Med 9: 1067-1087 (2017)、Lang FF et al., Journal of Clinical Oncology (2018)、James M. et al. The Journal of Oncology, 188 (6): 2391-7, 2012、日本專利第3867968號公報及日本專利第5574284號公報中所記載者，但並不限定於此。又，作為上述腫瘤溶解性疱疹單純型病毒，可使用於Mazzacurati et al., Mol Ther, 2015 Jan; 23 (1): 99-107、Hirooka Y, et al. BMC Cancer 2018, 18, 596、Nakatake R, et al. Cancer Sci. 2018 Mar, 109 (3); 600-610.及Andtbacka RHI, et al. J Clin Oncol. 2015; 33: 2780-2788中所記載者，但並不限定於此。又，作為上述腫瘤溶解性里奧病毒，可使用於Mahalingam, et al, Cancers 2018, 10, 160中所記載者，但並不限定於此。又，作為上述腫瘤溶解性新城雞瘟病毒，可使用於Journal of Virology. 2016 Jun; 90 (11): 5343-5352.中所記載者，但並不限定於此。又，作為上述腫瘤溶解性水泡口炎病毒病病毒，可使用於Muik A. et al. Cancer Res; 74 (13); 3567-78.中所記載者，但並不限定於此。再者，腫瘤溶解性病毒亦存在附加有藉由基因改變而表現蛋白質之功能者，代替此種蛋白質，或此外亦可進而表現上述IL-7及CCL19。
作為上述厭氧性菌，只要為藉由向細胞內導入編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸而可表現IL-7及CCL19之厭氧性菌，則並無特別限制，較佳為具有於惡性腫瘤細胞中進行積聚之能力之厭氧性革蘭氏陽性菌，可列舉：雙歧桿菌等雙叉桿菌屬菌、乳桿菌屬菌、李氏菌屬菌。再者，已知厭氧性菌容易於氧較少之環境下生長，故而容易於惡性腫瘤細胞中進行積聚。
作為上述脂質體，只要為可於腫瘤細胞中封入編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，且由磷脂質雙層膜所構成之脂質奈米膠囊，則並無特別限制，該脂質體可藉由使用市售品或藉由常法進行合成而獲得。
作為上述MSC，只要為藉由向細胞內導入編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，可表現IL-7及CCL19，且具有於惡性腫瘤細胞中進行積聚之能力之MSC，則並無特別限制。
作為上述奈米粒子，只要為具有可向腫瘤細胞中傳遞編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸之能力，奈米等級、較佳為直徑5～800 nm之粒子體，則並無特別限制，可列舉金奈米粒子等金屬奈米粒子或二氧化矽奈米粒子。該奈米粒子可藉由使用市售品或藉由常法進行合成而獲得。
上述所謂「核酸傳遞介質具有向惡性腫瘤細胞之積聚能力」係指核酸傳遞介質於惡性腫瘤細胞中特異性地積聚之能力。具體而言，可列舉：a)核酸傳遞介質具有識別惡性腫瘤細胞之細胞表面分子之物質，藉由該物質之作用核酸傳遞介質於惡性腫瘤細胞中進行積聚之能力；或b)利用藉由腫瘤組織之血管壁形成有較正常組織之血管寬1位數以上之數百奈米之間隙之EPR(enhanced permeability and retention，通透性增強與滯留)效應，核酸傳遞介質向惡性腫瘤細胞積聚之能力。作為上述核酸傳遞介質識別惡性腫瘤細胞之細胞表面分子之物質，可列舉嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。該CAR或TCR可利用於上述專利文獻2、3中所記載者。因此，作為具有向惡性腫瘤細胞之積聚能力之核酸傳遞介質，可列舉CAR表現免疫活性細胞、或TCR表現免疫活性細胞。再者，所謂嵌合抗原受體(CAR)係使識別癌細胞之細胞表面抗原之單鏈抗體(scFv，single chain Fv)、與誘導T細胞之活化之訊號傳遞區域融合而成之人工嵌合蛋白。
上述所謂「於惡性腫瘤細胞中具有特異之增殖能力」，係指即便於正常細胞中感染亦幾乎未增殖，但若於惡性腫瘤細胞中感染則進行增殖之能力，例如可列舉腫瘤溶解性病毒所具有之於惡性腫瘤細胞中特異性地增殖之能力。因此，作為於惡性腫瘤細胞中具有特異之增殖能力之核酸傳遞介質，可列舉腫瘤溶解性病毒。
上述所謂「具有惡性腫瘤細胞毒殺能力」係指毒殺惡性腫瘤細胞而溶解或殺滅惡性腫瘤細胞之能力。再者，藉由溶解或殺滅惡性腫瘤細胞，而向惡性腫瘤細胞內之惡性腫瘤抗原進行了溶解或殺滅之細胞周邊釋出。
作為上述「識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子」，只要為於惡性腫瘤之細胞表面具有之識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子即可，可列舉嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。該CAR或TCR可利用於上述專利文獻2、3中所記載者。因此，作為具有識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子之免疫活性細胞，可列舉CAR表現免疫活性細胞、或TCR表現免疫活性細胞。
作為上述惡性腫瘤抗原，係指於惡性腫瘤細胞中高於正常細胞地表現或於惡性腫瘤細胞中特異性地表現之蛋白質、糖脂質等物質，作為該惡性腫瘤抗原，可列舉：腫瘤相關抗原或癌睾丸抗原、血管新生相關抗原、由基因變異所導致之惡性腫瘤新生抗原(新抗原)之表位肽，具體而言，可列舉：WT1、MART-1(Melanoma antigen recognized by T-cells 1，T細胞1識別之黑色素瘤抗原)、NY-ESO-1、MAGE(Melanoma-associated antigen，黑色素瘤抗原)-A1、MAGE-A3、MAGE-A4、磷脂醯肌醇蛋白聚糖(Glypican)-3、KIF(Kinesin superfamily，驅動蛋白超家族)20A、存活素(Survivin)、AFP-1(Alpha Fetal Protein-1，α-胎蛋白-1)、gp100、MUC1(mucin 1，黏蛋白1)、PAP(Prostatic Acid Phosphatase，前列腺酸性磷酸酶)-10、PAP-5、TRP(ty-rosinase related protein，酪胺酸酶相關蛋白)2-1、SART(T細胞識別之鱗狀細胞癌抗原)-1、VEGFR(Vascular Endothelial Growth Facotr Receptor，血管內皮生長因子受體)1、VEGFR2、NEIL3、MPHOSPH1、DEPDC1、FOXM1、CDH3、TTK、TOMM34、URLC10、KOC1、UBE2T、TOPK、ECT2、間皮素(MESOTHELIN)、NKG2D、P1A、5T4、B7-H6、BCMA(B cell maturation antigen，B細胞成熟抗原)、CD123、CD133、CD138、CD171、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD33、CD38、CD44、CEA、cMet、CS1、EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor，表皮生長因子受體)、EGFRvIII、EphA2、ErbB2、FAP(Fluorogen-activating protein，螢光團激活蛋白質)、FR-α、HER2 HER2(Human Epidermal Receptor 2，第二型人表皮生長因子受體)、IL13Ra2、MUC1、MUC16、NKG2D、PSCA(Prostate Stem Cell Antigen，前列腺幹細胞抗原)、PSMA(Prostate Specific Membrane Antigen，前列腺特異性膜抗原)、ROR1(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1，酪胺酸激酶樣孤兒受體-1)、TARP、DLL3、PRSS21、緊密連接蛋白(Claudin)18.2、緊密連接蛋白18、CAIX(Carbonic Anhydrase IX，碳酸酐酶IX)、L1-CAM、FAP-α、CTAG1B(Cancer/testis antigen 1B，癌症/睾丸抗原1B)、FR-α等蛋白質、或GD2、GM2等糖脂質。
於上述「包含核酸傳遞介質、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸」中亦包含於核酸傳遞介質中包含編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸之態樣。例如，於核酸傳遞介質為免疫活性細胞之情形時，只要於免疫活性細胞內包含編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸即可。又，編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸可為被組入至免疫活性細胞之基因組中之狀態，亦可為未被組入至基因組中之狀態(例如游離基因之狀態)。
於上述核酸傳遞介質為免疫活性細胞之情形時，藉由向該免疫活性細胞中導入編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，即，向免疫活性細胞中導入外源性之編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸(較佳為與啟動子之下游可作動地連結之外源性之編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸)，可製作本案增強劑或誘導劑或本案惡性腫瘤復發抑制劑。作為導入之方法，只要為向免疫活性細胞中導入DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)之方法即可，例如可列舉：電穿孔法(Cytotechnology, 3, 133 (1990))、磷酸鈣法(日本專利特開平2-227075號公報)、脂質體轉染法(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84, 7413 (1987))、病毒感染法等方法。作為該病毒感染法，可列舉將包含所導入之核酸之載體與包裝質體轉染至GP2-293細胞(TAKARA BIO公司製造)、Plat-GP細胞(Cosmo Bio公司製造)、PG13細胞(ATCC CRL-10686)、PA317細胞(ATCC CRL-9078)等包裝細胞中而製作重組病毒，並使T細胞感染該重組病毒之方法(上述專利文獻2)。
進而，於上述核酸傳遞介質為病毒之情形時，可向該病毒中導入編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，即，向病毒中導入外源性之編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸(較佳為與啟動子之下游可作動地連結之外源性之編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸)，而製作「具有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸且表現IL-7、及CCL19之病毒」。可使用該製作之病毒作為本案增強劑或誘導劑或本案惡性腫瘤復發抑制劑。
同樣地，於上述核酸傳遞介質為厭氧性菌、脂質體、或間葉系幹細胞(MSC)之情形時，亦可向該厭氧性菌、脂質體、或間葉系幹細胞(MSC)中導入編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，即，向厭氧性菌、脂質體、或間葉系幹細胞(MSC)中導入外源性之編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸(較佳為與啟動子之下游可作動地連結之外源性之編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸)，而製作「具有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸且表現IL-7、及CCL19之厭氧性菌、脂質體、或間葉系幹細胞(MSC)」。可使用該製作之厭氧性菌、脂質體、或間葉系幹細胞(MSC)作為本案增強劑或誘導劑或本案惡性腫瘤復發抑制劑。又，可使用上述「具有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸且表現IL-7、及CCL19之病毒」、「具有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸且表現IL-7、及CCL19之厭氧性菌」、「具有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸且表現IL-7、及CCL19之脂質體」、或「具有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸且表現IL-7、及CCL19之間葉系幹細胞(MSC)」作為惡性抑制腫瘤之增殖劑。
又，作為向免疫活性細胞中導入上述編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸之其他方法，亦可為使用公知之基因編輯技術，以可於免疫活性細胞中在適當之促進劑之控制下表現之方式，將編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸組入至細胞之基因組中之方法。作為公知之基因編輯技術，可例示使用鋅指核酸酶、TALEN(Transcription activator-like effector nucleases，類轉錄活化因子核酸酶)、CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat，成簇規律間隔短回文重複序列)-Cas系統等核酸內切酶之技術。
於製作「含有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，且具有CAR作為識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子之免疫活性細胞，即，含有編碼CAR、IL-7、及CCL19之核酸且表現CAR、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞」作為本案增強劑或誘導劑、或本案惡性腫瘤復發抑制劑之情形時，可藉由以下中之任一種方法而製作。
(1)將含有編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸且表現IL-7及CCL19之載體、及含有編碼CAR之核酸且表現CAR之載體之2種同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(2)將含有編碼CAR之核酸與編碼IL-7之核酸且表現CAR與IL-7之載體、及含有編碼CAR之核酸與編碼CCL19之核酸且表現CAR與CCL19之載體之2種同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(3)將含有編碼CAR之核酸與編碼IL-7之核酸且表現CAR與IL-7之載體、及含有編碼IL-7之核酸與編碼CCL19之核酸且表現IL-7與CCL19之載體之兩種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(4)將含有編碼CAR之核酸與編碼CCL19之核酸且表現CAR與CCL19之載體、及含有編碼IL-7之核酸與編碼CCL19之核酸且表現IL-7與CCL19之載體之兩種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(5)將含有編碼CAR之核酸與編碼IL-7之核酸且表現CAR與IL-7之載體、及含有編碼CCL19之核酸且表現CCL19之載體之兩種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(6)將含有編碼CAR之核酸與編碼CCL19之核酸且表現CAR與CCL19之載體、及含有編碼IL-7之核酸且表現IL-7之載體之兩種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(7)將含有編碼CAR之核酸且表現CAR之載體、含有編碼IL-7之核酸且表現IL-7之載體、及含有編碼CCL19之核酸且表現CCL19之載體之3種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
同樣地，於製作「含有編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，且具有TCR作為識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子之免疫活性細胞，即，含有TCR、IL-7、及編碼CCL19之核酸，且表現TCR、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞」作為本案增強劑或誘導劑、或本案惡性腫瘤復發抑制劑之情形時，可藉由以下中之任一種方法而製作。
(1)將含有編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸且表現IL-7及CCL19之載體、及含有編碼TCR之核酸且表現TCR之載體之兩種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(2)將含有編碼TCR之核酸與編碼IL-7之核酸且表現TCR與IL-7之載體、及含有編碼TCR之核酸與編碼CCL19之核酸且表現TCR與CCL19之載體之兩種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(3)將含有編碼TCR之核酸與編碼IL-7之核酸且表現TCR與IL-7之載體、及含有編碼IL-7之核酸與編碼CCL19之核酸且表現IL-7與CCL19之載體之兩種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(4)將含有編碼TCR之核酸與編碼CCL19之核酸且表現TCR與CCL19之載體、及含有編碼IL-7之核酸與編碼CCL19之核酸且表現IL-7與CCL19之載體之兩種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(5)將含有編碼TCR之核酸與編碼IL-7之核酸且表現TCR與IL-7之載體、及含有編碼CCL19之核酸且表現CCL19之載體之兩種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(6)將含有編碼TCR之核酸與編碼CCL19之核酸且表現TCR與CCL19之載體、及含有編碼IL-7之核酸且表現IL-7之載體之兩種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
(7)將含有編碼TCR之核酸且表現TCR之載體、含有編碼IL-7之核酸且表現IL-7之載體、及含有編碼CCL19之核酸且表現CCL19之載體之3種載體同時或階段性地向免疫活性細胞中導入之方法；
進而，於製作上述「表現TCR、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞」之情形時，亦可預先製備於所需之腫瘤抗原中表現特異之TCR之免疫活性細胞，並使用該TCR表現免疫活性細胞，藉由以下中之任一種方法而製作。
(1)將含有編碼IL-7之核酸及編碼CCL19之核酸且表現IL-7及CCL19之載體導入至上述TCR表現免疫活性細胞中之方法；
(2)將含有編碼IL-7之核酸且表現IL-7之載體、及含有編碼CCL19之核酸且表現CCL19之載體之2種同時或階段性地導入至上述TCR表現免疫活性細胞中之方法；
除此以外，可製作「表現CAR、TCR、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞」作為本案增強劑或誘導劑、或本案惡性腫瘤復發抑制劑。具體而言，可列舉：以於上述「製作表現CAR、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞之情形」中所記載之各載體之全部或任一者中，進而包含編碼TCR之核酸且亦表現TCR之方式進行製作之方法；或以於上述「製作表現TCR、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞之情形」中所記載之各載體之全部或任一者中，進而包含編碼CAR之核酸且亦表現CAR之方式進行製作之方法；或向上述「TCR表現免疫活性細胞」中，導入上述「製作表現CAR、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞之情形」中所記載之各載體而進行製作之方法。
進而，於本案增強劑或誘導劑、或本案惡性腫瘤復發抑制劑中，於在免疫活性細胞中具有CAR之情形時，可製作「表現識別不同之惡性腫瘤抗原之複數種、較佳為兩種CAR之免疫活性細胞」。具體而言，可列舉以於上述「製作表現CAR、IL-7、及CCL19之免疫活性細胞之情形」中所記載之各載體中，包含編碼識別不同之惡性腫瘤抗原之複數種、較佳為兩種CAR之核酸且表現複數種、較佳為兩種CAR之方式進行製作之方法。尤其是若例如製作含有編碼識別惡性腫瘤抗原X之CAR之核酸及編碼IL-7之核酸且表現識別惡性腫瘤抗原X之CAR及IL-7之載體、與含有編碼識別惡性腫瘤抗原Y之CAR之核酸及編碼CCL19之核酸且表現識別惡性腫瘤抗原Y之CAR及CCL19之載體並導入至免疫活性細胞中，則於具有X及Y作為惡性腫瘤抗原之細胞之周邊分泌IL-7與CCL19，可進一步提高腫瘤特異性。
再者，於上述核酸傳遞介質為免疫活性細胞、病毒、厭氧性菌、或間葉系幹細胞之情形時，可使用如下者，其係培養免疫活性細胞、病毒、厭氧性菌、或間葉系幹細胞而獲得之培養物，且含有該免疫細胞。
作為上述惡性腫瘤復發抑制劑中之「惡性腫瘤復發」，係指於藉由通常之化學療法、輻射療法、或外科療法等進行惡性腫瘤治療後再次產生惡性腫瘤。作為該惡性腫瘤復發，較佳為對由核酸傳遞介質向惡性腫瘤細胞之積聚能力、或於惡性腫瘤細胞中之特異之增殖能力具有抗性之惡性腫瘤細胞引起之復發。
此處，所謂「由對向惡性腫瘤細胞之積聚能力具有抗性之惡性腫瘤細胞引起之復發」，例如可列舉如下惡性腫瘤復發：核酸傳遞介質為具有識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子之免疫活性細胞，且惡性腫瘤復發係由不具有細胞表面分子特異性地識別之惡性腫瘤抗原、或失去細胞表面分子特異性地識別之惡性腫瘤抗原之惡性腫瘤細胞引起。又，所謂「由對核酸傳遞介質於惡性腫瘤細胞中之特異之增殖能力具有抗性之惡性腫瘤細胞引起之復發」，例如可列舉由對由惡性腫瘤溶解性病毒所引起之感染不具有敏感性、或對由惡性腫瘤溶解性病毒所引起之感染失去敏感性之惡性腫瘤細胞引起之腫瘤復發。該「由對向惡性腫瘤細胞之積聚能力具有抗性之惡性腫瘤細胞引起之復發」例如可藉由調查復發之組織之惡性腫瘤細胞中之惡性腫瘤抗原而加以確認。
上述惡性腫瘤復發抑制劑係用於向具有進行了免疫治療之惡性腫瘤之對象投予。為了長期之復發抑制，亦可用於自進行了免疫治療之日起100天以後向具有進行了免疫治療之惡性腫瘤之對象投予。
本案增強劑或誘導劑、或本案惡性腫瘤復發抑制劑可含有藥學上所容許之添加劑。進而，可包含用以用作本案增強劑或誘導劑、或本案惡性腫瘤復發抑制劑之說明書。又，亦可於本案增強劑或誘導劑、或本案惡性腫瘤復發抑制劑中含有藥學上所容許之添加劑而製成醫藥組合物。以下，亦將「含有本案增強劑與藥學上所容許之添加劑之醫藥組合物」、「含有本案誘導劑與藥學上所容許之添加劑之醫藥組合物」、及「含有本案惡性腫瘤復發抑制劑與藥學上所容許之添加劑之醫藥組合物」合稱為「本案醫藥組合物」。作為上述添加劑，可列舉：生理鹽水、緩衝生理鹽水、細胞培養基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇及該等之組合、穩定劑、助溶劑及界面活性劑、緩衝劑及防腐劑、等張劑、填充劑、以及潤滑劑。
本案增強劑或誘導劑、本案惡性腫瘤復發抑制劑、或本案醫藥組合物可使用本領域業者所已知之方法，向需要惡性腫瘤之治療或復發抑制之受檢體投予，作為投予方法，可列舉向靜脈內、腫瘤內、皮內、皮下、肌內、腹腔內、動脈內、髓內、心臟內、關節內、黏液囊內、顱內、脊椎內、及蛛網膜下(腦脊髓液)之注射。
本案增強劑或誘導劑、本案惡性腫瘤復發抑制劑、或本案醫藥組合物可列舉1天4次、3次、2次或1次、每隔1天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、每週1次、每隔7天、每隔8天、每隔9天、每週2次、每月1次或每月2次獨立地投予之方法。
本案增強劑或誘導劑、本案惡性腫瘤復發抑制劑、或本案醫藥組合物之投予量可根據受驗體之年齡、性別、健康、及體重等而適當決定。例如，於核酸傳遞介質為免疫活性細胞之情形時，對人類成人，可列舉體重每1 kg投予1×103 ～1×109 個、較佳為1×104 ～1×108 個、更佳為1×105 ～1×107 個。又，於核酸傳遞介質為腫瘤溶解性病毒之情形時，對人類成人，可列舉每次投予約102 ～1010 個噬菌斑形成單位(PFU)、較佳為105 ～106 個噬菌斑形成單位(PFU)。
作為本說明書中之惡性腫瘤，可為固形惡性腫瘤，亦可為血液惡性腫瘤，除神經膠質瘤、黑色素瘤、惡性間皮瘤、腺癌、鱗狀細胞癌、腺鱗狀細胞癌、未分化癌、大細胞癌、小細胞癌、皮膚癌、甲狀腺癌、乳癌、前列腺癌、膀胱癌、陰道癌、頭頸部癌、頸部癌、子宮癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、脾癌、肺癌、氣管癌、支氣管癌、大腸癌、結腸癌、小腸癌、胃癌、食道癌、膽道癌、膽囊癌、睾丸癌、卵巢癌、腦腫瘤等癌、或骨組織、軟骨組織、脂肪組織、肌肉組織、血管組織及造血組織之癌以外，可列舉：軟骨肉瘤、尤因氏肉瘤、惡性血管內皮瘤、惡性神經鞘瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤等肉瘤、或肝胚細胞瘤、神經管胚細胞瘤、腎胚細胞瘤、神經胚細胞瘤、胰腺胚細胞瘤、胸膜肺胚細胞瘤、視網膜胚細胞瘤等胚細胞瘤、或胚細胞腫瘤、或淋巴瘤、或白血病、骨髓瘤。
本案增強劑或誘導劑、本案惡性腫瘤復發抑制劑、或本案醫藥組合物可與其他抗腫瘤劑併用而使用。又，可將使用本案增強劑或誘導劑、本案惡性腫瘤復發抑制劑、或本案醫藥組合物之方法與利用輻射之癌症治療法組合。作為上述其他抗腫瘤劑，可列舉：環磷醯胺、苯達莫司汀、異環磷醯胺、達卡巴等烷基化藥；噴司他丁、氟達拉濱、克拉屈濱、甲胺喋呤、5-氟尿嘧啶、6-巰基嘌呤、依諾他濱等代謝拮抗劑；利妥昔單抗、西妥昔單抗、曲妥珠單抗等分子靶向藥；伊馬替尼、吉非替尼、埃羅替尼、阿法替尼、達沙替尼、舒尼替尼、曲美替尼等激酶抑制劑；硼替佐米等蛋白酶體抑制劑；環孢靈、他克莫司等鈣調神經磷酸酶抑制劑；艾達黴素、多柔比星絲裂黴素C等抗癌性抗生素；伊立替康、依託泊苷等植物生物鹼；順鉑、奧沙利鉑、卡鉑等鉑製劑；他莫昔芬、比卡魯胺(Bicalutamide)等激素療法藥；干擾素、納武單抗、派姆單抗等免疫控制藥。
作為上述併用本案增強劑或誘導劑、本案惡性腫瘤復發抑制劑、或本案醫藥組合物與其他抗癌劑而使用之方法，可列舉：使用其他抗癌劑進行處理，其後使用本案增強劑或誘導劑、本案惡性腫瘤復發抑制劑、或本案醫藥組合物之方法；或同時使用本案增強劑或誘導劑、本案惡性腫瘤復發抑制劑、或本案醫藥組合物與其他抗癌劑之方法；或使用本案增強劑或誘導劑、本案惡性腫瘤復發抑制劑、或本案醫藥組合物進行處理，其後使用其他抗癌劑之方法。又，於併用本案增強劑或誘導劑、本案惡性腫瘤復發抑制劑、或本案醫藥組合物與其他抗癌劑之情形時，癌之治療效果進一步提高，並且藉由減少各者之投予次數或投予量，可減少由各者所引起之副作用。
關於在本說明書中所引用之學術文獻、專利申請等參考文獻，其整體係與分別具體地記載者相同程度地於本說明書中作為參考而加以引用。
[實施例]
以下，藉由實施例更具體地說明本發明，但本發明之技術範圍並不限定於該等例示。
(表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞及表現抗人CD20 CAR之T細胞之製作)
於下述實施例中所使用之「表現抗人CD20 CAR、小鼠IL-7、及小鼠CCL19之T細胞(表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞：於以下之實施例或圖式中亦稱為「7×19」)」及「表現抗人CD20 CAR之T細胞：於以下之實施例或圖式中亦稱為「Conv.」)」係依據上述專利文獻3及Tamada等人之文獻(Nature Biotechnology doi: 10.1038/nbt.4086)中所記載之方法而製作。以下，簡潔地記載製作方法。再者，上述「表現抗人CD20 CAR、小鼠IL-7、及小鼠CCL19之T細胞」係具有抗人CD20 CAR作為識別惡性腫瘤細胞抗原之細胞表面分子之T細胞，包含編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸。
關於表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞，首先，預先製作含有編碼抗人CD20 CAR之核酸、編碼小鼠IL-7之核酸、及編碼小鼠CCL19之核酸且表現抗人CD20 CAR、IL-7及CCL19之pMSGV載體。其次，向自CD90.1陽性(CD90.1+ )、CD90.2陰性(CD90.2- )之同基因型小鼠(Bar Harbor公司製造)之脾臟及淋巴結，使用Pan T Cell Isolation Kit II(Miltenyi Biotec公司製造)自小鼠活體分離之小鼠T細胞中使用反轉錄病毒導入該載體而製作。另一方面，表現抗人CD20 CAR之T細胞係預先製作表現抗人20 CAR之pMSGV載體，向上述分離之小鼠T細胞中使用反轉錄病毒導入該載體而製作。再者，無基因導入之上述分離之小鼠T細胞(non-transducted T cells)於以下之實施例或圖式中亦稱為「non-transducted」。此處，如上所述，為了向分離之小鼠T細胞中導入編碼抗人CD20 CAR之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸，使用作為反轉錄病毒載體之pMSGV載體。因此，於培養上述導入有各核酸之小鼠T細胞而進行增殖之情形時，亦存在於小鼠T細胞質內包含反轉錄病毒載體者，但多數係於小鼠T細胞中，將編碼抗人CD20 CAR之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸組入至基因組中。於在小鼠T細胞中，將編碼抗人CD20 CAR之核酸、編碼IL-7之核酸、及編碼CCL19之核酸組入至基因組中之情形時，抗人CD20 CAR、IL-7、及CCL19係利用所導入之外來之重組構建物表現。
T細胞之培養係使用添加有10%胎牛血清(FCS，Fetal calf serum)、100 U/mL之青黴素、100 μg/mL之鏈黴素、50 μM之2巰基乙醇、25 mM之HEPES(hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid，羥乙基哌乙磺酸)、2 mM之L-麩醯胺之RPMI-1640培養基。
[實施例1]
＜T細胞之存在＞
為了調查表現CAR-IL-7/CCL19之T細胞之抗腫瘤效果，調查於腫瘤組織中，源自宿主(受體(recipient))之內源性T細胞是否與所投予之供體T細胞同樣地浸潤於腫瘤組織。首先，向7-10週齡之C57BL/6小鼠(SLC公司製造)皮下接種2.5×106 個3LL-hCD20(以表現人CD20之方式進行了基因重組之源自小鼠肺癌之細胞3LL)(第0天)。其後於第7天腹腔內投予作為抗癌劑之環磷醯胺(CPA：100 mg/kg)。於第10天靜脈內投予由CD90.1陽性(CD90.1+ )、CD90.2陰性(CD90.2- )同基因型小鼠產生之1×106 個上述表現抗人CD20 CAR之T細胞、上述表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞、或無基因導入之上述分離之小鼠T細胞。於第19天自小鼠摘除腫瘤組織。於初次染色中，使用進行了生物素標記之抗CD90.1抗體(clone OX-7 BioLegend公司製造：與供體T細胞結合)及抗CD3抗體(clone 17A2：Tonbo biosciences公司製造：與供體T細胞及接受者之內源性T細胞之兩者結合)之組合，並使用Alexa Fluor488接合抗生蛋白鏈菌素(Thermo Fisher Scientific公司製造：綠色)及Alexa Fluor647接合抗大鼠IgG(Immunoglobulin G，免疫球蛋白G)2b(Abcam公司製造：紅色)作為第二次染色。核係利用DAPI(diamidino-phenyl-indole，二脒基苯基吲哚)(Thermo Fisher Scientific公司製造：藍色)進行染色。利用顯微鏡之觀察係以400倍進行。將結果示於圖1(a)。藉由第二次染色，進行了生物素標記之抗CD90.1抗體所結合之細胞顯示為綠色，抗CD3抗體所結合之細胞顯示為紅色，故而作為供體T細胞之表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞顯示為黃色(綠色＋紅色：CD90.1+ ＋CD3+ )，接受者之內源性T細胞為紅色(CD90.1- ＋CD3+ )，但於圖1(a)中係以灰度表示。
又，將使用Hybrid Cell Count program(KEYENCE公司製造)對利用圖1(a)標記之各陽性區域進行定量所得之結果示於圖1(b)。圖1(b)中，黑柱表示接受者(主體)之內源性T細胞(圖1(a)右圖中之紅色)之面積，白柱表示所投予之供體T細胞(圖1(a)右圖中之黃色)之面積。根據圖1(a)、(b)表明，於投予表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞之情形時，不僅所投予之T細胞，接受者(主體)之內源性T細胞於腫瘤局部之積聚亦增強，換言之，藉由於腫瘤局部分泌IL-7及CCL19，內源性T細胞於腫瘤局部之積聚亦增強。
[實施例2]
＜抗腫瘤效果中之T細胞之參與＞
對C57BL/6小鼠皮下接種2.5×106 個3LL-hCD20(第0天)。其後於第3天靜脈內投予由CD90.1陽性(CD90.1+ )、CD90.2陰性(CD90.2- )同基因型小鼠產生之1×106 個表現抗人CD20 CAR之T細胞(Conventional：Conv.)或表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞(7×19)。自第1天起2次/週左右腹腔內投予抗CD90.2抗體(anti-CD90.2：使用本發明者等人購自ATCC(American Type Culture Collection，美國菌種保存中心)之融合瘤而製作)，其為針對於內源性T細胞中表現之CD90.2(Thy1.2)之抗體。關於投予量，最初之2次係設為1 mg/小鼠，其後係設為0.5 mg/小鼠。將各群(n＝5)之第14天之腫瘤體積之mean±SD示於圖2。○表示各小鼠之值。
如圖2所示，於投予表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞之情形時，抑制惡性腫瘤之增殖，抗腫瘤效果極高，腫瘤消失，但藉由投予抗CD90.2抗體，抗腫瘤效果降低50%左右。因此，明確接受者之內源性T細胞亦參與表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞之抗腫瘤效果，換言之，關於表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞之抗腫瘤效果，不僅表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞本身，接受者之內源性之T細胞亦較大地參與。
[實施例3]
＜接受者之內源性T細胞之記憶化＞
對利用表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞進行之供體之CAR-T細胞及內源性T細胞之記憶功能獲得及具有記憶功能之細胞之增加，利用作為記憶細胞之標記物之CD44及CD62L進行評價。
對C57BL/6小鼠皮下接種2.5×106 個3LL-hCD20(第0天)。其後於第3天靜脈內投予由CD90.1陽性(CD90.1+ )、CD90.2陰性(CD90.2- )同基因型小鼠產生之1×106 個上述表現抗人CD20 CAR之T細胞(Conv.)或上述表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞(7×19)。於第28天採集脾臟細胞而用於以下之分析中。
供體T細胞係利用CD90.1陽性細胞(CD90.1+ )進行鑑定，接受者T細胞係利用CD90.2陽性細胞(CD90.2+ )進行鑑定。CD4陽性及CD8陽性T細胞中之記憶T細胞標記物(CD44及CD62L)及CAR之表現係利用流式細胞儀進行。點陣圖或直方圖之數值表示表示各閘中之細胞之比率。將結果示於圖3。
又，藉由IFN-γ之生產調查記憶化之功能、即對於刺激之反應性獲得。首先，將於第28天採集之脾臟細胞與利用絲裂黴素C(Kyowa Hakko Kirin公司製造)於37℃下處理90分鐘所得之3LL-hCD20或未表現hCD20之其母株3LL共同培養並進行刺激。IFN-γ之生產係藉由細胞內細胞介素染色進行調查。將結果示於圖4。圖4中，(a)之直方圖中之數值表示CD90.1陽性供體T細胞中之IFN-γ陽性細胞之比率。圖4中，(b)表示利用流式細胞儀檢測CD90.2陽性之內源性CD8陽性T細胞中之IFN-γ陽性細胞之結果。點陣圖之數值表示各4象限中之細胞之比率。
如圖3所示，於投予表現抗人CD20 CAR之T細胞(Conv.)之情形時，於CD90.2閘細胞(接受者之內源性T細胞)中，中央記憶T細胞(作為記憶T細胞標記物之CD44陽性及CD62L陽性細胞)於CD4陽性細胞中為5.5%，於CD8陽性細胞中為24.8%。另一方面，於投予表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞(7×19)之情形時，於CD90.2閘細胞(接受者之內源性T細胞)中，中央記憶T細胞於CD4陽性細胞中為6.76%，於CD8陽性細胞中為49.2%，中央記憶T細胞之比率均增加。因此，明確藉由投予表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞(7×19)，即自一個細胞分泌IL-7與CCL19，而使接受者之內源性T細胞活化，並且將接受者之內源性T細胞分化誘導為中央記憶T細胞，可增加中央記憶T細胞之數量，並且增加脾臟細胞群中之中央記憶T細胞之比率。換言之，明確表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞可用作投予對象中之具有記憶功能之T細胞之誘導劑、或投予對象中之具有記憶功能之T細胞之增強劑。
另一方面，確認到於CD90.1閘細胞(供體T細胞)中，中央記憶T細胞於CD4陽性細胞中為75.8%，於CD8陽性細胞中為90.7%，供體T細胞本身亦被誘導為中央記憶T細胞。再者，於Conv.中CD90.1閘細胞為0%，未檢測到CD90.1陽性細胞(n.d.)之原因在於，於Conv.中未表現IL-7與CCL19，表現CAR之T細胞之生存率較低。
進而，如圖4所示，藉由3LL之刺激，於供體細胞中於CD4陽性細胞中90.5%生產IFN-γ，於CD8陽性細胞中93.6%生產IFN-γ。又，於接受者之內源性T細胞(無CAR-T表現)中，於CD4陽性細胞中於Conv.中亦為0.957%，相對於此，於7×19中高達14.9%之細胞生產IFN-γ。因此，明確藉由利用表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞分泌IL-7與CCL19，供體T細胞及接受者細胞中之任一者均藉由刺激生產IFN-γ，而獲得記憶功能。
[實施例4]
＜T細胞受體之基因表現模式之變化＞
為了調查T細胞之表位多樣性，調查表現CAR-IL-7/CCL19之T細胞之處理前後之T細胞受體(TCR)譜之變化。向DBA/2小鼠(n＝5)皮下接種5×105 個P815-hCD20(以表現人CD20之方式進行了基因重組之小鼠肥胖細胞瘤P815)(第0天)。其後於第10天向靜脈內投予環磷醯胺(CPA：100 mg/kg)及1×106 個表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞而治療腫瘤。自P815腫瘤細胞投予起於第140天自藉由上述方式腫瘤得到治療而根治之小鼠(腫瘤排斥小鼠：Tumor-rejected mice)採集脾臟細胞，為了使利用細胞分選儀(SH800：Sony公司製造)分選之CAR陽性T細胞或CAR陰性T細胞增殖，與P815-hCD20或未表現hCD20之母株(hCD20陰性：hCD20- )P815一起培養4天。其後，為了進行TCR譜分析，利用流式細胞儀分選CD8陽性且CAR陽性(CD8+ CAR+ )或CD8陽性且CAR陰性(CD8+ CAR- )群。作為對照，分選出向小鼠投入前之CD8陽性且CAR陽性、或CD8陽性且CAR陰性群。TCR譜係利用下一代核酸定序儀進行分析，並利用3-D圖表示α及β鏈中之V及J區域之使用頻度。將結果示於圖5A-D、圖6A-D。圖5A-D為α鏈，圖6A-D為β鏈，又，圖5A、B、圖6A、B為各細胞投入前，圖5C、D、圖6C、D為各細胞投入後。圖中之左上之數值表示利用1-Pielou均勻度指數(數值越高表示多樣性越低(a higher number indicates a less diversity))算出之多樣性指數(diversity indexes)，且數值越低表示多樣性越高。
再者，T細胞受體係於T細胞之細胞膜上表現之抗原受體分子。已知其係以包含α鏈與β鏈、或γ鏈與δ鏈之異型二聚物之形式存在，藉由識別與主要組織相容性基因複合體(MHC)分子結合之抗原分子，而將T細胞活化。
根據圖5A-D、圖6A-D中之多樣性指數可明確，α鏈、β鏈之任一者均藉由投予表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞而多樣性指數值增加。因此，不僅所投予之表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞，接受者之內源性T細胞之TCR之多樣性亦降低，根據在腫瘤局部分泌IL-7及CCL19，並且破壞腫瘤細胞，可知被認為對腫瘤抗原具有記憶功能之T細胞選擇性地增加。
[實施例5]
＜腫瘤之復發抑制-1＞
藉由以下之方法進行利用動物之癌復發模型。首先，於利用表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞進行了處理之小鼠中，調查接受者T細胞之腫瘤特異性記憶應答。對7-10週齡之患癌小鼠(DBA/2：n＝4：SLC公司製造)皮下接種5×105 個P815-hCD20。其後於第10天向腹腔內投予作為抗癌劑之環磷醯胺(CPA：100 mg/kg)。於第14天，向靜脈內接種1×106 個表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞。對在接種P815-hCD20後第140天腫瘤得到治療而根治之小鼠(tumor-rejected mice)或對照之初始小鼠(naive mice)，於左右之側腹分別接種P815-hCD20或未表現hCD20之母株P815。腫瘤之體積係2次/週進行測定。將結果示於圖7A。又，使用接種有3LL-hCD20或未表現hCD20之母株3LL代替上述P815-hCD20的C57BL/6小鼠而進行同樣之分析。將結果示於圖7B。再者，由於母株P815及3LL不表現人CD20，故而成為不具有表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞之細胞表面分子特異性地識別之惡性腫瘤抗原的惡性腫瘤細胞。
圖7A中之橫軸對於初始小鼠，係最初投予P815-hCD20或P815之日(0天)起之天數，對於腫瘤得到治療而根治之小鼠中，係最初接種P815-hCD20後第140天再次接種P815-hCD20之日(0天)起之天數。又，圖7B中之橫軸對於初始小鼠，係最初接種3LL-hCD20或3LL之日(0天)起之天數，對於腫瘤得到治療而根治之小鼠，係再次接種3LL-hCD20之日(0天)起之天數。圖7A、7B中之縱軸為腫瘤之體積(mm3 )。
如圖7A、7B之下段所示，於對腫瘤得到治療而根治之小鼠(tumor-rejected mice)接種P815-hCD20或3LL-hCD20之情形時，未形成腫瘤。即，明確藉由利用表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞治療腫瘤，可抑制由具有CAR所識別之抗原之腫瘤細胞引起之腫瘤之復發。進而，令人驚訝的是，如圖7A、7B之上段所示，於對腫瘤得到治療而根治之小鼠接種細胞表面不具有CD20之母株P815或3LL之情形時，腫瘤之形成與初始小鼠相比明顯得以抑制。即，明確藉由利用表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞進行處理，亦可抑制由不具有CAR所識別之抗原之腫瘤細胞引起之腫瘤之形成，換言之，亦可抑制由不具有CAR所識別之抗原之腫瘤細胞引起之腫瘤復發。就CAR-T細胞之靶分子特異性反應性之觀點而言，意料之外的是如上所述藉由投予表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞，而對投予對象之免疫功能造成影響，投予對象亦長期地持續排斥未表現CAR之靶抗原之母株之腫瘤，抑制復發。若對照上述實施例4中之T細胞受體之基因表現模式之變化結果，則認為藉由投予表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞，而產生腫瘤細胞之破壞，作為其結果，接受者之內源性T細胞對腫瘤細胞本來具有之腫瘤抗原進行反應，誘導長期之記憶功能。即，認為藉由投予表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞，而破壞腫瘤細胞，並且於腫瘤局部分泌IL-7及CCL19，藉此極有效率地誘導表位擴展(Epitope Spreading)現象，誘導及增強記憶功能，藉此抑制惡性腫瘤之復發。再者，於上述癌復發模型中，最初於皮下接種P815-hCD20、P815、3LL-hCD20、及3LL，並於第140天於左右之側腹分別接種上述各細胞。因此，認為藉由投予表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞，不僅抑制惡性腫瘤之復發，亦抑制惡性腫瘤之轉移。因此，認為表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞亦可用作「惡性腫瘤轉移抑制劑」。
[實施例6]
＜腫瘤之復發抑制-2＞
為了確認腫瘤之復發抑制效果，向小鼠投予人惡性胸膜間皮瘤細胞株而形成腫瘤，其後調查由表現抗人間皮素CAR-IL-7/CCL19之T細胞之投予之有無所引起之143天之腫瘤復發之有無。將具體之實驗方案示於如圖8。又，如圖8中之「ACC-MESO1-GFP-Luc」、「表現抗間皮素CAR之T細胞」、「表現抗間皮素CAR之T細胞」之製備方法、T細胞之活化方法係如下所述。
(ACC-MESO1-GFP-Luc株之製作)
向由愛知縣癌症中心研究所 關戶好孝先生分讓之作為間皮素陽性腫瘤細胞株之人惡性間皮瘤細胞株ACC-MESO1中，使用慢病毒進行綠色螢光蛋白質-螢光素酶(GFP-Luc)之基因導入。
於第0天向96孔板上以1×103 cells/well接種ACC-MESO1。培養基係使用添加有10%FBS之RPMI1640(Gibco公司製造)。於第1天以MOI(multiple of infection，感染複數) 100添加作為發光細胞製作用慢病毒粒子之RediFect Red-FLuc-GFP(PerkinElmer公司製造)而開始轉導。此時為了提高基因導入效率，以最終濃度成為4 μg/mL之方式將海美溴銨(Hexadimethrine Bromide)(Sigmα-aldrich公司製造)添加至培養基中。於病毒添加24小時後(第2天)，去除包含病毒之培養基而進行培養基之更換。繼續培養後，利用SH800(SONY公司製造)僅分選表現GFP(Green Fluorescent Protein，綠色螢光蛋白)之細胞，而製成ACC-MESO1-GFP-Luc株。
(表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞、及表現抗人間皮素CAR之T細胞之製作)
表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞、及表現抗人間皮素CAR之T細胞(習知之表現CAR之T細胞)係基於日本專利特願2017-247109號及國際公開第2016/056228號說明書中所記載之方法而製作。若簡潔地進行記載，則製作依序具備包含序列編號3所示之重鏈可變區之胺基酸序列、序列編號4所表示之連接子之胺基酸序列及序列編號5所表示之輕鏈可變區之胺基酸序列之抗人間皮素單鏈抗體、人CD8跨膜區及人CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊號結構組元之第3代CAR構建物(序列編號6)。製作於該構建物之C末端依序具備序列編號1所表示之人IL-7、繼其後之序列編號7所表示之源自小核糖核酸病毒之2A肽(F2A)、序列編號2所表示之人CCL19、及源自疱疹病毒之胸苷激酶基因(HSV-tk)之構建物，並插入pMSGV1反轉錄病毒表現載體(Tamada k et al., Clin Cancer Res 18: 6436-6445 (2002))中而製作表現人IL-7/CCL19及HSV-tk之pMSGV1反轉錄病毒表現載體。利用反轉錄病毒將所獲得之pMSGV1反轉錄病毒表現載體導入至小鼠T細胞中而製作表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞。同樣地，代替上述表現人IL-7/CCL19及HSV-tk之pMSGV1反轉錄病毒表現載體，利用反轉錄病毒將表現依序具備上述抗人間皮素單鏈抗體、人CD8跨膜區及人CD28-4-1BB-CD3ζ細胞內訊號結構組元之第3代CAR構建物之pMSGV1反轉錄病毒表現載體導入至小鼠T細胞中而製作表現抗人間皮素CAR之T細胞(習知之表現抗人間皮素CAR之T細胞)。訊息肽係使用序列編號8所表示之訊息肽。
(T細胞之活化)
利用使RetroNectin 25 μL/mL(TAKARA BIO公司製造)、與抗人CD3單株抗體5 μg/mL(invitrogen公司製造、5 μg/mL)固相化所得之細胞培養用6孔板，將於第0天自健康人供體採集之2×106 個末梢血單核細胞與IL-2 200 IU/mL(Peprotech公司製造)一併於37℃下利用5%CO2 培養箱開始培養。培養液係使用向OpTmizer CTS(Gibco公司製造)中添加有L-麩醯胺2 mM(Gibco公司製造)、1%青黴素-鏈黴素(和光純藥工業公司製造)及兩性黴素2.5 μg/mL(Bristol-Myers Squibb公司製造)者。培養3天，於顯微鏡下確認於第3天T細胞進行活化而產生形態變化。
(腫瘤之復發觀察)
首先，於第0天對8週齡之雌NSG免疫缺陷小鼠以2×106 cells/mouse胸腔內投予上述ACC-MESO1-GFP-Luc。於第1天使用體內成像系統(IVIS，in vivo imaging system)確認於胸腔內之腫瘤存活。於第1天使利用健康供體之末梢血單核細胞(PBMC，Peripheral Blood Mononuclear Cells)製作並冷凍保存之上述習知之表現CAR之T細胞、表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞、及藉由上述方法進行了活化之T細胞解凍。上述習知之表現抗人間皮素CAR之T細胞與上述表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞之CAR表現率分別為49.6%、32.5%，故而於向習知之表現抗人間皮素CAR之T細胞中添加上述活化T細胞並將兩者之CAR表現率合計後，準備投予1×105 個細胞之上述習知之表現抗人間皮素CAR之T細胞之群(N＝5)、投予1×105 個細胞之上述表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞之群(N＝5)。習知之表現抗人間皮素CAR之T細胞及表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞之投予係自尾靜脈藉由靜脈內投予而進行。進而，於第3天以後，進行使用IVIS之腫瘤螢光強度之測定(發光量：Total Flux(photons/sec)。將結果示於圖9A、B。又，將使上述結果中之自投予起之天數與小鼠之生存率的關係圖表化所得者示於圖10，將使自投予起之天數與總螢光量(photons/second)之關係圖表化所得者示於圖11。於圖9A、B、圖10、及圖11中，以「7×19 CAR-T」表示投予了表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞者，以「Conventional CAR-T」表示投予了習知之表現抗間皮素CAR之T細胞者。再者，於本實施例6中使用內源性T細胞缺損之NSG免疫缺陷小鼠作為接受者，故而排除接受者之內源性T細胞之影響，且對所投予之表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞本身之效果進行評價。
如圖9A、B、圖10、及圖11所示，於第21天左右7×19 CAR-T、Conventional CAR-T中之任一者均幾乎未觀察到腫瘤螢光強度。於7×19 CAR-T中，其後至第143天為止未觀察到腫瘤螢光，確認到完全抑制復發。另一方面，於Conventional CAR-T中自每第45天起開始觀察腫瘤螢光，於第115天腫瘤螢光強度提高，於第129天1隻死亡，於第143天剩餘之4隻亦死亡。因此，明確藉由投予表現CAR-IL-7-CCL19之T細胞，即於腫瘤局部分泌IL-7及CCL19，並且破壞腫瘤細胞，可抑制惡性腫瘤之復發。
[實施例7]
＜接受者之內源性T細胞之記憶化＞
上述中使用具有CAR作為識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子之T細胞，使用具有T細胞受體(TCR)之T細胞作為識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子代替CAR，而對接受者之內源性T細胞之記憶化進行調查。
(表現P1A特異性TCR/IL-7/CCL19/eGFP之T細胞之製作)
於作為P815之腫瘤抗原之P1A中表現特異之TCR、小鼠IL-7、小鼠CCL19、及GFP之T細胞之製作係依據上述專利文獻3中所記載之方法而進行。若簡潔地進行記載，則如下所述。
人工合成編碼小鼠IL-7(無終止密碼子)、繼其後之源自小核糖核酸病毒之2A肽(F2A)、及小鼠CCL19之IL-7-F2A-CCL19 DNA片段(Life Technology公司製造)。藉由限制酵素(NCOI及ECORI)處理及連接，將上述中所合成之IL-7-F2A-CCL19 DNA片段插入至具有F2A-eGFP序列之pMSGV反轉錄病毒表現載體(上述專利文獻3)之多選殖位點，而獲得包含IL-7-F2A-CCL19-F2A-eGFP DNA片段(序列編號9)之pMSGV載體(IL-7×CCL19-eGFP表現載體)。又，作為對照，製作包含eGFP且不含IL-7及CCL19之pMSGV載體(eGFP對照載體)。再者，於序列編號9中，第1～462號鹼基為IL-7(第1～75號之鹼為IL-7之訊號序列)，第463～537號鹼基為F2A，第538～861號鹼基為CCL19(第538～612號鹼基為CCL19之訊號序列)，第868～942號鹼基為F2A，第946～1662號鹼基為編碼eGFP之核酸，第1663～1665號鹼基為終止密碼子。
自從Y. Liu獲取之作為H-2Ld 限制性之P815之腫瘤抗原之P1A中表現特異之TCR之基因轉殖小鼠(Sarma, S., Y. Guo, Y. Guilloux, C. Lee, X.-F. Bai, Y. Liu. 1999. J. Exp. Med. 189: 811.)採集脾臟細胞，獲得於作為源自脾臟細胞之P815之腫瘤抗原之P1A中表現特異之TCR之小鼠T細胞(P1A特異性TCR-T細胞)。其次，製作導入有IL-7×CCL19-eGFP表現載體及eGFP對照載體之反轉錄病毒，將包含上述P1A特異性TCR-T細胞之脾臟細胞(3×106 個/孔)轉導至利用P1A肽活化48小時後之細胞中，而獲得表現P1A特異性TCR/IL-7/CCL19/eGFP之T細胞(7×19 P1A-CTL)或表現P1A特異性TCR/eGFP之T細胞(conv. P1A-CTL)。各表現載體之轉導係利用檢測作為代用標記物之eGFP之流式細胞儀分析而進行確認。所獲得之各T細胞之eGFP之表現量於任一種實驗中均為70～80%。
將利用流式細胞儀對分別利用表現P1A特異性TCR/IL-7/CCL19/eGFP之T細胞或表現P1A特異性TCR/eGFP之T細胞對小鼠進行處理之情形之脾臟細胞中之CD8+ GFP+ 細胞之比率及CD8+ GFP+ 細胞絕對數進行分析之結果示於圖12(a)、(b)。於脾臟細胞中於利用表現P1A特異性TCR/IL-7/CCL19/eGFP之T細胞進行處理之情形時，確認到CD8+ GFP+ 細胞之比率及CD8+ GFP+ 細胞絕對數增加。
其次，將利用流式細胞儀對利用初始BDA/2小鼠之CD8+ 脾臟細胞及表現P1A特異性TCR/IL-7/CCL19/eGFP之T細胞進行了處理之小鼠之CD8+ GFP- 或CD8+ GFP+ 脾臟細胞中之CD44之表現進行分析之結果示於圖13(a)、(b)。圖13(a)表示代表性CD44+ 細胞之細胞數，圖13(b)表示CD44+ 細胞之比率。如圖13(a)、(b)所示，不僅所投予之T細胞(GFP+ 閘)，接受者之內源性T細胞(GFP- 閘)之CD44+ 之比率與初始T細胞相比，亦增加2倍以上。因此，確認到表現P1A特異性TCR/IL-7/CCL19/eGFP之T細胞具有使接受者之內源性T細胞記憶化之作用，即誘導接受者之內源性T細胞之記憶功能，增強接受者之內源性T細胞之記憶功能之作用。
進而，為了確認記憶化之功能、即對於刺激之反應性獲得，利用IFN-γ之生產進行調查。自脾臟細胞利用磁單離出T細胞，並與利用P815進行了處理之黏膜型肥大細胞(MMC，Mucosal mast cell)共同培養5天左右。將藉由ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)對培養基之上清液中之IFN-γ之濃度進行檢測所得之結果示於圖14。如圖14所示，確認到表現P1A特異性TCR/IL-7/CCL19/eGFP之T細胞之IFN-γ之生產較多。因此，確認到表現P1A特異性TCR/IL-7/CCL19/eGFP之T細胞提高接受者之內源性T細胞之抗腫瘤活性。因此認為於接受者中誘導復發抑制效果。
[實施例8]
＜表現IL-7及CCL19之病毒＞
上述中使用免疫活性細胞作為核酸傳遞介質，若於腫瘤局部分泌IL-7及CCL19，則即便未使用免疫活性細胞亦應可增強投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞、或可抑制惡性腫瘤復發。因此，使用病毒代替免疫活性細胞作為核酸傳遞介質而進行分析。
(表現小鼠IL-7及小鼠CCL19之基因重組痘瘡病毒之製作)
表現小鼠IL-7及小鼠CCL19之基因重組痘瘡病毒係依據上述專利文獻3及國際公開第2011/125469號說明書中所記載之方法，藉由以下之方法製作。將pTagBFP-N載體(FP172、Evrogen公司)之DNA作為模板，利用2個引子(5'-ATG GCC GGA CCG GCC ACC GGT CGC CAC CAT GAG CGA G-3'：序列編號10)與(5'-TCG AAT TCG CTA GCG GCC GCT TAA TTA AGC TTG TGC CCC AG-3'：序列編號11)，使藍色螢光蛋白質(BFP，Blue Fluorescent Protein)基因區域擴增。利用限制酵素SfiI與EcoRI切割其PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)產物，並將其選殖至pTK-SP-LG載體(國際公開第2011/125469號說明書)之相同之限制酵素部位，於合成痘瘡病毒啟動子(Hammond JM. et al., Journal of Virological Methods. 1997; 66 (1): 135-138)下構築連結有BFP之pTK-SP-BFP。其次，利用限制酵素AgeI與NotI切割pAmCyan1-N1載體(TAKARA BIO公司製造)，將其螢光蛋白質AmCyan1片段選殖至pTK-SP-BFP之利用相同之限制酵素進行了處理之部位，而構築pTK-SP-AmCyan1。
利用限制酵素BamHI切割包含編碼小鼠IL-7、繼其後之源自小核糖核酸病毒之2A肽(F2A)、小鼠CCL19、F2A、eGFP之DNA片段之pMSGV質體(上述專利文獻3)，於鈍化(Blunt)處理後，利用NcoI切割，將所獲得之小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19-F2A-eGFP片段選殖至利用限制酵素NheI切割pTK-SP-AmCyan1，且於鈍化處理後利用NcoI切割之部位，而構築轉移載體質體pTK-SP-小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19-F2A-eGFP。
將pGL4.20(Promega公司製造)之DNA作為模板，利用2個引子(5'-GCT CCG GAC GCC ACC ATG GAA GAT GCC AAA AAC-3'(序列編號12)與5'-GCG AAT TCC ACG GCG ATC TTG CCG CCC TTC T-3'(序列編號13))，使螢火蟲螢光素酶基因區域擴增。將利用限制酵素BspEI及EcoRI切割其PCR產物而獲得之Luc片段、及利用限制酵素EcoRI與BsrGI切割pTK-SP-小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19-F2A-eGFP而獲得之包含eGFP之一部分之片段同時選殖至利用限制酵素BspEI與BsrGI切割pTK-SP-小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19-F2A-eGFP所得之部位，而構築轉移載體質體pTK-SP-Luc-F2A-eGFP。
為了回收圖15(a)、(b)所示之具有病毒基因組之重組痘瘡病毒，使於6孔皿中培養為80%融合之CV1細胞以MOI＝0.02～0.1感染痘瘡病毒(LC16mO)，於室溫下吸附1小時後，與FuGENE HD(Promega公司製造)進行混合，依據手冊將所得之轉移載體質體DNA(pTK-SP-小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19-F2A-eGFP或pTK-SP-Luc-F2A-eGFP)添加至細胞中而取入，並於37℃下培養2～5天。回收細胞並進行冷凍熔解後，進行音波處理，適當地稀釋而接種至大致變得融合之BSC1細胞中，並添加包含0.8%甲基纖維素之伊格爾營養基(Eagle MEM)、5%FBS培養基，於37℃下培養2～5天。去除培養基，利用刀片之前端刮取BFP表現噬菌斑，使之懸浮於Opti-MEM培養基(Invitrogen公司製造)中。於BSC1細胞中進而重複該操作3次以上，而進行噬菌斑純化。於對噬菌斑純化後所採集之噬菌斑之懸浮液進行音波處理後，自其200 μL使用高純度病毒核酸套組(High Pure Viral Nucleic Acid Kit)(Roche公司製造)依據手冊提取基因組DNA，而供於利用PCR之分選。利用2個引子(5'-ATT TCT CCG TGA TAG GTA TCG ATG-3'(序列編號14)與5'-AAC GGT TTA CGT TGA AAT GTC C-3'序列編號15)進行PCR，對檢測到特定之大小之PCR產物之選殖，利用直接序列確認PCR產物之鹼基序列。選擇於鹼基序列方面無問題之病毒選殖，於A549細胞中使之擴增後，於RK13細胞中測定病毒力價，製成基因重組痘瘡病毒LC16mO TK-SP-小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19-F2A-eGFP(TK-ICE：圖15(a))或LC16mO TK-SP-Luc-F2A-eGFP(TK-LE：圖15(b))而供於以下之實驗。
將A549細胞(1×105 細胞/孔)或CT26細胞(5×104 細胞/孔)播種至24孔板並於37℃下培養後，以A549細胞MOI＝0.1或CT26細胞MOI＝10分別感染TK-ICE或TK-LE(n＝3)，自感染起24、48、72小時後利用螢光顯微鏡(Olympus公司製造)對細胞進行觀察(圖16)，並回收上清液。於各24、48、72小時後將所回收之上清液稀釋100倍，利用DuoSet ELISA Mouse IL-7 (R＆D Systems公司製造 DY407)、DuoSet ELISA Mouse CCL-19 (R＆D Systems公司製造 DY440)及DuoSet Ancillary Reagent Kit2 (R＆D Systems公司製造 DY008)，測定上清液0.5 mL中之IL-7及CCL19之分泌量。將測定結果示於圖17。
如圖16、17所示，感染24、48、72小時之A549細胞及CT26細胞中之eGFP螢光表現於TK-ICE與TK-LE中為相同程度，於A549細胞中感染48小時後幾乎於所有細胞中檢測出，於CT26細胞中隨著時間經過eGFP螢光之表現增加。又，於A549細胞及CT26細胞中，於感染了TK-ICE之情形時，自感染24小時後檢測到IL-7及CCL19，於A549細胞中於感染48小時後大致達到平穩時期，且於CT26細胞中隨著時間經過上升。另一方面，於感染了TK-LE之情形時，IL-7及CCL19為檢測極限以下。根據上述結果確認到，TK-ICE破壞腫瘤細胞，並且分泌IL-7、CCL19。
[實施例9]
＜抗腫瘤效果＞
根據上述實施例8確認到，上述中所製作之基因重組痘瘡病毒TK-ICE於腫瘤細胞中感染而破壞癌細胞，並且分泌IL-7及CCL19。因此，調查基因重組痘瘡病毒TK-ICE之抗腫瘤效果。
如圖18所示，將小鼠大腸癌CT26細胞(5×105 細胞)移植至BALB/c小鼠之兩腹部之皮下並使之生長。其次，對各基因重組痘瘡病毒(3-5×107 個噬菌斑形成單位(PFU))合計3次(0、2、4天)選擇形成於兩腹部之腫瘤中之較大者，並向投予至該選擇之腫瘤內，其後藉由兩腹部之腫瘤直徑測定而研究病毒之抗腫瘤效果。再者，第1次之投予前之投予側之腫瘤為43～102 mm3 ，非投予側之腫瘤為24～82 mm3 。將結果示於圖19。
根據圖19之結果，於未表現IL-7與CCL19之TK-LE投予群(N＝7)中，與PBS投予群(N＝8)相比，於投予側之腫瘤中抑制腫瘤之增殖，但於非投予群中未觀察到對於腫瘤之抑制效果。相對於此，於表現IL-7及CCL19之TK-ICE投予群(N＝4)中，與PBS投予群(N＝4)相比，不僅於投予側之腫瘤中，於非投予側之腫瘤中亦可見腫瘤增殖之抑制。再者，雖未圖示，但對在感染了TK-LE之腫瘤細胞中表現之發光酵素(螢光素酶)，藉由利用投予受質(螢光素)確認有無發光而非侵入地檢測病毒之方法，確認到向另一腹側之腫瘤投予之基因重組痘瘡病毒未轉移至另一腹側之腫瘤。因此，認為，藉由由TK-ICE所引起之腫瘤細胞之破壞，並且於腫瘤局部之IL-7及CCL19之分泌，引發投予對象之腫瘤免疫，並且內源性T細胞之記憶功能增強，藉此不僅確認到投予側之腫瘤之消失，亦確認到非投予側之腫瘤之增殖抑制，抑制該惡性腫瘤之復發。
圖1(a)係表示於實施例1中，對惡性腫瘤組織中之T細胞之存在利用標記抗體染色，並利用顯微鏡觀察所得之結果之圖。(b)係對上述(a)中所觀察到之結果進行圖像分析處理，表示所投予之供體T細胞與接受者之內源性T細胞之區域(μm2 )之圖表。
圖2係於實施例2中，對將表現抗人CD20 CAR-IL-7/CCL19之T細胞(7×19)或該T細胞與抗CD90.2抗體(anti-CD90.2)一併向小鼠投予之情形之於投予後第14天之惡性腫瘤體積(mm3 )進行調查所得之圖表。
圖3係表示於實施例3中，對所投予之供體T細胞及接受者之內源性T細胞之記憶化進行調查所得之結果之圖表。
圖4係表示於實施例3中，藉由IFN-γ(interferon-γ，干擾素-γ)之生產對所投予之供體T細胞及接受者之內源性T細胞之記憶化之功能進行調查所得之結果之圖表。(a)係利用流式細胞儀對CD90.1陽性之供體T細胞中之IFN-γ陽性細胞之比率進行檢測所得之結果，(b)係利用流式細胞儀對CD90.2陽性之內源性CD8陽性T細胞中之IFN-γ陽性細胞進行檢測所得之結果。
圖5A係表示於實施例4中，對表現CAR-IL-7/CCL19之T細胞之處理前之T細胞受體(TCR)譜之變化(α鏈：處理前，CAR-陽性)進行調查所得之結果之圖表。
圖5B係表示於實施例4中，對表現CAR-IL-7/CCL19之T細胞之處理前之T細胞受體(TCR)譜之變化(α鏈：處理前，CAR-陰性)進行調查所得之結果之圖表。
圖5C係表示於實施例4中，對表現CAR-IL-7/CCL19之T細胞之處理後之T細胞受體(TCR)譜之變化(α鏈：處理後，CAR-陽性)進行調查所得之結果之圖表。
圖5D係表示於實施例4中，對表現CAR-IL-7/CCL19之T細胞之處理後之T細胞受體(TCR)譜之變化(α鏈：處理後，CAR-陰性)進行調查所得之結果之圖表。
圖6A係表示於實施例4中，對表現CAR-IL-7/CCL19之T細胞之處理前之T細胞受體(TCR)譜之變化(β鏈：處理前，CAR-陽性)進行調查所得之結果之圖表。
圖6B係表示於實施例4中，對表現CAR-IL-7/CCL19之T細胞之處理前之T細胞受體(TCR)譜之變化(β鏈：處理前，CAR-陰性)進行調查所得之結果之圖表。
圖6C係表示於實施例4中，對表現CAR-IL-7/CCL19之T細胞之處理後之T細胞受體(TCR)譜之變化(β鏈：處理後，CAR-陽性)進行調查所得之結果之圖表。
圖6D係表示於實施例4中，對表現CAR-IL-7/CCL19之T細胞之處理後之T細胞受體(TCR)譜之變化(β鏈：處理後，CAR-陰性)進行調查所得之結果之圖表。
圖7A係於實施例5中，對在接種P815-hCD20後第140天腫瘤得到治療而根治之小鼠(腫瘤排斥小鼠(tumor-rejected mice))或對照之初始小鼠(naive mice)於左右之側腹分別接種P815-hCD20或未表現hCD20之母株P815，表示腫瘤體積之測定結果之圖。
圖7B係於實施例5中，對在接種3LL-hCD20後第140天腫瘤得到治療而根治之小鼠(tumor-rejected mice)或對照之初始小鼠(naive mice)於左右之側腹分別接種3LL-hCD20或未表現hCD20之母株3LL，表示腫瘤體積之測定結果之圖。
圖8係於實施例6中，用以確認腫瘤之復發抑制效果之實驗方案圖。
圖9A係於實施例6中，表示以曝光時間30秒對投予下述ACC-MESO1-GFP-Luc，且於第1天投予了表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞(7×19 CAR-T)之群及投予了習知之表現抗人間皮素CAR之T細胞(conventional CAR-T)之群中之第1、3、7、10、14、21、31、38天之小鼠進行拍攝所得之結果之圖。
圖9B係表於實施例6中，表示以曝光時間30秒對投予下述ACC-MESO1-GFP-Luc，且於第1天投予了表現抗人間皮素CAR-IL-7-CCL19之T細胞(7×19 CAR-T)之群及投予了習知之表現抗人間皮素CAR之T細胞(conventional CAR-T)之群中之第45、59、73、87、101、115、129、143天之小鼠進行拍攝所得之結果之圖。自第129天之左側起第2號個體因死亡故而省略照片。
圖10係於實施例6中，表示自投予下述ACC-MESO1-GFP-Luc起之天數與小鼠之生存率之關係的圖表。
圖11係於實施例6中，表示自投予下述ACC-MESO1-GFP-Luc起之天數與總螢光量之關係的圖表。
圖12係於實施例7中，(a)表示利用流式細胞儀對脾臟細胞中之CD8+ GFP+ 細胞之比率進行分析所得之結果之圖，(b)表示利用流式細胞儀對CD8+ GFP+ 細胞絕對數進行分析所得之結果之圖。
圖13係於實施例7中，(a)係表示初始BDA/2小鼠之CD8+ 脾臟細胞及利用表現P1A特異性TCR/IL-7/CCL19/eGFP之T細胞進行了處理之小鼠之CD8+ GFP- 或CD8+ GFP+ 脾臟細胞中之CD44+ 細胞之細胞數的圖，(b)係表示(a)中之CD44+ 細胞之比率之圖。
圖14係表示於實施例7中，與利用P815進行了處理之黏膜型肥大細胞(MMC，Mucosal mast cell)共同培養5天左右，並藉由ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析)對培養基之上清液中之IFN-γ之濃度進行檢測所得之結果之圖。
圖15係於實施例8中，(a)係表示基因重組痘瘡病毒LC16mO TK-SP-小鼠IL-7-F2A-小鼠CCL19-F2A-eGFP(TK-ICE)之結構之圖，(b)係表示基因重組痘瘡病毒LC16mO TK-SP-Luc-F2A-eGFP(TK-LE)之結構之圖。
圖16係於實施例8中，利用觀察圖像表示感染了基因重組痘瘡病毒TK-ICE或TK-LE之A549細胞及CT26細胞中之痘瘡病毒之細胞變性效果與eGFP(enhanced green fluorescent protein，強化型綠色螢光蛋白)螢光表現之關係的圖。
圖17係表示於實施例8中，對感染了基因重組痘瘡病毒TK-ICE或TK-LE之A549細胞或CT26細胞中之IL-7及CCL19之分泌量進行調查所得之圖。
圖18係表示於實施例8中，將小鼠大腸癌CT26細胞移植至小鼠之兩腹部之皮下之概念之圖。
圖19係表示於實施例9中，對使用小鼠大腸癌細胞CT26之腫瘤兩側皮下移植BALB/c小鼠模型向腫瘤內投予基因重組痘瘡病毒TK-ICE或TK-LE後之腫瘤尺寸(mm3 )之推移的圖。

Claims (20)

  1. 一種投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其包含核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸。
  2. 如請求項1之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其中核酸傳遞介質係選自免疫活性細胞、病毒、厭氧性菌、脂質體、間葉系幹細胞(MSC)、及奈米粒子之至少1種以上。
  3. 如請求項1或2之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其中核酸傳遞介質具有向惡性腫瘤細胞之積聚能力、或於惡性腫瘤細胞中之特異之增殖能力。
  4. 如請求項1至3中任一項之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其中核酸傳遞介質具有惡性腫瘤細胞毒殺能力。
  5. 如請求項1至4中任一項之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其中核酸傳遞介質為免疫活性細胞，且該免疫活性細胞具有識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子。
  6. 如請求項5之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其中識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子為嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
  7. 如請求項5或6之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其中免疫活性細胞為T細胞。
  8. 如請求項1至7中任一項之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑，其中具有記憶功能之T細胞或B細胞為中央記憶T細胞。
  9. 一種醫藥組合物，其含有如請求項1至8中任一項之投予對象中之具有記憶功能之T細胞或B細胞之增強劑與藥學上所容許之添加劑。
  10. 一種惡性腫瘤復發抑制劑，其包含核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸。
  11. 如請求項10之惡性腫瘤復發抑制劑，其中核酸傳遞介質係選自免疫活性細胞、病毒、厭氧性菌、脂質體、間葉系幹細胞(MSC)、及奈米粒子之至少1種以上。
  12. 如請求項10或11之惡性腫瘤復發抑制劑，其中核酸傳遞介質具有向惡性腫瘤細胞之積聚能力、或於惡性腫瘤細胞中之特異之增殖能力。
  13. 如請求項10至12中任一項之惡性腫瘤復發抑制劑，其中核酸傳遞介質具有惡性腫瘤細胞毒殺能力。
  14. 如請求項10至13中任一項之惡性腫瘤復發抑制劑，其中核酸傳遞介質為免疫活性細胞，且該免疫活性細胞具有識別惡性腫瘤抗原之細胞表面分子。
  15. 如請求項14之惡性腫瘤復發抑制劑，其中核酸傳遞介質係具有識別惡性腫瘤細胞抗原之細胞表面分子之免疫活性細胞，惡性腫瘤復發係由不具有該細胞表面分子特異性地識別之惡性腫瘤抗原之惡性腫瘤細胞引起之惡性腫瘤復發。
  16. 如請求項14或15之惡性腫瘤復發抑制劑，其中識別惡性腫瘤細胞抗原之細胞表面分子為嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)。
  17. 如請求項14至16中任一項之惡性腫瘤復發抑制劑，其中免疫活性細胞為T細胞。
  18. 如請求項11之惡性腫瘤復發抑制劑，其中核酸傳遞介質為腫瘤溶解性病毒。
  19. 一種醫藥組合物，其含有如請求項10至18中任一項之惡性腫瘤復發抑制劑與藥學上所容許之添加劑。
  20. 一種對投予對象中之T細胞或B細胞誘導記憶功能之誘導劑，其包含核酸傳遞介質、編碼介白素7(IL-7)之核酸、及編碼趨化介素(C-C結構組元)配體19(CCL19)之核酸。
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