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TW201840845A - 保護移植組織免受排斥的方法 - Google Patents

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TW201840845A
TW201840845A TW107110789A TW107110789A TW201840845A TW 201840845 A TW201840845 A TW 201840845A TW 107110789 A TW107110789 A TW 107110789A TW 107110789 A TW107110789 A TW 107110789A TW 201840845 A TW201840845 A TW 201840845A
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TW
Taiwan
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cells
cell
domain
hla
chimeric antigen
Prior art date
Application number
TW107110789A
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English (en)
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詹姆斯Ｌ 萊利
加文 艾利斯
Original Assignee
賓夕法尼亞大學董事會
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Publication date
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Abstract

本發明包括用於HLA-A2特異性嵌合抗原受體(CAR)之組合物及方法。在一些特定的實施例中，HLA-A2特異性嵌合抗原受體在調節性T細胞上表現。在一些特定的實施例中，HLA-A2特異性嵌合抗原受體保護移植組織免受排斥。

Description

保護移植組織免受排斥的方法
本申請案根據35 U.S.C.§ 119(e)主張於西元2017年3月28日申請之62/477815號之美國臨時案之優先權。其整體內容經由引用而併入本文。
本發明係關於保護移植組織免受排斥的方法，尤其係關於利用HLA-A2特異性嵌合抗原受體以保護移植組織免受排斥的組合物及方法。
當受移植者的免疫系統攻擊移植組織或器官時會發生移植排斥。排斥反應一般由受移植者體內的同種異體反應性(alloreactive)T細胞所介導，該T細胞係識別捐贈者的同種異體抗原(alloantigen)或異種抗原(xenoantigen)。宿主T細胞可以識別同種異體移植的人類白血球抗原(HLA)或相關的結合肽。同種異體反應性T細胞受表現同種異體MHC和共刺激活性的供給體抗原呈現細胞(APCs)所刺激。同種異體反應性CD4+T細胞產生細胞激素，其使細胞溶解性CD8對同種異體抗原的反應加劇。一般來說，當病患體內產生同種異體反應性T細胞的不良反應(如同種異體移植排斥、移植體抗宿主疾病)時，會以免疫抑制藥物(例如普賴松(prednisone)、硫唑嘌呤及環孢素A)來處理。不幸的是，病患通常需要終身持續使用這些藥物，而且這些藥物有許多危險的副作用，包括全身性的免疫抑制。
周邊血液含有少量表現調節性T表現型(Treg)的T細胞淋巴細胞(即CD4及CD25抗原均呈陽性)。調節性T細胞具有幾種子集，其中一種子集係在胸腺中發育。胸腺衍生之調節性T細胞的作用機制並不 依賴細胞激素，其係涉及細胞與細胞之間的接觸。該些細胞對於誘發和維持自我耐受以及預防自身免疫至關重要。這些調節性細胞係防止從胸腺排除作用(thymic deletion)中所逃逸的自體反應性T細胞進行活化及增生，或是辨識胸腺外的抗原，因此這些調節性細胞對於動態平衡(homeostasis)、免疫調節，以及保護宿主免於發生自體免疫是至關重要的。因此免疫調節性CD4+CD25+ T細胞通常被稱為「專業抑制細胞」。
因此，目前亟需一種抑制體內的同種異體反應及保護移植組織免受排斥反應的新組合物及方法。本發明滿足了這個需求。
如本文所述，本發明係關於利用HLA-A2特異性嵌合抗原受體以保護移植組織免受排斥的組合物及方法。
根據本發明的一實施例，其係包括一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，該細胞包括對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體(CAR)。嵌合抗原受體包括一HLA-A2結合結構域以及一CD8鉸鏈結構域。
根據本發明的另一實施例，其係包括一經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，該細胞包括對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體(CAR)。嵌合抗原受體包括一HLA-A2結合結構域、一CD8鉸鏈結構域、一CD8信號肽、一CD28跨膜結構域、一CD28共刺激以及一CD3ζ細胞內結構域。
本發明係基於以下發現：具有本發明所提供之HLA-A2特異性嵌合抗原受體的基因修飾免疫細胞，對HLA-A2、HLA-A28及/或HLA-A68顯現出專一性。本發明也基於以下發現：具有對個體HLA-A2特異性嵌合抗原受體的基因修飾調節性T細胞，展現出有效的免疫抑制效用。
相應地，根據本發明的某些實施例，其係提供了一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，其包括一嵌合抗原受體(CAR)，該嵌合抗原受體對HLA-A2具有親和力。
根據本發明的一實施例，其係提供一種經修飾的免疫細胞或 其前驅細胞，該細胞包括對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體，其中嵌合抗原受體包括一HLA-A2結合結構域。
在一些示例性實施例中，嵌合抗原受體更包括一信號肽。
在一些示例性實施例中，信號肽為一CD8信號肽。
在一些示例性實施例中，嵌合抗原受體更包括一鉸鏈結構域。
在一些示例性實施例中，鉸鏈結構域為一CD8鉸鏈結構域。
在一些示例性實施例中，HLA-A2結合結構域係選自於由抗體、抗體結合區(Fab)片段或單鏈變異區片段(scFv)所組成之群組。
在一些示例性實施例中，HLA-A2結合結構域包括一重鏈變異區，且重鏈變異區包括SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，HLA-A2結合結構域包括一輕鏈變異區，且輕鏈變異區包括SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，HLA-A2結合結構域包括一間隔序列。
在一些示例性實施例中，HLA-A2結合結構域包括SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，嵌合抗原受體包括一跨膜結構域以及一細胞內結構域。
在一些示例性實施例中，跨膜結構域包括一CD28跨膜結構域。
在一些示例性實施例中，跨膜結構域包括SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，細胞內結構域包括一CD28細胞內結構域以及一CD3ζ細胞內結構域。
在一些示例性實施例中，CD28細胞內結構域包括SEQ ID NO：19所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，CD3ζ細胞內結構域包括SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，CD8鉸鏈包括SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，CD8信號肽包括SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，嵌合抗原受體包括SEQ ID NO：23所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，其中HLA-A2結合結構域與HLA-A28交叉反應。
在一些示例性實施例中，HLA-A2結合結構域與HLA-A68交叉反應。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一經修飾的調節性T細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一自體細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為源自於一人類。
在另一個方面，本發明提供一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括對HLA-A2具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)，其中嵌合抗原受體包括一CD8信號肽、HLA-A2結合結構域、一CD8鉸鏈結構域、一CD28跨膜結構域、一CD28共刺激結構域以及一CD3ζ細胞內結構域。
在一些示例性實施例中，嵌合抗原受體包括SEQ ID NO：23所示之胺基酸序列。
在一些示例性實施例中，其中HLA-A2結合結構域與HLA-A28交叉反應。
在一些示例性實施例中，HLA-A2結合結構域與HLA-A68交叉反應。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一經修飾的調節性T細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一自體細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為源自於一人類。
在另一個方面，本發明提供一種經分離的核酸，包括一核酸 序列，且該核酸序列編碼對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體(CAR)，其中該嵌合抗原受體包括一HLA-A2結合結構域。
在一些示例性實施例中，嵌合抗原受體更包括一信號肽。
在一些示例性實施例中，信號肽為一CD8信號肽。
在一些示例性實施例中，嵌合抗原受體更包括一鉸鏈結構域。
在一些示例性實施例中，鉸鏈結構域為一CD8鉸鏈結構域。
在一些示例性實施例中，提供一種經分離的核酸，包括一核酸序列，且該核酸序列編碼對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體(CAR)，其中該嵌合抗原受體包括一CD8信號肽、一HLA-A2結合結構域、以及一CD8鉸鏈結構域。
在一些示例性實施例中，嵌合抗原受體包括一CD28跨膜結構域。
在一些示例性實施例中，嵌合抗原受體包括一CD28共刺激結構域。
在一些示例性實施例中，嵌合抗原受體包括一CD3ζ細胞內結構域。
在一些示例性實施例中，經分離的核酸包括SEQ ID NO：24所示之胺基酸序列。
在另一個方面，提供一種表現構築體，包括本文所述方面之分離的核酸。
在一些示例性實施例中，表現構築體包括一EF-1α啟動子。
在一些示例性實施例中，表現構築體包括一rev反應元件(RRE)。
在一些示例性實施例中，表現構築體包括一土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。
在一些示例性實施例中，表現構築體包括一cPPT序列。
在一些示例性實施例中，表現構築體包括一EF-1α啟動子、一rev反應元件、一土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)、以及一cPPT 序列。
在一些示例性實施例中，表現構築體為一病毒載體，病毒載體係選自於由反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體以及腺相關病毒載體所組成之群組。
在一些示例性實施例中，表現構築體為一腺病毒載體。
在一些示例性實施例中，腺病毒載體為一自我抑制的腺病毒載體。
在另一個方面，提供一種產生如本文所述方面之經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，包括將如本文所述方面之核酸或如本文所述方面之表現構築體引入免疫細胞。
在另一個方面，提供一種用於在有需要的一個體中實現一免疫抑制效用的方法，包括將一有效量之如本文所述方面的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞投與至個體。
在一些示例性實施例中，個體患有一同種異體反應及/或一自體免疫反應。
在一些示例性實施例中，同種異體反應或自體免疫反應在組織移植後發生，且其中該方法阻止、阻斷或抑制個體中的移植體抗宿主疾病。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一經修飾的調節性T細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一自體細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為源自於一人類。
在另一個方面，本發明提供一種用於在有需要之一個體中實現一預防性治療效用的方法，包括在一同種異體反應或一自體免疫反應開始之前將一有效量的如本文所述方面的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞投與至個體。
在一些示例性實施例中，同種異體反應或自體免疫反應在組織移植後發生，且其中該方法阻止、阻斷或抑制個體中的移植體抗宿主疾病。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一經修飾的調節性T細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一自體細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為源自於一人類。
在另一個方面，提供一種用於在具有一同種異體反應或一自體免疫反應且有需要的一個體中實現一免疫抑制作用的方法，包括將一經修飾的調節性T細胞投與至該個體，經修飾的調節性T細胞包括對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體，其中嵌合抗原受體包括一CD8信號肽、一HLA-A2結合結構域、一CD8鉸鏈結構域、一CD28跨膜結構域、一CD28共刺激結構域以及一CD3ζ細胞內結構域。
在一些示例性實施例中，同種異體反應或自體免疫反應在組織移植後發生，且其中該方法阻止、阻斷或抑制個體中的移植體抗宿主疾病。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一經修飾的調節性T細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一自體細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為源自於一人類。
在另一個方面，提供一種在有需要的一個體中治療糖尿病的方法，包括將一有效量的如本文所述方面的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞投與至該個體。
在一些示例性實施例中，糖尿病為第一型糖尿病。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一經修飾的調節性T細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一自體細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為源自於一人類。
在另一個方面，提供一種在有需要的一個體中治療糖尿病的方法，包括將一經修飾的調節性T細胞投與至個體，經修飾的調節性T細胞包括對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體，其中嵌合抗原受體包括一CD8信號肽、一HLA-A2結合結構域、一CD8鉸鏈結構域、一CD28 跨膜結構域、一CD28共刺激結構域以及一CD3ζ細胞內結構域。
在一些示例性實施例中，糖尿病為第一型糖尿病。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一經修飾的調節性T細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為一自體細胞。
在一些示例性實施例中，經修飾的細胞為源自於一人類。
當結合附圖一起閱讀時本發明時，將便於理解本發明的具體實施例的以下詳細敘述。為了說明本發明，在附圖中顯示出了示例性實施例。然而，應該理解的是，本發明不限於附圖中所示的實施例的精確佈置和手段。
圖1為HLA-A2特異性嵌合抗原受體的示意圖，當HLA-A2特異性嵌合抗原受體表現在人類調節性T細胞上時，其介導抗原特異性抑制。
圖2顯示初級人類CD8+細胞經下列方式處理後的結果，此些細胞經OPTI-MEM減血清培養液中洗滌3次，並以100x106細胞/毫升的密度進行再懸浮，與編碼有體外轉錄(in vitro transcribed)HLA-A2特異性嵌合抗原受體的RNA(10微克)混合並進行電穿孔。16小時後，將細胞以抗-生物素-SP(長間隔件)AffiniPure山羊抗-人類IgG(F(ab')片段特異性)進行染色，接著以鏈酶卵白素-PE(Streptavidin-PE)及抗-人類CD8染色。將細胞固定在2%之多聚甲醛中並以LSRII流式細胞儀進行分析。
圖3顯示如圖2中之經電穿孔處理的細胞，在GolgiPlug蛋白轉運抑制劑的存在下，以3：1的比例與不同HLA單倍型之人類捐贈者的PBMCs混合6小時後的處理結果。細胞係經固定、透化，並用抗-IL-2及抗-TNF-α抗體染色。
圖4顯示以CD4+ RosetteSep以及CD25正向磁篩選方式，從人類臍帶血所分離的調節性T細胞。調節性T細胞以抗-CD3/抗-CD28珠子刺激，並生長在XVIVO15培養基(添加有5%人類AB血清，該培養基 含1倍GlutaMAX及300IU/mL的IL-2)中。在初次刺激的48小時之後，將調節性T細胞以慢病毒轉導，以表現3PF12-28z嵌合抗原受體或不相關的嵌合抗原受體。當細胞在第14天靜息時，分析抗原特異性抑制情況，其係將調節性T細胞與經CFSE標記且表現有A2-SL9 WT TCR(一種HIV-特異性TCR)的同種異體T細胞以及K562細胞(該細胞係經基因轉殖以表現HLA-A2)混合，混合比例為8：1：0.5(Teff細胞：調節性T細胞：K562細胞)。為了探測非特異性抑制功能，將調節性T細胞與經CFSE標記的同種異體PBMCs細胞及抗-CD3刺激珠子在8：1：3(Teff細胞：調節性T細胞：珠子)的比例下混合。CFSE稀釋情況係在細胞培養5天後在CD8+的T細胞中測量。
圖5描繪轉導3PF12-28z或CD19-28z特異性嵌合抗原受體T細胞、或未轉導的陰性控制T細胞對人類C-肽水平之影響。
定義
除非另有定義，否則本文中的技術和科學術語的涵義均與本發明所屬技術領域具有通常知識之人所理解者相同。儘管在實施測試本發明的過程中可以使用任何近似或等同於本文所描述的方法和材料，但是本文係以較佳的材料和方法進行描述。在描述本發明和界定保護本發明範圍時，將使用以下術語。
需要注意的是，本文所使用的術語僅是為了描述特定實施例，而非不是限制性的。
本文中的冠詞「一」及「一個」(a及an)用於指一個或多於一個該冠詞的文法上受詞(即為，至少一個)。舉例來說，「一個元件」係指一個元件或多於一個元件。
當涉及例如量、持續時間等可測量值時，本文所使用的「約」意指涵蓋指定數值±20%或±10%的變化，較佳地係±5%，甚至更佳地係±1%，以及最佳地係±0.1%，只要此種變化程度適合於執行本文所公開的方法。
本文所使用的「活化」意指已經充分刺激以誘發出可檢測的細胞增生的T細胞狀態。活化還有關於誘發細胞激素產生及可檢測的效用功能(effector function)。術語「活化的T細胞」特別意指正在進行細胞分裂的T細胞。
本文所使用的「減輕」一疾病，意指降低該疾病的一種或多種症狀的嚴重程度。
「同種異體」意指來自同一物種但不同動物體的移植物。
「同種異體抗原」意指僅存在於一物種某些個體中的抗原，並能夠在缺乏它的個體中誘發其產生同種異體抗體。
本文所使用的術語「抗體」，意指與一抗原特異性地結合的免疫球蛋白分子。抗體可以是源自天然來源或來自重組來源的完整免疫球蛋白，且可以是完整免疫球蛋白的免疫反應性部分。抗體通常是免疫球蛋白分子的四聚體。本發明的抗體可以多種形式存在，包括例如多株抗體、單株抗體、變異區片段(fv)、抗體結合區(Fab)及F(ab)2、以及單鏈抗體(scFv)及人源化抗體(Harlow等人，1999，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，NY；Harlow等人，1989，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988，Science 242：423-426)。
術語「抗體片段」意指完整抗體的一部分，且意指完整抗體的抗原決定可變區。抗體片段的例子包括但不限於抗體結合區(Fab)、Fab'、F(ab')2及變異區片段、線型抗體、單鏈變異區片段(scFv)抗體及從抗體片段形成的多特異性抗體。
本文所使用的「抗體重鏈」，意指在於所有抗體分子的天然構型中，其兩個多肽鏈中分子量較大者。
本文所使用的「抗體輕鏈」，意指在於所有抗體分子的天然構型中，其兩個多肽鏈中分子量較小者。α輕鏈和β輕鏈是指兩種主要的抗體輕鏈同型。
本文所使用的術語「合成抗體」，意指使用重組DNA技術 所產生的抗體，例如本文中由嗜菌體表現的抗體。該術語還應該解釋為，以合成編碼有該抗體的DNA分子所產生的抗體，且該DNA分子表現一抗體蛋白或一胺基酸序列，該蛋白或該胺基酸序列係為該抗體具特異性的部分，其中該DNA或胺基酸序列係使用本領域已知的DNA或胺基酸序列合成技術所獲得。
本文所用的術語「抗原」，係定義為引起免疫反應的分子。這種免疫反應可能涉及抗體的產生，或特定的免疫活性細胞的活化，或涉及這兩者情況。本領域技術人員能夠理解，任何大分子，包括幾乎所有的蛋白或肽都可以做為抗原。此外，抗原可以源於重組或基因組DNA。本領域技術人員能夠理解，任何包括編碼有引發免疫反應之蛋白的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，其係編碼有如本文使用的術語「抗原」。此外，本領域技術人員能夠理解，抗原不需要僅由基因的全長核苷酸序列所編碼。很明顯地，本發明包括但不限於使用多於一個基因的部分核苷酸序列，且這些核苷酸序列係以不同組合排列來引起所期望的免疫反應。而且，本領域技術人員能夠理解，抗原不需要由一「基因」所編碼。很明顯地，抗原可以以合成方式產生或由生物樣本所衍生。這樣的生物樣本可以包括但不限於組織樣本、腫瘤樣本、細胞或生物體液。
本文所用的術語「自體」，意指來自於同一個體的任何材料，其稍後被重新引入回該個體。
本文所用的術語「同種異體」，意指來自同一物種不同動物體的任何材料。
本文所用的術語「嵌合抗原受體」或「CAR」，意指是指一人造T細胞受體，其係經工程化以表現在免疫作用細胞上，並與抗原產生特異性結合。嵌合抗原受體可用於過繼細胞轉移療法。將T細胞從患者體內取出並進行修飾，使其表現對抗原特定形態有特異性的受體。在一些實施例中，嵌合抗原受體對選定的目標具有特異性，例如人類白血球抗原(HLA)。嵌合抗原受體還可以包括細胞內活化結構域、跨膜結構域和包括抗原結合區域的細胞外結構域。在一些方面，嵌合抗原受體包括細胞外結構域，所述細胞外結構域包括與CD8鉸鏈結構域融合的抗HLA結合結構 域、CD28跨膜結構域和細胞內結構域以及CD3-zeta結構域。
術語「切割」，是指共價鍵的斷裂(例如在核酸分子的骨架中的斷裂或是肽鍵的水解)。切割可以藉由多種方法啟動，包括但不限於磷酸二酯鍵的酶促水解或化學水解。單股切割及雙股切割皆有可能。雙股切割可由於兩個不同的單股切割事件而發生。DNA切割可導致產生鈍端(blunt end)或交錯端(staggered end)。在某些實施例中，融合多肽可以用於鎖定經切割的雙股DNA。
如本文所用的術語「保守序列修飾」，旨在意指某些胺基酸修飾，其不會顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體的結合特性。這種保守修飾包括胺基酸之取代、添加及刪除。此種修飾可以藉由本領域已知的標準技術而引入本發明的抗體，例如定點誘變及PCR介導的誘變。保守胺基酸取代是胺基酸殘基被具有相似側鏈的胺基酸殘基所置換的取代。本領域已經定義了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、谷胺酸)、不帶電荷的極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、亮胺酸、異亮胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β-分支側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異亮胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，抗體的CDR區內的一或多個胺基酸殘基可以被來自同一側鏈家族的其他胺基酸殘基所取代，並且可以使用本文所述的功能測定法測試經改變之抗體的結合抗原能力。
本文所用的術語「共刺激配體」，包括在抗原呈現細胞(例如人造抗原呈現細胞(aAPC)、樹突細胞、B細胞等)上的分子，其特異性結合T細胞上的同源共刺激分子。除了例如由TCR/CD3複合物與裝載有肽的MHC分子的結合所提供的主要信號之外，該共刺激配體與其同源共刺激分子的結合也提供介導T細胞應答的信號，所述T細胞反應包括但不限於增生、活化、分化等。共刺激配體可以包括但不限於CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、誘導型共刺激配體(ICOS-L)、細胞間黏附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、 HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受體、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、結合Toll配體的促動劑或抗體以及特異性結合B7-H3的配體。共刺激配體尤其還包括與存在於T細胞上的共刺激分子特異性結合的抗體，所述共刺激分子例如但不限於CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及與CD83特異性結合的配體。
「共刺激分子」意指T細胞上的同源結合配偶體，其與共刺激配體特異性結合，從而介導T細胞的共刺激反應，例如但不限於增生。共刺激分子包括但不限於MHC I型分子、BTLA及Toll配體受體。
本文所用的「共刺激信號」是指與主要信號(例如TCR/CD3連接)搭配的信號，兩者共同導致T細胞增殖及/或關鍵分子之上調或下調。
「疾病」是動物無法維持動態平衡健康狀況，且其中若該疾病沒有改善則該動物的健康將持續惡化。相對地，動物中的「失調」是動物能夠維持動態平衡的健康狀況，但是該動物的健康狀況不如沒有失調時的那樣良好。如果不進行治療，失調不一定會導致動物健康狀況下降。
「捐贈者抗原」是指由待移植到受移植者體內的捐贈者組織所表現的抗原。
「受移植者抗原」是指針對捐贈者抗原的免疫反應的目標。
本文所用的術語「下調」是指減少或是消除一或多個基因的基因表現。
本文所用的「有效量」或「治療有效量」可以互換使用，並且是指本文所述的化合物、調配物、材料或組合物的數量，其有效地實現特定的生物學結果、提供治療，或預防的益處。此些結果可以包括但不限於當投與一數量之組合物至一動物時，與不存在本發明組合物時所檢測到的免疫反應相比，引起一可檢測程度的免疫抑制反應或是免疫耐受反應。該免疫反應可以很容易地以本領域所認可的許多方法來分析。本領域技術人員能夠理解，本文所投與的組合物數量會改變，且可以基於許多因素所決定，例如所治療的疾病或病症類型、所治療的哺乳動物的年齡及健康狀況及身體狀況、該疾病的嚴重性、所投與的化合物種類等。
「編碼」是指多核苷酸中特定核苷酸序列(例如，一基因、一cDNA或一mRNA)的固有特性，此序列在生物過程中作為合成其它聚合物與巨分子的模板，該聚合物與巨分子具有核苷酸(亦即rRNA、tRNA、與mRNA)的定義序列、或是胺基酸的定義序列，以及由此產生的生物性質。因此，若由轉錄一基因所產生的mRNA於細胞或其它生物系統中進行轉譯而產生一蛋白，則表示該基因係編碼此蛋白。編碼鏈(其核苷酸序列與mRNA序列相同，且通常存在於序列表中)與非編碼鏈(係作為基因或cDNA的轉錄模板)均可以意指編碼該蛋白質，或意指該基因或cDNA的其他產物。
本文所用的「內源性」是指來自生物體、細胞、組織或系統的任何物質，或是由生物體、細胞、組織或系統內部所產生的任何物質。
本文所用的「表位」係定義為抗原上的小化學分子，其可以引發免疫反應、誘發B及/或T細胞反應。一個抗原可以具有一或多個表位。大部分的抗原具有許多表位(即為，多價(multivalent)抗原)。通常來說，表位的大小約為10個胺基酸及/或糖。較佳地，表位的大小約為4至18個胺基酸，更佳地約為5至16個胺基酸，且最佳地約為8至10個胺基酸。本領域技術人員理解的是，一般來說，抗原特異性的主要條件是分子之整體三維結構，而非其特定線性序列，因而由此區分不同的表位。基於本文的揭露內容，用於本發明之肽可以是一表位。
本文所用的「外源性」是指從生物體、細胞、組織或系統外部引入的任何物質，或是由生物體、細胞、組織或系統外部所產生的任何物質。
本文所用的「擴增」是指數量上的增加，如T細胞數量的增加。在一個實施例中，相對於最初存在於培養基中的細胞數量，離體擴增之T細胞的數量增加。在另一個實施例中，相對於培養基中的其他細胞類型，離體擴增的T細胞的數量增加。本文所用的「離體」是指已經從活生物體(例如人類)中移出並在生物體的外部繁殖(例如在培養皿、試管或生物反應器中)的細胞。
本文所用的「表現」係定義為特定核苷酸序列藉由其啟動子 所驅動的轉錄及/或轉譯。
「表現載體」是指包括重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包括與待表現的核苷酸序列可操作地連接的表現控制序列。表現載體包括足夠的用於表現的順式作用元件(cis-acting elements)；其他用於表現的元件可以由宿主細胞提供或由體外表現系統提供。表現載體包括本領域已知的所有類型，例如併入重組多核苷酸的黏質體、質粒(例如裸露的質粒或是包括在脂質體中的質粒)及病毒(例如仙台病毒(Sendai viruses)、慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
「HLA-A2」是指HLA-A血清型群組中的一種人類白血球抗原。HLA-A是MHC I型細胞表面受體的三種主要類型之一。MHC I型分子是在細胞表面上所發現之主要組織相容性複合體(MHC)分子中兩個主要類別之一。MHC I型分子的功能是將非自身蛋白質的肽片段從細胞內呈現給免疫細胞(例如，細胞毒性T細胞)，從而引發免疫系統對被呈現的特定非自體抗原的即時反應。
「HLA-A28」是指HLA-A血清型群組中的一種人類白血球抗原。
「HLA-A68」是指HLA-A血清型群組中的一種人類白血球抗原。α「A」鏈是由HLA-A*68等位基因組所編碼，而β鏈由β-2微球蛋白(B2M)基因座所編碼。
本文所用的「同質(的)」，係指兩個聚合分子之間的次單元序列一致性，例如是在兩個核酸分子之間(兩個DNA分子或兩個RNA分子)或兩個多肽分子之間。當兩個分子中的次單元位置被相同的單體次單元佔據時；例如，如果兩個DNA分子中任何一者的一個位置係被腺嘌呤佔據時，則兩個DNA分子在該位置則為同質(的)。兩個序列之間的同質性是對應或同質位置數量的直接函數；例如，如果兩個序列中有一半位置(例如，長度為十個次單元的聚合物中有五個位置)是同質的，則兩個序列的同質性為50%；如果90%的位置(例如，10個中有9個)為相同或同質的，則兩個序列的同質性為90%。
非人類(例如鼠)抗體的「人源化」形式是含有來自非人免 疫球蛋白最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如，Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體的其他抗原結合次序列)。大多數情況下，人源化抗體是指，在人類免疫球蛋白(接受者抗體)中來自接受者互補性決定區(CDR)的殘基被來自非人物種(供給者抗體，例如具有所需特異性、親和力，和能力的小鼠、大鼠或兔)的CDR殘基所置換。在一些情況下，人類免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基被對應的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可以包括既不存在於接受者抗體也不存在於導入的CDR或框架序列中的殘基。這些修改係用以進一步改進和最佳化抗體性能。一般來說，人源化抗體本質上會包括至少一個(通常是兩個)的所有可變結構域，其中全部(或實質上全部)CDR區對應於非人免疫球蛋白中的CDR區，全部(或實質上全部)的FR區為人類免疫球蛋白的序列。最佳地，人源化抗體還會包括免疫球蛋白恆定區(Fc)的至少一部分，典型地是人類免疫球蛋白的恆定區。有關更多細節，請參閱Jones等人，Nature，321：522-525，1986；Reichmann等人，Nature，332：323-329，1988；Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596，1992。
「全人類」是指一種免疫球蛋白，如一抗體，其整個分子是源於人類或由與人類抗體相同的胺基酸序列組成。
本文所用的「一致性」是指兩個聚合分子之間的次單元序列一致性，特別是指兩個胺基酸分子之間的次單元序列一致性(例如兩個多肽分子之間的次單元序列一致性)。當兩個胺基酸序列在相同位置具有相同的殘基時(例如，如果兩個多肽分子中各自的一位置都被精胺酸佔據時),則它們在該位置是一致的。兩個胺基酸序列在相同比對位置中相同殘基的一致性或程度通常以百分比表示。兩個胺基酸序列之間的一致性是對應或一致位置數量的直接函數。例如，如果兩個序列中有一半位置(例如，長度為十個次單元的聚合物中有五個位置)是一致的，則兩個序列的一致性為50%。如果有90%的位置(例如，10個中有9個)為相匹配(matched)或一致的，則兩個序列的一致性為90%。
本文所用的術語「免疫球蛋白」或「Ig」被定義為一蛋白種類，其作用為抗體。B細胞表現的抗體有時被稱為BCR(B細胞受體)或 抗原受體。這類蛋白質中包括五個成員，分別是IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA是存在於身體分泌物中(如唾液、眼淚、母乳、胃腸分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的黏液分泌物)的一級抗體。IgG是最常見的循環抗體。IgM是大多數個體在初級免疫反應中產生的主要免疫球蛋白。IgM是最有效於凝集、補體固定和其他抗體反應的免疫球蛋白，且其在防禦細菌和病毒方面很重要。IgD沒有已知的抗體功能但可以作為抗原受體的免疫球蛋白。IgE是藉由在暴露於過敏原時引起肥大細胞及嗜鹼細胞釋放介質而介導立即型過敏反應的免疫球蛋白。
本文使用的術語「免疫反應」定義為對於抗原的細胞反應，這種反應發生在淋巴細胞將抗原性分子鑑定為外來物並誘發抗體形成和/或活化淋巴細胞以除去抗原時。
本文使用的術語「免疫刺激(immunostimulatory)」是指增加整體的免疫反應。
本文使用的術語「免疫抑制(immunosuppressive)」是指降低整體的免疫反應。
本文所用的「說明性材料」包括可用於傳達本發明組合物和方法的效用的公開文獻、記錄、圖表或任何其他表現媒介。舉例而言，本發明試劑盒的說明性材料可以固定在含有本發明核酸、肽和/或組合物的容器上，或者與含有本發明核酸、肽和/或組合物的容器一起運輸。或者，說明性材料可以與容器分開運輸，用意是說明性材料和化合物被接受者一起利用。
「分離的」是指從自然狀態中改變或移除。舉例而言，活體動物中天然存在的核酸或肽即不屬於「分離的」，但是與其天然狀態的共存材料部分或完全地分開的相同核酸或肽即屬於「分離的」。分離的核酸或蛋白質可以以本質上純化的形式存在，或者可以存在於非天然環境中(例如，宿主細胞)。
本文所用的「減弱(knockdown)」是指減少一個或多個基因的基因表現。
本文所用的「剔除(knockout)」是指消除一個或多個基因 的基因表現。
本文所用的「慢病毒(lentivirus)」是指反轉錄病毒科的一個屬。慢病毒屬於反轉錄病毒中獨特的一類，因為它們在能夠感染非分裂細胞。它們可以將大量的遺傳訊息傳遞到宿主細胞的DNA中，因此它們是基因傳遞載體的最有效方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒。源自慢病毒的載體提供了實現顯著水平的體內基因轉移的手段。
本文所用的「有限毒性」，是指本發明的肽、多核苷酸、細胞和/或抗體在體外或體內，對健康細胞、非腫瘤細胞、未患病細胞、非目標細胞或此些細胞的群體，表現出對缺乏本質上負面的生物效應、抗腫瘤效應或本質上負面的生理症狀。
本文所用的術語「修飾」是指本發明的分子或細胞的狀態或結構的改變。分子可以以多種方式進行修飾，包括以化學上地、結構上地和功能上地方式進行。細胞可以藉由引入核酸進行修飾。
本文所用的術語「調節」，是指相較於沒有治療或化合物的個體和/或在其他方面相同但未經處理的個體，在個體中介導了可檢測程度的增加或減少的反應。該術語包括擾亂和/或影響天然信號或反應，從而介導個體(較佳為人類)的有益治療反應。
在本發明中，以下列縮寫來代表常見的核酸鹼基。「A」是指腺苷，「C」是指胞嘧啶，「G」是指鳥苷，「T」是指胸苷，「U」是指尿苷。
除非另外指明，否則「編碼一胺基酸序列的核苷酸序列」包括彼此之簡併形式(degenerate versions)且編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質或RNA的術語「核苷酸序列」還可以包括內含子，以至於編碼蛋白質的核苷酸序列在一些形式中可含有內含子。
「腸胃外的」施予免疫原性組合物包括例如皮下注射(s.c.)、靜脈注射(i.v.)、肌肉注射(i.m.)或胸骨內注射或輸液技術(infusion techniques)。
本文所用的術語「多核苷酸」被定義為核苷酸鏈。此外，核酸是核苷酸的聚合物。因此，本文使用的核酸和多核苷酸是可互換的。本領域技術人員具有核酸是可以被水解成單體「核苷酸」的多核苷酸的基本 常識。單體核苷酸可以被水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限於藉由本領域可用的任何手段獲得的所有核酸序列，此些手段包括但不限於重組手段(即，使用一般複製技術和PCRTM等技術從重組文庫(recombinant library)或細胞基因組複製核苷酸序列)，以及藉由合成手段。
本文所用術語「肽」、「多肽」和「蛋白質」可互換使用，並且是指由藉由肽鍵共價連接的胺基酸殘基組成的化合物。蛋白質或肽必須包括至少兩個胺基酸，且對可以包括蛋白質或肽序列的胺基酸的最大數量並沒有限制。多肽包括了包括藉由肽鍵彼此連接的兩個或更多個胺基酸的任何肽或蛋白質。如本文所用，該術語是指兩條短鏈，其在本領域中通常也稱為肽、寡肽和寡聚物，並且例如指較長的鏈，其在本領域通常稱為蛋白質，其中存在有很多種類。舉例而言，「多肽」包括生物活性片段、本質上同源的多肽、寡肽、同二聚體、異二聚體、多肽的變體、修飾的多肽、衍生物、類似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重組肽、合成肽或其組合。
本文所用的術語「自身抗原」，定義為由宿主細胞或組織表現的抗原。自身抗原可以是腫瘤抗原，但在某些實施例中，自身抗原在正常細胞和腫瘤細胞中均有表現。技術人員很容易理解自身抗原可能在細胞中過度表現。
本文關於抗體所使用的術語「特異性結合」，是指在一樣品中識別特定抗原但本質上不識別或結合其他分子的抗體。舉例而言，一個能特異性結合來自一種物種抗原的抗體，也可以結合來自一種或多種物種的抗原。但是，這種跨物種反應性本身並不改變抗體的特異性分類。在另一個實施例中，一個特異性結合抗原的抗體也可以結合抗原的不同等位形式。然而，這種交叉反應本身並不改變抗體的特異性分類。在一些情況下，術語「特異性結合」可用於指抗體、蛋白質或肽與第二化學物質的相互作用，而意指該相互作用是取決於該化學物質上存在一特定結構的(例如，抗原決定簇(antigenic determinant)或表位)；舉例而言，抗體通常辨識並結合特定蛋白質結構而不是蛋白質。如果一抗體對表位「A」具有特異性，則在含有經標記的「A」和抗體的反應中，存在含有表位A的分子(或游 離且未標記的A)將減少經標記的A與抗體的結合量。
術語「刺激」是指由一刺激分子(例如TCR/CD3複合物)與其同源配體結合而誘發的初級反應，從而介導訊息傳遞事件，例如但不限於經由TCR/CD3複合物的訊息傳遞。刺激可以介導某些分子的表現(例如TGF-β的下調和/或細胞骨架結構的重組等等)。
本文所用的「刺激性分子」是指在T細胞上的一分子，其特異性結合至存在於抗原呈現細胞上的同源刺激性配體。
本文所用的「刺激性配體」是指一種配體，當其存在於抗原呈現細胞上(例如，人造抗原呈現細胞、樹突細胞、B細胞等)時可以與T細胞上的同源結合配體(在本文中稱為「刺激分子」)特異性結合，從而藉由T細胞介導初級反應，該初級反應包括但不限於活化、啟動免疫反應、增殖等。刺激性配體在本領域中是眾所皆知的，且其尤其涵蓋裝載有肽的MHC I型分子、抗CD3抗體、超促效劑抗CD28抗體、和超促效劑抗CD2抗體。
術語「個體」旨在包括可被引發免疫反應的生物活體(例如，哺乳動物)。本文使用的「個體」或「患者」可以是人類或非人類哺乳動物。舉例而言，非人類哺乳動物包括家畜和寵物(例如綿羊、牛、豬、犬科動物、貓科動物和鼠類哺乳動物)，較佳地，該個體是人。
本文所用的「本質上純化的」細胞，是基本上不含其他細胞類型的細胞。本質上純化的細胞也指已經從通常與其天然存在狀態相關的其他細胞類型分離的細胞。在一些情況下，本質上純化的細胞群指的是同質的細胞群。在其他情況下，這個術語單純指的是從與它們天然狀態天然相關的細胞分離的細胞。在一些實施例中，細胞在體外培養。在其他實施例中，細胞不在體外培養。
「目標點(target site)」或「目標序列(target sequence)」是指一基因組核酸序列，其定義出結合分子在足以發生結合的條件下可特異性地結合的核酸的一部分。
本文所用的術語「T細胞受體」或「TCR」是指一種膜蛋白複合物，其響應抗原的呈現而參與T細胞的活化。TCR負責辨識結合至主 要組織相容性複合體分子的抗原。TCR係由α和β鏈的異二聚體所構成，儘管在一些細胞中TCR係由γ和δ(γ/δ)鏈所構成。TCR可能以α/β及γ/δ的形式存在，兩種結構類似但具有不同的結構位置(anatomical locations)和功能。每條鏈由兩個細胞外結構域組成，分別為一個變異結構域和恆定結構域。在一些實施例中，TCR可以在任何包括有TCR的細胞上進行修飾，舉例而言，輔助性T細胞、細胞毒性T細胞、記憶性T細胞、調節性T細胞、天然殺手性T細胞和γ/δ T細胞。
本文使用的術語「治療性」是指治療和/或預防。治療效果係藉由抑制、緩解或根除疾病狀態所獲得。
「移植物」是指要被移植的生物相容性晶格(biocompatible lattice)或捐贈者的組織、器官或細胞。舉例來說，移植物可以包括但不限於皮膚細胞或組織、骨髓和實體器官(例如，心臟、胰腺、腎、肺和肝)。移植物也可以指任何要導入宿主的材料。例如，移植物可以指核酸或蛋白質。
本文所用的術語「轉染」、「轉化」或「轉導」是指將外源核酸轉移或引入宿主細胞中的過程。經「轉染」、「轉化」或「轉導」的細胞是已經用外源核酸轉染、轉化或轉導的細胞。該細胞包括主要目標細胞及其後代。
本文所用的「治療」一疾病，是指降低個體所經歷的疾病或至少一種失衡體徵或症狀的頻率或嚴重程度。
「載體」是一種物質的組合物，其包括分離的核酸且可被用於將分離的核酸傳遞至細胞內部。本領域有許多已知的載體，其中包括但不限於線性多核苷酸、與離子或兩親化合物相關的多核苷酸、質粒和病毒。因此，術語「載體」包括自主複製的質粒或病毒。該術語也應解釋為包括促進核酸轉移入細胞的非質粒化合物和非病毒化合物(例如，聚離胺酸化合物、脂質體等)。病毒載體的例子包括但不限於仙台病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、反轉錄病毒載體，慢病毒載體等。
「異種(xenogeneic)」是指來自不同物種的動物的任何物質。
範圍：在本文中，本發明不同方面可用數值範圍形式呈現。應該理解的是，數值範圍的描述僅僅是出於方便和簡潔的目的，並且不應被解釋為對於本發明範疇的僵化限制。因此，範圍的描述應被視為已具體公開了所有可能的次範圍以及該範圍內的單獨數值。舉例而言，範圍1至6的描述應該視為具有特定揭露的子範圍，例如從1至3、從1至4、從1至5、從2至4、從2至6、從3至6等，以及在該範圍內的個別數值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。且不管該範圍的幅度如何，都適用這樣的解釋。
描述
本發明包括利用HLA-A2特異性的嵌合抗原受體以保護移植組織免受排斥的組合物及方法。該嵌合抗原受體包括一抗原結合結構域，前述抗原結合結構域係與HLA-A2、HLA-A28、和/或HLA-A68結合。當HLA-A2特異性的嵌合抗原受體表現在調節性T細胞(Tregs)上時，其介導抗原特異性的抑制。HLA-A2特異性的嵌合抗原受體能夠將調節性T細胞重定向至表現HLA-A2、HLA-A28、和/或HLA-A68的組織，並且介導耐受性。
本發明包括HLA-A2特異性的嵌合抗原受體，以及其抑制同種異體反應的用途。同種異體反應在例如器官移植期間係由在同種異體移植物中普遍表現的捐贈者-MHCI型分子所引起。本發明是基於發現了包括HLA-A2特異性的嵌合抗原受體的調節性T細胞能夠以抗原特異性的方式抑制同種異體反應。
嵌合抗原受體(CAR)
本發明提供了用於經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如經修飾的調節性T細胞)的組合物和方法，其係包括對HLA-A2具有親和力的嵌合抗原受體。本發明標的中的嵌合抗原受體，係包括抗原結合結構域(例如，HLA-A2結合結構域)、跨膜結構域和細胞內結構域。本發明標的中的嵌合抗原受體可以選擇性地包括鉸鏈結構域和/或信號肽。在一些實施例中，信號肽是CD8信號肽。因此，本發明標的中的嵌合抗原受體包括抗原結合結構域(例如，HLA-A2結合結構域)、鉸鏈結構域、跨膜結構域和細胞內結構域。在一些實施例中，本發明標的中的嵌合抗原受體包括信號 肽、抗原結合結構域(例如，HLA-A2結合結構域)、鉸鏈結構域、跨膜結構域和細胞內結構域。在一些實施例中，標的中的嵌合抗原受體的每個結構域被連接子(linker)所分開。
抗原結合結構域可以可操作地連接至嵌合抗原受體的另一個結構域(如本文他處所述的跨膜結構域或細胞內結構域)，以在細胞中表現。在一個實施例中，編碼抗原結合結構域的第一核酸序列可操作地連接至編碼跨膜結構域的第二核酸，並且進一步可操作地連接至編碼細胞內結構域的第三核酸序列。
本文所述的抗原結合結構域可以與本文所述的任何跨膜結構域、本文所述的任何細胞內結構域或細胞質結構域、或本文所述的任何可包括在本發明的嵌合抗原受體中的其他結構域組合。
在一方面，本發明包括經分離的HLA-A2特異性的嵌合抗原受體，其包括CD8信號肽、HLA-A2 VH結構域、間隔序列、HLA-A2 VL結構域、CD8鉸鏈區、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域和CD3-ζ細胞內結構域。在另一方面，本發明包括經分離的核酸，其編碼HLA-A2特異性的嵌合抗原受體，其中嵌合抗原受體包括CD8信號肽、HLA-A2 VH結構域、間隔序列、HLA-A2 VL結構域、CD8鉸鏈區、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域和CD3-ζ細胞內結構域。本發明的另一方面包括經分離的多肽，其包括CD8信號肽、HLA-A2 VH結構域、間隔序列、HLA-A2 VL結構域、CD8鉸鏈區、CD28跨膜結構域和CD3-ζ細胞內結構域。
本發明的另一方面包括經基因修飾的T細胞，其包括分離的核酸，該分離的核酸編碼HLA-A2特異性嵌合抗原受體，其中嵌合抗原受體包括CD8信號肽、HLA-A2 VH結構域、間隔序列、HLA-A2 VL結構域、CD8鉸鏈區、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域和CD3-ζ胞內結構域。在一些實施例中，本發明的經基因修飾的免疫細胞(例如，T細胞)包括HLA-A2嵌合抗原受體，其中嵌合抗原受體包括CD8信號肽、HLA-A2 VH結構域、間隔序列、HLA-A2 VL結構域、CD8鉸鏈、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域和CD3-ζ胞內結構域。在一些實施例中，本發明的經基因修飾的免疫細胞(例如，T細胞)或其前驅細胞包括對HLA-A2具 有親和力的嵌合抗原受體。該嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域、CD8鉸鏈結構域、CD8信號肽、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域和CD3ζ細胞內結構域。
在本發明的某些實施例中，嵌合抗原受體係由SEQ ID NO：24的核酸序列所編碼。在其他實施例中，嵌合抗原受體包括SEQ ID NO：23的胺基酸序列。
在某些實施例中，經基因修飾的T細胞為調節性T細胞(Treg)。
表1中列出各個結構域的序列
因此，標的嵌合抗原受體可以是對HLA-A2具有親和力的嵌合抗原受體，其包括HLA-A2結合結構域，該HLA-A2結合結構域包括SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。標的HLA-A2嵌合抗原受體可以進一步包括鉸鏈結構域，該鉸鏈結構域包括SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列。標的HLA-A2嵌合抗原受體可進一步包括跨膜結構結構域，該跨膜結構結構域包括SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列。標的HLA-A2嵌合抗原受體可進一步包括細胞內結構域，該細胞內結構域包括SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列。標的HLA-A2嵌合抗原受體可以包括SEQ ID NO：23所示之胺基酸序列。
在某些實施例中，本發明標的的HLA-A2嵌合抗原受體包括對HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68的親和力，而這些親和力與MHC第一類分子的肽呈現無關。舉例而言，在某些實施例中，本發明標的的 HLA-A2嵌合抗原受體其特異性不受HLA-A2分子呈現的任何肽所影響。
抗原結合結構域
嵌合抗原受體的抗原結合結構結構域是嵌合抗原受體的細胞外區域，用於結合包括蛋白質、碳水化合物和醣脂等特定目標抗原。在一些實施例中，嵌合抗原受體包括對目標細胞上的目標抗原的親和力。該目標抗原可以包括與目標細胞相關任何類型的蛋白質或其表位。舉例而言，嵌合抗原受體可以對目標細胞上的一目標抗原有親和力，該目標抗原的出現代表該目標細胞處於一特定狀態。
在一個實施例中，本發明的嵌合抗原受體包括與HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68結合的抗原結合結構域。在另一個實施例中，本發明的抗原結合結構域包括與HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68分子結合的抗體或其片段。較佳地，抗原結合結構域是與HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68分子結合的scFv抗體。抗原結合結構域的選擇取決於存在於目標細胞表面上的抗原的類型和數量。舉例而言，可將抗原結合結構域用來識別一抗原，該抗原係為與目標細胞特定狀態相關的細胞表面標記。
如本文所述，本發明對目標細胞上特定目標抗原具有親和力的嵌合抗原受體，可以包括目標特異性的結合結構域。在一些實施例中，目標特異性的結合結構域是鼠類目標特異性的結合結構域(例如，目標特異性的結合結構域是源自鼠類)。在一些實施例中，目標特異性的結合結構域是人類目標特異性結合結構域(例如，目標特異性的結合結構域是源自人類)。在示例性實施例中，本發明的在目標細胞上對HLA-A2具有親和力的嵌合抗原受體可以包括HLA-A2結合結構域。在一些實施例中，HLA-A2結合結構域是鼠類HLA-A2結合結構域(例如，HLA-A2結合結構域是源自鼠類)。在一些實施例中，HLA-A2結合結構域是人源化的HLA-A2結合結構域。在一些實施例中，HLA-A2結合結構域是人類HLA-A2結合結構域(例如，HLA-A2結合結構域是源自人類)。
在一些實施例中，本發明的嵌合抗原受體可以對一種或多種目標細胞上的一種或多種目標抗原具有親和力。在一些實施例中，嵌合抗原受體可以對一種目標細胞上的一種或多種目標抗原具有親和力。在這樣 的實施例中，嵌合抗原受體是雙特異性的嵌合抗原受體或多特異性的嵌合抗原受體。在一些實施例中，嵌合抗原受體包括一個或多個目標特異性結合結構域，其賦予對一種或多種目標抗原的親和力。在一些實施例中，嵌合抗原受體包括一個或多個目標特異性結合結構域，其賦予對相同目標抗原的親和力。舉例而言，包括一個或多個對相同目標抗原具有親和力的目標特異性結合結構域的嵌合抗原受體可以與目標抗原的不同表位結合。當嵌合抗原受體中存在多個目標特異性結合結構域時，結合結構域可以串聯排列(arranged in tandem)並且可以藉由連接子肽分開。舉例而言，在包括兩個目標標特異性結合結構域的嵌合抗原受體中，結合結構域係透過寡肽或多肽連接子、Fc鉸鏈區或膜鉸鏈區在單個多肽鏈上彼此共價連接。
抗原結合結構域可以包括與抗原結合的任何結構域，並且可以包括但不限於單株抗體、多株抗體、合成抗體、人類抗體、人源化抗體、非人類抗體和其任何片段。因此，在一個實施例中，抗原結合結構域的部分包括哺乳動物抗體或其片段。在另一個實施例中，嵌合抗原受體的抗原結合結構域係選自於由抗HLA-A2抗體或其片段所組成之群組。在一些實施例中，抗原結合結構域係選自於由抗體、抗原結合片段(Fab)和單鏈可變片段(scFv)所組成之群組。在一些實施例中，本發明的HLA-A2結合結構域係選自於由HLA-A2特異性的抗體、HLA-A2特異性的Fab和HLA-A2特異性的scFv所組成的群組。在一個實施例中，HLA-A2結合結構域是HLA-A2特異性的抗體。在一個實施例中，HLA-A2結合結構域是HLA-A2特異性的Fab。在一個實施例中，HLA-A2結合結構域是HLA-A2特異性的scFv。
本文所用的術語「單鏈變異區片段」或「scFv」為免疫球蛋白(例如，小鼠或人類)的重鏈(VH)和輕鏈(VL)變異區的融合蛋白，且兩者以共價連接形成VH：：VL異二聚體。重鏈和輕鏈是直接地連接或是藉由編碼肽的連接子所連接，該連接子將重鏈的N端(N-terminus)與輕鏈的C端(C-terminus)連接，或將重鏈的C端與輕鏈的N端連接。在一些實施例中，抗原結合結構域(例如，HLA-A2結合結構域)包括具有從N端至C端的構型為重鏈-連接子-輕鏈的scFv。在一些實施例中，抗原結合結構域(例 如，HLA-A2結合結構域)包括具有從N端至C端的構型為輕鏈-連接子-重鏈的scFv。本領域技術人員能夠選擇適用於本發明的配置。
連接子通常因富含甘胺酸而賦與彈性，以及因絲胺酸或蘇胺酸而賦與溶解性。連接子可連接細胞外抗原結合域的重鏈可變區和輕鏈可變區。連接子的非限制性實例公開於Shen等人的論文：Anal.Chem.80(6)：1910-1917(2008)以及WO 2014/087010，此些內容藉由引用而將其整體併為本文揭露之一部分。本領域已知多種連接子序列，包括但不限於甘胺酸絲胺酸(GS)連接子(例如，如(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：25)、(GGGS)n(SEQ ID NO：26)、和(GGGGS)n(SEQ ID NO：27)，其中n表示至少為1的整數。示例性的連接子序列可以包括胺基酸序列，包括但不限於GGSG(SEQ ID NO：28)、GGSGG(SEQ ID NO：29)、GSGSG(SEQ ID NO：30)、GSGGG(SEQ ID NO：31)、GGGSG(SEQ ID NO：32)、GSSSG(SEQ ID NO：33)、GGGGS(SEQ ID NO：34)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：35)等。本領域技術人員能夠選擇適用於本發明的連接子序列。在一個實施例中，本發明的抗原結合結構域(例如，HLA-A2結合結構域)包括重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中VH和VL被連接子所分開，且連接子具有胺基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：35)，此序列可以由核酸序列ggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatct(SEQ ID NO：36)所編碼。
儘管移除了恆定區並引入了連接子，scFv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特異性。如Huston等人所述(Proc.Nat.Acad.Sci.USA，85：5879-5883,1988)，單鏈Fv多肽抗體可以從包括編碼VH和編碼VL序列的核酸所表現。另參見美國專利號5,091,513、5,132,405和4,956,778；以及美國專利公開號20050196754及20050196754。具有抑制活性的拮抗性scFvs已在以下這些文獻中描述(參見例如Zhao等人，Hyrbidoma(Larchmt)2008 27(6)：455-51；Peter等人，J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12；Shieh等人，J Imunol 2009 183(4)：2277-85；Giomarelli等人，Thromb Haemost 2007 97(6)：955-63；Fife等人，J Clin Invst 2006 116(8)：2252-61；Brocks等人，Immunotechnology 1997 3(3)：173-84；Moosmayer等人，Ther Immunol 1995 2(10：31-40))。具有刺激活性的促效性scFv已在以下這些文獻中描述(參見例如Peter等人，J Bioi Chem 2003 25278(38)：36740-7；Xie等人，Nat Biotech 1997 15(8)：768-71；Ledbetter等人，Crit Rev Immunol 1997 17(5-6)：427-55；Ho等人，BioChim Biophys Acta 2003 1638(3)：257-66)。
本文所用的「Fab」是抗體結構的一片段，其結合抗原但為單價且不具有Fc部分，舉例而言，由木瓜蛋白酶消化的抗體產生兩個Fab片段和一個Fc片段(例如，重鏈(H)恆定區；不結合抗原的Fc區)。
本文所用的「F(ab')2」是指藉由胃蛋白酶消化完整IgG抗體所產生的一抗體片段，其中該片段具有兩個抗原結合(ab')區域(二價)，其中每個(ab')區域包括兩個分開的胺基酸鏈，一部分的H鏈和輕鏈(L)藉由S-S鍵連接以用於結合抗原，且H鏈的其餘部分被連接在一起。一個「F(ab')2」片段可以分成兩個單獨的Fab'片段。
在一些情況下，抗原結合結構域可以源自於最終嵌合抗原受體將被使用的相同物種。舉例而言，為了用於人類，嵌合抗原受體的抗原結合域可以包括如本文別處所述的人類抗體或其片段。
在一個示例性實施例中，本發明的HLA-A2嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域(例如，HLA-A2特異性的scFv)。在一個實施例中，HLA-A2結合結構域包括SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。
在一個實施例中，HLA-A2結合結構域包括輕鏈變異區，該輕鏈變異區包括SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列。HLA-A2結合結構域的輕鏈變異區包括三個輕鏈互補性決定區(CDR)。本文所用的「互補性決定區」或「CDR」是指結合特定抗原的抗原結合分子的變異鏈的區域。因此，HLA-A2結合結構域可以包括一輕鏈可變區，其包括含有SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列的CDR1、包括SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列的CDR2、和包括SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列的CDR3。
在一個實施例中，HLA-A2結合結構域包括一重鏈可變區，其包括SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列。HLA-A2結合結構域可以包括一重鏈變異區，其包括含有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列的CDR1；含有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列的CDR2；和含有SEQ ID NO：7所示之 胺基酸序列的CDR3。
對於本領域技術人員來說，HLA-A2結合結構域已知可以具有維持與HLA-A2的特異性結合的變異。舉例而言，在一些實施例中，HLA-A2結合結構域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NOs：3、5-8和10-12所示之胺基酸序列的任一者的序列一致性為至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。舉例而言，在一些實施例中，HLA-A2結合結構域由一核酸序列所編碼，該核酸序列與SEQ ID NO：2、4和9所示之胺基酸序列的任一者的序列一致性為至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。
抗原結合結構域可以可操作地連接至嵌合抗原受體的另一個結構域(例如，跨膜結構域或細胞內結構域，兩者均在本文其他地方描述)。在一個實施例中，編碼抗原結合結構域的核酸可操作地連接編碼跨膜結構域的核酸及編碼細胞內結構域的核酸。
本文所述的抗原結合結構域(例如，與HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68結合的抗體或其片段)可組合至本文所述的任何跨膜結構域、任何細胞內結構域或細胞質結構域、或任何可包括在本發明嵌合抗原受體中的其他結構域。
跨膜結構域
就跨膜結構域而言，本發明的嵌合抗原受體(例如HLA-A2嵌合抗原受體)可被設計為包括一跨膜結構域，其將嵌合抗原受體的抗原結合結構域連接至細胞內結構域。標的嵌合抗原受體的跨膜結構域是能夠跨越一細胞的質膜(例如，免疫細胞或其前驅細胞)的區域。跨膜結構域係用於插入細胞膜(例如，真核細胞膜)。在一些實施例中，跨膜結構域介 於嵌合抗原受體的抗原結合結構域與細胞內結構域之間。
在一個實施例中，跨膜結構域天生地與嵌合抗原受體中的一個或多個結構域連接。在一些情況下，可以藉由選擇或是藉由胺基酸取代來修飾以避免這些跨膜結構域結合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜結構域，以最小化與受體複合物其他單元的交互作用。
跨膜結構域可以衍生自天然或合成來源。當衍生自天然來源時，該結構域可以源自任何膜結合蛋白或跨膜蛋白(例如，第一型跨膜蛋白)。當源自合成來源時，跨膜結構域可以是任何促進嵌合抗原受體插入細胞膜的人工序列(例如，人造疏水性序列)。本發明中特定用途的跨膜區實例，包括但不限於衍生自以下的跨膜結構域(即至少包括以下的跨膜結構域)：T細胞受體的α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、類鐸受體(toll-like receptor，TLR)1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9。在一些實施例中，跨膜結構域可以是合成的，在這種情況下，它主要包括疏水性殘基(例如，亮胺酸和纈胺酸)。較佳地，在合成的跨膜結構域的每個末端會是苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。
本文所述的跨膜結構域可組合至本文所述的任何抗原結合結構域、任何細胞內結構域、或任何可包括在標的嵌合抗原受體中的其他結構域。
在一些實施例中，跨膜結構域還包括鉸鏈區。本發明標的的嵌合抗原受體還可以包括鉸鏈區。嵌合抗原受體的鉸鏈區是位於抗原結合結構域和跨膜結構域之間的親水區。在一些實施例中，此結構域有助於嵌合抗原受體的蛋白質正確地折疊。鉸鏈區是嵌合抗原受體的選擇性元件。鉸鏈區可以包括選自抗體的Fc片段、抗體的鉸鏈區、抗體的CH2區、抗體的CH3區、人造鉸鏈序列或其組合的結構域。鉸鏈區的例子包括但不限於CD8a鉸鏈、由可以小至三個甘胺酸(Gly)的多肽以及IgGs的CH1和CH3結構域(例如，人類IgG4)製成的人造鉸鏈。
在一些實施例中，本發明標的的嵌合抗原受體包括將抗原結 合結構域與跨膜結構域連接的鉸鏈區，其又連接至細胞內結構域。鉸鏈區較佳能夠協助抗原結合結構域識別並結合目標細胞上的目標抗原(參見例如Hudecek等人，Cancer Immunol.Res。(2015)3(2)：125-135)。在一些實施例中，鉸鏈區是彈性的結構域，因此使抗原結合結構域具有最適於識別細胞(例如，腫瘤細胞)上目標抗原的特定結構和密度的結構(Hudecek等人，同上論文)。鉸鏈區域的彈性使鉸鏈區域可以具有許多不同的構型。
在一些實施例中，鉸鏈區是免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。在一些實施例中，鉸鏈區是源自受體的鉸鏈區多肽(例如，源自CD8的鉸鏈區)。
鉸鏈區的長度可為約4個胺基酸至約50個胺基酸，例如，約4個胺基酸至約10個胺基酸、約10個胺基酸至約15個胺基酸、約15個胺基酸至約20個胺基酸、約20胺基酸至約25胺基酸、約25胺基酸至約30胺基酸、約30胺基酸至約40胺基酸、或約40胺基酸至約50胺基酸。
適當的鉸鏈區是易於選取的，且其可以為任何一種合適長度，例如，1個胺基酸(例如，Gly)至20個胺基酸、2個胺基酸至15個胺基酸、3個胺基酸至12個胺基酸、包括4個胺基酸至10個胺基酸、5個胺基酸至9個胺基酸、6個胺基酸至8個胺基酸、或7個胺基酸至8個胺基酸的胺基酸，並且可以是1、2、3、4、5、6或7個胺基酸。
舉例而言，鉸鏈區包括甘胺酸聚合物(G)n、甘胺酸-絲胺酸聚合物(例如，包括(GS)n、(GSGGS)n(SEQ ID NO：25)和(GGGS)n(SEQ ID NO：26)，其中n是至少為1的整數)、甘胺酸-丙胺酸聚合物、丙胺酸-絲胺酸聚合物、和本領域已知的其他彈性連接子。可以使用甘胺酸和甘胺酸-絲胺酸聚合物；甘胺酸和絲胺酸兩者係相對較不結構化，因此可以作為成分之間的中性繫鏈(neutral tether)。可以使用甘胺酸聚合物；甘胺酸甚至比丙胺酸具有顯著更多的phi-psi空間(phi-psi space)，並且比具有較長側鏈的殘基的限制少得多(參見例如Scheraga，Rev.Computational.Chem。(1992)2：73-142)。示例性的鉸鏈區可以包括但不限於含有GGSG(SEQ ID NO：28)、GGSGG(SEQ ID NO：29)、GSGSG(SEQ ID NO：30)、GSGGG(SEQ ID NO：31)、GGGSG(SEQ ID NO：32)、GSSSG(SEQ ID NO：33)等的胺基酸序列。
在一些實施例中，鉸鏈區是免疫球蛋白重鏈鉸鏈區。免疫球蛋白鉸鏈區胺基酸序列在本領域是已知的；參見例如Tan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87(1)：162-166；和Huck等人，Nucleic Acids Res.(1986)14(4)：1779-1789。免疫球蛋白鉸鏈區可以包括，但不限於，以下胺基酸序列之一：DKTHT(SEQ ID NO：37)；CPPC(SEQ ID NO：38)；CPEPKSCDTPPPCPR(SEQ ID NO：39)(參見例如Glaser等人，J.Biol.Chem.(2005)280：41494-41503)；ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO：40)；KSCDKTHTCP(SEQ ID NO：41)；KCCVDCP(SEQ ID NO：42)；KYGPPCP(SEQ ID NO：43)；EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO：44)(人類IgG1鉸鏈)；ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO：45)(人類IgG2鉸鏈)；ELKTPLGDTTHTCPRCP(SEQ ID NO：46)(人類IgG3鉸鏈)；PNMVPHAHLHAQ(SEQ ID NO：47)(人類IgG4鉸鏈)等等。
鉸鏈區可以包括人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4鉸鏈區的胺基酸序列。在一個實施例中，與野生型(天然存在的)鉸鏈區相比，鉸鏈區可以包括一個或多個胺基酸之取代和/或插入和/或缺失。舉例而言，人類IgG1鉸鏈的His229可以被Tyr取代，因此鉸鏈區包括序列EPKSCDKTYTCPPCP(SEQ ID NO：48)；參見例如Yan等人，J.Biol.Chem.(2012)287：5891-5897。在一個實施例中，鉸鏈區可以包括源自人類CD8或其變體的胺基酸序列。
在一個實施例中，跨膜結構域包括CD28跨膜結構域。在另一個實施例中，跨膜結構域包括CD8鉸鏈結構域和CD28跨膜結構域。在一些實施例中，標的嵌合抗原受體包括具有SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列的CD8鉸鏈區，其可以由SEQ ID NO：16所示之核酸序列編碼。在一些實施例中，標的嵌合抗原受體包括具有SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列的CD28跨膜結構域，其可以由SEQ ID NO：18所示的核酸序列編碼。在一些實施例中，跨膜結構域包括CD8鉸鏈區和CD28跨膜結構域。
對於本領域技術人員來說，已知跨膜和/或鉸鏈結構域可以存在有維持其預期功能的變異。舉例而言，在一些實施例中，鉸鏈結構域和/或跨膜結構域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：15和/ 或17所示之胺基酸序列的任一者的序列一致性為至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。在一些實施例中，鉸鏈結構域和/或跨膜結構域由一核酸序列編碼，該核酸序列與SEQ ID NO：16和/或18所示之胺基酸序列的任一者的序列一致性為至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。
跨膜結構域可以組合至任何本文所述的鉸鏈結構域和/或可以包括本文所述的一個或多個跨膜結構域。
本文所述的跨膜結構域，例如T細胞受體的α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134(OX-40)、CD137(4-1BB)、CD154(CD40L)、類鐸受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9的跨膜結構域可組合至本文所述的任何抗原結合結構域、任何細胞內結構域或胞質結構域、或任何可包括在嵌合抗原受體中的其他結構域。
在一個實施例中，跨膜結構域可以是合成的，在這種情況下，它主要包括疏水性殘基(例如，亮胺酸和纈胺酸)。較佳地，在合成跨膜結構域的每個末端會是苯丙胺酸、色胺酸和纈胺酸的三聯體。
在嵌合抗原受體的細胞外結構域和跨膜結構域之間、或在嵌合抗原受體的細胞內結構域和跨膜結構域之間，可以併入有間隔結構域。本文所用的術語「間隔結構域」通常意指用於將跨膜結構域連接至多肽鏈中的細胞外結構域或細胞內結構域的任何寡肽或多肽。間隔結構域可包括多達300個胺基酸(例如，10至100個胺基酸、或25-50個胺基酸)。在一些實施例中，間隔結構域可以是短的寡肽或多肽連接子(例如，長度在2 至10個胺基酸之間)。舉例而言，甘胺酸-絲胺酸雙聯體(doublet)在標的嵌合抗原受體的跨膜結構域和細胞內信號傳導結構域之間提供特別適合的連接子。
細胞內結構域
本發明標的的嵌合抗原受體還包括細胞內信號傳導結構域。術語「細胞內信號傳導結構域」和「細胞內結構域」在本文中可互換使用。嵌合抗原受體的細胞內信號傳導結構域負責活化表現有嵌合抗原受體的細胞(例如，免疫細胞)的至少一種效用功能。細胞內信號傳導結構域傳導效用功能信號並指示細胞(例如，免疫細胞)執行其特定功能(例如，損害和/或破壞目標細胞)。
嵌合抗原受體的細胞內結構域或其他胞質結構域包括與本文他處描述的嵌合細胞內信號傳導分子類似或相同的細胞內結構域，且其負責活化表現有嵌合抗原受體的細胞。在一個實施例中，細胞內結構域包括CD3 ζ。在另一個實施例中，細胞內結構域包括CD28和CD3 ζ。
用於本發明的細胞內結構域的實例包括但不限於表面受體的細胞質部分、共刺激分子、及任何共同作用以啟動T細胞中信號傳遞的分子，以及這些元件的任何衍生物或變體與具有相同功能能力的任何合成序列。
細胞內信號傳導結構域的實例包括但不限於T細胞受體複合物的ζ鏈或其任何同系物(例如，η鏈、FcsRI γ和β鏈、MB 1(Iga)鏈、B29(Ig)鏈等)、人類CD3 ζ鏈、CD3多肽(△、δ和ε)、syk家族酪胺酸激酶(Syk、ZAP70等)、src家族酪胺酸激酶(Lck、Fyn、Lyn等)和涉及T細胞轉導的其他分子，如CD2、CD5和CD28。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域可以是人類CD3 ζ鏈、Fc γ RIII、FcsRI、Fc受體的胞質尾部、帶有細胞質受體的基於免疫受體酪胺酸的活化基序(ITAM)、以及前述分子的組合。
在一個實施例中，嵌合抗原受體的細胞內結構域包括一種或多種共刺激分子的任何部分(例如，來自CD3、CD8、CD27、CD28、ICOS、4-IBB、PD-1、任何其衍生物或其變體、具有相同功能能力的任何合成序列、 及其任何組合。
細胞內結構域的其他例子包括來自一個或多個分子或受體的片段或結構域，包括但不限於TCR、CD3 ζ、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD86、常見FcR γ、FcR β(Fc ε Rib)、CD79a、CD79b、Fc γ RIIa、DAP10、DAP12、T細胞受體(TCR)、CD8、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX9、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、KIR家族蛋白、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3，與CD83特異性連結的配體、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8 α、CD8 β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1，CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、Toll樣受體1(TLR1)、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、其他本文所描述的共刺激分子、其任何衍生物、變體或片段、具有相同功能能力的共刺激分子的任何合成序列及其任意組合。
細胞內結構域的其他例子，包括但不限於多種其他不同類型的免疫信號傳導受體的細胞內信號傳導結構域，其包括但不限於第一代、第二代和第三代T細胞信號傳導蛋白(包括，CD3，B7家族共刺激分子、和腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族受體(參見例如Park和Brentjens，J.Clin.Oncol.(2015)33(6)：651-653)。另外，細胞內信號傳導結構域可以包括NK細胞和NKT細胞所使用的信號傳導結構域(參見例如Hermanson和Kaufman，Front.Immunol。(2015)6：195)，例如NKp30的信號傳導結構域(B7-H6)(參見例如，Zhang等人，J.Immunol.(2012)189(5)：2290-2299)和DAP12(參見例如Topfer等人，J.Immunol.(2015)194(7)：3201-3212)、 NKG2D、NKp44、NKp46、DAP10和CD3z。
適用於本發明標的的嵌合抗原受體的細胞內信號傳遞結構域包括任何所需的信號傳導結構域，其提供不同且可檢測的信號(例如，提高細胞一種或多種細胞激素的產量；改變目標基因的轉錄；改變蛋白質活性；改變細胞行為(例如，細胞死亡、細胞增殖、細胞分化、細胞存活、細胞信號傳導反應的調節等)，以響應嵌合抗原受體的活化(即，被抗原和二聚化劑所活化)。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括至少一個(例如，1、2、3、4、5、6等)如下所述的ITAM基序。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括DAP10/CD28型信號傳導鏈。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域不是共價地附著於膜結合的嵌合抗原受體，而是散佈在細胞質中。
適用於本發明標的的嵌合抗原受體的細胞內信號傳導結構域包括含有基於免疫受體酪胺酸的活化基序(ITAMs)的細胞內信號傳導多肽。在一些實施例中，ITAM基序在細胞內信號傳導結構域中重複兩次，其中第一個ITAM基序和第二個彼此相隔6至8個胺基酸。在一個實施例中，標的嵌合抗原受體的細胞內信號傳導結構域包括3個ITAM基序。
在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括人類免疫球蛋白受體的信號傳導結構域，其包括有基於免疫受體酪胺酸的活化基序(ITAM)，例如但不限於Fc γ RIRI、Fc γ RIIA、Fc γ RIIC、Fc γ RIIIA、FcRL5(參見例如Gillis等人，Front.Immunol.(2014)5：254)。
適合的細胞內信號傳導結構域可以是一個含ITAM基序的部分，其係衍生自一個含有ITAM基序的多肽。舉例而言，適合的細胞內信號傳導結構域可以是含有ITAM基序的結構域，其係來自任何含有ITAM基序的蛋白質。因此，適合的細胞內信號傳導結構域不需要含有其來源蛋白質的完整序列。含有ITAM基序的多肽，其適例包括但不限於：DAP12、FCER1G(Fc ε I受體I γ鏈)、CD3D(CD3 δ)、CD3E(CD3 ε)、CD3G(CD3 γ)、CD3Z(CD3 ζ)和CD79A(抗原受體複合物相關的蛋白α鏈)。
在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域係源自於DAP12(又稱為TYROBP，TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白、KARAP、PLOSL、 DNAX-活化蛋白12、KAR相關蛋白、TYRO蛋白酪胺酸激酶結合蛋白、殺手活化受體相關蛋白、殺手活化受體相關蛋白等)。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域係源自於FCER1G(又稱為FCRG、Fc ε I受體I γ鏈、Fc受體γ鏈、fc-ε RI-γ、fcR γ、fceR1 γ、高親和力免疫球蛋白ε受體次單元γ、高親和力免疫球蛋白E受體γ鏈等)。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域係源自T細胞表面糖蛋白CD3 δ鏈(又稱為CD3D、CD3-DELTA、T3D、CD3抗原、δ亞基、CD3 δ、CD3d抗原、δ多肽(TiT3複合物)、OKT3 δ鏈、T-細胞受體T3 δ鏈、T-細胞表面糖蛋白CD3 δ鏈等)。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域係源自T細胞表面糖蛋白CD3 ε鏈(又稱為CD3e、T細胞表面抗原T3/Leu-4 ε鏈、T細胞表面糖蛋白CD3 ε鏈、AI504783、CD3、CD3 ε、T3e等)。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域係源自T細胞表面糖蛋白CD3 γ鏈(又稱為CD3G、T細胞受體T3 γ鏈、CD3-GAMMA、T3G、γ多肽(TiT3複合物)等)。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域係源自T細胞表面糖蛋白CD3 ζ鏈(又稱為CD3Z、T細胞受體T3 ζ鏈、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZ等)。在一個實施例中，細胞內信號傳導結構域係源自於CD79A(又稱為B細胞抗原受體複合物相關蛋白α鏈、CD79a抗原(免疫球蛋白相關α)、MB-1膜糖蛋白、ig-α、膜結合免疫球蛋白相關蛋白質、表面IgM相關蛋白質等)。在一個實施例中，適用於本公開的FN3嵌合抗原受體的細胞內信號傳導結構域包括DAP10/CD28型信號傳導鏈。在一個實施例中，適用於本公開內容的FN3嵌合抗原受體的細胞內信號傳導結構域包括ZAP70多肽。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括TCR ζ、FcR γ、FcR β、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d的細胞質信號傳導結構域。在一個實施例中，嵌合抗原受體中的細胞內信號傳導結構域包括人類CD3 ζ的細胞質信號傳導結構域。
儘管通常可以採用整個細胞內信號傳導結構域，但在許多情況下，沒有必要使用整個鏈。就使用細胞內信號傳導結構域的截短部分(truncated portion)而言，只要其傳導功能信號，就可以使用這種截短部分來代替完整的鏈。細胞內信號傳導結構域包括足以傳導效用功能信號 (effector function signal)的細胞內信號傳導結構域的任何截短部分。
本文所述的細胞內信號傳導結構域可組合至任何本文所述的抗原結合結構域、跨膜結構域、或任何可包括在嵌合抗原受體中的其他結構域。
在一個實施例中，標的嵌合抗原受體的胞內結構域包括CD28胞內結構域，所述CD28胞內結構域包括SEQ ID NO：19所示之胺基酸序列，其可以由SEQ ID NO：20所示的核酸序列所編碼。在一個實施例中，標的嵌合抗原受體的胞內結構域包括CD3 ζ結構域，所述CD3 ζ結構域含有SEQ ID NO：21所示的胺基酸序列，其可以由SEQ ID NO：22所示的核酸序列所編碼。在一個示例性實施例中，標的嵌合抗原受體的細胞內結構域包括CD28結構域和CD3 ζ結構域。
對於本領域技術人員來說，已知細胞內結構域的可存在有維持特定活性的變異。舉例而言，在一些實施例中，細胞內結構域包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NOs：19和/或21所示之胺基酸序列的任一者的序列一致性為至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。舉例而言，在一些實施例中，細胞內結構域係由一核酸序列所編碼，該核酸序列與SEQ ID NOs：20和/或22所示之核酸序列的任一者的序列一致性為至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。
在另一個實施例中，在嵌合抗原受體的抗原結合結構域和跨膜結構域之間，或在嵌合抗原受體的細胞內結構域和跨膜結構域之間可以併入有間隔結構域。本文所用的術語「間隔結構域」，通常意指用於將跨膜結構域連接至多肽鏈中的抗原結合結構域或細胞內結構域的任何寡肽或多 肽。在一個實施例中，間隔結構域可包括多達300個胺基酸，較佳為10-100個胺基酸，最佳為25-50個胺基酸。在另一個實施例中，較佳為2-10個胺基酸長度的短寡-或短多肽連接子可以形成嵌合抗原受體的跨膜結構域和細胞內結構域之間的連結。連接子的例子包括甘胺酸-絲胺酸雙聯體。
嵌合抗原受體序列
本發明標的的嵌合抗原受體可以是對HLA-A2具有親和力的嵌合抗原受體。在一個實施例中，本發明的HLA-A2嵌合抗原受體包括SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，其可以由SEQ ID NO：24所示的核酸序列所編碼。
對於本領域技術人員而言，已知嵌合抗原受體可存在有維持特定活性的變異。舉例而言，在一些實施例中，嵌合抗原受體包括一胺基酸序列，該胺基酸序列與SEQ ID NO：23所示之胺基酸序列的序列一致性為至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。舉例而言，在一些實施例中，嵌合抗原受體由一核酸序列編碼，該核酸序列與SEQ ID NO：24所示之胺基酸序列的序列一致性為至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%。
因此，本發明標的的嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域和跨膜結構域。在一個實施例中，嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域和跨膜結構域，其中該跨膜結構域包括CD8鉸鏈區。在一個實施例中，嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域和跨膜結構域，其中跨膜結構域包括CD28跨膜結構域。在一個實施例中，嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域和跨膜結構域，其中跨膜結構域包括CD8鉸鏈區和CD28跨膜結構域。
因此，本發明標的的嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域、跨膜結構域和細胞內結構域。在一個實施例中，嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中該細胞內結構域包括CD28結構域。在一個實施例中，嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中該胞內結構域包括CD3 ζ結構域。在一個實施例中，嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域、跨膜結構域和胞內結構域，其中該胞內結構域包括CD28結構域和CD3 ζ結構域。
因此，本發明標的的嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域、CD8鉸鏈區、CD28跨膜結構域、CD28細胞內結構域和CD3 ζ細胞內結構域。
因此，本發明提供了經修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如，修飾的調節性T細胞)，其包括如本文所述之對HLA-A2具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)。
人類抗體
嵌合抗原受體的抗原結合結構域較佳是包括人類抗體或其片段。全人類抗體對於人類個體之治療處理來說是特別理想的。人類抗體可以藉由本領域已知的各種方法製備，包括使用源自人類免疫球蛋白序列抗體庫的噬菌體展現法，及這些技術改良後的方法。另請參見美國專利Nos.4,444,887和4,716,111；和PCT公開號WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；這些文獻全文以引用方式併為本文的一部份。
人類抗體也可以使用無法表現功能性內源免疫球蛋白但能表現人類免疫球蛋白基因的轉殖基因小鼠所製造。舉例而言，可以將人類重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因複合物以隨機或以同源重組(homologous recombination)方式導入小鼠胚胎幹細胞。或者，除人類重鏈和輕鏈基因外，還可將人類變異區、恆定區和多樣性區導入小鼠胚胎幹細胞中。小鼠重鏈和輕鏈免疫球蛋白基因可能藉由同源重組導入人類免疫球蛋白基因座而分別或同時變得無功能。舉例而言，已經有文獻報導過，在嵌合和生殖系突變的小鼠中，抗體重鏈連接區(JH)基因的純合缺失會導致內源性抗體的 產生受到完全抑制。將經修飾的胚胎幹細胞擴增並顯微注射至囊胚(blastocysts)中以產生嵌合小鼠。然後繁殖嵌合小鼠以產生表現人類抗體的純合後代。基因轉殖小鼠係用一般方式，以所選擇的抗原(例如，本發明的多肽的全部或一部分)進行免疫。經過前述免疫後，可以使用常規雜交瘤技術從基因轉殖小鼠獲得對所選擇目標具有辨識能力的抗體。基因轉殖小鼠所攜帶的人類免疫球蛋白轉基因則在B細胞分化過程中進行重排，隨後發生類別轉換和體細胞突變。因此，使用這種技術，可能產生治療上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗體，包括但不限於IgG1(γ 1)和IgG3。關於這種用於生產人類抗體的技術的綜述，參見Lonberg和Huszar(Int.Rev.Immunol.,13：65-93(1995))。關於這種用於生產人類抗體和人類單株抗體的技術以及生產這些抗體的方案的詳細討論，參見例如PCT公開號WO 98/24893、WO 96/34096、WO 96/33735；及美國專利號5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；和5,939,598，前述各個文獻的全文內容係藉由引用而納為本文的一部份。此外，諸如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif)和Genpharm(San Jose,Calif)等公司可藉由使用與上述技術類似的技術來提供針對選定抗原的人類抗體。將人種系(human germ-line)的免疫球蛋白基因陣列轉移至生殖系突變小鼠中，則該小鼠在抗原激發(challenge)時會產生人類抗體，關於前述技術的詳細討論，參見例如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551(1993)；Jakobovits等人，Nature，362：255-258(1993)；Bruggermann等人，Year in Immunol.，7：33(1993)；和Duchosal等人，Nature，355：258(1992)。
人類抗體也可以由噬菌體呈現文庫獲得(Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.,227：381(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.,222：581-597(1991)；Vaughan等人，Nature Biotech.,14：309(1996))。從未免疫個體(unimmuned donor)中所取得的免疫球蛋白可變結構域(V domain)基因庫，可利用噬菌體呈現技術(McCafferty等人，Nature,348：552-553(1990))可在體外產生人類抗體和抗體片段。根據此技術，以符合讀取框的方式，將抗體可變結構域的基因轉殖(cloned in-frame)到絲狀噬菌體的主要或次要外殼蛋白基因中(例如，M13或fd)，並且在噬菌體顆粒的表面上呈現出 功能性抗體片段。由於絲狀顆粒所含有的噬菌體基因組複本為單股DNA，因此以其抗體功能特性所進行的挑選會等同於挑選那些編碼有所顯示性質抗體的基因。因此，噬菌體模擬出B細胞的某些特性。噬菌體之呈現可用不同形式進行；例如Johnson、Kevin S和Chiswell、David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。適用於噬菌體呈現的變異域基因片段可有多種不同來源。Clackson等人(Nature，352：624-628(1991))從來自未免疫小鼠脾臟的變異域基因的小型隨機組合基因庫中分離出抗噁唑酮抗體的多樣型陣列。按照Marks等人(J.Mol.Biol.,222：581-597(1991))或Griffith等人，EMBO J.,12：725-734(1993))所描述的技術，可以構建未免疫人類個體的變異域基因庫，並且可以分離出抗多種不同抗原(包括自身抗原)的抗體。前述技術亦可參見美國專利公告號5,565,332與5,573,905。前述文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份。
人體抗體也可以藉由體外活化的B細胞產生(參見美國專利號5,567,610和5,229,275，此些文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份)。人體抗體也可以使用雜交瘤技術於體外產生，例如但不限於Roder等人於Methods Enzymol.,121：140-167(1986)所述之技術。
人源化抗體
另一方面，在一些實施例中，可以將非人抗體進行人源化。其係對抗體的特定序列或區域加以修飾以提高其與人類天然產生的抗體的相似性。舉例而言，在本發明中，抗體或其片段可包括非人類的哺乳動物單鏈抗體(scFv)。在一個實施例中，抗原結合結構域部分是人源化的。
人源化抗體可以使用本領域已知的多種技術來製造，包括但不限於CDR移植(參見例如歐洲專利號EP 239,400；國際公開號WO 91/09967；及美國專利第5,225,539號、5,530,101及5,585,089，此些文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份)、鑲飾(veneering)或重塑(resurfacing)(參見例如歐洲專利第EP 592,106號和第EP 519,596號；Padlan，1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498；Studnicka 1994,Protein Engineering,7(6)：805-814；和Roguska等人，1994,PNAS,91：969-973，此些文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份)、鏈改組(chain shuffling) (參見例如美國專利第5,565,332號，其文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份)、以及以下文獻所揭露的技術。例如，美國專利申請公開號第US2005/0042664、美國專利申請公開號第US2005/0048617、美國專利第6,407,213號、國際公開號第WO 9317105號、Tan等人，J.Immunol.,169：1119-25(2002)、Caldas等人，Protein Eng.,13(5)：353-60(2000)、Morea等人，Morea et al.,Methods,20(3)：267-79(2000)、Baca等人，J.Biol.Chem.,272(16)：10678-84(1997)、Roguska等人，Protein Eng.,9(10)：895-904(1996)、Couto等人，Cancer Res.,55(23 Supp)：5973s-5977s(1995)、Couto等人，Cancer Res.,55(8)：1717-22(1995)、Sandhu JS，Gene,150(2)：409-10(1994)以及Pedersen等人，J.Mol.Biol.,235(3)：959-73(1994)，此些文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份。通常來說，構架區中的構架殘基將被來自CDR提供者抗體的對應殘基所替代，以改變(較佳為改善)抗原之結合。這些構架替代物會藉由本領域習知的方法來鑑定。例如，藉由模擬CDR及構架殘基的相互作用以鑑定對抗原結合重要的構架殘基，和藉由序列比對以鑑定在特定位置上的罕見構架殘基(參見例如，Queen等人，美國專利號5,585,089；和Riechmann等人，1988,Nature,332：323，此些文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份)。
人源化抗體具有從非人類來源引入其內的一或多個胺基酸殘基。這些非人類胺基酸殘基通常被稱為「外來」(import)殘基，其通常取自於「外來」(import)可變結構域。因此，人源化抗體包括來自非人免疫球蛋白分子的一或多個CDR和來自人類的骨架區(framework regions)。將抗體人源化的方法是本領域眾所周知的，基本上可以按照Winter和其同事的方法進行(Jones等人，Nature,321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature,332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534-1536(1988))，其係以囓齒動物的一或多個的CDRs序列來取代人類抗體的相應序列(即，CDR-移植，EP 239,400；PCT公開號WO 91/09967；和美國專利號4,816,567、6,331,415、5,225,539、5,530,101、5,585,089、6,548,640，此些文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份)。在前述方式做出的人源化嵌合抗體中，至少部分的人類可變結構域已被來自非人類物種的相應 序列所取代。實際上，人源化抗體通常是人類抗體，其中某些CDR的殘基，甚至某些的骨架區(FR)的殘基，被來自囓齒動物抗體中類似位點的殘基取代。抗體的人源化也可以藉由鑲飾或重塑(參見，EP 592,106；EP 519,596；Padlan，1991,Molecular Immunology,28(4/5)：489-498；Studnicka等人，Protein Engineering,7(6)：805-814(1994)；和Roguska等人，PNAS,91：969-973(1994))、或鏈改組(美國專利號5,565,332)的方式所實現，此些文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份。
選用人類可變結構域(包含輕鏈和重鏈)來製備人源化抗體，其目的係降低抗原性。根據所謂的「最佳擬合(best-fit)」法，囓齒動物抗體的可變結構域序列係針對已知人類可變結構域的整個序列庫來進行篩選。隨後，將最接近於囓齒動物之序列的人類序列作為人源化抗體的人類骨架區(FR，參見Sims等人，J.Immunol.,151：2296(1993)；Chothia等人.,J.Mol.Biol.,196：901(1987)，前述文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份)。另一種方法係使用從特定亞群人類抗體之輕鏈或重鏈的共通序列中所取得的特定骨架區。相同的骨架區可用於不同的人源化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993)，此些文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份)。
抗體可以被人源化並保留對目標抗原的高親和力和其他有利的生物特性。根據本發明的一個方式，人源化抗體是通過使用親本序列與人源化序列的三維模型分析親本序列與各種概念性人源化產物的過程來製備。
免疫球蛋白的立體模型通常是容易取得的且為本領域技術人員所熟知。說明並展示所選擇之免疫球蛋白候選序列的立體可能構型結構的電腦程式是可取得的。檢視該等展示結果，可分析出殘基在免疫球蛋白候選序列發揮其功能時所可能扮演的角色，亦即其係分析影響候選免疫球蛋白與其目標抗原間結合能力的殘基)。以此方式，骨架區(FR)的殘基可由接受者序列及外來序列中來選取，且與接受者序列及外來序列組合以達成所需的抗體特徵，諸如提高與目標抗原的親和力。一般而言，CDR殘基係直接影響該抗體與抗原的結合，並與該抗體與抗原間的結合有最實質 性的相關性。
人源化抗體保留與原始抗體類似的抗原特異性。然而，使用某些人源化方法時，可以使用「定向演化(directed evolution)」的方法提高抗體與目標抗原結合的親和力和/或特異性，如Wu等人，Wu等人.,J.Mol.Biol.,294：151(1999)，前述文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份。
核酸及表現載體
本發明提供了一核酸，其編碼對HLA-A2具有親和性的嵌合抗原受體。如本文所述，標的嵌合抗原受體包括抗原結合結構域(例如，HLA-A2結合結構域)、跨膜結構域和細胞內結構域。相應地，本發明提供了一核酸，其編碼標的嵌合抗原受體的抗原結合結構域(例如HLA-A2結合結構域)、跨膜結構域和細胞內結構域。
在一個示例性實施例中，編碼本發明的HLA-A2嵌合抗原受體的核酸係藉由SEQ ID NO：24所示的核酸序列所編碼。
在一些實施例中，本發明的核酸可以可操作地連接至轉錄控制單元(例如，啟動子和增強子等)。適合的啟動子和增強子元件為本領域技術人員所已知的。
為了在細菌細胞中表現，適合的啟動子包括但不限於lacI、lacZ、T3、T7、gpt、λ P和trc。為了在真核細胞中表現，適合的啟動子包括但不限於輕鏈和/或重鏈免疫球蛋白基因啟動子和增強子單元、巨細胞病毒立即早期啟動子(cytomegalovirus immediate early promoter)、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒長末端重複中的啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子，以及各種本領域已知的組織特異性啟動子。適合的可逆啟動子(reversible promoter)，包括可逆誘導型啟動子(reversible inducible promoter)，在本領域中係為已知。前述的可逆啟動子可分離自並源自於許多生物體(例如，真核生物和原核生物)。
對源自於第一生物且用於第二生物中的可逆啟動子(例如，第一生物為原核生物而第二生物為真核生物、或是一第一生物為真核生物而第二生物為原核生物等)的修飾為本領域中所熟知的。此類可逆啟動子，及基於此類可逆啟動子且亦包括其他控制蛋白質之系統，包括但不限於： 醇調節之啟動子(例如，醇脫氫酶I(alcA)基因啟動子、對醇反式活化蛋白具有反應性之啟動子(AlcR)等)、四環素調節之啟動子(例如，包括TetActivators、TetON、TetOFF等之啟動子系統)、類固醇調節之啟動子(例如，大鼠糖皮質激素受體啟動子系統、人類雌激素受體啟動子系統、類視黃素啟動子系統、甲狀腺啟動子系統、蛻皮激素啟動子系統、米非司酮(mifepristone)啟動子系統等)、金屬調節之啟動子(例如，金屬硫蛋白啟動子系統等)、相關病原調節之啟動子(例如，水楊酸調節之啟動子、乙烯調節之啟動子、苯並噻二唑調節之啟動子等)、溫度調節之啟動子(例如，熱休克可誘導啟動子(例如，HSP-70、HSP-90、大豆熱休克啟動子等))、光調節之啟動子、合成可誘導啟動子及前述啟動子的類似物。
在一些實施例中，啟動子是CD8細胞特異性啟動子、CD4細胞特異性啟動子、嗜中性粒細胞特異性啟動子或NK特異性啟動子。舉例而言，啟動子可以是CD4基因啟動子；參見例如Salmon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：7739；Marodon等人，(2003)Blood 101：3416。另一個例子，啟動子可以是CD8基因啟動子。NK細胞的特異性表現可以藉由使用NcrI(p46)啟動子來達成；參見例如Eckelhart等人，Blood(2011)117：1565。
為了在酵母細胞中表現，適合的啟動子是組成型的啟動子，例如ADH1啟動子、PGK1啟動子、ENO啟動子、PYK1啟動子等相似物；或可調節的啟動子，例如GAL1啟動子、GAL10啟動子、ADH2啟動子、PHOS啟動子、CUP1啟動子、GALT啟動子、MET25啟動子、MET3啟動子、CYC1啟動子、HIS3啟動子、ADH1啟動子、PGK啟動子、GAPDH啟動子、ADC1啟動子、TRP1啟動子、URA3啟動子、LEU2啟動子、ENO啟動子、TP1啟動子和AOX1(例如，用於畢赤酵母)。
合適載體和啟動子的選擇完全在本領域普通技術人員的水平內。適用於原核宿主細胞的啟動子包括但不限於噬菌體T7 RNA聚合酶啟動子；trp啟動子；lac操縱子啟動子；雜合啟動子(例如，lac/tac雜合啟動子、tac/trc雜合啟動子、trp/lac啟動子、T7/lac啟動子、trc啟動子、tac啟動子等)；araBAD啟動子；體內調節啟動子(例如，ssaG啟動子或相關 啟動子(參見例如美國專利公開號20040131637)、pagC啟動子(Pulkkinen及Miller，J.Bacteriol.(1991)173(1)：86-93；Alpuche-Aranda等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89(21)：10079-83)、nirB啟動子(Harborne等人，Mol.Micro.(1992)6：2805-2813)等及其類似物(參見例如Dunstan等人，Infect.Immun.(1999)67：5133-5141；McKelvie等人，Vaccine(2004)22：3243-3255；以及Chatfield等人，Biotechnol.(1992)10：888-892))；sigma70啟動子(例如，共同sigma70啟動子(參見例如GenBank登錄號AX798980、AX798961和AX798183)；固定相啟動子(例如，dps啟動子、spv啟動子等)；源自致病島SPI-2的啟動子(參見例如WO96/17951)；actA啟動子(參見例如，Shetron-Rama等人，Infect.Immun.(2002)70：1087-1096)；rpsM啟動子(參見例如Valdivia和Falkow，Mol.Microbiol.(1996).22：367)；tet啟動子(參見例如Hillen,W.及Wissmann,A.(1989)In Saenger,W.及Heinemann,U.(編)，Topics in Molecular and Structural Biology,Protein-Nucleic Acid Interaction.Macmillan，倫敦，英國，第10卷，第143至162頁)；SP6啟動子(參見例如Melton等人，Nucl.Acids Res.(1984)12：7035))等。適用於原核生物(例如大腸桿菌)的強啟動子包括但不限於Trc、Tac、T5、T7和PLambda。用於細菌宿主細胞的操縱子的非限制性實例包括乳糖啟動操縱子(當與乳糖接觸時，LacI抑制蛋白的構型改變，從而阻止Lad抑制蛋白與操縱子結合)、色胺酸啟動操縱子(當其與色胺酸複合時，TrpR抑制蛋白具有與操縱子結合的構象；在不存在色胺酸的情況下，TrpR抑制蛋白具有不與操縱子結合的構象)及tac啟動操縱子(參見例如deBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80：21-25)。
其他啟動子的適例，包括立即早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列係能夠驅動與其可操作地連接之任何多核苷酸序列之高表現量的強組成型啟動子序列。然而，亦可使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺失病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、鼻咽癌病毒(Epstein-Barr virus)立即早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子、EF-1 α啟 動子、以及人類基因啟動子(例如但不限於肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅素啟動子及肌酸激酶啟動子)。此外，本發明應不限於使用組成型啟動子。本發明亦涵蓋誘導型啟動子。誘導型啟動子可以作為一種分子開關，在有需要時，可用來啟動與其可操作地連接的多核苷酸序列的表現，或是在不想要發生這種表現時，用來關閉與其可操作地連接的多核苷酸序列的表現。誘導型啟動子之例子包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、醣皮質素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
在某些實施例中，含有適當啟動子的基因座或構建體或轉基因，是經由對可誘導系統之誘導來進行不可逆轉換。適用於誘導不可逆轉換的系統是本領域眾所周知的。舉例來說，不可逆轉換之誘導可利用Cre-lox介導之重組(參見例如Fuhrmann-Benzakein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)28：e99，前述文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份)。任何本領域中已知的重組酶、內切核酸酶、連接酶、重組位點等的適合組合，皆可用於產生不可逆轉換之啟動子。本文其他處描述之進行位點特異性重組之方法、機制及要求，可用來產生不可逆轉換之啟動子且其為本領域中眾所周知的，參見例如Grindley等人，Annual Review of Biochemistry(2006)567-605及Tropp Molecular Biology(2012)(Jones & Bartlett Publishers,Sudbury,Mass.)，前述文獻的整體內容經由引用而納為本文的一部份。
在一些實施例中，本發明的核酸進一步包括編碼嵌合抗原受體誘導型表現盒的核酸序列。在一個實施例中，嵌合抗原受體誘導型表現盒係用於產生在嵌合抗原受體信號傳遞後釋放的轉殖基因多肽產物。參見例如Chmielewski和Abken，Expert Opin.Biol.Ther.(2015)15(8)：1145-1154；和Abken，Immunotherapy(2015)7(5)：535-544。
本發明的核苷酸序列可存在於表現載體及/或選殖載體中。表現載體可包括可篩選標記、複製起始序列及其他提供載體複製功能及/或維持載體的元件。適當的表現載體包括例如質粒體、病毒載體，及前述載體的類似物。許多適當載體及啟動子皆為本領域技術人員所熟知；許多用於產生標的重組構建體的載體及啟動子是可購得的。以下提供的載體僅為適例，不應將其限制本發明。細菌載體：pBs、phagescript、PsiX174、pBluescript SK、pBs KS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene，La Jolla，CA，USA)、pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR540，及pRIT5(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。真核生物載體：pWLneo、pSV2cat、pOG44、PXR1、Psg(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG，及pSVL(Pharmacia)。
表現載體通常具有位於啟動子序列附近之方便限制位點(convenient restriction site)，讓編碼有異源蛋白的核酸序列得以插入。表現宿主可具有操作性的可篩選標記。適合之表現載體包括但不限於病毒載體(例如，基於下列病毒之病毒載體：牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒、腺病毒(參見例如Li等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1994)35：2543-2549；Borras等人，Gene Ther.(1999)6：515-524；Li及Davidson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：7700-7704；Sakamoto等人，H.Gene Ther.(1999)5：1088-1097；WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984及WO 95/00655)、腺相關病毒(參見例如Ali等人，Hum.Gene Ther.(1998)9：81-86、Flannery等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：6916-6921；Bennett等人，Invest.Opthalmol.Vis.Sci.(1997)38：2857-2863；Jomary等人，Gene Ther.(1997)4：683690；Rolling等人，Hum.Gene Ther.(1999)10：641-648；Ali等人，Hum.Mol.Genet.(1996)5：591-594；Srivastava的WO 93/09239，Samulski等人，J.Vir.(1989)63：3822-3828；Mendelson等人，Virol.(1988)166：154-165；及Flotte等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90：10613-10617)、SV40、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(參見例如Miyoshi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)94：10319-23；Takahashi等人，J.Virol.(1999)73：7812-7816)、反轉錄病毒載體(例如，小鼠白血病病毒、脾壞死病毒及源自於例如羅斯肉瘤病毒、哈維肉瘤病毒(Harvey Sarcoma Virus)、禽白血病病毒、人類免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒及乳腺腫瘤病毒之反轉錄病毒的載體)；及前述病毒載體的類似物。
其它適用的表現載體例如但不限於慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒載體、腺病毒載體、痘病毒載體、皰疹病毒載體、經過改造的雜合病毒載體、轉座子介導的載體，及前述載體的類似物。病毒載體技術在本領域中是眾所周知的，並且在例如Sambrook 等人，2012，分子選殖：實驗室手冊，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press，NY、以及其他病毒學和分子學生物學手冊中有相關說明。可用作載體的病毒包括但不限於反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒和慢病毒。
通常，適合的載體含有可在至少一種生物體中發揮功能的複製起始序列、啟動子序列、方便的限制性核酸內切酶位點及一或多個可篩選標記物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
在一些實施例中，可以使用表現載體(例如，慢病毒載體)將嵌合抗原受體引入免疫細胞或其前驅細胞(例如，T細胞)中。
相應地，本發明的表現載體(例如，慢病毒載體)可以包括編碼有嵌合抗原受體的核酸。在一些實施例中，表現載體(例如，慢病毒載體)將包括能夠協助編碼於前述核酸序列中的嵌合抗原受體的功能性表現的其他單元。在一些實施例中，表現載體包括編碼有嵌合抗原受體的核酸，且表現載體還包括哺乳動物啟動子。在一個實施例中，載體進一步包括延伸因子-1 α啟動子(EF-1 α啟動子)。使用EF-1 α啟動子可以提高下游轉基因(例如，編碼嵌合抗原受體之核酸序列)的表現效率。生理啟動子(例如，EF-1 α啟動子)較不可能會誘發由嵌入所介導的遺傳毒性，並可消除反轉錄病毒載體轉化幹細胞的能力。適用於載體(例如，慢病毒載體)的其他生理啟動子是本領域技術人員已知的，並且可以將其併入本發明的載體中。在一些實施例中，載體(例如，慢病毒載體)還包括非必需順式作用序列，其可改善效價和基因表現。非必需順式作用序列的一個非限制性適例是中心多嘌呤管道和中心終止序列(central polypurine tract and central termination sequence，cPPT/CTS)，其對於有效反轉錄和核輸入來說是重要的。其他非必需順式作用序列是本領域技術人員所習知，並且可以併入本發明的載體(例如，慢病毒載體)中。在一些實施例中，載體還包括轉錄後調節元件。轉錄後調節元件可以改善RNA轉譯、改善轉基因表現並穩定RNA轉錄物。轉錄後調節元件的一個實例是土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。相應地，在一些實施例中，本發明的載體還包括WPRE序列。許多不同的轉錄後調節元件是本領域技術人員習知的，並且可以併入本發明的載體(例如，慢病毒載體)中。本發明的載體可以進一步包括 另外的元件，例如用於RNA運送的rev反應元件(RRE)、包裝序列(packaging sequences)、和5'和3'長末端重複序列(LTRs)。術語「長末端重複」或「LTR」是指位於反轉錄病毒DNA末端的鹼基對結構域，其包括U3、R和U5區域。LTRs通常提供表現反轉錄病毒基因的所需功能(例如，基因轉錄物的促進、起始和聚腺苷酸化)和病毒複製的所需功能。在一個實施例中，本發明的載體(例如，慢病毒載體)包括3'U3缺失的LTR。因此，本發明的載體(例如，慢病毒載體)可包括本文所述元件的任何組合以增強轉基因的功能性表現效率。舉例而言，除編碼有嵌合抗原受體的核酸外，本發明的載體(例如，慢病毒載體)可包括WPRE序列、cPPT序列、RRE序列、5'LTR、3'U3缺失的LTR'。
本發明的載體可以是自我失活型載體。本文所用術語「自我失活型載體(self-inactivating vectors)」是指其中3'LTR增強子啟動子區(U3區)已被修飾(例如，藉由進行缺失或取代)的載體。自我失活型載體可以在病毒第一次複製後阻止病毒轉錄。因此，自我失活型載體僅可以感染並然後嵌入至宿主基因組(例如，哺乳動物基因組)中一次，不能進一步傳遞。因此，自我失活型載體可以大幅降低產生出具有複製能力病毒的風險。
在一些實施例中，本發明的核酸可以是RNA(例如，體外合成的RNA)。體外合成RNA的方法是本領域技術人員所習知的；可以使用任何已知的方法來合成包括編碼有本發明嵌合抗原受體序列的RNA。將RNA引入宿主細胞的方法是本領域所習知的。參見例如Zhao等人，Cancer Res.(2010)15：9053。可以以體外(in vitro)、離體(ex vivo)或體內(in vivo)方式將包括編碼有本發明嵌合抗原受體核苷酸序列的RNA導入宿主細胞。舉例而言，可以將包括編碼有本發明嵌合抗原受體核苷酸序列的RNA以體外方式或離體方式利用電穿孔將其導入宿主細胞(例如，NK細胞、細胞毒性T淋巴細胞等)中。
為分析嵌合抗原受體多肽或其部分之表現，待引入細胞的表現載體亦可含有可篩選標記基因或報導基因，或兩者皆有，以促進從被病毒載體所轉染或感染之細胞群體中，鑑定及選擇出表現細胞。在其他實施 例中，可篩選標記可被攜載於DNA的獨立片段上且用於共轉染程序。可篩選標記及報導基因的前後均可接有適合的調節序列，以使其能夠在宿主細胞中表現。可篩選標記的適例包括但不限於耐抗生素基因。
報導基因係用於識別可能被轉染的細胞及分析調節序列的功能。一般而言，報導基因為接受個體生物體或組織中不存在或不表現的基因，且其編碼有一多肽，該基因於表現時會展現某些易於偵測的特性(例如，酵素活性)。在將DNA引入接受個體的細胞中後，於適合時間分析報導基因的表現。適合的報導基因可包括但不限於編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌的鹼性磷酸酶之基因、或綠色螢光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479：79-82)。
產生經修飾免疫細胞的方法
本發明提供了製造/產生修飾的免疫細胞或其前驅細胞(例如，調節性T細胞)的方法。一般來說，這些細胞是藉由引入編碼有標的嵌合抗原受體(例如，HLA-A2嵌合抗原受體)的核酸來進行修改。
將核酸引入細胞的方法包括物理性、生物性和化學性方法。以物理方式將多核苷酸(例如，RNA)引入宿主細胞的方法，包括磷酸鈣沉澱、脂質體轉染、粒子轟擊(particle bombardment)、顯微注射、電穿孔等，以及前述方法的類似方法。RNA可以利用市售方法將其引入目標細胞中，包括電穿孔(Amaxa Nucleofector-II，Amaxa Biosystems,Cologne，德國)、(ECM 830(BTX)，Harvard Instruments，Boston，Mass.)或基因脈衝發生器II(Gene Pulser II，BioRad，Denver，Colo.)、細胞融合儀(Multiporator，Eppendort，Hamburg，Germany)。也可使用以下方法將RNA引入細胞中，例如使用脂質體轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚合物封裝(encapsulation)、肽介導之轉染或生物彈粒子傳遞系統(例如「基因槍」，參見例如Nishikawa等人，Hum Gene Ther.,12(8)：861-70(2001))。
以生物方式將目標聚核苷酸引入宿主細胞中的方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體，尤其是反轉錄病毒載體已成為將基因插入至哺乳動物(例如，人類)細胞中最常用的方法。其他病毒載體可源自慢病毒、痘病毒、第I型單純疱疹病毒病毒、腺病毒及腺相關病毒及其類似 病毒。參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。
在一些實施例中，是以表現載體來將編碼有本發明標的嵌合抗原受體的核酸導入細胞中。本發明提供了包括編碼有標的嵌合抗原受體(例如，HLA-A2嵌合抗原受體)核酸的表現載體。適合的表現載體包括慢病毒載體、γ反轉錄病毒載體、泡沫病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、腺病毒載體、經改造的雜交病毒、裸DNA(包括但不限於轉座子介導的載體(例如，Sleeping Beauty轉座子、Piggybak轉座子和整合酶(例如，Phi31))。其他某些適合的表現載體包括單純皰疹病毒(HSV)和反轉錄病毒表現載體。
腺病毒表現載體係以腺病毒為基礎，其中腺病毒嵌入至基因組DNA中的能力很低，但轉染宿主細胞的效率很高。腺病毒表現載體含有腺病毒序列，其足以：(a)支持表現載體的包裝，以及(b)最終在宿主細胞中表現標的嵌合抗原受體。在一些實施例中，腺病毒基因組是大小為36kb、線性且雙鏈的DNA，在腺病毒基因組中可以插入外源DNA序列(例如，編碼標的嵌合抗原受體的核酸)來取代大片段的腺病毒DNA，以便產生本發明的表現載體(參見例如Danthinne和Imperiale，Gene Therapy(2000)7(20)：1707-1714)。
另一種表現載體係以腺相關病毒(AAV)為基礎，其利用腺病毒偶聯系統的優點。AAV表現載體嵌入至宿主基因組中的頻率很高。它可以感染非分裂細胞，所以其用於將基因遞送至哺乳動物細胞中(例如，在組織培養或體內)。AAV載體能夠感染相當多種宿主。關於AAV載體的產生和使用的細節，係描述於美國專利第5,139,941號和第4,797,368號中。
反轉錄病毒表現載體能夠嵌入到宿主基因組中，遞送大量的外源遺傳物質，感染許多不同的物種和細胞類型，並且被包裝在特殊的細胞株中。反轉錄病毒載體的構築係藉由將核酸(例如，編碼標的嵌合抗原受體的核酸)插入病毒基因組的某些位置中，以產生複製缺陷的病毒。儘管反轉錄病毒載體能夠感染多種細胞類型，但是需要宿主細胞的分裂來實現標的嵌合抗原受體的嵌入和穩定表現。
慢病毒載體係源自慢病毒，且慢病毒是複雜的反轉錄病毒， 其除了常見的反轉錄病毒基因gag、pol和env之外，還含有其他具有調控或結構功能的基因(參見例如美國專利號6,013,516和5,994,136)。舉例來說，慢病毒可以是人類免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)或猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒載體係藉由將HIV之毒力基因進行多重減弱而產生。舉例而言，讓基因env、vif、vpr、vpu和nef產生缺失，而使載體具備生物安全性。慢病毒載體能夠感染非分裂細胞並且可以用於體內和離體基因的轉移及表現(例如，編碼標的嵌合抗原受體的核酸，參見例如美國專利號5,994,136)。
含有本發明內容的核酸的表現載體，可以藉由任何本領域技術人員所習知的方式引入宿主細胞。如有必要，表現載體可以包括轉染用的病毒序列。或者，表現載體可以藉由融合、電穿孔、基因槍法、轉染、脂質轉染等或其類似方式引入。宿主細胞在表現載體引入之前，可以在培養環境中生長和擴增，隨後進行用於載體的引入和嵌入的適當處理。接著，將宿主細胞擴增，並可藉助存在於載體中的標記對宿主細胞進行篩選。可使用的各種標記是本領域所習知的，並且可以包括hprt、新黴素抗性、胸苷激酶、潮黴素抗性等。本文所用術語「細胞」、「細胞株」和「細胞培養物」可互換使用。在一些實施例中，宿主細胞是免疫細胞或其前驅細胞(例如，T細胞、NK細胞或NKT細胞)。
本發明還提供了包括並穩定表現有本發明的標的嵌合抗原受體的基因改造細胞。在一些實施例中，基因改造細胞是基因改造的T淋巴細胞(T細胞)、初始T細胞(TN)、記憶T細胞(例如，中央記憶T細胞(TCM)、作用記憶細胞(TEM))、天然殺手細胞(NK細胞)和能夠產生治療相關後代的巨噬細胞。在一個實施例中，基因改造細胞是自體細胞。
將具有本發明內容的核酸的表現載體穩定的轉染至宿主細胞，可以用來產生修飾的細胞(例如，包括標的嵌合抗原受體)。其他產生本發明修飾細胞的方法，包括但不限於化學轉化方法(例如，使用磷酸鈣、樹枝狀聚合物、脂質體和/或陽離子聚合物)、非化學轉化方法(例如，電穿孔、光學轉化、基因電轉移和/或流體動力學遞送)和/或基於顆粒的方法(例如，基因交付(impalefection)、使用基因槍和/或磁力轉染 (magnetofection))。表現本發明標的嵌合抗原受體的轉染細胞可以以體外方式擴增。
以物理方式將表現載體引入至宿主細胞的方法，包括磷酸鈣沉澱、脂質轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔等或其類似方法。產生帶有載體和/或外源核酸的細胞的方法是本領域眾所周知的。參見例如Sambrook等人。(2001)，分子選殖：實驗室手冊，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。
以化學方式於將多核苷酸引入宿主細胞的方法，包括膠體分散體系統(例如，大分子複合物、奈米膠囊、微球體、珠子)和基於脂質的系統(包括，水包油乳液、微胞、混合微胞和脂質體)。作為體外和體內用遞送載具的膠體系統，其中一種可以是脂質體(例如，人造膜囊泡)。
適用的脂質由市面上購得。舉例而言，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可購自Sigma，St.Louis，MO。磷酸三十二烷基酯(「DCP」)可購自K&K Laboratories(Plainview，NY)。膽固醇(「Choi」)可購自Calbiochem-Behring。二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可購自Avanti Polar Lipids，Inc.(Birmingham,AL.)。脂質於氯仿或氯仿/甲醇中的儲備原液可儲存在約-20℃的環境下。氯仿係用作唯一的溶劑，因為其比甲醇更容易蒸發。「脂質體」係為一通稱，其係指因雙層脂質進行封閉生成或聚集而產生的各種單層及多層脂質載具。脂質體之特徵為具有囊泡結構，其具有磷脂雙層膜，而內部為水性介質。多層脂質體具有多個脂質層，其係藉由水性介質所分隔。其在過量的磷脂懸浮於水溶液中時自發地形成。在形成封閉結構之前，脂質組分會進行自我重組，並在脂質雙層之間捕獲水及溶於水中的溶解物(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，本實施例亦涵蓋在溶液中有與正常囊泡結構不同結構的組合物。舉例而言，脂質可呈現微胞結構(micellar structure)或僅以脂質分子之非均勻聚集物的形式存在。本實施例亦涵蓋脂染胺(lipofectamine)-核酸複合物。
不管是將外源性核酸引入宿主細胞中的方法，或是其他使細胞暴露於本發明抑制劑的方法，為確認宿主細胞中核酸序列之存在，可進行多種分析。此類分析包括例如本領域技術人員所熟知的「分子生物」分 析(例如，南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR)；例如偵測特定肽之存在或不存在的「生物化學」分析(例如，藉由免疫學手段(ELISA及西方墨點法)或藉由本發明所描述之分析來識別在本發明之範疇內的試劑。
此外，核酸的引入可以藉由任何方式進行(例如，轉導擴增的T細胞、轉染擴增的T細胞、以及電穿孔擴增的T細胞)。一種核酸可能由一種方法引入，另一種核酸則由另一種方法被引入至T細胞中。
RNA
在一個實施例中，引入宿主細胞的核酸為RNA。在另一個實施例中，RNA是mRNA，其包括體外轉錄RNA或人工合成RNA。RNA是利用聚合酶鏈鏈鏈鎖反應(PCR)所產生的模板以體外轉錄方式所生成。任何來源的目標DNA可以藉由PCR直接轉化成模板，利用適合的引子和RNA聚合酶來進行體外mRNA合成。舉例而言，DNA的來源可以是基因組DNA、質粒DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其它適當的DNA來源。
使用PCR產生mRNA體外轉錄用的模板，然後將其導入細胞中。進行PCR的方法在本領域是習知的。用於PCR之引子，經設計而具有與可作為PCR模板的DNA區域實質上互補的區域。本文中所用之「實質上互補」係指引子序列中之大部分或全部鹼基為互補，或一或多個鹼基為不互補或不匹配。實質上互補的序列能夠在PCR之退火條件下與預期的DNA目標發生黏接或雜交。引子可經設計以與DNA模板的任何部分實質上互補。舉例而言，引子可經設計以擴增一基因在細胞中通常會發生轉錄的部分(開放閱讀框架)，其包括5'及3' UTR。引子亦可經設計以擴增基因的一部分，其係編碼有目標特定結構域。在一個實施例中，引子經設計以擴增人類cDNA的編碼區，包括全部或部分的5'及3' UTR。適用於PCR的引子，可藉由本領域所習知的合成方法來產生。
「正向引子」為含有與在待擴增DNA序列上游的DNA模板上之核苷酸實質上互補之核苷酸區的引子。「上游」在本文中用以指相對於編碼股的待擴增之DNA序列之5'位置。「反向引子」為含有與在待擴增DNA序列下游之雙股DNA模板實質上互補的核苷酸區的引子。「下游」在 本文中用以指相對於編碼股的待擴增之DNA序列之3'位置。
本文亦可利用能夠促進RNA穩定性及/或轉譯效率之化學結構。RNA較佳會具有5'及3' UTR。在一個實施例中，5'UTR的長度為0至3000個核苷酸。待添加至編碼區的5'及3' UTR序列之長度可以不同方法進行改變，包括但不限於設計會黏接至UTR之不同區域的PCR引子。使用此方法，本發明所屬技術領域具有通常知識者可在將轉染轉錄RNA後，修改能夠達到最佳轉譯效率所需的5'及3' UTR長度。
5'及3'UTR部分可以是目標基因天然存在的內源性5'及3'端的UTR。或者，藉由在正向及反向引子中併入UTR序列，或藉由其他任何對模板的修飾，可以非內源性的UTR序列添加至目標基因。使用目標基因非內源性的UTR序列，有助於調整RNA的穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，目前已知3' UTR序列中的AU富含單元(AU-rich elements)會降低mRNA的穩定性。因此，根據本領域中所習知的UTRs特性來選擇及設計3'UTR，可以提高轉錄所得之RNA的穩定性。
在一個實施例中，5'UTR可含有內源性基因之克紮克序列(Kozak sequence)。或者，當利用如前文所述的以PCR添加目標基因非內源性之5' UTR時，可藉由添加5' UTR序列來重新設計共同克紮克序列。克紮克序列可提高某些RNA轉錄物的轉譯效率，但似乎並非所有的RNA都需要此種序列來進行有效率的轉譯。本領域中已知有許多mRNA需要克紮克序列。在其他實施例中，5' UTR可源自RNA病毒，其RNA基因組在細胞中為穩定存在。在其他實施例中，多種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR，以阻礙mRNA被核酸外切酶降解。
為在無需基因選殖的情況下也能夠從DNA模板進行RNA的合成，轉錄啟動子應連接至待轉錄序列上游之DNA模板。當充當RNA聚合酶之啟動子的序列添加至正向引子之5'端時，RNA聚合酶啟動子會併入PCR產物中待轉錄之開放閱讀框架的上游。在一個實施例中，啟動子為如本文別處所述之T7聚合酶啟動子。其他適用啟動子包括但不限於T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。T7、T3及SP6啟動子的共同核苷酸序列則為本領域中所習知。
在一實施例中，mRNA在5'端及3'聚腺苷酸尾(poly(A)tail)具有封帽，其係決定核糖體結合、轉譯起始及細胞中mRNA的穩定性。在環狀DNA模板上，例如質體DNA，RNA聚合酶會產生不適於在真核細胞中表現的長多聯產物。質體DNA的轉錄物，於其3' UTR之末端線性化後會產生正常尺寸之mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化，轉染至真核細胞後亦不會發生作用。
在線性DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可使轉錄物之3'端延伸超出模板之最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf,Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)；Nacheva及Berzal-Herranz,Eur.J.Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003))。
將聚腺苷酸/胸腺苷酸(polyA/T)伸長部嵌入至DNA模板中的習知方法為分子選殖。然而，嵌入至質體DNA中之polyA/T序列會使質體不穩定，這就是自細菌所獲得的質體DNA模板很常混摻有缺失及其他畸變的原因。這種情況不僅會讓選殖過程費力且費時，且穩定度通常不高。此為十分需要一種方法可以在不進行選殖的情況下建構出帶有polyA/T 3'伸長部DNA模板的原因。
在PCR期間使用含有聚胸腺苷酸尾(例如，100個胸腺苷酸所聚合而成，尺寸可為50至5000個胸腺苷酸)之反向引子，或在PCR之後藉由其他任何方法-包括但不限於DNA接合或體外重組，可以在轉錄用DNA模板上成生polyA/T區段。聚腺苷酸尾也讓RNA穩定且減少其降解。一般而言，聚腺苷酸尾的長度與經轉錄RNA之穩定性呈正相關。在一個實施例中，聚腺苷酸尾為100至5000個腺苷。
RNA的聚腺苷酸尾在使用聚腺苷酸聚合酶(例如，大腸桿菌聚腺苷酸聚合酶，E-PAP)體外轉錄之後可進一步延伸。在一個實施例中，將聚腺苷酸尾的長度由100個核苷酸增至300至400個核苷酸，會讓RNA的轉譯效率提高約兩倍。此外，不同化學基團與3'端之連接可提高mRNA穩定性。此類連接可含有經修飾的/人造核苷酸、適體(aptamers)及其他化合物。舉例而言，ATP類似物可使用聚腺苷酸聚合酶併入聚腺苷酸尾中。ATP類似物可進一步提高RNA穩定性。
5'端帽亦向RNA分子提供穩定性。在一較佳實施例中，本文揭示之方法所產生的RNA包括5'端帽。使用此項技術中已知及本文所述之技術提供5'端帽(Cougot等人，Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)；Stepinski，等人.,RNA,7：1468-95(2001)；Elango等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005))。
藉由本文揭示之方法產生的RNA亦可含有內部核糖體入口位點(IRES)序列。IRES序列可為任何病毒、染色體或人工設計之序列，其會引發核糖體不依賴端帽(cap-independent)的方式結合mRNA，且促進轉譯之起始。過程中可加入任何適於細胞電穿孔的溶解物，其可含有有助於細胞滲透性及存活的因子，例如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及界面活性劑。
在一些實施例中，將RNA電穿孔入細胞中，例如體外轉錄之RNA。
本文所揭露的方法可以應用於基礎研究和治療領域中關於宿主細胞活性之調節。基礎研究和治療領域涵蓋癌症、幹細胞、急性與慢性感染及自體免疫疾病，包括分析經遺傳修飾的宿主細胞殺死目標癌細胞之能力。
該些方法亦能大範圍地控制表現量，其係藉改變，例如，啟動子或RNA輸入量，使其能個別調節表現量。此外，以PCR為基礎的mRNA生產技術，對於設計出具有不同結構和其結構域組合之mRNA，有很大的幫助。
本發明RNA轉染方法其中一個優勢為，RNA轉染原則上係暫時性的且不需載體。RNA轉基因可輸送至淋巴球，並於簡短的體外細胞活化後於其中表現，其係作為最小表現匣而不須任何額外病毒序列。於該些條件下，轉基因不會嵌入宿主細胞基因體。由於RNA的轉染效率及其一致性地修飾整體淋巴球群體的能力，故無須進行細胞選殖。
以體外轉錄之RNA(IVT-RNA)進行宿主細胞的基因改造，係使用兩種不同策略，兩種皆已成功地於多個動物模式中測試過。以體外轉錄之RNA來轉染細胞，係藉由脂質轉染或電穿孔的手段。為了延長轉移 的IVT-RNA的表現，可使用各種修飾來穩定IVT-RNA。
文獻中已知有某些IVT載體，其以標準化方式作為體外轉錄之模板，且其係以產生穩定之RNA轉錄物的方式進行基因改造。目前，本領域所使用的方式係基於質體載體，其具下列結構：能使RNA轉錄之5' RNA聚合酶啟動子，其後是目標基因(其3'及/或5'端接有未轉譯區(UTR))、以及，含有50至70個腺苷酸的3'端多腺苷酸匣。在體外轉錄前，環狀質體藉由第II型限制酶在多腺苷酸匣下游進行線性化(識別序列對應於切割位點)。因此，多腺苷酸匣對應於轉錄物後之聚腺苷酸序列。此程序之結果為，一些核苷酸於線性化後仍為酵素切割位點之一部分，且延伸或遮蔽3'端之聚腺苷酸序列。目前尚不清楚的是，這種非生理上懸伸(overhang)是否會影響此構築於體細胞內所產生的蛋白量。
RNA比傳統的質體或病毒方法具更多優勢。由RNA開始進行的基因表現不須轉錄，且蛋白產物於轉染後快速產生。此外，由於RNA係僅進入細胞質，而非細胞核，因此典型之轉染方法就會有極高之轉染率。此外，在基於質體的方法中，在研究時，其驅動目標基因表現之啟動子，於細胞中需具有活性。
在另一方面，RNA構建體可藉由電穿孔傳遞入細胞。舉例而言，參見，如US 2004/0014645、US 2005/0052630A1、US 2005/0070841A1、US 2004/0059285A1、US 2004/0092907A1中所揭示的以電穿孔方式將核酸構築結構送入哺乳動物細胞的調配物和方法。前述方式的各種參數，包括任何已知細胞類型所需的電穿孔電場強度，基本上已揭露於相關研究文獻以及本領域許多專利和申請案中。參見例如美國專利號6,678,556、美國專利號7,171,264和美國專利號7,173,116。用於治療的電穿孔裝置可以在市面上買到，例如，MedPulserTM DNA電穿孔療法系統(Inovio/Genetronics，San Diego，Calif.)，並且其在例如美國專利號6,567,694、美國專利號6,516,223、美國專利號5,993,434、美國專利號6,181,964、美國專利號6,241,701和美國專利號6,233,482的專利中亦有描述。電穿孔也可用於體外轉染細胞，例如US20070128708A1中所描述。電穿孔也可用於體外傳遞核酸進入細胞。因此，由電穿孔所介導的將核酸(包 括表現構築體)投予至細胞，係使用許多本領技術人員所習知的商售裝置與電穿孔系統中任一者所進行，且其是一種將目標RNA遞送至目標細胞令人振奮的新方法。
免疫細胞來源
在擴增之前，從一個體獲得免疫細胞的來源以用於離體操作。舉例而言，用於離體處理的目標細胞來源還可以包括自體或異體供給體血液、臍帶血或骨髓。舉例而言，免疫細胞的來源可以來自預計以本發明的修飾免疫細胞進行治療的個體(例如，該個體的血液、臍帶血或骨髓)。個體的非限制性實例包括人、狗、貓、小鼠、大鼠及其轉基因物種。較佳地，個體為人類。
免疫細胞可以從多種來源獲得，包括血液、周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、脾臟組織、臍帶、淋巴或淋巴器官。免疫細胞是免疫系統的細胞，例如先天性或適應性免疫的細胞，例如，骨髓或淋巴樣細胞(包括淋巴細胞，典型地是T細胞和/或NK細胞)。其他示例性細胞包括幹細胞(例如，多功能型幹細胞和多潛能型幹細胞(包括誘導性多功能型幹細胞(iPSC))。在一些方面，該些細胞是人類細胞。參照待治療的個體，細胞可以屬於同種異體的和/或自體的。該些細胞通常是原代細胞，例如直接從個體分離和/或從個體分離並冷凍的細胞。
在某些實施例中，免疫細胞是T細胞，例如CD8+ T細胞(例如，CD8+初始T細胞、中央記憶T細胞或作用記憶T細胞)、CD4+ T細胞、天然殺手T細胞(NKT細胞)、調節性T細胞(Treg)、幹細胞記憶性T細胞、淋巴樣祖細胞、造血幹細胞、自然殺手細胞(NK細胞)或樹突細胞。在一些實施例中，細胞是單核球或顆粒細胞，例如骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性球、樹突細胞、肥大細胞、嗜酸性球和/或嗜鹼性球。在一個實施例中，目標細胞是誘導性多功能型幹細胞(iPS cell)或源自iPS細胞的細胞，例如由一個體產生的iPS細胞，其經過操作以改變(例如，誘導其中的突變)或操縱一種或多種目標基因的表現，並分化成例如T細胞(例如，CD8+ T細胞(例如，CD8+初始T細胞、中央記憶T細胞或作用記憶T細胞)、CD4+ T細胞、幹細胞型記憶T細胞、淋巴樣祖細胞或造血幹細胞)。
在一些實施例中，細胞包括T細胞中一個或多個亞組或其他細胞類型，例如整個T細胞群體、CD4+細胞、CD8+細胞，及前述細胞的亞群，前述亞群可例如藉由功能、活化狀態、成熟度、分化潛力、擴增、再循環、定位和/或持續能力、抗原特異性、抗原受體的類型、特定器官或區室中的存在情況、標記或細胞激素分泌概況和/或分化程度所定義。T細胞和/或CD4+和/或CD8+ T細胞的亞型和亞群為初始T(TN)細胞、作用T細胞(TEFF)、記憶T細胞，及前述細胞的亞型。舉例來說，該細胞可為幹細胞型記憶T細胞(TSCM)、中央記憶T細胞(TCM)、作用記憶T細胞(TEM)，或終末分化作用記憶T細胞)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、未成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T(MAIT)細胞、天然存在及適應調節性T(Treg)細胞、輔助T細胞(例如，TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡輔助型T細胞)、α/β T細胞和δ/γ T細胞。在某些實施例中，其可以使用本領域可得的任何數量的T細胞株。
在一些實施例中，所述方法包括從個體分離免疫細胞、並製備、加工、培養和/或改造這些細胞。在一些實施例中，改造細胞的製備包括一個或多個培養和/或製備步驟。以前述方式改造的細胞可以從一樣品分離(例如，生物樣品(例如，從個體獲得或從源自個體的樣品)。在一些實施例中，分離出細胞的個體是患有疾病、患有病症，需要細胞治療，或將採用細胞治療的個體。在一些實施例中，個體是需要特定治療干預(例如，細胞經分離、加工和/或改造的過繼性細胞療法)的人類。因此，在一些實施例中的細胞是原代細胞(例如，原代人類細胞)。樣品包括直接從個體取得的組織、體液和其他樣品，以及由一個或多個處理步驟(例如分離、離心、基因工程(例如，用病毒載體轉導)、洗滌和/或培育)所產生的樣品。生物樣品可以是直接從生物來源獲得的樣品或經處理的樣品。生物樣品包括但不限於體液(例如，血液、血漿、血清、腦脊髓液、滑囊液、尿液和汗液)、組織和器官樣品，包括由其等衍生的經處理樣品。
在一些方面，細胞的來源或經分離之細胞的樣品是血液或血液衍生的樣品，或為或來源於血球分離術或白細胞去除術產品。舉例來說， 樣品可以是全血、周邊血液單核球(PBMCs)、白血球、骨髓、胸腺、組織活檢體、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾臟、其他淋巴組織、肝、肺、胃、腸、結腸、腎、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宮頸、睾丸、卵巢、扁桃體或其他器官、和/或來源於其之細胞。在細胞療法(例如，過繼性細胞療法)之情況下，樣品包括來自自體和同種異體來源的樣品。
在一些實施例中，細胞源自於細胞株(例如，T細胞株)。在一些實施例中，細胞係取自異種來源(例如，來自小鼠、大鼠、非人類靈長類動物和豬)。在一些實施例中，該些細胞之分離包括一或多個製備步驟和/或基於非親和性之細胞分離步驟。在一些實例中，對細胞進行洗滌、離心和/或在一種或多種試劑存在下培育，以例如除去不合需要之組分、富集所需的組分、溶解或除去對特定試劑敏感之細胞。在一些實例中，其係基於一或多種性質(例如，密度，黏附性質、大小、敏感性和/或對特定組分之抗受性)所分離出的細胞。
在一些實例中，來自個體循環血液的細胞係藉由例如血球分離術或白血球分離術而獲得。在某些情況，樣品含有淋巴細胞(包括T細胞、單核細胞、顆粒細胞、B細胞、其他有核白血球細胞)、紅血球和/或血小板，且在某些情況下會包括紅血球和血小板以外的細胞。在一些實施例中，對自個體收集的血液細胞進行洗滌(例如，除去血漿部分，並將細胞置於適合的緩衝液或培養基中，以用於後續的處理步驟)。在一些實施例中，係使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞。在一些方面，根據製造商的說明書，洗滌步驟係藉由切向流過濾(TFF)來完成。在一些實施例中，細胞在洗滌後會再懸浮於各種生物相容的緩衝液中。在某些實施例中，會移除血液細胞樣品的組分，並將細胞直接再懸浮於培養基中。在一些實施例中，該等方法包括基於密度之細胞分離方法，例如，溶解紅血球並通過Percoll或Ficoll梯度離心而從周邊血液製備白細胞。
在一個實施例中，來自個體循環血液的免疫細胞，係藉由血球分離術或白血球分離術所獲得。血球分離術的產物通常含有淋巴細胞(包括T細胞、單核球、顆粒球、B細胞、其他有核白血球細胞)、紅血球和血 小板。由血球分離術所收集的細胞可以經過洗滌來去除血漿部分，並將細胞置於適合的緩衝液或培養基中(例如，磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、缺乏鈣且可能缺乏鎂的洗滌液，或缺乏鈣且不含大多數二價陽離子的洗滌液)，以用於後續的處理步驟。洗滌後，可以將細胞再懸浮在各種生物相容的緩衝液中，例如無鈣、無鎂的PBS。或者，可以去除血球分離術樣品中不合期望的成分，並將細胞直接再懸浮在培養基中。
在一些實施例中，分離方法包括基於一種或多種特定分子在細胞中之表現或存在來分離不同類型的細胞。前述特定分子可例如為表面蛋白質、細胞內標誌物或核酸等的表面標誌物。在一些實施例中，其可利用任何已知基於這些標記物的分離方法。在一些實施例中，分離係基於親和性或免疫親和性而進行。舉例而言，在某些情況下，分離包括根據一或多種標記物(通常為細胞表面標記物)於細胞是否表現或其表現量，來分離細胞和細胞群體。舉例來說，其係藉由會與這些標記物特異性結合的抗體或結合搭配物一起培育，隨後通常進行洗滌步驟，並將結合至抗體或結合搭配物的細胞與未結合至抗體或結合搭配物的細胞進行分離。此類分離步驟可基於正向篩選，其中保留已與試劑結合的細胞，供進一步的使用，和/或基於負向篩選，其中保留未與抗體或結合搭配物結合的細胞。在一些實例中，兩種部分皆被保留，以供進一步使用。在一些方面，當無法取得能夠從一混雜群體中特異性地識別出單一細胞類型的抗體的情況下，此時負向篩選的方式特別好用，因此，分離所根據的標記物最好是非目標群體細胞所表現的標記物。分離率不需要到達100%，也不需要完全去除特定的細胞群體或表現有特定標記物的細胞。舉例而言，特定類型細胞(例如，該些表現有標記物的細胞)的正向篩選或富集，係指增加這些細胞的數量或百分比，但不表示完全去除不表現該標記的細胞。同樣地，特定類型細胞(例如，該些表現有標記物的細胞)的負向篩選、去除或耗乏，是指減少這些細胞的數量或百分比，但無須完全去除這些細胞。
在一些實例中，會進行多次分離步驟，其係將一步驟所得出的正向篩選或負向篩選部分進行另一次的分離步驟(例如，後續正向篩選或負向篩選)。在一些實例中，單次的分離步驟能同時耗乏表現不同標記物 的細胞，例如將細胞與多種抗體或結合搭配物培育，每種抗體或結合搭配物能夠特異性地辨識出負向篩選用的標記物。同樣地，可以將細胞與多種在各種細胞類型上表現的抗體或結合搭配物一起培育，同時對多種細胞類型進行正向篩選。
在一些實施例中，一或多種T細胞群體係富含或耗乏一或多種特定標誌物(例如表面標誌物)為陽性(標誌物+)或表現高水平(標誌物高)的細胞，或富含或耗乏一或多個標記物為陰性(標記物-)或表現相對較低水平(標記物低)的細胞。舉例而言，在一些方面，其係藉由正向或負向篩選技術來分離出T細胞的特定亞群。舉例來說，其可以是，一或多種表面標誌物為陽性或高表現量的細胞，例如是CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T細胞)。在某些情況下，這些標記物在某些T細胞群(例如，非記憶細胞)上不存在或其表現量較低，但這些標記物存在於其他某些T細胞群(例如，記憶細胞)中或其表現量較高。在一個實施例中，細胞(例如，CD8+細胞或T細胞(例如，CD3+細胞))富含有(即正向篩選出)CD45RO、CCR7、CD28、CD27、CD44、CD127和/或CD62L為陽性或高表面表現量的細胞和/或耗乏掉(例如，用負向篩選以去除)CD45RA為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實施例中，細胞富含或耗乏掉CD122、CD95、CD25、CD27和/或IL7-Ra(CD127)為陽性或高表面表現量的細胞。在一些實例中，CD8+T細胞富含有CD45RO為陽性(或CD45RA陰性)及CD62L為陽性的細胞。舉例而言，可使用CD3/CD28綴合的磁珠(例如，DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T細胞擴增儀)正向篩選CD3+、CD28+ T細胞。
在一些實施例中，將T細胞與PBMC樣品分離的方式係對不會在T細胞(例如，B細胞、單核球或其他白血球)上表現的標記物(例如，CD14)進行反向篩選。在一些方面，係使用CD4+或CD8+篩選步驟來分離出CD4+輔助細胞與CD8+細胞毒性T細胞。藉由對在一或多個初始、記憶和/或作用T細胞亞群上有表現或表現量較高的標記物進行正向或反向篩選，以將這些CD4+和CD8+群體進一步分選成亞群。在一些實施例中，舉例而言，藉由以基於與相應亞群相關的表面抗原進行正向或反向篩選， CD8+細胞會進一步富含或耗乏掉初始、中央記憶、作用記憶和/或中央記憶幹細胞。在一些實施例中，會對中央記憶T(TCM)細胞進行富集，以增加療效，例如改善投與後的長期存活率、擴增程度和/或移植狀況，在某些方面，這些亞群的療效尤其顯著。在一些實施例中，將富含有TCM的CD8+ T細胞和CD4+ T細胞合併起來，會進一步增強療效。
在一些實施例中，記憶T細胞存在於CD8+周邊血液淋巴細胞的CD62L+和CD62L-這兩個亞群中。PBMC可富含有或耗乏掉CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+級分，例如使用抗CD8和抗CD62L抗體。在一些實施例中，CD4+ T細胞群體和/或CD8+ T群體會富含有中央記憶(TCM)細胞。在一些實施例中，中央記憶T(TCM)細胞之富集係基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127為陽性或有高表面表現量；在某些情況，前述細胞的富集係基於對表現或高度表現有CD45RA和/或顆粒酶B的細胞進行負向篩選。在某些情況下，其係藉由耗乏掉表現有CD4、CD14、CD45RA的細胞以及對表現有CD62L的細胞進行正向篩選或富集，來分離出富含有TCM細胞的CD8+群體。在一個方面，中央記憶T(TCM)細胞之富集是藉由以下方式進行：選出沒有CD4表現的細胞，將其作為起始物，接著以CD14和CD45RA的表現進行負向篩選，並且以CD62L進行正向篩選。在某些情況下，前述篩選是同時進行的，而在其他情況是依序進行，但其順序不拘。在一些方面，用在製備CD8+細胞群體或亞群過程中針對CD4表現進行篩選的相同步驟也會用在產生CD4+細胞群體或亞群的過程中，致使針對以CD4進行分離後，且視情況在一或多個進一步的正向或負向篩選步驟之後，陽性和陰性部分兩者都會保留下來，且其會用於所述方法的後續步驟中。
藉由鑑別具有細胞表面抗原的細胞群體來將CD4+T輔助細胞分選為初始、中樞記憶和作用細胞。CD4+淋巴球可以藉由標準方法獲得。在一些實施例中，初始CD4+T淋巴球是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T細胞。在一些實施例中，中央記憶CD4+細胞是CD62L+和CD45RO+。在一些實施例中，作用CD4+細胞是CD62L-和CD45RO。在一個實例中，為了以負向篩選來富集出CD4+細胞，所用的單株抗體混合 液通常會包括抗-CD14、抗-CD20、抗-CD11b、抗-CD16、抗-HLA-DR和抗-CD8的抗體。在一些實施例中，抗體或結合搭配物係結合於固體載體或基質(例如，磁珠或順磁珠)，以便在正向和/或負向篩選中分離細胞。
在一些實施例中，細胞在基因改造前或於基因改造過程中進行培育和/或培養。培育步驟可以包括培養(culture、cultivation)、刺激、活化和/或繁殖。在一些實施例中，組合物或細胞會孵育於具有刺激條件或刺激劑的環境下。孵育的條件包括經設計以誘導群體發生細胞增殖、擴增、活化和/或存活、經設計以模擬抗原暴露和/或使細胞俾便進行基因改造(例如，引入重組抗原受體)等條件。前述條件可以包括一或多種特定的培養基、溫度、氧氣含量、二氧化碳含量、時間、試劑(例如，營養素、胺基酸、抗生素、離子)和/或刺激因子(例如，細胞激素、趨化因子、抗原、結合搭配物、融合蛋白、重組的可溶性受體、和其他任何經設計用於活化細胞的試劑。在一些實施例中，刺激條件或試劑包括一或多種能夠活化TCR複合物細胞內信號傳導結構域的試劑(例如，配位體)。在一些方面，試劑會開啟或起始T細胞中之TCR/CD3細胞內信號傳導級聯。此類試劑可以包括抗體和/或一種或多種細胞激素。前述抗體可以是對TCR成分和/或共刺激受體有特異性的抗體，例如，抗CD3、抗CD28抗體，且可例如結合於固體載體(如珠子)上。視情況，擴增方法可以進一步包括向培養基中添加抗CD3和/或抗CD28抗體(例如，以至少約0.5ng/ml之濃度添加)的步驟。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2和/或IL-15。舉例來說，刺激劑包括濃度為至少約10個單位/mL的IL-2。
在另一個實施例中，T細胞係以溶解紅血球和減少單核球(例如藉由PERCOLLTM梯度離心)的方式從周邊血液分離出來的。或者，T細胞可以從臍帶分離出來。無論如何，以正向或負向篩選技術可以進一步分離出來特定的T細胞亞群。
以前述方式所分離到的臍帶血單核球可以耗乏掉表現某些抗原的細胞，包括但不限於CD34，CD8，CD14，CD19和CD56。耗乏掉這類細胞可以使用經分離的抗體、包括抗體的生物樣品(如腹水)、與物理性支持物結合的抗體、和與細胞結合的抗體來達成。
以負向篩選方式來富集T細胞群體，可以使用被負向篩選過的細胞所特有表面標記物的抗體組合。較佳的方法為以負向磁性免疫黏附或流式細胞儀來進行的細胞分流及/或篩選，其係使用一單株抗體混合物，而該單株抗體混合物係針對會表現於經負向選擇過的細胞上的細胞表面標記物。舉例而言，為了以負向篩選方式來富集CD4+細胞，所使用的單株抗體混合物通常包括抗CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。
對於正向或負向選擇來分離期望細胞群體來說，可以使用不同的細胞及表面(例如粒子(例如珠子))之濃度。在某些實施例中，其可能會顯著降低珠粒及細胞混合後的體積(即增加細胞之濃度)，以確保細胞與珠粒的接觸量最大化。舉例而言，在一實施例中，其係使用20億個細胞/毫升之濃度。在一實施例中，其係使用10億個細胞/毫升之濃度。在另一實施例中，其係使用大於100百萬個細胞/毫升之濃度。在另一實施例中，其係使用10百萬、15百萬、20百萬、25百萬、30百萬、35百萬、40百萬、45百萬或50百萬個細胞/毫升之細胞濃度。在又一實施例中，其係使用75百萬、80百萬、85百萬、90百萬、95百萬或100百萬個細胞/毫升之細胞濃度。在另一實施例中，其可使用125百萬或150百萬個細胞/毫升之濃度。利用高濃度可增加細胞產率、細胞活化程度提高及細胞擴增情況更好。
T細胞亦可在洗滌步驟後進行冷凍，且其中不需要移除單核球的步驟。不希望受限於理論，冷凍及後續解凍步驟藉由在細胞群體中移除顆粒球以及一定程度的單核球會提供更均勻之產物。在經過移除血漿及血小板之洗滌步驟後，可將細胞懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為本領域所習知且可用於本文，但在非限制性實例中，其中一種方法係涉及利用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有其他適宜的細胞冷凍介質。之後，以1℃/分鐘之速率將細胞冷凍至-80℃，且將其儲存在液氮儲存罐之氣相中。前述細胞冷凍過程可使用其他經控制的冷凍方法，也可用不受控地在-20℃下或液氮中的立即冷凍法。
在一個實施例中，T細胞群體包含在例如周邊血單核球、臍 帶血細胞，純化的T細胞群體及T細胞株等細胞內。在另一個實施例中，周邊血單核球包含T細胞群體。在又一個實施例中，純化的T細胞包含T細胞群體。
在某些實施例中，T調節細胞(Treg)可以從一樣品中分離出來。該樣品可以包括但不限於臍帶血或周邊血。在某些實施例中，T調節細胞係藉由流式細胞術分選所分離到的。在分離之前，可藉由本領域已知的任何方式對樣品中的T調節細胞進行富集。經分離的T調節細胞可以在使用前進行冷凍保存和/或擴增。分離T調節細胞的方法係描述於美國專利號7,754,482、8,722,400和9,555,105以及美國專利申請號13/639,927中，這些文獻的整體內容以引用方式而納入本文。
免疫細胞擴增
不論是在將細胞修飾以表現標的嵌合抗原受體之前或之後，該細胞可使用例如以下專利中所述之方法進行活化及擴增：美國專利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041，及美國專利申請公開案第20060121005號。舉例而言，本發明的免疫細胞可藉由與表面接觸來擴增，該表面附接有一介質與一配體，該介質會刺激CD3/TCR複合體相關信號，該配體會刺激免疫細胞表面上的共刺激分子。具體而言，免疫細胞群體可以如下方式刺激：藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段接觸，或固定在一表面上的抗CD2抗體接觸，或藉由與蛋白激酶C活化劑(例如苔蘚蟲素(bryostatin))以及鈣離子載體(calcium ionophore)接觸來刺激。對於免疫細胞表面上輔助分子之共刺激，係使用結合輔助分子之配體。舉例而言，可在適於刺激免疫細胞增殖之條件下使T細胞群體與抗CD3抗體及抗CD28抗體接觸。抗CD28抗體之實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone，Besançon，France)，其可用於本發明，而其他業內通常已知的方法也同樣適用(見Berg等人，Transplant Proc.(1998)30(8)：3975-3977；Haanen等人，J.Exp.Med.(1999)190(9)：1319-1328；Garland等人，J.Immunol.Methods(1999)227(1-2)：53-63)。
以本文揭露方法來擴增免疫細胞，其可增加約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更多，以及可以是前述數值間的任一、所有、全部，或部分整數之倍數。在一個實施例中，免疫細胞擴增範圍為約20倍至約50倍之間。
培養後，免疫細胞可以在培養裝置中的細胞培養基中培育一段時間，或者直到細胞達到匯合(confluency)或高細胞密度以便在細胞繼代至另一個培養裝置之前達到最佳繼代。培養裝置可以是任何常用於體外培養細胞的培養裝置。較佳地，在將細胞繼代到另一個培養裝置之前，匯合程度為70%或更高。更佳地，匯合程度為90%或更高。一段時間可以是任何適合體外培養細胞的時間。於免疫細胞培養過程中，可在任何時間更換免疫細胞培養基。較佳地，每2至3天更換一次免疫細胞培養基。接著，從培養裝置中收取免疫細胞，然後免疫細胞可立即使用或冷凍保存以供以後使用。在一個實施例中，本發明包括冷凍經擴增的免疫細胞。在將核酸引入其中之前，冷凍保存的免疫細胞會預先解凍。
在另一個實施例中，本文的方法包括分離免疫細胞和擴增免疫細胞。在另一個實施例中，本發明進一步包括在擴增之前冷凍免疫細胞。在又一個實施例中，將低溫保存的免疫細胞解凍，以用於將編碼嵌合膜蛋白的RNA進行電穿孔。
用於離體擴增細胞之另一個程序，係描述於美國專利第5,199,942號中(以引用方式納入本文)。例如美國專利第5,199,942號中所描述的擴增方式可為本發明擴增方法的替代形式或與其他擴增方式一起使用。簡言之，免疫細胞之離體培養及擴增可包括添加例如美國專利第5,199,942號中所描述的細胞生長因子或其他因子，例如flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit配位體。在一個實施例中，免疫細胞之擴增包括將免疫細胞與選自於由flt3-L、IL-1、IL-3及c-kit所組成之群組的因子一起培養。
本文所述的培養步驟(與如本文所述的與試劑接觸或於電穿 孔之後)時間可以非常短，舉例而言，小於24小時，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23小時。如本文進一步描述的培養步驟(與本文所述的試劑接觸)可以更長，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天。
本文係使用各種術語來描述培養中的細胞。細胞培養通常意指從活生物體中取出並在受控條件下生長的細胞。原代細胞培養是直接從生物體中取出的細胞、組織或器官，並在進行第一次繼代培養之前的培養。當細胞在促進細胞生長和/或分裂的條件下置於生長培養基中時，它們會在培養中擴增，產生更大量的細胞。當細胞在培養中擴增時，細胞增殖速率通常藉由細胞數量翻倍所需的時間量來測量，又稱為倍增時間。
每一輪的繼代培養被稱為一次繼代。當細胞進行繼代培養時，它們被稱為已經繼代。特定的細胞群體或細胞株有時以其經繼代次數所表示或辨明。舉例而言，已經繼代十次的經培養細胞群體可以被稱為P10培養。原代培養，即從組織中分離細胞後的第一次培養被命名為P0。在第一次繼代培養之後，將細胞描述為次代培養(P1或第1代)。第二次繼代培養後，細胞成為第三代培養(P2或第2代)等等。本領域技術人員能理解，在繼代期間可能有許多次的群體倍增；因此培養的群體倍增次數大於繼代次數。繼代間細胞的擴增情況(即群體倍增次數)取決於許多因素，包括但不限於接種密度、基質、培養基和繼代間的時間。
在一實施例中，可將細胞培養若干小時(約3小時)至約14天或其間之任何整數的小時數。適用於免疫細胞培養之條件包括可含有增殖及存活所需因子之適宜培養基(例如最小必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15(Lonza))，該等因子包括血清(例如，胎牛或人類血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGF β及TNF-α，或其他任何熟習此項技術者已知用於細胞生長的添加劑。用於細胞生長的其他添加劑包括但不限於表面活性劑、人血漿蛋白粉及還原劑(例如，N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇)。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20、Optimizer、並含有胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，且可不含血清，或可 添加有適量血清(或血漿)、或一預設的激素群，及/或足使免疫細胞生長及擴增的細胞因子。抗生素(例如，青黴素及鏈黴素)僅在實驗培養中添加，而不包括在欲輸注至個體中之細胞培養物中。目標細胞被維持在支持生長所需之條件下，例如適宜溫度(例如，37℃)及氣體環境(例如，添加5% CO2的空氣)。
用於培養免疫細胞的培養基可以包括可共刺激免疫細胞的試劑。舉例而言，可以刺激CD3的試劑是抗-CD3的抗體，可以刺激CD28的試劑是抗-CD28的抗體。經由本文公開的數據所證明，藉由本發明公開的方法所分離的細胞可以擴增約10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、7000倍、8000倍、9000倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍、10,000,000倍或更大。在一個實施例中，培養經過電穿孔處理的群體，免疫細胞擴增約20倍至約50倍，或更多。在一個實施例中，人類T調節細胞的擴增係藉由披載有抗CD3抗體的KT64.86人工抗原呈現細胞(aAPC)來進行。用於擴增活化免疫細胞的方法可以在美國專利號7,754,482、8,722,400和9,555,105中找到，此些文獻的整體內容以引用方式而納入本文。
在一個實施例中，擴增免疫細胞的方法可以進一步包括分離經擴增的免疫細胞，以供進一步應用。在另一個實施例中，擴增方法可以進一步包括將擴增過免疫細胞進行後續的電穿孔，然後進行培養。後續的電穿孔可以包括將編碼有介質的核酸導入到擴增的免疫細胞群中，例如，轉導擴增的免疫細胞、轉染擴增的免疫細胞、或以電穿孔的方式將核酸導入擴增的免疫細胞，其中所述介質會進一步刺激免疫細胞。試劑可以刺激免疫細胞，例如藉由刺激其進一步的擴增、效用功能或另一種免疫細胞功能。
治療方法
本發明所述的經修飾免疫細胞(例如，調節性T細胞)可以含括在用於免疫治療(特別是抑制免疫療法)的組合物中。該組合物可以包括藥物組合物並且還包括醫藥上可接受的載體。包括有經修飾免疫細 胞的藥物組合物，可以一治療有效量的方式進行投與。
在一個方面，本發明包括用於過繼性細胞轉移療法的方法，其包括將本發明的修飾免疫細胞投與至需要的個體(例如，調節性T細胞)。另一方面，本發明包括治療個體疾病或病症的方法，其包括將經修飾免疫細胞群體投與至有需要的個體。
在一個實施例中，治療有需要的個體中之疾病或病症的方法包括，將有效治療量的經修飾Treg投與至該個體，該經修飾Treg包括標的嵌合抗原受體(例如，HLA-A2嵌合抗原受體)。在一個實施例中，治療有需要的個體中之疾病或病症的方法包括，將治療有效量的經修飾Treg投與至該個體，該經修飾Treg包括標的嵌合抗原受體(例如，HLA-A2嵌合抗原受體)，其中該標的嵌合抗原受體包括可與HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68結合的抗原結合結構域。在一個實施例中，HLA-A2特異性嵌合抗原受體包括CD8信號肽、HLA-A2 VH結構域、間隔區序列、HLA-A2 VL結構域、CD8鉸鏈區、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域及CD3ζ細胞內結構域。
本發明的HLA-A2嵌合抗原受體能夠將免疫細胞(例如，調節性T細胞)重定向至表現HLA-A2同種異體抗原的目標。如此一來，本發明的標的嵌合抗原受體是同種異體特異性的嵌合抗原受體。表現有本發明的HLA-A2嵌合抗原受體的調節性T細胞，當藉由與HLA-A2結合而發生活化時，調節性T細胞會被誘發而進行增殖，且其抑制功能也會增強。
當投與包含有本發明的標的嵌合抗原受體的經修飾免疫細胞時，可使移植的組織免受排斥。在一個實施例中，包含有本發明標的嵌合抗原受體的經修飾免疫細胞(例如，包括HLA-A2嵌合抗原受體的Treg)可介導HLA-A2特異性的免疫抑制。在一個實施例中，包含有本發明的標的嵌合抗原受體的經修飾免疫細胞(例如，包括HLA-A2嵌合抗原受體的Treg)可以抑制T細胞增殖以響應同種異體抗原(例如HLA-A2抗原)。在一些實施例中，在細胞、組織和/或器官移植後，HLA-A2可以普遍表現於移植的細胞、組織和/或器官中。在這種情況下，可能有相當多的免疫細胞會浸潤至移植的細胞、組織和/或器官中，導致移植的細胞、組織和/或器官 被破壞。因此，在一些實施例中，包含有本發明的標的嵌合抗原受體的經修飾免疫細胞(例如，包括HLA-A2嵌合抗原受體的Treg)能夠降低免疫細胞的浸潤情況，從而使移植的細胞、組織和/或器官免受破壞。在一些情況下，移植的細胞、組織和/或器官可能會介導毒性。因此，在一些實施例中，包含有本發明標的嵌合抗原受體的經修飾免疫細胞(例如，包括HLA-A2嵌合抗原受體的Treg)能夠減少移植的細胞，組織和/或器官所介導的毒性。
因此，本發明提供了用於在有需要的個體中實現預防性治療效果的方法，和/或在有需要的個體(例如，正在經歷和/或患有同種異體反應或自體免疫反應的人)中實現免疫抑制效果的方法。在一些實施例中，在有需要的個體中實現預防性治療效果的方法，和/或在具有同種異體反應或自身免疫反應而有需要的個體中實現免疫抑制作用的方法，係包括將包含有本發明的標的嵌合抗原受體的修飾免疫細胞投與至該個體。在一個實施例中，本發明提供了在具有同種異體反應或自身免疫反應之有需要的個體中實現免疫抑制作用的方法，其係包括將包含有對HLA-A2具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)之經修飾調節性T細胞投與至該個體，其中嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域、CD8鉸鏈結構域、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域和CD3ζ細胞內結構域。在一個實施例中，本發明提供了在有需要的個體中實現預防性治療效果的方法，其包括將包含有對HLA-A2具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)的修飾的調節性T細胞投與至該個體，其中嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域、CD8鉸鏈結構域、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域和CD3ζ細胞內結構域。
第1型糖尿病是T細胞所介導的自身免疫性疾病，其會導致胰島β細胞被破壞、低胰島素血症和葡萄糖體內平衡的嚴重改變。調節性T細胞(Tregs)的失效可能在第1型糖尿病的發展中扮演重要角色。在免疫體內平衡時，調節性T細胞會抵消自身反應性之作用T細胞的作用，從而參與周邊耐受性。因此，作用T細胞和調節性T細胞之間之不平衡，可能會破壞周邊耐受性，導致第1型糖尿病之發展。在一些實施例中，包含有本發明標的嵌合抗原受體的經修飾免疫細胞(例如，包括HLA-A2嵌合抗原受體的Treg)，能夠抑制T細胞所介導的自身免疫疾病(例如，第1 型糖尿病)。因此，本發明提供了對有需要個體治療其糖尿病的方法，包括將包含有本發明的標的嵌合抗原受體的經修飾免疫細胞投與至該個體。在一些實施例中，其係提供了對有需要的個體治療其糖尿病的方法，該方法包括將包含有對HLA-A2具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)之經修飾調節性T細胞投與至該個體，其中該嵌合抗原受體包括HLA-A2結合結構域、CD8鉸鏈結構域、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域和CD3ζ細胞內結構域。在一些實施例中，糖尿病是第I型糖尿病。
在某些實施例中，嵌合抗原受體由SEQ ID NO：24之核酸序列所編碼。在某些實施例中，嵌合抗原受體包括SEQ ID NO：23之胺基酸序列。
在某些實施例中，經修飾的免疫細胞是經修飾的調節性T細胞(Treg)。在一些實施例中，經修飾的免疫細胞是自體細胞。在一些實施例中，經修飾的免疫細胞(例如，經修飾的調節性T細胞)源自於人類。
嵌合抗原受體可將T調節細胞重定向至表現HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68之組織，從而增強對移植組織的保護而免受排斥。包含有編碼HLA-A2特異性之核酸的T細胞，可在組織移植之前、之時或之後投與至於該個體。
本發明的方法應該被解釋為包括對任何類型的移植器官、組織或細胞可保護其免於排斥，包括但不限於肺、心臟、心臟瓣膜、皮膚、肝臟、手、腎臟、胰腺、腸、胃、胸腺、骨骼、肌腱、角膜、睾丸、神經、靜脈、血液、骨髓、幹細胞、朗格漢斯細胞胰島(islets of Langerhans cells)和造血細胞。本發明的方法還包括針對移植物抗宿主病(GVHD)之保護。
在某些實施例中，除了嵌合抗原受體之外，還可以給予個體次級治療，例如免疫抑制藥物。免疫抑制藥物的例子包括但不限於潑尼松(prednisone)、硫唑嘌呤(azathioprine)、他克莫司(tacrolimus)和環孢菌素A(cyclosporine A)。
醫藥組合物
本發明之醫藥組合物可包括如本發明所述之經修飾免疫細胞與一或多種醫藥上或生理上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑之組合。該 等組合物可包括緩衝液(例如，中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及類似物)；碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇)；蛋白質；多肽或胺基酸(例如，甘胺酸)；抗氧化劑；螯合劑(例如，EDTA或麩胱甘肽)；佐劑(例如，氫氧化鋁)；及防腐劑。本發明的組合物較佳係經調配以供靜脈內投與。
本發明之醫藥組合物可以以適用於欲治療(或預防)疾病之方式投與。投與量及投與頻率將由例如患者之病況以及患者疾病的類型及嚴重程度等因素來確定，但適宜劑量可藉由臨床試驗來確定。
待投與的本發明細胞，對於進行治療的個體來說，可以是自體細胞、同種異體細胞、或異種細胞。
本發明的細胞可以以適宜的臨床前和臨床實驗和試驗中確定的劑量和途徑和時間來投與。細胞組合物可以以這些範圍內的劑量多次投與。本發明細胞的投與，可與其他本領域技術人員所確定適用於治療所欲疾病或病症的方法進行組合。
本文還提供了免疫細胞群體，及含有這些細胞且/或富集有這些細胞的組合物。舉例來說，表現重組受體的細胞占組合物內總細胞數的比例為，或占某特定類型的細胞(如調節性T細胞)的比例為，至少50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，或更多。這些組合物中包含適用於投與的醫藥組合物和調配物，例如用於過繼性細胞療法。本文還提供了將細胞和組合物投與至個體(例如患者)的治療方法。
本文還提供了包括用於投與之細胞的組合物，其包括醫藥組合物和調配物，例如單位劑量形式的組合物，其包括於給定劑量或其部分中所投與的細胞數量。醫藥組合物和調配物通常包括一種或多種可選的醫藥上可接受的載體或賦形劑。在一些實施例中，組合物包括至少一種額外的治療試劑。
術語「醫藥調配物」係指一種調配物，其所呈形式允許所含活性成分之生物活性得以有效發揮，且不含有會對其所投與之個體產生不可接受毒性之其他成分。「醫藥上可接受之載體」是指藥物調配物中除活性 成分之外對個體無毒的成分。醫藥上可接受之載體包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。在某些情況下，載體的選擇在某種程度上由特定細胞和/或投與方式決定。因此，有多種調配物係適合用於本發明。舉例而言，醫藥組合物可含有防腐劑。合適之防腐劑可以包括，舉例而言，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉和苯扎氯銨。在某些情況下，使用兩種或更多種防腐劑之混合物。防腐劑或其混合物通常佔總組合物重量之約0.0001%至約2%之重量。載體由例如Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.Ed.(1980)中所描述。醫藥上可接受之載體通常在採用之劑量和濃度下對接受體無毒，且包括但不限於：緩衝劑(例如，磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機酸)、抗氧化劑(包括抗壞血酸和甲硫胺酸)、防腐劑(例如，十八烷基二甲基芐基氯化銨、六甲雙銨氯化物、苯扎氯銨、芐索氯銨、苯酚、丁基或苯甲醇、對羥基苯甲酸烷基酯-例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇，和間甲酚)、低分子量(少於約10個殘基)多肽、蛋白質(例如，血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、親水聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)、胺基酸(例如，甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸)、單醣、雙糖和其他碳水化合物(包括葡萄糖、甘露糖或糊精)、螯合劑(例如，EDTA)、糖類(例如，蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇)、成鹽相對離子(例如，鈉)、金屬錯合物(例如，鋅-蛋白質錯合物)，和/或非離子表面活性劑(例如，聚乙二醇(PEG))。
在某些情況下，組合物中包括緩衝劑。適合的緩衝劑包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀，和其它各種酸和鹽。在某些情況下，本文會使用兩種或更多種緩衝劑之混合物。緩衝劑或其混合物的重量通常佔組合物總重量的約0.001%至約4%。製備可投與醫藥組合物的方法為已知的。示例性方法係更仔細地描述於例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Lippincott Williams & Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
調配物可以包括水溶液。調配物或組合物亦可以含有多於一種適用以細胞治療的特定適應症、疾病或病症的活性成分；較佳係具有與 細胞活性互補的活性成分，且其個別活性不會對彼此造成不良影響。這些活性成分適合以對預期目的有效之量組合存在。因此，在一些實施例中，醫藥組合物進一步包括其它醫藥活性劑或藥物，例如化學治療劑(例如，天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、阿黴素、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲胺喋呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春鹼、和/或長春新鹼)。在一些實施例中，醫藥組合物含有可有效治療或預防疾病或病症的細胞量(例如治療有效量或預防有效量)。一些實施例中的治療或預防功效係藉由定期分析經治療個體來監測。所需劑量可以藉由單次推注(bolus)投與細胞、藉由多次推注投與細胞、或藉由連續輸注投與細胞來遞送。
調配物包括用於經口服、靜脈內、腹膜內、皮下、肺、經皮、肌肉內、鼻內、口腔、舌下或栓劑投與之彼等調配物。在一些實施例中，其係非經腸胃來投與細胞群體。如本文所用之術語「非經腸胃」包括經靜脈內、肌肉內、皮下，直腸，陰道和腹膜內投藥。在一些實施例中，細胞係以周邊全身性遞送的方式，藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射，向個體投與。在一些實施例中，組合物以無菌液體製劑形式提供，例如等張性水溶液、懸浮液、乳液、分散液或黏性組合物，在某些方面其可以緩衝至所選擇的pH值。液體製劑通常比凝膠、其他黏性組合物和固體組合物更容易製備。另外，液體組合物在某些程度上更便於投與，特別是藉由注射。另一方面，黏性組合物可以在適當黏度範圍內進行調配，使其能與特定組織接觸的更久。液體或黏性組合物可包括載劑，載劑可為溶劑或分散介質，其包括例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)，及前述載劑的適當混合物。
無菌的注射溶液可藉由將細胞併入溶劑來製備，例如與適合載劑、稀釋劑或賦形劑(例如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖或其類似物)混合。根據給藥途徑和所需製劑，組合物可含有輔助物質，例如濕潤劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、pH緩衝劑、膠凝或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑、顏料及類似物。在某些情況下，可查詢標準文本以製備適合製劑。
在本文的組合物中可添加增強組合物之穩定性及無菌性的 各種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸)可用來確保防止微生物之作用。延長可注射醫藥形式之吸收，可藉由使用延遲吸收劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)來實現。
一般來說，用於活體內投與的調配物係為無菌。無菌性可藉由例如經由無菌過濾膜過濾來輕易地實現。
通常可陳述的是，包含有本文所述經修飾細胞的醫藥組合物可以104至109個細胞/公斤體重，在一些情況下105至106個細胞/公斤體重(包括彼等範圍內之所有整數值)之劑量來進行投與。免疫細胞組合物亦可以該等劑量投與多次。該等細胞可藉由免疫療法中一般已知的輸注技術來進行投與(參見例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。藉由監測患者的疾病跡象並相應地調整治療，醫學領域的技術人員可輕易地決定對於特定患者的最佳劑量和治療方案。
本發明的經修飾免疫細胞的投與可以任何本領域技術人員已知的方便方式來進行。本發明的細胞可藉由氣霧吸入、注射、攝取、輸注、植入或移植的方式投與個體。本文所述的組合物可以經動脈、皮下、皮內、瘤內、結節內、髓內、肌內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內的方式投與。在其他情況下，本發明的細胞係直接注射到個體中的炎症部位、個體中的局部疾病部位、淋巴結、器官、腫瘤等。
應該理解，適用於本發明的方法和組合物並不限於實施例中提出的特定製劑。本文所提出之以下實施例，係對本領域普通技術人員提供關於如何製造及使用本發明的細胞、擴增和培養方法以及治療方法的完整揭露和說明，其並非旨在限制發明人認為何者是其發明的範圍。
除非另有說明，否則在實踐本發明時，可採用熟習此項技術者所習知的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學的習知技術。此等技術全面地闡述於例如下列文獻中：“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”,fourth edition(Sambrook,2012)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Culture of Animal Cells”(Freshney,2010)；“Methods in Enzymology”“Handbook of Experimental Immunology”(Weir,1997)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller and Calos,1987)；“Short Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,2002)；“Polymerase Chain Reaction：Principles,Applications and Troubleshooting”,(Babar,2011)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,2002)。這些技術可應用於生產本發明的多核苷酸和多肽，且因此可以考慮製造和實踐本發明。以下部分將討論特別適用於特定實施例所的技術。
本文提及或引用的文章、專利和專利申請以及所有其他文獻和電子可用資訊的整體內容以引用方式納入本文，其程度如同每個單獨的公開文獻被具體地且單獨地指明為以引用方式納入本文。申請人保留將任何此類文章、專利、專利申請或其他實體文獻和電子文獻中任何和所有材料與資訊實際併入本申請的權利。
儘管已參考本發明之具體實施例所描述的本發明，但是本領域技術人員應該明瞭，在不脫離本發明的真實精神和範圍的情況下，可以進行各種更動且可以替換等效物。對於本領域技術人員來說顯而易見的是，在不脫離本文所公開的實施例所涵蓋的範圍下，可使用適合的等效物對本文所描述的方法進行其他適合的修改及改變。另外，可進行許多修改以適應本發明之目標、精神和範圍的特定情況、材料、物質之組成、程序、程序步驟或步驟。所有此些修改旨在包括在所附申請專利範圍的範圍內。目前已詳細描述了某些實施例，通過參考以下實例將更清楚地理解這些實施例，且這些實例僅是為了說明的目的而被涵蓋而不是限制。
實驗例
以下實施例用於描述本發明，這些實驗例僅用於說明而非對本發明造成限制，本發明涵蓋由本文提供的教示以及顯而易見的所有變化。
以下描述這些實驗中使用的材料和方法。
3PF12抗體係源自：Watkins等人，The isolation and characterization of human monoclonal HLA-A2 antibodies from an immune V gene phage display library.(2000).doi：10.1034/j.1399-0039.2000.550305.。
HLA-A2特異性嵌合抗原受體核苷酸序列：(SEQ ID NO： 24)
HLA-A2特異性嵌合抗原受體胺基酸序列：(SEQ ID NO：23)
以下描述這些實驗之結果。
本發明產生了HLA-A2特異性嵌合抗原受體(CAR)。HLA-A2特異性嵌合抗原受體包括可與HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68結合的抗原結合結構域。當在嵌合抗原受體在人類調節細胞(Tregs)上表現時，所述嵌合抗原受體可以介導抗原特異性抑制。此新型嵌合抗原受體可將Treg重新定向至表現HLA-A2、HLA-A28和/或HLA-A68之組織並介導耐受性。
在一個實施例中，嵌合抗原受體包括胞外結構域，其包括CD8信號肽、HLA-A2 VH結構域、柔性G-S間隔序列、HLA-A2VL結構域、CD8鉸鏈區、CD28跨膜/細胞內結構域和CD3ζ結構域(圖1)。在另一個實施例中，嵌合抗原受體由SEQ ID NO：24之核苷酸序列編碼。在又一個實施例中，嵌合抗原受體包括SEQ ID NO：23之胺基酸序列。嵌合抗原受 體係由3PF12 scFv之主要胺基酸序列所組裝，其細節請見Watkins等人(2000)doi：10.1034/j.1399-0039.2000.550305。重鏈和輕鏈藉由柔性的G-S連接子分開，並放入慢病毒載體pTRPE中。該載體含有：用來嵌合抗原受體引導至細胞表面之CD8信號肽、為嵌合抗原受體可撓性考量的CD8鉸鏈區、及用於訊息傳遞的CD28跨膜/細胞內結構域及CD3 ζ結構域。
本發明的嵌合抗原受體與MacDonald等人，(J Clin Invest.2016；126(4)：1413-142；以及J Immunol May 1,2016,196(1 Supplement)140.6)所提出的嵌合抗原受體不同，此些文獻的嵌合抗原受體係源自BB7.2雜交瘤而不是3PF12，且其在在scFv結構域之後含有myc標籤，並缺少CD8鉸鏈結構域。同樣地，與本發明的嵌合抗原受體相比較，來自Boardman等人(American Journal of Transplantation.2016 Dec 1])的嵌合抗原受體係源自於Watkins等人，((2000)doi：10.1034/j.1399-0039.2000.550305)中的3PB2序列，而不是3PF12序列，且其在scFv結構域之後含有myc標籤，並缺少CD8鉸鏈結構域，且在訊號結構域後含有eGFP。
實驗例1：HLA-A2特異性T細胞
首先，將正常提供者的分離術產物與RosetteSep試劑在室溫培育20分鐘，以分離出人類CD8+ T細胞，隨後在Lymphoprep的上方疊加細胞，並在室溫下以400xg轉速離心40分鐘。接著將細胞用OPTI-MEM減少血清的培養液(Thermo Fisher Scientific)洗滌三次，並以100x106細胞/毫升的密度再懸浮於OPTI-MEM培養液中，與10μg體外轉錄的3PF12-28z RNA混合，並用BTX800(Harvard Apparatus BTX)，以500V電壓、時間持續700微秒、且在0.2公分的電穿孔比色管進行電穿孔。再根據製造商的說明書以mMessage mMachine T7轉錄試劑盒(ThermoFisher Scientific)進行體外RNA轉錄，並用RNeasy MinElute Clean Up Kit進行清理。細胞先在37℃、5% CO2之培育箱中培育16小時，再用抗-生物素(長間隔)AffiniPure山羊抗-人類IgG,F(ab')2片段特異性抗體在冰上染細胞30分鐘，隨後以PBS洗滌三次，且用PBS稀釋的1μL Streptavidin-PE及1μL抗-人類CD8-APC-H7(BD Biosciences)培育另外30分鐘。將細胞以2%多聚甲醛固定，並以LSRII流式細胞儀(BD Biosciences)(圖2)進行分析。以3PF12-28z RNA電穿孔之細胞，在細胞表面顯示有可偵測的嵌合抗原受體表現。
將如同圖2方式進行電穿孔之細胞，在GolgiPlug蛋白運輸抑制劑(BD Biosciences)存在的情況下，以3：1之比例，與經解凍且不同HLA單倍型的同種異體人類捐贈者的PBMCs，於37℃/5% CO2之培養箱中混合6小時。接著藉由使細胞與100μL之固定培養基A(ThermoFisher Scientific)在室溫下培育30分鐘來固定及透化(permeabilize)細胞，接著洗滌細胞，並用稀釋於100μL固定液B(ThermoFisher Scientific)的α-IL-2-APC抗體(3μL)及α-TNF-α-PE-Cy7抗體(2μL)(均購自BD Biosciences)對細胞進行染色。接著以PBS洗滌細胞，再以LSR II流式細胞儀進行分析(圖3)。嵌合抗原受體+CD8+T細胞被目標PBMCs表面上的HLA-A2及HLA-A68分子所活化，造成IL-2及TNF-α之產生。相較之下，嵌合抗原受體+CD8+ T細胞並沒有被來自三個不同HLA-A2-及HLA-A68-捐贈者的PBMCs所活化，證明了嵌合抗原受體對特定，但非所有的，HLA分子具有特異性。
實施例2：HLA-A2特異性調節性T細胞
首先，藉由將人類臍帶血與CD4+ RosetteSep試劑(幹細胞)培育，以從人類捐贈者的臍帶血中分離出調節性T細胞細胞，隨後在Lymphoprep的上方疊加細胞，並以400xg轉速離心30分鐘，接著進行CD25正向磁篩選(StemCell Technologies)。以α-CD3/α-CD28珠子來刺激調節性T細胞細胞，並將細胞培養於含有1倍GlutaMAX及300IU/毫升IL-2且帶有5%人類AB血清(Invitrogen)的XVIVO15培養液中，並將其放置在37℃、5% CO2的培養箱中。在初次刺激48小時之後，將調節性T細胞細胞以慢病毒轉導，以表現3PF12-28z嵌合抗原受體或一不相關的嵌合抗原受體。在第四天將α-CD3/α-CD28珠子移除，並且在第4、6、9和12天以上述完整的XVIVO15培養液餵養細胞，而IL-2係以假設消耗需求來替換。當細胞在第14天靜息時，洗滌Tregs三次來去除IL-2，並將它們與已經進行RNA電穿孔以表達有SL9 WT TCR的同種異體T細胞(已用2.5μM之CFSE標記16小時)、以及轉基因表達有HLA-A2和SL9抗原的K562細胞，以8：1：0.5的比例(Teff：Treg：K562細胞)進行混合。為了探測非 特異性抑制功能，將調節性T細胞與CFSE標記的PBMCs及α-CD3刺激珠子(Gibco)以8：1：3的比例(Teff：Treg：珠子)進行混合。在37℃、5% CO2培養箱培育5天後，用稀釋於100μL PBS的CD8-APC-H7抗體(1μL及CD4-BV421抗體(0.5μL)在攝氏4度下對細胞進行15分鐘的染色，接著洗滌細胞，並且將其再懸浮於2% PFA中以進行固定。細胞接著以LSR II流式細胞儀進行分析(圖4)。在沒有任何其他干擾的情況下，標記CFSE的目標細胞，將因為SL9 WT TCR及由K562細胞上的I型MHC所呈現的SL9肽兩者的交互作用而分裂，導致CFSE信號的淡化。將HLA-A2+嵌合抗原受體Treg與目標細胞共培養，會抑制細胞的分裂情況，其如CFSE信號(藍色)的淡化程度降低所顯示。相反地，當CFSE目標細胞與不相關的嵌合抗原受體Tregs(綠色)或非Treg CD4+ T細胞(紅色)共同培養時，CFSE目標細胞呈現高度增殖。為了顯示兩組Tregs均具有相同的抑制潛力，圖4的右圖顯示，在藉由α-CD3刺激珠子對共培養中的Tregs及經CFSE標記的PBMCs進行多株刺激時，與不相關的(綠色)和與HLA-A2+(藍色)的嵌合抗原受體Tregs共同培養的CFSE目標細胞皆同樣地被抑制且受抑制程度相同，且其受抑制程度比與非Treg CD4+細胞(紅色)共同培養時來得更高。
實施例3：HLA-A2特異性T細胞會鎖定HLA-A2+胰島組織
將來自人類捐贈者的HLA-A2+胰島移植到NSG小鼠的左腎囊下。三天後，靜脈注射攜帶有3PF12-28z或不相關的CD19-28z嵌合抗原受體的轉導T細胞(10×106個，經慢病毒轉導)。以未轉導的T細胞作為陰性對照組。定期收集小鼠的尿液樣本並將其儲存-80℃下，直到以ELISA來分析人類c肽含量(圖5)。如圖5所示，攜帶有3PF12-28z嵌合抗原受體的轉導T細胞能降低人類C肽含量，代表攜帶有3PF12-28z嵌合抗原受體的轉導T細胞會鎖定經移植的HLA-A2+胰島。
實施例4：以HLA-A2特異性T細胞來治療第一型糖尿病的過繼性免疫療法
第1型糖尿病是由T細胞所介導的自身免疫性疾病，會導 致胰島β細胞被破壞、低胰島素血症和葡萄糖體內平衡的嚴重改變。調節性T細胞(Tregs)的失效可能在第1型糖尿病的發展中扮演重要角色。在免疫體內平衡時，Treg會抵消自身反應性之作用T細胞的效果，從而參與周邊耐受性。因此，作用T細胞和Treg之間的不平衡，可能會破壞周邊耐受性，導致第1型糖尿病的發展。
將自體Treg係從一個體中分離出來，並在體外進行刺激及擴增。以慢病毒轉導HLA-A2嵌合抗原受體至Treg，以產生HLA-A2特異性之Treg。將HLA-A2特異性之Treg(例如，實驗例2所產生的那些細胞，即3PF12-28z嵌合抗原受體轉導的Treg)投與於具有第一型糖尿病之個體。
其他實施例
本文的變量之任何定義中的元件列表的敘述包括將該變量定義為任何所列元件的單一元件或組合(或子組合)。本文實施例的敘述包括作為任何單一實施例或與任何其他實施例或其部分的組合。
本文揭露的每個專利、專利申請和公開文獻，在此藉由引用併入本文。雖然已經參照具體實施例揭露本發明，但顯而易見的是，本領域的其他技術人員可以在不脫離本發明的真實精神和範疇的情況下設計出本發明的其他實施例和變型。所附權利要求旨在被解釋為包括所有這些實施例和等同之變型。
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)
<400> 1
<210> 2
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)
<400> 2
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)重鏈(HC)變異區
<400> 3
<210> 4
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)重鏈(HC)變異區
<400> 4
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)重鏈CDR1
<400> 5
<210> 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)重鏈CDR2
<400> 6
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)重鏈CDR3
<400> 7
<210> 8
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)輕鏈(LC)變異區
<400> 8
<210> 9
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)輕鏈變異區
<400> 9
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)輕鏈CDR1
<400> 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)輕鏈CDR2
<400> 11
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2單鏈抗體(scFv)輕鏈CDR3
<400> 12
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8信號肽
<400> 13
<210> 14
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8信號肽
<400> 14
<210> 15
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8鉸鏈
<400> 15
<210> 16
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8鉸鏈
<400> 16
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<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜域結構域
<400> 17
<210> 18
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28跨膜域結構域
<400> 18
<210> 19
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28細胞內域結構域
<400> 19
<210> 20
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28細胞內域結構域
<400> 20
<210> 21
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ結構域
<400> 21
<210> 22
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ結構域
<400> 22
<210> 23
<211> 497
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2嵌合抗原受體
<400> 23
<210> 24
<211> 1491
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HLA-A2嵌合抗原受體
<400> 24
<210> 25
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> 重複n次。n是至少為1的整數。
<400> 25
<210> 26
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(4)
<223> 重複n次。n是至少為1的整數。
<400> 26
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<220>
<221> REPEAT
<222> (1)..(5)
<223> 重複n次。n是至少為1的整數。
<400> 27
<210> 28
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 28
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 29
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 30
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 31
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 32
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 33
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 34
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 35
<210> 36
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 連接子
<400> 36
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 37
<210> 38
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 38
<210> 39
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 39
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 40
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 41
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 42
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 43
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 44
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 45
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 46
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 47
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 鉸鏈
<400> 48

Claims (50)

  1. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體(CAR)，其中該嵌合抗原受體包括一CD8信號肽、一HLA-A2結合結構域以及一CD8鉸鏈結構域。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的經修飾的細胞，其中該HLA-A2結合區係選自於由抗體、抗體結合區(Fab)片段或單鏈變異區片段(scFv)所組成之群組。
  3. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該HLA-A2結合結構域包括一重鏈變異區(heavy chain variable region)，該重鏈變異區包括SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列。
  4. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該HLA-A2結合區包括一輕鏈變異區(light chain variable region)，該輕鏈變異區包括SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列。
  5. 如申請專利範圍第3或4項任一項所述的經修飾的細胞，其中該HLA-A2結合結構域包括一間隔序列。
  6. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該HLA-A2結合結構域包括SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列。
  7. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該嵌合抗原受體包括一跨膜結構域以及一細胞內結構域。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的經修飾的細胞，其中該跨膜區包括一CD28跨膜結構域。
  9. 如申請專利範圍第7或8項任一項所述的經修飾的細胞，其中該跨膜結構域包括SEQ ID NO：17所示之胺基酸序列。
  10. 如申請專利範圍第7至9項任一項所述的經修飾的細胞，其中該細胞內區包括一CD28細胞內結構域以及一CD3ζ細胞內結構域。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的經修飾的細胞，其中該CD28細胞內結構域包括SEQ ID NO：19所示之胺基酸序列。
  12. 如申請專利範圍第10或11項任一項所述的經修飾的細胞，其中該CD3ζ細胞內結構域包括SEQ ID NO：21所示之胺基酸序列。
  13. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該CD8鉸鏈包括SEQ ID NO：15所示之胺基酸序列。
  14. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該CD8信號肽包括SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列。
  15. 一種經修飾的免疫細胞或其前驅細胞，包括對HLA-A2具有親和力的嵌合抗原受體(CAR)，其中該嵌合抗原受體包括一CD8信號肽、HLA-A2結合結構域、一CD8鉸鏈結構域、一CD28跨膜結構域、一CD28共刺激結構域(costimulatory domain)以及一CD3ζ細胞內結構域。
  16. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該嵌合抗原受體包括SEQ ID NO：23所示之胺基酸序列。
  17. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該HLA-A2結合結構域與HLA-A28交叉反應。
  18. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該HLA-A2結合結構域與HLA-A68交叉反應。
  19. 如申請專利範圍第1至18項任一項所述的經修飾的細胞，其中該經修飾的細胞為一經修飾的調節性T細胞。
  20. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該經修飾的細胞為一自體細胞。
  21. 如前述申請專利範圍任一項所述的經修飾的細胞，其中該經修飾的細胞為源自於一人類。
  22. 一種經分離的核酸，包括一核酸序列，該核酸序列編碼對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體(CAR)，其中該嵌合抗原受體包括一CD8信號肽、一HLA-A2結合結構域、以及一CD8鉸鏈結構域。
  23. 如申請專利範圍第22項所述的經分離的核酸，其中該嵌合抗原受體包括一CD28跨膜結構域。
  24. 如申請專利範圍第22或23項任一項所述的經分離的核酸，其中該嵌合抗原受體包括一CD28共刺激結構域。
  25. 如申請專利範圍第22至24項任一項所述的經分離的核酸，其中該嵌 合抗原受體包括一CD3ζ細胞內結構域。
  26. 如申請專利範圍第22至25項任一項所述的經分離的核酸，包括SEQ ID NO：24所示之胺基酸序列。
  27. 一種表現構築體，包括如申請專利範圍第22至26項任一項所述的經分離的核酸。
  28. 如申請專利範圍第27項所述的表現構築體，其中該表現構築體包括一EF-1α啟動子。
  29. 如申請專利範圍第27或28項任一項所述的表現構築體，其中該表現構築體包括一rev反應元件(RRE)。
  30. 如申請專利範圍第27至29項任一項所述的表現構築體，其中該表現構築體包括一土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件(WPRE)。
  31. 如申請專利範圍第27至30項任一項所述的表現構築體，其中該表現構築體包括一cPPT序列。
  32. 如申請專利範圍第27至31項任一項所述的表現構築體，其中該表現構築體包括一EF-1α啟動子、一rev反應元件、一土撥鼠肝炎病毒轉錄後調節元件、以及一cPPT序列。
  33. 如申請專利範圍第27至32項任一項所述的表現構築體，其中該表現構築體為一病毒載體，該病毒載體係選自於由反轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體以及腺相關病毒載體所組成之群組。
  34. 如申請專利範圍第27至33項任一項所述的表現構築體，其中該表現構築體為一腺病毒載體。
  35. 如申請專利範圍第34項所述的表現構築體，其中該腺病毒載體為一自我抑制的腺病毒載體。
  36. 一種產生如申請專利範圍第1至21項任一項所述的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞的方法，該方法包括將如申請專利範圍第22至26項任一項所述的核酸或如申請專利範圍第27至35項任一項所述的表現構築體引入該免疫細胞。
  37. 一種用於在有需要的一個體中實現一免疫抑制效用的方法，包括將一有效量的如申請專利範圍第1至21任一項所述的經修飾的免疫細胞或 其前驅細胞投與至該個體。
  38. 如申請專利範圍第37項所述的方法，其中該個體患有一同種異體反應(alloresponse)及/或一自體免疫反應。
  39. 一種用於在有需要的一個體中實現一預防性治療效用的方法，包括在一同種異體反應或一自體免疫反應開始之前將一有效量的如申請專利範圍第1至21任一項所述的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞投與至該個體。
  40. 一種用於在具有一同種異體反應或一自體免疫反應且有需要的一個體中實現一免疫抑制作用的方法，該方法包括將一經修飾的調節性T細胞投與至該個體，該經修飾的調節性T細胞包括對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體，其中該嵌合抗原受體包括一CD8信號肽、一HLA-A2結合結構域、一CD8鉸鏈結構域、一CD28跨膜結構域、一CD28共刺激結構域以及一CD3ζ細胞內結構域。
  41. 如申請專利範圍第37至40項任一項所述的方法，其中該同種異體反應或該自體免疫反應在組織移植後發生，且其中該方法阻止、阻斷或抑制該個體中的移植體抗宿主疾病(graft-vs-host-disease)。
  42. 如申請專利範圍第37至41項任一項所述的方法，其中該經修飾的細胞為一經修飾的調節性T細胞。
  43. 如申請專利範圍第37至42項任一項所述的方法，其中該經修飾的細胞為一自體細胞。
  44. 如申請專利範圍第37至43項任一項所述的方法，其中該經修飾的細胞為源自於一人類。
  45. 一種在有需要的一個體中治療糖尿病的方法，包括將一有效量的如申請專利範圍第1至21任一項所述的經修飾的免疫細胞或其前驅細胞投與至該個體。
  46. 一種在有需要的一個體中治療糖尿病的方法，包括將一經修飾的調節性T細胞投與至該個體，該經修飾的調節性T細胞包括對HLA-A2具有親和力的一嵌合抗原受體，其中該嵌合抗原受體包括一CD8信號肽、一HLA-A2結合結構域、一CD8鉸鏈結構域、一CD28跨膜結構 域、一CD28共刺激結構域以及一CD3ζ細胞內結構域。
  47. 如申請專利範圍第45至46項任一項所述的方法，其中該糖尿病為第一型糖尿病。
  48. 如申請專利範圍第45至47項任一項所述的方法，其中該經修飾的細胞為一經修飾的調節性T細胞。
  49. 如申請專利範圍第45至48項任一項所述的方法，其中該經修飾的細胞為一自體細胞。
  50. 如申請專利範圍第45至49項任一項所述的方法，其中該經修飾的細胞為源自於一人類。
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