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TW201900167A - 治療肝疾病之方法 - Google Patents

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TW201900167A
TW201900167A TW107110537A TW107110537A TW201900167A TW 201900167 A TW201900167 A TW 201900167A TW 107110537 A TW107110537 A TW 107110537A TW 107110537 A TW107110537 A TW 107110537A TW 201900167 A TW201900167 A TW 201900167A
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TW
Taiwan
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inhibitor
formula
compound
pharmaceutically acceptable
acc
Prior art date
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TW107110537A
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English (en)
Inventor
詹姆 吉爾 貝提斯
大衛 高登 克萊克森 布萊肯里吉
格蘭特 雷蒙 布達斯
Original Assignee
美商基利科學股份有限公司
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Abstract

本揭示內容係關於預防及/或治療肝疾病之方法，其包含向有需要之患者投與ASK1抑制劑與ACC抑制劑之組合。

Description

治療肝疾病之方法
本揭示內容係關於預防及/或治療肝疾病之方法。
肝疾病係全世界死亡之主要原因。肝疾病可由感染、損傷、暴露於藥物或有毒化合物、酒精、食物中之雜質、血液中正常物質之異常積聚、自體免疫過程、遺傳缺陷(例如血色素沈積症)或未知原因引起。肝疾病基於疾病之持續時間通常分類為急性或慢性。 根據美國肝臟基金會(American liver Foundation)，超過20%之群體患有非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。當不予以治療時，NAFLD可進展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，從而引起嚴重不良效應。在美國，估計有16百萬成人患有NASH且大約50%患有與NASH相關之晚期肝纖維化(橋狀纖維化或肝硬化)。基於該等數字，預計至2020年，NASH將成為肝移植之主要適應症。NASH之特徵在於存在脂肪變性及其他特徵，包括肝細胞變性(氣球樣變(ballooning)、麥洛利氏小體(Mallory hyaline))、發炎性細胞浸潤及發生進行性纖維化。 目前無用於治療NASH之經批准療法且無降低患有NASH之患者之纖維化及/或脂肪變性之療法。因此，業內仍需要提供治療肝疾病或肝疾病症狀之新穎有效醫藥劑。
本文中揭示治療及/或預防有需要之患者之肝疾病的方法，其包含向該患者投與治療有效量之細胞凋亡信號調控激酶1 (ASK1)抑制劑與治療有效量之乙醯基-CoA羧化酶(ACC)抑制劑之組合。肝疾病可係任何肝疾病，包括(但不限於)慢性及/或代謝性肝疾病、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。 在某些實施例中，本文中提供治療及/或預防有需要之患者之非酒精性脂肪性肝炎(NASH)之方法，其包含向該患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合。 在本文所提供之方法中，ASK1抑制劑及ACC抑制劑可共投與。在此等實施例中，ASK1抑制劑及ACC抑制劑可作為單一醫藥組合物一起投與，或以一種以上之醫藥組合物分開投與。因此，本文中亦提供醫藥組合物，其包含治療有效量之ASK1抑制劑及治療有效量之ACC抑制劑。
相關申請案之交叉參考 本申請案根據35 U.S.C. § 119(e)主張於2017年3月28日提出申請之美國臨時申請案第62/477,859號、於2017年4月5日提出申請之美國臨時申請案第62/482,097號、於2017年5月25日提出申請之美國臨時申請案第62/511,027號及於2017年5月31日提出申請之美國臨時申請案第62/513,311號之權益，其每一者均係以全文引用的方式併入本文中。定義及一般參數 如本說明書中所使用，除非在使用其之上下文中另有指示，否則以下術語及片語通常意欲具有如下文所述之含義。 如本文中所使用，用於定量量測背景下之術語「約」意指所指示量± 10%，或替代地所指示量± 5%或± 1%。 術語「醫藥上可接受之鹽」係指保留基礎化合物之生物有效性及性質且通常不係在生物學上或其他方面不合意之本文中所揭示化合物之鹽。 有酸加成鹽及鹼加成鹽。 醫藥上可接受之酸加成鹽可自無機及有機酸製備。 可用於與基礎化合物反應以形成醫藥上可接受之鹽(分別為酸加成鹽或鹼加成鹽)之酸及鹼為熟習此項技術者所已知。若本文中所闡述之化合物係作為酸加成鹽獲得，則游離鹼可藉由使酸式鹽之溶液鹼化來獲得。 相反，若產物係游離鹼，則可根據自鹼化合物製備酸加成鹽之習用程序藉由將游離鹼溶解於適宜有機溶劑中並用酸處理該溶液來產生加成鹽、尤其醫藥上可接受之加成鹽。 熟習此項技術者將認識到可用於製備醫藥上可接受之無毒加成鹽之各種合成方法。 醫藥上可接受之酸加成鹽可自無機及有機酸製備。 源自無機酸之鹽包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及諸如此類之鹽。 源自有機酸之鹽包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯-磺酸、柳酸及諸如此類之鹽。同樣，醫藥上可接受之鹼加成鹽可自無機及有機鹼來製備。源自無機鹼之鹽包括(僅例如)鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽、銨鹽、鈣鹽及鎂鹽。 源自有機鹼之鹽包括(但不限於)一級、二級及三級胺之鹽，例如烷基胺(亦即，NH2 (烷基))、二烷基胺(亦即，HN(烷基)2 )、三烷基胺(亦即，N(烷基)3 )、經取代之烷基胺(亦即，NH2 (經取代之烷基))、二(經取代之烷基)胺(亦即，HN(經取代之烷基)2 )、三(經取代之烷基)胺(亦即，N(經取代之烷基)3 )、烯基胺(亦即，NH2 (烯基))、二烯基胺(亦即，HN(烯基)2 )、三烯基胺(亦即，N(烯基)3 )、經取代之烯基胺(亦即，NH2 (經取代之烯基))、二(經取代之烯基)胺(亦即，HN(經取代之烯基)2 )、三(經取代之烯基)胺(亦即，N(經取代之烯基)3 、單-、二-或三-環烷基胺(亦即，NH2 (環烷基)、HN(環烷基)2 、N(環烷基)3 )、單-、二-或三-芳基胺(亦即，NH2 (芳基)、HN(芳基)2 、N(芳基)3 )或混合胺等。適宜胺之具體實例包括(僅例如)異丙胺、三甲基胺、二乙基胺、三(異丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲基胺基乙醇、六氫吡嗪、六氫吡啶、嗎啉、N-乙基六氫吡啶及諸如此類。 類似地，自基礎化合物(在揭示後)製備醫藥上可接受之鹽之方法為熟習此項技術者所已知且揭示於(例如) Berge等人，Journal of Pharmaceutical Science, 1977年1月, 第66卷, 第1期及其他來源中。如本文中所使用，「醫藥上可接受之載劑」包括賦形劑或諸如溶劑、稀釋劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及諸如此類等對所揭示化合物或其用途無害之試劑。此等載劑及試劑用於製備醫藥活性物質之組合物之用途為業內所熟知(例如，參見Remington’sPharmaceutical Sciences , Mace Publishing Co., Philadelphia, PA 第17版(1985)；及Modern Pharmaceutics , Marcel Dekker, Inc. 第3版(G.S. Banker及C.T. Rhodes編輯)。 術語「治療有效量」及「有效量」可互換使用，且係指當以一或多個劑量投與需要此治療之患者(例如人類)時足以實現如下文所定義之治療之化合物的量。治療有效量將端視以下各項而有所變化：患者、所治療之疾病、患者之體重及/或年齡、疾病之嚴重程度或如由具資質開處方者或照護者確定之投與方式。 術語「治療(treatment或treating)」意指出於以下目的投與如本文所闡述之化合物或醫藥組合物：(i) 延遲疾病發作，亦即使疾病之臨床症狀不發展或延遲其發展；(ii) 抑制疾病，亦即使臨床症狀之發展停止；及/或(iii) 減輕疾病，亦即使其臨床症狀或嚴重程度消退。肝疾病 肝疾病基於疾病之持續時間係對肝臟之急性或慢性損害。肝損害可由以下引起：感染、損傷、暴露於藥物或有毒化合物(例如酒精或食物中之雜質)、血液中正常物質之異常積聚、自體免疫過程、遺傳缺陷(例如血色素沈積症)或其他未知原因。例示性肝疾病包括(但不限於)肝硬化、肝纖維化、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、肝缺血再灌注損傷、原發性膽汁性肝硬化(PBC)及肝炎，包括病毒性及酒精性肝炎二者。 非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)係並非由酒精引起之肝細胞中多餘脂肪之積聚。NAFLD之特徵在於肝細胞中脂肪之累積且通常與代謝症候群之一些態樣(例如2型糖尿病、胰島素抗性、高脂血症、高血壓)相關。由於食用富含碳水化合物及高脂肪之飲食，此疾病之頻率已變得愈來愈高。NAFLD患者之一子組發生非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。 NASH (脂肪肝疾病之亞型)係NAFLD之更嚴重形式。其特徵在於大泡性脂肪變性、肝細胞之氣球樣變性及/或最終導致肝結瘢(亦即纖維化)之發炎。經診斷患有NASH之患者進展至晚期肝纖維化且最終肝硬化。目前用於患有終末期疾病之肝硬化NASH患者之治療為肝移植。 另一常見肝疾病係原發性硬化性膽管炎(PSC)。其係緩慢損害肝臟內部及外部膽管之慢性或長期肝疾病。在患有PSC之患者中，膽汁由於膽管封阻而累積於肝中，在此其逐漸損害肝細胞且引起肝硬化或肝臟之結瘢。目前，對治癒PSC無有效治療。許多患有PSC之患者最終由於肝衰竭而需要肝移植，通常在經診斷患有該疾病後約10年。PSC亦可導致膽管癌。 肝纖維化係細胞外基質蛋白(包括膠原)之過度累積，其發生在大多數類型之慢性肝疾病中。晚期肝纖維化導致肝硬化、肝衰竭及門靜脈高血壓，且通常需要肝移植。方法 本文中揭示治療及/或預防有需要之患者之肝疾病的方法，其包含向該患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合。活動性肝疾病之存在可藉由血液中存在升高之酶含量來檢測。具體而言，已知高於臨床上可接受之正常範圍之丙胺酸轉胺酶(ALT)及天冬胺酸轉胺酶(AST)之血液含量指示持續之肝損害。在進行醫學治療的同時在臨床上使用常規監測肝疾病患者之ALT及AST血液含量來量測肝疾病之進展。將升高之ALT及AST降低至可接受之正常範圍內視為反映患者之持續肝損害之嚴重程度降低之臨床證據。 在某些實施例中，肝疾病係慢性肝疾病。慢性肝疾病涉及肝實質之進行性破壞及再生，此導致纖維化及肝硬化。一般而言，慢性肝疾病可由以下引起：病毒(例如B型肝炎、C型肝炎、巨細胞病毒(CMV)或艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus，EBV))、毒性藥劑或藥物(例如酒精、胺甲喋呤(methotrexate)或呋喃妥因(nitrofurantoin))、代謝性疾病(例如非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、血色素沈積症或威爾森氏症(Wilson’s Disease))、自體免疫疾病(例如自體免疫慢性肝炎、原發性膽汁性膽管炎(先前稱為原發性膽汁性肝硬化)或原發性硬化性膽管炎)或其他原因(例如右心衰竭)。 在一個實施例中，本文中提供降低肝硬化程度之方法。在一個實施例中，肝硬化之病理學特徵在於正常微觀小葉架構之喪失，伴有纖維化及結節再生。量測肝硬化程度之方法為業內所熟知。在一個實施例中，肝硬化程度降低約5%至約100%。在一個實施例中，個體之肝硬化程度降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%。 在某些實施例中，肝疾病係代謝性肝疾病。在一個實施例中，肝疾病係非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)。NAFLD係與胰島素抗性及代謝症候群(肥胖症、混合型高脂血症、糖尿病(II型)及高血壓)相關。認為NAFLD涵蓋一系列疾病活動且以肝臟中脂肪累積(脂肪肝)開始。 已顯示，肥胖症及胰島素抗性二者很可能在NAFLD之病程中起重要作用。除不良飲食以外，NAFLD具有若干個其他已知原因。舉例而言，NAFLD可由某些藥劑引起，例如胺碘達隆(amiodarone)、抗病毒藥物(例如核苷類似物)、阿斯匹林(aspirin)(很少作為兒童雷氏症候群(Reye’s syndrome)之一部分)、皮質類固醇、胺甲喋呤、他莫昔芬(tamoxifen)或四環素。NAFLD亦已因存在可引起腹部脂肪沈積增加之高果糖玉米糖漿而與軟飲料之消耗有關，但蔗糖之消耗顯示類似效應(可能係由於其分解成果糖)。已知遺傳學亦起作用，此乃因已鑑別出兩種針對此易感性之遺傳突變。 若不予以治療，則NAFLD可發展成非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。NASH視為肝臟硬化之主要原因。因此，本文中提供治療及/或預防有需要之患者之非酒精性脂肪性肝炎(NASH)之方法，其包含向該患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合。 本文中亦提供治療及/或預防有需要之患者之肝纖維化之方法，其包含向該患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合。肝纖維化係細胞外基質蛋白(包括膠原)之過度累積，其發生在大多數類型之慢性肝疾病中。在某些實施例中，晚期肝纖維化導致肝硬化及肝衰竭。量測肝臟組織學(例如纖維化程度之變化、小葉肝炎及門靜脈周橋接壞死)之方法為業內所熟知。 在一個實施例中，肝纖維化(其為形成纖維組織、類纖維瘤或纖維變性)之程度降低超過約90%。在一個實施例中，肝纖維化(其為纖維組織之形成)、類纖維瘤或纖維變性之程度降低至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少約40%、至少約30%、至少約20%、至少約10%、至少約5%或至少約2%。 本文中所闡述之一些實施例係關於治療肝疾病之方法，其包含投與治療有效量之如本文所闡述之化合物I形式或如本文所闡述之醫藥組合物。肝疾病可分類為4個階段：F0指示無纖維化；F1指示輕度纖維化；F2指示中度纖維化；F3指示重度纖維化；且F4指示肝硬化。在一個實施例中，如根據纖維化階段所量測之肝纖維化之程度自基線降低。在一個實施例中，經一段時期每日治療後，肝纖維化階段改良自基線大於1或自基線大於2。在另一實施例中，藉由包含向患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合的方法，肝纖維化階段自F4改良至F3、自F3改良至F2或自F2改良至F1。在另一實施例中，提供治療有需要之患者之肝纖維化之方法，其中該患者之肝纖維化階段為F3，該方法包含向該患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合。在另一實施例中，提供治療有需要之患者之肝纖維化之方法，其中該患者之肝纖維化階段為F4，該方法包含向該患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合。在一個實施例中，在每日投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合24週後，自基線之肝纖維化階段改良大於1。在另一實施例中，在每日投與如本文所闡述之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合48或92週後，自基線之肝纖維化階段改良大於1。在另一實施例中，在每日投與如本文所闡述之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合48或92週後，自基線之肝纖維化階段改良大於1。 在一個實施例中，本文中所提供之化合物降低肝臟中纖維發生之程度。肝纖維發生係導致肝臟中過量細胞外基質組分沈積之過程，稱為纖維化。其在數種病狀中觀察到，例如慢性病毒性B型肝炎及C型肝炎、酒精性肝疾病、藥物誘發之肝疾病、血色素沉著症、自體免疫肝炎、威爾森氏症、原發性膽汁性膽管炎(先前稱為原發性膽汁性肝硬化)、硬化性膽管炎、肝臟血吸蟲病及其他者。在一個實施例中，纖維發生之程度降低超過約90%。在一個實施例中，纖維發生之程度降低至少約90%、至少約80%、至少約70%、至少約60%、至少約50%、至少40%、至少約30%、至少約20%、至少約10%、至少約5%或至少2%。 在其他實施例中，本文中提供治療及/或預防有需要之患者之原發性硬化性膽管炎(PSC)之方法，其包含向該患者投與治療有效量之ASK1抑制劑與治療有效量之ACC抑制劑之組合。 已觀察到，在表觀遺傳學測試中，患有NASH之患者比健康患者平均年長約2.8歲。因此，在一個實施例中，可用於治療NASH之化合物將可用於減緩、改良或逆轉表觀遺傳學年齡或由於NASH所致之衰老效應。在另一實施例中，用於治療NASH之組合療法(例如如本文中所揭示之ASK1抑制劑化合物與ACC抑制劑化合物之組合)將可用於改良或逆轉由於NASH所致之衰老效應。 在一個實施例中，ASK1抑制劑及ACC抑制劑可於組合調配物中一起投與或以分開之醫藥組合物投與，其中每一抑制劑可調配成任何適宜劑型。在某些實施例中，本文中所提供之方法包含分開投與包含ASK1抑制劑及醫藥上可接受之載劑或賦形劑之醫藥組合物及包含ACC抑制劑及醫藥上可接受之載劑或賦形劑之醫藥組合物。根據本揭示內容之組合調配物包含ASK1抑制劑及ACC抑制劑以及一或多種醫藥上可接受之載劑或賦形劑及視情況其他治療劑。含有活性成分之組合調配物可呈適於預期投與方法之任何形式。 纖維化改良可藉由磁共振彈性成像(MRE)來量測。MRE可用於區分≥1期之纖維化改良之硬度。在一個實施例中，本揭示內容提供之方法係向經診斷患有NASH之人類患者投與選自式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物之化合物，並藉由MRE量測纖維化之改善。在一個實施例中，本揭示內容提供向經診斷患有NASH之人類患者投與式(I)化合物或式(II)化合物與式(III)化合物或式(IV)化合物之組合、或同時投與式(I)化合物或式(II)化合物與式(III)化合物或式(IV)化合物，並藉由MRE量測纖維化改良之方法。在另一實施例中，本揭示內容提供藉由MRE診斷患有NASH之人類並投與式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物或其組合以治療NASH之方法。預測纖維化改良之MRE硬度之AUROC係0.62 (95%CI 0.45-0.78)且最佳臨限值係≥ 0%相對降低。 組織學改良亦可藉由質子密度脂肪分數(PDFF)來量測。PDFF可用於預測≥1級之脂肪變性改良。PDFF亦可用於預測NAS反應(≥2點降低)。在一個實施例中，本揭示內容提供投與選自式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物或其組合之化合物之方法以提供≥1級脂肪變性改良。在另一實施例中，本揭示內容提供投與選自式(I)化合物、式(II)化合物、式(III)化合物、式(IV)化合物或其組合之化合物之方法以提供NAS評分中≥2點降低。預測NAS反應之PDFF之AUROC係0.70 (95% CI 0.51-0.89)且最佳臨限值係≥ 25%相對降低。對於脂肪變性改良，PDFF之AUROC係0.70 (95% CI 57-83)且最佳臨限值係≥0%相對降低。ASK1 抑制劑 在本文中所揭示之方法及醫藥組合物之某些實施例中，ASK1抑制劑係具有式(I)結構之化合物：(I)，或其醫藥上可接受之鹽。 在本文中所揭示之方法及醫藥組合物之某些實施例中，ASK1抑制劑係具有式(II)結構之化合物：(II)，或其醫藥上可接受之鹽。 在本文中所揭示之方法及醫藥組合物之某些實施例中，ASK1抑制劑係具有式(V)結構之化合物：(V)，或其醫藥上可接受之鹽。 式(I)、式(II)及式(V)之化合物可使用熟習此項技術者已知之方法來合成並表徵，例如美國專利第8,742,126號及美國專利申請公開案第2011/0009410號及第2013/0197037號中所闡述之彼等。在一個實施例中，ASK1抑制劑係式(I)化合物或其醫藥上可接受之鹽。在一個實施例中，ASK1抑制劑係式(II)化合物或其醫藥上可接受之鹽。在一個實施例中，ASK1抑制劑係式(V)化合物或其醫藥上可接受之鹽。ACC 抑制劑 在本文中所揭示之方法及醫藥組合物之某些實施例中，ACC抑制劑係具有式(III)結構之化合物：(III)，或其醫藥上可接受之鹽。在本文中所揭示之方法及醫藥組合物之某些實施例中，ACC抑制劑係具有式(IV)結構之化合物：(IV)，或其醫藥上可接受之鹽。式(III)及式(IV)之化合物可使用熟習此項技術者已知之方法來合成並表徵，例如國際申請公開案第WO/2013071169號中所闡述之彼等。投藥及投與 儘管活性成分可單獨投與，但其可作為如下文所闡述之醫藥調配物或醫藥組合物投與。本揭示內容之用於獸用及人用二者之調配物均包含活性成分中之至少一者以及一或多種其可接受之載劑及視情況其他治療成分。該(等)載劑在與調配物之其他成分相容且對其接受者生理上無害之意義上必須「可接受」。 活性成分中之每一者可與習用載劑及賦形劑一起調配，其將根據通常實踐進行選擇。錠劑可含有賦形劑、助流劑、填充劑、黏合劑及諸如此類。水性調配物係以無菌形式製備，且當意欲藉由除經口投與以外之方式遞送時通常將係等滲的。所有調配物將視情況含有賦形劑，例如Handbook of Pharmaceutical Excipients (1986)中所述之彼等。賦形劑包括抗壞血酸及其他抗氧化劑、螯合劑(例如EDTA)、碳水化合物(例如糊精、羥基烷基纖維素、羥基烷基甲基纖維素)、硬脂酸及諸如此類。調配物之pH在約3至約11範圍內，但通常為約7至10。 活性成分之治療有效量可由熟練臨床醫師使用習用劑量遞增研究容易地確定。通常，活性成分(亦即，如本文所闡述之化合物)將以0.01毫克至2克之劑量投與。在一個實施例中，劑量將為約10毫克至450毫克。在另一實施例中，劑量將為約25毫克至約250毫克。在另一實施例中，劑量將為約50毫克或100毫克。在一個實施例中，劑量將為約100毫克。預期活性成分可以一天一次、兩次或三次投與。同樣，活性成分可以一週一次或兩次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次或每六週一次投與。在一個實施例中，ASK1抑制劑之劑量為6毫克至25毫克且ACC抑制劑之劑量為5毫克至30毫克。在一個實施例中，ASK1抑制劑之劑量為約6毫克且ACC抑制劑之劑量為約10毫克。在一個實施例中，ASK1抑制劑之劑量為約6毫克且ACC抑制劑之劑量為約20毫克。在一個實施例中，ASK1抑制劑之劑量為18毫克且ACC抑制劑之劑量為20毫克。在某些實施例中，劑量係總日劑量。 活性成分之醫藥組合物可包括適於前述投與途徑之彼等。調配物可便捷地以單位劑型來呈遞且可藉由製藥業內所熟知之任何方法來製備。技術及調配物通常參見Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., Easton, PA)。此等方法包括使活性成分與構成一或多種輔助成分之載劑締合之步驟。一般而言，調配物係藉由使活性成分與液體載劑或精細固體載劑或二者均勻且充分締合，且然後(若需要)使產物成形來製備。 適於經口投與之調配物可以以下形式來呈現：各自含有預定量之活性成分之離散單元，例如膠囊、扁囊劑或錠劑；粉末或顆粒；於水性或非水性液體中之溶液或懸浮液；或水包油液體乳液或油包水液體乳液。活性成分亦可以大丸劑、藥糖劑或糊劑之形式投與。在某些實施例中，活性成分可以皮下注射形式投與。 錠劑可藉由壓製或模製來製得，其視情況含有一或多種輔助成分。壓製錠劑可藉由在適宜機器中壓製呈自由流動形式(例如粉末或顆粒)之活性成分來製備，其視情況與黏合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑或表面活性劑混合。模製錠劑可藉由在適宜機器中模製經惰性液體稀釋劑潤濕之粉末狀活性成分之混合物來製得。錠劑可視情況經包衣或刻痕且視情況經調配以自其緩慢或受控釋放活性成分。 活性成分可藉由適合病狀之任何途徑來投與。適宜途徑包括經口、經直腸、經鼻、局部(包括經頰及舌下)、經陰道及非經腸(包括皮下、肌內、靜脈內、真皮內、鞘內及硬膜外)及諸如此類。應瞭解，較佳途徑可隨(例如)接受者之情況而有所變化。在某些實施例中，活性成分為經口生物可利用的，且因此可經口投藥。在一個實施例中，患者係人類。 當在本文中所揭示之方法中組合使用時，ASK1抑制劑及ACC抑制劑可於單一醫藥組合物中一起投與或以一種以上之醫藥組合物分開(同時或依序)投與。在某些實施例中，ASK1抑制劑及ACC抑制劑係一起投與。在其他實施例中，ASK1抑制劑及ACC抑制劑係分開投與。在一些態樣中，ASK1抑制劑係在ACC抑制劑之前投與。在一些態樣中，ACC抑制劑係在ASK1抑制劑之前投與。當分開投與時，ASK1抑制劑及ACC抑制劑可藉由相同或不同遞送途徑投與患者。醫藥組合物 本揭示內容之醫藥組合物包含有效量之選自由式(I)化合物及式(II)化合物組成之群之ASK1抑制劑，及有效量之選自由式(III)化合物及式(IV)化合物組成之群之ACC抑制劑。 舉例而言，當用於經口使用時，可製備錠劑、糖錠劑、菱形錠劑、水性或油性懸浮液、可分散粉末或顆粒、乳液、硬質或軟質膠囊、糖漿或酏劑。意欲用於經口使用之組合物可根據業內已知之用於製造醫藥組合物之任何方法來製備，且此等組合物可含有一或多種試劑(包括甜味劑、矯味劑、著色劑及防腐劑)，以便提供可口之製劑。含有活性成分與適於製造錠劑之醫藥上可接受之無毒賦形劑之混合物之錠劑係可接受的。該等賦形劑可係(例如)惰性稀釋劑，例如碳酸鈣或碳酸鈉、乳糖、乳糖一水合物、交聯羧甲基纖維素鈉、聚維酮(povidone)、磷酸鈣或磷酸鈉；造粒劑及崩解劑，例如玉蜀黍澱粉或海藻酸；黏合劑，例如纖維素、微晶纖維素、澱粉、明膠或阿拉伯樹膠；及潤滑劑，例如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。錠劑可未經包衣，或可藉由包括微囊化之已知技術來包衣以延遲在胃腸道中之崩解及吸附且藉此在較長時期中提供持續作用。舉例而言，可單獨採用諸如單硬脂酸甘油基酯或二硬脂酸甘油基酯等延時材料或與蠟一起採用。 用於經口使用之調配物亦可呈現為硬明膠膠囊，其中活性成分與惰性固體稀釋劑(例如，磷酸鈣或高嶺土(kaolin))混合；或為軟明膠膠囊，其中活性成分與水或油介質(例如，花生油、液體石蠟或橄欖油)混合。 本揭示內容之水性懸浮液含有活性材料與適於製造水性懸浮液之賦形劑之混合物。此等賦形劑包括懸浮劑，例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、海藻酸鈉、聚乙烯基吡咯啶酮、黃蓍膠及阿拉伯樹膠，及分散劑或潤濕劑，例如天然磷脂(例如卵磷脂)、環氧烷與脂肪酸之縮合產物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、環氧乙烷與長鏈脂肪族醇之縮合產物(例如十七烷伸乙基氧基鯨蠟醇)、環氧乙烷與源自脂肪酸及己醣醇酸酐之部分酯之縮合產物(例如聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯)。水性懸浮液亦可含有一或多種防腐劑，例如對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯；一或多種著色劑；一或多種矯味劑及一或多種甜味劑，例如蔗糖或糖精。 油懸浮液可藉由將活性成分懸浮於植物油(例如，花生油、橄欖油、芝麻油或椰子油)或礦物油(例如，液體石蠟)中來調配。經口懸浮液可含有增稠劑，例如蜂蠟、硬質石蠟或十六烷醇。可添加甜味劑(例如上文所述之彼等)及矯味劑以提供可口之經口製劑。該等組合物可藉由添加抗氧化劑(例如抗壞血酸)來保存。 適於藉由添加水來製備水性懸浮液之本揭示內容之可分散粉末及顆粒提供活性成分與分散劑或潤濕劑、懸浮劑及一或多種防腐劑之混合物。適宜分散劑或潤濕劑以及懸浮劑由上文所揭示之彼等例示。亦可存在其他賦形劑，例如，甜味劑、矯味劑及著色劑。 本揭示內容之醫藥組合物亦可呈水包油乳液之形式。油相可係植物油，例如橄欖油或花生油；礦物油，例如液體石蠟；或該等之混合物。適宜乳化劑包括天然樹膠，例如阿拉伯樹膠及黃蓍膠；天然磷脂，例如大豆卵磷脂；源自脂肪酸及己醣醇酸酐之酯或部分酯，例如去水山梨醇單油酸酯；及該等部分酯與環氧乙烷之縮合產物，例如聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯。乳液亦可含有甜味劑及矯味劑。糖漿及酏劑可與甜味劑(例如甘油、山梨醇或蔗糖)一起調配。此等調配物亦可含有緩和劑、防腐劑、矯味劑或著色劑。 本揭示內容之醫藥組合物可呈無菌可注射製劑之形式，例如無菌可注射之水性或油性懸浮液。此懸浮液可根據已知技術使用已於上文提及之彼等適宜分散劑或潤濕劑以及懸浮劑來調配。無菌可注射製劑亦可係於無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中之無菌可注射溶液或懸浮液(例如於1,3-丁二醇中之溶液)或製備為凍乾粉末。可採用之可接受之媒劑及溶劑係水、林格氏溶液(Ringer’s solution)及等滲氯化鈉溶液。另外，可習用地採用無菌不揮發油作為溶劑或懸浮介質。出於此目的，可採用任何溫和不揮發油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。另外，脂肪酸(例如油酸)可同樣地用於製備可注射物。 可與載劑材料組合以產生單一劑型之活性成分之量將端視於所治療主體及特定投與模式(例如經口投與或皮下注射)而有所變化。舉例而言，意欲用於經口投與人類之延時釋放調配物可含有大約1 mg至1000 mg活性材料，該活性材料與適當及便捷量之載劑材料複合，該載劑材料之量可自總組成之約5%至約95% (重量:重量)變化。舉例而言，意欲用於靜脈內輸注之水溶液可含有約3 μg至500 μg活性成分/毫升溶液，以使得可以約30 mL/小時之速率進行適宜體積之輸注。當經調配用於皮下投與時，在約兩個月至約四個月之時期內調配物通常以一個月約兩次投與。 適於非經腸投與之調配物包括水性及非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及可使調配物與預期接受者之血液等滲之溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑及增稠劑。 調配物可以單位劑量或多劑量容器(例如，密封安瓿及小瓶)呈遞，且可儲存於冷凍亁燥(凍亁)條件下，從而僅需在即將使用前添加無菌液體載劑(例如，注射用水)。臨時注射溶液及懸浮液係自先前所闡述之種類之無菌粉末、顆粒及錠劑來製備。較佳單位劑型調配物係如上文所陳述之含有活性成分之日劑量或單位日子劑量或其適當部分之彼等。實例 實例 1. NASH 之小鼠模型中之效能 進行以下研究以評估ASK1抑制劑及ACC抑制劑之組合在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)之小鼠模型中之效能(相對於單獨之個別藥劑在該模型中之效能)。藉由長期投與高飽和脂肪、膽固醇及糖之「速食」飲食(FFD)達總計6個月來誘導雄性C57BL/6小鼠之NASH，而使瘦的對照動物維持正常飼料(chow diet)。6個月後與對照小鼠相比，FFD小鼠中確立NASH表型，且特徵在於大泡性脂肪變性、升高之ALT及AST以及與肝星形細胞活化相關之增加之轉錄本含量。參見 Charlton M等人，Fast food diet mouse: novel small animal model of NASH with ballooning, progressive fibrosis, and high physiological fidelity to the human condition. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology 2011; 301 (5):G825-34。 5個月後，隨後用安慰劑(媒劑)、ASK1抑制劑(式(I))、ACC抑制劑(式(III))或用式(I)及式(III)之組合治療FFD小鼠1個月。對照小鼠在整個6個月之研究時期中保持正常飼料。終點分析包括肝脂肪變性(脂肪變性面積%)、肝甘油三酯、肝膽固醇、ALT之形態測定量化及促纖維變性轉錄本Timp1及Col1A1之量測。方法 動物 此研究中使用雄性C57CL/6小鼠(在研究開始時為12週齡)。所有用於研究動物之程序均符合美國農業部動物福祉法(U.S. Department of Agriculture’s Animal Welfare Act)(9 CFR第1部分、第2部分及第3部分)；實驗室動物護理及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(Institute for Laboratory Animal Research, The National Academies Press, Washington, D.C)；及國立衛生研究院(National Institutes of Health)實驗室動物福祉辦公室(Office of Laboratory Animal Welfare)。FFD 小鼠模型之活體實驗方案 實驗設計示於表1中。投與研究動物標準飼料(Harlan Teklad Global Diets 2014, TD2014)或市售高脂肪、高膽固醇飲食(Research Diets Inc., DB12079B)，下文稱為NASH飲食。投與動物如下於飲用水中調配之果糖/葡萄糖：將23.1 g果糖(Sigma, F2543)及17.2 g葡萄糖(Sigma, 49158)混合至1000 mL飲用水中。 在研究之最後一個月(第5個月-第6個月)，投與用單獨之式(I)化合物、或式(III)化合物、或式(I)與式(III)化合物組合之治療。式(I)化合物係呈含於FFD飲食中之0.15%混合物投與，式(III)化合物係在含0.5%羧甲基纖維素鈉(中等黏度)、1%乙醇、98.5% 50 mM Tris緩衝液(pH 8)之逆滲透水中調配。式(III)化合物係調配成0.1 mg/mL或0.2 mg/mL，且係依表中所提供之劑量給予。 在PO投藥開始前5天，將第2組及第5組置於DB12079B上達35天，該DB12079B含有0.15%之式(I)化合物研磨至該飲食中之。式(I)化合物之長達一週之引入投藥之設計在於克服引入式(I)化合物之第一週期間對食物之厭惡。在PO投藥前7天開始，向第1組至第7組中之動物假投藥媒劑BID。假投藥之設計在於使動物適應經口胃管灌食劑量投與。在研究之第1天開始，向所有劑量組中之動物每日投藥三次；用相同體積之不含化合物之調配物(第1組，媒劑)或如下文(表1)所概述之適當化合物在AM (7:00 +/- 1小時)依序兩次，且在晚上(19:00 +/- 1小時)一次達28天(直至投藥第29天)。在第29天時將每一組分成兩部分，且一半在投藥後2小時處死，且一半在投藥後8小時處死。表 1. 實驗設計及劑量組 脂肪肝之量測 使用AperioAT2掃描儀以40×放大率(Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL)捕獲經蘇木素及伊紅(H&E)染色之載玻片之全載玻片掃描影像。檢查數位載玻片影像之掃描品質，注釋並輸出至Leica Digital Image Hub (Leica Biosystems)檔案內之適當網路文件夾。使用Visiopharm影像分析軟體(Visiopharm, Hoersholm, Denmark)在全載玻片掃描影像上實施脂肪變性之量化。肝實質內之脂質液泡係低光密度之圓形區域(白色)。列舉該等區域之數量及大小，並將總脂肪變性面積表示為總肝組織橫斷面積之百分比。基於大小及形狀，將肝內血管(例如門靜脈及中央靜脈之分支)自此分析排除。個別地審查自動化分析之遮罩以確認結果之準確度。測定投藥後8小時處死之動物(每一組之一半)之脂肪肝。對所有動物實施所有其他分析。來自鼠類肝臟之甘油三酯及膽固醇之量化 組織提取：將小鼠肝組織樣品(25 ± 10 mg，以冷凍狀態準確地稱重)均質化並用水不混溶有機溶劑混合物萃取，該水不混溶有機溶劑混合物將三醯甘油部分以及游離及酯化膽固醇部分萃取至有機相中。離心後，將含有三醯甘油、膽固醇及膽固醇酯之有機上層之等分試樣用乙醇稀釋10倍或25倍。取此稀釋液之兩個獨立等分試樣。分析一個等分試樣之三醯甘油，第二個等分試樣用於總膽固醇測定。 三醯甘油測定：對於三醯甘油測定，將一個等分試樣之25倍稀釋液(或在具有低三醯甘油含量之樣品之情形下不稀釋)在氮流下蒸發。在超音波處理下利用於PBS溶液中之0.1%十二烷基硫酸鈉逐步重構乾燥之提取物，之後與三醯甘油測定試劑(Infinity™甘油三酯液體穩定試劑，Thermo Scientific，產品數據表，InfinityTM ，甘油三酯液體穩定試劑)混合。 此試劑溶液含有若干種酶、輔因子及顯色試劑4-胺基安替比林(antipyrine)。利用此試劑測定三醯甘油(TAG)係基於Wako，產品數據表，三醯甘油- G代號997-69801, Wako Pure Chemical Industries Ltd., Dallas, TX之方法，及如下之McGowan等人(McGowan, MW等人，Clin. Chem 1983:29:538)及Fossati等人(Fossati, P. Prencipe L. Clin Chem. 1892:28:2077-80)之修改： 1. 甘油三酯由脂酶酶促水解為游離脂肪酸及甘油。 2. 甘油由三磷酸腺苷(ATP)及甘油激酶(GK)磷酸化以產生甘油-3-磷酸及二磷酸腺苷。 3. 甘油-3-磷酸由磷酸二羥基丙酮(DAP)藉由甘油磷酸酯氧化酶氧化，產生過氧化氫(H2 O2 )。 4. 在由過氧化酶催化之Trinder5 型色彩反應中，H2 O2 與4-胺基安替比林(4-AAP)及3,5-二氯-2-羥基苯磺酸鹽(DHBS)反應以產生紅色染料。此染料之吸光度與樣品中所存在之甘油三酯之濃度成比例。 在與三醯甘油測定試劑一起在37℃下培育30 min後，將樣品轉移至微量滴定板中，且於微量板讀數儀(SpectraMax M2, Molecular Devices)中在540 nm下量測吸光度。使用三油酸甘油基酯(三油酸甘油酯(triolein))作為三醯甘油參照標準，使用自強化校準標準物產生之線性最小平方迴歸分析實施定量。藉助與組織樣品相同之提取及培育步驟來取校準標準樣品。使用Microsoft Excel 2013實施重量校正及濃度計算。最終組織含量係以µmol三醯甘油(TAG) / g肝組織給出。 總膽固醇測定：對於總膽固醇測定，將內標準品溶液(膽固醇-d6 )及1 M氫氧化鉀乙醇溶液添加至10倍樣品稀釋液之等分試樣(參見上文)。將混合物在70℃下培育一小時以使膽固醇酯水解為游離脂肪酸及膽固醇。之後，用冰乙酸使反應混合物酸化且用己烷萃取。將己烷層去除，蒸發且重構於乙腈中。 將重構萃取物之等分試樣注射至裝配有C18反相管柱之Waters Acquity/AB Sciex QTrap 4000 LC-MS/MS系統上。使用大氣壓化學電離(APCI)以正模式操作質譜儀。 針對m/z 375 [M-H2 O]+ →167+ 之膽固醇-D6 產物離子之峰面積量測膽固醇之m/z 369 [M-H2 O]+ →161+ 產物離子之峰面積。使用油酸膽固醇基酯作為參照標準，使用自強化校準標準物產生之加權(1/x)線性最小平方迴歸分析實施定量。藉助與組織樣品相同之提取及水解步驟取校準標準樣品。收集原始數據且使用AB SCIEX軟體Analyst 1.5.1進行處理。使用Microsoft Excel 2013來實施數據簡化、重量校正、校正油酸膽固醇基酯至膽固醇水解及濃度計算。最終組織含量係以mg總膽固醇/ g肝組織給出。ALT 在最終屍體剖檢時收集來自所有小鼠之血清。根據丙酮酸鹽及5'-磷酸吡哆醛量測血清ALT且在Cobas Hitachi 6000 Chemistry System, Roche Diagnostics上進行分析。基因表現 將大約100 mg冷凍左側葉塊狀物送至DC3用於溶解及RNA提取。用nCounter master套組(NanoString)中所含之所有試劑及消耗品根據製造商說明書進行NanoString分析以量測RNA轉錄本。簡言之，將靶向110個肝纖維化有關基因及6個對照管家基因(表2)之編碼色彩之報導基因探針在預熱之65℃溫度循環器中與100 ng RNA樣品雜交16至22小時(過夜)，反應中包括雜交緩衝液及捕獲探針。培育之後，將樣品置於製備工作站上，在此將過量探針去除，並將探針-轉錄本複合物固定在經鏈黴抗生物素蛋白塗覆之柱上。最後，將該等柱於nCounter數位分析儀(NanoString Technologies, Seattle, WA)中成像。利用nSover 3.0軟體將所有轉錄本正規化至6個管家基因(B2m、HPRT、Pgk1、RPL13a、Rpn1及SFRS4)之幾何平均值。表 2 ： Nanostring 探針 結果 實例1指示ASK1抑制劑及ACC抑制劑之組合治療產生大於任一單獨投與之藥劑之抗脂肪變性效能。具體而言，圖1顯示式(I)化合物及式(III)化合物之組合顯著降低大泡性脂肪變性。實例1亦顯示式(I)化合物及式(III)化合物之組合顯著改良肝甘油三酯(圖2)、肝膽固醇(圖3)及血清ALT (圖4)之組合。另外，式(I)化合物及式(III)化合物之組合顯示促纖維變性轉錄本Col1A1減少之趨勢(圖6)，且該組合顯示Timp1 (圖5)轉錄本顯著減少。實例 2. 在膽鹼缺乏、高脂肪、高膽固醇 NASH 模型中之效能 進行以下研究以評估ASK1抑制劑(ASK1i) (式(V))及ACC抑制劑(ACCi) (式(III))之組合在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)之齧齒類動物模型中之效能(相對於單獨之個別藥劑在該模型中之效能)。在此模型中，藉由投與膽鹼缺乏高脂肪飲食(CDHFD)在雄性Wistar大鼠中誘導NASH。動物 雄性Wistar (Crl:Wi(Han))大鼠(到達時8-9週齡)係自Charles River, Raleigh, NC購得且用於當前研究中。此研究符合動物福祉法最終規定(Final Rules of the Animal Welfare Act regulations)(聯邦法規第9卷(Code of Federal Regulations, Title 9))、來自實驗室動物福祉辦公室(Office of Laboratory Animal Welfare)之關於人道照護及使用實驗室動物之公共衛生服務政策(Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals)及來自國家研究委員會(National Research Council)之實驗室動物之照護及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)之所有適用部分。媒劑製備 媒劑(於去離子水中之w/v 50 mM tris緩衝液(pH 8))係在使用前製備且儲存在設定維持在2-8℃下之冰箱中。為製備1 L，將800 mL熱水(約80℃)添加至適當容器且劇烈攪拌直至形成激烈渦旋。將5.0克甲基纖維素鈉緩慢添加至羧甲基纖維素鈉進行渦旋。繼續攪拌直至所有羧甲基纖維素溶解為止，且將溶液冷卻至環境溫度。將5.12 g Tris HCl添加至容器。將2.12克Tris鹼添加至容器。將10 g乙醇添加至容器。將組分攪拌大約15分鐘，確保所有固體均已溶解。在柔和混合下添加QS水至1 L。式 (III) 製備 式(III)調配物係使用媒劑藉由將式(III)稀釋至期望濃度來製備。研究設計 食物係酌情隨意(pro libitum)的，且在研究第1天給予所有研究中之動物膽鹼缺乏、高脂肪、高膽固醇飲食(CDHFD；Research Diets, A16092003) (第1組對照飼料組除外，其接受標準飲食(5CR4))，如表3中所概述。對於接受ASK1抑制劑之彼等動物，ASK1i係於飲食(飲食A16111101)中投與。飲食A16111101係已添加ASK1i (0.03%)之膽鹼缺乏、高脂肪、高膽固醇飲食。在處死當天，收穫肝臟並進行石蠟包埋，且收集血漿並冷凍。處死當天不對動物進行投藥。表 3. 實驗設計及劑量組 由Charles River (Reno, Nevada)收集組織，在Histo-tec (Hayward, CA)處理並包埋於石蠟中且然後運至Gilead Sciences (Foster City)。製備5 μm厚之組織切片用於染色。苦味酸天狼星紅 (picrosirius red) 染色 ：使切片於0.2%磷鉬酸(EMS，目錄號26357-01)中預處理，且接著隨後於飽和苦味酸溶液中之0.1 % (W/V)天狼星紅(Sirius Red) 88-89-1 (EMS，目錄號26357-02)中在室溫下培育1小時。此後於0.01 N HCl (EMS，目錄號26357)中分化且於分級醇中脫水。使用Leica AT2掃描儀以40×放大率捕獲經苦味酸天狼星紅(PSR)染色載玻片之全載玻片影像。檢查數位載玻片影像之掃描品質，注釋且輸出至Leica數位影像Hub檔案內之適當網路文件夾。使用Visiopharm影像分析軟體(Visiopharm, Hoersholm, Denmark)對全載玻片影像實施定量影像分析以測定PSR之程度及強度。量測總PSR染色面積且表示為經染色之總肝臟面積百分比。結果示於圖7中。血漿 TIMP-1 ELISA ： 使用市售大鼠TIMP-1特異性ELISA套組(R&D Systems, Minneapolis, MN)以一式兩份測定血漿TIMP-1濃度。根據製造商之說明書稍作修改在血漿中分析TIMP-1。將緩衝液RD1-21 (50 μL)添加至預塗覆有小鼠抗TIMP-1之ELISA板孔。在進行ELISA之前，產生大鼠TIMP-1 (表現NS0之重組TIMP-1：2400-37.5 pg/mL)之七點標準曲線並將血漿樣品以1:100稀釋於緩衝液RD5-17中。將樣品及標準品(各自50 μL)以一式兩份添加至含有RD1-21之孔且在回轉式板振盪器(orbital plate shaker)(300 rpm)上培育(室溫) 2小時。在抗原捕獲後，使用自動化板洗滌器用洗滌緩衝液將板洗滌5次(350 μL/孔/洗滌)。洗滌後，將大鼠TIMP-1偶聯物(100 μl)添加至每一孔，並將板在回轉式板振盪器(300 rpm)上培育(室溫) 2小時。然後將板洗滌5次，且將受質溶液(100 μL)添加至每一孔。將板在室溫下避光培育30分鐘。最後，將停止溶液(100 μL)添加至每一孔。立即在SpectraMax 190微量板讀數儀(Molecular Devices, Sunnyvale CA)上在450 nm下測定光密度(O.D.)吸光度。將每一標準品及樣品之相對O.D.針對空白樣品進行背景校正，且使用4參數曲線擬合方法產生O.D.轉化為TIMP-1濃度之標準曲線。使用SoftMax Pro5軟體，使用100之稀釋因子確定未知樣品之TIMP-1濃度。結果示於圖8中。血漿玻尿酸 (HA) 分析： 使用市售HA測試套組(Corgenix, Inc., Broomfield, CO)以一式兩份測定血漿HA濃度。根據製造商之說明書稍作修改在血漿中分析HA。分析之前，產生HA參照溶液(800-12.5 ng/mL)之七點標準曲線，並將每一參照樣品及血漿樣品以1份稀釋至10份反應緩衝液(30 μL參照/樣品至300 μL反應緩衝液)。將樣品及標準品(100 μL)以一式兩份添加至預塗覆有HA結合蛋白(HABP)之微量板孔，且在回轉式板振盪器(300 rpm)上培育(室溫) 60分鐘。在抗原捕獲後，使用自動化板洗滌器用PBS將板洗滌4次(350 μL/孔/洗滌)。洗滌後，將HRP偶聯HABP (100 μL)添加至每一孔，且將板在回轉式板振盪器(300 rpm)上培育(室溫) 30分鐘。然後將板洗滌4次，且將單組分受質溶液(100 μl)添加至每一孔。將板在室溫下避光培育30分鐘。最後，將停止溶液(100 μl)添加至每一孔。立即在SpectraMax 190微量板讀數儀(Molecular Devices, Sunnyvale CA)上在450 nm下測定光密度(O.D.)吸光度。將每一標準品及樣品之相對O.D.針對空白樣品進行背景校正，且使用4參數曲線擬合方法產生O.D.轉化為HA濃度之標準曲線。使用SoftMax Pro5軟體確定未知樣品之HA濃度。結果示於圖9中。結果 實例2展示ASK1i及ACCi之抗纖維變性效能。與處於正常飲食之大鼠相比，在6週(2.7%面積)及12週(8.3%面積) CDHFD顯著增加肝PSR。用ASK1i、ACCi或ASK1i + ACCi治療使PSR分別降低18% (ns)、50% (p ＜ 0.05)及59% (p＜ 0.01)。CDHFD大鼠中TIMP1之血漿含量增加，且藉由ASK1i + ACCi降低至治療開始之含量以下(p˂0.05)。在所有含ACCi之組中HA均降低。實例 3. NASH 中細胞凋亡 - 信號調控激酶 (ASK1) 抑制劑 ( 式 (II)) 與乙醯基 -CoA 羧化酶抑制劑 ( 式 (IV)) 組合之臨床前研究 70名藉由MRE根據肝質子密度脂肪分數(PDFF) ≥10%且肝硬度≥2.88 kPa診斷患有NASH或肝生檢與NASH及2-3期纖維化一致之個體入選。相繼同類群組以經口QD方式接受式(II) 18 mg、式(IV) 20 mg之單一療法或式(II) +式(IV) (18/20 mg)之組合療法達12週。在基線(BL)、W4及W12時量測中央讀取之PDFF及MRE及血清纖維化標記物。投與氘化水以量測脂質之分數合成(重新脂質生成[DNL])。 在12週內，所有方案均安全且耐受良好。在單一療法與組合同類群組之間觀察到類似之AE率(表4)。無個體過早中斷治療。與BL相比，式(IV)使得PDFF (p=0.006)及TIMP-1 (p=0.049)顯著改良，且ALT及PIII-NP降低不顯著(表4)。式(II) +式(IV)之組合使得PDFF (p＜0.001)、ALT (p=0.019)及PIII-NP (p=0.057)顯著降低。表 4 ：安全性及在 W12 時成像、肝臟生物化學及血清纖維化標記物之相對變化 (%) † †所有數據均係自BL之中值(IQR)相對變化(%)或(n) %。 *p＜0.05對BL。 在此研究中，在患有NASH之患者中，利用式(II) +式(IV)之組合之12週治療係安全的且使得脂肪肝、肝臟生物化學及纖維化標記物改良。
圖 1. 大泡性脂肪變性，以大泡面積%表示。(*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；***p ＜ 0.001，****p ＜ 0.0001，藉由ANOVA與媒劑差異顯著；#與任一單一藥劑差異顯著)。圖表顯示平均值± SEM。圖 2. 以umol/g計之肝甘油三酯。(*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；*** p ＜ 0.001，****p ＜ 0.0001，藉由ANOVA與媒劑差異顯著；#藉由t-測試與任一單一藥劑差異顯著)。圖表顯示平均值± SEM。圖 3. 以mg/g計之肝膽固醇。(*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；*** p ＜ 0.001，****p ＜ 0.0001，藉由ANOVA與媒劑差異顯著；#藉由t-測試與任一單一藥劑差異顯著)。圖表顯示平均值± SEM。圖 4. ALT IU/L。(*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；*** p ＜ 0.001，****p ＜ 0.0001，藉由ANOVA與媒劑差異顯著；#藉由t-測試與任一單一藥劑差異顯著)。圖表顯示平均值± SEM。圖 5. 藉由定量RT-PCR量測之肝纖維化基因Timp1之肝表現。(*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；*** p ＜ 0.001，****p ＜ 0.0001，藉由ANOVA與媒劑差異顯著；#藉由t-測試與任一單一藥劑差異顯著)。圖表顯示平均值± SEM。圖 6. 藉由定量RT-PCR量測之肝纖維化基因Col1a1之肝表現。(*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；*** p ＜ 0.001，****p ＜ 0.0001，藉由ANOVA與媒劑差異顯著；#藉由t-測試與任一單一藥劑差異顯著)。圖表顯示平均值± SEM。圖 7. PSR面積%。(*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；*** p ＜ 0.001，****p ＜ 0.0001，藉由ANOVA與媒劑差異顯著；#藉由t-測試與任一單一藥劑差異顯著)。圖表顯示平均值± SEM。圖 8. 血漿TIMP1 ng/mL (*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；*** p ＜ 0.001，****p ＜ 0.0001，藉由ANOVA與媒劑差異顯著；#藉由t-測試與任一單一藥劑差異顯著)。圖表顯示平均值± SEM。圖 9. 血漿HA ng/ml (*p ＜ 0.05；**p ＜ 0.01；*** p ＜ 0.001，****p ＜ 0.0001，藉由ANOVA與媒劑差異顯著；#藉由t-測試與任一單一藥劑差異顯著)。圖表顯示平均值± SEM。

Claims (16)

  1. 一種ASK1抑制劑之用途，其用於製造用於治療及/或預防肝疾病之藥劑，其中該藥劑進一步包含ACC抑制劑或係與ACC抑制劑組合投與，其中該ASK1抑制劑係式(I)化合物：(I)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(III)化合物：(III)，或其醫藥上可接受之鹽。
  2. 一種ASK1抑制劑之用途，其用於製造用於治療及/或預防肝疾病之藥劑，其中該藥劑進一步包含ACC抑制劑或係與ACC抑制劑組合投與，其中該ASK1抑制劑係式(I)化合物：(I)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(IV)化合物：(IV)，或其醫藥上可接受之鹽。
  3. 一種ASK1抑制劑之用途，其用於製造用於治療及/或預防肝疾病之藥劑，其中該藥劑進一步包含ACC抑制劑或係與ACC抑制劑組合投與，其中該ASK1抑制劑係式(II)化合物：(II)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(III)化合物：(III)，或其醫藥上可接受之鹽。
  4. 一種ASK1抑制劑之用途，其用於製造用於治療及/或預防肝疾病之藥劑，其中該藥劑進一步包含ACC抑制劑或係與ACC抑制劑組合投與，其中該ASK1抑制劑係式(II)化合物：(II)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(IV)化合物：(IV)，或其醫藥上可接受之鹽。
  5. 一種ASK1抑制劑之用途，其用於製造用於治療及/或預防肝疾病之藥劑，其中該藥劑進一步包含ACC抑制劑或係與ACC抑制劑組合投與，其中該ASK1抑制劑係式(V)化合物：(V)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(III)化合物：(III)，或其醫藥上可接受之鹽。
  6. 一種ASK1抑制劑之用途，其用於製造用於治療及/或預防肝疾病之藥劑，其中該藥劑進一步包含ACC抑制劑或係與ACC抑制劑組合投與，其中該ASK1抑制劑係式(V)化合物：(V)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(IV)化合物：(IV)，或其醫藥上可接受之鹽。
  7. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該ASK1抑制劑及該ACC抑制劑係一起投與。
  8. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該ASK1抑制劑及該ACC抑制劑係分開投與。
  9. 如請求項1至6中任一項之用途，其中該肝疾病係非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
  10. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之ASK1抑制劑及治療有效量之ACC抑制劑，其中該ASK1抑制劑係式(I)化合物：(I)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(III)化合物：(III)，或其醫藥上可接受之鹽。
  11. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之ASK1抑制劑及治療有效量之ACC抑制劑，其中該ASK1抑制劑係式(I)化合物：(I)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(IV)化合物：(IV)，或其醫藥上可接受之鹽。
  12. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之ASK1抑制劑及治療有效量之ACC抑制劑，其中該ASK1抑制劑係式(II)化合物：(II)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(III)化合物：(III)，或其醫藥上可接受之鹽。
  13. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之ASK1抑制劑及治療有效量之ACC抑制劑，其中該ASK1抑制劑係式(II)化合物：(II)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(IV)化合物：(IV)，或其醫藥上可接受之鹽。
  14. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之ASK1抑制劑及治療有效量之ACC抑制劑，其中該ASK1抑制劑係式(V)化合物：(V)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(III)化合物：(III)，或其醫藥上可接受之鹽。
  15. 一種醫藥組合物，其包含治療有效量之ASK1抑制劑及治療有效量之ACC抑制劑，其中該ASK1抑制劑係式(V)化合物：(V)，或其醫藥上可接受之鹽； 且該ACC抑制劑係式(IV)化合物：(IV)，或其醫藥上可接受之鹽。
  16. 如請求項10至15中任一項之醫藥組合物，其進一步包含醫藥上可接受之載劑。
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