JP2020512342A - 肝疾患を処置する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、肝疾患を予防および／または処置する方法であって、それを必要とする患者にＡＳＫ１阻害剤をＡＣＣ阻害剤と組み合わせて投与することを含む方法に関する。一局面において、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物が提供される。別の局面において、上記肝疾患は非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）である。別の局面において、上記ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）または（ＩＩ）の化合物または薬学的に許容されるその塩であり、上記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物または薬学的に許容されるその塩である。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２０１７年３月２８日に出願された米国仮出願第６２／４７７，８５９号、２０１７年４月５日に出願された同第６２／４８２，０９７号、２０１７年５月２５日に出願された同第６２／５１１，０２７号および２０１７年５月３１日に出願された同第６２／５１３，３１１号（これらの各々は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。

本開示は、肝疾患を予防および／または処置する方法に関する。

肝疾患は、世界中で主要な死因である。肝疾患は、感染、傷害、薬物または毒性の化合物、アルコール、食物中の不純物への曝露、および血液中の正常な物質の異常な蓄積、自己免疫過程、遺伝子欠損（ヘモクロマトーシスなど）または未知の原因（複数可）により引き起こされ得る。肝疾患は、疾患の期間に基づいて急性または慢性と一般的に分類される。

米国肝臓協会によると、人口の２０パーセントより多くが非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する。無処置のままだと、ＮＡＦＬＤは、重篤な有害作用を引き起こす非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に進行し得る。米国における概算１６００万人の成人がＮＡＳＨを有し、概ね５０％はＮＡＳＨに関連する進行した肝臓線維症（架橋状線維症または肝硬変）を有する。これらの数字に基づき、ＮＡＳＨは２０２０年までに肝移植のための主要な適応症になると予想される。ＮＡＳＨは、脂肪症の存在によって、ならびに肝細胞性変性（気球状、マロリーヒアリン）、炎症性細胞浸潤および進行性線維症の発達を含む他の特性によって特徴付けられる。

ＮＡＳＨの処置のための現在承認されている療法も、ＮＡＳＨ患者において線維症および／または脂肪症を低減する療法もない。したがって、肝疾患または肝疾患の症状を処置するための新しい有効な薬剤を提供する必要性がまだある。

それを必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のアポトーシスシグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）阻害剤を治療的有効量のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む方法が本明細書で開示される。肝疾患は、慢性および／または代謝性肝疾患、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を限定されずに含む、任意の肝疾患であってよい。

ある特定の実施形態では、それを必要とする患者において非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。

本明細書で提供される方法では、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤は、同時投与されてもよい。そのような実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤は、単一の医薬組成物として一緒に投与されてもよいか、または複数の医薬組成物で別々に投与されてもよい。したがって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物も本明細書で提供される。

図１は、大滴性脂肪変性（ｍａｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）を％大滴性面積（ｍａｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ ａｒｅａ）として示す。（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃いずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

図２は、肝臓トリグリセリドをμｍｏｌ／ｇで示す。（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

図３は、肝臓コレステロールをｍｇ／ｇで示す。（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

図４は、ＡＬＴ ＩＵ／Ｌを示す。（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^{＊＊ ＊}ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

図５は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定された肝臓線維症遺伝子Ｔｉｍｐ１の肝臓発現を示す。（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

図６は、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって測定された肝臓線維症遺伝子Ｃｏｌ１ａ１の肝臓発現を示す。（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

図７は、パーセントＰＳＲ面積を示す。（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

図８は、血漿ＴＩＭＰ１ ｎｇ／ｍＬを示す。（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

図９は、血漿ＨＡ ｎｇ／ｍｌを示す。（^＊ｐ＜０．０５；^＊＊ｐ＜０．０１；^＊＊＊ｐ＜０．００１；^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡによりビヒクルと有意に異なる；＃ｔ検定によりいずれの単一の薬剤とも有意に異なる）。グラフは、平均±ＳＥＭを示す。

定義および一般パラメーター
本明細書で用いるように、以下の用語および語句は、それらが使用される文脈が別途示す場合を除き、一般的に下記のような意味を有するものである。

本明細書で用いるように、定量的測定との関連で使用される用語「約」は、指示量の±１０％、あるいは指示量の±５％もしくは±１％を意味する。

用語「薬学的に許容される塩」は、基礎となる化合物の生物学的効果および特性を保持し、生物学的にも他の点でも望ましくなくはない、本明細書で開示される化合物の塩を指す。酸付加塩（ａｃｉｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓａｌｔ）および塩基付加塩（ｂａｓｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓａｌｔ）がある。薬学的に許容される酸付加塩は、無機および有機の酸で調製することができる。薬学的に許容される塩（それぞれ、酸付加塩（ａｃｉｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓａｌｔ）または塩基付加塩（ｂａｓｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓａｌｔ））を形成するための基礎となる化合物との反応に有用な酸および塩基は、当業者に公知である。本明細書に記載される化合物が酸付加塩として得られる場合、遊離塩基は酸性塩の溶液を塩基性化して得ることができる。反対に、生成物が遊離塩基である場合、付加塩、特に薬学的に許容される付加塩は、塩基化合物から酸付加塩を調製するための従来の手順により、遊離塩基を適する有機溶媒に溶解し、溶液を酸で処理することによって生成することができる。当業者は、無毒の薬学的に許容される付加塩を調製するために使用することができる様々な合成方法を認識する。薬学的に許容される酸付加塩は、無機および有機の酸から調製することができる。無機酸に由来する塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などを含む。有機酸に由来する塩は、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などを含む。同様に、薬学的に許容される塩基付加塩は、無機および有機の塩基から調製することができる。無機の塩基に由来する塩には、例にすぎないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウムの塩が含まれる。有機の塩基に由来する塩には、限定されずに、一級、二級および三級アミン、例えばアルキルアミン（すなわち、ＮＨ_２（アルキル））、ジアルキルアミン（すなわち、ＨＮ（アルキル）_２）、トリアルキルアミン（すなわち、Ｎ（アルキル）_３）、置換型アルキルアミン（すなわち、ＮＨ_２（置換型アルキル））、ジ（置換型アルキル）アミン（すなわち、ＨＮ（置換型アルキル）_２）、トリ（置換型アルキル）アミン（すなわち、Ｎ（置換型アルキル）_３）、アルケニルアミン（すなわち、ＮＨ_２（アルケニル））、ジアルケニルアミン（すなわち、ＨＮ（アルケニル）_２）、トリアルケニルアミン（すなわち、Ｎ（アルケニル）_３）、置換型アルケニルアミン（すなわち、ＮＨ_２（置換型アルケニル））、ジ（置換型アルケニル）アミン（すなわち、ＨＮ（置換型アルケニル）_２）、トリ（置換型アルケニル）アミン（すなわち、Ｎ（置換型アルケニル）_３、モノ−、ジ−もしくはトリ−シクロアルキルアミン（すなわち、ＮＨ_２（シクロアルキル）、ＨＮ（シクロアルキル）_２、Ｎ（シクロアルキル）_３）、モノ−、ジ−もしくはトリ−アリールアミン（すなわち、ＮＨ_２（アリール）、ＨＮ（アリール）_２、Ｎ（アリール）_３）、または混合アミン等の塩が含まれる。適するアミンの具体例には、例にすぎないが、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリ（イソプロピル）アミン、トリ（ｎ−プロピル）アミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、ピペラジン、ピペリジン、モルホリン、Ｎ−エチルピペリジンなどが含まれる。同様に、基礎となる化合物（開示後）から薬学的に許容される塩を調製する方法は当業者に公知であり、例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７７年１月、第６６巻、１号、および他の出典で開示される。

本明細書で用いるように、「薬学的に許容される担体」には、賦形剤または作用物質、例えば、溶媒、希釈剤、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤、ならびに開示される化合物にもその使用にも有害でないようなものなどが含まれる。薬学的に活性な物質の組成物を調製するためのそのような担体および作用物質の使用は、当技術分野で周知である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、 Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ 第１７版（１９８５年）；およびＭｏｄｅｒｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． 第３版（Ｇ．Ｓ． ＢａｎｋｅｒおよびＣ．Ｔ． Ｒｈｏｄｅｓ編）を参照）。

用語「治療的有効量」および「有効量」は互換的に使用され、そのような処置を必要とする患者（例えば、ヒト）に１用量または複数用量で投与されるとき、下で規定される処置の実行に十分である化合物の量を指す。治療的有効量は、患者、処置される疾患、患者の体重および／もしくは年齢、疾患の重症度、または資格のある処方者もしくは介護者によって決定される投与様式によって異なる。

用語「処置」または「処置すること」は、以下の目的で本明細書に記載の化合物または医薬組成物を投与することを意味する：（ｉ）疾患の開始を遅延させること、すなわち、疾患の臨床症状を起こさせないことまたはその発生を遅延させること；（ｉｉ）疾患を抑制すること、すなわち、臨床症状の発生を阻止すること；および／または（ｉｉｉ）疾患を軽減すること、すなわち、臨床症状またはその重症度の退行を引き起こすこと。

肝疾患
肝疾患は、疾患の期間に基づく、肝臓への急性または慢性の損傷である。肝損傷は、感染、傷害、薬物または毒性化合物、例えばアルコールまたは食物中の不純物への曝露、血液中の正常な物質の異常な蓄積、自己免疫過程、遺伝子欠損（ヘモクロマトーシスなど）または他の未知の原因により引き起こされ得る。例示的な肝疾患には、限定されずに、肝硬変、肝臓線維症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、アルコール性脂肪肝炎（ＡＳＨ）、肝臓虚血再かん流傷害、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）ならびにウイルス性およびアルコール性の肝炎を含む肝炎が含まれる。

非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）は、アルコールによって引き起こされない、肝臓細胞における余分の脂肪の蓄積である。ＮＡＦＬＤは肝細胞における脂肪の蓄積によって特徴付けられ、メタボリックシンドロームの一部の態様（例えば、２型真性糖尿病、インスリン抵抗性、高脂血症、高血圧）にしばしば関連している。この疾患の頻度は、炭水化物に富むおよび高脂肪の食事の消費のためにますます一般的になっている。ＮＡＦＬＤ患者のサブセットは、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を起こす。

脂肪肝疾患のサブタイプであるＮＡＳＨは、ＮＡＦＬＤのより重度の形態である。それは、大滴性脂肪変性（ｍａｃｒｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ）、肝細胞のバルーン変性（ｂａｌｌｏｏｎ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）および／または肝臓の瘢痕化（すなわち、線維症）に最終的につながる炎症によって特徴付けられる。ＮＡＳＨと診断された患者は、進行したステージの肝臓線維症および最終的に肝硬変に進行する。末期疾患の肝硬変ＮＡＳＨ患者のための現在の処置は、肝移植である。

別の一般的な肝疾患は、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）である。それは、肝臓の内外の胆管に徐々に損傷を与える、慢性または長期の肝疾患である。ＰＳＣ患者では、ブロックされた胆管により胆汁が肝臓に蓄積し、そこでそれは徐々に肝臓細胞に損傷を与え、肝硬変または肝臓の瘢痕化を引き起こす。現在では、ＰＳＣを治癒させる有効な処置がない。ＰＳＣを有する多くの患者は、疾患を診断されてから一般的に約１０年後に、肝不全のために肝移植を最終的に必要とする。ＰＳＣは、胆管がんにつながることもある。

肝臓線維症は、ほとんどのタイプの慢性肝疾患において起こる、コラーゲンを含む細胞外マトリクスタンパク質の過剰な蓄積である。進行した肝臓線維症は肝硬変、肝不全および門脈圧亢進をもたらし、肝移植をしばしば必要とする。

方法
それを必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む方法が本明細書で開示される。活動的な肝疾患の存在は、血液中の高い酵素レベルの存在によって検出することができる。具体的には、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の臨床的に容認された正常範囲より上の血中レベルは、進行中の肝損傷を示すことが知られている。医療処置の間の肝疾患の進行を測定するために、ＡＬＴおよびＡＳＴの血中レベルのための肝疾患患者の慣用的なモニタリングが臨床で使用される。高いＡＬＴおよびＡＳＴの容認された正常範囲内へ低減は、患者の進行中の肝損傷の重症度の低減を反映する臨床エビデンスとしてとられる。

ある特定の実施形態では、肝疾患は慢性肝疾患である。慢性肝疾患は肝実質の進行性の破壊および再生を含み、線維症および肝硬変につながる。一般に、慢性肝疾患は、ウイルス（Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）またはエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）など）、有毒な薬剤または薬物（アルコール、メトトレキセートまたはニトロフラントインなど）、代謝疾患（非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、ヘモクロマトーシスまたはウイルソン病など）、自己免疫性疾患（例えば、自己免疫性慢性肝炎、原発性胆汁性胆管炎（以前には原発性胆汁性肝硬変として知られる）または原発性硬化性胆管炎、または他の原因（右心不全など）により引き起こされ得る。

一実施形態では、肝硬変のレベルを低減させる方法が本明細書で提供される。一実施形態では、肝硬変は、線維症および結節性再生を伴う、正常な顕微鏡的小葉構造の喪失によって病理学的に特徴付けられる。肝硬変の程度を測定する方法は、当技術分野で周知である。一実施形態では、肝硬変のレベルは、約５％から約１００％低減される。一実施形態では、肝硬変のレベルは、被験体において少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％低減される。

ある特定の実施形態では、肝疾患は、代謝性肝疾患である。一実施形態では、肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）である。ＮＡＦＬＤは、インスリン抵抗性およびメタボリックシンドローム（肥満、複合高脂血症、真性糖尿病（ＩＩ型）および高血圧）と関連する。ＮＡＦＬＤは、一連の疾患活動を包含すると考えられ、肝臓における脂肪蓄積（肝臓脂肪症）として始まる。

肥満およびインスリン抵抗性が、おそらくＮＡＦＬＤの疾患過程において強力な役割を演ずることが示されている。劣った食事に加えて、ＮＡＦＬＤはいくつかの他の公知の原因を有する。例えば、ＮＡＦＬＤは、ある特定の医薬品、例えばアミオダロン、抗ウイルス薬（例えば、ヌクレオシド類似体）、アスピリン（稀に小児におけるライエ症候群の部分として）、コルチコステロイド、メトトレキセート、タモキシフェンまたはテトラサイクリンにより引き起こされ得る。腹部における脂肪の堆積の増加を引き起こすことができる高フルクトースコーンシロップの存在を通して、ＮＡＦＬＤはソフトドリンクの消費にも関連づけられているが、スクロースの消費は（おそらくフルクトースへのその分解のために）類似の作用を示す。この感受性に関する２つの遺伝子変異が同定されているので、遺伝的特質も一役を担うことが知られている。

無処置のままだと、ＮＡＦＬＤは非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に発達することができる。ＮＡＳＨは、肝臓の肝硬変の主因と考えられている。したがって、それを必要とする患者において非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。

それを必要とする患者において肝臓線維症を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む方法も本明細書で提供される。肝臓線維症は、ほとんどのタイプの慢性肝疾患において起こる、コラーゲンを含む細胞外マトリクスタンパク質の過剰な蓄積である。ある特定の実施形態では、進行した肝臓線維症は、肝硬変および肝不全をもたらす。肝臓組織学、例えば線維症の程度の変化、小葉の肝炎および門脈周囲の架橋状壊死を測定するための方法は、当技術分野で周知である。

一実施形態では、線維組織の形成、フィブロイドまたは線維の変性である肝臓線維症のレベルは、約９０％より多く低減される。一実施形態では、線維組織の形成、フィブロイドまたは線維の変性である線維症のレベルは、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも約４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、少なくとも約５％または少なくとも約２％低減される。

本明細書に記載される一部の実施形態は、肝疾患を処置する方法であって、治療的有効量の本明細書に記載される化合物Ｉの形態または本明細書に記載される医薬組成物を投与することを含む方法に関する。肝疾患は、４ステージに分類することができる：Ｆ０は、線維症を示さない；Ｆ１は、軽度の線維症を示す；Ｆ２は、中等度の線維症を示す；Ｆ３は、重度の線維症を示す；Ｆ４は、肝硬変を示す。一実施形態では、線維症ステージによって測定される肝臓線維症のレベルは、ベースラインから低減される。一実施形態では、ある期間にわたる毎日の処置の後、肝臓線維症ステージの改善はベースラインから１より大きいか、またはベースラインから２より大きい。別の実施形態では、肝臓線維症ステージは、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む方法によって、Ｆ４からＦ３に、Ｆ３からＦ２にまたはＦ２からＦ１に改善される。別の実施形態では、患者の肝臓線維症ステージはＦ３である、それを必要とする患者の肝臓線維症を処置する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む方法が提供される。別の実施形態では、患者の肝臓線維症ステージはＦ４である、それを必要とする患者の肝臓線維症を処置する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む方法が提供される。一実施形態では、ベースラインからの肝臓線維症ステージの改善は、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤と治療的有効量のＡＣＣ阻害剤の組み合わせの２４週間の毎日の投与の後には１より大きい。別の実施形態では、ベースラインからの肝臓線維症ステージの改善は、本明細書に記載される治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせたＡＳＫ１阻害剤の４８または９２週間の毎日の投与の後には１より大きい。さらに別の実施形態では、ベースラインからの肝臓線維症ステージの改善は、本明細書に記載される治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせたＡＳＫ１阻害剤の４８または９２週間の毎日の投与の後には１より大きい。

一実施形態では、本明細書で提供される化合物は、肝臓における線維形成のレベルを低減する。肝臓の線維形成は、線維症として知られる、肝臓における過剰の細胞外マトリクス構成成分の堆積につながる過程である。それは、いくつかの状態、例えば、慢性のウイルス性Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、アルコール性肝疾患、薬物性肝疾患、ヘモクロマトーシス、自己免疫肝炎、ウイルソン病、原発性胆汁性胆管炎（以前は原発性胆汁性肝硬変として知られる）、硬化性胆管炎、肝臓住血吸虫病および他の状態で観察される。一実施形態では、線維形成のレベルは、約９０％より多く低減される。一実施形態では、線維形成のレベルは、少なくとも約９０％、少なくとも約８０％、少なくとも約７０％、少なくとも約６０％、少なくとも約５０％、少なくとも４０％、少なくとも約３０％、少なくとも約２０％、少なくとも約１０％、少なくとも約５％または少なくとも２％低減される。

さらに他の実施形態では、それを必要とする患者において原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて患者に投与することを含む方法が本明細書で提供される。

ＮＡＳＨを有する患者は健康な患者より平均して約２．８歳高齢であることが後成的試験で観察されている。したがって、一実施形態では、ＮＡＳＨの処置のために有用な化合物は、ＮＡＳＨによる後成的年齢または加齢の影響を減速する、改善する、または逆転させるために有用だろう。別の実施形態では、ＮＡＳＨの処置のための併用療法、例えば、本明細書に開示されるＡＳＫ１阻害剤化合物のＡＣＣ阻害剤化合物との組み合わせは、ＮＡＳＨによる加齢の影響の改善または逆転のために有用である可能性がある。

一実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤は、組み合わせ製剤において一緒に、または別個の医薬組成物で投与することができ、ここで各阻害剤を任意の適する剤形で製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ＡＳＫ１阻害剤および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物ならびにＡＣＣ阻害剤および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を別々に投与することを含む。本開示による組み合わせ製剤は、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤を１つまたは複数の薬学的に許容される担体または賦形剤および必要に応じて他の治療剤と一緒に含む。有効成分を含有する組み合わせ製剤は、意図された投与方法に適するいかなる形態であってもよい。

線維症改善は、磁気共鳴エラストグラフィー（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｌａｓｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＭＲＥ）によって測定することができる。１ステージ以上の線維症改善に関して硬さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）を判別するために、ＭＲＥを使用することができる。一実施形態では、本開示は、ヒトに対し、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、式（ＩＶ）の化合物から選択される化合物を、ＮＡＳＨと診断された患者に投与し、ＭＲＥによって線維症改善を測定する方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ヒトに対し、式（Ｉ）の化合物または式（ＩＩ）の化合物を、式（ＩＩＩ）の化合物または式（ＩＶ）の化合物と組み合わせて、または同時に、ＮＡＳＨと診断された患者に投与し、ＭＲＥによって線維症改善を測定する方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＭＲＥによってＮＡＳＨを有するヒトを診断し、ＮＡＳＨを処置するために、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、式（ＩＶ）の化合物またはその組み合わせを投与する方法を提供する。線維症改善を予測するＭＲＥの硬さのＡＵＲＯＣは０．６２（９５％ＣＩ ０．４５〜０．７８）であり、最適な閾値は０％以上の相対的減少である。

組織学的改善は、プロトン密度脂肪分画（ｐｒｏｔｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆａｔ ｆｒａｃｔｉｏｎ）（ＰＤＦＦ）によって測定することもできる。１グレード以上の脂肪症改善を予測するために、ＰＤＦＦを使用することができる。ＰＤＦＦは、ＮＡＳ応答（２ポイント以上の低下）を予測するために使用することもできる。一実施形態では、本開示は、１グレード以上の脂肪症改善を提供するために、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、式（ＩＶ）の化合物から選択される化合物またはその組み合わせを投与する方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、ＮＡＳスコアの２ポイント以上の低下を提供するために、式（Ｉ）の化合物、式（ＩＩ）の化合物、式（ＩＩＩ）の化合物、式（ＩＶ）の化合物から選択される化合物またはその組み合わせを投与する方法を提供する。ＮＡＳ応答を予測するＰＤＦＦのＡＵＲＯＣは０．７０（９５％ＣＩ ０．５１〜０．８９）であり、最適な閾値は２５％以上の相対的減少である。脂肪症改善については、ＰＤＦＦのＡＵＲＯＣは０．７０（９５％ＣＩ ５７〜８３）であり、最適な閾値は０％以上の相対的減少である。

ＡＳＫ１阻害剤
本明細書で開示される方法および医薬組成物のある特定の実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）の構造を有する化合物：
または薬学的に許容されるその塩である。

本明細書で開示される方法および医薬組成物のある特定の実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤は、式（ＩＩ）の構造を有する化合物：
または薬学的に許容されるその塩である。

式（Ｉ）および式（ＩＩ）の化合物は、当業者に公知である方法、例えば、米国特許第８，７４２，１２６号および米国特許出願公開第２０１１／０００９４１０号および２０１３／０１９７０３７号に記載されるものを使用して合成し、特徴付けることができる。一実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）の化合物または薬学的に許容されるその塩である。一実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤は、式（ＩＩ）の化合物または薬学的に許容されるその塩である。

ＡＣＣ阻害剤
本明細書で開示される方法および医薬組成物のある特定の実施形態では、ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩＩ）の構造を有する化合物：
または薬学的に許容されるその塩である。

本明細書で開示される方法および医薬組成物のある特定の実施形態では、ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＶ）の構造を有する化合物：
または薬学的に許容されるその塩である。

式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）の化合物は、当業者に公知である方法、例えば、国際出願公開第２０１３０７１１６９号に記載されるものを使用して合成することおよび特徴付けることができる。

投薬および投与
有効成分は単独で投与することが可能であるが、下記のように医薬製剤または医薬組成物としてそれらを投与し得る。獣医学およびヒトでの使用のための本開示の製剤は、有効成分の少なくとも１つを、そのための１つまたは複数の許容される担体、および必要に応じて他の治療成分と一緒に含む。担体（複数可）は、製剤の他の成分に適合するという意味、およびそのレシピエントにとって生理的に無害であるという意味において「許容」されなければならない。

有効成分の各々は従来の担体および賦形剤で製剤化することができ、それらは通常の実施に従って選択される。錠剤は、賦形剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、充填剤、結合剤などを含有することができる。水性製剤は無菌形態で調製され、経口投与以外による送達が意図される場合には、一般的に等張性である。全ての製剤は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（１９８６年）に示されるものなどの賦形剤を必要に応じて含有する。賦形剤には、アスコルビン酸および他の抗酸化剤、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、炭水化物、例えばデキストリン、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルメチルセルロース、ステアリン酸などが含まれる。製剤のｐＨは、約３から約１１の範囲内であるが、通常は約７から１０である。

有効成分の治療的有効量は、従来の用量漸増研究を使用して、熟練した臨床医が容易に決定することができる。一般的に、有効成分（すなわち、本明細書に記載の化合物）は、０．０１ミリグラムから２グラムまでの用量で投与される。一実施形態では、投薬量は、約１０ミリグラムから４５０ミリグラムまでである。別の実施形態では、投薬量は、約２５から約２５０ミリグラムまでである。別の実施形態では、投薬量は、約５０または１００ミリグラムである。一実施形態では、投薬量は、約１００ミリグラムである。有効成分は、１日につき１回、２回または３回投与することができることが意図される。さらに、有効成分は、週１回もしくは２回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、５週に１回または６週に１回投与することができる。一実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤の用量は６から２５ミリグラムであり、ＡＣＣ阻害剤の用量は５から３０ミリグラムである。一実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤の用量は約６ミリグラムであり、ＡＣＣ阻害剤の用量は約１０ミリグラムである。一実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤の用量は約６ミリグラムであり、ＡＣＣ阻害剤の用量は約２０ミリグラムである。一実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤の用量は１８ミリグラムであり、ＡＣＣ阻害剤の用量は２０ミリグラムである。ある特定の実施形態では、用量は、合計日用量である。

有効成分のための医薬組成物には、上述の投与経路に適するものを含めることができる。製剤は単位剤形で都合よく提供することができ、薬学分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。技術および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に一般的に見出される。そのような方法は、有効成分を１つまたは複数の副成分を構成する担体と合わせるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体または微粉固体担体または両方と均一および緊密に合わせ、次に、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。

経口投与に適する製剤は、有効成分の所定量を各々含有するカプセル剤、カシェ剤もしくは錠剤などの個別の単位として；粉末もしくは顆粒として；水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁物として；または、水中油型の液体乳剤もしくは油中水型の液体乳剤として提供することができる。有効成分は、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与することもできる。ある特定の実施形態では、有効成分は、皮下注射として投与されてもよい。

錠剤は、必要に応じて１つまたは複数の副成分と一緒に、圧縮または成形によって作製することができる。圧縮錠剤は、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤または界面活性剤と必要に応じて混合した、粉末または顆粒などの易流動性の形態の有効成分を適する機械の中で圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性の液体希釈剤で湿らせた粉末化有効成分の混合物を適する機械の中で成形することによって作製することができる。錠剤は、必要に応じてコーティングすることまたは刻みを付けることができ、必要に応じてそこからの有効成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化される。

有効成分は、状態に適当な任意の経路によって投与することができる。適する経路には、経口、直腸、経鼻、局所（口内および舌下を含む）、膣および非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）などが含まれる。好ましい経路は、例えばレシピエントの状態によって異なってもよいことが理解される。ある特定の実施形態では、有効成分は経口で生体利用可能であり、したがって、経口的に投薬することができる。一実施形態では、患者はヒトである。

本明細書で開示される方法において組み合わせで使用されるとき、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤は、単一の医薬組成物で一緒に、または複数の医薬組成物で別々に（同時または逐次的に）投与することができる。ある特定の実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤は、一緒に投与される。他の実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤は、別々に投与される。一部の態様では、ＡＳＫ１阻害剤は、ＡＣＣ阻害剤の前に投与される。一部の態様では、ＡＣＣ阻害剤は、ＡＳＫ１阻害剤の前に投与される。別々に投与されるとき、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤は、同じまたは異なる送達経路によって患者に投与することができる。
医薬組成物

医薬組成物
本開示の医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩ）の化合物から選択される有効量のＡＳＫ１阻害剤、ならびに式（ＩＩＩ）の化合物および式（ＩＶ）の化合物からなる群から選択される有効量のＡＣＣ阻害剤を含む。

例えば経口使用のために使用されるとき、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁物、分散性の粉末もしくは顆粒、乳剤、ハードもしくはソフトカプセル、シロップ剤またはエリキシル剤を調製することができる。経口使用を目的とする組成物は、医薬組成物の製造のための当技術分野で公知の任意の方法によって調製することができ、そのような組成物は、口に合う調製物を提供するために、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤および保存剤を含む、１つまたは複数の作用物質を含有することができる。錠剤の製造のために適する無毒の薬学的に許容される賦形剤と混合された有効成分を含有する錠剤が、許容される。これらの賦形剤は、例えば、不活性の希釈剤、例えば、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウム、ラクトース、ラクトース一水和物、クロスカルメロースナトリウム、ポビドン、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；顆粒化および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプンまたはアルギン酸；結合剤、例えば、セルロース、微結晶性セルロース、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム；ならびに、潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであってよい。錠剤はコーティングされなくてもよく、または、胃腸管で崩壊および吸着を遅延させ、それによってより長い期間の持続作用を提供するために、マイクロカプセル化を含む公知の技術によってコーティングされてもよい。例えば、時間遅延材料（ｔｉｍｅ ｄｅｌａｙ ｍａｔｅｒｉａｌ）、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを単独で、またはワックスと一緒に用いることができる。

経口使用のための製剤は、有効成分が不活性の固体希釈剤、例えばリン酸カルシウムもしくはカオリンと混合されるハードゼラチンカプセルとして、または、有効成分が水もしくは油媒体、例えば落花生油、流動パラフィンもしくはオリーブ油と混合されるソフトゼラチンカプセルとして提供することもできる。

本開示の水性懸濁物は、水性懸濁物の製造に適する賦形剤と混合させた活性材料を含む。そのような賦形剤には、懸濁剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム、ならびに、分散または湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸の縮合生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が含まれる。水性懸濁物は、例えばエチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１つまたは複数の保存剤、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の矯味矯臭剤、および例えばスクロースまたはサッカリンなどの１つまたは複数の甘味剤を含むこともできる。

植物油、例えば落花生油、オリーブ油、胡麻油もしくはヤシ油に、または例えば流動パラフィンなどの鉱油に有効成分を懸濁することによって、油性懸濁物を製剤化することができる。油性懸濁物は、例えば蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含有することができる。口に合う経口調製物を提供するために、例えば上に示すものなどの甘味剤、および矯味矯臭剤を添加することができる。これらの組成物は、例えばアスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存することができる。

水の添加による水性懸濁物の調製に適する本開示の分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つまたは複数の保存剤と混合させた有効成分を提供する。適する分散剤または湿潤剤、および懸濁剤は、上で開示されるものによって例示される。さらなる賦形剤、例えば甘味剤、矯味矯臭剤および着色剤が存在してもよい。

本開示の医薬組成物は、水中油型乳剤の形態であってもよい。油相は、例えばオリーブ油または落花生油などの植物油、例えば流動パラフィンなどの鉱油、またはこれらの混合物であってよい。適する乳化剤には、天然に存在するゴム、例えばアラビアゴムおよびトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、例えばダイズレシチン、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、ならびにエチレンオキシドとのこれらの部分エステルの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが含まれる。乳剤は、甘味剤および矯味矯臭剤を含有することもできる。シロップ剤およびエリキシル剤は、例えばグリセロール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤で製剤化することができる。そのような製剤は、粘滑薬、保存剤、矯味矯臭剤または着色剤を含有することもできる。

本開示の医薬組成物は、例えば無菌の注射可能な水性または油性の懸濁物などの、無菌の注射可能な調製物の形態であってよい。この懸濁物は、上で言及されている適する分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用する公知の技術によって製剤化することができる。無菌の注射可能な調製物は、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液などの無毒の非経口的に許容される希釈剤もしくは溶媒中の無菌の注射可能な溶液もしくは懸濁物であってもよいか、または凍結乾燥粉末として調製されてもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液および等張性の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、溶媒または懸濁媒体として、無菌の不揮発性油を従来通り用いることができる。この目的のために、合成のモノまたはジグリセリドを含む、任意の刺激の少ない不揮発性油を用いることができる。さらに、注射剤の調製において、例えばオレイン酸などの脂肪酸を同様に使用することができる。

単一の剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、処置する宿主および特定の投与様式、例えば経口投与または皮下注射によって異なる。例えば、ヒトへの経口投与のために意図される時限放出製剤は、概ね１から１０００ｍｇの活性材料を、全組成物の約５から約９５％（重量：重量）まで変動してよい適当な、および好都合な量の担体材料と混合されて含有することができる。投与のために容易に測定可能な量を提供するように、医薬組成物を調製することができる。例えば、約３０ｍＬ／時間の速度での適する体積の注入ができるように、静脈内注入のために意図される水溶液は、溶液１ミリリットルにつき約３から５００μｇの有効成分を含有することができる。皮下投与のために製剤化されるとき、製剤は、一般的に約２から約４カ月の期間にわたって１カ月につき約２回投与される。

非経口投与のために適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を、意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有することができる、水性および非水性の無菌注射溶液；ならびに、懸濁剤および増粘剤を含むことができる、水性および非水性の無菌懸濁物が含まれる。

製剤は、単位用量または多回用量容器、例えば、密封アンプルおよびバイアルで提供することができ、使用直前に無菌の液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席の注射溶液および懸濁物は、前記の種類の無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製される。好ましい単位投薬製剤は、本明細書で上に挙げたような、有効成分の１日用量または単位１日部分用量（ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、またはその適当な部分を含有するものである。

（実施例１ ＮＡＳＨのマウスモデルにおける有効性）
以下の研究は、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）のマウスモデルにおいて、モデルにおける単独の個々の薬剤の有効性と比較した、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤の組み合わせの有効性を評価するために実行した。ＮＡＳＨは、合計６カ月間の飽和脂肪、コレステロールおよび糖分の高い「ファーストフード」食（ＦＦＤ）の慢性投与によって雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて誘導し、痩せ型（ｌｅａｎ）対照動物は、通常の固形飼料食で維持した。ＮＡＳＨ表現型は６カ月後に対照マウスと比較してＦＦＤマウスにおいて確立され、大滴性脂肪変性、高いＡＬＴおよびＡＳＴ、ならびに肝臓星細胞の活性化に関連した転写物の増加したレベルによって特徴付けられた。Ｃｈａｒｌｔｏｎ Ｍら、「Ｆａｓｔ ｆｏｏｄ ｄｉｅｔ ｍｏｕｓｅ： ｎｏｖｅｌ ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＮＡＳＨ ｗｉｔｈ ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ， ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｆｉｂｒｏｓｉｓ， ａｎｄ ｈｉｇｈ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ」。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ。Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０１１年；３０１巻（５号）：Ｇ８２５〜３４頁を参照。

５カ月後、ＦＦＤマウスをプラセボ（ビヒクル）、ＡＳＫ１阻害剤（式（Ｉ））、ＡＣＣ阻害剤（式（ＩＩＩ））または式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の組み合わせによってその後１カ月間処置した。対照マウスは、６カ月の全試験期間の間、通常の固形飼料食のままであった。エンドポイント分析は、肝臓脂肪症（脂肪症面積の％）、肝臓トリグリセリド、肝臓コレステロール、ＡＬＴの形態計測的定量化、ならびに線維症促進転写物Ｔｉｍｐ１およびＣｏｌ１Ａ１の測定を含んだ。

方法
動物
この研究では、雄Ｃ５７ＣＬ／６マウス（試験開始時１２週齢）を使用した。動物を試験するために使用した全ての手順は、米国農務省のＡｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ（９ＣＦＲパート１、２および３）；Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．）；およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅに従った。

ＦＦＤマウスモデルのための生存中の実験プロトコール
実験設計を、表１に示す。試験動物に、標準の固形飼料食（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ Ｇｌｏｂａｌ Ｄｉｅｔｓ ２０１４、ＴＤ２０１４）または市販されている高脂肪、本明細書においてＮＡＳＨ食と呼称する高コレステロール食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ Ｉｎｃ、ＤＢ１２０７９Ｂ）を投与した。ＦＦＤを受けた動物は、以下の通りに配合された飲料水中のフルクトース／グルコースを投与された：２３．１ｇフルクトース（Ｓｉｇｍａ、Ｆ２５４３）および１７．２ｇのグルコース（Ｓｉｇｍａ、４９１５８）を、１０００ｍＬの飲料水に混合した。

研究の最終月の間（５カ月目〜６カ月目）、単独の式（Ｉ）の化合物または式（ＩＩＩ）の化合物、または式（Ｉ）および式（ＩＩＩ）の化合物の組み合わせによる処置を投与した。式（Ｉ）の化合物はＦＦＤ食において０．１５％混合物として投与し、式（ＩＩＩ）の化合物は、逆浸透水中の０．５％カルボキシメチルセルロースナトリウム（中間粘度）、１％エタノール、９８．５％の５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８、に製剤化した。式（ＩＩＩ）の化合物は０．１または０．２ｍｇ／ｍＬで製剤化し、表に提供した用量で与えた。

ＰＯ投薬の開始の５日前に、群２および５に、食餌に粉砕混合した０．１５％の式（Ｉ）の化合物を含有するＤＢ１２０７９Ｂを３５日間与えた。式（Ｉ）の化合物を導入する第１週の間の食物嫌悪を克服するように、式（Ｉ）の化合物の１週間のリードイン（ｌｅａｄ−ｉｎ）投薬を設計した。ＰＯ投薬の７日前に開始して、群１〜７の動物は、１日２回ビヒクルを偽投薬した。偽投薬は、動物を経口胃管栄養用量投与に順応させるように設計されていた。試験の１日目に開始して、全ての用量群の動物は、１日に３回投薬した；化合物を含有しない製剤（群１、ビヒクル）または下で（表１）概説される適当な化合物を含有する同じ体積の製剤を、ＡＭ（７：００＋／−１時間）に２回逐次的に、および夕方（１９：００＋／−１時間）に１回、２８日間（２９日目の投薬まで）。各群を２つに分け、２９日目に半分は用量の２時間後に屠殺し、半分は用量の８時間後に屠殺した。

肝臓脂肪症の測定
ヘマトキシリンとエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色したスライドの全スライドスキャン画像を、ＡｐｅｒｉｏＡＴ２スキャナ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を倍率４０×で使用して捕捉した。デジタルスライド画像をスキャン品質についてチェックし、注釈を付け、ライカデジタル画像ハブ（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）アーカイブの中の適当なネットワークフォルダにエクスポートした。Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ画像分析ソフトウェア（Ｖｉｓｏｐｈａｒｍ、Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して、全スライドスキャン画像上で脂肪症の定量化を実行した。肝実質の中の脂質液胞（ｌｉｐｉｄ ｖａｃｕｏｌｅ）は、低光学密度（白色）の円形領域であった。これらの領域の数およびサイズを列挙し、全脂肪症性面積（ｔｏｔａｌ ｓｔｅａｔｏｔｉｃ ａｒｅａ）を全肝臓組織断面積の百分率で表した。肝内血管（門脈および中心静脈の支脈など）は、サイズおよび形状に基づいてこの分析から排除した。結果の精度を確認するために、自動分析のマスクを個々に精査した。用量の８時間後に屠殺した動物（各群の半分）で、肝臓脂肪症を決定した。全ての他の分析は、全ての動物で実行した。
マウス肝臓からのトリグリセリドおよびコレステロールの定量化

組織抽出：マウス肝臓組織試料（２５±１０ｍｇ、凍結状態で正確に秤量する）をホモジナイズし、トリアシルグリセリド分画ならびに遊離のおよびエステル化されたコレステロール分画を有機相に抽出する水不混和性の有機溶媒混合物で抽出した。遠心分離の後、トリアシルグリセリド、コレステロールおよびコレステロールエステルを含有する有機上層のアリコートを、エタノールで１０倍または２５倍に希釈した。この希釈物の２つの別個のアリコートをとった。１つのアリコートはトリアシルグリセリドについて分析し、第２のアリコートは全コレステロール決定のために使用した。

トリアシルグリセリド決定：トリアシルグリセリド決定のために、２５倍希釈物（または、低トリアシルグリセリド含有量を有する試料の場合は希釈なし）の１つのアリコートは、窒素ストリームの下で蒸発させた。乾燥抽出物は、超音波処理の下でのＰＢＳ溶液中の０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで、続いてトリアシルグリセリド決定試薬（Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）トリグリセリド液体安定試薬、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、製品データシート、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）、トリグリセリド液体安定試薬）との混合によって段階的に再構成した。

この試薬溶液は、いくつかの酵素、補因子および発色試薬４−アミノアンチピリンを含有した。この試薬によるトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）の決定は、以下の通り、Ｗａｋｏ、製品データシート、トリアシルグリセリド−ＧコードＮｏ．９９７−６９８０１、Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ．、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ、の方法、ならびにＭｃＧｏｗａｎら（ＭｃＧｏｗａｎ， ＭＷら、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ１９８３年：２９巻：５３８頁）およびＦｏｓｓａｔｉら（Ｆｏｓｓｅｔｉ， Ｐ． Ｐｒｅｎｃｉｐｌｅ Ｌ． Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．１９８２年：２８巻：２０７７〜８０頁）による改変に基づいた：
１．トリグリセリドは、リパーゼによって遊離脂肪酸およびグリセロールに酵素的に加水分解される。
２．グリセロールは、グリセロールキナーゼ（ＧＫ）を用いてアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）によってリン酸化され、グリセロール−３−リン酸およびアデノシン二リン酸を生成する。
３．グリセロール−３−リン酸はグリセロールリン酸オキシダーゼによってジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＡＰ）によって酸化され、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を生成する。
４．ペルオキシダーゼによって触媒されるＴｒｉｎｄｅｒ^５タイプの呈色反応では、Ｈ_２Ｏ_２は、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡＰ）および３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホネート（ＤＨＢＳ）と反応して、赤色色素を生成する。この色素の吸光度は、試料中に存在するトリグリセリドの濃度に比例する。

３７℃で３０分間のトリアシルグリセリド決定試薬とのインキュベーションの後、試料をマイクロタイタープレートに移し、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で吸光度を５４０ｎｍで測定する。定量化は、トリアシルグリセリド参照標準としてグリセリルトリオレエート（トリオレイン）を使用した、強化された較正標準から生成された線形最小二乗回帰分析を使用して実行した。較正標準試料は、組織試料と同じ抽出およびインキュベーションステップを通してとった。重量補正および濃度計算は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）２０１３を使用して実行した。最終組織含有量は、肝臓組織１ｇあたりのμｍｏｌトリアシルグリセリド（ＴＡＧ）で与えられた。

総コレステロール決定：総コレステロール決定のために、内部標準溶液（コレステロール−ｄ_６）および１Ｍエタノール水酸化カリウム溶液を１０倍試料希釈物（上を参照）のアリコートに加えた。コレステロールエステルを遊離脂肪酸およびコレステロールに加水分解するために、混合物を７０℃で１時間インキュベートした。その後、反応混合物を氷酢酸で酸性化し、ヘキサンで抽出した。ヘキサン層を取り出し、蒸発させ、アセトニトリルで再構成した。

Ｃ１８反転相カラムを備えているＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ／ＡＢ Ｓｃｉｅｘ ＱＴｒａｐ ４０００ ＬＣ ＭＳ／ＭＳシステムの上へ、再構成した抽出物のアリコートを注入した。質量分析計は、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）を使用してポジティブモードで操作した。

コレステロールのｍ／ｚ ３６９［Ｍ−Ｈ_２Ｏ］^＋→１６１^＋生成物イオンのピーク面積は、ｍ／ｚ ３７５［Ｍ−Ｈ_２Ｏ］^＋→１６７^＋のコレステロール−Ｄ_６生成物イオンのピーク面積に対して測定した。参照標準としてコレステリルオレエートを使用して、強化された較正標準から生成された加重（１／ｘ）線形最小二乗回帰分析を使用して定量化を実行した。較正標準試料は、組織試料と同じ抽出および加水分解ステップを通してとった。生データを収集し、ＡＢ ＳＣＩＥＸソフトウェアＡｎａｌｙｓｔ １．５．１を使用して処理した。データ整理、重量補正、コレステリルオレエートからコレステロールへの加水分解のための補正および濃度計算は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）２０１３を使用して実行した。最終組織含有量は、肝臓組織１ｇあたりの総コレステロールｍｇで与えた。
ＡＬＴ

末期の剖検で血清を全てのマウスから収集した。血清ＡＬＴは、ピリドキサール−５’−リン酸によってピルビン酸塩によって測定し、Ｃｏｂａｓ Ｈｉｔａｃｈｉ ６０００ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓで分析した。

遺伝子発現
溶解およびＲＮＡ抽出のために、凍結左側葉の概ね１００ｍｇのかたまりを、ＤＣ３に送った。ＲＮＡ転写物を測定するために、ｎＣｏｕｎｔｅｒマスターキット（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）に含まれる全試薬および消耗品でＮａｎｏＳｔｒｉｎｇアッセイを製造業者の指示に従って実行した。簡潔には、１１０個の肝臓線維症関連遺伝子および６つの対照ハウスキーピング遺伝子（表２）を標的にするカラーコードリポータープローブを、予熱した６５℃サーモサイクラーの中でハイブリダイゼーション緩衝液および捕捉プローブを含む反応において１００ｎｇのＲＮＡ試料と１６から２２時間、一晩ハイブリダイズさせた。インキュベーションの後、試料をプレップステーションに置き、そこでは、過剰なプローブを除去し、プローブ−転写物複合体をストレプトアビジンでコーティングされたカートリッジの上に固定化した。最後に、カートリッジをｎＣｏｕｎｔｅｒ Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）で画像化した。全ての転写物は、ｎＳｏｖｅｒ ３．０ソフトウェアによって６つのハウスキーピング遺伝子（Ｂ２ｍ、ＨＲＰＴ、Ｐｇｋ１、ＲＰＬ１３ａ、Ｒｐｎ１およびＳＦＲＳ４）の幾何平均に正規化した。

結果
実施例１は、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤を組み合わせた処置が、単独で投与されるいずれの薬剤より大きな抗脂肪症有効性（ａｎｔｉ−ｓｔｅａｔｏｉｃ ｅｆｆｉｃａｃｙ）をもたらすことを示す。詳細には、図１は、式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の組み合わせに関して、大滴性脂肪変性の有意な低減を示す。実施例１は、式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の組み合わせに関して、肝臓トリグリセリド（図２）、肝臓コレステロール（図３）および血清ＡＬＴ（図４）に対する組み合わせについての有意な改善も示す。さらに、式（Ｉ）の化合物および式（ＩＩＩ）の化合物の組み合わせは、線維症促進転写物Ｃｏｌ１Ａ１が低減する傾向を示し（図６）、この組み合わせはＴｉｍｐ１転写物の有意な低減を示した（図５）。

（実施例２ コリン欠乏、高脂肪、高コレステロールＮＡＳＨモデルにおける有効性）
以下の研究は、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）のげっ歯動物モデルにおいて、モデルにおける単独の個々の薬剤の有効性と比較した、ＡＳＫ１阻害剤（ＡＳＫ１ｉ）およびＡＣＣ阻害剤（ＡＣＣｉ）の組み合わせの有効性を評価するために実行した。このモデルでは、ＮＡＳＨは、コリン欠乏高脂肪食（ＣＤＨＦＤ）の投与によって雄ウィスターラットにおいて誘導した。
動物

動物
雄ウィスター（Ｃｒｌ：Ｗｉ（Ｈａｎ））ラット（到着時８〜９週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣから得て、現在の研究で使用した。この研究は、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ規則（連邦行政命令集、タイトル９）の最終規則の全ての適用可能なセクション、Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ ＷｅｌｆａｒｅからのＰｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ ｏｎ Ｈｕｍａｎｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ、およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｏｕｎｃｉｌからのＧｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓに従った。

ビヒクル調製
脱イオン水の中のビヒクル、ｗ／ｖ５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８を使用前に調製し、２〜８℃を維持するように設定した冷蔵庫に保存した。１Ｌを調製するために、８００ｍＬの熱水（約８０℃）を適当な容器に加え、激しい渦が形成されるまで激しく撹拌した。５．０グラムのメチルセルロースナトリウムをボルテックスで撹拌しながらカルボキシメチルセルロースナトリウムに徐々に加えた。全てのカルボキシメチルセルロースが溶解するまで撹拌を継続し、溶液を周囲温度まで冷却した。５．１２ｇのトリスＨＣｌを、容器に加えた。２．１２ｇのトリス塩基を、容器に加えた。１０ｇのエタノールを、容器に加えた。構成成分を概ね１５分間撹拌して、全ての固体を確実に溶解した。弱く混合しながら、ＱＳ水を１Ｌまで加えた。

式（ＩＩＩ）調製物
式（ＩＩＩ）製剤は、式（ＩＩＩ）を所望の濃度に希釈することによって、ビヒクルを使用して調製した。
試験設計

食事は自由摂食とし、表３に概説したように、標準食（５ＣＲ４）を受けた群１、対照固形飼料群を除いて、試験の１日目に全ての試験動物はコリン欠乏、高脂肪、高コレステロール食（ＣＤＨＦＤ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ、Ａ１６０９２００３）を与えられた。ＡＳＫ１阻害剤を受けた動物については、ＡＳＫ１ｉは食餌（食餌Ａ１６１１１１０１）において投与された。食餌Ａ１６１１１１０１は、ＡＳＫ１ｉが添加されていた（０．０３％）、コリン欠乏、高脂肪、高コレステロール食である。屠殺の日、肝臓を採取してパラフィン包埋し、血漿を収集して冷凍した。屠殺の日、動物は投薬されなかった。

組織はＲｅｎｏ、ＮｅｖａｄａのＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒによって収集され、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡのＨｉｓｔｏ−ｔｅｃにおいて処理およびパラフィン包埋され、その後Ｆｏｓｔｅｒ ＣｉｔｙのＧｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに送付された。厚さ５μｍの組織切片を染色のために調製した。

ピクロシリウスレッド染色：切片は０．２％リンモリブデン酸（ＥＭＳ、Ｃａｔ＃２６３５７−０１）で前処理し、次に室温で１時間、飽和ピクリン酸溶液（ＥＭＳ、Ｃａｔ＃２６３５７−０２）の中の０．１％（ｗ／ｖ）Ｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄ ８８−８９−１にその後インキュベートした。これの後に、０．０１Ｎ ＨＣｌ（ＥＭＳ、Ｃａｔ＃２６３５７）の中での分染および段階的なアルコールでの脱水が続いた。

ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色スライドの全スライド画像を、ライカＡＴ２スキャナを４０×倍率で使用して捕捉した。デジタルスライド画像をスキャン品質についてチェックし、注釈を付け、ライカデジタル画像ハブアーカイブの中の適当なネットワークフォルダにエクスポートした。ＰＳＲの程度および強度を決定するために、Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ画像分析ソフトウェア（Ｖｉｓｉｏｐｈａｒｍ、Ｈｏｅｒｓｈｏｌｍ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して全スライド画像の上で定量的画像分析を実行した。ＰＳＲで染色された全面積を測定し、染色された肝臓全面積の百分率で表した。結果を、図７に示す。

血漿ＴＩＭＰ−１ ＥＬＩＳＡ：血漿ＴＩＭＰ−１の濃度は、市販のラットＴＩＭＰ−１特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を使用して二連で決定した。わずかに改変した製造業者の仕様書により、ＴＩＭＰ−１を血漿でアッセイした。マウス抗ＴＩＭＰ−１で予めコーティングしたＥＬＩＳＡプレートウェルに、緩衝液ＲＤ１−２１（５０μｌ）を加えた。ＥＬＩＳＡの前に、ラットＴＩＭＰ−１の７点標準曲線（ＮＳ０発現組換えＴＩＭＰ−１：２４００〜３７．５ｐｇ／ｍＬ）を作成し、血漿試料を緩衝液ＲＤ５−１７で１：１００に希釈した。ＲＤ１−２１を含有するウェルに試料および標準（各々５０μｌ）を二連で加え、オービタルプレート振盪機（３００ｒｐｍ）の上で２時間インキュベートした（室温）。抗原捕捉の後、自動プレート洗浄機を使用してプレートを洗浄緩衝液で５回洗浄した（３５０μＬ／ウェル／洗浄）。洗浄の後、各ウェルにラットＴＩＭＰ−１コンジュゲート（１００μｌ）を加え、オービタルプレート振盪機（３００ｒｐｍ）の上でプレートを２時間インキュベートした（室温）。プレートを次に５回洗浄し、基質溶液（１００μｌ）を各ウェルに加えた。遮光下で３０分間、プレートを室温でインキュベートした。最後に、停止溶液（１００μｌ）を各ウェルに加えた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）の上で、光学密度（Ｏ．Ｄ．）吸光度を４５０ｎｍで直ちに決定した。各標準および試料のための相対Ｏ．Ｄ．をブランク試料に対してバックグラウンド補正し、ＴＩＭＰ−１濃度へのＯ．Ｄ．の変換のための標準曲線を、４パラメーター曲線あてはめ方法を使用して作成した。未知試料のＴＩＭＰ−１濃度は、２０の希釈係数を使用したＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ５ソフトウェアを使用して決定した。結果を、図８に示す。

血漿ヒアルロン酸（ＨＡ）アッセイ：血漿ＨＡ濃度は、市販のＨＡ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ（Ｃｏｒｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、Ｂｒｏｏｍｆｉｅｌｄ、ＣＯ）を使用して、二連で決定した。わずかに改変した製造業者の仕様書により、ＨＡを血漿でアッセイした。アッセイの前に、ＨＡ参照溶液（８００〜１２．５ｎｇ／ｍＬ）の７点標準曲線を作成し、各参照試料および血漿試料を、１０部の反応緩衝液に対して１部で希釈した（３００μｌ反応緩衝液に対して３０μｌの参照／試料）。ＨＡ結合性タンパク質（ＨＡＢＰ）で予めコーティングしたマイクロプレートウェルに試料および標準（１００μｌ）を二連で加え、オービタルプレート振盪機（３００ｒｐｍ）の上で６０分間インキュベートした（室温）。抗原捕捉の後、自動プレート洗浄機を使用してプレートをＰＢＳで４回洗浄した（３５０μＬ／ウェル／洗浄）。洗浄の後、各ウェルにＨＲＰコンジュゲートＨＡＢＰ（１００μｌ）を加え、オービタルプレート振盪機（３００ｒｐｍ）の上でプレートを３０分間インキュベートした（室温）。プレートを次に４回洗浄し、１成分基質溶液（１００μｌ）を各ウェルに加えた。遮光下で３０分間、プレートを室温でインキュベートした。最後に、停止溶液（１００μｌ）を各ウェルに加えた。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）の上で、光学密度（Ｏ．Ｄ．）吸光度を４５０ｎｍで直ちに決定した。各標準および試料のための相対Ｏ．Ｄ．をブランク試料に対してバックグラウンド補正し、ＨＡ濃度へのＯ．Ｄ．の変換のための標準曲線を、４パラメーター曲線あてはめ方法を使用して作成した。未知試料のＨＡ濃度は、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ５ソフトウェアを使用して決定した。結果を、図９に示す。

結果
実施例２は、ＡＳＫ１ｉおよびＡＣＣｉの抗線維症の有効性を実証する。通常食のラットと比較して、６週（２．７％の面積）および１２週（８．３％の面積）時に、ＣＤＨＦＤは肝臓のＰＳＲを有意に増加させた。ＡＳＫ１ｉ、ＡＣＣｉまたはＡＳＫ１ｉ＋ＡＣＣｉによる処置は、ＰＳＲをそれぞれ１８％（ｎｓ）、５０％（ｐ＜０．０５）および５９％（ｐ＜０．０１）低減した。ＴＩＭＰ１の血漿レベルはＣＤＨＦＤラットにおいて増加し、ＡＳＫ１ｉ＋ＡＣＣｉによって処置開始時レベル未満に低減された（ｐ＜０．０５）。ＨＡは、全てのＡＣＣｉ含有群で低減された。

（実施例３ ＮＡＳＨにおけるアポトーシスシグナル調節キナーゼ（ＡＳＫ１）阻害剤（式（ＩＩ））とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤（式（ＩＶ））の組み合わせの前臨床研究）
ＭＲＥによる肝臓のプロトン密度脂肪分画（ＰＤＦＦ）≧１０％および肝臓硬さ≧２．８８ｋＰａ、またはＮＡＳＨと一貫した肝生検およびステージ２〜３線維症によって診断されたＮＡＳＨを有する７０人の被験体が登録された。連続したコホートが、式（ＩＩ）１８ｍｇ、式（ＩＶ）２０ｍｇによる単独療法、または式（ＩＩ）＋式（ＩＶ）（１８／２０ｍｇ）による併用療法を１２週間ＱＤで経口的に受けた。中央読取り（ｃｅｎｔｒａｌｌｙ−ｒｅａｄ）ＰＤＦＦおよびＭＲＥ、ならびに血清線維症マーカーを、ベースライン時（ＢＬ）、Ｗ４およびＷ１２に測定した。脂質の部分的合成（新規脂質生成［ＤＮＬ］）を測定するために、重水素水を投与した。

１２週間にわたって、全てのレジメンは安全で、十分な耐容性を示した。類似のＡＥ率が、単独療法コホートと組み合わせコホートの間で観察された（表４）。早期に処置を中止した被験体はいなかった。ＢＬと比較して、式（ＩＶ）は、ＰＤＦＦ（ｐ＝０．００６）およびＴＩＭＰ−１（ｐ＝０．０４９）における有意な改善、ならびにＡＬＴおよびＰＩＩＩ−ＮＰにおける有意でない低減をもたらした（表４）。式（ＩＩ）＋式（ＩＶ）の組み合わせは、ＰＤＦＦ（ｐ＜０．００１）、ＡＬＴ（ｐ＝０．０１９）およびＰＩＩＩ−ＮＰ（ｐ＝０．０５７）における有意な低減につながった。

ＮＡＳＨ患者におけるこの研究では、式（ＩＩ）＋式（ＩＶ）の組み合わせによる１２週処置は安全であって、肝臓脂肪症、肝臓生化学および線維症マーカーの改善につながった。

本明細書で提供される方法では、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤は、同時投与されてもよい。そのような実施形態では、ＡＳＫ１阻害剤およびＡＣＣ阻害剤は、単一の医薬組成物として一緒に投与されてもよいか、または複数の医薬組成物で別々に投与されてもよい。したがって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物も本明細書で提供される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩＩ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
(項目２)
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＶ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
(項目３)
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（ＩＩ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩＩ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
(項目４)
肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（ＩＩ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＶ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
(項目５)
前記ＡＳＫ１阻害剤および前記ＡＣＣ阻害剤が一緒に投与される、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
前記ＡＳＫ１阻害剤および前記ＡＣＣ阻害剤が別々に投与される、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
前記肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩＩ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
(項目９)
治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＶ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
(項目１０)
治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（ＩＩ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩＩ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
(項目１１)
治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（ＩＩ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＶ）：
の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
(項目１２)
薬学的に許容される担体をさらに含む、項目８から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

Claims (12)

1. 肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
   前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩＩ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
2. 肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
   前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＶ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
3. 肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（ＩＩ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
   前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩＩ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
4. 肝疾患の処置および／または予防を必要とする患者において肝疾患を処置および／または予防する方法であって、治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤を治療的有効量のＡＣＣ阻害剤と組み合わせて前記患者に投与することを含み、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（ＩＩ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
   前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＶ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩である、方法。
5. 前記ＡＳＫ１阻害剤および前記ＡＣＣ阻害剤が一緒に投与される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ＡＳＫ１阻害剤および前記ＡＣＣ阻害剤が別々に投与される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記肝疾患が非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
   前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩＩ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
9. 治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（Ｉ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
   前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＶ）：
   の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
10. 治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（ＩＩ）：
    の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
    前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＩＩ）：
    の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
11. 治療的有効量のＡＳＫ１阻害剤および治療的有効量のＡＣＣ阻害剤を含む医薬組成物であって、前記ＡＳＫ１阻害剤は、式（ＩＩ）：
    の化合物または薬学的に許容されるその塩であり；
    前記ＡＣＣ阻害剤は、式（ＩＶ）：
    の化合物または薬学的に許容されるその塩である、医薬組成物。
12. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項８から１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。