TW201722482A - 包含類鐸(toll-like)受體促效劑之抗體共軛物 - Google Patents
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Abstract
本文提供包含類鐸(toll-like)受體促效劑之抗體共軛物及該等共軛物用於治療癌症之用途。在一些實施例中，該等共軛物包含抗HER2抗體。
Description
本發明提供包含類鐸受體促效劑之抗體共軛物及該等共軛物用於治療癌症之用途。
先天免疫性係抵抗環境損害(包括但不限於病原體，例如細菌或病毒)之快速非特異性免疫反應。適應性免疫性係較慢但更具特異性之免疫反應，其賦予宿主長效或保護性免疫性，且涉及初始T淋巴球分化及活化成CD4+T輔助細胞及/或CD8+細胞毒性T細胞，以促進細胞及體液性免疫性。先天免疫系統之抗原呈遞細胞(例如樹突細胞或巨噬細胞)藉由吞噬及處理外源抗原並將其呈遞至T細胞之細胞表面上從而活化T細胞反應，用作先天與適應性免疫系統之間之關鍵鏈接。
類鐸受體(TLR)係主要在樹突細胞、巨噬細胞、單核球、天然殺傷細胞及T淋巴球上表現之模式識別受體(PRR)。TLR結合至來自細菌、真菌、原生動物及病毒之病原體相關分子模式(PAMP)且用作抵抗侵襲性病原體之第一道防線。TLR活化導致樹突細胞之增加之抗原攝取、成熟及T細胞刺激能力。TLR包含細胞外N末端富含白胺酸之重複(LRR)結構域，之後為富含半胱胺酸之區、跨膜結構域及含有保守區(稱為鐸/IL-1受體(TIR)結構域)
之細胞內(細胞質)尾。LRR結構域對於配體結合及相關信號傳導至關重要且係PRR之共同特徵。TIR結構域在蛋白質-蛋白質相互作用中至關重要且與先天免疫性相關。TLR係誘導參與免疫反應之基因表現所必需的，且在抗原特異性獲得性免疫性之形成中起重要作用。
業內仍需要用於治療疾病(具體而言癌症)之新免疫療法。
本發明提供包含類鐸受體促效劑、其醫藥上可接受之鹽、其醫藥組合物及其組合之抗體共軛物，其可用於治療疾病(具體而言癌症)。本發明進一步提供治療、預防或改善癌症之方法，其包含向有需要之個體投與有效量之本發明之抗體共軛物。本發明亦提供包含TLR7促效劑及連接體之化合物，其可用於共軛至抗HER2抗體且藉此製備本發明之免疫刺激性共軛物。本文闡述本發明之多個實施例。
在本發明之一個態樣中，提供具有式(I)之結構之化合物及其醫藥上可接受之鹽，其係TLR7促效劑：
其中：RD係且RE係H；或RE係且RD係H；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；
L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；R4係
-ONH2、-NH2、、、、、-N3、、-NHC(=O)CH=CH2、-SH、-SR7、-OH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、
-NHC(=O)CH2Br、-NHC(=O)CH2I、-C(O)NHNH2、、-CO2H、-C(O)NHNH2、、、、、
R5係；X1係、、或；X2係、、或；X3係
R6係2-吡啶基或4-吡啶基；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；
每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
在本發明之一個態樣中，提供具有式(I)之結構之化合物及其醫藥上可接受之鹽，其係TLR7促效劑：
其中：RD係且RE係H；或RE係且RD係H；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、
-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；R4係
-ONH2、-NH2、
、、、、-N3、、-NHC(=O)CH=CH2、SH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、-NHC(=O)CH2Br、
-NHC(=O)CH2I、-C(O)NHNH2、、-CO2H、-C(O)NHNH2、
R5係；X1係、、或；X2係、或；X3係、或；R6係2-吡啶基或4-吡啶基；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17及18。
在本發明之一個態樣中，提供具有式(Ia)或式(Ib)之結構之式(I)化合物及其醫藥上可接受之鹽：
其中：R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或
-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R4係、、、、、-ONH2、-NH2、、、、-NHC(=O)CH=CH2、-N3、、SH、-SR7、-OH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、-NHC(=O)CH2Br、-NHC(=O)CH2I、-C(O)NHNH2、或-CO2H；R5係；X1係、、或；X2係、、或；X3係、、、
R6係2-吡啶基或4-吡啶基；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；
每一n皆獨立地選自1、2、3及4；且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
在本發明之一個態樣中，提供具有式(Ia)或式(Ib)之結構之式(I)化合物及其醫藥上可接受之鹽：
其中：R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或
-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R4係、、、、、-ONH2、-NH2、、、、
-NHC(=O)CH=CH2、-N3、、SH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、-NHC(=O)CH2Br、
-NHC(=O)CH2I、-C(O)NHNH2、或-CO2H；
R5係；X1係、、或；X2係、或；X3係、或；R6係2-吡啶基或4-吡啶基；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；
每一n皆獨立地選自1、2、3及4；且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
本發明之另一態樣係具有式(II)之結構之抗體共軛物及其醫藥上可接受之鹽：
其中：R50係或，其中*指示與Ab之附接點；Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、
-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；R40係
、、、、、、-S-、-NHC(=O)CH2-、-S(=O)2CH2CH2-、-(CH2)2S(=O)2CH2CH2-、-NHS(=O)2CH2CH2、-NHC(=O)CH2CH2-、-CH2NHCH2CH2-、-NHCH2CH2-、、、、
X1係、、或；
X2係、、或；
X3係、、、
每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；R12係H、甲基或苯基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
本發明之另一態樣係具有式(II)之結構之抗體共軛物及其醫藥上可接受之鹽：
其中：
R50係或，其中*指示與Ab之附接點；Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；R40係
、、、、、、-S-、-NHC(=O)CH2-、-S(=O)2CH2CH2-、-(CH2)2S(=O)2CH2CH2-、-NHS(=O)2CH2CH2、-NHC(=O)CH2CH2-、CH2NHCH2CH2-、
-NHCH2CH2-、、、、
X1係、、或；X2係、或；
X3係、或；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；R12係H、甲基或苯基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
本發明之一個態樣係具有式(IIa)或式(IIb)之結構之式(II)之抗體共軛物及其醫藥上可接受之鹽：
其中：Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R40係
、、、、、或-S-；
X1係、、或；X2係
X3係、、、
每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
本發明之一個態樣係具有式(IIa)或式(IIb)之結構之式(II)之抗體共軛物及其醫藥上可接受之鹽：
其中：Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；R40係
、、、、、或-S-；
X1係、、或；X2係、或；X3係、或；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
本發明之另一態樣係包括治療有效量之式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物、或其醫藥上可接受之鹽及醫藥上可接受之載劑的醫藥組合物。
本發明之另一態樣係治療HER2陽性癌症之方法，其中該方法包含向需要該治療之個體投與有效量之式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物或其醫藥上可接受之鹽。HER2陽性癌症可為以下中之任一者：胃癌、食道癌、胃食道接合部腺癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、膀胱癌、尿道癌、胰臟癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤、神經胚細胞瘤、神經膠母細胞瘤及頭頸癌。HER2陽性癌症可具有高HER2表現(例如，具有3+ IHC評分)或低HER2表現(例如，具有2+ IHC評分)。
本發明之另一態樣係式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物或其醫藥上可接受之鹽之用途，其用於製造用於治療HER2陽性癌症之藥劑。
本發明之另一態樣係用於醫學治療方法中之抗體共軛物，其中該醫學治療方法係用於治療HER2陽性癌症，且其中抗體共軛物係式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物或其醫藥上可接受之鹽。另外，本發明之又一態樣係在與僅抗HER2抗體相比時，用於抑制HER2陽性癌症持續時段及/或減少HER2陽性癌症復發之方法中的抗體共軛物。
本文所述抗體共軛物不僅可用於治療高HER2表現腫瘤(例如，具有3+ IHC評分)，而且亦用於治療較低HER2表現腫瘤(例如，具有2+ IHC評分)。
圖1繪示在N87異種移植物腫瘤模型中抗HER2-mAb2-(C-1)共軛物之單一治療後的結果。與未治療之動物(空心圓)相比時，在所有測試劑量下觀察到腫瘤消退，該等測試劑量包括1mg/kg(實心菱形)、2.5mg/kg(實心三角形)、5mg/kg(實心圓)及10mg/kg(實心正方形)。在與未治療之動物(空心圓)相比時，在經10mg/kg僅未共軛之抗HER2-mAb2(空心三角形)、或同型對照抗體-(C-1)共軛物(空心菱形)治療之N87異種移植物小鼠中未觀察到N87胃腫瘤消退。數據代表隨時間(投藥後)之平均腫瘤體積(平均值+/- SEM)。
圖2繪示在用抗HER2-mAb1-(C-1)或抗HER2-mAb1-(C-5)之單一劑量治療人類N87異種移植物腫瘤後的結果。在與未治療之動物(空心圓)相比時，在用1mg/kg之抗HER2-mAb1-(C-1)(實心正方形)或1mg/kg之抗HER2-mAb1-(C-5)(實心三角形)治療後，觀察到人類N87異種移植物腫瘤消退，而用0.3mg/kg之抗HER2-mAb1-(C-1)(實心圓)或0.3mg/kg之抗
HER2-mAb1-(C-5)(實心菱形)治療引起腫瘤淤滯。在與未治療之動物(空心圓)相比時，在經同型對照抗體-(C-5)共軛物(空心菱形)治療之N87異種移植物小鼠中未觀察到N87胃腫瘤消退。數據代表隨時間(投藥後)之平均腫瘤體積(平均值+/- SEM)。
圖3繪示在用抗HER2-mAb1-(C-5)之單一劑量治療人類N87異種移植物腫瘤後的結果。在與未治療之動物(空心圓)相比時，在用5mg/kg之抗HER2-mAb1-(C-5)(實心正方形)或3mg/kg之抗HER2-mAb1-(C-5)(實心圓)治療後，觀察到人類N87異種移植物腫瘤消退，而用1mg/kg之抗-HER2-mAb1-(C-5)(實心三角形)治療引起腫瘤淤滯。數據代表隨時間(投藥後)之平均腫瘤體積(平均值+/- SEM)。
圖4繪示在用與不同化合物共軛之抗HER2-mAb1之單一劑量治療人類N87異種移植物腫瘤後的結果。在與未治療之動物(空心圓)相比時，在用1mg/kg之抗HER2-mAb1-(C-5)(實心三角形)、抗HER2-mAb1-(C-60)(空心三角形)、抗HER2-mAb1-(C-59)(實心正方形)、抗HER2-mAb1-(C-61)(空心正方形)、抗HER2-mAb1-(C-35)(實心六角形)、抗HER2-mAb1-(C-37)(空心六角形)、抗HER2-mAb1-(C-64)(實心菱形)或抗HER2-mAb1-(C-62)(空心菱形)治療後觀察到人類N87異種移植物腫瘤初始消退、之後淤滯。數據代表隨時間(投藥後)之平均腫瘤體積(平均值+/- SEM)。
圖5A及5B繪示用抗大鼠HER2-(C-46)共軛物之單一劑量治療MMC小鼠乳房腫瘤(大鼠HER2陽性)的結果。結果展現，在經抗大鼠HER2-(C-46)共軛物治療之8隻小鼠中之7隻中觀察到完全腫瘤消退(圖5A)，但在經裸抗大鼠HER2抗體治療之8隻小鼠中之僅3隻中觀察到完全腫瘤消退(圖5B)。
在MMC乳癌同源模型中，在腫瘤達到200mm3之平均大小時，開始治療。數據代表隨時間(投藥後)之平均腫瘤體積(平均值+/- SEM)。
圖6繪示在用抗HER2-mAb1-(C-5)之單一劑量治療人類HCC1954乳房異種移植物腫瘤後的結果。在與未治療之動物(空心圓)相比時，在用10mg/kg之抗HER2-mAb1-(C-5)(實心正方形)或3mg/kg之抗HER2-mAb1-(C-5)(實心圓)治療後，觀察到人類HCC1954異種移植物腫瘤消退，而用1mg/kg之抗-HER2-mAb1-(C-5)(實心三角形)治療引起腫瘤淤滯。在與未治療之動物(空心圓)相比時，在經10mg/kg之同型對照抗體-(C-5)共軛物(空心菱形)或僅未共軛之抗HER2-mAb1(空心三角形)治療之HCC1954異種移植物小鼠中未觀察到腫瘤消退。數據代表隨時間(投藥後)之平均腫瘤體積(平均值+/- SEM)。
圖7繪示在用抗HER2-mAb1-(C-5)之單一劑量治療人類SKOV3卵巢異種移植物腫瘤後的結果。在與未治療之動物(空心圓)相比時，在用10mg/kg之抗HER2-mAb1-(C-5)(實心正方形)治療後觀察到人類SKOV3異種移植物腫瘤消退，而用3mg/kg之抗HER2-mAb1-(C-5)(實心圓)治療引起初始腫瘤消退、之後腫瘤再生長。在與未治療之動物(空心圓)相比時，在經10mg/kg之同型對照抗體-(C-5)共軛物(空心菱形)或僅未共軛之抗HER2-mAb1(空心三角形)治療之SKOV3異種移植物小鼠中未觀察到腫瘤消退。數據代表隨時間(投藥後)之平均腫瘤體積(平均值+/- SEM)。
圖8A-8C繪示顯示N87(圖8A)、HCC1954(圖8B)及SKOV3(圖8C)異種移植物腫瘤上之HER2表現的代表性免疫組織化學(IHC)影像。將腫瘤基於其HER2表現程度評分為3+(N87及HCC1954)及2+(SKOV3)。
本申請案主張於2015年10月29日提出申請之美國臨時申請案第62/247896號之權益，其全部內容以引用方式併入本文中。
本文闡述本發明之各個列舉實施例。應認識到，在每一實施例中所指定之特徵可與其他指定特徵組合以提供本發明之其他實施例。
在本申請之整個文本中，若說明書之文本(例如，表1)與序列表之間存在差異，則以說明書之文本為準。
如本文所用術語「C4-C6烷基」係指含有4至6個碳原子之完全飽和具支鏈或直鏈烴。「C4-C6烷基」之非限制性實例包括正丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基及己基。
如本文所用之「HER2」(亦稱為ERBB2；NEU；NGL；TKR1；CD340；p185；MLN19；HER-2/neu)係指表皮生長因子(EGF)受體家族之跨膜酪胺酸激酶受體。HER2包含細胞外結合結構域、跨膜結構域及細胞內酪胺酸激酶結構域。HER2不具有其自身之配體結合結構域，且因此不可結合生長因子。然而，HER2緊密結合至其他配體結合之EGF受體家族成員(例如HER1或HER3)以形成異二聚體，從而穩定配體結合並增強激酶介導之下游信號傳導路徑活化。將人類HER2/NEU基因定位至染色體位置17q12，且HER2/NEU基因之基因體序列可參見NG_007503.1下之基因庫。在人類中，存在五個HER2同種型：A、B、C、D及E；術語「HER2」在本文中用於共同地指所有HER2同種型。如本文所用，人類HER2蛋白亦涵蓋在其全長內與HER2同種型A、B、C、D及E具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、
85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的蛋白，其中該等蛋白仍具有HER2之功能中之至少一者。人類HER2同種型A(即最長同種型)之mRNA及蛋白序列係：智人erb-b2受體酪胺酸激酶2(ERBB2)，轉錄變體1，mRNA[NM_004448.3] (SEQ ID NO：25)
受體酪胺酸-蛋白激酶erbB-2同種型，前體[智人][NP_004439.2]
(SEQ ID NO：26)
其他人類HER2同種型之mRNA及蛋白序列可參見具有以下登錄號之基因庫：HER2同種型B：NM_001005862.2(mRNA)→NP_001005862.1(蛋白質)；
HER2同種型C：NM_001289936.1(mRNA)→NP_001276865.1(蛋白質)；HER2同種型D：NM_001289937.1(mRNA)→NP_001276866.1(蛋白質)；HER2同種型E：NM_001289938.1(mRNA)→NP_001276867.1(蛋白質)。
如本文所用術語「抗體」係指源自特異性結合至抗原之免疫球蛋白分子之蛋白質或多肽序列。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈或完整免疫球蛋白，且可源自天然來源或重組來源。天然存在之「抗體」係包含由二硫鍵互連之至少兩條重(H)鏈及兩條輕(L)鏈的醣蛋白。每一重鏈包括重鏈可變區(在本文中縮寫為VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包括三個結構域：CH1、CH2及CH3。每一輕鏈包括輕鏈可變區(在本文中縮寫為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包括一個結構域CL。可將VH及VL區進一步細分成超變區(稱為互補決定區(CDR))及更保守之區(稱為框架區(FR))，二者間雜排列。每一VH及VL係由三個CDR及四個FR構成，其自胺基末端至羧基末端按下列順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈及輕鏈之可變區含有與抗原相互作用之結合結構域。抗體之恆定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統之各種細胞(例如效應物細胞)及經典補體系統之第一組份(C1q))的結合。抗體可為單株抗體、人類抗體、人類化抗體、駱駝化抗體或嵌合抗體。抗體可為任一同型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、種類(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。
術語「抗體片段」係指抗體中保留與(例如，藉由結合、位阻、穩定/
去穩定、空間分佈)抗原之表位特異性相互作用能力的至少一個部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗體片段、二硫鍵連接之Fv(sdFv)、由VH及CH1結構域組成之Fd片段、直鏈抗體、單一結構域抗體(例如sdAb(VL或VH))、駱駝科動物VHH結構域、自抗體片段(例如包含在鉸鏈區由二硫橋連接之兩個Fab片段之二價片段)形成之多特異性抗體及經分離CDR或抗體之其他表位結合片段。亦可將抗原結合片段納入單一結構域抗體、馬克西抗體(maxibodies)、微小抗體、奈米抗體、胞內抗體、二價抗體、三價抗體、四價抗體、v-NAR及雙-scFv中(例如，參見Hollinger及Hudson，Nature Biotechnology 23：1126-1136,2005)。亦可基於多肽(例如III型纖連蛋白(Fn3))將抗原結合片段移植至支架中(參見美國專利第6,703,199號，其闡述纖連蛋白多肽微小抗體)。術語「scFv」係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段的融合蛋白，其中輕鏈及重鏈可變區(例如)經由合成連接體(例如，短撓性多肽連接體)以鄰接方式連接，且能夠表現為單鏈多肽，且其中scFv保留衍生出其之完整抗體之特異性。除非說明，否則如本文所用之scFv可具有(例如)關於多肽之N末端及C末端呈任一次序之VL及VH可變區，scFv可包含VL-連接體-VH或可包含VH-連接體-VL。
如本文所用術語「互補決定區」或「CDR」係指抗體可變區內賦予抗原特異性及結合親和力之胺基酸序列。舉例而言，每一重鏈可變區中通常存在三個CDR(例如，HCDR1、HCDR2及HCDR3)，且在每一輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2及LCDR3)。可使用多種業內熟知之方案測定給定CDR之精確胺基酸序列邊界，該等方案包括以下中所述之彼等：Kabat等人(1991),「Sequences of Proteins of Immunological Interest,」
第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(「Kabat」編號系統)，Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273,927-948(「Chothia」編號系統)或其組合。在針對給定CDR區(例如，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2或LC CDR3)之組合Kabat及Chothia編號方案中，在一些實施例中，CDR對應於定義為Kabat CDR之部分之胺基酸殘基，以及定義為Chothia CDR之部分之胺基酸殘基。
術語「表位」包括任何能夠特異性結合至免疫球蛋白或以其他方式與分子相互作用之蛋白決定子。表位決定子通常係由分子之化學活性表面基團(例如，胺基酸或碳水化合物或糖側鏈)組成，且可具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。表位可為「線性」或「構象」。構象及線性表位之不同之處在於，在變性溶劑存在下不與前者而非後者結合。
如本文所用片語「單株抗體」或「單株抗體組合物」係指具有實質上相同胺基酸序列或源自相同基因來源之多肽(包括抗體、雙特異性抗體等)。此術語亦包括單一分子組合物之抗體分子之製劑。單株抗體組合物展示針對特定表位之單一結合特異性及親和力。
如本文所用之片語「人類抗體」包括具有可變區之抗體，其中框架區及CDR區二者皆源自人類來源之序列。另外，若抗體含有恆定區，則該恆定區亦源自該等人類序列，例如人類種系序列或人類種系序列之突變形式或含有源自人類框架序列分析之共有框架序列的抗體，例如，如Knappik等人(2000.J Mol Biol 296,57-86)所述。可使用熟知之編號方案(例如Kabat編號方案、Chothia編號方案或Kabat與Chothia之組合)定義免疫球蛋白可變結構域(例如CDR)之結構及位置(例如，參見Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and Human Services
(1991)，編輯Kabat等人；Al Lazikani等人，(1997)J.Mol.Bio.273：927 948)；Kabat等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH第91-3242號出版物，U.S.Department of Health and Human Services；Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，(1989)Nature 342：877-883；及Al-Lazikani等人，(1997)J.Mal.Biol.273：927-948。
本發明之人類抗體可包括並非由人類序列編碼之胺基酸殘基(例如藉由活體外隨機誘變或定點誘變或藉由活體內體細胞突變引入之突變或用於促進穩定性或製造之保守取代)。然而，如本文所用術語「人類抗體」並不意欲包括源自另一哺乳動物物種(例如小鼠)種系之CDR序列已移植至人類框架序列上之抗體。
如本文所用片語「重組人類抗體」包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，例如自對人類免疫球蛋白基因轉基因或轉染色體的動物(例如小鼠)或自其製備之雜交瘤分離之抗體、自經轉變以表現人類抗體之宿主細胞、例如自轉染瘤分離之抗體、自重組、組合人類抗體文庫分離之抗體及藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列之全部或部分剪接至其他DNA序列之任何其他方式製備、表現、產生或分離的抗體。該等重組人類抗體具有其中框架區及CDR區源自人類種系免疫球蛋白序列之可變區。然而，在某些實施例中，可使該等重組人類抗體經歷活體外誘變(或，當使用人類Ig序列之轉基因動物時，經歷活體內體細胞誘變)，且因此重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列儘管源自人類種系VH及VL序列並與其相關，但其係可不天然存在於人類活體內抗體種系譜內的序列。
如本文所用術語「Fc區」係指包含抗體之CH3、CH2及恆定結構域之
鉸鏈區之至少一部分之多肽。視情況，Fc區可包括在一些抗體種類中存在之CH4結構域。Fc區可包含抗體之恆定結構域之整個鉸鏈區。在一個實施例中，本發明包含抗體之Fc區及CH1區。在一個實施例中，本發明包含抗體之Fc區、CH3區。在另一實施例中，本發明包含來自抗體之恆定結構域之Fc區、CH1區及Cκ/λ區。在一個實施例中，本發明之結合分子包含恆定區，例如重鏈恆定區。在一個實施例中，與野生型恆定區相比，該恆定區經修飾。亦即，本文揭示之本發明多肽可包含對三個重鏈恆定結構域(CH1、CH2或CH3)中之一或多者及/或對輕鏈恆定區結構域(CL)之改變或修飾。實例性修飾包括一或多個結構域中之一或多個胺基酸之添加、缺失或取代。可包括該等變化以最佳化效應物功能、半衰期等。
如本文所用術語「結合特異性」係指個別抗體組合位點與一個抗原性決定子而非與不同抗原性決定子反應的能力。抗體之組合位點位於分子之Fab部分中，且係自重鏈及輕鏈之超變區構築而成。抗體之結合親和性係抗體之單一抗原性決定子與單一組合位點之間之反應強度。其係抗體之抗原性決定子與組合位點之間操作之吸引力及排斥力之和。
如本文所用術語「親和力」係指單一抗原性位點處抗體與抗原之間之相互作用強度。在每一抗原性位點內，抗體「臂」之可變區藉助弱的非共價力在多個位點處與抗原相互作用；相互作用愈大，則親和力愈強。
術語「保守序列修飾」係指不顯著影響或改變含有胺基酸序列之抗體或抗體片段之結合特徵的胺基酸修飾。該等保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。可藉由業內已知之標準技術(例如定點誘變及PCR介導之誘變)將修飾引入本發明抗體或抗體片段中。保守胺基酸取代係其中胺基酸殘基經具有類似側鏈之胺基酸殘基替代者。業內已定義具有類似側鏈之胺基酸
殘基之家族。該等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電極性側鏈之胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分支側鏈之胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳香族側鏈之胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。因此，抗體內之一或多個胺基酸殘基可經來自同一側鏈家族之其他胺基酸殘基替代，且可利用本文所述之功能分析來測試經改變抗體。
術語「同源」或「一致性」係指兩個聚合物分子之間、例如兩個核酸分子(例如兩個DNA分子或兩個RNA分子)之間或兩個多肽分子之間的亞單位序列一致性。當兩個分子二者中之亞單位位置由相同單體亞單位佔據時；例如若在兩個DNA分子中每一者中之位置由腺嘌呤佔據，則其在該位置處同源或一致。兩條序列之間之同源性係匹配或同源位置數之直接函數；例如若兩條序列中位置之一半(例如聚合物10個亞單位長度上之5個位置)同源，則該兩條序列為50%同源；若90%之位置(例如10個中之9個)匹配或同源，則該兩條序列為90%同源。可藉由在比較窗內比較兩個最佳比對序列測定「序列一致性」百分比，其中對於兩個序列之最佳比對，與參照序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗中之胺基酸序列之片段可包含添加或缺失(例如，空位或懸突)。該百分比可藉由以下計算：測定兩個序列中出現相同胺基酸殘基之位置數以產生匹配位置數，用匹配位置數除以比較窗中之位置之總數，及將結果乘以100以產生序列一致性百分比。輸出係關於查詢序列之個體序列之一致性百分比。
術語「癌症」及「癌性」係指或闡述哺乳動物中特徵通常在於細胞生長失調之生理病況。癌症之實例包括(但不限於)癌、淋巴瘤、母細胞瘤(包括髓母細胞瘤及視網膜母細胞瘤)、肉瘤(包括脂肪肉瘤及滑膜細胞肉瘤)、神經內分泌腫瘤(包括類癌腫瘤、胃泌素瘤及島細胞癌)、間皮瘤、神經鞘瘤(包括聽神經瘤)、腦脊髓膜瘤、腺癌、黑色素瘤及白血病或淋巴惡性病。該等癌症之更具體實例包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)；肺癌，包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌及肺鱗狀癌；腹膜癌；肝細胞癌；胃癌，包括胃腸癌；胰臟癌、膠質母細胞瘤、神經細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney cancer或renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食道癌、膽道腫瘤以及頭頸癌。
「HER2陽性癌症」或「HER2表現癌症」係包含在其細胞表面存在HER2蛋白之細胞的癌症。檢測或確定癌細胞上HER2之存在之許多方法為業內已知。舉例而言，在一些實施例中，細胞表面上HER2之存在可藉由免疫組織化學(IHC)、流式細胞術、西方墨點法、免疫螢光分析、放射免疫分析(RIA)、酶聯免疫吸附分析(ELISA)、均相時間解析螢光(HTRF)或正電子發射斷層攝影術(PET)測定。
如本文所用術語「組合」或「醫藥組合」意指自混合或組合一種以上之活性成份產生且包括活性成份之固定及非固定組合二者的產品。術語「固定組合」意指將活性成份(例如，本發明化合物)及一或多種額外治療劑以單一實體或劑量之形式同時投與個體。術語「非固定組合」意指將活性成份(例如本發明化合物)及一或多種額外治療劑作為單獨實體同時、並行或
依序且無特定時間限制地投與個體，其中該投與可在個體體內提供活性成份之治療有效含量。後者亦適用於雞尾酒療法，例如投與3種或更多種活性成份。
如本文所用術語「組合物」或「醫藥組合物」係指本發明化合物與至少一種及視情況一種以上其他醫藥上可接受之化學組份(例如載劑、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑)之混合物。
如本文所用術語「光學異構物」或「立體異構物」係指本發明給定化合物中可存在之各種立體異構物構形中之任一者且包括幾何異構物。應瞭解，取代基可附接至碳原子之對掌性中心。術語「對掌性」係指具有與其鏡像配偶體不重疊之性質的分子，而術語「非對掌性」係指與其鏡像配偶體可重疊之分子。因此，本發明包括化合物之鏡像異構物、非鏡像異構物或外消旋物。「鏡像異構物」係一對彼此為非重疊鏡像之立體異構物。鏡像異構物對之1：1混合物為「外消旋」混合物。若適宜，該術語可用於指示外消旋混合物。「非鏡像異構物」係具有至少兩個不對稱原子、但彼此不為鏡像之立體異構物。根據Cahn-lngold-Prelog R-S系統來指定絕對立體化學。當化合物係純鏡像異構物時，每一對掌性碳之立體化學可指定為R或S。絕對構形未知之拆分化合物可端視其在鈉D線波長下旋轉平面偏振光之方向(右旋或左旋)而指定為(+)或(-)。本文所述某些化合物含有一或多個不對稱中心或軸且可由此產生鏡像異構物、非鏡像異構物及其他立體異構物形式，該等形式可根據絕對立體化學定義為(R)-或(S)-。
如本文所用術語「醫藥上可接受之載劑」包括如彼等熟習此項技術者已知之任一及所有溶劑、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、吸收延遲劑、鹽、防腐劑、藥
物穩定劑、黏合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、甜味劑、矯味劑、染料及諸如此類及其組合(參見(例如)Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，第1289-1329頁)。除任何與活性成份不相容之習用載劑之外，本發明涵蓋其於治療或醫藥組合物中之用途。
如本文所用術語「醫藥上可接受之鹽」係指不會消除本發明化合物之生物活性及性質且不會對其投與之個體引起顯著刺激的鹽。
如本文所用術語「個體」涵蓋哺乳動物及非哺乳動物。哺乳動物之實例包括(但不限於)人類、黑猩猩、猿、猴子、牛、馬、綿羊、山羊、豬；兔、狗、貓、大鼠、小鼠、豚鼠及諸如此類。非哺乳動物之實例包括(但不限於)鳥、魚及諸如此類。個體通常係人類。
術語「需要該治療之個體」係指在生物、醫學或生活品質上受益於該治療之個體。
如本文所用術語「治療有效量」係指本發明之抗體共軛物將引發個體之生物或醫學反應(例如降低或抑制酶或蛋白質活性)、或改善症狀、緩和病況、減緩或延遲疾病進展、或預防疾病等之量。在一個非限制性實施例中，術語「治療有效量」係指本發明之抗體共軛物在投與個體時有效至少部分緩和、抑制、預防及/或改善病況、或病症或疾病之量。
如本文所用術語「TLR7促效劑」係指能夠活化類鐸受體7(TLR7)之化合物或抗體共軛物。
如本文所用術語「治療」(「treat」、「treating」或「treatment」)係指以預防及/或治療方式減輕、減弱或改善疾病或病況症狀、預防額外症狀、改善或預防症狀之潛在代謝病因、抑制疾病或病況、阻止疾病或病況之發展、減輕疾病或病況、使疾病或病況消退、減輕由疾病或病況所引起
之病況或終止疾病或病況之症狀。
本文提供之化合物名稱係使用ChemDraw Ultra 12.0版(CambridgeSoft®)或JChem 5.3.1版(ChemAxon)來獲得。
除非另外指明，否則術語「本發明之化合物」(「compounds of the present invention」、「compounds of the invention」)或「本文提供之化合物」係指式(I)及其子式之化合物(即式(Ia)及式(Ib)化合物)及其醫藥上可接受之鹽、立體異構物(包括非鏡像異構物及鏡像異構物)、互變異構物及經同位素標記之化合物(包括氘取代)。
除非另外指明，否則術語「本發明之抗體共軛物」係指式(II)及其子式之抗體共軛物(即式(IIa)及式(IIb)化合物)及其醫藥上可接受之鹽、立體異構物(包括非鏡像異構物及鏡像異構物)、互變異構物及經同位素標記之化合物(包括氘取代)。
除非本文另外指明或上下文明顯矛盾，否則如本文所使用，在本發明上下文(尤其在申請專利範圍之上下文)中使用之術語「一」(「a」、「an」)、「該」及類似術語皆理解為涵蓋單數及複數二者。
本發明之免疫刺激性化合物係具有式(I)之結構之TLR7促效劑：
其中：RD係且RE係H；或RE係且RD係H；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；
R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R4係、、、、、-ONH2、-NH2、、、、、-N3、、-NHC(=O)CH=CH2、-SH、-SR7、-OH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、-NHC(=O)CH2Br、
-NHC(=O)CH2I、-C(O)NHNH2、、-CO2H、-C(O)NHNH2、
R5係；X1係、、或；X2係、、或；X3係、、、
R6係2-吡啶基或4-吡啶基；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、
-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
在其他所列舉實施例之以下清單中提供本發明之化合物之某些態樣及實例。應認識到，在每一實施例中所指定之特徵可與其他指定特徵組合以提供本發明之其他實施例。
實施例1. 式(I)化合物及其醫藥上可接受之鹽，其中：RD係且RE係H；或RE係且RD係H；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、
-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R4係、、、、、-ONH2、-NH2、
、、、、-N3、、-NHC(=O)CH=CH2、SH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、-NHC(=O)CH2Br、-NHC(=O)CH2I、-C(O)NHNH2、、-CO2H、-C(O)NHNH2、
R5係；X1係、、或；X2係、或；X3係、或；R6係2-吡啶基或4-吡啶基；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
實施例2. 具有式(Ia)或式(Ib)之結構之式(I)化合物及其醫藥上可接受之鹽，
其中：R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R4係、、、、、-ONH2、-NH2、
、、、、-N3、、-NHC(=O)CH=CH2、SH、-SR7、-OH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、-NHC(=O)CH2BR、
-NHC(=O)NHNH2、、-CO2H、-C(O)NHNH2、
R5係；X1係、、或；X2係、、或；X3係、、、
R6係2-吡啶基或4-吡啶基；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；
每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
實施例3. 式(Ia)或式(Ib)之化合物及其醫藥上可接受之鹽，其中：R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、
-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R4係、、、、、-ONH2、-NH2、
、、、、-N3、、-NHC(=O)CH=CH2、SH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、-NHC(=O)CH2Br、
-NHC(=O)CH2I、-C(O)NHNH2、、-CO2H、-C(O)NHNH2、
R5係；X1係、、或；X2係、或；X3係、或；R6係2-吡啶基或4-吡啶基；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
實施例4. 具有式(Ia)或式(Ib)之結構之式(I)化合物及其醫藥上可接受之鹽，
其中：R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R4係、、、、、-ONH2、-NH2、、、、-NHC(=O)CH=CH2、
-N3、、SH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、-NHC(=O)CH2Br、
-NHC(=O)CH2I、-C(O)NHNH2、或-CO2H；
R5係；X1係、、或；X2係、或；X3係、或；R6係2-吡啶基或4-吡啶基；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
實施例5. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C4-C6烷基；
R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-；
R4係、、、、
、-ONH2、-NH2、、、或；
R5係；X1係；X2係或；
X3係；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
實施例6. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-；
R4係、、、、、-ONH2、-NH2、、或；R5係；X1係；X2係或；X3係；每一n皆獨立地選自1、2、3及4，且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
實施例7. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、
-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-；
R4係、、、、、-ONH2、-NH2、、、或；
R5係；X1係；X2係或；X3係；每一n皆獨立地選自1、2、3及4，且每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
實施例8. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；L2係-(CH2)n-或-C(=O)(CH2)n；
R4係、、、、
、-ONH2、-NH2、、、或；R5係，且每一n皆獨立地選自1、2、3及4。
實施例9. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；L2係-(CH2)n-或-C(=O)(CH2)n；
R4係、、、或
R5係，
且每一n皆獨立地選自1、2、3及4。
實施例10. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；L2係-(CH2)n-或-C(=O)(CH2)n；R4係-ONH2或-NH2；且每一n皆獨立地選自1、2、3及4。
實施例11. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；L2係-(CH2)n-或-C(=O)(CH2)n；
R4係、或；且每一n皆獨立地選自1、2、3及4。
實施例12. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R1係-NHR2。
實施例13. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R1係-NHCHR2R3。
實施例14. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R2係-C4烷基。
實施例15. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R2係-C5烷基。
實施例16. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R2係-C6烷基。
實施例17. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R3係L1OH。
實施例18. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：L1係-(CH2)-。
實施例19. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：L1係-(CH2CH2)-。
實施例20. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：L2係-(CH2)n-*、-((CH2)nO)t(CH2)n-*、-(CH2)nX1(CH2)n-*、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-*、-(CH2)nNHC(=O(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-*或-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n*，其中*表示與R4之附接點。
實施例21. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：L2係-C(=O)(CH2)n*-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-*、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-*、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-*、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-*、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-*、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-*、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-*或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-*，其中*表示與R4之附接點。
實施例22. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：L2係-(CH2)n-*或-C(=O)(CH2)n-*，其中*表示與R4之附接點。
實施例23. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：L2係-(CH2CH2)-*或-C(=O)(CH2CH2)-*，其中*表示與R4之附接點。
實施例24. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：L2係-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-*、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-*、-C(=O)(CH2)nC(R7)2-*、-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-*
或-(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-*，其中*表示與R4之附接點。
實施例25. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：
R4係、、、或
實施例26. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：
R4係-ONH2、或-NH2。
實施例27. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：
R4係、或。
實施例28. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R4係-NHC(=O)CH=CH2、-N3、、SH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、
-NHC(=O)CH2Br、-NHC(=O)CH2I、-C(O)NHNH2、、-CO2H、-NHCH(=O)或-NHCH(=S)。
實施例29. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：
R4係、
實施例30. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R4係-SR7或-OH。
實施例31. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中R5係。
實施例32. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X1係
實施例33. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X1係
實施例34. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X1係。
實施例35. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X2係
實施例36. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X2係
實施例37. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X2係。
實施例38. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X2係
實施例39. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X2係
實施例40. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X3係
實施例41. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X3係
實施例42. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X3係
實施例43. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X3係
實施例44. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：X3係。
實施例45. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：R6係2-吡啶基或4-吡啶基。
實施例46. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基。
實施例47. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：每一R7皆係H。
實施例48. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：每一R7皆係C1-C6烷基。
實施例49. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：每一m皆獨立地選自1、2、3及4。
實施例50. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：每一m皆係1或2。
實施例51. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：每一n皆獨立地選自1、2、3及4。
實施例52. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：每一n皆係2或3。
實施例53. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
實施例54. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5及6。
實施例55. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其選自：1-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；(2R)-2-胺基-3-((1-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸；(6R)-6-(2-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-2-側氧基乙基)-5-側氧基硫嗎啉-3-甲酸；3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側
氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；(2S)-2-胺基-3-((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸；(6R)-6-(2-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-2-側氧基乙基)-5-側氧
基硫嗎啉-3-甲酸；3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；1-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺
基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；1-(2-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；(2R)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,19-二側氧基-10,13,16-三氧雜-4-硫雜-7-氮雜十九-1-酸；
(2R,5S)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,19-二側氧基-10,13,16-三氧雜-4-硫雜-7-氮雜十九-1-酸；(2R,5R)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,19-二側氧基-10,13,16-三氧雜-4-硫雜-7-氮雜十九-1-酸；(19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,14-二側氧基-4,7,10-三氧雜-17-硫雜-13-氮雜二十碳烷-20-酸；(16R,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,14-二側氧基-4,7,10-三氧雜-17-硫雜-13-氮雜二十碳烷-20-酸；(16S,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,14-二側氧基-4,7,10-三氧雜-17-硫雜-13-氮雜二十碳烷-20-酸；1-(21-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-21-側氧基-3,6,9,12,15,18-六氧雜二十一烷基)-1H-吡咯-2,5-二酮；(2R)-2-胺基-28-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,28-二側氧基-10,13,16,19,22,25-六氧雜-4-硫雜-7-氮雜二十八烷-1-酸；(2R,5S)-2-胺基-28-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,28-二側氧基
-10,13,16,19,22,25-六氧雜-4-硫雜-7-氮雜二十八烷-1-酸；(2R,5R)-2-胺基-28-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,28-二側氧基-10,13,16,19,22,25-六氧雜-4-硫雜-7-氮雜二十八烷-1-酸；(28R)-28-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-25-羧基-1,23-二側氧基-4,7,10,13,16,19-六氧雜-26-硫雜-22-氮雜二十九烷-29-酸；(25R,28R)-28-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-25-羧基-1,23-二側氧基-4,7,10,13,16,19-六氧雜-26-硫雜-22-氮雜二十九烷-29-酸；(25S,28R)-28-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-25-羧基-1,23-二側氧基-4,7,10,13,16,19-六氧雜-26-硫雜-22-氮雜二十九烷-29-酸；1-((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-1H-吡咯-2,5-二酮；(2R)-2-胺基-3-((2-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)硫基)戊烷二酸；N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺；
(19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-(羧基甲基)-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,14-二氮雜二十碳烷-20-酸；(16S,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-(羧基甲基)-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,14-二氮雜二十碳烷-20-酸；(16R,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-(羧基甲基)-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,14-二氮雜二十碳烷-20-酸；(20R)-20-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-17-羧基-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-18-硫雜-10,14-二氮雜二十一碳烷-21-酸；(17R,20R)-20-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-17-羧基-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-18-硫雜-10,14-二氮雜二十一碳烷-21-酸；(17S,20R)-20-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-17-羧基-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-18-硫雜-10,14-二氮雜二十一碳烷-21-酸；5-(4-((4-(3-胺基丙基)六氫吡嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺；1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)丙-1-酮；N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-
基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺；(2R)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,9,19-三側氧基-13,16-二氧雜-4-硫雜-7,10-二氮雜十九-1-酸；(2R,5S)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,9,19-三側氧基-13,16-二氧雜-4-硫雜-7,10-二氮雜十九-1-酸；(2R,5R)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,9,19-三側氧基-13,16-二氧雜-4-硫雜-7,10-二氮雜十九-1-酸；(19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,11,14-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,13-二氮雜二十碳烷-20-酸；(16R,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,11,14-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,13-二氮雜二十碳烷-20-酸；(16S,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,11,14-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,13-二氮雜二十碳烷-20-酸；4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)-N-(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)六氫吡嗪-1-甲醯胺；
3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲
基)胺基)-4-側氧基丁酸；1-(2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸；1-((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-1H-
吡咯-2,5-二酮；3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸；N-(21-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-21-側氧基-3,6,9,12,15,18-六氧雜二十一烷基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺；4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲
氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯；(2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸；(S)-1-(3-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；1-(3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側
氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸；1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-(胺基氧基)乙酮；1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-胺基乙氧基)丙-1-酮；N-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺；(S)-1-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-(胺基氧基)乙酮；(S)-1-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)丙-1-酮；(S)-N-(2-(2-(3-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺；N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-
基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺；5-(4-((4-(2-(2-(胺基氧基)乙氧基)乙基)六氫吡嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺；N-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)丙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺；5-(4-((4-(2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙基)六氫吡嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺；N-(2-(2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺；5-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯；(S)-5-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯；(S)-2-胺基-6-(5-(4-(3-((2-胺基-4-(((S)-1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸；(S)-2-胺基-6-(5-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸；5-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)丙基)胺基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基
吡咯啶-1-基酯；(S)-2-胺基-6-(5-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)丙基)胺基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸；5-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯；(S)-2-胺基-6-(5-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸；5-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸全氟苯基酯；3-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)丙酸全氟苯基酯；3-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)丙酸全氟苯基酯；(S)-2-胺基-6-(3-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)丙醯胺基)己酸，及N-(15-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-15-側氧基-3,6,9,12-四氧雜十五烷基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊醯胺。
實施例56. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其選自：1-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲
基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮；1-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮，及1-(2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮。
實施例57. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其選自：(2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸；4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸4-((R)-6-胺基-2-((S)-2-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)-3-苯基丙醯胺基)己醯胺基)苄基酯；4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苄基酯；(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸；
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸；N-(2-((5-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-甲基-5-側氧基戊-2-基)二硫基)乙基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺；1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-4-甲基-4-(甲基硫基)戊-1-酮；(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)(羥基)磷醯基)氧基)甲基)-2-(3-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸；(2R,2'R)-3,3'-((2-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-側氧基乙氧基)亞胺基)丙烷-1,3-二基)雙(硫烷二基))雙(2-胺基丙酸)；(R)-2-胺基-6-((((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)甲基)-17-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-10,17-二側氧基-8,14-二氧雜-4-硫雜-7,11-二氮雜十六-6-烯酸，及2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙-1-醇。
此外，使用較重同位素、尤其氘(即，2H或D)取代可提供某些治療優點，此歸因於較大代謝穩定性，例如活體內半衰期延長或劑量需求降低或
治療指數改良。應瞭解，在此上下文中氘被視為式(I)化合物之取代基。此一較重同位素(特定而言氘)之濃度可藉由同位素富集因子定義。如本文所用術語「同位素富集因子」意指指定同位素之同位素豐度與天然豐度之比率。若本發明化合物中之取代基表示為氘，則該化合物每一指定氘原子之同位素富集因子為至少3500(在每一指定氘原子納入52.5%氘)、至少4000(納入60%氘)、至少4500(納入67.5%氘)、至少5000(納入75%氘)、至少5500(納入82.5%氘)、至少6000(納入90%氘)、至少6333.3(納入95%氘)、至少6466.7(納入97%氘)、至少6600(納入99%氘)或至少6633.3(納入99.5%氘)。
本發明之醫藥上可接受之溶劑合物包括其中結晶溶劑可經同位素取代之彼等，例如D2O、d6-丙酮、d6-DMSO。
本文闡述用於製備式(I)及其子式之化合物之一般程序。在所述反應中，倘若反應性官能基(例如羥基、胺基、亞胺基、硫醇或羧基)在最終產物中合意，則可對該等基團進行保護以避免其不期望地參與反應。在本文範疇內，除非上下文另外指明，否則僅將不為本發明化合物之具體期望最終產物之成份且易於移除之基團稱為「保護基團」。該等保護基團對官能基之保護、保護基團本身及其裂解反應闡述於例如標準參考著作中，例如J.F.W.McOmie,「Protective Groups in Organic Chemistry」，Plenum Press,London及New York 1973；T.W.Greene及P.G.M.Wuts,「Protective Groups in Organic Synthesis」，第3版，Wiley,New York 1999；「The Peptides」；第3卷(編輯：E.Gross及J.Meienhofer),Academic Press,London及New York 1981，「Methoden der organischen Chemie」
(Methods of Organic Chemistry),Houben Weyl，第4版，第15/I卷，Georg Thieme Verlag,Stuttgart 1974；H.-D.Jakubke及H.Jeschkeit,「Aminosäuren,Peptide,Proteine」(Amino acids,Peptides,Proteins),Verlag Chemie,Weinheim,Deerfield Beach,and Basel 1982；及Jochen Lehmann,「Chemie der Kohlenhydrate：Monosaccharide und Derivate」(Chemistry of Carbohydrates：Monosaccharides and Derivatives),Georg Thieme Verlag,Stuttgart 1974。保護基團之特徵在於其可易於藉由例如溶劑分解、還原、光解或另一選擇為在生理學條件下(例如藉由酶裂解)移除(即，並不發生不期望之二級反應)。
在某些實施例中，藉由使式(I)及其子式之化合物之游離鹼形式與化學計量量之適當醫藥上可接受之有機酸或無機酸或適宜陰離子交換試劑反應將本文提供之式(I)及其子式之化合物製備為醫藥上可接受之酸加成鹽。
該等反應通常係在水或有機溶劑、或二者之混合物中實施。通常，若可行，則期望使用非水性介質，例如，醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈。
或者，使用起始材料或中間體之鹽來製備式(I)及其子式之化合物之鹽形式。
本發明化合物之具有至少一個鹽形成基團之鹽可以彼等熟習此項技術者已知之方式製備。舉例而言，本發明化合物之具有酸基團之鹽可藉由例如以下方式來形成：用金屬化合物(例如適宜有機羧酸之鹼金屬鹽，例如2-乙基己酸之鈉鹽)、有機鹼金屬或鹼土金屬化合物(例如相應的氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽，例如鈉或鉀氫氧化物、碳酸鹽或碳酸氫鹽)、相應的鈣化合物或氨或適宜有機胺來處理該等化合物，較佳使用化學計量量或
僅較小過量之鹽形成劑。本發明化合物之酸加成鹽係以常用方式藉由例如用酸或適宜陰離子交換試劑處理該等化合物來獲得。本發明化合物之含有酸性及鹼性鹽形成基團(例如游離羧基及游離胺基)之內鹽可藉由(例如)用(例如)弱鹼將鹽(例如酸加成鹽)中和至等電點或藉由用離子交換劑處理來形成。
可根據彼等熟習此項技術者已知之方法將鹽轉化成游離化合物。金屬鹽及銨鹽可藉由(例如)用適宜酸處理來轉化，且酸加成鹽可藉由(例如)用適宜鹼性劑處理來轉化。
所有上述過程步驟皆可在彼等熟習此項技術者已知之反應條件下實施，該等條件包括具體所述之彼等：於溶劑或稀釋劑不存在時或(習慣上)存在時，該等溶劑或稀釋劑包括(例如)對所用試劑呈惰性並使其溶解之溶劑或稀釋劑；於觸媒、縮合劑或中和劑(例如離子交換劑，例如陽離子交換劑，例如，呈H+形式，此端視反應及/或反應物之性質而定)不存在時或存在時；在低溫、常溫或高溫下(例如溫度介於約-100℃至約190℃之間，包括(例如)約-80℃至約150℃，例如在-80℃至-60℃下，於室溫下，在-20℃至40℃下或在回流溫度下)；在常壓下或在密閉容器中，若需要，在壓力下及/或在惰性氣氛中，例如在氬或氮氣氛中。
式(I)及其子式之化合物之醫藥上可接受之酸加成鹽包括(但不限於)乙酸鹽、己二酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽(besylatye、benzenesulfonate)、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、樟腦磺酸鹽(camphor sulfonate、camsylate)、癸酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶鹼鹽、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽(edisylate、ethanedisulfonate)、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate、glucoheptonate)、
葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、麩胺酸鹽、戊二酸鹽、羥乙酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、苦杏仁酸鹽、甲磺酸鹽(mesylate、methanesulfonate)、甲基硫酸鹽、黏酸鹽、萘酸鹽、萘磺酸鹽(napsylate)、2-萘磺酸鹽(2-napsylate)、萘磺酸鹽(naphthalenesulfonate)、2-萘磺酸鹽(2-naphthalenesulfonate)、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、癸二酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基柳酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽、三苯乙酸鹽(trifenatate、triphenylacetete)及昔萘酸鹽形式。
用於形成式(I)及其子式之化合物之某些醫藥上可接受之酸加成鹽的有機酸或無機酸包括(但不限於)乙酸、己二酸、抗壞血酸、天冬胺酸、苯甲酸、苯磺酸、碳酸、樟腦磺酸、癸酸、氯茶鹼鹽、檸檬酸、乙二磺酸、富馬酸、D-甘油-D-葡-庚糖酸、半乳糖二酸、半乳糖二酸/黏酸、葡庚糖酸(gluceptic acid、glucoheptonoic acid)、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、麩胺酸、戊二酸、乙醇酸、馬尿酸、氫溴酸、鹽酸、氫碘酸、羥乙磺酸、乳酸、乳糖酸、月桂基硫酸、蘋果酸、馬來酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲磺酸(mesylic acid、methanesulfonic acid)、黏酸、萘甲酸、1-羥基-2-萘甲酸、萘磺酸、2-萘磺酸、菸鹼酸、硝酸、十八烷酸、油酸、草酸、棕櫚酸、撲酸、磷酸、聚半乳糖醛酸、丙酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、磺基柳酸、硫酸、酒石酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸及三苯基乙酸。
在一個實施例中，本發明提供呈以下鹽形式之3-(3-氟-4-(3-(六氫吡啶-4-基)丙氧基)苯基)-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺：乙酸鹽、己二酸
鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽(besylatye、benzenesulfonate)、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、樟腦磺酸鹽(camphor sulfonate、camsylate)、癸酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶鹼鹽、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽(edisylate、ethanedisulfonate)、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate、glucoheptonate)、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、麩胺酸鹽、戊二酸鹽、羥乙酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽(mesylate、methanesulfonate)、甲基硫酸鹽、黏酸鹽、萘酸鹽、萘磺酸鹽(napsylate)、2-萘磺酸鹽(2-napsylate)、萘磺酸鹽(naphthalenesulfonate)、2-萘磺酸鹽(2-naphthalenesulfonate)、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、癸二酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基柳酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽、三苯乙酸鹽(trifenatate、triphenylacetete)或昔萘酸鹽形式。
在一個實施例中，本發明提供呈以下鹽形式之3-(4-(((1r,4r)-4-胺基環己基)甲氧基)-3-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺：乙酸鹽、己二酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽(besylatye、benzenesulfonate)、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、樟腦磺酸鹽(camphor sulfonate、camsylate)、癸酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶鹼鹽、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽(edisylate、ethanedisulfonate)、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate、glucoheptonate)、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、麩胺酸鹽、戊二酸鹽、羥乙酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二
酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽(mesylate、methanesulfonate)、甲基硫酸鹽、黏酸鹽、萘酸鹽、萘磺酸鹽(napsylate)、2-萘磺酸鹽(2-napsylate)、萘磺酸鹽(naphthalenesulfonate)、2-萘磺酸鹽(2-naphthalenesulfonate)、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、癸二酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基柳酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽、三苯乙酸鹽(trifenatate、triphenylacetete)或昔萘酸鹽形式。
在一個實施例中，本發明提供呈以下鹽形式之3-(4-((4-胺基二環[2.2.2]辛-1-基)甲氧基)-3-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺：乙酸鹽、己二酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽(besylatye、benzenesulfonate)、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、樟腦磺酸鹽(camphor sulfonate、camsylate)、癸酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶鹼鹽、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽(edisylate、ethanedisulfonate)、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate、glucoheptonate)、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、麩胺酸鹽、戊二酸鹽、羥乙酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽(mesylate、methanesulfonate)、甲基硫酸鹽、黏酸鹽、萘酸鹽、萘磺酸鹽(napsylate)、2-萘磺酸鹽(2-napsylate)、萘磺酸鹽(naphthalenesulfonate)、2-萘磺酸鹽(2-naphthalenesulfonate)、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、癸二酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基柳酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽、三苯乙酸鹽(trifenatate、triphenylacetete)或昔萘酸鹽形式。
在一個實施例中，本發明提供呈以下鹽形式之3-(4-((4-胺基二環[2.2.2]辛-1-基)甲氧基)-3-氯苯基)-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-胺：乙酸鹽、己二酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽(besylatye、benzenesulfonate)、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、樟腦磺酸鹽(camphor sulfonate、camsylate)、癸酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶鹼鹽、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽(edisylate、ethanedisulfonate)、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate、glucoheptonate)、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸鹽、麩胺酸鹽、戊二酸鹽、羥乙酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽(mesylate、methanesulfonate)、甲基硫酸鹽、黏酸鹽、萘酸鹽、萘磺酸鹽(napsylate)、2-萘磺酸鹽(2-napsylate)、萘磺酸鹽(naphthalenesulfonate)、2-萘磺酸鹽(2-naphthalenesulfonate)、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、癸二酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基柳酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽、三苯乙酸鹽(trifenatate、triphenylacetete)或昔萘酸鹽形式。
在一個實施例中，本發明提供呈以下鹽形式之4-((2-氯-4-(6-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯氧基)甲基)二環[2.2.2]辛-1-胺：乙酸鹽、己二酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽(besylatye、benzenesulfonate)、碳酸氫鹽/碳酸鹽、硫酸氫鹽/硫酸鹽、溴化物/氫溴酸鹽、樟腦磺酸鹽(camphor sulfonate、camsylate)、癸酸鹽、氯化物/鹽酸鹽、氯茶鹼鹽、檸檬酸鹽、乙二磺酸鹽(edisylate、ethanedisulfonate)、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽(gluceptate、glucoheptonate)、葡萄糖酸鹽、葡萄糖醛酸
鹽、麩胺酸鹽、戊二酸鹽、羥乙酸鹽、馬尿酸鹽、氫碘酸鹽/碘化物、羥乙磺酸鹽、乳酸鹽、乳糖酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、扁桃酸鹽、甲磺酸鹽(mesylate、methanesulfonate)、甲基硫酸鹽、黏酸鹽、萘酸鹽、萘磺酸鹽(napsylate)、2-萘磺酸鹽(2-napsylate)、萘磺酸鹽(naphthalenesulfonate)、2-萘磺酸鹽(2-naphthalenesulfonate)、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、十八烷酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、撲酸鹽、磷酸鹽/磷酸氫鹽/磷酸二氫鹽、聚半乳糖醛酸鹽、丙酸鹽、癸二酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、磺基柳酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、甲苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、三氟乙酸鹽、三苯乙酸鹽(trifenatate、triphenylacetete)或昔萘酸鹽形式。
其他適宜酸加成鹽之清單可參見(例如)「Remington's Pharmaceutical Sciences」，第20版，Mack Publishing Company，Easton,Pa.,(1985)；及「Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties,Selection,and Use」，Stahl及Wermuth(Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2002)。
除非在闡述該等製程時另外指明，否則可選擇之適用於任一特定反應之溶劑包括所特定提及之彼等，或(例如)水、酯(例如低碳鏈烷酸低碳烷基酯，例如乙酸乙酯)、醚(例如脂肪族醚(例如二乙醚)或環醚(例如四氫呋喃或二噁烷))、液體芳香族烴(例如苯或甲苯)、醇(例如甲醇、乙醇或1-丙醇或2-丙醇)、腈(例如乙腈)、鹵代烴(例如二氯甲烷或氯仿)、醯胺(例如二甲基甲醯胺或二甲基乙醯胺)、鹼(例如雜環氮鹼，例如吡啶或N-甲基吡咯啶-2-酮)、羧酸酐(例如低碳烷酸酐，例如乙酸酐)、環狀、直鏈或具支鏈烴(例如環己烷、己烷或異戊烷、甲基環己烷)或彼等溶劑之混合物(例如水溶液)。該等溶劑混合物亦可藉由(例如)層析或分配用於處理中。
在某些實施例中，式(I)及其子式之化合物係以溶劑合物(例如，水合
物)形式製備或形成。在某些實施例中，式(I)及其子式之化合物之水合物係藉由使用有機溶劑(例如二氧雜環己烯、四氫呋喃或甲醇)自水性/有機溶劑混合物重結晶來製備。此外，本發明化合物(包括其鹽)亦可以其水合物形式獲得，或包括其他用於其結晶之溶劑。
本發明化合物可固有地或經過設計而與醫藥上可接受之溶劑(包括水)形成溶劑合物；因此，預計本發明涵蓋溶劑化及未溶劑化兩種形式。術語「溶劑合物」係指本發明化合物(包括其醫藥上可接受之鹽)與一或多種溶劑分子之分子複合物。該等溶劑分子係彼等在醫藥領域中常用且已知對接受者無害者，例如，水、乙醇及諸如此類。術語「水合物」係指溶劑分子為水之複合物。
本發明化合物之任一不對稱原子(例如，碳或諸如此類)可呈外消旋異構物或富集鏡像異構物形式存在，例如(R)-、(S)-或(R,S)-組態。在某些實施例中，每一不對稱原子在(R)-或(S)-組態中皆具有至少50%鏡像異構物過量、至少60%鏡像異構物過量、至少70%鏡像異構物過量、至少80%鏡像異構物過量、至少90%鏡像異構物過量、至少95%鏡像異構物過量或至少99%鏡像異構物過量。原子上具有不飽和雙鍵之取代基若可能則可呈順式-(Z)-或反式-(E)-形式存在。
因此，如本文所使用，本發明化合物可呈可能的異構物、旋轉異構物、阻轉異構物、互變異構物或其混合物中的一種形式存在，例如呈實質上純的幾何(順式或反式)異構物、非鏡像異構物、光學異構物(對映體)、外消旋物或其混合物形式。
任何所得異構物混合物皆可依據其成份之物理化學差異，(例如)藉由層析及/或分段結晶法，分離成純或實質上純之幾何或光學異構物、非鏡像
異構物、外消旋異構物。
可藉由已知方法將任何所得最終產物或中間體之外消旋異構物拆分成光學對映體，例如，藉由分離使用光學活性酸或鹼獲得之其非鏡像異構物鹽並釋放光學活性酸性或鹼性化合物。具體而言，由此可採用鹼性部分體將本發明化合物拆分成其光學對映體，(例如)由使用光學活性酸(例如酒石酸、二苯甲醯基酒石酸、二乙醯基酒石酸、二-O,O'-對-甲苯甲醯基酒石酸、苯乙醇酸、蘋果酸或樟腦-10-磺酸)形成之鹽進行分段結晶法。亦可使用對掌性吸附劑，藉由對掌性層析(例如高壓液相層析(HPLC))來拆分外消旋產物。
在某些實施例中，將式(I)或其子式之化合物製備成其個別立體異構物。在其他實施例中，藉由使式(I)或其子式之化合物之外消旋混合物與光學活性拆分劑反應，形成一對非鏡像異構物化合物，分離該等非鏡像異構物並回收光學純鏡像異構物，將該等化合物製備成其個別立體異構物。在某些實施例中，使用式(I)或其子式之化合物之共價非鏡像異構物衍生物或藉由使用可解離複合物(例如，結晶非鏡像異構物鹽)來拆分鏡像異構物。非鏡像異構物具有不同的物理性質(例如，熔點、沸點、溶解度、反應性等)且很容易利用該等差異性來分離。在某些實施例中，非鏡像異構物係藉由層析或藉由分離/拆分技術基於溶解度差異來分離。然後藉由不會引起消旋之任何實踐方式回收光學純鏡像異構物以及拆分劑。適用於自化合物之外消旋混合物拆分其立體異構物之技術的更詳細說明可參見Jean Jacques、Andre Collet、Samuel H.Wilen,「Enantiomers,Racemates and Resolutions」,John Wiley and Sons Inc.，1981。
可根據本發明獲得之異構物之混合物可以彼等熟習此項技術者已知
之方式分離成個別異構物；非鏡像異構物可藉由例如在多相溶劑混合物之間分配、重結晶及/或例如矽膠上之層析分離或藉由例如反相管柱上之中壓液相層析來分離，且外消旋物可藉由例如使用光學純之鹽形成試劑形成鹽來分離，且由此獲得之非鏡像異構物混合物可藉助例如分段結晶或光學活性管柱材料上之層析來分離。
端視起始材料及程序之選擇，本發明之化合物之某些實施例係以一種可能異構物或其混合物之形式存在，例如純光學異構物或異構物混合物，例如外消旋物及非鏡像異構物混合物，此端視不對稱碳原子之數量而定。本發明意欲包括所有該等可能的異構物，包括外消旋混合物、非鏡像異構物混合物及光學純形式。光學活性(R)-及(S)-異構物可使用對掌性合成子或對掌性試劑來製備或使用習用技術來進行拆分。若化合物含有雙鍵，則取代基可為E或Z組態。若化合物含有經二取代之環烷基，則環烷基取代基可具有順式或反式組態。本發明亦欲包括所有互變異構物形式。
可根據標準方法(例如，使用層析方法、分佈方法、(重)結晶及諸如此類)對中間體及最終產物實施處理及/或純化。本發明亦係關於以下過程之彼等形式：其中在該過程任一階段作為中間體獲得之化合物係用作起始材料並實施其餘過程步驟，或其中起始材料係在反應條件下形成或以衍生物形式(例如以受保護形式或以鹽形式)使用，或可藉由本發明方法獲得之化合物係在過程條件下產生並進一步經受原位處理。用於合成本發明化合物之所有起始材料、結構單元、試劑、酸、鹼、脫水劑、溶劑及觸媒皆市面有售，或可藉由熟習此項技術者已知之有機合成方法產生。
式(I)及其子式(式(Ia)及式(Ib))之化合物係藉由本文一般方案中所述及如實例中所闡釋之方法製得。
方案1A闡釋用於製備某些式(A1)化合物之非限制性合成方案，其中-連接體-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A1)。在方案1A中，連接體係具有末端羰基部分之任何連接體(L’)(即-L’-C(=O))。亦在方案1A中，R1係如本文所述且R4係可與硫醇、二硫化物、胺、酮、二酮、疊氮化物或炔烴反應之反應部分。方案1B闡釋用於製備某些式(A1)化合物之非限制性合成方案，其中-連接體-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A1)。在方案1B中，連接體係具有末端羰基部分之任何連接體(L’)(即-L’-C(=O))。亦在方案1B中，R1係如本文所述且R4部分具有胺基(例如羥基胺或胺)且RB係具有經保護之胺基之部分，其中Prot係保護基團，例如Boc、Fmoc及Cbz。
該醯胺鍵形成可使用熱、EDCI偶合、HATU偶合、HBTU偶合、TBTU偶合或T3P偶合完成。
方案2A闡釋用於製備某些式(A2)化合物之非限制性合成方案，其中-連接體-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A2)。在方案2A中，連接體係具有末端羰基部分之任何連接體(L’)(即-L’-C(=O))。亦在方案2A中，R1係如本文所述且R4係可與硫醇、二硫化物、胺、酮、二酮、疊氮化物或炔烴反應之反應部分。方案2B闡釋用於製備某些式(A2)化合物之非限制性合成方案，其中-連接體-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A2)。在方案2B
中，連接體係具有末端羰基部分之任何連接體(L’)(即-L’-C(=O))。亦在方案2B中，R1係如本文所述且R4部分具有胺基(例如羥基胺或胺)且RB係具有經保護之胺基之部分，其中Prot係保護基團，例如Boc、Fmoc及Cbz。
該醯胺鍵形成可使用熱、EDCI偶合、HATU偶合、HBTU偶合、TBTU偶合或T3P偶合完成。
方案3A闡釋用於製備某些式(Ia)化合物之非限制性合成方案，其中-L2-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A1)。該醯胺鍵形成可使用熱、EDCI偶合、HATU偶合、HBTU偶合、TBTU偶合或T3P偶合完成。在方案3A中，連接體(L2)包含具有末端羰基部分之連接體部分(LA)(即-LA-C(=O))。方案3B闡釋用於製備某些式(I)化合物之非限制性合成方案，其中-L2-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A1)。該醯胺鍵形成可使用熱、EDCI偶合、HATU偶合、HBTU偶合、TBTU偶合或T3P偶合完成。在方案3B中，連接體(L2)包含具有末端羰基部分之連接體部分(LA)(即-LA-C(=O))，且RB係具有經保護之胺基之部分，其中Prot係保護基團，例如Boc、Fmoc及Cbz。
方案4A闡釋用於製備某些式(Ib)化合物之非限制性合成方案，其中-L2-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A2)。該醯胺鍵形成可使用熱、EDCI偶合、HATU偶合、HBTU偶合、TBTU偶合或T3P偶合完成。在方案4A中，連接體(L2)包含具有末端羰基部分之連接體部分(LA)(即-LA-C(=O))。方案4B闡釋用於製備某些式(Ib)化合物之非限制性合成方案，其中-L2-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A2)。該醯胺鍵形成可使用熱、EDCI偶合、HATU偶合、HBTU偶合、TBTU偶合或T3P偶合完成。在方案4B中，連接體(L2)包含具有末端羰基部分之連接體部分(LA)(即-LA-C(=O))，且RB係具有經保護之胺基之部分，其中Prot係保護基團，例如Boc、Fmoc及Cbz。
方案4
在方案3及4中，
R4係、、、、、
-ONH2、-NH2、、、、、-N3、
、-NHC(=O)CH=CH2、SH、-SSR6、-S(=O)2(CH=CH2)、-(CH2)2S(=O)2(CH=CH2)、-NHS(=O)2(CH=CH2)、-NHC(=O)CH2Br、
-NHC(=O)CH2I、-C(O)NHNH2、、-CO2H、-C(O)NHNH2、
RB係-ONH-；LA係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；L2係-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、
-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
其中X1係、、或；X2係
、或；且X3係
且R1、R7、R8、R9及R10係如本文中所定義。
方案5闡釋用於製備某些式(B1)化合物之非限制性合成方案，其中-連接體-R4部分藉由中間體(int-A1)之二級胺之烷基化附接至中間體(int-A1)。在方案5中，最初將連接體(LA)經末端醛官能化(即-LA-C(=O)H)且隨後與中間體(int-A1)之二級胺反應。亦在方案5中，R1係如本文所述且
R4係可與硫醇、二硫化物、胺、酮、二酮、疊氮化物或炔烴反應之反應部分。
該N-烷基化可使用還原劑(例如NaCNBH3、NaBH4或NaBH(OAC)3)完成。
方案6闡釋用於製備某些式(B2)化合物之非限制性合成方案，其中-連接體-R4部分藉由中間體(int-A2)之二級胺之烷基化附接至中間體(int-A2)。在方案6中，最初將連接體(LA)經末端醛官能化(即-LA-C(=O)H)且隨後與中間體(int-A2)之二級胺反應。亦在方案6中，R1係如本文所述且R4係可與硫醇、二硫化物、胺、酮、二酮、疊氮化物或炔烴反應之反應部分。
該N-烷基化可使用還原劑(例如NaCNBH3、NaBH4或NaBH(OAC)3)完成。
方案7闡釋用於製備某些式(Ia)化合物之非限制性合成方案，其中-L2-R4部分藉由中間體(int-A1)之二級胺之烷基化附接至中間體(int-A1)。在方案7中，隨後使最初經末端醛官能化之連接體部分LA(即-L’-C(=O)H)
與中間體(int-A1)之二級胺反應，藉此形成連接體L2，其包含具有末端-CH2-基團之連接體部分LA。該N-烷基化可使用還原劑(例如NaCNBH3、NaBH4或NaBH(OAC)3)完成。
方案8闡釋用於製備某些式(Ib)化合物之非限制性合成方案，其中-L2-R4部分藉由中間體(int-A2)之二級胺之烷基化附接至中間體(int-A2)。在方案8中，最初使連接體部分(LA)經末端醛官能化(即-L’-C(=O)H)，隨後使其與中間體(int-A2)之二級胺反應，藉此形成連接體L2，其包含具有末端-CH2-基團之連接體部分LA。該N-烷基化可使用還原劑(例如NaCNBH3、NaBH4或NaBH(OAC)3)完成。
在方案7及8中，R4係如針對方案3及4所定義；LA係-(CH2)(n-1)-、-((CH2)(n-1)O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)(n-1)X1(CH2)n-、-(CH2)(n-1)NHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)(n-1)NHC(=O(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-或
-((CH2)(n-1)O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-或-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n；
其中X1係、、或；且R1及R7係如本文中所定義。
方案9闡釋用於製備某些式(A1)化合物之非限制性合成方案，其中-連接體-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A1)。在方案9中，連接體係具有末端羰基部分之任何連接體(L’)(即-L’-C(=O))。亦在方案9中，R1係如本文所述，R4係或，且RC係或。
該醯胺鍵形成可使用熱、EDCI偶合、HATU偶合、HBTU偶合、TBTU偶合或T3P偶合完成。
方案10闡釋用於製備某些式(A2)化合物之非限制性合成方案，其中-連接體-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A2)。在方案10中，連接體係具有末端羰基部分之任何連接體(L’)(即-L’-C(=O))。亦在方案10中，R1
係如本文所述，R4係或，且RC係或。
該醯胺鍵形成可使用熱、EDCI偶合、HATU偶合、HBTU偶合、TBTU偶合或T3P偶合完成。
方案11闡釋用於製備某些式(Ia)化合物之非限制性合成方案，其中-L2-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A1)。
在方案11中，連接體(L2)包含具有末端羰基部分之連接體部分(LA)(即-LA-C(=O))。該醯胺鍵形成可使用熱、EDCI偶合、HATU偶合、HBTU偶合、TBTU偶合或T3P偶合完成。
方案12闡釋用於製備某些式(Ib)化合物之非限制性合成方案，其中-L2-R4部分藉由醯胺鍵附接至中間體(int-A2)。
在方案12中，連接體(L2)包含具有末端羰基部分之連接體部分(LA)(即-LA-C(=O))。該醯胺鍵形成可使用熱、EDCI偶合、HATU偶合、HBTU偶
合、TBTU偶合或T3P偶合完成。
在方案11及12中，
R4係或；RC係或LA係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-；L2係-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或
-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-；其中X1係、、或
；X2係、或；且X3係
且R1及R7係如本文中所定義。
下文給出用於製備本發明之式(I)及其子式之化合物(即式(Ia)及式(Ib)之化合物)之中間體的合成：
向圓底燒瓶中裝入4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-胺(1，市售，1.0當量)、4-(溴甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲基酯(2，市售，1.0當量)、碳酸銫(1.0當量)及DMF(1.0M)。將反應混合物於室溫下攪拌18小時且隨後在真空中移除溶劑。向所得混合物中添加EtOAc並在真空中移除溶劑。向此混合物中添加DCM並在真空中移除溶劑。隨後藉由ISCO層析(0-10% MeOH：DCM，梯度)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀4-((2-胺基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲基酯(3)。
在圓底燒瓶中製備氫化鋰鋁(LAH)(1.0當量，粉末)於THF(0.3M)中之漿液，冷卻至0℃並劇烈攪拌15分鐘。向此混合物中逐份添加4-((2-胺基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯甲酸甲基酯(3,1.0當量，來自前述步驟)。移除冰浴並將反應混合物於室溫下攪拌4小時，添加額外LAH直至反應完全為止。向反應混合物中添加Et2O且隨後將混合物轉移至Erlenmeyer燒瓶並在劇烈攪拌下冷卻至0℃。隨後藉由緩慢添加飽和硫酸鈉溶液驟冷反應。獲得白色沈澱並將混合物經由含有矽藻土之釉料過濾並用THF及Et2O洗滌。隨後在真空中移除揮發性物質且物質不經進一步純化即用於下一步驟。
於0℃下向含有DCM(0.1M)中之(4-((2-胺基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]
嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苯基)甲醇(4,1.0當量，來自步驟2)之圓底燒瓶中添加亞硫醯氯(10.0當量)。隨後移除冰浴並將反應混合物於室溫下攪拌4小時。隨後將反應混合物冷卻回0℃並藉由添加NaOH(1.0M,40.0當量)及飽和NaHCO3(aq.)緩慢驟冷。將物質轉移至分液漏斗並用DCM洗滌3次。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空中移除揮發性物質。隨後在圓底燒瓶中將所得粗產物溶解於DMF(0.1M)且不經進一步純化即使用。向此物質中添加六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯(1.0當量)及Huenig鹼(1.2當量)並於室溫下攪拌18小時。隨後將反應混合物用EtOAc稀釋，轉移至分液漏斗並用飽和NaCl(aq.)2×及水2×洗滌。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空中移除揮發性物質。藉由ISCO層析(0-10% MeOH：DCM，梯度)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀4-(4-((2-胺基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯(5)。
向圓底燒瓶中裝入4-(4-((2-胺基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯(5,1.0當量，來自步驟3)、市售戊基胺(6,3.0當量)、Huenig鹼(5.0當量)及DMSO(0.5M)。將反應混合物加熱至120℃並攪拌18小時。隨後將反應混合物冷卻至室溫並添加水。隨後冷凍此混合物且藉由凍乾移除大多數揮發性物質。藉由ISCO層析(0-10% MeOH(MeOH含有0.7N NH3)：DCM，梯度)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯(7)。
於0℃下向圓底燒瓶中之4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯(6,1.0當量，來自步驟4)於DCM(0.1M)中之溶液中添加二噁烷中之HCl(4.0M,20.0當量)。隨後移除冰浴並將反應混合物於室溫下攪拌3小時。隨後向反應混合物中添加MeOH中之NH3(0.7N)並在真空中移除揮發性物質。再重複兩次添加MeOH中之NH3(0.7N)及在真空中移除揮發性物質。隨後藉由ISCO層析(0-20% MeOH(MeOH含有0.7N NH3)：DCM，梯度)純化粗製反應混合物，以提供固體狀5-(2-甲氧基-4-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.37(d,1H),7.10(s,1H),6.91(d,1H),6.74(d,1H),6.22(d,1H),5.52(s,2H),3.92(s,3H),3.61(s,2H),3.54(t,2H),3.35(s,3H),3.22(m,4H),2.69(m,4H),1.51(m,2H),1.30(m,2H),1.18(m,2H),0.89(s,3H)。LRMS[M+H]=438.3。
向圓底燒瓶中裝入4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2-胺(1，市售，1.0當量)、3-(溴甲基)-4-甲氧基苯甲酸乙基酯(8，市售，1.0當量)、碳酸銫(1.0當量)及DMF(1.0M)。將反應混合物於室溫下攪拌18小時。隨後在真空中移除溶劑。向所得混合物中添加EtOAc並在真空中移除溶劑。向此混合物中添加DCM並在真空中移除溶劑。隨後藉由ISCO層析(0-10% MeOH：DCM，梯度)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀3-((2-胺基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苯甲酸乙基酯(9)。
在圓底燒瓶中製備LAH(1.0當量，粉末)於THF(0.3M)中之漿液，冷卻至0℃並劇烈攪拌15分鐘。向此混合物中逐份添加3-((2-胺基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苯甲酸乙基酯(9,1.0當量，來自步驟1)。隨後移除冰浴並將反應混合物於室溫下攪拌4小時(若直至此時反應不完全，則添加額外LAH並繼續攪拌直至反應完全)。隨後使用Et2O將反應
混合物轉移至Erlenmeyer燒瓶。將混合物冷卻至0℃並劇烈攪拌。隨後藉由緩慢添加飽和硫酸鈉溶液驟冷反應。獲得白色沈澱並將混合物經由含有矽藻土之釉料過濾並用THF及Et2O洗滌。隨後在真空中移除揮發性物質且物質不經進一步純化即用於下一步驟。
於0℃下向含有DCM(0.1M)中之(3-((2-胺基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苯基)甲醇(10,1.0當量，來自步驟2)之圓底燒瓶中添加亞硫醯氯(10.0當量)。隨後移除冰浴並將反應混合物於室溫下攪拌4小時。隨後將反應混合物冷卻至0℃並藉由添加NaOH(1.0M,40.0當量)及飽和NaHCO3(aq.)緩慢驟冷。將物質轉移至分液漏斗並用DCM洗滌3次。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空中移除揮發性物質。隨後在圓底燒瓶中將所得粗產物溶解於DMF(0.1M)且不經進一步純化即使用。向此物質中添加六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯(1.0當量)及Huenig鹼(1.2當量)並於室溫下攪拌18小時。隨後將反應混合物用EtOAc稀釋，轉移至分液漏斗並用飽和NaCl(aq.)2×及水2×洗滌。將合併之有機層經硫酸鈉乾燥，過濾並在真空中移除揮發性物質。藉由ISCO層析(0-10% MeOH：DCM，梯度)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀4-(3-((2-胺基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯(11)。
向圓底燒瓶中裝入4-(3-((2-胺基-4-氯-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯(11,1.0當量，來自步驟
3)、市售(S)-2-胺基己-1-醇(3.0當量)、Huenig鹼(5.0當量)及DMSO(0.5M)。將反應混合物加熱至120℃並攪拌18小時。隨後將反應混合物冷卻至室溫並添加水。隨後冷凍此混合物且藉由凍乾移除大多數揮發性物質。藉由ISCO層析(0-10% MeOH(MeOH含有0.7N NH3)：DCM，梯度)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀(S)-4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯(12)。
於0℃下向圓底燒瓶中之(S)-4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯(12,1.0當量，來自步驟4)於DCM(0.1M)於中之溶液中添加二噁烷中之HCl(4.0M,20.0當量)。隨後移除冰浴並將反應混合物於室溫下攪拌3小時。隨後向反應混合物中添加MeOH中之NH3(0.7N)並在真空中移除揮發性物質。再重複兩次添加MeOH中之NH3(0.7N)及在真空中移除揮發性物質。隨後藉由ISCO層析(0-20% MeOH(MeOH含有0.7N NH3)：DCM，梯度)純化粗製反應混合物，以提供固體狀(S)-2-((2-胺基-5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-基)胺基)己-1-醇(Int-2)：1H(CD3OD)：δ 7.50(d,1H),7.29(d,1H),7.09(d,1H),6.63(s,1H),6.29(d,1H),5.69(d,1H),5.40(d,1H),4.34(m,1H),3.95(s,3H),3.51(m,2H),3.42(s,2H),3.12(m,4H),2.56(m,2H),1.48(m,1H),1.21(m,3H),0.96(m,2H),0.83(t,3H)。LRMS[M+H]=468.3。
5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-3)係根據(S)-2-((2-胺基-5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-基)胺基)己-1-醇(Int-2)之合成製備，只是在步驟4中使用市售N-戊基胺代替(S)-2-胺基己-1-醇。1H NMR(CD3OD)：δ 7.42(d,1H),7.32(d,1H),7.09(d,1H),6.70(s,1H),6.25(d,1H),5.54(d,2H),3.92(s,3H),3.52(t,2H),3.46(s,2H),3.14(m,4H),2.60(m,4H),1.48(m,2H),1.30(m,2H),1.13(m,2H),0.88(t,3H)。LRMS[M+H]=438.3。
本發明之抗體共軛物包含TLR7促效劑且具有式(II)之結構：
其中：
R50係或，其中*指示
與Ab之附接點；Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；R40係、、、、、、-S-、-NHC(=O)CH2-、-S(=O)2CH2CH2-、-(CH2)2S(=O)2CH2CH2-、
-NHS(=O)2CH2CH2、-NHC(=O)CH2CH2-、-CH2NHCH2CH2-、-NHCH2CH2-、、、、
X1係、、或；
X2係、、或；
X3係、、、
每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；R12係H、甲基或苯基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
在其他所列舉實施例之以下清單中提供本發明之化合物之某些態樣及實例。應認識到，在每一實施例中所指定之特徵可與其他指定特徵組合以提供本發明之其他實施例。
實施例58. 式(II)之抗體共軛物，其中：
R50係或、其中*指示與Ab之附接點；Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、
-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R40係、、、、、、、-S-、-NHC(=O)CH2-、-S(=O)2CH2CH2-、-(CH2)2S(=O)2CH2CH2-、-NHS(=O)2CH2CH2、-NHC(=O)CH2CH2-、-CH2NHCH2CH2-、-NHCH2CH2-、
X1係、、或；X2係、或；
X3係、或；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經
-C(=O)OH取代之C1-4烷基；R12係H、甲基或苯基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
實施例59. 具有式(IIa)或式(IIb)之結構之式(II)之抗體共軛物及其醫藥上可接受之鹽：
其中：Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、
-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R40係、、、、、、-S-、-NHC(=O)CH2-、-S(=O)2CH2CH2-、-(CH2)2S(=O)2CH2CH2-、-NHS(=O)2CH2CH2、-NHC(=O)CH2CH2-、-CH2MHCH2CH2-、
-NHCH2CH2-、、、、
X1係、、或；
X2係、、或；
X3係、、、
或；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；
每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；R12係H、甲基或苯基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
實施例60. 式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物及其醫藥上可接受之鹽，其中：Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、
-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R40係、、、、、、-S-、-NHC(=O)CH2-、-S(=O)2CH2CH2-、-(CH2)2S(=O)2CH2CH2-、-NHS(O)2CH2CH2、-NHC(=O)CH2CH2-、-CH2NHCH2CH2-、
-NHCH2CH2-、、、、
X1係、、或；
X2係、或；
X3係、或；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一R8皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl及-OH；每一R9皆獨立地選自H、C1-C6烷基、F、Cl、-NH2、-OCH3、-OCH2CH3、
-N(CH3)2、-CN、-NO2及-OH；每一R10皆獨立地選自H、C1-6烷基、氟、經-C(=O)OH取代之苄基氧基、經-C(=O)OH取代之苄基、經-C(=O)OH取代之C1-4烷氧基及經-C(=O)OH取代之C1-4烷基；R12係H、甲基或苯基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
實施例61. 具有式(IIa)或式(IIb)之結構之式(II)之抗體共軛物及其醫藥上可接受之鹽：
其中：Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C3-C6烷基或-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、
-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R40係、、、、、或-S-；
X1係、、或；
X2係、或；
X3係、或；每一R7皆獨立地選自H及C1-C6烷基；每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
實施例62. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2或-NHCHR2R3；R2係-C4-C6烷基；R3係L1OH；L1係-(CH2)m-；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R40係、、、、、或；
X1係；X2係或；X3係；
每一m皆獨立地選自1、2、3及4；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
實施例63. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n；
R40係、、、或；
X1係；X2係或；X3係
每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
實施例64. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-；
R40係、、或；
X1係；X2係或；X3係；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
實施例65. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；L2係-(CH2)n-或-C(=O)(CH2)n；
R40係、、或；且每一n皆獨立地選自1、2、3及4，且y係1至16之整數。
實施例66. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：Ab係特異性結合至人類HER2之抗體或其抗原結合片段；R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；
L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-或-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-；
R40係；
X1係；X2係或；X3係；每一n皆獨立地選自1、2、3及4；每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18，且y係1至16之整數。
實施例67. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：R1係-NHR2。
實施例68. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：R1係-NHCHR2R3。
實施例69. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：R2係-C4烷基。
實施例70. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：R2係-C5烷基。
實施例71. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：R2係-C6烷基。
實施例72. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：R3係L1OH；
實施例73. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：L1係-(CH2)-；
實施例74. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：L1係-(CH2CH2)-；
實施例75. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：L2係-(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)n-、-(CH2)nX1(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-(CH2)nNHC(=O(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n。
實施例76. 式(I)、式(Ia)或式(Ib)之化合物，其中：L2係-C(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-、-C(=O)((CH2)nO)t(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-、-C(=O)NH((CH2)nO)t(CH2)nX1(CH2)n-、-C(=O)X2X3C(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-C(=O)(CH2)nC(=O)NH(CH2)n-。
實施例77. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：L2係-(CH2)n-或-C(=O)(CH2)n-。
實施例78. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：L2係-C(=O)X2X3C(=O)(CH2)n-、
-C(=O)X2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2-、-C(=O)(CH2)nC(R7)2SS(CH2)nNHC(=O)(CH2)n-或-(CH2)nX2C(=O)(CH2)nNHC(=O)((CH2)nO)t(CH2)n-。
實施例79. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
R40係、、、、、或S。
實施例80 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
R40係、、或。
實施例81. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：R40係
實施例82. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
R40係、或-S-。
實施例83. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
R40係。
實施例84. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
R40係。
實施例85. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
R40係、、
實施例86. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X1係、、或。
實施例87. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X1係或。
實施例88. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：X1係。
實施例89. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X2係、或。
實施例90. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X2係或。
實施例91. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X2係。
實施例92. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X2係。
實施例93. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X2係。
實施例94. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X3係、或。
實施例95. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X3係。
實施例96. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：X3係。
實施例97. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X3係。
實施例98. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：
X3係。
實施例99. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：每一m皆獨立地選自1、2、3及4。
實施例100. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：每一m皆係1或2。
實施例101. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：每一n皆獨立地選自1、2、3及4。
實施例102. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：每一n皆係
2或3。
實施例103. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17及18。
實施例104. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中：每一t皆獨立地選自1、2、3、4、5及6。
實施例105. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中y係1至16之整數。
實施例106. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中y係1至8之整數。
實施例107. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其中y係1至4之整數。
實施例108. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其選自：
其中y係1至4之整數且Ab係抗HER2抗體或其抗原結合片段。
實施例109. 式(II)、式(IIa)或式(IIb)之抗體共軛物，其選自：
亦提供用於評估本發明之抗體共軛物之分析方法之一些態樣的方案。該等分析方法及結果可展現，該等共軛物具有有利之性質，例如使得其更易於製造、更易於投與患者、對於患者更有效及/或潛在更安全之性質。一個實例係藉由粒徑篩析層析(SEC)測定分子大小，其中試樣中之期望抗體物種之量係相對於試樣中存在之高分子量污染物(例如，二聚體、多聚體或聚集抗體)或低分子量污染物(例如，抗體片段、降解產物或個別抗體鏈)測定。一般而言，期望具有較高量之單體且由於(例如)聚集物對抗體試樣之其他性質(例如但不限於清除率、免疫原性及毒性)之影響期望具有較低量之(例如)聚集抗體。又一實例係藉由疏水相互作用層析(HIC)測定疏水性，其中試樣之疏水性係相對於一組具有已知性質之標準抗體評價。一般而言，由於疏水性對抗體試樣之其他性質(例如但不限於聚集、隨時間聚集、黏附至表面、肝毒性、清除率及藥物動力學暴露)之影響，期望具有低疏水性。參見Damle,N.K.,Nat Biotechnol.2008；26(8)：884-885；Singh,S.K.,Pharm Res.2015；32(11)：3541-71。在藉由疏水相互作用層析量測時，較高疏水性指數評分(即自HIC管柱溶析較快)反應共軛物之疏水性較低。如實例70及表3中所示，大多數測試抗體共軛物顯示大於0.8之疏水性指數。在一些實施例中，提供如藉由疏水相互作用層析測定之疏水性指數為0.8或更大之抗體共軛物。
本文提供之抗體共軛物包括特異性結合至人類HER2之抗體或其抗體片段(例如，抗原結合片段)(抗HER2抗體)。在許多癌症類型中觀察到HER2過表現，例如胃癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、膀胱癌、胰臟癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤、神經胚細胞瘤或頭頸癌。包含抗HER2抗體之抗體共軛物可特異性靶向HER2陽性癌症或腫瘤。
在一些實施例中，本文提供之抗體共軛物包括特異性結合至人類HER2之單株抗體或其抗體片段，例如人類或人類化抗HER2單株抗體。在一些實施例中，特異性結合至人類HER2之抗體或其抗體片段可選自曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、馬格土希單抗(margetuximab)或HT-19、或其抗體片段或其位點特異性半胱胺酸突變體。
曲妥珠單抗(商標名賀癌平或Herclon)係結合至HER2受體之細胞外結構域之近膜部分的人類化單株抗體(Hudis CA,N Engl J Med.2007；357(1)：39-51)。曲妥珠單抗重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列闡述於美國專利第5,821,337號中。曲妥珠單抗與由人類HER2之殘基557-561、570-573及593-603形成之三個環區相互作用(Cho等人，Nature 421：756-760,2003)。曲妥珠單抗可能藉由防止HER2-受體二聚化、促進HER2受體之內吞破壞、抑制細胞外結構域之脫落干擾HER2信號傳導(Hudis CA,N Engl J Med.2007；357(1)：39-51)。抗HER2抗體之另一重要作用機制係介導抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)。在ADCC中，抗HER2抗體結合至腫瘤細胞且隨後經由Fcγ受體(FcγR)相互作用招募免疫細胞(例如巨噬細胞)。曲妥珠單抗具有保守人類IgG Fc區，且能招募負責抗體依賴性細胞毒性之免疫效
應細胞(Hudis CA,N Engl J Med.2007；357(1)：39-51)。曲妥珠單抗於1998年9月獲得美國FDA批准用於治療腫瘤過表現HER2且針對其轉移性疾病接受一或多個化學療法方案之患者的轉移性乳癌。
帕妥珠單抗(亦稱作2C4、奧密塔克(Omnitarg)、Perjeta(賀疾妥))係結合至HER2受體之細胞外結構域且抑制HER2與其他HER受體之二聚化的人類化單株抗體。帕妥珠單抗重鏈及輕鏈之胺基酸序列闡述於美國專利第7,560,111號中。帕妥珠單抗主要與人類HER2之區245-333之殘基、尤其殘基His 245、Val 286、Ser 288、Leu 295、His 296或Lys 311相互作用(Franklin等人，Cancer Cell 5：317-328,2004)。顯示帕妥珠單抗較曲妥珠單抗在破壞在乳房及前列腺癌細胞系中形成HER1-HER2及HER3-HER2複合物方面更有效(Agus等人，J Clin Oncol.2005；23(11)：2534-43.Epub，2005年2月7日)。帕妥珠單抗之效能無需抗體依賴性細胞毒性，此乃因其活性無需完整Fc區(Agus等人，J Clin Oncol.2005；23(11)：2534-43.Epub，2005年2月7日)。於2012年6月，帕妥珠單抗接受美國FDA批准與曲妥珠單抗及多西他賽(docetaxel)組合用於治療具有HER2陽性轉移性乳癌之患者，其尚未接受抗HER2療法或化學療法用於轉移性疾病。
馬格土希單抗(亦稱作MGAH22)係另一抗HER2單株抗體(殘基http：//www.macrogenics.com/products-margetuximab.html)。馬格土希單抗之Fc區經最佳化，以使其與免疫效應細胞上之活化FcγR之結合增加，但與抑制性FcγR之結合減少。馬格土希單抗目前係在臨床試驗下用於治療具有復發或難治性晚期乳癌之患者，該等患者之腫瘤藉由免疫組織化學以2+水準表現HER2，且藉由FISH缺乏HER2基因擴增之證據。
HT-19係另一抗HER2單株抗體，其結合至人類HER2中不同於曲妥珠
單抗或帕妥珠單抗之表位之表位且顯示與曲妥珠單抗相當地抑制HER2信號傳導且與曲妥珠單抗及帕妥珠單抗組合可增強HER2降解(Bergstrom D.A.等人，Cancer Res.2015；75：LB-231)。
其他適宜抗HER2單株抗體包括(但不限於)以下美國專利中所述之抗HER2抗體：第9,096,877號；第9,017,671號；第8,975,382號；第8,974,785號；第8,968,730號；第8,937,159號；第8,840,896號；第8,802,093號；第8,753,829號；第8,741,586號；第8,722,362號；第8,697,071號；第8,652,474號；第8,652,466號；第8,609,095號；第8,512,967號；第8,349,585號；第8,241,630號；第8,217,147號；第8,192,737號；第7,879,325號；第7,850,966號；第7,560,111號；第7,435,797號；第7,306,801號；第6,399,063號；第6,387,371號；第6,165,464號；第5,772,997號；第5,770,195號；第5,725,856號；第5,720,954號；第5,677,171號。
在一些實施例中，抗HER2抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)包含具有表1中所述之任何VH結構域之胺基酸序列的VH結構域。其他適宜抗HER2抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)可包括經突變、但在VH結構域中與表1中所述之序列中繪示之VH區具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%一致性的胺基酸。在某些實施例中，本發明亦提供特異性結合至HER2之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)，其中抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)包含具有表1中所列舉之VH CDR中之任一者之胺基酸序列的VH CDR。在特定實施例中，本發明提供特異性結合至HER2之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)，其包含1個、2個、3個、4個、5個或更多個具有表1中所列舉之VH CDR中之任一者之胺基酸序列的VH CDR(或另一選擇為，由其組成)。
在一些實施例中，抗HER2抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)包含具有表1中所述之任何VL結構域之胺基酸序列的VL結構域。其他適宜抗HER2抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)可包括已經發生突變、但在VL結構域中與表1中所述之序列中繪示之VL區具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%一致性的胺基酸。本發明亦提供特異性結合至HER2之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)，抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)包含具有表1中所列舉之VL CDR中之任一者之胺基酸序列的VL CDR。具體而言，本發明提供特異性結合至HER2之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)，其包含1個、2個、3個或更多個具有表1中所列舉之VL CDR中之任一者之胺基酸序列的VL CDR(或另一選擇為，由其組成)。
本文揭示之其他抗HER2抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)包括已發生突變但在CDR區中與表1中所述序列中繪示之CDR區具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%一致性之胺基酸。在一些實施例中，其包括突變體胺基酸序列，其中與表1中所述序列中繪示之CDR區相比，在CDR區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸發生突變。
本文亦提供編碼特異性結合至HER2之抗體及其抗原結合片段之
VH、VL、全長重鏈及全長輕鏈的核酸序列，例如，表1中之核酸序列。該等核酸序列可經最佳化用於哺乳動物細胞中之表現。
本文揭示之其他抗HER2抗體包括其中胺基酸或編碼胺基酸之核酸已經發生突變、但與表1中所述之序列具有至少80、85、90、95、96、97、98或99%一致性之彼等。在一些實施例中，抗體或其抗原結合片段包括突變胺基酸序列，其中在與表1中所述之序列中繪示之可變區比較時，在可變區中不超過1、2、3、4或5個胺基酸發生突變，同時實質上保留相同治療活性。
由於所提供每一抗體皆結合至HER2，故可「混合並匹配」VH、VL、全長輕鏈及全長重鏈序列(胺基酸序列及編碼胺基酸序列之核苷酸序列)以產生本文揭示之其他HER2結合抗體。可使用業內已知之結合分析(例如，ELISA、實例中所述之分析)測試該等「混合並匹配」之HER2結合抗體。在混合並匹配鏈時，來自特定VH/VL配對之VH序列應替代為結構類似之VH序列。來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長重鏈序列應替代為結構類似之全長重鏈序列。來自特定VH/VL配對之VL序列應替代為結構類似之VL序列。來自特定全長重鏈/全長輕鏈配對之全長輕鏈序列應替代為結構類似之全長輕鏈序列。
因此，在一個實施例中，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合區，其具有：包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈可變區；其中抗體特異性結合至HER2。在另一實施例中，本發明提供(i)經分離單株抗體，其具有：包含SEQ ID NO：9、21、23、30或32中之任一者之胺基酸序列之全長重鏈；及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之全長輕鏈；或(ii)包含其抗原結合部分之功能蛋白。
在另一實施例中，本發明提供包含如表1中所述之重鏈CDR1、CDR2及CDR3及輕鏈CDR1、CDR2及CDR3或其組合的HER2結合抗體。抗體之VH CDR1之胺基酸序列示於SEQ ID NO：1、4及6中。抗體之VH CDR2之胺基酸序列示於SEQ ID NO：2及5中。抗體之VH CDR3之胺基酸序列示於SEQ ID NO：3中。抗體之VL CDR1之胺基酸序列示於SEQ ID NO：11及14中。抗體之VL CDR2之胺基酸序列示於SEQ ID NO12及15中。抗體之VL CDR3之胺基酸序列示於SEQ ID NO：13及16中。
鑒於該等抗體中之每一者皆結合HER2且抗原結合特異性主要係由CDR1、CDR2及CDR3區提供，可「混合並匹配」VH CDR1、CDR2及CDR3序列以及VL CDR1、CDR2及CDR3序列(即可混合並匹配來自不同抗體之CDR，但每一抗體必須含有VH CDR1、CDR2及CDR3及VL CDR1、CDR2及CDR3)，以產生本文所揭示之其他HER2結合結合分子。可使用業內已知之結合分析及闡述於實例中之彼等(例如ELISA)測試該等「混合並匹配」之HER2結合抗體。在混合並匹配VH CDR序列時，來自特定VH序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應替代為結構類似之CDR序列。同樣，在混合並匹配VL CDR序列時，來自特定VL序列之CDR1、CDR2及/或CDR3序列應替代為結構類似之CDR序列。熟習此項技術者將易於明瞭，可藉由使用來自本文針對本發明單株抗體展示之CDR序列之結構類似之序列取代一或多個VH及/或VL CDR區序列來產生新穎VH及VL序列。
因此，本發明提供經分離單株抗體或其抗原結合區，其包括包含選自由SEQ ID NO：1、4及6組成之群之胺基酸序列之重鏈CDR1；包含選自由SEQ ID NO：2及5組成之群之胺基酸序列之重鏈CDR2；包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈CDR3；包含選自由SEQ ID NO：11及14組成之群之胺
基酸序列之輕鏈CDR1；包含選自由SEQ ID NO：12及15組成之群之胺基酸序列之輕鏈CDR2；及包含選自由SEQ ID NO：13及16組成之群之胺基酸序列之輕鏈CDR3；其中抗體特異性結合HER2。
在某些實施例中，特異性結合至HER2之抗體係表1中所闡述之抗體或抗體片段(例如抗原結合片段)。
在一些實施例中，特異性結合至人類HER2之抗體包括包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HCDR1)；包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈互補決定區2(HCDR2)；包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈互補決定區3(HCDR3)；包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LCDR1)；包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2(LCDR2)；及包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3(LCDR3)。
在一些實施例中，特異性結合至人類HER2之抗體包括包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HCDR1；包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HCDR2；包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HCDR3；包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之LCDR1；包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之LCDR2；及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之LCDR3。
在一些實施例中，特異性結合至人類HER2之抗體包括包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈可變區。
在一些實施例中，特異性結合至人類HER2之抗體包括包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈。
在一些實施例中，特異性結合至人類HER2之抗體包括包含SEQ ID
NO：21之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈。
在一些實施例中，特異性結合至人類HER2之抗體包括包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈。
在一些實施例中，特異性結合至人類HER2之抗體包括包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈。
在一些實施例中，特異性結合至人類HER2之抗體包括包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈。
在一些實施例中，本發明提供特異性結合人類HER2中之表位之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)。在一些實施例中，本發明提供特異性結合至人類HER2中之表位之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)，其中表位包含SEQ ID NO：26之殘基557-561、570-573及593-603中之一或多者。在一些實施例中，本發明提供特異性結合至人類HER2中之表位之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)，其中表位包含SEQ ID NO：26之殘基245-333中之一或多者。在一些實施例中，本發明提供特異性結合至人類HER2中之表位之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)，其中表位包含SEQ ID NO：26之以下殘基中之一或多者：His 245、Val 286、Ser 288、Leu 295、His 296或Lys 311。
一旦測定抗原上之期望表位，可(例如)使用本發明中所述之技術生成針對該表位之抗體。或者，在發現過程期間，抗體之生成及表徵可闡明關於合意表位之資訊。根據此資訊，則可競爭性篩選結合至相同表位之抗體。達成此之方法係執行交叉競爭研究以發現彼此競爭性結合之抗體，例如，抗體競爭結合至抗原。基於抗體之交叉競爭「分揀」抗體之高通量方法闡述於國際專利申請案第WO 2003/48731號中。如由熟習此項技術者所瞭
解，實際上，抗體可特異性結合之任何事情可為表位。表位可包含抗體結合之彼等殘基。
本文揭示之抗體及抗體共軛物可包含經修飾抗體或其抗原結合片段，其包含對VH及/或VL內之框架殘基之修飾，以(例如)改良抗體/抗體共軛物之性質。
在一些實施例中，進行框架修飾以降低抗體之免疫原性。舉例而言，一種方式係將一或多個框架殘基「回復突變(back-mutate)」成相應之種系序列。該等殘基可藉由比較抗體框架序列與衍生出該抗體之種系序列來鑑別。為使框架區序列與期望種系構形「匹配」，可藉由(例如)定點誘變使殘基「回復突變」成相應種系序列。該等「回復突變」抗體亦意欲由本發明所涵蓋。
另一類型之框架修飾涉及使框架區或甚至一或多個CDR區內之一或多個殘基突變，以移除T細胞表位，由此降低抗體之潛在免疫原性。此方式亦稱為「去免疫化」且另外詳細闡述於Carr等人之美國專利公開案第20030153043號中。
除在框架或CDR區內進行之修飾外或另一選擇，本文揭示之抗體可經改造以包括Fc區內之修飾，通常改變抗體之一或多種功能性質，例如血清半衰期、補體固定、Fc受體結合及/或抗原依賴性細胞毒性。
此外，本文揭示之抗體可經化學修飾(例如可將一或多個化學部分附接至該抗體)或經修飾以改變其醣基化，以再次改變抗體之一或多種功能性質。該等實施例中之每一者另外詳細闡述於下文中。
在一個實施例中，CH1之鉸鏈區經修飾以改變(例如增加或減少)鉸鏈
區中之半胱胺酸殘基數。此方式另外闡述於Bodmer等人之美國專利第5,677,425號中。改變CH1鉸鏈區中之半胱胺酸殘基數以(例如)促進輕鏈及重鏈之組裝或增加或降低抗體之穩定性。
在一些實施例中，可用於本文揭示之抗體共軛物中之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)包括經修飾或經改造之抗體，例如經修飾以引入一或多個半胱胺酸殘基作為與藥物部分共軛之位點的抗體(Junutula JR等人：Nat Biotechnol 2008,26：925-932)。在一個實施例中，本發明提供包含在本文所述位置處用半胱胺酸取代一或多個胺基酸的經修飾抗體或其抗體片段。半胱胺酸取代位點係在抗體之恆定區中且因此適用於多種抗體，且位點經選擇以提供穩定且均質共軛物。經修飾抗體或片段可具有兩個或更多個半胱胺酸取代，且該等取代可與如本文所述之其他抗體修飾及共軛方法組合使用。在抗體之特定位置插入半胱胺酸之方法為業內已知，參見(例如)Lyons等人，(1990)Protein Eng.,3：703-708、WO 2011/005481、WO2014/124316、WO 2015/138615。在某些實施例中，經修飾抗體或抗體片段包含在抗體或抗體片段之重鏈之選自以下之位置在其恆定區上用半胱胺酸取代一或多個胺基酸：117、119、121、124、139、152、153、155、157、164、169、171、174、189、205、207、246、258、269、274、286、288、290、292、293、320、322、326、333、334、335、337、344、355、360、375、382、390、392、398、400及422，且其中該等位置係根據EU系統編號。在一些實施例中，經修飾抗體或抗體片段包含在抗體或抗體片段之輕鏈之選自以下之位置在其恆定區上用半胱胺酸取代一或多個胺基酸：107、108、109、114、129、142、143、145、152、154、156、159、161、165、168、169、170、182、183、197、199及203，其中該等位置
係根據EU系統編號，且其中輕鏈係人類κ輕鏈。在某些實施例中，經修飾抗體或其抗體片段包含在其恆定區中用半胱胺酸取代兩個或更多個胺基酸之組合，其中組合包含抗體重鏈之位置375、抗體重鏈之位置152、抗體重鏈之位置360或抗體輕鏈之位置107之取代，且其中該等位置係根據EU系統編號。在某些實施例中，經修飾抗體或其抗體片段包含在其恆定區上用半胱胺酸取代一個胺基酸，其中取代係抗體重鏈之位置375、抗體重鏈之位置152、抗體重鏈之位置360、抗體輕鏈之位置107、抗體輕鏈之位置165或抗體輕鏈之位置159，且其中該等位置係根據EU系統編號，且其中輕鏈係κ鏈。
在特定實施例中，經修飾抗體或其抗體片段包含在其恆定區上用半胱胺酸取代兩個胺基酸之組合，其中經修飾抗體或其抗體片段包含抗體重鏈之位置152及375之半胱胺酸，其中該等位置係根據EU系統編號。
在其他特定實施例中，經修飾抗體或其抗體片段包含在抗體重鏈之位置360用半胱胺酸取代一個胺基酸，且其中該等位置係根據EU系統編號。
在其他特定實施例中，經修飾抗體或其抗體片段包含在抗體輕鏈之位置107用半胱胺酸取代一個胺基酸，且其中該等位置係根據EU系統編號，且其中輕鏈係κ鏈。
在其他實施例中，可用於本文揭示之抗體共軛物中之抗體或抗體片段(例如，抗原結合片段)包括經修飾或經改造抗體，例如經修飾以引入一或多個其他反應性胺基酸(除半胱胺酸外)(包括Pcl、吡咯離胺酸)、肽標籤(例如S6、A1及ybbR標籤)及非天然胺基酸代替天然序列之至少一個胺基酸、由此提供抗體或抗原結合片段上與式(I)或其子式之藥物部分共軛之反應位點的抗體。舉例而言，抗體或抗體片段可經修飾以納入Pcl或吡咯離胺酸
(W.Ou等人(2011)PNAS 108(26),10437-10442；WO2014124258)或非天然胺基酸(J.Y.Axup等人Proc Natl Acad Sci U S A,109(2012)，第16101-16106頁；關於綜述，參見C.C.Liu及P.G.Schultz(2010)Annu Rev Biochem 79,413-444；C.H.Kim，等人，(2013)Curr Opin Chem Biol.17,412-419)作為與藥物共軛之位點。類似地，可向抗體中引入用於酶共軛方法之肽標籤(Strop P.等人Chem Biol.2013,20(2)：161-7；Rabuka D.,Curr Opin Chem Biol.2010 Dec；14(6)：790-6；Rabuka D等人，Nat Protoc.2012,7(6)：1052-67)。一種其他實例係使用4’-磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)用於輔酶A類似物之共軛(WO2013184514)。使該等經修飾或經改造之抗體與酬載或連接體-酬載組合共軛之方法為業內已知。
在另一實施例中，抗體之Fc鉸鏈區經突變以縮短抗體之生物半衰期。更特定而言，將一或多個胺基酸突變引入Fc-鉸鏈片段之CH2-CH3結構域界面區中，使得該抗體具有相對於天然Fc-鉸鏈結構域SpA結合受損的葡萄球菌蛋白A(SpA)結合。此方式另外詳細闡述於Ward等人之美國專利第6,165,745號中。
在其他實施例中，藉由用不同胺基酸殘基替代至少一個胺基酸殘基來改變Fc區以改變抗體之效應物功能。舉例而言，可用不同胺基酸殘基來替代一或多個胺基酸，使得抗體具有對效應物配體經改變之親和力但保留親代抗體之抗原結合能力。對其親和力改變之效應物配體可係(例如)Fc受體或補體之C1組份。此方式闡述於(例如)Winter等人之美國專利第5,624,821號及第5,648,260號中。
在另一實施例中，可用不同胺基酸殘基替代選自胺基酸殘基之一或多個胺基酸，使得抗體具有經改變之C1q結合及/或降低或消除補體依賴性細
胞毒性(CDC)。此方式闡述於(例如)Idusogie等人之美國專利第6,194,551號中。
在另一實施例中，改變一或多個胺基酸殘基以由此改變抗體固定補體之能力。此方式闡述於(例如)Bodmer等人之PCT公開案WO 94/29351中。異型胺基酸殘基包括(但不限於)IgG1、IgG2及IgG3亞類之重鏈之恆定區以及κ同型之輕鏈之恆定區，如Jefferis等人，MAbs.1：332-338(2009)所述。
在另一實施例中，(例如)藉由修飾一或多個胺基酸殘基以增加抗體對活化Fcγ受體之親和力或降低抗體對一致性Fcγ受體之親和力，Fc區經修飾以增加抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)之能力。人類活化Fcγ受體包括FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIIa及FcγRIIIb，且人類抑制性Fcγ受體包括FcγRIIb。此方式闡述於(例如)Presta之PCT公開案WO 00/42072中。另外，已定位人類IgG1上針對FcγR1、FcγRII、FcγRIII及FcRn之結合位點，且已闡述具有經改良結合之變體(參見Shields等人，J.Biol.Chem.276：6591-6604,2001)。已闡述單株抗體之Fc介導之效應物功能(例如增加之ADCC/ADCP功能)之最佳化(參見Strohl,W.R.,Current Opinion in Biotechnology 2009；20：685-691)。在一些實施例中，抗體共軛物包括包含賦予增強之ADCC/ADCP功能之突變或突變組合(例如一或多個選自以下之突變：G236A、S239D、F243L、P247I、D280H、K290S、R292P、S298A、S298D、S298V、Y300L、V305I、A330L、I332E、E333A、K334A、A339D、A339Q、A339T、P396L(所有位置皆係藉由EU編號))的免疫球蛋白重鏈。
在另一實施例中，藉由(例如)修飾一或多個胺基酸以增加抗體對通常不可識別親代抗體之活化受體(例如FcαRI)之親和力，Fc區經修飾以增加抗
體介導ADCC及/或ADCP之能力。此方式闡述於(例如)Borrok等人，mAbs.7(4)：743-751中。在特定實施例中，抗體共軛物包括包含賦予增強之ADCC及/或ADCP功能之一或多個抗體序列之突變或融合的免疫球蛋白重鏈。
在再一實施例中，修飾抗體之醣基化。舉例而言，可製備無醣基化之抗體(亦即，抗體缺乏醣基化)。可改變醣基化以(例如)增加抗體對「抗原」之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)改變抗體序列內之一或多個醣基化位點來完成。舉例而言，可進行一或多個胺基酸取代以消除一或多個可變區框架醣基化位點，由此消除該位點之醣基化。該無醣基化可增加抗體對抗原之親和力。此一方式闡述於(例如)Co等人之美國專利第5,714,350號及第6,350,861號中。
另外或另一選擇為，可製備具有經改變醣基化類型之抗體，例如具有降低量之岩藻糖基殘基之低岩藻糖基化抗體或具有增加之二等分GlcNac結構的抗體。已證實，該等經改變醣基化模式增加抗體之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由(例如)在具有經改變之醣基化機構之宿主細胞中表現抗體來完成。業內已闡述具有經改變醣基化機構之細胞且其可用作宿主細胞，該等宿主細胞可表現本發明之重組抗體，由此產生具有經改變醣基化之抗體。舉例而言，Hang等人之EP 1,176,195闡述具有編碼岩藻糖基轉移酶之功能被破壞之FUT8基因之細胞系，使得在此一細胞系中表現之抗體展現低岩藻糖基化。Presta之PCT公開案WO 03/035835闡述將岩藻糖附接至Asn(297)連接碳水化合物之能力有所降低的變體CHO細胞系Lecl3細胞，亦導致在該宿主細胞中表現之抗體的低岩藻糖基化(亦參見Shields等人(2002)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人之PCT公開案WO 99/54342闡述經改造以表現修飾醣蛋白之醣基轉移酶(例如β(1,4)-N乙醯
基葡萄糖胺基轉移酶III(GnTIII))之細胞系，使得在該等經改造細胞系中表現之抗體展現增加之二等分GlcNac結構，其增加抗體之ADCC活性(亦參見Umana等人，Nat.Biotech.17：176-180,1999)。
在另一實施例中，抗體經修飾以增加其生物半衰期。多種方式係可能的。舉例而言，可引入下列突變中之一或多者：T252L、T254S、T256F，如頒予Ward等人之美國專利第6,277,375號中所闡述。另一選擇為，為增加生物半衰期，可在CH1或CL區內改變抗體以含有自IgG之Fc區中CH2結構域之兩個環所獲取之補救受體結合表位，如Presta等人之美國專利第5,869,046號及第6,121,022號中所闡述。
可藉由業內已知之任一方式(包括但不限於重組表現、化學合成及酶消化抗體四聚體)來產生抗HER2抗體及其抗體片段(例如抗原結合片段)，而可藉由(例如)雜交瘤或重組產生來獲得全長單株抗體。重組表現可來自業內已知之任一適當宿主細胞，例如哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。
本文亦提供編碼本文所述抗體之多核苷酸，例如編碼包含如本文所述互補決定區之重鏈或輕鏈可變區或片段之多核苷酸。在一些實施例中，編碼重鏈可變區之多核苷酸與SEQ ID NO：8之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈可變區之多核苷酸與SEQ ID NO：18之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。
在一些實施例中，編碼重鏈之多核苷酸與SEQ ID NO：10、22或24中
之任一者之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。在一些實施例中，編碼輕鏈之多核苷酸與SEQ ID NO：20或34之多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%核酸序列一致性。
本文揭示之一些多核苷酸編碼抗HER2抗體之可變區。本文揭示之一些多核苷酸編碼抗HER2抗體之可變區及恆定區二者。一些多核苷酸序列編碼包含抗HER2抗體之重鏈及輕鏈二者之可變區的多肽。一些多核苷酸編碼兩個分別實質上與本文揭示之任何抗HER2抗體之重鏈及輕鏈之可變區相同之多肽區段。
可藉由新生固相DNA合成或藉由PCR誘變編碼抗HER2抗體或其結合片段之現有序列(例如，如下文實例中所述之序列)來產生多核苷酸序列。核酸之直接化學合成可藉由業內已知之方法來完成，例如Narang等人，Meth.Enzymol.68：90,1979之磷酸三酯方法；Brown等人，Meth.Enzymol.68：109,1979之磷酸二酯方法；Beaucage等人，Tetra.Lett.,22：1859,1981之二乙基亞磷醯胺方法；及美國專利第4,458,066號之固體載體方法。藉由PCR向多核苷酸序列中引入突變可如以下中所述實施：例如，PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification,H.A.Erlich(編輯)，Freeman Press,NY,NY,1992；PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Innis等人(編輯)，Academic Press,San Diego,CA,1990；Mattila等人，Nucleic Acids Res.19：967,1991；及Eckert等人，PCR Methods and Applications 1：17,1991。
亦提供用於產生上述抗HER2抗體之表現載體及宿主細胞。可採用各
種表現載體來表現編碼抗HER2抗體鏈或結合片段之多核苷酸。可使用基於病毒及非病毒之表現載體在哺乳動物宿主細胞中產生抗體。
非病毒載體及系統包括質粒、附加型載體(通常具有用於表現蛋白質或RNA之表現序列盒)及人類人工染色體(例如參見Harrington等人，Nat Genet 15：345,1997)。舉例而言，可用於在哺乳動物(例如人類)細胞中表現抗HER2多核苷酸及多肽之非病毒載體包括pThioHis A、B及C、pCDNATM3.1/His、pEBVHis A、B及C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV載體及業內已知用於表現其他蛋白質之諸多其他載體。有用病毒載體包括基於逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒之載體、基於SV40、乳頭瘤病毒、HBP艾伯斯坦-巴爾病毒(Epstein Barr virus)之載體、牛痘病毒載體及塞姆利基森林病毒(Semliki Forest virus，SFV)載體。參見Brent等人，上文文獻；Smith,Annu.Rev.Microbiol.49：807,1995；及Rosenfeld等人，Cell 68：143,1992。
表現載體之選擇取決於欲表現載體之預期宿主細胞。通常，表現載體含有啟動子及其他可操作地連接至編碼抗HER2抗體鏈或片段之多核苷酸之調控序列(例如增強子)。在一些實施例中，採用可誘導啟動子來預防除在誘導條件下插入序列之表現。可誘導啟動子包括(例如)阿拉伯糖、lacZ、金屬硫蛋白啟動子或熱激啟動子。可在非誘導條件下擴增經轉變生物體之培養物，此並不偏離表現產物由宿主細胞較佳耐受之編碼序列群體。除啟動子外，亦可需要或期望其他調控元件以用於有效表現抗HER2抗體鏈或片段。元件通常包括ATG起始密碼子及毗鄰核糖體結合位點或其他序列。另外，表現效率可藉由包括適於使用中之細胞系統之增強子來增強(例如，參見Scharf等人，Results Probl.Cell Differ.20：125,1994；及Bittner等人，
Meth.Enzymol.,153：516,1987)。舉例而言，可使用SV40增強子或CMV增強子來增加哺乳動物宿主細胞中之表現。
表現載體亦可提供分泌信號序列位置以與由插入之抗HER2抗體序列編碼之多肽形成融合蛋白。更通常而言，使插入之抗HER2抗體序列在包括於載體中之前連接至信號序列。欲用於接收編碼抗HER2抗體輕鏈及重鏈可變結構域之序列之載體有時亦編碼恆定區或其部分。該等載體容許以具有恆定區之融合蛋白形式表現可變區，由此使得產生完整抗體或其片段。通常，該等恆定區係人類。
用於具有及表現抗HER2抗體鏈之宿主細胞可為原核或真核。大腸桿菌(E.coli)係一種可用於選殖及表現本發明多核苷酸之原核宿主。其他適用微生物宿主包括桿菌(bacilli)(例如枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis))及其他腸桿菌科(enterobacteriaceae)(例如沙門桿菌屬(Salmonella)、黏質沙雷氏菌(Serratia)及各種假單胞菌(Pseudomonas)屬)。在該等原核宿主中，亦可製備通常含有與宿主細胞相容之表現控制序列(例如複製源)之表現載體。此外，存在任一數量之各種熟知啟動子，例如乳糖啟動子系統、色胺酸(trp)啟動子系統、β-內醯胺酶啟動子系統或來自噬菌體λ之啟動子系統。啟動子通常視情況使用操縱因子序列控制表現，且具有用於引發及完成轉錄及轉譯之核糖體結合位點序列及諸如此類。亦可採用其他微生物(例如酵母)以表現本文揭示之抗HER2多肽。亦可使用昆蟲細胞與桿狀病毒載體之組合。
在一些特定實施例中，使用哺乳動物宿主細胞來表現及產生本發明之抗HER2多肽。舉例而言，其可為表現內源性免疫球蛋白基因之雜交瘤細胞系(例如骨髓瘤雜交瘤純系)或具有外源性表現載體之哺乳動物細胞系(例
如SP2/0骨髓瘤細胞)。該等細胞包括任一正常短命或正常或異常永生動物或人類細胞。舉例而言，已研發許多能夠分泌完整免疫球蛋白之適宜宿主細胞系，包括各種CHO細胞系、Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、經轉變B細胞及雜交瘤。使用哺乳動物組織細胞培養物來表現多肽通常論述於(例如)Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.,1987中。用於哺乳動物宿主細胞之表現載體可包括表現對照序列(例如複製源)、啟動子及增強子(例如參見Queen等人，Immunol.Rev.89：49-68,1986)及必需處理資訊位點(例如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點)及轉錄終止子序列。表現載體通常含有源自哺乳動物基因或哺乳動物病毒之啟動子。適宜啟動子可為組成型、細胞類型特異性、階段特異性及/或可調變或可調控。有用啟動子包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、組成型腺病毒主要晚期啟動子、地塞米松(dexamethasone)可誘導MMTV啟動子、SV40啟動子、MRP polIII啟動子、組成型MPSV啟動子、四環素(tetracycline)可誘導CMV啟動子(例如人類即刻早期CMV啟動子)、組成型CMV啟動子及業內已知之啟動子-增強子組合。
引入含有所關注多核苷酸序列之表現載體之方法端視細胞宿主之類型而有所變化。舉例而言，氯化鈣轉染通常用於原核細胞，而磷酸鈣處理或電穿孔可用於其他細胞宿主(通常參見Sambrook等人，見上文)。其他方法包括(例如)電穿孔、磷酸鈣處理、脂質體介導之轉變、注射及微注射、彈道方法、病毒體、免疫脂質體、多價陽離子：核酸共軛物、裸DNA、人工病毒粒子、融合至疱疹病毒結構蛋白VP22(Elliot及O'Hare,Cell 88：223,1997)、DNA之藥劑增強之吸收及離體轉導。對於重組蛋白之長期、高產率生產而言，通常期望穩定表現。舉例而言，可使用本文揭示之表現載體(其
含有複製之病毒源或內源性表現元件及可選擇標記物基因)來製備穩定表現抗HER2抗體鏈或結合片段之細胞系。在引入載體後，可在切換至選擇性培養基中之前使細胞在富集培養基中生長1-2天。可選擇標記物之目的在於賦予選擇抗性，且其存在容許生長在選擇性培養基中成功表現引入序列之細胞。可使用適用於細胞類型之組織培養技術使抗性穩定轉染細胞增殖。
用於形成式(II)之免疫刺激性共軛物之一般反應方案示於以下方案13中：
其中：RG1係與式(Ia)化合物之相容性R4基團反應以形成相應R40基團之反應基團，例如馬來醯亞胺與硫醇反應以產生琥珀醯亞胺環，或羥基胺與酮反應以產生肟；R1、R4、L2、Ab及R40係如本文中所定義。
用於形成式(IIb)之免疫刺激性共軛物之一般反應方案示於以下方案14中：
其中：RG1係與式(Ib)化合物之相容性R4基團反應以形成相應R40基團
之反應基團，例如馬來醯亞胺與硫醇反應以產生琥珀醯亞胺環，或羥基胺與酮反應以產生肟；R1、R4、L2、Ab及R40係如本文中所定義。
所提供抗體共軛物可用於多種應用，包括但不限於治療癌症，例如HER2陽性癌症。在某些實施例中，本文提供之抗體共軛物可用於抑制腫瘤生長、減小腫瘤體積、誘導分化及/或降低腫瘤(例如HER2實體腫瘤)之致瘤性。使用方法可為活體外、離體或活體內方法。
在一些實施例中，本文提供治療、預防或改善有需要之個體(例如人類患者)之疾病(例如HER2陽性癌症)的方法，其係藉由向個體投與本文所述抗體共軛物中之任一者來達成。亦提供本發明之抗體共軛物之用途，其用於治療或預防個體(例如人類患者)之疾病。另外，提供抗體共軛物之用途，其用於治療或預防個體之疾病。在一些實施例中，提供抗體共軛物，其用於製造用於治療或預防個體之疾病之藥劑。在某些實施例中，經抗體共軛物治療之疾病係癌症，例如HER2陽性癌症。可經抗體共軛物治療之各種癌症列舉於上文定義部分中。HER2陽性癌症可為包含細胞表面存在HER2蛋白之細胞的任何癌症。舉例而言，HER2陽性癌症可為原發性腫瘤或以下中任一者之轉移：胃癌、食道癌、胃食道接合部腺癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、膀胱癌、尿道癌、胰臟癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤、神經胚細胞瘤、神經膠母細胞瘤、神經內分泌腫瘤及頭頸癌。在某些實施例中，癌症之特徵在於抗體共軛物之抗體、抗體片段(例如抗原結合片段)所結合之HER2表現細胞。在某些實施例中，癌症之特徵在於除HER2表現外亦並行表現多種人類表皮生長因子受體。在一些實施例中，HER2陽性癌症可具有高HER2表現，例如免疫組織
化學(IHC)評分為3+，其定義為>30%之侵襲性腫瘤細胞之均勻強烈膜染色，如藉由American Society of Clinical Oncology及College of American Pathologists(ASCO/CAP)IHC評分所測定(參見English等人，Mol Diagn Ther.2013年4月；17(2)：85-99)。在一些實施例中，HER2陽性癌症可具有相對較低HER2表現，例如IHC評分為2+，其定義為不均勻或強度較弱、但在至少10%細胞或極少腫瘤(其藉由ASCO/CAP IHC評分顯示30%或更少腫瘤細胞完全膜染色)中具有明顯周向分佈之完全膜染色(參見English等人，Mol Diagn Ther.2013年4月；17(2)：85-99)。
在一些實施例中，提供為有需要之個體治療HER2陽性癌症之方法，該等方法包含向個體投與治療有效量之本文所述抗體共軛物中之任一者。HER2陽性癌症可為包含細胞表面存在HER2蛋白之細胞的任何癌症。在一些實施例中，在與單獨抗HER2抗體比較時，所用抗體共軛物能抑制HER2陽性癌症達持續時段及/或減少HER2陽性癌症之復發。
亦預計本文所述抗體共軛物可用於治療各種非惡性疾病或病症，例如發炎性腸病(IBD)、胃腸潰瘍、蒙尼柴爾病(Menetrier's disease)、B型肝炎、C型肝炎、分泌腺瘤或蛋白損失症候群、腎病症、血管生成病症、眼病(例如眼假組織胞漿菌病症候群或年齡相關性黃斑變性)、骨相關病狀(例如骨關節炎、佝僂病及骨質疏鬆症)、全身性黏滯性過大症候群、Osler Weber-Rendu病、慢性阻塞性肺病、或燒傷、創傷、輻射後水腫、中風、低氧或缺血、糖尿病腎病變、佩吉特病(Paget's disease)、光老化(例如，藉由UV輻射人類皮膚引起)、良性前列腺肥大、某些微生物感染(包括選自腺病毒、漢坦病毒(hantavirus)、伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、耶爾森氏菌(Yersinia spp.)及百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)之微生物
病原體)、由血小板聚集引起之血栓、生殖病況(例如子宮內膜異位症、卵巢過刺激症候群、先兆子癇、功能障礙性子宮出血或月經頻多)、急性及慢性腎病(包括增殖性腎小球性腎炎)、肥厚性瘢痕形成、內毒素性休克及真菌感染、家族性腺瘤病息肉病、骨髓發育不良症候群、再生障礙性貧血、缺血性損傷、肺、腎或肝纖維化、嬰兒肥厚性幽門狹窄、泌尿道阻塞症候群、牛皮癬關節炎。
該等抗體共軛物之投與方法包括(但不限於)非經腸(例如，靜脈內)投與(例如在一段時間內以濃注或連續輸注形式注射)、經口投與、肌內投與、腫瘤內投與、肌內投與、腹膜內投與、腦脊液內投與、皮下投與、關節內投與、滑膜內投與、注射至淋巴結或鞘內投與。
對於疾病之治療，本發明之抗體共軛物之適當劑量取決於多種因素，例如欲治療之疾病之類型、疾病之嚴重程度及過程、疾病之反應、先前療法、患者之病史等等。抗體共軛物可一次性投與或經一系列持續數天至數月之治療進行投與，或直至實現治癒或達成疾病狀態減輕(例如腫瘤大小減小)為止。最佳投藥時間表可自患者體內之藥物累積之量測來計算，且將端視特定抗體共軛物之相對功效而變。在一些實施例中，劑量係0.01mg至20mg(例如，0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg、0.06mg、0.07mg、0.08mg、0.09mg、0.1mg、0.2mg、0.3mg、0.4mg、0.5mg、0.6mg、0.7mg、0.8mg、0.9mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg、16mg、17mg、18mg、19mg或20mg)/kg體重，且可每日、每週、每月或每年給予一或多次。在某些實施例中，本發明之抗體共軛物係每兩週給予一次或每三週給予一次。在某些實施例中，本發明之抗體共軛物係僅給
予一次。治療醫師可基於藥物在體液或組織中之所量測之滯留時間及濃度來估計投藥之重複速率。
在某些情況下，可將本發明之抗體藥物共軛物與其他治療劑(例如其他抗癌劑、抗過敏劑、抗惡心劑(或抗嘔吐劑)、疼痛緩解劑、細胞保護劑及其組合)進行組合。
考慮用於組合療法中之一般化學治療劑包括阿那曲唑(anastrozole)(Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide)(Casodex®)、硫酸博來黴素(bleomycin sulfate)(Blenoxane®)、白消安(busulfan)(Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(capecitabine)(Xeloda®)、N4-戊氧基羰基-5-去氧-5-氟胞苷、卡鉑(carboplatin)(Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine)(BiCNU®)、氯芥苯丁酸(chlorambucil)(Leukeran®)、順鉑(cisplatin)(Platinol®)、克拉屈濱(cladribine)(Leustatin®)、環磷醯胺(cyclophosphamide)(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC-Dome®)、更生黴素(dactinomycin)(放線菌素D(Actinomycin D)，Cosmegan)、鹽酸道諾黴素(daunorubicin hydrochloride)(Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松、多西他賽(docetaxel)(Taxotere®)、鹽酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride)(Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(etoposide)(Vepesid®)、磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)(Fludara®)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(Adrucil®、Efudex®)、氟他胺(flutamide)(Eulexin®)、替紮他濱(tezacitibine)、吉西他濱(Gemcitabine)
(雙氟去氧胞苷)、羥基脲(hydroxyurea)(Hydrea®)、伊達比星(Idarubicin)(Idamycin®)、異環磷醯胺(ifosfamide)(IFEX®)、伊立替康(irinotecan)(Camptosar®)、L-天門冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲硫四氫葉酸鈣、美法侖(melphalan)(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、胺甲喋呤(methotrexate)(Folex®)、米托蒽醌(mitoxantrone)(Novantrone®)、滅髓瘤(mylotarg)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Taxol®)、菲尼克斯(phoenix)(釔90/MX-DTPA)、噴司他汀(pentostatin)、聚苯丙生20(polifeprosan 20)與卡莫司汀(carmustine)植入物(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)(Nolvadex®)、替尼泊苷(teniposide)(Vumon®)、6-硫鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉紮明(tirapazamine)(Tirazone®)、注射用鹽酸托泊替坎(topotecan hydrochloride)、長春鹼(vinblastine)、(Velban®)、長春新鹼(vincristine)(Oncovin®)、長春瑞濱(vinorelbine)(Navelbine®)、表柔比星(epirubicin)(Ellence®)、奧沙利鉑(oxaliplatin)(Eloxatin®)、依西美坦(exemestane)(Aromasin®)、來曲唑(letrozole)(Femara®)及氟維司群(fulvestrant)(Faslodex®)。
如本文所用術語「醫藥組合」係指呈一種劑量單元形式之固定組合或用於組合投與之非固定組合或部分之套組(其中兩種或更多種治療劑可獨立地同時或單獨地在一定時間間隔內投與，尤其其中該等時間間隔使得組合配偶體展示合作(例如協同)效應)。
術語「組合療法」係指投與兩種或更多種治療劑以治療本發明中所述之治療性病況或病症。該投與涵蓋以實質上同時之方式、例如在具有活性成份之固定比率之單一膠囊中共投與該等治療劑。另一選擇為，該投與涵蓋針對每一活性成份以多種或在單獨容器(例如，膠囊、粉末及液體)中共
投與。可在投與前將粉末及/或液體重構或稀釋至期望劑量。另外，該投與亦涵蓋以依序方式在大約相同的時間或在不同時間使用每一類型之治療劑。在任一情形下，治療方案將在治療本文所述之病況或病症中提供藥物組合之有益效應。
組合療法可提供「協同作用」且證實具有「協同性」，亦即，在一起使用活性成份時所達成之效應大於分開使用化合物所產生效應之總和。在活性成份處於以下情形時可獲得協同效應：(1)在組合單位劑量調配物中共調配且同時投與或遞送；(2)以單獨調配物形式交替或平行遞送；或(3)藉由一些其他方案。在以交替療法遞送時，可在依序投與或遞送(例如藉由單獨注射器中之不同注射)化合物時獲得協同效應。一般而言，在交替療法期間，依序(亦即連續)投與有效劑量之每一活性成份，而在組合療法中，一起投與有效劑量之兩種或更多種活性成份。
在一個實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與一或多種其他抗HER2抗體(例如曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、馬格土希單抗)、或上述HT-19或與其他抗HER2共軛物(例如阿多-曲妥珠單抗艾坦辛(ado-trastuzumab emtansine)(亦稱為Kadcyla®或T-DM1))之組合來達成。
在一個實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與一或多種酪胺酸激酶抑制劑(包括但不限於EGFR抑制劑、Her3抑制劑、IGFR抑制劑及Met抑制劑)之組合來達成。
舉例而言，酪胺酸激酶抑制劑包括(但不限於)鹽酸厄洛替尼(Erlotinib hydrochloride)(Tarceva®)；利尼伐尼(Linifanib)(N-[4-(3-胺基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)尿素，亦稱為ABT 869，購自
Genentech)；蘋果酸舒尼替尼(Sunitinib malate)(Sutent®)；伯舒替尼(Bosutinib)(4-[(2,4-二氯-5-甲氧基苯基)胺基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基六氫吡嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-甲腈，亦稱為SKI-606，且闡述於美國專利第6,780,996號中)；達沙替尼(Dasatinib)(Sprycel®)；帕唑帕尼(Pazopanib)(Votrient®)；索拉菲尼(Sorafenib)(Nexavar®)；澤替馬(Zactima)(ZD6474)；及伊馬替尼(Imatinib)或甲磺酸伊馬替尼(Gilvec®及Gleevec®)。
表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑包括(但不限於)鹽酸厄洛替尼(Tarceva®)、吉非替尼(Iressa®)；N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-[[(3"S")-四氫-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基胺基)-2-丁烯醯胺，Tovok®)；凡德他尼(Vandetanib)(Caprelsa®)；拉帕替尼(Lapatinib)(Tykerb®)；(3R,4R)-4-胺基-1-((4-((3-甲氧基苯基)胺基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)六氫吡啶-3-醇(BMS690514)；卡奈替尼二鹽酸鹽(Canertinib dihydrochloride)(CI-1033)；6-[4-[(4-乙基-1-六氫吡嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯基乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(AEE788,CAS 497839-62-0)；木利替尼(Mubritinib)(TAK165)；培利替尼(Pelitinib)(EKB569)；阿法替尼(Afatinib)(Gilotrif®)；來那替尼(Neratinib)(HKI-272)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]胺基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-胺基甲酸(3S)-3-嗎啉基甲基酯(BMS599626)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氫-2-甲基環戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)；及4-[4-[[(1R)-1-苯基乙基]胺基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚(PKI166，CAS187724-61-4)。
EGFR抗體包括(但不限於)西妥昔單抗(Cetuximab)(Erbitux®)；帕尼單抗(Panitumumab)(Vectibix®)；馬妥珠單抗(Matuzumab)(EMD-72000)；尼妥珠單抗(Nimotuzumab)(hR3)；紮魯木單抗(Zalutumumab)；TheraCIM h-R3；MDX0447(CAS 339151-96-1)；及ch806(mAb-806，CAS 946414-09-1)。
其他HER2抑制劑包括(但不限於)來那替尼(HKI-272，(2E)-N-[4-[[3-氯-4-[(吡啶-2-基)甲氧基]苯基]胺基]-3-氰基-7-乙氧基喹啉-6-基]-4-(二甲基胺基)丁-2-烯醯胺，且闡述於PCT公開案第WO 05/028443號中)；拉帕替尼或二甲苯磺酸拉帕替尼(Tykerb®)；(3R,4R)-4-胺基-1-((4-((3-甲氧基苯基)胺基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)六氫吡啶-3-醇(BMS690514)；(2E)-N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)胺基]-7-[[(3S)-四氫-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4-(二甲基胺基)-2-丁烯醯胺(BIBW-2992，CAS 850140-72-6)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]胺基]-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-胺基甲酸(3S)-3-嗎啉基甲基酯(BMS 599626，CAS 714971-09-2)；卡奈替尼二鹽酸鹽(PD183805或CI-1033)；及N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氫-2-甲基環戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)。
HER3抑制劑包括(但不限於)LJM716、MM-121、AMG-888、RG7116、REGN-1400、AV-203、MP-RM-1、MM-111及MEHD-7945A。
MET抑制劑包括(但不限於)卡博替尼(Cabozantinib)(XL184，CAS 849217-68-1)；弗雷替尼(Foretinib)(GSK1363089，先前稱作XL880，CAS 849217-64-7)；提瓦替尼(Tivantinib)(ARQ197，CAS 1000873-98-2)；1-(2-羥基-2-甲基丙基)-N-(5-(7-甲氧基喹啉-4-基氧基)吡啶-2-基)-5-甲基-3-側
氧基-2-苯基-2,3-二氫-1H-吡唑-4-甲醯胺(AMG 458)；克裡唑替尼(Cryzotinib)(Xalkori®，PF-02341066)；(3Z)-5-(2,3-二氫-1H-吲哚-1-基磺醯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基六氫吡嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亞甲基)-1,3-二氫-2H-吲哚-2-酮(SU11271)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-({3,5-二甲基-4-[(4-甲基六氫吡嗪-1-基)羰基]-1H-吡咯-2-基}亞甲基)-N-甲基-2-側氧基吲哚啉-5-磺醯胺(SU11274)；(3Z)-N-(3-氯苯基)-3-{[3,5-二甲基-4-(3-嗎啉-4-基丙基)-1H-吡咯-2-基]亞甲基}-N-甲基-2-側氧基吲哚啉-5-磺醯胺(SU11606)；6-[二氟[6-(1-甲基-1H吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]嗒嗪-3-基]甲基]-喹啉(JNJ38877605，CAS 943540-75-8)；2-[4-[1-(喹啉-6-基甲基)-1H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡嗪-6-基]-1H-吡唑-1-基]乙醇(PF04217903，CAS 956905-27-4)；N-((2R)-1,4-二噁烷-2-基甲基)-N-甲基-N'-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-側氧基-5H-苯并[4,5]環庚[1,2-b]吡啶-7-基]磺醯胺(MK2461，CAS 917879-39-1)；6-[[6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-1,2,4-三唑并[4,3-b]嗒嗪3-基]硫基]-喹啉(SGX523，CAS 1022150-57-7)；及(3Z)-5-[[(2,6-二氯苯基)甲基]磺醯基]-3-[[3,5-二甲基-4-[[(2R)-2-(1-吡咯啶基甲基)-1-吡咯啶基]羰基]-1H-吡咯-2-基]亞甲基]-1,3-二氫-2H-吲哚-2-酮(PHA665752，CAS 477575-56-7)。
IGFR抑制劑包括(但不限於)BMS-754807、XL-228、OSI-906、GSK0904529A、A-928605、AXL1717、KW-2450、MK0646、AMG479、IMCA12、MEDI-573及BI836845。關於綜述，參見(例如)Yee,JNCI,104；975(2012)。
在另一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與一或多種增殖信號傳導路徑抑制劑(包括
但不限於MEK抑制劑、BRAF抑制劑、PI3K/Akt抑制劑、SHP2抑制劑亦及mTor抑制劑及CDK抑制劑)之組合來達成。
舉例而言，促分裂原活化之蛋白激酶(MEK)抑制劑包括(但不限於)XL-518(亦稱為GDC-0973，Cas編號1029872-29-4，購自ACC Corp.)；2-[(2-氯-4-碘苯基)胺基]-N-(環丙基甲氧基)-3,4-二氟-苯甲醯胺(亦稱為CI-1040或PD184352且闡述於PCT公開案第WO2000035436號中)；N-[(2R)-2,3-二羥基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)胺基]-苯甲醯胺(亦稱為PD0325901且闡述於PCT公開案第WO2002006213號中)；2,3-雙[胺基[(2-胺基苯基)硫基]亞甲基]-丁二腈(亦稱為U0126且闡述於美國專利第2,779,780號中)；N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)胺基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3-二羥基丙基]-環丙烷磺醯胺(亦稱為RDEA119或BAY869766且闡述於PCT公開案第WO2007014011號中)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙基胺基)-8,9,16-三羥基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氫-1H-2-苯并氧雜環十四炔-1,7(8H)-二酮(亦稱為E6201且闡述於PCT公開案第WO2003076424號中)；2’-胺基-3’-甲氧基黃酮(亦稱為PD98059，購自Biaffin GmbH & Co.,KG,Germany)；威羅菲尼(Vemurafenib)(PLX-4032，CAS 918504-65-1)；(R)-3-(2,3-二羥基丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基胺基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H,8H)-二酮(TAK-733，CAS 1035555-63-5)；皮馬瑟替(Pimasertib)(AS-703026，CAS 1204531-26-9)；及曲美替尼二甲亞碸(Trametinib dimethyl sulfoxide)(GSK-1120212，CAS 1204531-25-80)。
BRAF抑制劑包括(但不限於)威羅菲尼(或Zelboraf®)、GDC-0879、PLX-4720(購自Symansis)、達拉菲尼(Dabrafenib)(或GSK2118436)、LGX
818、CEP-32496、UI-152、RAF 265、瑞格菲尼(Regorafenib)(BAY 73-4506)、CCT239065、或索拉菲尼(或甲苯磺酸索拉菲尼或Nexavar®)、或伊匹單抗(Ipilimumab)(或MDX-010、MDX-101或益伏(Yervoy))。
磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑包括(但不限於)4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺醯基)六氫吡嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]嗎啉(亦稱為GDC0941、RG7321、GNE0941、皮曲立西(Pictrelisib)或皮克立西(Pictilisib)；且闡述於PCT公開案第WO 09/036082號及第WO 09/055730號中)；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-側氧基-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氫咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(亦稱為BEZ 235或NVP-BEZ 235，且闡述於PCT公開案第WO 06/122806號中)；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二嗎啉基嘧啶-4-基)吡啶-2-胺(亦稱為BKM120或NVP-BKM120，且闡述於PCT公開案第WO2007/084786號中)；陶紮色替(Tozasertib)(VX680或MK-0457，CAS 639089-54-6)；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亞甲基]-2,4-噻唑啶二酮(GSK1059615，CAS 958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙醯基氧基)-1-[(二-2-丙烯基胺基)亞甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氫-11-羥基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基環戊[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866，CAS 502632-66-8)；8-苯基-2-(嗎啉-4-基)-烯-4-酮(LY294002，CAS 154447-36-6)；(S)-N1-(4-甲基-5-(2-(1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基)吡啶-4-基)噻唑-2-基)吡咯啶-1,2-二甲醯胺(亦稱為BYL719或奧匹利昔(Alpelisib))；2-(4-(2-(1-異丙基-3-甲基-1H-1,2,4-三唑-5-基)-5,6-二氫苯并[f]咪唑并[1,2-d][1,4]氧氮呯-9-基)-1H-吡唑-1-基)-2-甲基丙醯胺(亦稱為GDC0032、RG7604或他塞利昔(Taselisib))。
mTOR抑制劑包括(但不限於)替西羅莫司(Temsirolimus)
(Torisel®)；瑞達福羅莫司(Ridaforolimus)(先前稱作迪弗莫司(deferolimus)，二甲基亞膦酸(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9]三十六碳-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基酯，亦稱為AP23573及MK8669，且闡述於PCT公開案第WO 03/064383號中；依維莫司(Everolimus)(Afinitor®或RAD001)；雷帕黴素(Rapamycin)(AY22989，Sirolimus®)；塞馬莫德(Simapimod)(CAS 164301-51-3)；(5-{2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反式-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；及N 2 -[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸-內鹽(SF1126，CAS 936487-67-1)。
CDK抑制劑包括(但不限於)帕博西尼(Palbociclib)(亦稱為PD-0332991，Ibrance®，6-乙醯基-8-環戊基-5-甲基-2-{[5-(1-六氫吡嗪基)-2-吡啶基]胺基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮)。
在又一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與一或多種促細胞凋亡劑(包括但不限於IAP抑制劑、BCL2抑制劑、MCl1抑制劑、TRAIL藥劑、CHK抑制劑)之組合。
舉例而言，IAP抑制劑包括(但不限於)LCL161、GDC-0917、AEG-35156、AT406及TL32711。IAP抑制劑之其他實例包括(但不限於)
揭示於以下中之彼等：WO04/005284、WO 04/007529、WO05/097791、WO 05/069894、WO 05/069888、WO 05/094818、US2006/0014700、US2006/0025347、WO 06/069063、WO 06/010118、WO 06/017295及WO08/134679，所有案件皆以引用方式併入本文中。
BCL-2抑制劑包括(但不限於)4-[4-[[2-(4-氯苯基)-5,5-二甲基-1-環己烯-1-基]甲基]-1-六氫吡嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(4-嗎啉基)-1-[(苯基硫基)甲基]丙基]胺基]-3-[(三氟甲基)磺醯基]苯基]磺醯基]苯甲醯胺(亦稱為ABT-263且闡述於PCT公開案第WO 09/155386號中)；替曲卡星A(Tetrocarcin A)；抗黴素(Antimycin)；棉酚(Gossypol)((-)BL-193)；奧巴克拉(Obatoclax)；乙基-2-胺基-6-環戊基-4-(1-氰基-2-乙氧基-2-側氧基乙基)-4H色酮-3-甲酸酯(HA14 -1)；奧利默森(Oblimersen)(G3139，Genasense®)；Bak BH3肽；(-)-棉酚乙酸(AT-101)；4-[4-[(4'-氯[1,1'-聯苯]-2-基)甲基]-1-六氫吡嗪基]-N-[[4-[[(1R)-3-(二甲基胺基)-1-[(苯基硫基)甲基]丙基]胺基]-3-硝基苯基]磺醯基]-苯甲醯胺(ABT-737，CAS 852808-04-9)；及那韋克拉(Navitoclax)(ABT-263，CAS 923564-51-6)。
促細胞凋亡受體促效劑(PARA)包括DR4(TRAILR1)及DR5(TRAILR2)，包括但不限於杜拉樂明(Dulanermin)(AMG-951，RhApo2L/TRAIL)；馬帕木單抗(Mapatumumab)(HRS-ETR1，CAS 658052-09-6)；來沙木單抗(Lexatumumab)(HGS-ETR2，CAS 845816-02-6)；阿波單抗(Apomab)(Apomab®)；可那木單抗(Conatumumab)(AMG655，CAS 896731-82-1)；及替加珠單抗(Tigatuzumab)(CS1008，CAS 946415-34-5，購自Daiichi Sankyo)。
檢查點激酶(CHK)抑制劑包括(但不限於)7-羥基星狀孢菌素
(UCN-01)；6-溴-3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-(3R)-3-六氫吡啶基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(SCH900776，CAS 891494-63-6)；5-(3-氟苯基)-3-脲基噻吩-2-甲酸N-[(S)-六氫吡啶-3-基]醯胺(AZD7762,CAS 860352-01-8)；4-[((3S)-1-氮雜二環[2.2.2]辛-3-基)胺基]-3-(1H-苯并咪唑-2-基)-6-氯喹啉-2(1H)-酮(CHIR 124，CAS 405168-58-3)；7-胺基更生黴素(7-AAD)、颗粒海鞘生物鹼(Isogranulatimide)、去溴海綿生物鹼(debromohymenialdisine)；N-[5-溴-4-甲基-2-[(2S)-2-嗎啉基甲氧基]-苯基]-N'-(5-甲基-2-吡嗪基)尿素(LY2603618，CAS 911222-45-2)；蘿蔔硫素(Sulforaphane)(CAS 4478-93-7，異硫氰酸4-甲基亞磺醯基丁基酯)；9,10,11,12-四氫-9,12-環氧-1H-二吲哚并[1,2,3-fg：3',2',1'-kl]吡咯并[3,4-i][1,6]苯并二氮雜環辛-1,3(2H)-二酮(SB-218078，CAS 135897-06-2)；及TAT-S216A(YGRKKRRQRRRLYRSPAMPENL(SEQ ID NO：33))及CBP501((d-Bpa)sws(d-Phe-F5)(d-Cha)rrrqrr)。
在另一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與一或多種免疫調節劑(例如共刺激分子活化劑或免疫檢查點分子抑制劑中之一或多者)之組合來達成。
在某些實施例中，免疫調節劑係共刺激分子之活化劑。在一個實施例中，共刺激分子之促效劑選自OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3或CD83配體之促效劑(例如，促效劑抗體或其抗原結合片段或可溶性融合物)。
在某些實施例中，免疫調節劑係免疫檢查點分子之抑制劑。在一個實
施例中，免疫調節劑係PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及/或TGFRβ之抑制劑。在一個實施例中，免疫檢查點分子之抑制劑抑制PD-1、PD-L1、LAG-3、TIM-3或CTLA4、或其任一組合。術語「抑制」或「抑制劑」包括某一參數(例如，所給分子之活性)之降低，例如，免疫檢查點抑制劑。舉例而言，此術語包括將活性(例如PD-1或PD-L1活性)抑制至少5%、10%、20%、30%、40%、50%或更多。因此，抑制無需100%。
抑制性分子之抑制可以DNA、RNA或蛋白水準實施。在一些實施例中，可使用抑制性核酸(例如，dsRNA、siRNA或shRNA)以抑制抑制性分子之表現。在其他實施例中，抑制性信號之抑制劑係多肽，例如可溶性配體(例如，PD-1-Ig或CTLA-4 Ig)；或結合至抑制性分子之抗體或其抗原結合片段，例如結合至PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及/或TGFRβ或其組合之抗體或其片段(本文中亦稱作「抗體分子」)。
在一個實施例中，抗體分子係完整抗體或其片段(例如Fab、F(ab')2、Fv或單鏈Fv片段(scFv))。在其他實施例中，抗體分子具有重鏈恆定區(Fc)，其選自(例如)IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD及IgE之重鏈恆定區；尤其選自(例如)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之重鏈恆定區，更尤其IgG1或IgG4(例如人類IgG1或IgG4)之重鏈恆定區。在一個實施例中，重鏈恆定區係人類IgG1或人類IgG4。在一個實施例中，改變(例如突變)恆定區以修飾抗體分子之性質(例如增加或降低以下中之一或多者：Fc受體結合、抗體醣基化、半胱胺酸殘基數、效應物細胞功能或補體功能)。
在某些實施例中，抗體分子係呈雙特異性或多特異性抗體分子之形式。在一個實施例中，雙特異性抗體分子具有針對PD-1或PD-L1之第一結合特異性且具有第二結合特異性(例如針對TIM-3、LAG-3或PD-L2之第二結合特異性)。在一個實施例中，雙特異性抗體分子結合至PD-1或PD-L1及TIM-3。在另一實施例中，雙特異性抗體分子結合至PD-1或PD-L1及LAG-3。在另一實施例中，雙特異性抗體分子結合至PD-1及PD-L1。在又一實施例中，雙特異性抗體分子結合至PD-1及PD-L2。在另一實施例中，雙特異性抗體分子結合至TIM-3及LAG-3。上述分子之任一組合可製成多特異性抗體分子，例如包括針對PD-1或PD-1之第一結合特異性及針對TIM-3、LAG-3或PD-L2中之兩者或更多者之第二及第三結合特異性的三特異性抗體。
在某些實施例中，免疫調節劑係PD-1(例如人類PD-1)之抑制劑。在另一實施例中，免疫調節劑係PD-L1(例如人類PD-L1)之抑制劑。在一個實施例中，PD-1或PD-L1之抑制劑係針對PD-1或PD-L1之抗體分子。PD-1或PD-L1抑制劑可單獨或與其他免疫調節劑組合、例如與LAG-3、TIM-3或CTLA4之抑制劑組合投與。在實例性實施例中，PD-1或PD-L1之抑制劑(例如抗PD-1或PD-L1抗體分子)係與LAG-3抑制劑(例如抗LAG-3抗體分子)組合投與。在另一實施例中，PD-1或PD-L1之抑制劑(例如抗PD-1或PD-L1抗體分子)係與TIM-3抑制劑(例如抗TIM-3抗體分子)組合投與。在其他實施例中，PD-1或PD-L1之抑制劑(例如抗PD-1抗體分子)係與LAG-3抑制劑(例如抗LAG-3抗體分子)及TIM-3抑制劑(例如抗TIM-3抗體分子)組合投與。
免疫調節劑與PD-1抑制劑(例如，PD-L2、CTLA4、TIM3、LAG3、
VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及/或TGFR中之一或多者)之其他組合亦在本發明內。業內已知或本文所揭示之任一抗體分子可用於檢查點分子抑制劑之上述組合中。
在一實施例中，PD-1抑制劑係選自尼沃魯單抗(Nivolumab)、派姆單抗(Pembrolizumab)或匹利珠單抗(Pidilizumab)之抗PD-1抗體。在一些實施例中，抗PD-1抗體係尼沃魯單抗。尼沃魯單抗之替代性名稱包括MDX-1106、MDX-1106-04、ONO-4538或BMS-936558。在一些實施例中，抗PD1抗體係尼沃魯單抗(CAS登記號：946414-94-4)。尼沃魯單抗係特異性阻斷PD1之完全人類IgG4單株抗體。尼沃魯單抗(純系5C4)及特異性結合至PD1之其他人類單株抗體揭示於美國專利第8,008,449號及PCT公開案第WO2006/121168號中。
在其他實施例中，抗PD-1抗體係派姆單抗。派姆單抗(商標名KEYTRUDA，先前稱作蘭布魯珠單抗(Lambrolizumab)，亦稱為Merck 3745、MK-3475或SCH-900475)係結合至PD1之人類化IgG4單株抗體。派姆單抗揭示於(例如)Hamid,O.等人(2013)New England Journal of Medicine 369(2)：134-44、PCT公開案第WO2009/114335號及美國專利第8,354,509號中。
在一些實施例中，抗PD-1抗體係匹利珠單抗。匹利珠單抗(CT-011；CureTech)係結合至PD1之人類化IgG1k單株抗體。匹利珠單抗及其他人類化抗PD-1單株抗體揭示於PCT公開案第WO2009/101611號中。其他抗PD1抗體揭示於美國專利第8,609,089號、美國公開案第2010028330號及/或美國公開案第20120114649號中。其他抗PD1抗體包括AMP 514(Amplimmune)。
在一些實施例中，PD-1抑制劑係免疫黏附素(例如包含融合至恆定區(例如免疫球蛋白序列之Fc區)之PD-L1或PD-L2之細胞外或PD-1結合部分之免疫黏附素)。在一些實施例中，PD-1抑制劑係AMP-224。
在一些實施例中，PD-L1抑制劑係抗PD-L1抗體。在一些實施例中，抗PD-L1抑制劑係選自YW243.55.S70、MPDL3280A、MEDI-4736或MDX-1105MSB-0010718C(亦稱為A09-246-2)，其揭示於(例如)WO 2013/0179174中且具有本文所揭示之序列(或與其實質上相同或類似之序列，例如與指定序列至少85%、90%、95%一致或具有更高一致性之序列)。
在一個實施例中，PD-L1抑制劑係MDX-1105。MDX-1105(亦稱為BMS-936559)係闡述於PCT公開案第WO 2007/005874號中之抗PD-L1抗體。
在一個實施例中，PD-L1抑制劑係YW243.55.S70。YW243.55.S70抗體係闡述於PCT公開案第WO 2010/077634號中之抗PD-L1。
在一個實施例中，PD-L1抑制劑係MDPL3280A(Genentech/Roche)。MDPL3280A係結合至PD-L1之人類Fc最佳化IgG1單株抗體。MDPL3280A及針對PD-L1之其他人類單株抗體揭示於美國專利第7,943,743號及美國公開案第20120039906號中。
在其他實施例中，PD-L2抑制劑係AMP-224。AMP-224係阻斷PD1與B7-H1之間之相互作用之PD-L2 Fc融合可溶性受體(B7-DCIg；Amplimmune；例如揭示於PCT公開案第WO2010/027827號及第WO2011/066342號中)。
在一個實施例中，LAG-3抑制劑係抗LAG-3抗體分子。在一個實施例中，LAG-3抑制劑係BMS-986016。
在另一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與一或多種細胞介素(包括但不限於干擾素、IL2、IL15、IL7或IL21)之組合來達成。
在另一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與一或多種STING受體促效劑(干擾素基因之刺激物)(例如闡述於WO 2014/189805中之化合物)之組合來達成。
在另一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與一或多種血管生成抑制劑之組合來達成，該等血管生成抑制劑係例如貝伐珠單抗(Bevacizumab)(Avastin®)、阿西替尼(axitinib)(Inlyta®)；丙胺酸布立尼布(Brivanib alaninate)(BMS-582664，(S)-((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-胺基丙酸酯)；索拉菲尼(Sorafenib)(Nexavar®)；帕唑帕尼(Pazopanib)(Votrient®)；蘋果酸舒尼替尼(Sutent®)；西地尼布(Cediranib)(AZD2171，CAS 288383-20-1)；瓦蓋特(Vargatef)(BIBF1120，CAS 928326-83-4)；弗雷替尼(Foretinib)(GSK1363089)；替拉替尼(Telatinib)(BAY57-9352，CAS 332012-40-5)；阿法替尼(Apatinib)(YN968D1，CAS 811803-05-1)；伊馬替尼(Gleevec®)；帕納替尼(Ponatinib)(AP24534，CAS 943319-70-8)；替沃尼布(Tivozanib)(AV951，CAS 475108-18-0)；瑞格菲尼(Regorafenib)(BAY73-4506，CAS 755037-03-7)；二鹽酸瓦他拉尼(Vatalanib dihydrochloride)(PTK787，CAS 212141-51-0)；布立尼布(Brivanib)(BMS-540215，CAS 649735-46-6)；凡德他尼(Vandetanib)(Caprelsa®或AZD6474)；二磷酸莫替沙尼(Motesanib diphosphate)(AMG706，CAS
857876-30-3，N-(2,3-二氫-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)胺基]-3-吡啶甲醯胺，闡述於PCT公開案第WO 02/066470號中)；多維替尼二乳酸(Dovitinib dilactic acid)(TKI258，CAS 852433-84-2)；利尼伐尼(Linfanib)(ABT869，CAS 796967-16-3)；卡博替尼(Cabozantinib)(XL184，CAS 849217-68-1)；來他替尼(Lestaurtinib)(CAS 111358-88-4)；N-[5-[[[5-(1,1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫基]-2-噻唑基]-4-六氫吡啶甲醯胺(BMS38703，CAS 345627-80-7)；(3R,4R)-4-胺基-1-((4-((3-甲氧基苯基)胺基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)六氫吡啶-3-醇(BMS690514)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氫-2-甲基環戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)；4-甲基-3-[[1-甲基-6-(3-吡啶基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基]胺基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]-苯甲醯胺(BHG712，CAS 940310-85-0)；及阿柏西普(Aflibercept)(Eylea®)。
在另一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與一或多種熱休克蛋白抑制劑之組合來達成，該等熱休克蛋白抑制劑係例如坦螺旋黴素(Tanespimycin)(17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德黴素(geldanamycin)，亦稱為KOS-953及17-AAG，購自SIGMA，且闡述於美國專利第4,261,989號中)；瑞他黴素(Retaspimycin)(IPI504)、加奈特布(Ganetespib)(STA-9090)；[6-氯-9-(4-甲氧基-3,5-二甲基吡啶-2-基甲基)-9H-嘌呤-2-基]胺(BIIB021或CNF2024,CAS 848695-25-0)；反式-4-[[2-(胺基羰基)-5-[4,5,6,7-四氫-6,6-二甲基-4-側氧基-3-(三氟甲基)-1H-吲唑-1-基]苯基]胺基]環己基甘胺酸酯(SNX5422或PF04929113，CAS 908115-27-5)；5-[2,4-二羥基-5-(1-甲基乙基)苯
基]-N-乙基-4-[4-(4-嗎啉基甲基)苯基]-3-異噁唑甲醯胺(AUY922，CAS 747412-49-3)；或17-二甲基胺基乙基胺基-17-去甲氧基格爾德黴素(17-DMAG)。
在另一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與一或多種HDAC抑制劑或其他後生調節劑之組合來達成。實例性HDAC抑制劑包括(但不限於)伏立司他(Voninostat)(Zolinza®)；羅米地辛(Romidepsin)(Istodax®)；曲古抑菌素A(Treichostatin A)(TSA)；奧克氟汀(Oxamflatin)；伏立諾他(Vorinostat)(Zolinza®，辛二醯基苯胺羥肟酸)；皮羅醯胺(Pyroxamide)(辛二醯基-3-胺基吡啶醯胺羥肟酸)；曲坡欣A(Trapoxin A)(RF-1023A)；曲坡欣B(RF-10238)；環[(αS,2S)-α-胺基-η-側氧基-2-環氧乙烷辛醯基-O-甲基-D-酪胺醯基-L-異亮胺醯基-L-脯胺醯基](Cyl-1)；環[(αS,2S)-α-胺基-η-側氧基-2-環氧乙烷辛醯基-O-甲基-D-酪胺醯基-L-異亮胺醯基-(2S)-2-六氫吡啶羰基](Cyl-2)；環[L-丙胺醯基-D-丙胺醯基-(2S)-η-側氧基-L-α-胺基環氧乙烷辛醯基-D-脯胺醯基](HC-毒素)；環[(αS,2S)-α-胺基-η-側氧基-2-環氧乙烷辛醯基-D-苯基丙胺醯基-L-亮胺醯基-(2S)-2-六氫吡啶羰基](WF-3161)；衣原體素(Chlamydocin)((S)-環(2-甲基丙胺醯基-L-苯基丙胺醯基-D-脯胺醯基-η-側氧基-L-α-胺基環氧乙烷辛醯基)；制蚜菌素(Apicidin)(環(8-側氧基-L-2-胺基癸醯基-1-甲氧基-L-色胺醯基-L-異亮胺醯基-D-2-六氫吡啶羰基)；羅米地辛(Romidepsin)(Istodax®，FR-901228)；丁酸4-苯基酯；斯普他汀A(Spiruchostatin A)；麥普因(Mylproin)(丙戊酸)；恩替諾特(Entinostat)(MS-275，N-(2-胺基苯基)-4-[N-(吡啶-3-基-甲氧基羰基)-胺基-甲基]-苯甲醯胺)；德普地辛
(Depudecin)(4,5：8,9-二脫水-1,2,6,7,11-五去氧-D-蘇式-D-艾杜糖-十一-1,6-二烯糖醇)；4-(乙醯基胺基)-N-(2-胺基苯基)-苯甲醯胺(亦稱為CI-994)；N1-(2-胺基苯基)-N8-苯基-辛烷二醯胺(亦稱為BML-210)；4-(二甲基胺基)-N-(7-(羥基胺基)-7-側氧基庚基)苯甲醯胺(亦稱為M344)；(E)-3-(4-(((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)(2-羥基乙基)胺基)-甲基)苯基)-N-羥基丙烯醯胺；帕比司他(Panobinostat)(Farydak®)；莫賽替諾司他(Mocetinostat)及貝林司他(Belinostat)(亦稱為PXD101、Beleodaq®或(2E)-N-羥基-3-[3-(苯基胺磺醯基)苯基]丙-2-烯醯胺)或西達本胺(chidamide)(亦稱為CS055或HBI-8000、(E)-N-(2-胺基-5-氟苯基)-4-((3-(吡啶-3-基)丙烯醯胺基)甲基)苯甲醯胺)。其他後生調節劑包括(但不限於)EZH2(zeste同系物2之增強子)、EED(胚胎外胚層形成)或LSD1(離胺酸特異性組織蛋白去甲基酶1A或KDM1A)之抑制劑。
在另一實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與吲哚胺-吡咯2,3-二氧酶(IDO)(例如吲哚西莫(Indoximod)(亦稱為NLG-8189)、α-環己基-5H-咪唑并[5,1-a]異吲哚-5-乙醇(亦稱為NLG919)或(4E)-4-[(3-氯-4-氟苯胺基)-亞硝基亞甲基]-1,2,5-噁二唑-3-胺(亦稱為INCB024360))之抑制劑中之一或多者之組合來達成。
在一些實施例中，本發明提供治療癌症之方法，其係藉由向有需要之個體投與本發明之抗體共軛物與上述抑制劑、活化劑、免疫調節劑、促效劑或調節劑中之任一者中之兩者或更多者之組合來達成。舉例而言，本發明之抗體共軛物可與一或多種檢查點抑制劑及/或一或多種免疫活化劑組合使用。
除上述治療方案外，患者亦可經受癌細胞之手術移除及/或輻射療法。
為製備包括一或多種本文所述抗體共軛物之醫藥或無菌組合物，可將所提供抗體共軛物與醫藥上可接受之載劑或賦形劑混合。
治療及診斷劑之調配物可藉由與生理上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑混合以(例如)凍乾粉末、漿液、水溶液、洗劑或懸浮液形式製備(例如，參見Hardman等人，Goodman及Gilman之The Pharmacological Basis of Therapeutics,McGraw-Hill,New York,N.Y.,2001；Gennaro,Remington：The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott,Williams及Wilkins,New York,N.Y.,2000；Avis等人(編輯),Pharmaceutical Dosage Forms：Parenteral Medications,Marcel Dekker,NY,1993；Lieberman等人(編輯),Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets,Marcel Dekker,NY,1990；Lieberman等人(編輯)Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems,Marcel Dekker,NY,1990；Weiner及Kotkoskie,Excipient Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,2000)。
在一些實施例中，包含本發明之抗體共軛物之醫藥組合物係凍乾物製劑。在某些實施例中，包含抗體共軛物之醫藥組合物係小瓶中含有抗體共軛物、組胺酸、蔗糖及聚山梨醇酯20之凍乾物。在某些實施例中，包含抗體共軛物之醫藥組合物係小瓶中含有抗體共軛物、琥珀酸鈉及聚山梨醇酯20之凍乾物。在某些實施例中，包含抗體共軛物之醫藥組合物係小瓶中含有抗體共軛物、海藻糖、檸檬酸鹽及聚山梨醇酯8之凍乾物。凍乾物可經(例如)水、鹽水重構用於注射。在具體實施例中，溶液包含抗體共軛物、組胺酸、蔗糖及聚山梨醇酯20，pH為約5.0。在另一具體實施例中，溶液包含
抗體共軛物、琥珀酸鈉及聚山梨醇酯20。在另一具體實施例中，溶液包含抗體共軛物、去水海藻糖、去水檸檬酸鹽、檸檬酸及聚山梨醇酯8，pH為約6.6。對於靜脈內投與，通常將所得溶液進一步稀釋至載劑溶液中。
選擇用於治療劑之投與方案取決於若干因素，包括實體之血清或組織轉換率、症狀之程度、實體之免疫原性及生物基質中靶細胞之易接近性。在某些實施例中，投與方案使與可接受之副作用程度一致之遞送至患者之治療劑的量最大化。因此，所遞送生物製劑之量部分地取決於具體實體及所治療病況之嚴重程度。可獲得選擇抗體、細胞介素及小分子之適當劑量之指南(例如，參見Wawrzynczak,Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK,1996；Kresina(編輯),Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1991；Bach(編輯),Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,N.Y.,1993；Baert等人，New Engl.J.Med.348：601-608,2003；Milgrom等人，New Engl.J.Med.341：1966-1973,1999；Slamon等人，New Engl.J.Med.344：783-792,2001；Beniaminovitz等人，New Engl.J.Med.342：613-619,2000；Ghosh等人，New Engl.J.Med.348：24-32,2003；Lipsky等人，New Engl.J.Med.343：1594-1602,2000)。
適當劑量之確定係由臨床醫師(例如)使用此項技術中已知或懷疑影響治療或預計影響治療之參數或因素來進行。通常，劑量係以稍微小於最佳劑量之量開始且此後以小的增量增加，直至相對於任何不利副作用達成期望或最佳效應為止。重要之診斷手段包括彼等(例如)發炎之症狀或所產生發炎細胞介素之含量。
本發明醫藥組合物中之活性成份之實際劑量量可變以便獲得可有效達成對特定患者有期望治療反應之量的活性成份、組合物及投與模式，而對患者無毒。所選劑量量將端視多種藥物代謝動力學因素而定，該等參數包括所用本發明特定組合物或其酯、鹽或醯胺之活性、投與途徑、投與時間、所用特定化合物之排泄速率、治療之持續時間、與所用特定組合物組合使用之其他藥物、化合物及/或物質、所治療患者之年齡、性別、體重、身體狀況、一般健康情況及先前病史及已為醫學技術中所已知之類似因素。
可藉由連續輸注來提供包含本發明之抗體共軛物之組合物，或藉由(例如)以下間隔之劑量來提供：一天、一週或每週1-7次、每隔一週一次、每三週一次、每四週一次、每五週一次、每六週一次、每七週一次或每八週一次。可經靜脈內、皮下、局部、經口、經鼻、經直腸、經肌內、經大腦內或藉由吸入提供劑量。具體劑量方案係涉及避免顯著不期望副作用之最大劑量或投藥頻率者。
對於本發明之抗體共軛物，投與至患者之劑量可為0.0001mg/kg至100mg/kg患者體重。劑量可介於0.001mg/kg患者體重與50mg/kg之間、介於0.005mg/kg與20mg/kg之間、介於0.01mg/kg與20mg/kg之間、介於0.02mg/kg與10mg/kg之間、介於0.05與5mg/kg之間、介於0.1mg/kg與10mg/kg之間、介於0.1mg/kg與8mg/kg之間、介於0.1mg/kg與5mg/kg之間、介於0.1mg/kg與2mg/kg之間、介於0.1mg/kg與1mg/kg之間。可使用患者重量(以公斤(kg)表示)乘以欲投與劑量(以mg/kg表示)來計算抗體共軛物之劑量。
可重複本發明之抗體共軛物之劑量且各投與可間隔小於1天、至少1天、2天、3天、5天、10天、15天、30天、45天、2個月、75天、3個月、4
個月、5個月或至少6個月。在一些實施例中，本發明之抗體共軛物係每週兩次、每週一次、每兩週一次、每三週一次、每四週一次或以更小頻率投與。在具體實施例中，每2週重複本發明之抗體共軛物之劑量。
用於特定患者之有效量可端視諸如以下等因素而有所變化：所治療病況、患者之整體健康狀況、投與之方法、途徑及劑量及副作用嚴重程度(例如參見Maynard等人，A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice,Interpharm Press,Boca Raton,Fla.,1996；Dent,Good Laboratory and Good Clinical Practice,Urch Publ.,London,UK,2001)。
投與途徑可為(例如)藉由局部或經皮施加、藉由皮下、靜脈內、腹膜胺內、大腦內、肌內、眼內、動脈內、腦脊髓內、病灶內投與注射或輸注、或藉由持續釋放系統或植入體(例如參見Sidman等人，Biopolymers 22：547-556,1983；Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277,1981；Langer,Chem.Tech.12：98-105,1982；Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688-3692,1985；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030-4034,1980；美國專利第6,350,466號及第6,316,024號)。若需要，則該組合物亦可包括增溶劑或局部麻醉劑(例如利多卡因(lidocaine))以減輕注射位點之疼痛，或包括此二者。此外，亦可採用肺投與，例如藉由使用吸入器或噴霧器，及與氣溶膠化劑一起調配。例如參見美國專利第6,019,968號、第5,985,320號、第5,985,309號、第5,934,272號、第5,874,064號、第5,855,913號、第5,290,540號及第4,880,078號及PCT公開案第WO 92/19244號、第WO 97/32572號、第WO 97/44013號、第WO 98/31346號及第WO 99/66903號，每一者之全部內容皆以引用方式併入本文中。
該等額外成份之實例已為業內熟知。
與第二治療劑(例如細胞介素、類固醇、化學治療劑、抗生素或輻射)共投與或經其治療之方法為業內已知(例如，參見Hardman等人，(編輯)(2001)Goodman及Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,10.sup.th編輯，McGraw-Hill,New York,N.Y.；Poole及Peterson(編輯)(2001)Pharmacotherapeutics for Advanced Practice：A Practical Approach,Lippincott、Williams及Wilkins,Phila.,Pa.；Chabner及Longo(編輯)(2001)Cancer Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott、Williams及Wilkins,Phila.,Pa.)。有效量之治療可將症狀減輕至少10%、至少20%、至少約30%、至少40%或至少50%。
可與本發明之抗體共軛物組合投與之額外治療劑(例如，預防或治療劑)可與本發明之抗體共軛物隔開投與：相隔小於5分鐘、相隔小於30分鐘、相隔1小時、相隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔約12小時至18小時、相隔18小時至24小時、相隔24小時至36小時、相隔36小時至48小時、相隔48小時至52小時、相隔52小時至60小時、相隔60小時至72小時、相隔72小時至84小時、相隔84小時至96小時或相隔96小時至120小時。可在一個相同患者訪視內投與兩種或更多種療法。
在某些實施例中，本發明之抗體共軛物可經調配以確保在活體內之適當分佈。實例性靶向部分體包括葉酸鹽或生物素(例如，參見頒予Low等人之美國專利第5,416,016號)；甘露糖苷(Umezawa等人，(1988)Biochem.
Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗體(Bloeman等人，(1995)FEBS Lett.357：140；Owais等人，(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性劑蛋白A受體(Briscoe等人，(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p 120(Schreier等人，(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；亦參見K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。
本發明提供將包含本發明之抗體共軛物(單獨或與其他療法組合)之醫藥組合物投與有需要之個體之方案。本發明組合療法之療法(例如預防劑或治療劑)可並行或依序投與個體。本發明組合療法之療法(例如預防劑或治療劑)亦可循環投與。循環療法涉及投與第一療法(例如第一預防劑或治療劑)一段時間，隨後投與第二療法(例如第二預防劑或治療劑)一段時間，且重複此依序投與(亦即循環)，以減少對其中一種療法(例如藥劑)產生抗性，從而避免或減少其中一種療法(例如藥劑)之副作用及/或改良療法效能。
本發明組合療法之療法(例如預防劑或治療劑)可並行投與個體。
術語「並行」並不限於在嚴格相同之時間下投與療法(例如預防劑或治療劑)，而是意指以一定順序且在一定時間間隔內將包含本發明之抗體或其片段之醫藥組合物投與個體，使得本發明之抗體或抗體共軛物可與其他療法一起發揮作用，以提供比以其他方式投與時更提高之效益。舉例而言，每一療法可在相同時間或以任一順序在不同時間點依序投與個體；然而，若不在相同時間投與，則其應在時間上充分靠近投與以提供期望治療或預防效應。每一療法可依任一適當形式及藉由任何適宜途徑分開投與個體。在各個實施例中，療法(例如，預防劑或治療劑)係依以下間隔投與個體：相隔小於5分鐘、相隔小於15分鐘、相隔小於30分鐘、相隔小於1小時、相
隔約1小時、相隔約1小時至約2小時、相隔約2小時至約3小時、相隔約3小時至約4小時、相隔約4小時至約5小時、相隔約5小時至約6小時、相隔約6小時至約7小時、相隔約7小時至約8小時、相隔約8小時至約9小時、相隔約9小時至約10小時、相隔約10小時至約11小時、相隔約11小時至約12小時、相隔24小時、相隔48小時、相隔72小時或相隔1週。在其他實施例中，在同一患者門診時投與兩種或更多種療法(例如預防劑或治療劑)。
可在同一醫藥組合物中將組合療法之預防劑或治療劑投與個體。另一選擇為，可在單獨醫藥組合物中將組合療法之預防劑或治療劑並行投與個體。可藉由相同或不同投與途徑將預防劑或治療劑投與個體。
應瞭解，本文所述實例及實施例僅為舉例說明之目的，且基於其之各種修改或變化應為熟習此項技術者所瞭解且欲包括在本申請案之精神與範圍內及隨附申請專利範圍之範疇內。
以下實例進一步闡述本發明，該等實例並非限制申請專利範圍中所闡述之本發明之範疇。
向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、HBTU(1.2當量)、
Huenig鹼(3.0當量)、3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸(1.2當量)及DMSO(0.1M)。將反應混合物於室溫下攪拌3小時且隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之1-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-1)：1H NMR(CDCl3)：δ 7.35(d,1H),7.12(d,1H),6.86(d,1H),6.72(s,2H),6.69(d,1H),6.40(s,1H),5.46(t,1H),5.33(s,2H),4.16(s,2H),3.95(s,3H),3.82(m,6H),3.40(m,4H),3.21(m,2H),2.67(m,4H),1.39(m,2H),1.26(m,2H),1.14(m,2H),0.86(t,3H)。LRMS[M+H]=589.3。
向圓底燒瓶中裝入1-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-1,1.0當量)並溶解於ACN-PBS緩衝液(1：2,0.02M)中。向此混合物中添加溶解於DPBS緩衝液(0.07M)中之L-半胱胺酸(2.0當量)。將反應混合物於室溫下攪拌1小時。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈非鏡像異構物之混合物之TFA鹽形式之(2R)-2-胺基
-3-((1-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸(C-2)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.36(d,1H),7.28(d,1H),7.05(d,1H),6.81(d,1H),6.24(d,1H),5.57(s,2H),4.26(m,2H),4.02(m,1H),3.95(s,3H),3.78(m,6H),3.55(m,2H),3.44(m,1H),3.23(m,3H),3.12(m,2H),2.76(m,2H),2.53(m,1H),1.53(m,2H),1.30(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=710.3。
向圓底燒瓶中裝入(2R)-2-胺基-3-((1-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸(C-1)並溶解於PBS緩衝液(pH 7.5，100mM磷酸鹽與5nM EDTA)及乙腈(1：1,0.012M)中。隨後將反應混合物於40℃下攪拌6小時。此時，使粗製反應混合物冷卻至室溫並藉由RP-HPLC(0.5M ACN中之NH4OAc：10mM H2O中之NH4OAc，C18管柱)純化，從而得到固體狀呈區域異構物及非鏡像異構物之混合物形式之(6R)-6-(2-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-2-側氧基乙
基)-5-側氧基硫嗎啉-3-甲酸(C-3)。1H NMR(CD3OD)：δ 7.38(d,1H),7.13(s,1H),6.94(d,1H),6.74(d,1H),6.22(d,1H),5.52(s,2H),4.24(m,1H),3.93(s,3H),3.82(m,1H),3.67(s,2H),3.60(m,4H),3.54(t,2H),3.43(m,2H),3.18(m,1H),3.01(m,1H),2.87(m,1H),2.58(m 7H),1.50(m,2H),1.29(m,2H),1.17(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=710.4。
向圓底燒瓶中裝入1-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-1,1.0當量)、L-半胱胺酸(1.0當量)及PBS：MeCN(2：1,0.008M)。將反應混合物於室溫下攪拌1小時且隨後向反應混合物中添加1M NaOH(20.0當量)。隨後將反應物再攪拌3小時，隨後藉由RP-HPLC(0.5mM MeCN中之NH4OAc：10mM H2O中之NH4OAc，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-4aSR)、C-4aRR)、(C-4bRR)及(C-4bRR))形式之3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲
基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-4a)及2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-4b)之混合物：1H NMR(DMSO)：δ 7.88(s,1),7.26(s,1H),6.98(s,1H),6.77(d,1H),6.64(s,1H),6.46(s,1H),6.01(s,1H),5.40(s,2H),3.85(s,3H),3.36(m,17H),2.29(m,8H),1.90(s,2H),1.39(m,2H),1.21(m,2H),1.09(m,2H),0.81(t,3H)。LRMS[M+H]=728.4。
(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-4aSR)；
(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-4aRR)
(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-
側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-4bRR)
(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-4bSR)。
向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醛(4.0當量)、氰基硼氫化鈉(13.0當量)及MeOH(0.04M)。將反應混合物於室溫下攪拌1小時且隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-5)：1H NMR(CDCl3)：δ 7.32(d,1H),7.12(d,1H),6.87(d,1H),6.72(s,2H),6.70(d,1H),6.41(d,1H),5.45(t,1H),5.31(s,2H),4.07(s,2H),3.95(s,3H),3.73(t,2H),3.40(m,4H),3.17(m,6H),2.89(m,4H),1.39(m,2H),1.26(m,2H),1.14(m,2H),0.86(t,3H)。LRMS[M+H]=
561.3。
注意：藉由向圓底燒瓶中添加1-(2-羥基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1.0當量)、戴斯-馬丁過碘烷(Dess-Martin periodinane)(1.5當量)及DCM(0.1M)並於室溫下攪拌2小時製備2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醛。隨後過濾反應混合物，在真空中移除揮發性物質且產物不經進一步純化即使用。
(C-6)係遵循類似於實例2之程序製備，只是使用化合物(C-5)代替化合物(C-1)，從而得到固體狀呈非鏡像異構物之混合物之TFA鹽形式之(2S)-2-胺基-3-((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-2,5-二側氧基吡咯啶-3-基)硫基)丙酸(C-6)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.36(d,1H),7.21(m,1H),7.02(m,1H),6.78(m,1H),6.23(d,1H),5.56(m,2H),4.21(m,1H),4.09(s,1H),4.03(m,1H),3.95(m,3H),3.75(m,2H),3.54(t,2H),3.43(m,1H),3.34
(m,1H),3.22(m,2H),3.03(m,6H),2.84(m,2H),2.63(m,1H),1.52(m,2H),1.30(m,2H),1.18(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=682.4。
(C-7)係遵循類似於實例3之程序製備，只是使用化合物(C-5)代替化合物(C-1)，從而得到固體狀呈區域異構物及非鏡像異構物之混合物形式之(6R)-6-(2-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-2-側氧基乙基)-5-側氧基硫嗎啉-3-甲酸(C-7)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.37(d,1H),7.10(s,1H),6.91(d,1H),6.72(d,1H),6.22(d,1H),5.51(s,2H),4.13(m,1H),3.92(s,3H),3.88(m,1H),3.58(s,2H),3.52(t,2H),3.40(m,2H),3.16(m,1H),2.99(m,1H),2.86(m,1H),2.67(m10H),1.49(m,2H),1.29(m,2H),1.17(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=682.3。
3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-8a)及2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-8b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-5)代替化合物(C-1)，以產生固體狀呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-8aSR)、(C-8aRR)、(C-8bRR)及(C-8bRR))形式之化合物(C-8a)及(C-8b)之混合物：1H NMR(DMSO)：δ 7.81(s,1),7.33(s,1H),6.96(s,1H),6.76(d,1H),6.69(s,1H),6.48(s,1H),6.10(s,1H),5.45(s,2H),3.82(s,3H),3.37(m,17H),2.35(m,8H),1.90(s,2H),1.41(m,2H),1.20(m,2H),1.08(m,2H),0.80(t,3H)。LRMS[M+H]=700.4。
(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙
基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)
甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-8aSR)；
(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-8aRR)；
(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-8bRR)；
(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧
基乙基)硫基)-4-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-8bSR)。
1-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-9)係遵循類似於實例1之程序製備，只是使用3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸代替3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之1-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-9)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.37(d,1H),7.27(d,1H),7.06(d,1H),6.82(s,2H),6.81(d,1H),6.24(d,1H),5.58(s,2H),4.38(s,2H),3.96(s,3H),3.86(m,4H),3.67(m,4H),3.56(m,4H),3.24(m,4H),2.61(t,2H),1.53(m,2H),1.31(m,2H),1.20(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=633.3。
3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-10a)及2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-10b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-9)代替化合物(C-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-10aSR)、(C-10aRR)、(C-10bRR)及(C-10bRR))形式之化合物(C-10a)及(C-10b)之混合物。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物：1H NMR(CD3OD)：δ 7.35(d,1H),7.29(d,1H),7.05(d,1H),6.77(m,1H),6.23(s,1H),5.56(s,2H),4.32(m,2H),3.94(s,3H),3.86(m,3H),3.72(m,3H),3.54(m,10H),3.21(m,4H),2.67(m,4H),1.52(m,2H),1.30(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=772.4。
(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-10aSR)；
(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-10aRR)；
(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-10bRR)；
(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-10bSR)。
1-(2-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙氧基)
乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-11)係遵循類似於實例1之程序製備，只是使用3-(2-(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸代替3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之1-(2-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-11)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.37(d,1H),7.26(d,1H),7.05(d,1H),6.82(d,1H),6.80(s,2H),6.24(d,1H),5.58(s,2H),4.32(s,2H),3.96(s,3H),3.74(t,2H),3.64(m,2H),3.58(m,12H),3.64(m,4H),3.20(m,4H),2.68(m,2H),1.53(m,2H),1.32(m,2H),1.20(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=721.4。
(2R)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,19-二側氧基-10,13,16-三氧雜-4-硫雜-7-氮雜十九-1-酸(C-12)及(19R)-19-胺基
-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,14-二側氧基-4,7,10-三氧雜-17-硫雜-13-氮雜二十碳烷-20-酸(C-12b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-11)代替化合物(C-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-12aSR)、(C-12aRR)、(C-12bRR)及(C-12bRR))形式之化合物(C-12a)及(C-12b)之混合物。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物：1H NMR(CD3OD)：δ 7.36(d,1H),7.31(s,1H),7.06(d,1H),6.79(d,1H),6.24(d,1H),5.57(s,2H),4.34(s,2H),4.23(m,1H),3.96(s,3H),3.86(m,4H),3.76(m,4H),3.58(m,14H),3.27(m,4H),3.22(m,2H),2.84(m,1H),2.71(m,2H),1.53(m,2H),1.31(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=860.4。
(2R,5S)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,19-二側氧基-10,13,16-三氧雜-4-硫雜-7-氮雜十九-1-酸(C-12aSR)；
(2R,5R)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,19-二側氧
基-10,13,16-三氧雜-4-硫雜-7-氮雜十九-1-酸(C-12aRR)；
(16R,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,14-二側氧基-4,7,10-三氧雜-17-硫雜-13-氮雜二十碳烷-20-酸(C-12bRR)；
(16S,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,14-二側氧基-4,7,10-三氧雜-17-硫雜-13-氮雜二十碳烷-20-酸(C-12bSR)。
1-(21-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-21-側氧基-3,6,9,12,15,18-六氧雜二十一烷基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-13)係遵循類似於實例1之程序製備，只是使
用1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15,18-六氧雜二十一碳烷-21-酸代替3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之1-(21-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-21-側氧基-3,6,9,12,15,18-六氧雜二十一烷基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-13)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.38(d,1H),7.27(d,1H),7.07(d,1H),6.84(d,1H),6.82(s,2H),6.25(d,1H),5.59(s,2H),4.36(s,2H),3.97(s,3H),3.65(m,32H),3.20(m,4H),2.71(m,2H),1.55(m,2H),1.32(m,2H),1.21(m,2H),0.89(t,3H)。LCMS[M+H]=853.5。
(2R)-2-胺基-28-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,28-二側氧基
-10,13,16,19,22,25-六氧雜-4-硫雜-7-氮雜二十八烷-1-酸(C-14a)及(28R)-28-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-25-羧基-1,23-二側氧基-4,7,10,13,16,19-六氧雜-26-硫雜-22-氮雜二十九烷-29-酸(C-14b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-13)代替化合物(C-1)，以提供固體狀呈HCl鹽形式之呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-14aSR)、(C-14aRR)、(C-14bRR)及(C-14bRR))形式之化合物(C-14a)及(C-14b)之混合物(在RP-HPLC純化後，將產物溶解於乙腈中，用過量2N HCl處理，且隨後凍乾)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.47(s,1H),7.39(d,1H),7.13(d,1H),6.82(d,1H),6.25(d,1H),5.58(s,2H),4.38(s,2H),4.32(m,1H),4.00(s,3H),3.77(m,4H),3.76(m,4H),3.64(m,28H),3.55(m,5H),3.31(m,4H),3.12(m,1H),2.86(m,1H),2.72(s,2H),2.62(m,1H),1.54(m,2H),1.31(m,2H),1.20(m,2H),0.89(t,3H)。LCMS[M+H]=992.4。
(2R,5S)-2-胺基-28-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,28-二側氧基-10,13,16,19,22,25-六氧雜-4-硫雜-7-氮雜二十八烷-1-酸(C-14aSR)；
(2R,5R)-2-胺基-28-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,28-二側氧
基-10,13,16,19,22,25-六氧雜-4-硫雜-7-氮雜二十八烷-1-酸(C-14aRR)；
(25R,28R)-28-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-25-羧基-1,23-二側氧基-4,7,10,13,16,19-六氧雜-26-硫雜-22-氮雜二十九烷-29-酸(C-14bRR)；
(25S,28R)-28-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-25-羧基-1,23-二側氧基-4,7,10,13,16,19-六氧雜-26-硫雜-22-氮雜二十九烷-29-酸(C-14bSR)。
步驟1：1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)
甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)丙-1-酮係遵循類似於實例1之程序製備，只是使用3-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)丙酸代替3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸。
步驟2：向圓底燒瓶中裝入1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)丙-1-酮(1.0當量)、CuSO4(0.25當量)、L-抗壞血酸鈉鹽(1.1當量)、1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2.2當量)及t-BuOH/水混合物(1：1,v/v,0.012M)。將反應混合物放置於真空下且隨後用N2沖洗(將此再重複四次)。隨後將反應混合物於室溫下攪拌2小時且藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)隨後純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之1-((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-15)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.94(s,1H),7.37(d,1H),7.29(s,1H),7.05(d,1H),6.85(s,2H),6.81(d,1H),6.24(d,1H),5.57(s,2H),4.73(s,2H),4.52(t,2H),4.36(s,2H),3.95(s,3H),3.85(t,2H),3.84(m,4H),3.66(t,2H),3.54(m,6H),3.27(m,4H),2.63(t,2H),1.53(m,2H),1.30(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=758.4。
3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-16a)及2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-16b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-15)代替化合物(C-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-16aSR)、(C-16aRR)、(C-16bRR)及(C-16bRR))形式之化合物(C-16a)及(C-16b)之混合物。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物：1H NMR(CD3OD)：δ 7.91(s,1H),7.36(d,1H),7.30(s,1H),7.06(d,1H),6.80(d,1H),6.24(d,1H),5.57(s,2H),4.54(s,2H),4.44(m,2H),4.34(s,2H),4.25(m,1H),3.95(s,3H),4.83(m,6H),3.68(t,2H),3.55(m,6H),3.25(m,2H),2.86(m,1H),2.64(m,2H),1.53
(m,2H),1.30(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=897.4
(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-16aSR)；
(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-16aRR)；
(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-16bRR)；
(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基
-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-16bSR)。
N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺(C-17)係遵循類似於實例1之程序製備，只是使用3-(2-(2-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸代替3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺(C-17)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.37(d,1H),7.28(d,1H),7.06(d,1H),6.82(d,1H),6.80(s,2H),6.24(d,1H),5.58(s,2H),4.37(s,2H),3.96(s,3H),3.84(m,4H),3.40(m,4H),3.56(m,6H),3.48(t,2H),3.20(m,6H),2.69(t,2H),2.45(t,2H),1.53(m,2H),1.31(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=748.4。
(19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-(羧基甲基)-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,14-二氮雜二十碳烷-20-酸(C-18a)及(20R)-20-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-17-羧基-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-18-硫雜-10,14-二氮雜二十一碳烷-21-酸(C-18b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-17)代替化合物(C-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-18aSR)、(C-18aRR)、(C-18bRR)及(C-18bRR))形式之化合物(C-18a)及(C-18b)之混合物。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物：1H NMR(CD3OD)：δ 7.37(d,1H),7.30(s,1H),7.07(d,1H),6.80(d,1H),6.25(d,1H),5.57(s,2H),4.35(s,2H),4.19(m,1H),3.95(s,3H),3.89(s,3H),3.76(m,3H),3.60(s,4H),3.53(m,4H),
3.41(m,1H),3.36(m,2H),3.22(s,2H),2.70(t,2H),2.42(2H),1.53(m,2H),1.30(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=887.4。
(16S,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-(羧基甲基)-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,14-二氮雜二十碳烷-20-酸(C-18aSR)；
(16R,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-(羧基甲基)-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,14-二氮雜二十碳烷-20-酸(C-18aRR)；
(17R,20R)-20-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-17-羧基-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-18-硫雜-10,14-二氮雜二十一碳烷-21-酸(C-18bRR)；
(17S,20R)-20-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-17-羧基-1,11,15-三側氧基-4,7-二氧雜-18-硫雜-10,14-二氮雜二十一碳烷-21-酸(C-18bSR)。
5-(4-((4-(3-胺基丙基)六氫吡嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(C-19)係藉由兩步順序製備。在第一步驟中，向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、(3-溴丙基)胺基甲酸第三丁基酯(1.2當量)、Huenig鹼(2.4當量)及DMF(0.2M)。將反應混合物加熱至60℃且隨後攪拌18小時。隨後將粗製反應混合物冷卻至室溫並藉由ISCO層析(0-20% MeOH：DCM)純化，以提供中間體(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)丙基)胺基甲酸第三丁基酯。在第二步驟中，使用類似於(Int-1)之合成中之最後一個步驟之程序以獲得固體狀5-(4-((4-(3-胺基丙基)六氫吡嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(C-19)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.24(d,1H),7.10(d,1H),6.85(d,1H),6.57
(d,1H),6.11(s,1H),5.42(s,2H),3.95(s,3H),3.52(s,2H),3.35(m,2H),2.80(t,2H),2.51(m,4H),2.45(m,4H),1.72(m,2H),1.40(m,2H),1.28(m,4H),1.15(m,2H),0.88(t,3H)。LRMS[M+H]=495.3。
1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)丙-1-酮(C-20)係遵循實例19之程序製備，只是使用2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11-三氧雜-5-氮雜十四烷-14-酸代替(3-溴丙基)胺基甲酸第三丁基酯，從而得到固體狀1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)丙-1-酮(C-20)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.24(d,1H),7.11(s,1H),6.86(d,1H),6.57(d,1H),6.12(d,1H),5.42(s,2H),3.96(s,3H),3.76(t,2H),3.59(m,12H),3.37(t,2H),2.76(t,2H),2.66(t,2H),2.45(m,4H),1.41(m,2H),1.28(m,2H),1.16(m,2H),0.89(t,3H)。LRMS[M+H]=597.4。
向圓底燒瓶中裝入1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)丙-1-酮(C-20)(1.0當量)、DIEA(10.0當量)及DMF(0.004M)並將混合物於室溫下攪拌15分鐘。隨後向燒瓶中裝入2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(1.5當量)、DIEA(10.0當量)及DMF(0.006M)。亦將此混合物於室溫下攪拌15分鐘且隨後混合兩種溶液並將反應混合物於室溫下攪拌1小時。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙醯胺(C-21)：1H NMR(CD3CN)：δ 7.30(d,1H),7.05(s,1H),6.98(s,1H),6.86(d,1H),6.82(s,2H),6.74(s,1H),6.68(d,1H),6.21(d,1H),6.08(t,1H),5.38(s,2H),4.08(s,2H),3.89(s,3H),3.70(t,2H),3.41(m,14H),3.29(m,2H),2.55,(t,2H),2.38(m,4H),1.41(m,2H),1.26(m,2H),1.13(m,2H),0.85(t,3H)。LCMS[M+H]=734.4。
(2R)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,9,19-三側氧基-13,16-二氧雜-4-硫雜-7,10-二氮雜十九-1-酸(C-22a)及(19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,11,14-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,13-二氮雜二十碳烷-20-酸(C-22b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-21)代替化合物(C-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-22aSR)、(C-22aRR)、(C-22bRR)及(C-22bRR))形式之化合物(C-22a)及(C-22b)之混合物。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物：1H NMR(CD3OD)：δ 7.37(d,1H),7.32(s,1H),7.08(d,1H),6.81(d,1H),6.24(d,1H),5.57(s,2H),4.34(s,2H),4.20(m,1H),3.96(s,3H),3.82(m,9H),3.56(m,9H),3.38(m,3H),3.21(m,2H),2.70(t,2H),1.54(m,2H),1.32(m,2H),1.19(m,2H),0.89(t,3H)。LCMS[M+H]=873.4。
(2R,5S)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,9,19-三側氧基-13,16-二氧雜-4-硫雜-7,10-二氮雜十九-1-酸(C-22aSR)；
(2R,5R)-2-胺基-19-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-(羧基甲基)-6,9,19-三側氧基-13,16-二氧雜-4-硫雜-7,10-二氮雜十九-1-酸(C-22aRR)；
(16R,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,11,14-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,13-二氮雜二十碳烷-20-酸(C-22bRR)；
(16S,19R)-19-胺基-1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并
[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-16-羧基-1,11,14-三側氧基-4,7-二氧雜-17-硫雜-10,13-二氮雜二十碳烷-20-酸(C-22bSR)。
向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1當量)、(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸4-硝基苯基酯(0.9當量)、三乙胺(3.0當量)及DMSO(0.01M)。將反應混合物於室溫下攪拌2小時且隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)-N-(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)六氫吡嗪-1-甲醯胺(C-23)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.96(s,1H),7.36(d,1H),7.26(d,1H),7.05(d,1H),6.85(s,2H),6.79(d,1H),6.24(d,1H),5.57(s,2H),4.74(s,2H),4.53(t,2H),4.35(s,2H),3.95(s,3H),3.86(t,2H),3.85(m,4H),3.54(m,12H),3.22(m,6H),1.53(m,2H),1.30(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=817.4。
注意：(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸4-硝基苯基酯
係使用以下程序製備：
步驟1：向2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙胺(1.0當量)於CH2Cl2(0.05M)中之溶液中添加三乙胺(2.5當量)及二碳酸二第三丁基酯(1.1當量)並將反應混合物於室溫下攪拌30分鐘。隨後將反應混合物在真空中濃縮並使用RP-C18 ISCO純化殘餘物且隨後凍乾，以產生(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸第三丁基酯。
步驟2：將(2-(2-(2-(2-疊氮基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸第三丁基酯(1當量)及1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2.0當量)於t-BuOH(0.08M)中之溶液用N2氣沖洗五次且隨後添加L-抗壞血酸鈉鹽(1.0當量0.16M於H2O中)及CuSO4(0.2當量0.03M於H2O中)。將反應混合物再次用N2氣沖洗五次且隨後於室溫下攪拌4h。隨後將反應混合物藉由ISCO RP-C18純化並凍乾，從而得到(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸第三丁基酯。
步驟3：將(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸第三丁基酯於TFA(0.02M)中之溶液在真空中濃縮，從而得到1-((1-(23-胺基-3,6,9,12,15,18,21-七氧雜二十三基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-1H-吡咯
-2,5-二酮。LCMS[M+H]=354.2。
步驟4：向1-((1-(2-(2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1當量)於CH2Cl2(0.01M)中之溶液中添加氯甲酸4-硝基苯基酯(1.10當量)及三乙胺(2.50當量)並將反應混合物於室溫下攪拌10分鐘。隨後將反應混合物在真空中濃縮，藉由RP-C18 ISCO純化且隨後凍乾，從而得到(2-(2-(2-(2-(4-((2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸4-硝基苯基酯，LCMS[M+H]=519.2。
3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺
基)-4-側氧基丁酸(C-24a)及2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-24b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-23)代替化合物(C-1)，以提供固體狀呈TFA鹽形式之呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-24aSR)、(C-24aRR)、(C-24bRR)及(C-24bRR))形式之化合物(C-24a)及(C-24b)之混合物。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物：LCMS[M+H]=956.4。
(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-24aSR)；
(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-24aRR)；
(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-24bRR)；
(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-1-側氧基-5,8,11-三氧雜-2-氮雜十三烷-13-基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-24bSR)。
向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙醛(4.0當量)、氰基硼氫化鈉(13.0當量)及MeOH(0.04M)。將反應混合物於室溫下攪拌1小時。隨後藉由RP-HPLC
(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之1-(2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-25)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.36(d,1H),7.16(d,1H),6.96(d,1H),6.83(s,2H),6.76(d,1H),6.23(d,1H),5.53(s,2H),3.93(s,3H),3.84(s,2H),3.78(m,2H),3.71(m,2H),3.64(m,2H),3.54(m,2H),3.35(m,4H),3.27(t,2H),2.95(m,4H),1.52(m,2H),1.30(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=605.4。
注意：藉由向圓底燒瓶中添加1-(2-(2-羥基乙氧基)乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(1.0當量)、戴斯-馬丁過碘烷(1.5當量)及DCM(0.1M)並將反應混合物於室溫下攪拌2小時製備2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙醛。隨後過濾反應混合物，在真空中移除揮發性物質且產物不經進一步純化即使用。
3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-26)及2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-26b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-25)代替化合物(C-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-26aSR)、(C-26aRR)、(C-26bRR)及(C-26bRR))形式之化合物(C-26a)及(C-26b)之混合物。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物：LCMS[M+H]=744.4。
(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-26aSR)；
(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)
乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-26aRR)；
(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-26bRR)；
(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-26bSR)。
步驟1：向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、2-疊氮基乙醛(4.0當量)、氰基硼氫化鈉(32.0當量)及MeOH(0.02M)。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05%
H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀5-(4-((4-(2-疊氮基乙基)六氫吡嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺：LCMS[M+H]=507.3。
步驟2：向圓底燒瓶中裝入5-(4-((4-(2-疊氮基乙基)六氫吡嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(1.0當量)、1-(丙-2-炔-1-基)-1H-吡咯-2,5-二酮(2.3當量)及t-BuOH與水之混合物(2：1,v/v,0.008M)。將反應混合物在真空下脫氣並用N2沖洗五次以移除O2。使用注射器向反應混合物中添加L-抗壞血酸鈉鹽(1.1當量於0.5ml H2O中，在真空下脫氣並用N2沖洗五次以移除O2)，且隨後使用注射器添加CuSO4(0.2當量於0.5ml水中，在真空下脫氣並用N2沖洗五次以移除O2)。隨後於將反應混合物室溫下攪拌2小時。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之1-((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-27)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.95(s,1H),7.36(d,1H),7.22(d,1H),7.02(d,1H),6.86(s,2H),6.79(d,1H),6.23(d,1H),5.57(s,2H),4.76(s,2H),4.52(t,2H),4.26(s,2H),3.95(s,3H),3.54(t,2H),2.85(m,8H),2.94(t,2H),1.53(m,2H),1.31(m,2H),1.18(m,2H),0.88(t,3H)。LCMS[M+H]=642.4。
注意：藉由向圓底燒瓶中添加2-疊氮基乙醇(1.0當量)、戴斯-馬丁過碘烷(1.5當量)及DCM(0.20M)且隨後將反應混合物於室溫下攪拌2小時製備2-疊氮基乙醛。隨後過濾反應混合物，在真空中移除揮發性物質且產物不經進一步純化即使用。
3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-28a)及2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-28b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-27)代替化合物(C-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-28aSR)、(C-28aRR)、(C-28bRR)及(C-28bRR))形式之化合物(C-28a)及(C-28b)之混合物。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物：LCMS[M+H]=781.4
(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-28aSR)；
(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-28aRR)；
(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-28bRR)；
(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-(((1-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-28bSR)。
N-(21-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-21-側氧基-3,6,9,12,15,18-六氧雜二十一烷基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺(C-29)係遵循類似於實例1之程序製備，只是使用1-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3-側氧基-7,10,13,16,19,22-六氧雜-4-氮雜二十五-25-酸代替3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之N-(21-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-21-側氧基-3,6,9,12,15,18-六氧雜二十一烷基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺(C-29)：1H NMR(DMSO)：δ 8.00(t,1H),7.42(d,1H),7.38(s,3H),7.20(s,1H),7.00(s,2H),6.95(s,1H),6.57(s,1H),6.23(d,1H),5.57(s,2H),4.30(s,2H),3.87(s,3H),3.59(m,4H),3.49(m,28H),3.35(t,2H),3.14(m,2H),2.32(m,2H),1.45(m,2H),1.21(m,2H),1.09(m,2H),0.81(t,3H)。LRMS[M+H]=924.4。
步驟1：向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、HOAT(2.0當量)、Huenig鹼(14.0當量)、((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基)-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯(1.2當量)及吡啶：DMF(1：4,0.02M)。將反應混合物於室溫下攪拌4小時，且隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯：LCMS[M+H]=1065.5。
步驟2：將4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯溶解於DMF(0.007M)中並添加六氫吡啶(100.0當量)。將反應物於室溫下攪拌30分鐘。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯：LCMS[M+H]=843.5。
步驟3：向圓底燒瓶中裝入4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-胺基-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯(1.0當量)、3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸(1.1當量)、Huenig鹼(5.0當量)、HATU(1.05當量)及DMF(0.004M)。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苄基酯(C-30)：LCMS[M+H]=1038.5。
步驟1：向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-4-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量),HOAT(2.0當量)、Huenig鹼(14.0當量)、(3S,4R,5R,6R)-三乙酸2-(2-(3-((((9H-茀-9-
基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三基酯(1.2當量)及吡啶：DMF(1：4,0.015M)。將反應混合物於室溫下攪拌4小時。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀(3S,4R,5R,6R)-三乙酸2-(2-(3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三基酯：LCMS[M+H]=1212.4。
步驟2：將(3S,4R,5R,6R)-三乙酸2-(2-(3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三基酯(1.0當量)溶解於MeOH、THF及水(2：1：0.4)(0.005M)中。隨後添加LiOH(8.0當量)並將反應物於室溫下攪拌2小時。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀(2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-胺基丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸：LCMS[M+H]=850.4。
步驟3：向圓底燒瓶中裝入(2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-胺基丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸(1.0當量)、3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸(2.0當量)、
Huenig鹼(6.0當量)、HBTU(1.8當量)及DMF(0.003M)。將反應物於室溫下保持攪拌15分鐘。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之(2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸(C-31)：LCMS[M+H]=1001.3。
(S)-1-(3-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-32)係遵循類似於實例1之程序製備，只是使用化合物(Int-2)代替化合物(Int-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之(S)-1-(3-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-32)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.49(d,2H),7.21(d,1H),6.82(s,2H),6.77(d,1),6.28(d,1H),5.67(d,1H),5.51(d,1H),4.36(m,1H),4.18(s,2H),3.98(s,3H),
3.76(t,2H),3.54(dd,1H),3.46(dd,1H),3.16(m,4H),3.05(m,4H),2.71(t,2H),1.48(m,1H),1.26(m,3H),1.05(m,1H),0.84(t,3H)。LRMS[M+H]=619.4。
1-(3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-33)係遵循類似於實例1之程序製備，只是使用化合物(Int-3)代替化合物(Int-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之1-(3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(C-33)。LRMS[M+H]=589.3。
3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-34)及2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-34b)係遵循類似於實例4之程序製備，只是使用化合物(C-33)代替化合物(C-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之呈其各別非鏡像異構物(下文化合物(C-34aSR)、(C-34aRR)、(C-34bRR)及(C-34bRR))形式之化合物(C-34a)及(C-34b)之混合物。藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物：1H NMR(DMSO)：δ 7.51(s,2H),7.39(m,2H),7.27(d,1H),7.15(d,1H),6.59(s,1H),6.22(t,1H),5.56(s,2H),3.86(s,4H),3.66(m,3H),3.42(m,8H),3.25(m,4H),3.08(m,2H),2.81(m,3H),2.65(m,1H),1.43(m,2H),1.22(m,3H),1.07(m,2H),0.83(t,3H)。LCMS[M+H]=728.3
(S)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-
側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-34aSR)；
(R)-3-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-34aRR)；
(R)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-34bRR)；
(S)-2-(((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)-4-((3-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙基)胺基)-4-側氧基丁酸(C-34bSR)。
步驟1：向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、2-(((第三丁氧基羰基)胺基)氧基)乙酸(1.1當量)、HATU(1.05當量)、Huenig鹼(5.0當量)及DMF(0.2M)。將反應混合物於室溫下攪拌18小時且隨後藉由ISCO層析(0-20% MeOH：DCM)純化粗製反應混合物，以提供2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-側氧基乙氧基胺基甲酸第三丁基酯。
步驟2：於0℃下向裝有2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-側氧基乙氧基胺基甲酸第三丁基酯(1.0當量)及DCM(0.1M)之圓底燒瓶中添加HCl(20.0當量，4M於二噁烷中)。移除冷浴並將反應混合物於室溫下攪拌3小時。在真空中移除揮發性物質。向所得殘餘物中添加MeOH(具有8% NH4OH)並在真空中移除揮發性物質。將此再重複2次。隨後藉由ISCO層析(0-10% MeOH(8% NH4OH)：DCM)純化粗製反應混合物，以遞送固體狀1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-(胺基氧基)乙酮(C-35)：1H NMR(CDCl3)：δ 7.12(d,1H),7.00(s,1H),6.90(s,1H),6.69(d,1H),6.38(d,1H),5.52(t,1H),5.30(s,2H),4.35(s,2H),3.94(s,3H),3.64(s,2H),3.52(m,2H),3.38(m,4H),2.44(m,4H),1.62(s,2H),1.45(m,2H),1.38(m,2H),1.25(m,2H),1.12(m,2H),0.87(t,3H)。LRMS[M+H]=511.4。
1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-胺基乙氧基)丙-1-酮(C-36)係遵循類似於實例35之程序製備，只是使用3-(2-((第三丁氧基羰基)胺基)乙氧基)丙酸代替2-(((第三丁氧基羰基)胺基)氧基)乙酸，從而得到固體狀1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-胺基乙氧基)丙-1-酮(C-36)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.26(d,1H),7.09(d,1H),6.86(d,1H),6.59(d,1H),6.13(d,1H),5.43(s,2H),4.57(s,2H),3.94(s,3H),3.73(t,2H),3.58(m,4H),3.54(m,2H),3.37(m,2H),2.93(t,2H),2.66(m,2H),2.44(m,4H),1.41(m,2H),1.27(m,2H),1.15(m,2H),0.87(t,3H)。LRMS[M+H]=553.4。
N-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙
醯胺(C-37)係遵循類似於實例35之程序製備，只是使用1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-胺基乙氧基)丙-1-酮(C-36)代替Int-1，從而得到固體狀N-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺(C-37)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.27(d,1H),7.09(d,1H),6.86(d,1H),6.59(d,1H),6.13(d,1H),5.44(s,2H),4.08(s,2H),3.93(s,3H),3.72(t,2H),3.56(m,8H),3.40(m,4H),2.64(t,2H),2.44(m,4H),1.43(m,2H),1.27(m,2H),1.14(m,2H),0.87(t,3H)。LRMS[M+H]=626.4。
(S)-1-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-(胺基氧基)乙酮(C-38)係遵循類似於實例35之程序製備，只是使用化合物(Int-2)代替化合物(Int-1)，從而得到固體狀(S)-1-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-(胺基氧基)乙酮(C-38)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.54(d,1),7.40(d,1H),7.13(d,1H),6.68(s,1H),6.29(d,1H),5.69(d,1H),5.48(d,1H),4.36(m,3H),3.96(s,3H),3.74(m,2H),3.51(m,4H),2.66(m,4H),1.49(m,1H),1.38(m,3H),1.24(m,2H),0.96(m,2H),0.84(t,3H)。LRMS
[M+H]=541.3。
(S)-1-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)丙-1-酮(C-39)係遵循類似於實例35之程序製備，只是使用化合物(Int-2)代替化合物(Int-1)且使用2,2-二甲基-4-側氧基-3,8,11-三氧雜-5-氮雜十四烷-14-酸代替2-(((第三丁氧基羰基)胺基)氧基)乙酸，從而得到固體狀(S)-1-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)丙-1-酮(C-39)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.56(d,1H),7.44(d,1H),7.16(d,1H),6.77(s,1H),6.31(d,1H),5.71(d,1H),5.50(d,1H),4.38(m,1H),3.98(s,3H),3.78(m,4H),3.72(m,2H),3.67(m,6H),3.53(m,4H),3.14(m,2H),2.77(m,2H),2.69(m,4H),1.51(m,1H),1.26(m,3H),1.02(m,2H),0.86(t,3H)。LRMS[M+H]=627.5。
(S)-N-(2-(2-(3-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺(C-40)係遵循類似於實例35之程序製備，只是使用化合物(C-39)代替化合物(Int-1)，從而得到固體狀(S)-N-(2-(2-(3-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺(C-40)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.54(d,1H),7.47(d,1H),7.17(d,1H),6.78(s,1H),6.30(d,1H),5.68(d,1H),5.50(d,1H),4.36(m,1H),4.09(s,2H),3.97(s,3H),3.73(m,8H),3.56(m,4H),3.43(t,2H),3.23(m,2H),2.88(m,4H),2.66(t,2H),1.49(m,1H),1.26(m,3H),1.04(m,2H),0.84(t,3H)。LRMS[M+H]=700.4。
N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺(C-41)係遵循類似於實例35之程序製備，只是使用
化合物(C-20)代替化合物(Int-1)，從而得到固體狀N-(2-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺(C-41)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.25(d,1H),7.11(s,1H),6.86(d,1H),6.58(d,1H),6.12(d,1H),5.43(s,2H),4.10(s,2H),3.96(s,3H),3.76(t,2H),3.60(m,12H),3.44(t,2H),3.36(t,2H),2.66(t,2H),2.46(m,4H),1.40(m,2H),1.30(m,2H),1.15(m,2H),0.89(t,3H)。LRMS[M+H]=670.4。
步驟1. 在第一步驟中，向圓底燒瓶中裝入DCE(0.02M)中之5-(2-甲氧基-4-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)及2-(2-((1,3-二側氧基異吲哚啉-2-基)氧基)乙氧基)乙醛(1.2當量)並向此混合物中添加乙酸(6.0當量)，將混合物於室溫下攪拌15分鐘，隨後添加三乙醯氧基硼氫化鈉(3.0當量)。於室溫下再繼續攪拌3小時。隨後在真空中移除揮發性物質。將殘餘物溶解於MeOH中並藉由反相HPLC使用C18管柱(用含有0.05% TFA之10-50%乙腈-H2O溶析)純化，以遞送2-(2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)異吲哚啉-1,3-二酮。LCMS[M+H]=671.40。
步驟2. 向圓底燒瓶中裝入2-(2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)異吲哚啉-1,3-二酮(1.0當量)、水合肼(10.0當量)、MeOH(0.02M)及水(0.2M)。將混合物於室溫下攪拌4小時。藉由反相HPLC使用C18管柱(用含有0.05% TFA之10-50%乙腈-H2O溶析)純化反應混合物。將含有期望產物之部分彙集並在減壓下濃縮，隨後將殘餘物溶解於MeOH中並裝載至預處理之Sphere PL-HCO3 MP-樹脂管柱並用MeOH溶析，濃縮溶析液，從而得到固體狀5-(4-((4-(2-(2-(胺基氧基)乙氧基)乙基)六氫吡嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(C-42)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.22(d,1H),7.08(d,1H),6.83(d,1H),6.56(d,1H),6.10(d,1H),5.40(s,2H),3.94(s,3H),3.76(m,2H),3.60(m,4H),3.50(s,2H),3.34(d,3H),2.59(m,4H),2.49(s,4H),1.38(m,2H),1.26(m,2H),1.12(m,2H),0.87(t,3H)。LCMS[M+H]=541.40。
注意：2-(2-((1,3-二側氧基異吲哚啉-2-基)氧基)乙氧基)乙醛係以兩步製程製備。
步驟1：於0℃下向N-羥基酞醯亞胺(1.0當量)、二乙二醇(1.0當量)及三苯基膦(1.3當量)於THF(0.2M)中之溶液中添加DEAD(2.2M溶液，於甲苯中，1.3當量)。將所得溶液於室溫下攪拌過夜。在真空中濃縮反應混合物。藉由矽膠層析(用20-70%EtOA/己烷溶析)純化殘餘物。在此層析後，產物仍含有一些Ph3PO，隨後藉由反相層析(C18管柱，用20-40-100% CH3CN/水溶析)對其進行再純化，從而得到2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)異吲哚啉-1,3-二酮，LCMS[M+H]=252.10。
步驟2：向2-(2-(2-羥基乙氧基)乙氧基)異吲哚啉-1,3-二酮(1.0當量)及
碳酸氫鈉(2.0當量)於無水DCM(0.08M)中之攪拌混合物中添加戴斯-馬丁過碘烷(2.0當量)，將所得混合物於室溫下攪拌3小時。將反應混合物用DCM稀釋，隨後用1N NaOH溶液及鹽水洗滌，分離有機層並經MgSO4乾燥並在真空中蒸發。藉由矽膠層析(用30-70% EtAOc/己烷溶析)純化粗製混合物，以遞送2-(2-((1,3-二側氧基異吲哚啉-2-基)氧基)乙氧基)乙醛。LCMS[M+H]=250.10。
N-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)丙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺(C-43)係遵循類似於實例35之程序製備，只是使用化合物(C-19)代替化合物(Int-1)，從而得到固體狀N-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)丙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺(C-43)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.12(d,1H),6.98(d,1H),6.73(d,1H),6.45(d,1H),6.00(d,1H),5.30(s,2H),3.97(s,2H),3.84(s,3H),3.41(s,2H),3.25(s,2H),2.40(s,6H),2.27(m,3H),1.63(m,2H),1.28(m,2H),1.17(m,3H),1.02(m,2H),0.77(t,3H)。LCMS[M+H]=568.40。
5-(4-((4-(2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙基)六氫吡嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(C-44)係遵循類似於實例19之程序製備，只是使用(2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)乙基)胺基甲酸第三丁基酯代替(3-溴丙基)胺基甲酸第三丁基酯，從而得到固體狀5-(4-((4-(2-(2-(2-胺基乙氧基)乙氧基)乙基)六氫吡嗪-1-基)甲基)-2-甲氧基苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(C-44)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.36(d,1H),7.13(d,1H),6.92(d,1H),6.73(d,1H),6.21(s,1H),5.51(s,2H),3.92(s,3H),3.69(m,12H),3.53(t,2H),3.12(m,2H),2.84(m,8H),1.50(m,2H),1.28(m,2H),1.17(m,2H),0.87(t,3H)。LRMS[M+H]=569.3。
N-(2-(2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺
(C-43)係遵循類似於實例35之程序製備，只是使用化合物(C-44)代替
化合物(Int-1)，從而得到固體狀N-(2-(2-(2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺(C-45)：1H NMR(CDCl3)：δ 7.20(s,1H),6.97(d,1H),6.90(s,1H),6.87(s,1H),6.76(d,1H),6.56(d,1H),6.17(d,1H),5.84(s,2H),5.21(s,2H),4.69(m,2H),4.07(s,2H),3.85(s,3H),3.53(m,8H),3.45(m,2H),3.39(s,2H),3.24(m,2H),2.52(t,2H),2.40(m,8H),1.22(m,2H),1.16(m,2H),1.02(m,2H),0.78(t,3H)。LRMS[M+H]=642.4。
向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、二異丙基胺(1.3當量)、二琥珀醯亞胺戊二酸酯(disuccinimidal glutarate)(1.3當量)及DMSO(0.1M)。將反應混合物於室溫下攪拌3小時。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之5-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(C-46)：1H NMR(DMSO)：δ 7.41(s,1H),7.37(s,
3H),7.19(s,1H),6.94(s,1H),6.57(s,1H),6.22(d,1H),5.56(s,2H),4.30(s,2H),3.86(s,3H),3.44(m,4H),3.35(m,2H),2.92(m,2H),2.80(m,8H),2.71(m,2H),1.83(m,2H),1.44(m,2H),1.20(m,2H),1.09(m,2H),0.80(t,3H)。LRMS[M+H]=649.3。
(S)-5-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(C-47)係遵循類似於實例46之程序製備，只是使用化合物(Int-2)代替化合物(Int-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之(S)-5-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(C-47)：1H NMR(DMSO)：δ 7.54(s,1H),7.43(s,3H),7.22(s,1H),6.61(s,1H),6.28(d,1H),6.24(d,1H),5.67(d,1H),5.50(d,1H),4.82(s,1H),4.39(s,1H),4.22(m,2H),3.89(s,3H),3.36(m,4H),3.28(m,2H),2.92(m,2H),2.82(m,8H),2.72(m,2H),1.84(m,2H),1.34(m,2H),1.15(m,2H),0.86(m,2H),0.77(t,3H)。LRMS[M+H]=679.3。
向圓底燒瓶中裝入(S)-5-(4-(3-((2-胺基-4-((1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(C-47(1.0eq)、Boc-Lys-OH(2.0eq)、DIEA(5.0eq)及DMF(30mM)。將反應物於室溫下攪拌16小時且在真空中移除揮發性物質。使用RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，以獲得(S)-6-(5-(4-(3-((2-胺基-4-(((S)-1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊醯胺基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)己酸，LCMS[M+1]=810.5。將(S)-6-(5-(4-(3-((2-胺基-4-(((S)-1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊醯胺基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)己酸用30體積%之0.1M DCM中之TFA處理，且在真空中移除揮發性物質，以獲得固體狀呈TFA鹽形式之(S)-2-胺基-6-(5-(4-(3-((2-胺基-4-(((S)-1-羥基己-2-基)胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸(C-48)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.49(m,2H),7.21(d,1H),6.77(s,1H),6.29(d,1H),5.68(d,1H),5.50(d,1H),4.36(m,1H),4.20(m,2H),3.99(S,3H),3.93(m,1H),3.76(m,2H),3.50(m,2H),3.19(m,4H),2.44(t,2H),2.24(t,2H),2.16(m,4H),1.88(m,4H),1.51(m,
2H),1.25(m,6H),1.03(m,2H),0.84(t,3H)。LRMS[M+H]=710.3。
(S)-2-胺基-6-(5-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸(C-49)係遵循類似於實例48之程序製備，只是使用化合物(C-46)代替化合物(C-47)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之(S)-2-胺基-6-(5-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸(C-49)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.37(d,1H),7.22(d,1H),7.01(d,1H),6.78(d,1H),6.23(s,1H),5.56(s,2H),4.07(m,2H),3.95(s,3H),3.79(m,1H),3.73(m,2H),3.55(m,2H),2.98(m,4H),2.43(t,2H),2.23(t,2H),2.04(m,4H),1.89(m,4H),1.54(m,6H),1.30(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LRMS[M+H]=680.4。
5-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)丙基)胺基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(C-50)係遵循類似於實例46之程序製備，只是使用化合物(C-19)代替化合物(Int-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之5-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)丙基)胺基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(C-50)：1H NMR(DMSO)：δ 8.00(s,1H),7.40(m,4H),7.02(s,1H),6.82(s,1H),6.55(d,1H),6.21(d,1H),5.53(s,2H),3.83(,m,5H),3.00(m,8H),2.81(m,4H),2.69(m,2H),2.19(m,2H),1.84(m,2H),1.75(m,4H),1.45(m,2H),1.22(m,4H),1.09(m,4H),0.80(t,3H)。LRMS[M+H]=706.4。
(S)-2-胺基-6-(5-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)丙基)胺基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸(C-51)係遵循類似於實例48之程序製備，只是使用化合物(C-50)代替化合物(C-47)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之(S)-2-胺基-6-(5-((3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)丙基)胺基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸(C-51)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.35(d,1H),7.12(s,1H),6.94(d,1H),6.75
(d,1H),6.22(s,1H),5.52(s,2H),3.92(s,3H),3.86(t,1H),3.71(s,2H),3.54(m,2H),3.22(m,8H),3.05(m,2H),2.82(m,2H),2.21(m,4H),1.89(m,4H),1.53(m,6H),1.30(m,4H),1.18(m,2H),0.88(t,3H)。LRMS[M+H]=737.4。
5-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(C-52)係遵循類似於實例46之程序製備，只是使用化合物(Int-3)代替化合物(Int-1)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之5-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(C-52)：LRMS[M+H]=649.4。
(S)-2-胺基-6-(5-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸(C-53)係遵循類似於實例48之程序製備，只是使用化合物(C-52)代替化合物(C-47)，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之(S)-2-胺基-6-(5-(4-(3-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-4-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊醯胺基)己酸(C-53)：1H NMR(DMSO)：δ 8.22(s,3H),7.79(t,1H),7.51(s,2H),7.42(m,2H),7.27(t,1H),7.17(d,1H),6.61(s,1H),6.23(d,1H),5.57(s,2H),4.05(m,2H),3.87(s,5H),3.42(m,3H),3.02(m,3H),2.89(m,2H),2.31(t,2H),2.09(t,2H),1.72(m,4H),1.41(m,5H),1.22(m,2H),1.07(m,2H),0.83(t,3H)。LRMS[M+H]=680.4。
向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-4-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、DIEA(3.0當量)、戊二酸雙(全氟苯基)酯(2.0當量)及DMF(0.01M)。將反應物於室溫下攪拌2小時且隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而產生固體狀呈TFA鹽形式之5-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-5-側氧基戊酸全氟苯基酯(C-54)。LCMS[M+1]=718.4。
注意：藉由向圓底燒瓶中添加戊二醯基二氯(1.0當量)、THF(0.15M)及三乙胺(2.2當量)及將反應混合物冷卻至0℃製備戊二酸雙(全氟苯基)酯。隨後緩慢添加2,3,4,5,6-五氟苯酚(2.1當量)於THF(1.2M)中之溶液。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。經由矽膠過濾混合物且隨後在真空中濃縮。藉由用己烷-乙酸乙酯(9：1)溶析之矽膠管柱純化殘餘物並濃縮，以產生固體狀戊二酸雙(全氟苯基)酯。LCMS[M+23]=487.2。
3-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)丙酸全氟苯基酯(C-55)係遵循類似於實例54之程序製備為固體狀呈TFA鹽形式，只是使用3,3'-氧基二丙酸雙(全氟苯基)酯代替戊二酸雙(全氟苯基)酯。1H NMR(乙腈-d 3)δ 7.33(d,1H),7.30(d,1H),6.95(d,1H),6.73(d,1H),6.22(d,1H),6.06(m,1H),5.43(s,2H),4.18(s,2H),3.92(s,3H),3.81(t,2H),3.74(t,2H),3.47(m,2H),2.95(t,2H),2.60(t,2H),2.14(d,2H),1.45(m,2H),1.28(m,2H),1.15(m,2H),0.87(t,3H)。LRMS[M+H]=748.4。19F NMR(471MHz，乙腈-d 3)δ -154.71(d,2F),-160.40(d,1F),-164.57(dd,2F)。
3-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)丙酸酯(C-56)係遵循類似於實例54之程序製備，只是使用3,3'-(乙烷-1,2-二基雙(氧基))二丙酸雙(全氟苯基)酯代替戊二酸雙(全氟苯基)酯，以獲得3-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙氧基)丙酸酯(C-54)。LRMS[M+H]=792.4。
向圓底燒瓶中裝入3-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)丙酸全氟苯基酯(C-55,1.0當量)、Boc-Lys-OH(2.0 eqquiv.)、DIEA(5.0當量)及DMF(30mM)。將反應物於室溫下攪拌16小時且在真空中移除揮發性物質。使用RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，以獲得(S)-6-(3-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺
基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)丙醯胺基)-2-((第三丁氧基羰基)胺基)己酸。LCMS[M+1]=810.5。將boc保護之化合物用30體積%之0.1M DCM中之TFA處理，且隨後在真空中移除揮發性物質，以獲得固體狀呈TFA鹽形式之(S)-2-胺基-6-(3-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)丙醯胺基)己酸(C-57)：1H NMR(DMSO)：δ 8.18(m,3H),7.80(s,1H),7.41(m,4H),7.18(s,1H),6.94(d,1H),6.59(d,1H),6.22(d,1H),5.56(s,2H),4.24(m,1H),3.86(m,7H),3.56(m,4H),3.44(m,4H),3.01(m,4H),2.60(m,2H),2.28(m,2H),1.74(m,2H),1.45(m,2H),1.38(m,3H),1.21(m,3H),1.09(m,2H),0.80(t,3H)。LCMS[M+1]=710.5。
N-(15-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-15-側氧基-3,6,9,12-四氧雜十五烷基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊醯胺(C-58)係遵循類似於實例46之程序製備，只是使用17-側氧基
-21-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)-4,7,10,13-四氧雜-16-氮雜二十一碳烷-1-酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯代替琥珀醯亞胺戊二酸二酯，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之N-(15-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-15-側氧基-3,6,9,12-四氧雜十五烷基)-5-((3aS,4S,6aR)-2-側氧基六氫-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基)戊醯胺(C-58)：1H NMR(DMSO)：δ 7.84(m,2H),7.42(m,4H),7.22(m,1H),6.94(d,1H),6.56(d,1H),6.42(s,1H),6.37(s,1H),6.22(s,1H),5.57(s,2H),4.29(m,2H),4.11(m,2H),3.86(s,3H),3.60(m,4H),3.48(m,16H),3.37(m,4H),3.16(m,4H),3.08(m,2H),2.80(m,1H),2.56(m,2H),2.05(m,2H),1.58(m,1H),1.45(m,5H),1.23(m,4H),1.07(m,2H),0.80(t,3H)。LRMS[M+H]=911.6。
4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸4-((R)-6-胺基-2-((S)-2-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)-3-苯基丙醯胺基)己醯胺基)苄基酯(C-59)係根據針對實例(C-30)所示之方案製備為固體狀呈TFA鹽形式，只是在第一步驟中使用((S)-1-(((R)-6-胺基-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)
苯基)胺基)-1-側氧基己-2-基)胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯代替((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基)-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯：1H NMR(CD3OD)：δ 8.26(d,1H),7.91(t,1H),7.61(d,2H),7.35(m,3H),7.25(m,3H),7.19(m,3H),7.03(d,1H),6.79(d,1H),6.76(s,2H),6.24(d,1H),5.57(s,2H),5.11(s,2H),4.41(m,1H),4.33(s,2H),3.98(t,1H),3.95(s,3H),3.70(m,3H),3.54(t,2H),3.24(m,4H),3.10(m,1H),3.02(m,1H),2.83(m,1H),2.47(t,2H),1.92(m,2H),1.52(m,4H),1.42(m,2H),1.30(m,3H),1.18(m,2H),0.88(t,3H)。LRMS[M+H]=1013.5。
4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-甲酸4-((S)-2-((S)-2-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)丙醯胺基)苄基酯(C-60)係根據針對實例(C-30)所示之方案製備為固體狀呈TFA鹽形式，只是在第一步驟中使用((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧
基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基丙-2-基)胺基)-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯代替((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯基)胺基)-1-側氧基-5-脲基戊-2-基)胺基)-1-側氧基丁-2-基)胺基甲酸(9H-茀-9-基)甲基酯：1H NMR(CD3OD)：δ 9.65(s,1H),8.20(d,1H),7.97(d,1H),7.60(m,2H),7.34(m,2H),7.31(s,1H),7.22(d,1H),7.03(d,1H),6.80(m,2H),6.77(s,2H),6.23(d,1H),5.57(s,2H),5.11(s,2H),4.48(t,1H),4.31(s,3H),4.15(t,1H),3.95(m,4H),3.68(m,4H),3.62(m,2H),3.53(m,8H),2.49(t,2H),2.11(m,1H),1.52(m,2H),1.44(d,3H),1.28(m,2H),1.18(m,2H),0.98(m,6H),0.87(t,3H)。LRMS[M+H]=952.6。
步驟1：向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、HOAT(2.0當量)、Huenig鹼(14.0當量)、(3S,4R,5R,6R)-三乙酸2-(2-(3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-((((4-硝基苯氧基)羰基)氧基)甲基)苯氧
基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三基酯(1.2當量)及吡啶：DMF(1：4,0.015M)。將反應混合物於室溫下攪拌4小時。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀(3S,4R,5R,6R)-三乙酸2-(2-(3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三基酯：LCMS[M+H]=1212.4。
步驟2：將(3S,4R,5R,6R)-三乙酸2-(2-(3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三基酯(1.0當量)溶解於MeOH、THF及水(2：1：0.4)(0.005M)中。隨後添加LiOH(8.0當量)並將反應物於室溫下攪拌2小時。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀(2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-胺基丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸：LCMS[M+H]=850.4。
步驟3：向圓底燒瓶中裝入(2R,3R,4R,5S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-胺基丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸(1.0當量)、3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸(2.0當量)、Huenig鹼(6.0當量)、HBTU(1.8當量)及DMF(0.003M)。將反應物於室溫
下保持攪拌15分鐘。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-(3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺基)丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸(C-61)：LCMS[M+H]=1001.3。
(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-(((4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-羰基)氧基)甲基)-2-(3-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸(C-62)係根據針對實例(C-61)所示之方案製備為固體狀呈TFA鹽形式，只是在最後步驟中使用3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸代替3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸：1H NMR(CD3OD)：δ 8.20(d,1H),7.37(d,1H),7.21(m,2H),7.05(m,1H),6.99(d,1H),6.78(m,3H),6.23(d,
1H),5.55(s,2H),5.09(s,2H),3.92(m,4H),4.81(d,1H),4.00(s,2H),3.94(s,3H),3.89(d,1H),3.62(m,9H),3.53(m,8H),2.90(m,3H),2.66(t,2H),2.37(t,2H),1.51(m,2H),1.29(m,2H),1.17(m,2H),0.87(t,3H)。LRMS[M+H]=1045.4。
步驟1：向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-5-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、4-甲基-4-(甲基二硫基)戊酸2,5-二側氧基吡咯啶-1-基酯(1.3當量)、Huenig鹼(20.0當量)及DMF(0.03M)。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。隨後使用RP-C18 ISCO(ACN：H2O，利用TFA作為調節劑)純化粗製反應混合物且隨後凍乾，以產生固體狀呈TFA鹽形式之1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-4-甲基
-4-(甲基二硫基)戊-1-酮：LCMS[M+H]=614.3。
步驟2：向圓底燒瓶中裝入1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-4-甲基-4-(甲基二硫基)戊-1-酮1.0當量)、(2S,3S)-1,4-二巰基丁-2,3-二醇(1.0當量)及二甲基乙醯胺：H2O(1：1,0.03M)。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。隨後使用RP-C18 ISCO(ACN：H2O，利用TFA作為調節劑)純化粗製反應混合物且隨後凍乾，以產生固體狀呈TFA鹽形式之1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-4-巰基-4-甲基戊-1-酮：LCMS[M+H]=568.3。
步驟3：向圓底燒瓶中裝入1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-4-巰基-4-甲基戊-1-酮(1.0當量)、2-(吡啶-2-基二硫基)乙-1-胺HCl鹽(2.0當量)、Huenig鹼(10.0當量)及THF：PBS(1：1,0.03M)。將反應混合物於室溫下攪拌15分鐘。隨後使用RP-C18 ISCO(ACN：H2O，利用TFA作為調節劑)純化粗製反應混合物且隨後凍乾，以產生固體狀呈TFA鹽形式之1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-4-((2-胺基乙基)二硫基)-4-甲基戊-1-酮：LCMS[M+H]=643.4。
步驟4：向圓底燒瓶中裝入1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-4-((2-胺基乙基)二硫基)-4-甲基戊-1-酮(1.0當量)、3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸(1.0當量)、Huenig鹼(5.0當量)、HATU(1.0當量)及DMF(0.02M)。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。隨後使用RP-C18 ISCO(ACN：H2O，利用TFA作為調節劑)純化粗製反應混合物且隨後凍乾，以產生固體狀呈
TFA鹽形式之N-(2-((5-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-甲基-5-側氧基戊-2-基)二硫基)乙基)-3-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙醯胺(C-63)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.37(d,1H),7.26(d,1H),7.08(m,1H),6.83(d,1H),6.81(s,2H),6.24(d,1H),5.58(s,2H),4.37(s,2H),4.20(br,4H),3.97(s,3H),3.75(t,2H),3.55(t,2H),3.38(m,2H),3.38(br,4H),2.72(t,2H),2.55(m,2H),2.45(t,2H),1.89(m,2H),1.54(m,2H),1.31(m,8H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LRMS[M+H]=794.4。
1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-4-甲基-4-(甲硫基)戊-1-酮(C-63)係遵循針對中間體Int-1所述之程序製備，只是在步驟3中使用4-甲基-4-(甲硫基)-1-(六氫吡嗪-1-基)戊-1-酮代替六氫吡嗪-1-甲酸第三丁基酯。使用RP-C18 ISCO(ACN：H2O，利用TFA作為調節劑)純化粗製反應混合物且隨後凍乾，以產生固體狀呈TFA鹽形式之1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-4-甲基-4-(甲硫基)戊-1-酮(C-64)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.36(d,1H),7.25(d,1H),7.05(m,1H),6.81(d,1H),6.24(d,1H),5.58(s,2H),4.34(s,2H),3.90(br,4H),3.96(s,3H),3.55(t,2H),3.28(br,4H),2.55(m,2H),1.95(s,3H),1.80
(m,2H),1.54(m,2H),1.31(m,2H),1.27(s,6H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LRMS[M+H]=582.4。
步驟1：於0℃下向圓底燒瓶中裝入2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙-1-醇(C-68)(1.0當量)、三氯磷烷(3.0當量)、三乙胺(9.0當量)及THF(0.2M)並攪拌1h。隨後藉由緩慢添加冰水驟冷反應並用EtOAc 3x洗滌。隨後凍乾含有期望產物之水層。分離膦酸氫2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基酯且不經進一步純化即用於下一步驟：LCMS[M+H]=546.3。
步驟2：向圓底燒瓶中裝入(2S,3R,4S,5S,6S)-三乙酸2-(2-(3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-(羥基甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三基酯(1.0當量)、膦酸氫2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙基酯(2.0當量)、特戊醯氯(42.0當量)及吡啶(0.03M)。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。此時，添加吡啶：H2O(1：0.1,0.14M)中之二碘化物(1.06當量)並將混合物攪拌10min。隨後使用RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，以獲得固體狀呈TFA鹽形式之(2S,3R,4S,5S,6S)-三乙酸2-(2-(3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-((((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)(羥基)磷醯基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三基酯：LCMS[M+H]=1292.5。
步驟3：向圓底燒瓶中裝入(2S,3R,4S,5S,6S)-三乙酸2-(2-(3-((((9H-茀-9-基)甲氧基)羰基)胺基)丙醯胺基)-4-((((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)(羥基)磷醯基)氧基)甲基)苯氧基)-6-(甲氧基羰基)四氫-2H-吡喃-3,4,5-三基酯(1.0當量)、氫氧化鋰-H2O(10.0當量)及MeOH：H2O(3：1.5,0.007M)。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。隨後使用RP-C18 ISCO(ACN：H2O，利用TFA作為調節劑)純化粗製反應混合物且隨後凍乾，以產生固體狀呈TFA鹽形式之(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)(羥基)磷醯基)氧基)甲基)-2-(3-胺基丙醯胺基)苯氧
基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸：LCMS[M+H]=930.4。
步驟4：向圓底燒瓶中裝入(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)(羥基)磷醯基)氧基)甲基)-2-(3-胺基丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸(1.0當量)、3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙酸(1.0當量)、Huenig鹼(6.0當量)、HATU(1.0當量)及DMF(0.005M)。將反應物於室溫下保持攪拌15分鐘。隨後藉由RP-HPLC(0.035% ACN中之TFA：0.05% H2O中之TFA，C18管柱)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀呈TFA鹽形式之(2S,3S,4S,5R,6S)-6-(4-((((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙氧基)(羥基)磷醯基)氧基)甲基)-2-(3-(3-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)丙醯胺基)丙醯胺基)苯氧基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-甲酸(C-65)：1H NMR(CD3OD)：δ 8.19(s,1H),7.37(d,1H),7.14(m,3H),6.79(s,2H),6.77(d,1H),6.22(d,1H),5.53(s,2H),4.86(s,2H),4.84(d,1H),4.08(s,2H),3.95(d,1H),3.92(s,3H),4.00(br,4H),3.76(s,2H),3.62(m,5H),3.53(m,10H),3.27(m,2H),2.85(m,4H),2.63(m,2H),2.37(t,2H),1.52(m,2H),1.31(m,2H),1.17(m,2H),0.88(t,3H)。LRMS[M+H/2Z]=563.4。
向圓底燒瓶中裝入1-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-(胺基氧基)乙-1-酮(C-35)(2.4當量)、(2R,2'R)-3,3'-((2-側氧基丙烷-1,3-二基)雙(硫烷二基))雙(2-胺基丙酸)(1.0當量)及乙醇(0.02M)。將反應混合物於室溫下攪拌30min。使用RP-C18 ISCO(ACN：H2O，利用TFA作為調節劑)純化粗製反應混合物且隨後凍乾，以產生固體狀(2R,2'R)-3,3'-((2-((2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-2-側氧基乙氧基)亞胺基)丙烷-1,3-二基)雙(硫烷二基))雙(2-胺基丙酸)(C-66)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.35(d,1H),7.28(d,1H),7.05(m,1H),6.80(d,1H),6.23(d,1H),5.57(s,2H),4.32(s,2H),4.20(m,1H),4.05(m,1H),3.94(s,3H),3.81(m,4H),3.55(m,2H),3.44(m,2H),3.20(m,4H),2.96(m,1H),2.88(m,1H),1.53(m,2H),1.31(m,2H),1.18(m,2H),0.88(t,3H)。LRMS[M+H]=789.3。
向圓底燒瓶中裝入N-(2-(3-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-3-側氧基丙氧基)乙基)-2-(胺基氧基)乙醯胺(C-37)(2.4當量)、(2R,2'R)-3,3'-((2-側氧基丙烷-1,3-二基)雙(硫烷二基))雙(2-胺基丙酸)(1.0當量)及乙醇(0.02M)。將反應混合物於室溫下攪拌30min。使用RP-C18 ISCO(ACN：H2O，利用TFA作為調節劑)純化粗製反應混合物且隨後凍乾，以產生固體狀(R)-2-胺基-6-((((R)-2-胺基-2-羧基乙基)硫基)甲基)-17-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)-10,17-二側氧基-8,14-二氧雜-4-硫雜-7,11-二氮雜十六-6-烯酸(C-67)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.36(d,1H),7.29(d,1H),7.07(m,1H),6.80(d,1H),6.24(d,1H),5.57(s,2H),4.57(s,2H),4.31(m,2H),4.11(m,1H),4.03(m,1H),3.95(s,3H),3.86(br,4H),3.73(t,2H),3.54(m,6H),3.40(m,2H),3.20(m,8H),2.96(m,2H),2.67(t,2H),1.52(m,2H),1.30(m,2H),1.19(m,2H),0.88(t,3H)。LRMS[M+H]=904.4。
向圓底燒瓶中裝入5-(2-甲氧基-4-(六氫吡嗪-1-基甲基)苄基)-N4-戊
基-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-2,4-二胺(Int-1,1.0當量)、2-溴乙-1-醇(1.3當量)、三乙胺(20.0當量)及乙腈(0.03M)。將反應混合物於室溫下攪拌2小時。隨後藉由ISCO層析(0-10% MeOH：DCM，梯度)純化粗製反應混合物，從而得到固體狀2-(4-(4-((2-胺基-4-(戊基胺基)-5H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-5-基)甲基)-3-甲氧基苄基)六氫吡嗪-1-基)乙-1-醇(C-68)：1H NMR(CD3OD)：δ 7.22(d,1H),7.08(d,1H),6.83(d,1H),6.55(d,1H),6.10(d,1H),5.39(s,2H),3.93(s,3H),3.66(t,2H),3.50(s,2H),3.32(m,2H),3.20(s,1H),2.51(m,10H),1.37(m,2H),1.27(m,2H),1.25(s,1H),1.12(m,2H),0.86(t,3H)。LRMS[M+H]=482.4。
分析式(I)化合物以量測其作為類鐸受體7促效劑之活性。
使用人類TLR7及NF-kB驅動之螢光素酶報導基因載體(pNifty-Luciferase)穩定轉染人類胚腎293(HEK293)細胞。作為對照分析，使用經pNifty-Luc轉染之正常HEK293。將細胞培養於補充有2mM L-麩醯胺酸、10%熱不活化之FBS、1%青黴素及鏈黴素、2μg/ml嘌呤黴素(InvivoGen編號ant-pr-5)及5μg/ml殺稻瘟菌素(Invitrogen編號46-1120)之DMEM中。Bright-GloTM螢光素酶分析緩衝液及受質係由Promega編號E263B及編號E264B(分別為分析受質及緩衝液)供應。384孔透明底板係由Greiner bio-酮(編號789163-G)供應且係定製條形碼板。
將細胞以25,000個細胞/孔平鋪於384孔板中之最終體積為50μl之培養基中。在37℃及5% CO2下過夜(18小時)培養後容許細胞黏著至板。然後將連續稀釋之實驗及陽性對照化合物分配至每一孔，且在37℃及5% CO2
下培育7小時。經單獨DMSO刺激之細胞亦用作陰性對照。培育後，根據製造商之說明書，將30μl預混合分析緩衝液及受質緩衝液添加至每一孔中。在CLIPR機器上讀取發光信號，其中每板之積分時間為20秒。
產生每一化合物之劑量反應曲線，且EC50值測定為給出50%最大信號之濃度。
呈游離形式或醫藥上可接受之鹽形式之各種式(I)化合物展現藥理學性質，例如如藉由本申請案中所述之活體外測試所指示。彼等實驗中之EC50值係以所討論測試化合物引起基線與最大反應之間之中途之反應的濃度給出。在其他實例中，式(I)化合物之EC50值介於1nM至2μM之範圍內。在其他實例中，式(I)化合物之EC50值介於1nM至1μM之範圍內。在其他實例中，式(I)化合物之EC50值介於1nM至500nM之範圍內。在其他實例中，式(I)化合物之EC50值介於1nM至250nM之範圍內。在其他實例中，式(I)化合物之EC50值介於1nM至100nM之範圍內。在其他實例中，式(I)化合物之EC50值介於1nM至50nM之範圍內。在其他實例中，式(I)化合物之EC50值介於1nM至25nM之範圍內。在其他實例中，式(I)化合物之EC50值介於1nM至10nM之範圍內。
為闡釋本發明化合物之活體外活性，由某些式(I)化合物之TLR7刺激之EC50值列舉於表2中。據信半胱胺酸加成物係因溶酶體內降解產生之推定分解代謝產物(Bioconjugate Chem.2006,17,114-124)。表2之某些化合物係具有半胱胺酸之相應母化合物之衍生結果。
表2
具有位點特異性半胱胺酸突變之抗HER2抗體(例如曲妥珠單抗)之製備已先前闡述於WO 2014/124316及WO 2015/138615中，其各自以引用方
式併入本文中。簡言之，化學合成抗HER2抗體(例如曲妥珠單抗)之重鏈及輕鏈之DNA編碼可變區且將其選殖至兩個哺乳動物表現載體pOG-HC及pOG-LC(其含有人類IgG1及人類κ輕鏈之恆定區)中。載體含有CMV啟動子及信號序列：MKTFILLLWVLLLWVIFLLPGATA(SEQ ID NO：27)。採用寡核苷酸引導之誘變以製備抗HER2抗體之Cys突變體構築體，且藉由DNA測序確認Cys突變體構築體之序列。
舉例而言，可在抗HER2抗體中之以下一個或多個位置引入半胱胺酸(所有位置皆係藉由EU編號)：(a)抗體重鏈之位置152、360及/或375，及(b)抗體輕鏈之位置107、159及/或165。舉例而言，可在重鏈之位置152引入半胱胺酸，從而產生抗HER2 mAb4，其具有SEQ ID NO：19之輕鏈序列及SEQ ID NO：30之重鏈序列。
藉由使用如先前所述之瞬時轉染方法共轉染重鏈及輕鏈質體在293 FreestyleTM細胞中使抗HER2抗體之Cys突變體表現(Meissner，等人，Biotechnol Bioeng.75：197-203(2001))。藉由標準蛋白A親和層析自細胞上清液純化表現之抗體。
使用類似方法以將曲妥珠單抗之重鏈及輕鏈之可變區選殖至兩個載體中用於在CHO細胞中表現。重鏈載體編碼人類IgG1抗體之恆定區，包括信號肽(MPLLLLLPLLWAGALA)(SEQ ID NO：28)、用以驅動重鏈之表現之CMV啟動子及適當信號及選擇序列用於穩定轉染至CHO細胞中。輕鏈載體編碼κ輕鏈之恆定區，包括信號肽(MSVLTQVLALLLLWLTGTRC)(SEQ ID NO：29)、用以驅動輕鏈之表現之CMV啟動子及適當信號及選擇序列用於穩定轉染至CHO細胞中。為產生抗體，將重鏈載體及輕鏈載體共轉染至CHO細胞系中。細胞經歷選擇，且隨後在針對抗體產生最佳化之條
件下培養穩定轉染之細胞。藉由標準蛋白A親和層析自細胞上清液純化抗體。
使用標準誘變方法對抗體載體之恆定區進行額外突變。
使用闡述於Junutula JR，等人，Nature Biotechnology 26：925-932(2008)中之方法將將包含連接體之本發明之式(I)化合物共軛至改造至抗體中之Cys殘基。
由於哺乳動物細胞中表現之抗體中之經改造之Cys殘基在生物合成期間由加合物(二硫化物)(例如麩胱甘肽(GSH)及/或半胱胺酸)修飾(Chen等人2009)，故如最初表現之經修飾Cys對於硫醇反應試劑(例如馬來醯亞胺基或溴-乙醯胺或碘-乙醯胺基團)無反應。為共軛經改造之Cys殘基，需要藉由還原二硫化物移除麩胱甘肽或半胱胺酸加合物，此通常需要還原所表現抗體中之所有二硫化物。此可藉由首先將抗體暴露於還原劑(例如二硫蘇糖醇(DTT))、之後再氧化抗體之所有天然二硫鍵以恢復及/或穩定功能抗體結構來完成。因此，為還原天然二硫鍵及經改造之Cys殘基之半胱胺酸或GSH加合物之間之二硫鍵，向先前純化之曲妥珠單抗之Cys突變體中添加新鮮製備之DTT至10mM或20mM之最終濃度。在於37℃下抗體與DTT一起培育1小時後，將混合物利用PBS透析3天且每日更換緩衝液以移除DTT並再氧化天然二硫鍵。藉由反相HPLC監測再氧化過程，該反相HPLC能夠自個別重鏈及輕鏈分子分離抗體四聚體。在加熱至80℃之PRLP-S 4000A管柱(50mm×2.1mm,Agilent)上分析反應且藉由含有0.1% TFA之水中之30-60%乙腈之線性梯度以1.5ml/min之流速實施管柱溶析。於280nm下監測自管柱之蛋白溶析。繼續透析直至再氧化完成。再氧化恢復鏈內及鏈間
二硫化物，而透析使得透析掉連接至新近引入之Cys殘基之半胱胺酸及麩胱甘肽。
在再氧化後，將含有馬來醯亞胺之化合物以對於經改造Cys通常1.5：1、2：1或5：1之比率添加至PBS緩衝液(pH 7.2)中之再氧化抗體，並實施培育1小時。通常，藉由標準方法在蛋白A樹脂上純化、之後將緩衝液更換為PBS移除過量游離化合物。
使用樹脂上方法交替還原及再氧化抗HER2抗體(例如曲妥珠單抗)之Cys突變體。在PBS(無鈣或鎂鹽)中平衡蛋白A瓊脂糖珠粒(1ml/10mg抗體)且隨後以分批模式添加至抗體試樣。0.5M半胱胺酸之儲液係藉由將850mg半胱胺酸HCl溶解於10ml溶液(其係藉由向250ml 0.5M磷酸鈉中添加3.4g NaOH製備，pH 8.0)中來製備且隨後向抗體/珠粒漿液中添加20mM半胱胺酸，並於室溫下輕柔混合30-60分鐘。將珠粒裝載至重力管柱且用50個床體積之PBS洗滌小於30分鐘，隨後將管柱用再懸浮於一個床體積之PBS中之珠粒封蓋。為調節再氧化之速率，視情況添加50nM至1μM氯化銅。藉由移除樹脂之小測試試樣、在IgG溶析緩衝液(Thermo)中溶析及藉由如上文所述RP-HPLC分析來監測再氧化過程。一旦再氧化進展至期望完成性，可立即藉由以下方式起始共軛：添加相對於經改造半胱胺酸2-3莫耳濃度過量之化合物，及於室溫下使混合物反應5-10分鐘，之後將管柱用至少20管柱體積之PBS洗滌。將抗體共軛物用IgG溶析緩衝液溶析並用0.1體積之0.5M磷酸鈉(pH 8.0)中和並將緩衝液更換為PBS。或者，代替在樹脂上與抗體共軛，將管柱用至少20管柱體積之PBS洗滌，且將抗體用IgG溶析緩衝液溶析並用緩衝液(pH 8.0)中和。隨後使用抗體進行共軛反應或急凍用於將來使用。
分析抗體-TLR7促效劑共軛物以測定共軛程度。自經還原及去醣基化試樣之LC-MS數據外推化合物-對-抗體比率。LC/MS可定量附接至共軛物試樣中之抗體之連接體-酬載(化合物)之的平均分子數。HPLC將抗體分離成輕鏈及重鏈，且根據每條鏈之連接體-酬載基團之數目分離重鏈(HC)及輕鏈(LC)。質譜數據能夠鑑別混合物中之組份物質，例如LC、LC+1、LC+2、HC、HC+1、HC+2等。可自LC及HC鏈上之平均負荷計算抗體共軛物之平均化合物對抗體比率。給定共軛物試樣之化合物-對-抗體比率代表附接至含有兩條輕鏈及兩條重鏈之四聚體抗體之化合物(連接體-酬載)分子的平均數目。
使用分析型尺寸排除層析(AnSEC)在Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)及/或蛋白KW-803 5μm 300×8mm(Shodex)管柱上對共軛物進行概述；基於分析型粒徑篩析層析分析聚集。亦藉由分析型疏水相互作用層析(AnHIC)在安裝於Agilent 1260 LC系統(Santa Clara,CA,USA)上之Tosoh Bioscience(King of Prussia,PA,USA)TSKgel Butyl-NPR管柱(100mm×4.6mm,2.5μm)上使用緩衝液A(20mM His-HCl、1.5M硫酸銨，pH 6.0)及緩衝液B(20mM His-HCl、15%異丙醇，pH 6.0)之二元梯度利用藉由用0.5體積之3M硫酸銨稀釋約20μg抗體(最初於PBS中)製備之試樣來對共軛物進行概述。利用已知疏水性之四個標準試樣之線性回歸計算疏水性指數。報告藉由面積之最大峰之疏水性。
大多數共軛物達成高化合物-對-抗體比率，主要係單體且顯示低疏水性(高疏水性指數對應於早期自HIC管柱溶析出)。經由此方法之共軛對於大部分化合物產生大於95%之共軛效率(表3)。大多數共軛物含有小於4%二聚
體及寡聚物質(表3)。認為疏水性指數(HI)為0.80或更大係有利之特徵。大多數共軛物顯示HI值大於0.8(表3)。此表明共軛物可有效地製得且具有有利特徵。
a 共軛物中之抗HER2抗體係：抗HER2 mAb1具有SEQ ID NO：19之LC；SEQ ID NO：9之HC。抗HER2 mAb2具有SEQ ID NO：19之LC；SEQ ID NO：21之HC。抗hHER2 mAb3具有SEQ ID NO：19之LC；SEQ ID NO：23之HC。抗HER2 mAb4具有SEQ ID NO：19之LC；SEQ ID NO：30之HC。抗HER2 mAb5具有SEQ ID NO：19之LC；SEQ ID NO：32之HC。
b 化合物-對-抗體比率係根據LCMS。
c 聚集係藉由分析型粒徑篩析層析量測；包括二聚體及寡聚物質。BLQ=定量下限。
d 疏水相互作用層析(HIC)量測：使用最大峰之滯留時間計算疏水性指數。
e儘管藉由AnSEC未觀察到聚集或僅觀察到低程度，但自管柱之晚溶析表明無效結果。
本發明之一些化合物亦可使用涉及抗體之部分還原之程序共軛至未經改造之抗體之天然半胱胺酸殘基(Doronina,S.O.等人，Nat.Biotechnol.21,778-784,2003)。首先在含有2mM EDTA之PBS中藉由添加TCEP至10mM之最終濃度並將混合物於37℃下培育1小時來部分還原抗HER2抗體(濃度為5至10mg/ml)之鏈間及鏈內二硫鍵。在脫鹽及添加1% w/v PS-20清潔劑後，於4℃下使部分還原之抗體(1-2mg/ml)與0.5至1mg TLR7促效劑化合物/10mg抗體反應過夜。藉由蛋白A層析藉由標準方法純化所得共軛物並將緩衝液更換為PBS，且藉由如上文所述MS、AnSEC及AnHIC對其進行概述。藉由還原抗HER2 mAb3、之後與化合物C-1共軛製得之一個共軛物實例之量測之化合物-對-抗體比率、聚集行為及疏水性數據概述於表3中。
在替代方法(美國專利申請案20150150998)中，未經改造之重組體抗HER2抗體之鏈間二硫鍵可使用以下兩個步驟經修飾及共軛至本發明之促效劑化合物。
方案15使用1,3二氯丙-2-酮橋接兩個步驟共軛至天然半胱胺酸殘基，之後添加至所引入酮中。
步驟1：鏈間二硫橋之還原及使用1,3-二氯丙-2-酮之再橋接：於4℃下向抗HER2抗體mAb3(136μM)及1,3-二氯丙-2-酮(33mM)於0.1M HEPES緩衝液(pH 8.0)中之溶液中添加TCEP．HCl(1.63mM)。將所得混合物於4℃下輕柔攪動16h。隨後使用PD-10脫鹽管柱(GE Healthcare)將反應混合物之緩衝液更換成PBS。使用50K Amicon過濾器濃縮所得溶液，以產生經修飾之抗HER2抗體。修飾係藉由ESI-MS(溶析液A：水+0.1%甲酸；溶析液B：乙腈+0.04%甲酸；梯度：在2分鐘內自3%至80% B-流速1.0ml/min.管柱：Proswift Monolith 4.6*50mm 40℃)來確認；145398Da(藉由PNGase F去醣基化後)。
步驟2：促效劑化合物(C-37)之共軛：使經修飾之抗HER2抗體(30mg/ml)與3.0mM包含連接之胺基-氧基部分之化合物(C-37)在0.1M乙酸苯銨緩衝液(pH 4.6)中以15%(v/v)DMSO之最終濃度反應。於23℃下將反應混合物培育約16小時。隨後使用50K Amicon過濾器將反應混合物之緩衝液更換成PBS(pH 7.4)，從而產生經修飾之抗HER2-化合物共軛物。
使用化合物(C-35)以共軛至經修飾之抗HER2抗體獲得類似共軛物。
藉由如上文所述MS、AnSEC及AnHIC對共軛物進行概述。量測之化合物-對-抗體比率、聚集行為及疏水性數據概述於表3中。兩種實例性共軛
物達成高化合物-對-抗體比率，主要係單體且顯示低疏水性(高疏水性指數對應於早期自HIC管柱溶析出)。經由此方法之共軛產生大於85%之共軛效率(表3)。共軛物含有小於2%二聚體及寡聚物質(表3)。共軛物顯示HI值大於0.85(表3)。此表明共軛物可有效地製得且具有有利特徵。
經由確立方法用本發明之某些化合物官能化天然抗體。舉例而言，將PBS(pH 7.2)中4mg/ml之抗大鼠HER2抗體(7.16.4；購自Bio X Cell；West Lebanon,NH)與760μM化合物C-47)以20%(v/v)之最終DMSO濃度混合。將反應物於室溫下培育過夜，且隨後用50mM Tris pH 8驟冷。使用類似方法以與抗HER2 mAb3或促效劑化合物C-46及C-50製備共軛物。藉由蛋白A層析藉由標準方法純化所得抗體共軛物且將緩衝液更換為PBS。
藉由如上文所述MS、AnSEC及AnHIC對抗體共軛物進行概述。量測之化合物-對-抗體比率、聚集行為及疏水性數據概述於表3中。若干離胺酸反應之抗體共軛物在所用AnSEC管柱上顯示晚溶析及/或峰之曳尾，此表明管柱相互作用，此使得難以檢測聚集物。
轉譯後4’-磷酸泛醯巰基乙胺基化係用於位點特異性標記具有結構上不同之小分子之重組體蛋白的通用方法(Yin J，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102：15815-15820,2005；Zhou Z，等人，ACS Chem.Biol.
2：337-346,2007)。採取此酶方式(其係基於混雜4’-磷酸泛醯巰基乙胺基轉移酶(PPTase)之催化作用)以製備高度均質抗體共軛物(參見WO2013184514)。酶標記係藉由在抗體之恆定區之各個位點納入11或12聚體S6、ybbR及A1肽序列來完成。舉例而言，可在殘基E388(EU編號)之後在抗HER2 mAb2之重鏈中納入序列GDSLDMLEWSLM(SEQ ID NO：31)之A1標籤以產生抗HER2 mAb5，其具有SEQ ID NO：19之輕鏈序列及SEQ ID NO：32之重鏈序列。一個策略係兩步方法以藉由轉譯後4’-磷酸泛醯巰基乙胺基化製備位點特異性抗體-化合物共軛物(參見WO2013184514)。此方式之第一步驟係基於肽標記之抗體經含有生物正交基團(例如疊氮基、烯烴、炔烴、酮或醛部分)之CoA類似物之PPTase催化之標記。在生物正交標記之抗體之親和純化後，兩步方法之第二步驟涉及包含與生物正交基團反應之部分之化合物的共軛。舉例而言，以下部分闡述在重鏈之恆定區內之具體位點含有A1標籤插入之抗HER2突變體抗體的兩步方法。另外，儘管兩步方法係針對肟接合化學例示，但此策略可延伸至其他生物正交化學，例如點擊化學，包括無銅之點擊化學、Staudinger接合、基於異腈之點擊化學及四嗪接合。
肟接合化學已由若干研究組用作有效之生物正交方法以製備位點特異性蛋白共軛物(Axup JY，等人，Proc Natl Acad Sci U S A.109：16101-16106,2012；Rabuka D，等人，Nat Protoc.7：1052-1067,2012)。為組合轉譯後4’-磷酸泛醯巰基乙胺基化與肟接合，使用CoA生物合成酶CoAA、CoAD及CoAE自相應泛酸酯前體分子(化合物int-4)以化學酶方式製備酮修飾之CoA類似物(Worthington AS,Burkart MD(2006)Org Biomol Chem.4：44-46)(Kosa NM,Haushalter RW,Smith AR,Burkart
MD(2012)Nat Methods 9：981-984)。接下來，使用PPTase催化以酶方式將生物正交酮基團位點特異性地共軛至抗HER2抗體之嵌入A1標籤上。具體而言，於37℃下在補充有12.5mM MgCl2及20mM NaCl之75mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)中在約0.5μM來自大腸桿菌之AcpS PPTase存在下使2.5μM抗HER2 mAb5與30μM酮-CoA類似物(化合物C-69)(相對於抗體12莫耳當量)共軛2天。為驅動共軛反應完成，向反應混合物補充約1μM枯草芽孢桿菌Sfp PPTase，同時將化合物C-69之濃度增加至約60μM。將反應物於室溫下再培育4天。藉由獲得經還原及去醣基化試樣之拆解ESI-MS譜驗證抗HER2 mAb5抗體經酮-CoA類似物(化合物C-69)之標記。觀察質量與相應酮官能化重鏈之計算分子量一致。在藉由蛋白A親和層析(MabSelect SuRe,GE Healthcare Life Sciences)移除PPTase酶及過量酮-CoA類似物後，用PierceTM IgG溶析緩衝液(Thermo Fisher Scientific)溶析酮活化之抗體抗HER2-mAb5-(C-69)，之後立刻用1M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0)中和。將中和抗體溶液之緩衝液更換為PBS並使用50K Amicon過濾器濃縮。
酮基團之位點特異性附接使得隨後將促效劑化合物肟接合至酮活化之抗HER2 mAb5-(C-69)作為兩步方法之第二步驟。使48μM酮官能化抗體與30倍莫耳濃度過量(1.4mM)之胺基氧基-促效劑C-35及C-37在100mM含有7%(v/v)DMSO之乙酸苯銨緩衝液(pH 4.6)中反應。於室溫下培育17小時後，藉由用50K Amicon過濾器超濾移除過量胺基氧基試劑並用PBS重複洗滌。藉由如上文所述MS、AnSEC及AnHIC對抗體共軛物進行概述。量測之化合物-對-抗體比率、聚集行為及疏水性數據概述於表3中。如表3中所示，兩步方法得到酮活化之抗HER2 mAb5-(C-69)經胺基氧基-促效劑
C-35及C-37之幾乎定量標記。
藉由使5mM化合物(int-4)與25mM ATP於37℃下在含有20mM MgCl2之50mM HEPES緩衝液(pH 8.0)中在10μM金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CoAA、25μM大腸桿菌CoAD及20μM大腸桿菌CoAE存在下反應約16h將化合物(int-4)轉化成酮官能化CoA類似物(C69)。在反應混合物以20,817 x g離心2min後，藉由經由具有10kDa截止值之Amicon超離心過濾器超濾分離可溶性酶。藉由形成抗HER2 mAb5-(C-69)-(C-35)及抗HER2 mAb5-(C-69)-(C-37)驗證化合物(i-4)至酮官能化CoA類似物(C59)之酶轉化(參見表3)。
藉由水解此反應中形成之琥珀醯亞胺環增強含有馬來醯亞胺之酬載與抗體之Cys殘基之間形成之鍵之穩定性。在小鼠血清中活體外培育後研究琥珀醯亞胺環水解對利用本發明之促效劑化合物製備之抗體共軛物之穩定性的效應。藉由LC-MS監測因共軛至抗體之馬來醯亞胺酬載之酬載去共軛及琥珀醯亞胺環之水解產生的質量變化。已報導琥珀醯亞胺環之水解係由某些條件(例如高pH、高溫或高鹽)刺激(J.Am.Chem.Soc.1955,77：3922；Biochemistry 1976,15：2836；Biochem.J.1979,179：191-197；J Pharm Sci.1984,73：1767-1771；Bioorg.Med.Chem.Lett.17：6286-6289,
2007)。為探測共軛物之活體外穩定性，於37℃下在50-70%小鼠血清中培養抗HER2抗體mAb2共軛物。在每一時間點(通常0、8、24、48及72小時)取50微克共軛物試樣且立刻急凍。稍後將試樣解凍用於處理及分析。簡言之，用PNGaseF處理抗體以移除N-連接之聚醣及利用在重鏈之鉸鏈區附近切割之蛋白水解酶處理，以便在經DTT還原以使二硫鍵斷裂之前分離Fab與Fc。隨後藉由ESI-MS分析輕鏈、重鏈Fab及重鏈Fc片段。自相應共軛物物質之相對MS強度計算去共軛抗體、具有含水解琥珀醯亞胺環之附接酬載之共軛物及具有含完整琥珀醯亞胺環之附接酬載之共軛物之相對群體。針對共軛物亞組之去共軛程度及琥珀醯亞胺水解程度示於表4及5中。一般而言，在72小時活體外培育期間，共軛物損失小於13%之化合物負荷，且直至48小時，琥珀醯亞胺環水解通常係高於85%完成。由化合物(C-5)及化合物(C-21)例示之本發明之某些化合物因經由逆馬來醯亞胺反應對去共軛之較低易感性展現改良之共軛物穩定性且經由琥珀醯亞胺環水解進一步穩定。
對於N87胃癌異種移植物小鼠模型，使用6-8週齡之雌性SCID-米色小鼠(購自Harlan Laboratories)進行植入。使N87細胞(自ATCC獲得，目錄編號CRL-5822，供應商批號7686255)在無菌條件中在具有5% CO2之37℃培育器中生長2週。使細胞在具有10%胎牛血清之RPMI培養基中生長。每3-4天利用0.05%胰蛋白酶/EDTA使細胞傳代。在植入當天，提起N87細胞(傳代4次)並以1×106個細胞及50%基質膠/100μl之濃度再懸浮於RPMI1640無血清培養基中。對細胞進行Radil測試以確保其不含黴漿菌及鼠類病毒。
使用28g針(100μl注射體積)向下肋中皮下注射植入N87細胞。在植入後，一旦腫瘤可觸及，藉由測徑器量測腫瘤且對小鼠每週稱重兩次。隨後在兩個維度上量測腫瘤一週兩次。使用(L×W2)/2計算測徑器量測。根據Guide for Care and Use of Laboratory Animals及Institutional Animal Care and Use Committee之規定，向小鼠餵入正常飲食並圈養在SPF動物設施中。
在異種移植物腫瘤達到約200mm3時，藉由靜脈內途徑向小鼠投與0.3-10mg/kg抗HER2抗體或抗HER2-TLR7促效劑共軛物。藉由使抗體針對齧齒類動物中未發現之靶標表現及經由針對抗HER2抗體所述之類似方法共軛生成同型對照抗體。一週量測腫瘤兩次。使用Prism 5(GraphPad)軟體繪示平均腫瘤體積之圖。在腫瘤大小達到2000mm3之體積時，達成效能研究之終點。在注射後，亦密切監測小鼠之臨床劣化之體徵。若小鼠出於任何原因顯示發病之任何體徵(包括呼吸窘迫、弓背姿勢、活動性降低、後足癱瘓、作為胸膜滲出液之體徵之呼吸急促、接近20%或15%之體重減
輕加上其他體徵)，或若其實施正常活動(進食、移動)之能力受損，則將小鼠安樂死。
用1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg或10mg/kg之單一劑量之抗HER2-mAb2-(C-1)共軛物靜脈內治療N87胃腫瘤異種移植物小鼠，其中化合物(C-1)共軛至抗HER2-mAb2重鏈之Cys 152及Cys 375。在測試之所有劑量(包括測試之最低劑量-1mg/kg)下在經抗HER2-mAb2-(C-1)共軛物治療之所有小鼠中觀察到N87異種移植物腫瘤完全消退(圖1)。在與未治療之動物相比時，在經10mg/kg單獨未共軛之抗HER2-mAb2、或同型對照抗體-(C-1)共軛物治療之N87異種移植物小鼠中未觀察到腫瘤消退(圖1)。
以0.3mg/kg或1mg/kg之單一劑量之抗HER2-mAb1-(C-1)或抗HER2-mAb1-(C-5)治療N87胃腫瘤異種移植物小鼠(10隻小鼠/組)。儘管經1mg/kg抗HER2-mAb1-(C-1)之單一劑量之治療導致人類N87異種移植物腫瘤完全消退，但0.3mg/kg抗HER2-mAb1-(C-1)引起腫瘤淤滯(圖2)。類似地，儘管經1mg/kg抗HER2-mAb1-(C-5)之單一劑量之治療導致人類N87異種移植物腫瘤完全消退，但0.3mg/kg抗HER2-mAb1-(C-5)引起腫瘤淤滯(圖2)。在與未治療之動物相比時，在經同型對照抗體-(C-5)共軛物治療之N87異種移植物小鼠中未觀察到N87胃腫瘤消退。該等數據顯示可藉由低劑量(例如1mg/kg)之抗HER2-TLR7促效劑共軛物(例如，抗HER2-mAb1-(C-1)或抗HER2-mAb1-(C-5)、抗HER2-mAb2-(C-1))之單一治療達成腫瘤消退。
在單獨研究中，用1mg/kg、3mg/kg或5mg/kg之單一劑量之抗HER2-mAb1-(C-5)治療N87胃腫瘤異種移植物小鼠(8隻小鼠/組)。儘管經3
mg/kg或5mg/kg抗HER2-mAb1-(C-5)之單一劑量之治療導致人類N87異種移植物腫瘤完全消退，但1mg/kg抗HER2-mAb1-(C-5)在此研究中引起腫瘤淤滯(圖3)。
另外，用1mg/kg之單一劑量之抗HER2-mAb1-(C-5)、抗HER2-mAb1-(C-35)、抗HER2-mAb1-(C-37)、抗HER2-mAb1-(C-59)、抗HER2-mAb1-(C-60)、抗HER2-mAb1-(C-61)、抗HER2-mAb1-(C-62)或抗HER2-mAb1-(C-64)治療N87胃腫瘤異種移植物小鼠(6隻小鼠/組)。經1mg/kg與不同化合物共軛之抗HER2-mAb1之單一劑量之治療引起腫瘤淤滯(圖4)，此類似於在1mg/kg抗HER2-mAb1-(C-5)之單一劑量治療後觀察者。
對於MMC(大鼠HER2+)乳癌同源模型，使用表現含有Val664至Glu664突變之活化大鼠Erbb2(c-neu)致癌基因之6-10週齡之雌性FVB/N轉基因小鼠(FVB-Tg(MMTV-Erbb2)NK1Mul/J；最初購自Jackson Laboratories，室內養殖)進行植入。使MMC細胞(衍生自從FVB/N轉基因小鼠獲得之腫瘤，自Professor Nora Disis,University of Washington獲得)在無菌條件中在具有5% CO2之37℃培育器中生長2週。使細胞在具有20%胎牛血清及青黴素/Strep之DMEM培養基中生長。每3-4天利用0.05%胰蛋白酶/EDTA使細胞傳代。在植入當天，提起細胞(傳代4次)並以2.5×105個細胞及10%基質膠/100μl之濃度再懸浮於RPMI1640無血清培養基中。對細胞進行Radil測試
以確保其不含黴漿菌及鼠類病毒。
使用28規針(100μl注射體積)向下肋中皮下注射植入MMC細胞。在植入後，一旦腫瘤可觸及，藉由測徑器量測腫瘤且對小鼠每週稱重2次。隨後在兩個維度上量測腫瘤一週兩次。使用(L×W2)/2計算測徑器量測。根據Guide for Care and Use of Laboratory Animals及Institutional Animal Care and Use Committee之規定，向小鼠餵入正常飲食並圈養在SPF動物設施中。
在腫瘤達到約200mm3時，藉由靜脈內途徑向8隻小鼠之組投與1mg/kg抗大鼠HER2抗體(7.16.4，購自Bio X Cell；West Lebanon,NH)或1mg/kg抗大鼠HER2-TLR7促效劑共軛物(抗大鼠HER2-(C-46))。一週量測腫瘤兩次。使用Prism 5(GraphPad)軟體繪示平均腫瘤體積之圖。在腫瘤大小達到2000mm3之體積時，達成效能研究之終點。在注射後，亦密切監測小鼠之臨床劣化之體徵。若小鼠出於任何原因顯示發病之任何體徵(包括呼吸窘迫、弓背姿勢、活動性降低、後足癱瘓、作為胸膜滲出液之體徵之呼吸急促、接近20%或15%之體重減輕加上其他體徵)，或若其實施正常活動(進食、移動)之能力受損，則將小鼠安樂死。
為測試MMC大鼠HER2+乳癌同源模型中抗大鼠HER2-(C-46)共軛物之效能，用1mg/kg抗大鼠HER2-(C-46)共軛物、或未共軛之抗大鼠HER2靜脈內治療具有皮下MMC乳房腫瘤之小鼠(8隻小鼠/組)。如圖5A及5B中所示，在經抗大鼠HER2-(C-46)共軛物之單一劑量治療之8隻小鼠中之7隻中觀察到MMC小鼠乳房腫瘤(大鼠HER2+)之完全消退(圖5A)，但在經裸抗大鼠HER2抗體治療之8隻小鼠中之僅3隻中觀察到完全消退(圖5B)。
該等數據表明，抗大鼠HER2-(C-46)共軛物較單獨未共軛之抗大鼠
HER2抗體在治療上更有效地抵抗大鼠HER2陽性同源乳癌。
對於HCC1954乳房異種移植物小鼠模型，使用6-8週齡之雌性SCID-米色小鼠(購自Harlan Laboratories)進行植入。使HCC1954細胞(自ATCC獲得，目錄編號CRL-2338，供應商批號5107643)在無菌條件中在具有5% CO2之37℃培育器中生長2週。使細胞在具有10%胎牛血清之RPMI培養基中生長。每3-4天利用0.05%胰蛋白酶/EDTA使細胞傳代。在植入當天，提起(收穫)HCC1954細胞(傳代17次)並以1×106個細胞及50%基質膠/100μl之濃度再懸浮於RPMI1640無血清培養基中。對細胞進行Radil測試以確保其不含黴漿菌及鼠類病毒。
使用27G針(100μl注射體積)向右乳房脂肪墊中皮下注射植入HCC1954細胞。在植入後，一旦腫瘤可觸及，藉由測徑器量測腫瘤且對小鼠每週稱重兩次。隨後在兩個維度上量測腫瘤一週兩次。使用(L×W2)/2計算測徑器量測。根據Guide for Care and Use of Laboratory Animals及Institutional Animal Care and Use Committee之規定，向小鼠餵入正常飲食並圈養在SPF動物設施中。
在異種移植物腫瘤達到約200mm3時，藉由靜脈內途徑向小鼠投與1-10mg/kg抗HER2抗體或抗HER2-TLR7促效劑共軛物。藉由使抗體針對齧齒類動物中未發現之靶標表現及經由針對抗HER2抗體所述之類似方法共軛生成同型對照抗體。一週量測腫瘤兩次。使用Prism 5(GraphPad)軟
體繪示平均腫瘤體積之圖。在腫瘤大小達到2000mm3之體積時，達成效能研究之終點。在注射後，亦密切監測小鼠之臨床劣化之體徵。若小鼠出於任何原因顯示發病之任何體徵(包括呼吸窘迫、弓背姿勢、活動性降低、後足癱瘓、作為胸膜滲出液之體徵之呼吸急促、接近20%或15%之體重減輕加上其他體徵)，或若其實施正常活動(進食、移動)之能力受損，則將小鼠安樂死。
以1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg之單一劑量之抗HER2-mAb1-(C-5)共軛物靜脈內治療HCC1954乳房腫瘤異種移植物小鼠，其中化合物(C-5)共軛至抗HER2-mAb1重鏈之Cys 152及Cys 375(8隻小鼠/組)。儘管經10mg/kg或3mg/kg抗HER2-mAb1-(C-5)之單一劑量治療導致人類HCC1954異種移植物腫瘤之完全消退，但1mg/kg抗HER2-mAb1-(C-5)引起初始腫瘤消退、之後腫瘤淤滯(圖6)。在經10mg/kg單獨未共軛之抗HER2-mAb2治療之HCC1954異種移植物小鼠中未觀察到腫瘤消退(圖6)。
該等數據表明，可在高HER2表現HCC1954乳房腫瘤異種移植物中藉由3mg/kg之抗HER2-TLR7促效劑共軛物(抗HER2-mAb1-(C-5))之單一治療達成腫瘤消退。
對於SKOV3卵巢異種移植物小鼠模型，使用6-8週齡之雌性SCID-米色小鼠(購自Harlan Laboratories)進行植入。使SKOV3細胞(自ATCC獲
得，目錄編號HTB-77，供應商批號7349765)在無菌條件中在具有5% CO2之37℃培育器中生長2週。使細胞在具有10%胎牛血清之McCoy’s5A培養基中生長。每3-4天利用0.05%胰蛋白酶/EDTA使細胞傳代。在植入當天，提起(收穫)SKOV3細胞(傳代11次)並以5×106個細胞及50%基質膠/100μl之濃度再懸浮於McCoy’s5A無血清培養基中。對細胞進行Radil測試以確保其不含黴漿菌及鼠類病毒。
使用28 ½ G(100μl注射體積)向下肋中皮下注射植入SKOV3細胞。在植入後，一旦腫瘤可觸及，藉由測徑器量測腫瘤且對小鼠每週稱重兩次。隨後在兩個維度上量測腫瘤一週兩次。使用(L×W2)/2計算測徑器量測。根據Guide for Care and Use of Laboratory Animals及Institutional Animal Care and Use Committee之規定，向小鼠餵入正常飲食並圈養在SPF動物設施中。
在異種移植物腫瘤達到約200mm3時，藉由靜脈內途徑向小鼠投與3-10mg/kg抗HER2抗體或抗HER2-TLR7促效劑共軛物。藉由使抗體針對齧齒類動物中未發現之靶標表現及經由針對抗HER2抗體所述之類似方法共軛生成同型對照抗體。一週量測腫瘤兩次。使用Prism 5(GraphPad)軟體繪示平均腫瘤體積之圖。在腫瘤大小達到2000mm3之體積時，達成效能研究之終點。在注射後，亦密切監測小鼠之臨床劣化之體徵。若小鼠出於任何原因顯示發病之任何體徵(包括呼吸窘迫、弓背姿勢、活動性降低、後足癱瘓、作為胸膜滲出液之體徵之呼吸急促、接近20%或15%之體重減輕加上其他體徵)，或若其實施正常活動(進食、移動)之能力受損，則將小鼠安樂死。
對於HER2免疫組織化學(IHC)，使用HER2染色及異種移植物HER2
評分之標準化指南及方案(例如，參見English等人，Mol Diagn Ther.2013年4月；17(2)：85-99)。
用3mg/kg或10mg/kg之單一劑量之抗HER2-mAb1-(C-5)共軛物靜脈內治療SKOV3卵巢腫瘤異種移植物小鼠，其中化合物(C-5)共軛至抗HER2-mAb1重鏈之Cys 152及Cys 375。儘管經10mg/kg抗HER2-mAb1-(C-5)之單一劑量之治療在8隻小鼠中之7隻中導致人類SKOV3異種移植物腫瘤完全消退，但3mg/kg抗HER2-mAb1-(C-5)引起初始腫瘤消退、之後腫瘤再生長(圖7)。在與未治療之動物相比時，在經10mg/kg單獨未共軛之抗HER2-mAb1、或同型對照抗體-(C-5)共軛物治療之SKOV3異種移植物小鼠中未觀察到腫瘤消退(圖7)。
該等數據顯示，可在異種移植物模型中藉由10mg/kg之抗HER2-TLR7促效劑共軛物(例如，抗HER2-mAb1-(C-1)或抗HER2-mAb1-(C-5))之單一治療達成腫瘤消退，其中與N87及HCC異種移植物模型相比，Her2表現程度較低(圖8C，與圖8A及8B相比)。基於HER2表現程度，N87及HCC1954具有3+ IHC評分，且SKOV3具有2+ IHC評分。因此，本文所述抗HER2-TLR7促效劑共軛物不僅可抑制高HER2表現腫瘤(例如，具有3+ IHC評分)中之腫瘤生長，且亦抑制低HER2表現腫瘤(例如，具有2+ IHC評分)中之腫瘤生長。
<110> 瑞士商諾華公司
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Claims (26)
- 一種式(II)之共軛物或其醫藥上可接受之鹽，
- 如請求項1之共軛物，其中Ab選自曲妥珠單抗(trastuzumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、馬格土希單抗(margetuximab)或HT-19、或其位點特異 性半胱胺酸突變體，其中該位點特異性半胱胺酸突變體包含在以下一個或多個位置之半胱胺酸(所有位置皆係藉由EU編號)：(a)抗體重鏈之位置152、360及375，及(b)抗體輕鏈之位置107、159及165。
- 如請求項1之共軛物，其中Ab選自以下中之任一者：(a)包含以下之抗體：包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HCDR1)；包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈互補決定區2(HCDR5)；包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈互補決定區3(HCDR3)；包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LCDR1)；包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2(LCDR2)；及包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3(LCDR3)；(b)包含以下之抗體：包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HCDR1；包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HCDR2；包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HCDR3；包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之LCDR1；包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之LCDR2；及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之LCDR3；(c)包括包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體；(d)包括包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO： 19之胺基酸序列之輕鏈的抗體；(e)包括包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈的抗體；(f)包括包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈的抗體；或(g)包括包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈的抗體。
- 如請求項1至3中任一項之共軛物，其中Ab係人類或人類化抗HER2抗體。
- 如請求項1至3中任一項之共軛物，其中Ab包含經修飾Fc區。
- 如請求項1至3中任一項之共軛物，其中Ab包含在以下一個或多個位置之半胱胺酸(所有位置皆係藉由EU編號)；(a)該抗體重鏈之位置152、360及375，及(b)該抗體輕鏈之位置107、159及165。
- 如請求項1至3中任一項之共軛物，其中Ab包含在抗體重鏈之位置152及375之半胱胺酸(所有位置皆係藉由EU編號)。
- 如請求項1至3中任一項之共軛物，其中該式(II)之抗體共軛物包含式(IIa)或式(IIb)之結構：
- 如請求項1至3中任一項之共軛物，其中R1係-NHR2；R2係-C4-C6烷基；L2係-(CH2)n-或-C(=O)(CH2)n； R40係、、或；且每一n皆獨立地選自1、2、3及4，且y係1至16之整數。
- 如請求項1至3中任一項之共軛物，其中該共軛物具有0.8或更大之疏水性指數，如藉由疏水相互作用層析所測定。
- 一種共軛物，其包含下式中之任一者：
- 如請求項11之共軛物，其中Ab選自曲妥珠單抗、帕妥珠單抗、馬格土希單抗或HT-19、或其位點特異性半胱胺酸突變體，其中該位點特異性半胱胺酸突變體包含在以下一個或多個位置之半胱胺酸(所有位置皆係藉由EU編號)：(a)抗體重鏈之位置152、360及375，及(b)抗體輕鏈之位置107、159及165。
- 如請求項11之共軛物，其中Ab選自以下中之任一者：(a)包含以下之抗體：包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之重鏈互補決定區1(HCDR1)；包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之重鏈互補決定區2(HCDR2)；包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之重鏈互補決定區3(HCDR3)；包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列之輕鏈互補決定區1(LCDR1)；包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列之輕鏈互補決定區2(LCDR2)；及包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之輕鏈互補決定區3(LCDR3)；(b)包含以下之抗體：包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之HCDR1；包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HCDR2；包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HCDR3；包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之LCDR1；包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之LCDR2；及包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之LCDR3；(c)包括包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之重鏈可變區及包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之輕鏈可變區的抗體；(d)包括包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈的抗體；(e)包括包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈的抗體；(f)包括包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO： 19之胺基酸序列之輕鏈的抗體；或(g)包括包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈的抗體。
- 如請求項11之共軛物，其中Ab包括包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列之輕鏈。
- 如請求項14之共軛物，其中該化合物附接至抗體重鏈之位置152及375之半胱胺酸(所有位置皆係藉由EU編號)。
- 如請求項11之共軛物，其中y係約3至4。
- 如請求項11至16中任一項之共軛物，其中該共軛物具有0.8或更大之疏水性指數，如藉由疏水相互作用層析所測定。
- 一種醫藥組合物，其包含一或多種如請求項1至17中任一項之共軛物及醫藥上可接受之載劑。
- 一種如請求項1至17中任一項之共軛物或如請求項18之醫藥組合物的用途，其用於製造用於為有需要之個體治療HER2陽性癌症的藥劑。
- 如請求項19之用途，其中在與單獨抗HER2抗體相比時，該共軛物能抑制該HER2陽性癌症達持續時段及/或降低該HER2陽性癌症之復發。
- 如請求項19之用途，其中該HER2陽性癌症選自胃癌、食道癌、胃食道接合部腺癌、結腸癌、直腸癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮內膜癌、膀胱癌、尿道癌、胰臟癌、肺癌、前列腺癌、骨肉瘤、神經胚細胞瘤、神經膠母細胞瘤及頭頸癌。
- 如請求項19之用途，其中該共軛物係經靜脈內、腫瘤內或皮下投與至該個體。
- 如請求項19之用途，其中該共軛物係以約0.01-20mg/kg體重之劑量投與。
- 如請求項19之用途，其中該藥劑進一步包含第二藥劑或與該第二藥劑組合使用。
- 一種具有式(I)之結構之化合物或其醫藥上可接受之鹽，
- 一種共軛物，其包含附接至抗體或其抗原結合片段之如請求項25之化合物。
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