TW201718654A

TW201718654A - 具高親和力之抗人類cd19抗體

Info

Publication number: TW201718654A
Application number: TW105131515A
Authority: TW
Inventors: 湯瑪士霍夫; 克勞蒂亞費拉拉寇樂; 艾克哈得摩斯納; 米黑
Original assignee: 赫孚孟拉羅股份公司
Priority date: 2015-10-02
Filing date: 2016-09-30
Publication date: 2017-06-01
Also published as: CA3000045C; KR102761077B1; JP2018535657A; CL2018000829A1; IL258271A; CA3000045A1; BR112018006350A2; CR20180175A; PE20181089A1; CN108137698A; RU2761077C1; AU2016330807B2; IL258271B; US20230312710A1; PH12018500707A1; ZA201801993B; TWI748964B; MY193249A; CO2018004532A2; MA43019A

Abstract

本發明係關於針對人類CD19之抗體(抗人類CD19抗體)、其等生產之方法、含有該等抗體之醫藥組合物及使用其等之方法。

Description

具高親和力之抗人類CD19抗體

本發明係關於針對人類CD19之人類化抗體(抗人類CD19抗體)、其等生產之方法、含有該等抗體之醫藥組合物及使用其等之方法。

人類CD19係僅僅會在B細胞及濾泡性樹突細胞上表現之95kDa跨膜蛋白(B細胞共受體)。業內發現CD19會與CD21及CD81締合。CD19及CD21為正常B細胞分化所必需(Carter,R.H.等人，Immunol.Res.26(2002)45-54)。針對CD19之抗體已用於若干臨床試驗中(例如，參見Hekman,A.等人，Cancer Immunol.Immunother.32(191)364-372；Vlasfeld,L.T.等人，Cancer Immunol.Immunother.40(1995)37-47；Conry,R.M.等人，J.Immunother.Emphasis Tumor Immunol.18(1995)231-241；Manzke,O.等人，Int.J.Cancer 91(2001)516-522)。

針對CD19之抗體可具有抑制或刺激B細胞活化之效應。CD19抗體與促分裂原刺激之B細胞之結合抑制後續Ca²⁺升高，且CD19抗體可抑制或增強該等細胞之所得活化及增殖以及B細胞增殖及分化，此端視所用有絲分裂刺激物及藉助抗體之交聯程度而定。欲藉由針對CD19之抗體治療之癌症包括例如B細胞譜系惡性病，例如B細胞淋巴瘤或B細胞白血病，包括(但不限於)非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、慢性淋巴球性白血病及急性淋巴母細胞性白血病。針對CD19之抗體亦可用於治療自體免疫疾病、類風濕性關節炎、狼瘡、牛皮癬或骨病。

在WO 2011/147834中報導針對CD19之抗體及其用途。然而，已發現，該等抗體之序列中具有某些去醯胺熱點。本文所述抗體之特徵不僅在於不含該等去醯胺熱點之序列，其對於標的CD19亦具有較高的親和力。

在一態樣中，本發明提供具高親和力之抗人類CD19抗體。

在一態樣中提供以下抗體，其特異性結合至人類CD19之親和力高於包含包括SEQ ID NO：113之胺基酸序列的可變重鏈及包括SEQ ID NO：114之胺基酸序列的可變輕鏈之抗體。

在另一態樣中，所提供的是特異性結合至人類CD19之抗體，其中該抗體包含(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列，(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列，(d)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列，(e)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列，及(f)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列。

在另一態樣中，抗體係單株抗體。在另一態樣中，抗體係人類、人類化或嵌合抗體。在另一態樣中，抗體係特異性結合至人類CD19之抗體片段。

在具體態樣中提供抗體，其中該抗體包含包括SEQ ID NO：99之胺基酸序列的VH結構域及包括SEQ ID NO：100之胺基酸序列的VL結構域。

在另一態樣中提供如前文所述之抗體，其係全長IgG1抗體。

在具體態樣中提供如本文所述之抗體，其係具突變L234A、L235A及P329G之全長IgG1抗體(編號係根據Kabat之EU索引)。

在另一態樣中提供如本文所述之抗體，其對人類及食蟹猴CD19具有交叉反應性。

在另一態樣中提供雙特異性抗體，其中該抗體特異性結合至人類CD19及第二抗原結合部分，其中該抗體包含(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列，(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列，(d)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列，(e)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列，及(f)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列。

本發明之另一態樣提供經分離多核苷酸，其編碼如前文所述之抗體。本發明進一步提供包含本發明之經分離多核苷酸之載體、尤其表現載體，及包含本發明之經分離多核苷酸或載體之宿主細胞。在一些實施例中，宿主細胞係真核細胞、尤其哺乳動物細胞。

在另一態樣中提供產生本發明抗體之方法，其包含以下步驟：(i)在適於表現抗原結合分子之條件下培養本發明之宿主細胞，及(ii)回收抗原結合分子。本發明亦涵蓋藉由本發明方法產生之抗體。

本發明進一步提供醫藥組合物，其包含本發明抗體及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。

本發明亦涵蓋本發明抗體或本發明醫藥組合物，其用作藥劑。在一態樣中提供本發明抗體或本發明醫藥組合物，其用於治療有需要之個體之疾病。在特定態樣中提供本發明抗體或本發明醫藥組合物，其用於治療癌症。在另一態樣中提供本發明抗體或本發明醫藥組合物，其用於治療自體免疫疾病、類風濕性關節炎、狼瘡、牛皮癬或骨病。

亦提供本發明抗體之用途，其用於製造用來治療有需要之個體之疾病的藥劑，具體而言用於製造用來治療癌症之藥劑；以及治療個體疾病之方法，其包含向該個體投與治療有效量之包含呈醫藥上可接受形式之抗體的組合物。在特定態樣中，疾病係癌症。在另一態樣中，疾病選自由以下組成之群：自體免疫疾病、類風濕性關節炎、狼瘡、牛皮癬或骨病。在上述實施例中之任一者中，個體較佳係哺乳動物、尤其人類。

在圖1中圖解說明親代純系8B8之CDR區之隨機化策略。顯示根據Kabat編號之親代純系8B8之可變結構域及CDR區(加框)。VL序列對應於SEQ ID NO：114且VH序列對應於SEQ ID NO：113。(X)代表隨機化位置。

圖2顯示文庫生成策略之示意性描述。顯示用於生成基於8B8之文庫之PCR擴增及選殖策略，其中A)隨機化輕鏈及重鏈中之CDR1區及CDR2區，或B)隨機化輕鏈中之CDR1區及CDR3區以及重鏈中之CDR3區。指示用於選殖至噬菌粒中之各別酶。

圖3顯示親代抗CD19純系8B8與所選親和力成熟結合劑之比對。顯示純系8B8及所有所選親和力成熟結合劑之序列。框出重鏈及輕鏈二者之CDR。

圖4A至4H係關於親代8B8純系及其親和力成熟變體之SPR分析。顯示純系8B8及其不含LCDR1 N27d及N28熱點之親和力成熟衍生物之感測圖。

圖5顯示不同CD19 IgG1純系與表現人類CD19之腫瘤細胞(WSU-DLCL2細胞)之結合。結合係使用PE偶聯之AffiniPure抗人類IgG F(ab`)2片段特異性山羊F(ab`)2片段來檢測。顯示所測試純系之中值螢光強度(MFI)對濃度。

定義

除非另外定義，否則本文所用之技術及科學術語具有與本發明所屬領域中常用之含義相同的含義。出於解釋本說明書之目的，將應用以下定義且若適當，以單數使用之術語亦將包括複數且反之亦然。

如本文所用術語「抗原結合分子」在其最廣泛意義上係指特異性結合抗原決定子之分子。抗原結合分子之實例係抗體、抗體片段及支架抗原結合蛋白。

術語「抗原結合部分」係指特異性結合至抗原決定子之多肽分子。在一態樣中，抗原結合部分能夠經由其標的細胞抗原活化信號傳導。在具體態樣中，抗原結合部分能夠將實體引導至其與靶位點附接處。抗原結合部分包括能夠特異性結合至標的細胞抗原之抗體及其片段。另外，能夠特異性結合至標的細胞抗原之抗原結合部分包括如下文所定義之支架抗原結合蛋白，例如基於經設計重複蛋白或經設計重複結構域(例如經設計錨蛋白重複蛋白(DARPin))(例如，參見WO 2002/020565)或脂質運載蛋白(抗運載蛋白)之結合結構域。

術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、單特異性及多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性即可。

如本文所用術語「單株抗體」係指自實質上同源之抗體群獲得之抗體，即包含該群之個別抗體相同及/或結合相同表位，可能之變體抗體除外，例如，含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生，該等變體通常係以較小量存在。與通常包括針對不同決定子(表位)之不同抗體之多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定子。

如本文所用術語「單特異性」抗體表示具有一或多個結合位點之抗體，每一結合位點結合至相同抗原之相同表位。術語「雙特異性」意指能夠特異性結合至至少兩個不同抗原決定子之抗原結合分子。通常，雙特異性抗原結合分子包含兩個抗原結合位點，其中之每一者特異性針對不同的抗原決定子。在某些實施例中，雙特異性抗原結合分子能夠同時結合兩個抗原決定子，尤其兩個在兩種不同細胞上表現之抗原決定子。

如當前申請案內所用術語「價」表示在抗原結合分子中存在指定數量之結合位點。因此，術語「二價」、「四價」及「六價」表示在抗原結合分子中分別存在兩個結合位點、四個結合位點及六個結合位點。

術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用且係指具有實質上與天然抗體結構類似之結構的抗體。「天然抗體」係指具有不同結構之天然免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG類抗體係約150,000道爾頓(dalton)之異四聚體糖蛋白，其係由二硫鍵鍵結之兩條輕鏈及兩條重鏈構成。自N末端至C末端，每一重鏈依次具有可變區(VL)(亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)及三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)(亦稱為重鏈恆定區)。類似地，自N末端至C末端，每一輕鏈依次具有可變區(VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)及輕鏈恆定結構域(CL)(亦稱為輕鏈恆定區)。可將抗體之重鏈指定為5個類型中之一者，稱為α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)或μ(IgM)，其中之一些可進一步分成亞型，例如γ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及α2(IgA2)。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈指定為兩種類型中之一者，稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ)。

「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')₂、雙價抗體、三價抗體、四價抗體、交叉Fab片段；直鏈抗體、單鏈抗體分子(例如scFv)；及單結構域抗體。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Plückthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有延長的活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。雙價抗體係可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段，參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc Natl Acad Sci USA 90,6444-6448(1993)。三價抗體及四價抗體亦闡述於Hudson等人，Nat Med 9,129-134(2003)中。單一結構域抗體係包含抗體之重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis Inc.,Waltham,MA；例如，參見美國專利第6,248,516 B1號)。可藉由各種技術來製備抗體片段，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)來產生，如本文所述。

木瓜酶消化完整抗體產生兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，其含有每一重鏈及輕鏈可變結構域亦及輕鏈之恆定結構域及重鏈之第一恆定結構域(CH1)。因此，如本文所用術語「Fab片段」係指包含輕鏈片段(其包含輕鏈(CL)之VL結構域及恆定結構域)及重鏈之VH結構域及第一恆定結構域(CH1)之抗體片段。Fab'片段與Fab片段之不同之處在於在重鏈CH1結構域之羧基末端添加幾個殘基，包括一或多個來自抗體鉸鏈區之半胱胺酸。Fab'-SH係恆定結構域之半胱胺酸殘基具有游離硫醇基之Fab'片段。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原組合位點(兩個Fab片段)之F(ab')₂片段及Fc區之一部分。

術語「交叉Fab(cross-Fab)片段」或「xFab片段」或「交叉Fab(crossover Fab)片段」係指Fab片段，其中重鏈及輕鏈之可變區或恆定區發生交換。交叉Fab分子之兩種不同的鏈組成係可能的且包含在本發明雙特異性抗體中：一方面，Fab重鏈及輕鏈之可變區發生交換，即交叉Fab分子包含由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成之肽鏈及由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成之肽鏈。此交叉Fab分子亦稱為CrossFab_(VLVH)。另一方面，當Fab重鏈及輕鏈之恆定區發生交換時，交叉Fab分子包含由重鏈可變區(VH)及輕鏈恆定區(CL)構成之肽鏈及由輕鏈可變區(VL)及重鏈恆定區(CH1)構成之肽鏈。此交叉Fab分子亦稱為CrossFab_(CLCH1)。

「單鏈Fab片段」或「scFab」係由抗體重鏈可變結構域(VH)、抗體恆定結構域1(CH1)、抗體輕鏈可變結構域(VL)、抗體輕鏈恆定結構域(CL)及連接體組成之多肽，其中該等抗體結構域及該連接體在N末端至C末端方向上具有以下順序中之一者：a)VH-CH1-連接體-VL-CL，b)VL-CL-連接體-VH-CH1，c)VH-CL-連接體-VL-CH1，或d)VL-CH1-連接體-VH-CL；且其中該連接體係至少30個胺基酸、較佳32至50個胺基酸之多肽。該等單鏈Fab片段係經由CL結構域與CH1結構域之間之天然二硫鍵來穩定。另外，該等單鏈Fab分子可經由插入半胱胺酸殘基(例如根據Kabat編號，可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100)生成鏈間二硫鍵來進一步穩定。

「交叉單鏈Fab片段」或「x-scFab」係由抗體重鏈可變結構域(VH)、抗體恆定結構域1(CH1)、抗體輕鏈可變結構域(VL)、抗體輕鏈恆定結構域(CL)及連接體組成之多肽，其中該等抗體結構域及該連接體在N末端至C末端方向上具有以下順序中之一者：a)VH-CL-連接體-VL-CH1，及b)VL-CH1-連接體-VH-CL；其中VH及VL一起形成特異性結合至抗原之抗原結合位點且其中該連接體係至少30個胺基酸之多肽。另外，該等x-scFab分子可經由插入半胱胺酸殘基(例如根據Kabat編號，可變重鏈中之位置44及可變輕鏈中之位置100)生成鏈間二硫鍵來進一步穩定。

「單鏈可變片段(scFv)」係用10至約25個胺基酸之短連接體肽連結之抗體重鏈(V_H)及輕鏈(V_L)可變區之融合蛋白。連接體通常富含甘胺酸用於撓性以及絲胺酸或蘇胺酸用於溶解性，且可連結V_H之N末端與V_L之C末端，或反之亦然。此蛋白質保留原始抗體之特異性，但移除恆定區且引入連接體。scFv抗體闡述於例如Houston,J.S.,Methods in Enzymol.203(1991)46-96)中。另外，抗體片段包含單鏈多肽，其具有VH結構域之特徵，即能夠與VL結構域一起組裝成功能性抗原結合位點，或具有VL結構域之特徵，即能夠與VH結構域一起組裝成功能性抗原結合位點，且由此提供全長抗體之抗原結合性質。

「支架抗原結合蛋白」為業內已知，例如，已使用纖連蛋白及經設計之錨蛋白重複蛋白(DARPin)作為抗原結合結構域之替代支架，例如參見Gebauer及Skerra,Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.Curr Opin Chem Biol 13：245-255(2009)及Stumpp等人，Darpins：A new generation of protein therapeutics.Drug Discovery Today 13：695-701(2008)。在本發明之一態樣中，支架抗原結合蛋白選自由以下組成之群：CTLA-4(厄維體(Evibody))、脂質運載蛋白(抗運載蛋白)、蛋白質A源分子(例如蛋白質A之Z-結構域(親和體)、A-結構域(Avimer/大抗體))、血清運鐵蛋白(穿體)；經設計錨蛋白重複蛋白(DARPin)、抗體輕鏈或重鏈之可變結構域(單一結構域抗體，sdAb)、抗體重鏈之可變結構域(奈米抗體，aVH)、V_NAR片段、纖連蛋白(阿德耐汀(AdNectin))、C型凝集素結構域(四連接素(Tetranectin))；新穎抗原受體β-內醯胺酶之可變結構域(V_NAR片段)、人類γ-結晶蛋白或泛蛋白(親和素分子)；人類蛋白酶抑制劑之kunitz型結構域、微體(例如來自打結素(knottin)家族之蛋白質)、肽適配體及纖連蛋白(阿德耐汀)。

CTLA-4(細胞毒性T淋巴球相關抗原4)係主要在CD4+ T細胞上表現之CD28家族受體。其細胞外結構域具有可變結構域樣Ig摺疊。對應於抗體之CDR之環可經異源序列取代以賦予不同的結合性質。經改造以具有不同結合特異性之CTLA-4分子亦稱為厄維體(例如US7166697B1)。厄維體之大小與抗體(例如結構域抗體)之經分離可變區大致相同。關於其他細節，參見Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。

脂質運載蛋白係運輸疏水性小分子(例如類固醇、後膽色素(bilin)、類視色素及脂質)之細胞外蛋白家族。其於錐形結構之開口端具有含有多個環之剛性β-摺疊二級結構，該結構可經改造以結合至不同的標的抗原。抗運載蛋白之大小介於160-180個胺基酸之間，且源自脂質運載蛋白。關於其他細節，參見Biochim Biophys Acta 1482：337-350(2000)、US7250297B1及US20070224633。

親和體係源自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)之蛋白A之支架，其可經改造以結合至抗原。結構域係由約58個胺基酸之三螺旋束組成。已藉由表面殘基之隨機化生成文庫。關於其他細節參見Protein Eng.Des.Sel.17,455-462(2004)及EP 1641818A1。

Avimer係源自A-結構域支架家族之多結構域蛋白質。約35個胺基酸之天然結構域呈現經定義二硫鍵結結構。藉由使由A-結構域家族展現之天然變化改組來生成多樣性。關於其他細節，參見Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)及Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6),909-917(2007年6月)。

轉鐵蛋白係單體血清運輸醣蛋白。轉鐵蛋白可藉由在允許式表面環中插入肽序列來改造以結合不同標的抗原。經改造轉鐵蛋白支架之實例包括穿體。關於其他細節，參見J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。

經設計錨蛋白重複蛋白(DARPin)係源自調介整合膜蛋白附接至細胞骨架之蛋白家族的錨蛋白。單一錨蛋白重複係由兩個α-螺旋及β-轉折組成之33殘基基序。其可藉由隨機化每一重複之第一α-螺旋及β-轉折中之殘基來改造以結合不同標的抗原。可藉由增加模組數量(親和力成熟方法)來增大其結合界面。關於其他細節，參見J.Mol.Biol.332,489-503(2003)、PNAS 100(4),1700-1705(2003)及J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)及US20040132028A1。

單一結構域抗體係由單一單體可變抗體結構域組成之抗體片段。第一單一結構域係源自駱駝科動物之抗體重鏈之可變結構域(奈米抗體或V_HH片段)。此外，術語單一結構域抗體包括自主人類重鏈可變結構域(aVH)或源自鯊魚之V_NAR片段。

纖連蛋白係可經改造以結合至抗原之支架。阿德耐汀係由人類纖連蛋白III型(FN3)之15個重複單元之第10結構域之天然胺基酸序列的骨架組成。貝他三明治(.β.-sandwich)一端之3個環可經改造以使阿德耐汀能夠特異性識別所關注治療標的。關於其他細節，參見Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)、US20080139791、WO2005056764及US6818418B1。

肽適配體係由恆定支架蛋白(通常為硫氧還蛋白(TrxA))組成之組合識別分子，該蛋白含有插入活性位點之限制性可變肽環。關於其他細節，參見Expert Opin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。

微體係源自長度為25至50個胺基酸之天然微蛋白，其含有3-4個半胱胺酸橋，微蛋白之實例包括KalataBI及芋螺毒素(conotoxin)及打結素。微蛋白之環可經改造以包括高達25個胺基酸，而不會影響微蛋白之總體摺疊。關於經改造打結素結構域之其他細節，參見WO2008098796。

「結合至相同表位之抗原結合分子」作為參考分子係指在競爭分析中將參考分子與其抗原之結合阻斷50%或更高之抗原結合分子，且反之，參考抗體在競爭分析中將該抗原結合分子與其抗原之結合阻斷50%或更高。

術語「抗原結合結構域」係指包含特異性結合至抗原之一部分或全部且與其互補之區域的抗原結合分子部分。倘若抗原較大，則抗原結合分子僅可結合至抗原之具體部分，該部分稱為表位。抗原結合結構域可由例如一或多個可變結構域(亦稱為可變區)來提供。較佳地，抗原結合結構域包含抗體輕鏈可變區(VL)及抗體重鏈可變區(VH)。

如本文所用術語「抗原決定子」與「抗原」及「表位」同義，且係指多肽大分子上抗原結合部分結合形成抗原結合部分-抗原複合物之位點(例如胺基酸之鄰接段或由非鄰接胺基酸之不同區域構成之構象構形)。有用抗原決定子可發現於例如腫瘤細胞之表面上、病毒感染細胞之表面上、其他病變細胞之表面上、免疫細胞之表面上、游離於血清中及/或細胞外基質(ECM)中。除非另有指示，否則在本文中可用作抗原之蛋白質可為來自任一脊椎動物來源之蛋白質之任一天然形式，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在具體實施例中，抗原係人類蛋白。倘若本文中提及特定蛋白質，則該術語涵蓋未經處理之「全長」蛋白質以及源自細胞處理之任一蛋白質形式。該術語亦涵蓋蛋白質之天然變體，例如剪接變體或等位基因變體。

「特異性結合」意指結合對抗原具有選擇性且可區別於不期望或非特異性相互作用。抗原結合分子結合至特定抗原之能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者所熟悉之其他技術(例如表面電漿共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002)))來量測。在一實施例中，抗原結合分子與無關蛋白質之結合程度小於該抗原結合分子與抗原之結合的約10%，如藉由例如SPR所量測。在某些實施例中，結合至抗原之分子具有1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10^-8M或更小，例如10^-8M至10^-13M，例如10^-9M至10^-13M)之解離常數(Kd)。

「親和力」或「結合親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如抗原)之間的非共價相互作用之和之強度。除非另有指示，否則如本文所用「結合親和力」係指反映結合對之成員(例如，抗體與抗原)之間之1：1相互作用的固有結合親和力。分子X對其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(Kd)來表示，解離常數係解離速率常數與締合速率常數(分別為k解離及k締合)之比率。因此，等效親和力可包含不同速率常數，只要速率常數之比率保持相同即可。親和力可藉由業內已知之常用方法(包括本文所述之彼等)來量測。量測親和力之具體方法係表面電漿共振(SPR)。

除非另有指示，否則術語「CD19」係指B淋巴球抗原CD19(亦稱為B淋巴球表面抗原B4或T細胞表面抗原Leu-12)，且包括來自任何脊椎動物來源之任何天然CD19，該脊椎動物來源包括哺乳動物，例如靈長類動物(例如人類)、非人類靈長類動物(例如食蟹猴)及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。人類CD19之胺基酸序列顯示於Uniprot登錄號P15391(形式160，SEQ ID NO：115)中。該術語涵蓋未經處理之「全長」人類CD19以及人類CD19之源自細胞處理之任一形式，只要如本文所報告之抗體與其結合即可。CD19係在人類B細胞表面上表現之結構不同之細胞表面受體，該等B細胞包括(但不限於)前B細胞、早期發育中之B細胞(即，不成熟B細胞)、經由最後分化成漿細胞之成熟B細胞及惡性B細胞。CD19係由以下疾病表現：大多數前B急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、非霍奇金氏淋巴瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病(CLL)、前淋巴球性白血病、毛細胞白血病、普通急性淋巴球性白血病及一些無標記急性淋巴母細胞性白血病。CD19在漿細胞上之表現進一步表明其可在分化B細胞腫瘤(例如多發性骨髓瘤)上表現。因此，CD19抗原係治療非霍奇金氏淋巴瘤、慢性淋巴球性白血病及/或急性淋巴母細胞性白血病之免疫療法之標的。

術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈之參與抗原結合分子與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有相似結構，其中各結構域包含四個保守框架區(FR)及三個超變區(HVR)。例如，參見Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。

如本文所用術語「超變區」或「HVR」係指抗體可變結構域之序列具有超變性及/或形成結構上經定義之環(「超變環」)之區域中的每一者。通常，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自超變環及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或參與抗原識別。實例性超變環出現於胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)處(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。實例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現於胺基酸殘基L1之24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2之50-65及H3之95-102處(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。超變區(HVR)亦稱為互補決定區(CDR)，且該等術語在本文中可互換使用來提及形成抗原結合區域之可變區部分。此具體區域已闡述於Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,「Sequences of Proteins of Immunological Interest」(1983)及Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)中，其中該等定義在彼此進行比較時包含胺基酸殘基之重疊或子集。然而，如本文所定義及使用之術語之範疇意欲涵蓋應用任一定義意指抗體或其變體之CDR。涵蓋如由上文所引用參考文獻中之每一者定義之CDR的適宜胺基酸殘基以比較方式陳述於下表A中。涵蓋具體CDR之確切殘基數量將端視CDR之序列及大小而變化。給定抗體之可變區胺基酸序列，熟習此項技術者可以常規方式確定包含具體CDR之殘基。

¹表A中之所有CDR定義皆係根據Kabat等人所述之編號規定加以編號(參見下文)。

²如表A中所用之具有小寫字母「b」之「AbM」係指如由Oxford Molecular之「AbM」抗體建模軟體定義之CDR。

Kabat等人亦定義用於可變區序列且適用於任一抗體之編號系統。熟習此項技術者可明確地將此「Kabat編號」系統指定給任何可變區序列，除序列本身外不依賴於任何實驗數據。如本文所用「Kabat編號」係指Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,「Sequence of Proteins of Immunological Interest」(1983)所述之編號系統。除非另外規定，否則對抗體可變區中之特定胺基酸殘基位置進行編號之提及係根據Kabat編號系統來進行。

除VH中之CDR1外，CDR通常包含形成超變環之胺基酸殘基。CDR 亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其係接觸抗原之殘基。SDR含於CDR之稱為縮短CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之區域內。實例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現於胺基酸殘基L1之31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58及H3之95-102處。(參見Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)。)除非另有指示，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)在本文中係根據Kabat等人所述來編號(參見上文)。

如本文所用術語「親和力成熟」在抗原結合分子(例如，抗體)背景下係指以下抗原結合分子：例如藉由突變源自參考抗原結合分子，與參考抗體結合至相同抗原、較佳結合至相同表位；且對抗原之親和力高於參考抗原結合分子。親和力成熟通常涉及修飾抗原結合分子之一或多個CDR中之一或多個胺基酸殘基。通常，親和力成熟之抗原結合分子結合至與初始參考抗原結合分子相同之表位。

「框架」或「FR」係指除超變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常係由4個FR結構域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現於VH(或VL)中之以下序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

出於本文目的，「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列的框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數量為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列一致。

術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自具體來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種的抗體。

抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5大類抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁及IgA₂。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。

「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上所有之至少一個、且通常兩個可變結構域，其中所有或實質上所有之HVR(例如，CDR)對應於非人類之彼等HVR，且所有或實質上所有之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經受人類化之抗體。本發明涵蓋之「人類化抗體」之其他較佳形式係如下之彼等：其中恆定區相對於原始抗體之恆定區已另外經修飾或改變，以生成本發明之尤其關於C1q結合及/或Fc受體(FcR)結合之性質。

「人類」抗體係具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者：其係由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他人類抗體編碼序列之非人類來源。人類抗體之此定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。

術語「Fc結構域」或「Fc區」在本文中用於定義抗體重鏈之含有恆定區之至少一部分的C末端區域。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。IgG Fc區包含IgG CH2及IgG CH3結構域。人類IgG Fc區之「CH2結構域」通常自約位置231之胺基酸殘基延伸至約位置340之胺基酸殘基。在一實施例中，碳水化合物鏈附接至CH2結構域。本文之CH2結構域可為天然序列CH2結構域或變體CH2結構域。「CH3結構域」包含Fc區中CH2結構域C末端之殘基段(即自IgG之約位置341之胺基酸殘基至約位置447之胺基酸殘基)。本文之CH3區可為天然序列CH3結構域或變體CH3結構域(例如在一個鏈中引入「隆凸」(「凸起」)且在另一鏈中相應地引入「空腔」(「孔洞」)之CH3結構域；參見美國專利第5,821,333號，其以引入方式明確併入本文中)。該等變體CH3結構域可用於促進如本文所述之兩個不一致抗體重鏈之異二聚化。在一實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226、或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，可存在或可不存在Fc區之C末端離胺酸(Lys447)。除非在本文中另外規定，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據EU編號系統(亦稱為EU索引)來進行，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。

「凸起於孔洞」技術闡述於例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人，Prot Eng 9,617-621(1996)及Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常，該方法涉及在第一多肽之界面處引入隆凸(「凸起」)且在第二多肽之界面上引入相應空腔(「孔洞」)，使得隆凸可定位於空腔中以促進異二聚體形成並防止同二聚體形成。隆凸係藉由使用較大側鏈(例如酪胺酸或色胺酸)替代第一多肽界面之較小胺基酸側鏈來構築。藉由使用較小胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸)替代較大胺基酸側鏈在第二多肽之界面上產生尺寸與隆凸相同或相似之補償性空腔。隆凸及空腔可藉由改變編碼多肽之核酸(例如藉由位點特異性誘變)或藉由肽合成來製造。在特定實施例中，凸起修飾包含Fc結構域之兩個亞單位中之一者中之胺基酸取代T366W，且孔洞修飾包含Fc結構域之兩個亞單位中之另一者中之胺基酸取代T366S、L368A及Y407V。在另一特定實施例中，包含凸起修飾之Fc結構域亞單位另外包含胺基酸取代S354C，且包含孔洞修飾之Fc結構域亞單位另外包含胺基酸取代Y349C。引入該兩種半胱胺酸殘基可在Fc區之兩個亞單位之間形成二硫橋，由此進一步穩定二聚體(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。

「等效於免疫球蛋白之Fc區之區域」意欲包括免疫球蛋白Fc區之天然等位基因變體以及具有產生取代、添加或缺失但不實質上降低免疫球蛋白調介效應物功能(例如抗體依賴性細胞毒性)之能力的變化之變體。舉例而言，一或多個胺基酸可缺失免疫球蛋白Fc區之N末端或C末端但不實質損失生物功能。該等變體可業內已知之一般規則來選擇以對活性具有最小效應(例如，參見Bowie,J.U.等人，Science 247：1306-10(1990))。

術語「效應物功能」係指可歸因於抗體Fc區之彼等生物活性，其可隨抗體同型而有所變化。抗體效應物功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)、Fc受體結合、抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、細胞介素分泌、免疫複合物介導之抗原呈遞細胞之抗原攝取、細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調及B細胞活化。

「活化Fc受體」係在經抗體之Fc區接合後引發刺激具有受體之細胞實施效應物功能之信號傳導事件的Fc受體。活化Fc受體包括FcγRIIIa (CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及FcαRI(CD89)。具體活化Fc受體係人類FcγRIIIa(參見UniProt登錄號P08637，141版)。

「胞外結構域」係膜蛋白之延伸至細胞外間隙(即標的細胞外部之空間)中之結構域。胞外結構域通常係蛋白質之開始接觸表面從而引起信號轉導之部分。

術語「肽連接體」係指包含一或多個胺基酸、通常約2至20個胺基酸之肽。肽連接體為業內已知或闡述於本文中。適宜非免疫原性連接體肽係例如(G₄S)_n、(SG₄)_n或G₄(SG₄)_n肽連接體，其中「n」通常係介於1與10之間、通常介於1與4之間、具體而言為2之數值。

如本申請案內所用之術語「胺基酸」表示天然羧基α-胺基酸之群，其包含丙胺酸(三字母代碼：ala，單字母代碼：A)、精胺酸(arg,R)、天冬醯胺(asn,N)、天冬胺酸(asp,D)、半胱胺酸(cys,C)、麩醯胺酸(gln,Q)、麩胺酸(glu,E)、甘胺酸(gly,G)、組胺酸(his,H)、異白胺酸(ile,I)、白胺酸(leu,L)、離胺酸(lys,K)、甲硫胺酸(met,M)、苯丙胺酸(phe,F)、脯胺酸(pro,P)、絲胺酸(ser,S)、蘇胺酸(thr,T)、色胺酸(trp,W)、酪胺酸(tyr,Y)及纈胺酸(val,V)。

「融合」或「連結」意指藉由肽鍵直接或經由一或多個肽連接體連接之組份。

相對於參考多肽(蛋白質)序列之「胺基酸序列一致性百分數(%)」定義為在比對序列並引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分數後，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分數之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、SAWI或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需之任何算法。然而，出於本文目的，胺基酸序列一致性%之值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2來產生。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech,Inc.設計，且源代碼已與使用者文件一起編入美國版權局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.,20559中，其中其係以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech,Inc.，South San Francisco,California公開獲得，或可自源代碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)中。所有序列比較參數皆係由ALIGN-2程式設定且不改變。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或對(against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表達為相對於、與或對給定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%之給定胺基酸序列A)計算如下：100×分數X/Y

其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，倘若胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度，則A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另有明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%的值皆係如前面緊接段落中所述使用ALIGN-2電腦程式來獲得。

術語「胺基酸序列變體」包括在親代抗原結合分子(例如人類化或人類抗體)之一或多個超變區殘基中存在胺基酸取代之實質變體。通常，經選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗原結合分子具有某些生物性質(例如，增加的親和力、降低的免疫原性)之改變(例如，改良)及/或實質上保留親代抗原結合分子之某些生物性質。實例性取代變體係親和力成熟抗體，其可便利地例如使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(例如本文所述之彼等)來生成。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且將變體抗原結合分子展示於噬菌體上並篩選具體生物活性(例如結合親和力)。在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生於一或多個HVR內，只要該等變化不會實質上降低抗原結合分子結合抗原之能力即可。舉例而言，可對HVR作出不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。可用於鑑別抗體之可靶向用於誘變之殘基或區域的方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085中所述。在此方法中，鑑別出殘基或目標殘基群(例如帶電殘基，例如Arg、Asp、His、Lys及Glu)，且經中性或帶負電之胺基酸(例如，丙胺酸或多丙胺酸)替代以確定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在對初始取代展示功能敏感性之胺基酸位置引入其他取代。或者或另外，抗原-抗原結合分子複合物之晶體結構以鑑別抗體與抗原之間之接觸點。可靶向該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物或將其消除。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。

胺基酸序列插入包括胺基及/或羧基末端融合物(長度在一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽範圍內)、以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。

「保守取代」提供於表B中之「較佳取代」標題下且進一步闡述於提及胺基酸側鏈類別(1)至(6)之下文中。可將胺基酸取代引入所關注分子及經篩選具有期望活性之產物中，該期望活性係例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或經改良之ADCC或CDC。

可根據常見側鏈性質將胺基酸分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu； (4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳香族殘基：Trp、Tyr、Phe。

非保守取代將使得需要將該等類別中一者之成員與另一類別交換。

在某些實施例中，改變本文所提供之抗原結合分子以增加或降低抗體醣基化之程度。分子之醣基化變體可便捷地藉由改變胺基酸序列、使得產生或移除一或多個醣基化位點來獲得。倘若抗原結合分子包含Fc區，則其所附接之碳水化合物可能有所變化。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈、二分枝寡醣，其通常藉由N-連接附接至Fc區之CH2結構域的Asn297。例如，參見Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括多種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸以及附接至二分枝寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的岩藻糖。在一些實施例中，可修飾抗原結合分子中之寡醣以產生具有某些經改良性質之變體。在一態樣中，提供具有缺少附接(直接或間接)至Fc區之岩藻糖之碳水化合物結構的抗原結合分子變體。該等岩藻糖基化變體可具有經改良之ADCC功能，參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)或第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。本發明抗原結合分子之其他變體包括具有二等分寡醣之彼等，例如其中附接至Fc區之二分枝寡醣由GlcNAc二等分。該等變體可具有降低的岩藻糖基化及/或經改良之ADCC功能，參見例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)、美國專利第6,602,684號(Umana等人)及US 2005/0123546(Umana等人)。亦提供在附接至Fc區之寡醣中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變體。該等抗體變體可具有經改良之CDC功能且闡述於例如WO 1997/30087(Patel等人)、 WO 1998/58964(Raju,S.)及WO 1999/22764(Raju,S.)中。

在某些實施例中，可期望產生本發明抗原結合分子之經半胱胺酸改造之變體，例如「thioMAb」，其中該分子之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在具體實施例中，經取代殘基出現於分子之可及位點。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，由此使反應性硫醇基團定位於抗體之可及位點且可用於將抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)，以產生免疫偶聯物。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)、重鏈之A118(EU編號)及重鏈Fc區之S400(EU編號)。經半胱胺酸改造之抗原結合分子可如例如美國專利第7,521,541號中所述來生成。

在某些實施例中，本文所提供之抗原結合分子可經進一步修飾以含有業內已知且易於獲得之額外非蛋白質性部分。適於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中之穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物的數量可有所變化，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，衍生所用聚合物之數量及/或類型可基於包括(但不限於)以下在內之考慮因素來確定：欲改良抗體之具體性質或功能、抗體衍生物是否將用於定義條件下之療法等。在另一態樣中，提供抗體及非蛋白性部分之偶聯物，其可藉由曝露於輻射來選擇性加熱。在一實施例中，非蛋白質性部分係碳奈米管(Kam,N.W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)如下波長：其不會危害正常細胞，但將非蛋白質性部分加熱至可將毗鄰抗體-非蛋白質性部分之細胞殺死的溫度。在另一態樣中，可獲得本文所提供抗原結合分子之免疫偶聯物。「免疫偶聯物」係偶聯至一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。

術語「多核苷酸」係指經分離核酸分子或構築體，例如信使RNA(mRNA)、病毒源RNA或質體DNA(pDNA)。多核苷酸可包含習用磷酸二酯鍵或非習用鍵(例如醯胺鍵，例如發現於肽核酸(PNA)中者)。術語「核酸分子」係指存在於多核苷酸中之任一或多個核酸區段，例如DNA或RNA片段。

「經分離」核酸分子或多核苷酸欲指已自其天然環境取出之核酸分子、DNA或RNA。舉例而言，出於本發明之目的，將載體中所含之編碼多肽之重組多核苷酸視為經分離形式。經分離多核苷酸之其他實例包括維持於異源宿主細胞中之重組多核苷酸或於溶液中之經純化(部分地或實質上)多核苷酸。經分離核酸包括通常含有多核苷酸分子之細胞中所含的多核苷酸分子，但該多核苷酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置。經分離RNA分子包括本發明之活體內或活體外RNA轉錄本以及正鏈及負鏈形式及雙鏈形式。本發明之經分離多核苷酸或核酸進一步包括以合成方式產生之該等分子。另外，多核苷酸或核酸可為或可包括調控元件，例如啟動子、核糖體結合位點或轉錄終止子。

具有與本發明參考核苷酸序列至少例如95%「一致」之核苷酸序列的核酸或多核苷酸欲指該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列一致，只是該多核苷酸序列可包括參考核苷酸序列之每100個核苷酸至多5處點突變。換言之，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95%一致之核苷酸序列的多核苷酸，參考序列中至多5%的核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或可將佔參考序列中之總核苷酸至多5%之多個核苷酸插入參考序列中。參考序列之該等改變可發生在參考核苷酸序列之5’或3’末端位置或在彼等末端位置之間之任何位置，其係個別地散佈在參考序列中之各殘基之間或在參考序列內呈一或多個鄰接基團形式。實際上，可使用已知電腦程式(例如上文針對多肽所論述者，例如ALIGN-2)按慣例確定任一具體多核苷酸序列與本發明核苷酸序列是否為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致。

術語「表現盒」係指以重組或合成方式生成之具有一系列允許標的細胞中之具體核酸轉錄之指定核酸元件的多核苷酸。重組表現盒可納入質體、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，表現載體之重組表現盒部分較其他序列尤其包括欲轉錄核酸序列及啟動子。在某些實施例中，本發明之表現盒包含編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段之多核苷酸序列。

術語「載體」或「表現載體」與「表現構築體」同義，且係指用於引入在標的細胞中與其可操作地締合之特定基因且引導其表現之DNA分子。該術語包括呈自複製核酸結構之載體，以及納入引入其之宿主細胞基因組中之載體。本發明之表現載體包含表現盒。表現載體容許轉錄大量穩定mRNA。表現載體位於標的細胞內部後，立即藉由細胞轉錄及/或轉譯機構來產生由基因編碼之核糖核酸分子或蛋白質。在一實施例中，本發明之表現載體包含包括編碼本發明之雙特異性抗原結合分子或其片段之多核苷酸序列的表現盒。

術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指向其中引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉化體」及「經轉化細胞」，其包括原代經轉化細胞及源自其之子代(與傳代次數無關)。子代之核酸含量可與親代細胞不完全相同，且可含有突變。本文包括經篩選或選擇用於原始經轉化細胞中之具有相同功能或生物活性的突變體子代。宿主細胞係可用於生成本發明抗原結合分子之任一類型之細胞系統。宿主細胞包括培養細胞，例如哺乳動物培養細胞，例如CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或雜交瘤細胞、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞(僅舉幾個例子)，且亦包括轉基因動物、轉基因植物或培養植物或動物組織中所包含之細胞。

藥劑之「有效量」係指在投與該藥劑之細胞或組織中產生生理學變化所需之量。

藥劑(例如醫藥組合物)之「治療有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望治療或預防結果之量。舉例而言，治療有效量之藥劑會消除、降低、延遲、最小化或防止疾病之不良效應。

「個體(individual)」或「個體(subject)」係哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及齧齒類動物(例如小鼠及大鼠)。較佳地，個體(individual或subject)係人類。

術語「醫藥組合物」係指如下製劑：其呈允許其中所含活性成份之生物活性有效之形式，且不含對將投與調配物之個體具有不可接受之毒性的其他組份。

「醫藥上可接受之賦形劑」係指醫藥組合物中除活性成份外對個體無毒之成份。醫藥上可接受之賦形劑包括(但不限於)緩衝液、穩定劑或防腐劑。

術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於該等治療產品之使用之警告的資訊。

如本文用「治療(treatment)」(及其語法變化形式，例如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指嘗試改變所治療個體之自然病程之臨床干預，且可出於預防目的或在臨床病理學病程期間實施。治療之期望效應包括(但不限於)預防疾病之發生或復發、減輕症狀、減弱疾病之任何直接或間接病理結果、預防轉移、降低疾病進展之速率、改善或緩和疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明分子用於延遲疾病之發生或減緩疾病之進展。

如本文所用術語「癌症」係指增生性疾病，例如淋巴瘤、淋巴球性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細支氣管肺泡細胞肺癌、骨癌、胰臟癌、皮膚癌、頭或頸癌、表皮或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內膜癌、子宮頸癌、陰道癌、陰戶癌、霍奇金氏病、食管癌、小腸癌、內分泌系統癌症、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎臟或輸尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、間皮瘤、肝細胞癌、膽管癌、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊軸腫瘤、腦幹膠質瘤、多形性神經膠母細胞瘤、星細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤、腦脊髓膜瘤、鱗狀細胞癌、垂體腺瘤及尤文氏肉瘤(Ewings sarcoma)，包括上述癌症中任一者之難治性形式或上述癌症中一或多者之組合。

本發明之抗體

本發明提供新穎抗人類CD19抗體，其具有尤其有利之性質，例如可產生性、穩定性、結合親和力、生物活性、靶向效率及減小的毒性。

在一態樣中，本發明提供具高親和力之抗人類CD19抗體。

在另一態樣中提供特異性結合至人類CD19之抗體，其中該抗體包含(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列，(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列，(d)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列，(e)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列，及(f)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列。

在一態樣中，抗體包含(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列，(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列，(d)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列，(e)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列，及(f)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列，且特異性結合至人類CD19 之親和力高於包含包括SEQ ID NO：113之胺基酸序列的可變重鏈及包括SEQ ID NO：114之胺基酸序列的可變輕鏈之抗體。

在另一態樣中，抗體係單株抗體。在另一態樣中，抗體係人類、人類化或嵌合抗體。在另一態樣中，抗體係人類化抗體。在另一態樣中，抗體係特異性結合至人類CD19之抗體片段。

本發明之另一態樣提供特異性結合至CD19之如本文所揭示抗體。在另一態樣中，如本文所揭示之抗體特異性結合至人類CD19。在另一態樣中，如本文所揭示之抗體特異性結合至食蟹猴CD19。在另一態樣中，如所揭示之抗體具有交叉物種反應性。

在某些態樣中，如本文所揭示之抗CD19抗體具有1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM、10^-8M至10^-13M或10^-9M至10^-13M之平衡解離常數(Kd)。在具體態樣中，如本文所揭示之抗體以1nM或更小之平衡解離常數(Kd)結合至CD19，如藉由表面電漿共振(SPR)所測定。

在本發明之另一態樣中提供如本文所揭示之抗CD19抗體，其解離常數(kd)為10^-2/s、10^-3/s、10^-4/s、10^-5/s、10^-6/s、10^-7/s或10^-8/s、10^-4/s至10^-9/s或10^-5/s至10^-11/s。在具體實施例中，如本文所揭示之抗體特異性結合至CD19且特徵另外在於如藉由表面電漿共振(SPR)所測定10^-4/s或更小之解離常數(kd)。

在另一態樣中提供特異性結合至CD19之抗體，其中該抗體包含與包含包括SEQ ID NO：113之胺基酸序列的可變重鏈及包括SEQ ID NO：114之胺基酸序列的可變輕鏈之抗體相比較少之去胺位點。在另一態樣中提供特異性結合至CD19之抗體，其中該抗體包含與包含包括SEQ ID NO：113之胺基酸序列的可變重鏈及包括SEQ ID NO：114之胺基酸序列的可變輕鏈之抗體相比較少之天冬醯胺殘基。

在另一態樣中提供抗體，其包含相對於包含包括SEQ ID NO：113之胺基酸序列的可變重鏈及包括SEQ ID NO：114之胺基酸序列的可變輕鏈之抗體包含至少一個胺基酸取代的變體可變輕鏈及/或變體可變重鏈，其中至少一個天冬醯胺殘基經取代。在較佳態樣中，至少兩個、至少三個或至少四個天冬醯胺殘基經取代。

在另一態樣中，所提供的是特異性結合至人類CD19之抗體，其中該抗體選自由以下組成之群(i)抗體，其包含包括SEQ ID NO：25之胺基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO：26之胺基酸序列的CDR-L2、包括SEQ ID NO：27之胺基酸序列的CDR-L3、包括SEQ ID NO：28之胺基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO：29之胺基酸序列的CDR-H2，及包括SEQ ID NO：30之胺基酸序列的CDR-H3，(ii)抗體，其包含包括SEQ ID NO：31之胺基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO：32之胺基酸序列的CDR-L2、包括SEQ ID NO：33之胺基酸序列的CDR-L3、包括SEQ ID NO：34之胺基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO：35之胺基酸序列的CDR-H2，及包括SEQ ID NO：36之胺基酸序列的CDR-H3，(iii)抗體，其包含包括SEQ ID NO：37之胺基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO：38之胺基酸序列的CDR-L2、包括SEQ ID NO：39之胺基酸序列的CDR-L3、包括SEQ ID NO：40之胺基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO：41之胺基酸序列的CDR-H2，及包括SEQ ID NO：42之胺基酸序列的CDR-H3，(iv)抗體，其包含包括SEQ ID NO：43之胺基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO：44之胺基酸序列的CDR-L2、包括SEQ ID NO：45之胺基酸序列的CDR-L3、包括SEQ ID NO：46之胺基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO：47之胺基酸序列的CDR-H2，及包括SEQ ID NO：48之胺基酸序列的CDR-H3，(v)抗體，其包含包括SEQ ID NO：49之胺基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO：50之胺基酸序列的CDR-L2、包括SEQ ID NO：51之胺基酸序列的CDR-L3、包括SEQ ID NO：52之胺基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO：53之胺基酸序列的CDR-H2，及包括SEQ ID NO：54之胺基酸序列的CDR-H3，(vi)抗體，其包含包括SEQ ID NO：55之胺基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO：56之胺基酸序列的CDR-L2、包括SEQ ID NO：57之胺基酸序列的CDR-L3、包括SEQ ID NO：58之胺基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO：59之胺基酸序列的CDR-H2，及包括SEQ ID NO：60之胺基酸序列的CDR-H3，及(vii)抗體，其包含包括SEQ ID NO：61之胺基酸序列的CDR-L1、包括SEQ ID NO：62之胺基酸序列的CDR-L2、包括SEQ ID NO：63之胺基酸序列的CDR-L3、包括SEQ ID NO：64之胺基酸序列的CDR-H1、包括SEQ ID NO：65之胺基酸序列的CDR-H2，及包括SEQ ID NO：66之胺基酸序列的CDR-H3。

在另一態樣中提供特異性結合至CD19之抗體，其中該抗體包含(i)包含SEQ ID NO：111之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO：112之胺基酸序列的VL結構域，(ii)包含SEQ ID NO：101之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO：102之胺基酸序列的VL結構域，(iii)包含SEQ ID NO：103之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO：104之胺基酸序列的VL結構域，(iv)包含SEQ ID NO：99之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO：100之胺基酸序列的VL結構域，(v)包含SEQ ID NO：105之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO：106之胺基酸序列的VL結構域，(vi)包含SEQ ID NO：107之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO：108之胺基酸序列的VL結構域，或(vii)包含SEQ ID NO：109之胺基酸序列的VH結構域及包含SEQ ID NO：110之胺基酸序列的VL結構域。

在另一態樣中，如前文所述之抗體包含由能夠穩定締合之第一及第二亞單位構成之Fc結構域。

在另一態樣中，Fc結構域係IgG，具體而言IgG1 Fc結構域或IgG4 Fc結構域。更具體而言，Fc結構域係IgG1 Fc結構域。在具體態樣中，Fc結構域包含促進Fc結構域之第一及第二亞單位締合之修飾。

Fc結構域修飾降低Fc受體結合及/或效應物功能

本發明抗原結合分子之Fc結構域係由包含免疫球蛋白分子之重鏈結構域之多肽鏈對組成。舉例而言，免疫球蛋白G(IgG)分子之Fc結構域係二聚體，其每一亞單位包含CH2及CH3 IgG重鏈恆定結構域。Fc結構域之兩個亞單位能夠彼此穩定締合。

Fc結構域賦予本發明之抗原結合分子有利的藥物動力學性質，包括長血清半衰期(其有助於在標的組織中良好累積)及有利的組織-血液分佈比率。然而，同時，其可導致本發明抗體不期望靶向表現Fc受體之細胞而非具有抗原之較佳細胞。因此，在具體態樣中，本發明抗原結合分子之Fc結構域展現與天然IgG1 Fc結構域相比降低的Fc受體結合親和力及/或降低的效應物功能。在一態樣中，Fc實質上並不與Fc受體結合及/或並不誘導效應物功能。在具體態樣中，Fc受體係Fcγ受體。在一態樣中，Fc受體係人類Fc受體。在特定態樣中，Fc受體係活化人類Fcγ受體、更特定而言係人類FcγRIIIa、FcγRI或FcγRIIa，最特定而言係人類FcγRIIIa。在一態樣中，Fc結構域並不誘導效應物功能。降低的效應物功能可包括(但不限於)以下中之一或多者：降低的補體依賴性細胞毒性(CDC)、降低的抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)、降低的抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、減少的細胞介素分泌、減少的免疫複合物介導之抗原呈遞細胞之抗原攝取、減少的與NK細胞之結合、減少的與巨噬細胞之結合、減少的與單核球之結合、減少的與多形核細胞之結合、降低的誘導細胞凋亡之直接信號傳導、減少的樹突細胞成熟或降低的T細胞引發。

在某些態樣中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，由此生成Fc區變體。Fc區變體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列包含一或多個胺基酸位置之胺基酸修飾(例如取代)。

在具體態樣中，本發明提供抗體，其中Fc結構域包含一或多個減少與 Fc受體、具體而言與Fcγ受體之結合之胺基酸取代。

在一態樣中，本發明抗體之Fc結構域包含一或多個降低Fc結構域對Fc受體之結合親和力及/或效應物功能之胺基酸突變。通常，相同之一或多個胺基酸突變存在於Fc結構域之兩個亞單位中之每一者中。具體而言，Fc結構域包含位置E233、L234、L235、N297、P331及P329(EU編號)之胺基酸取代。具體而言，Fc結構域包含IgG重鏈之位置234及235(EU編號)及/或329(EU編號)之胺基酸取代。更具體而言，提供本發明抗體，其包含在IgG重鏈中具有胺基酸取代L234A、L235A及P329G(「P329G LALA」，EU編號)之Fc結構域。胺基酸取代L234A及L235A係指所謂的LALA突變。胺基酸取代之「P329G LALA」組合幾乎完全消除了人類IgG1 Fc結構域之Fcγ受體結合，且闡述於國際專利申請公開案第WO 2012/130831 A1號中，其亦闡述製備該等突變Fc結構域之方法及測定其性質(例如Fc受體結合或效應物功能)之方法。

具有降低的Fc受體結合及/或效應物功能之Fc結構域包括具有Fc結構域殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代之彼等(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者具有取代之Fc突變體，包括在殘基265及297經丙胺酸取代之所謂的「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。

在另一態樣中，Fc結構域係IgG4 Fc結構域。與IgG1抗體相比，IgG4抗體展現降低的Fc受體結合親和力及降低的效應物功能。在更特定態樣中，Fc結構域係包含位置S228(Kabat編號)之胺基酸取代、具體而言胺基酸取代S228P之IgG4 Fc結構域。在更特定態樣中，Fc結構域係包含胺基酸取代L235E及S228P及P329G(EU編號)之IgG4 Fc結構域。該等IgG4Fc結構域突變體及其Fcγ受體結合性質亦闡述於WO 2012/130831中。

且其中該抗體包含在IgG重鏈中具有胺基酸殘基234A、235A及329G(EU編號)之Fc結構域。

突變Fc結構域可使用業內所熟知之遺傳或化學方法藉由胺基酸缺失、取代、插入或修飾來製備。遺傳方法可包括編碼DNA序列之位點特異性誘變、PCR、基因合成及諸如此類。可例如藉由測序來驗證正確的核苷酸變化。

與Fc受體之結合可容易地藉由例如ELISA或藉由表面電漿共振(SPR)使用標準儀器(例如BIAcore儀器(GE Healthcare))來測定，且Fc受體例如可藉由重組表現來獲得。或者，Fc結構域或包含Fc結構域之細胞活化抗體對Fc受體之結合親和力可使用已知表現具體Fc受體之細胞系(例如表現FcγIIIa受體之人類NK細胞)來評估。

Fc結構域或包含Fc結構域之本發明抗體之效應物功能可藉由業內已知之方法來量測。適用於量測ADCC之分析闡述於本文中。評價所關注分子之ADCC活性之活體外分析的其他實例闡述於美國專利第5,500,362 號；Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)及Hellstrom等人，Proc Natl Acad Sci USA 82,1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號；Bruggemann等人，J Exp Med 166,1351-1361(1987)中。或者，可使用非放射性分析方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTI^TM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)及CytoTox 96^®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。可用於該等分析之效應細胞包括末梢血單核細胞(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在體內評價所關注分子之ADCC活性，例如在動物模型中評價，例如Clynes等人，Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中所揭示之動物模型。

在一些態樣中，Fc結構域與補體組份、特定而言與C1q之結合亦有所減小。因此，在一些其中Fc結構域經改造以具有降低的效應物功能之實施例中，該降低的效應物功能包括降低的CDC。可實施C1q結合分析以確定本發明之雙特異性抗體是否能夠結合C1q且由此具有CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評價補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等人，Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg及Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。

多核苷酸

本發明另外提供編碼如本文所述抗體或其片段之經分離多核苷酸。

編碼本發明抗體之經分離多核苷酸可表示為編碼整個抗原結合分子之單一多核苷酸或表示為多個(例如兩個或更多個)共表現之多核苷酸。由共表現之多核苷酸編碼之多肽可經由例如二硫鍵或其他方式締合以形成功能性抗原結合分子。舉例而言，可藉由來自免疫球蛋白之重鏈部分之單獨多核苷酸來編碼免疫球蛋白之輕鏈部分。在共表現時，重鏈多肽將與輕鏈多肽締合形成免疫球蛋白。

在一些態樣中，經分離多核苷酸編碼如本文所述之整個本發明抗體。在其他實施例中，經分離多核苷酸編碼如本文所述之本發明抗體中所包含之多肽。

在某些實施例中，多核苷酸或核酸係DNA。在其他實施例中，本發明之多核苷酸係例如呈信使RNA(mRNA)形式之RNA。本發明RNA可為單鏈或雙鏈。

重組方法

本發明之抗體可例如藉由固態肽合成(例如Merrifield固相合成)或重組產生來獲得。對於重組產生而言，將一或多個例如如上文所述編碼抗體或其多肽片段之多核苷酸分離並插入一或多個載體中以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該多核苷酸可易於使用習用程序分離並測序。在本發明之一態樣中，提供包含本發明多核苷酸中之一或多者之載體、較佳表現載體。可使用熟習此項技術者所熟知之方法來構築含有抗體(片段)之編碼序列以及適當轉錄/轉譯控制信號之表現載體。該等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/遺傳重組。例如，參見以下文獻中所述之技術：Maniatis等人，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1989)；及Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)。表現載體可為質體、病毒之一部分，或可為核酸片段。表現載體包括表現盒，在該表現盒中，編碼抗體或其多肽片段之多核苷酸(即編碼區)經選殖與啟動子及/或其他轉錄或轉譯控制元件可操作締合。如本文所用「編碼區」係由轉譯成胺基酸之密碼子組成之核酸部分。儘管「終止密碼子」(TAG、TGA或TAA)並不轉譯成胺基酸，但其可視為編碼區之一部分(若存在)，但任何側接序列(例如啟動子、核糖體結合位點、轉錄終止子、內含子、5'及3'非轉譯區及諸如此類)並非編碼區之一部分。兩個或更多個編碼區可存在於單一多核苷酸構築體中(例如位於單一載體上)或單獨多核苷酸構築體中(例如位於單獨(不同)載體上)。另外，任一載體皆可含有單一編碼區，或可包含兩個或更多個編碼區，例如，本發明載體可編碼一或多個多肽，該一或多個多肽以後轉譯或共轉譯方式經由蛋白水解性裂解分離成最終蛋白質。此外，本發明之載體、多核苷酸或核酸可編碼異源編碼區，該等異源編碼區與編碼本發明抗體或其多肽片段或其變體或衍生物之多核苷酸融合或不融合。異源編碼區包括(但不限於)指定元件或基序，例如分泌信號肽或異源功能結構域。可操作締合係如下情形：以使基因產物之表現處於調控序列之影響或控制下之方式，使用於基因產物(例如多肽)之編碼區與一或多個調控序列締合。兩個DNA片段(例如多肽編碼區及與其締合之啟動子)在以下情形下為「可操作地締合」：誘導啟動子功能會引起編碼期望基因產物之mRNA轉錄，且兩個DNA片段之間連接之性質並不干擾表現調控序列引導基因產物表現之能力或干擾DNA模板轉錄之能力。因此，若啟動子能夠實現編碼多肽之核酸之轉錄，則啟動子區域與該核酸可操作地締合。啟動子可為僅在預定細胞中引導DNA之實質性轉錄之細胞特異性啟動子。除啟動子外，其他轉錄控制元件(例如增強子、操縱子、抑制子及轉錄終止信號)可與多核苷酸可操作地締合以引導細胞特異性轉錄。

適宜啟動子及其他轉錄控制區揭示於本文中。各種轉錄控制區已為熟習此項技術者已知。該等轉錄控制區包括(但不限於)在脊椎動物細胞中發揮作用之轉錄控制區，例如(但不限於)來自巨細胞病毒(例如立即早期啟動子，與內含子-A聯結)、猿猴病毒40(例如早期啟動子)及反轉錄病毒(例如Rous肉瘤病毒)之啟動子及增強子區段。其他轉錄控制區包括源自脊椎動物基因之彼等(例如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素及兔β-球蛋白)以及能夠控制真核細胞中之基因表現之其他序列。其他適宜轉錄控制區包括組織特異性啟動子及增強子以及誘導型啟動子(例如四環素誘導型啟動子)。類似地，各種轉譯控制元件已為熟習此項技術者已知。該等轉譯控制元件包括(但不限於)核糖體結合位點、轉譯起始及終止密碼子及源自病毒系統之元件(尤其內部核糖體進入位點或IRES，亦稱為CITE序列)。表現盒亦可包括其他特徵，例如複製起點及/或染色體整合元件(例如反轉錄病毒長末端重複(LTR)或腺相關病毒(AAV)反轉末端重複(ITR))。

本發明之多核苷酸及核酸編碼區可與編碼分泌或信號肽之其他編碼區締合，該等分泌或信號肽引導由本發明多核苷酸編碼之多肽之分泌。舉例而言，若抗體或其多肽片段之分泌係期望的，則可將編碼信號序列之DNA置於編碼本發明抗體或其多肽片段之核酸上游。根據信號假說，由哺乳動物細胞分泌之蛋白質具有信號肽或分泌前導序列，一旦開始在粗糙內質網中輸出生長蛋白鏈，該信號肽或分泌前導序列即自成熟蛋白質發生裂解。熟習此項技術者應瞭解，由脊椎動物細胞分泌之多肽通常具有融合至多肽之N末端之信號肽，該信號肽自轉譯之多肽發生裂解而產生分泌或「成熟」形式之多肽。在某些實施例中，使用天然信號肽(例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽)，或使用保留引導可操作地與該序列締合之多肽之分泌能力之該序列的功能衍生物。或者，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。舉例而言，野生型前導序列可經人類組織纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸苷酶之前導序列取代。

在編碼本發明抗體或其多肽片段之多核苷酸內部或末端可包括編碼短蛋白質序列之DNA，該短蛋白質序列可用於促進後續純化(例如組胺酸標籤)或幫助標記融合蛋白。

在本發明之另一態樣中，提供包含一或多個本發明多核苷酸之宿主細胞。在某些實施例中，提供包含一或多個本發明載體之宿主細胞。多核苷酸及載體可單獨或組合納入本文分別針對多核苷酸及載體所述之任一特徵。在一態樣中，宿主細胞包含(例如已經轉化或轉染有)包括編碼本發明抗體(之一部分)之多核苷酸之載體。如本文所用術語「宿主細胞」係指可經改造以生成本發明之融合蛋白或其片段之任一類細胞系統。適於複製抗原結合分子且支持其表現之宿主細胞已為業內所熟知。該等細胞可視需要經具體表現載體轉染或轉導，且可使大量含有載體之細胞生長用於大規模發酵罐接種以獲得足量抗原結合分子用於臨床應用。適宜宿主細胞包括原核微生物(例如大腸桿菌)或各種真核細胞(例如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞或諸如此類)。舉例而言，多肽可在細菌中產生，尤其在不需要醣基化時。在表現後，多肽可以可溶性部分形式自細菌細胞團分離且可進一步純化。除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母)適用於編碼多肽之載體之選殖或表現宿主，包括醣基化路徑已經「人類化」以產生具有部分或完全人類醣基化模式之多肽的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004)及Li等人，Nat Biotech 24,210-215(2006)。

適用於表現(醣基化)多肽之宿主細胞亦源自多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出多種桿狀病毒株可與昆蟲細胞聯合使用，具體而言用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。亦可利用植物細胞培養物作為宿主。例如，參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述用於在轉基因植物中產生抗體之PLANTIBODIES^TM技術)。亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。舉例而言，可使用適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係經SV40轉化之猴腎CV1細胞系(COS-7)、人類胚腎細胞系(293或293T細胞，如例如Graham等人，J Gen Virol 36,59(1977)中所述)、幼倉鼠腎細胞(BHK)、小鼠支持細胞(TM4細胞，如例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中所述)、猴腎細胞(CV1)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76)、人類宮頸癌細胞(HELA)、犬腎細胞(MDCK)、水牛鼠(buffalo rat)肝細胞(BRL 3A)、人類肺細胞(W138)、人類肝細胞(Hep G2)、小鼠乳房腫瘤細胞(MMT 060562)、TRI細胞(如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中所闡述)、MRC 5細胞及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括dhfr-CHO細胞(Urlaub等人，Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，例如YO、NS0、P3X63及Sp2/0。關於適於蛋白質產生之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，參見例如Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。宿主細胞包括培養細胞(僅舉幾個為例，例如哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆蟲細胞、細菌細胞及植物細胞)，但亦包括轉基因動物、轉基因植物或培養植物或動物組織內所包含之細胞。在一實施例中，宿主細胞係真核細胞、較佳哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類胚胎腎(HEK)細胞或淋巴細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。業內已知在該等系統中表現外源基因之標準技術。表現包含免疫球蛋白之重鏈或輕鏈之多肽之細胞可經改造以亦表現其他免疫球蛋白鏈，使得表現產物係具有重鏈及輕鏈二者之免疫球蛋白。

在一態樣中提供產生本發明抗體或其多肽片段之方法，其中該方法包含在適於表現本發明抗體或其多肽片段之條件下培養包含編碼本發明抗體或其多肽片段之多核苷酸之宿主細胞，如本文所提供，及自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收本發明抗體或其多肽片段。

在某些實施例中，能夠特異性結合至標的細胞抗原(例如Fab片段)從而形成抗原結合分子之一部分的部分包含能夠結合至抗原之至少免疫球蛋白可變區。可變區可形成天然或非天然抗體及其片段之一部分並源自該等天然或非天然抗體及其片段。產生多株抗體及單株抗體之方法已為業內所熟知(例如，參見Harlow及Lane，「Antibodies,a laboratory manual」,Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。非天然抗體可使用固相肽合成來構築，可以重組方式產生(例如，如美國專利第4,186,567號中所述)或可例如藉由篩選包含可變重鏈及可變輕鏈之組合文庫來獲得(例如，參見頒予McCafferty之美國專利第5,969,108號)。

免疫球蛋白之任一動物物種可用於本發明中。可用於本發明中之非限制免疫球蛋白可為鼠類、靈長類動物或人類來源。若融合蛋白意欲用於人類應用，則可使用嵌合形式之免疫球蛋白，其中免疫球蛋白之恆定區來自人類。人類化或全人類形式之免疫球蛋白亦可根據業內所熟知之方法來製備(例如，參見頒予Winter之美國專利第5,565,332號)。人類化可藉由各種方法來達成，包括(但不限於)(a)將非人類(例如供體抗體)CDR接枝至保留或不保留關鍵框架殘基之人類(例如接受者抗體)框架及恆定區上(例如，對於保留良好抗原結合親和力或抗體功能至關重要之彼等)，(b)僅將非人類特異性決定區(SDR或a-CDR；對於抗體-抗原相互作用較為關鍵之殘基)接枝至人類框架及恆定區上，或(c)移植整個非人類可變結構域，但使用人類樣部分藉由替代表面殘基將其「覆蓋」。人類化抗體及其製備方法綜述於例如Almagro及Fransson，Front Biosci 13,1619-1633(2008)中，且進一步闡述於例如以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332,323-329(1988)；Queen等人，Proc Natl Acad Sci USA 86,10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Jones等人，Nature 321,522-525(1986)；Morrison等人，Proc Natl Acad Sci 81,6851-6855(1984)；Morrison及Oi,Adv Immunol 44,65-92(1988)；Verhoeyen等人，Science 239,1534-1536(1988)；Padlan,Molec Immun 31(3),169-217(1994)；Kashmiri等人，Methods 36,25-34(2005)(闡述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan,Mol Immunol 28,489-498(1991)(闡述「表面重修」)；Dall’Acqua等人，Methods 36,43-60(2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36,61-68(2005)及Klimka等人，Br J Cancer 83,252-260(2000)(闡述FR改組之「引導選擇」方式)。本發明之具體免疫球蛋白係人類免疫球蛋白。可使用業內已知之各種技術來產生人類抗體及人類可變區。人類抗體概述於van Dijk及van de Winkel，Curr Opin Pharmacol 5,368-74(2001)及Lonberg,Curr Opin Immunol 20,450-459(2008)中。人類可變區可形成藉由雜交瘤方法製得之人類單株抗體之一部分並源自該等人類單株抗體(例如，參見Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987))。人類抗體及人類可變區亦可藉由以下方式來製備：將免疫原投與已經修飾而因應抗原激發產生具有人類可變區之完整人類抗體或完整抗體之轉基因動物(例如，參見Lonberg,Nat Biotech 23,1117-1125(2005))。人類抗體及人類可變區亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變區序列來生成(例如，參見Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178,1-37(O’Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)；及McCafferty等人，Nature 348,552-554；Clackson等人，Nature 352,624-628(1991))。噬菌體通常展示呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段之抗體片段。

在某些態樣中，根據例如PCT公開案WO 2012/020006(參見關於親和力成熟之實例)或美國專利申請公開案第2004/0132066號中所揭示之方法改造抗體以具有增強的結合親和力。本發明之抗原結合分子結合至特異性抗原決定子之能力可經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者所熟悉之其他技術(例如表面電漿共振技術(Liljeblad等人，Glyco J 17,323-329(2000)))及傳統結合分析(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))來量測。可使用競爭分析來鑑別與參考抗體競爭結合至具體抗原之抗原結合分子。在某些實施例中，該競爭性抗原結合分子結合至由參考抗原結合分子結合之相同表位(例如線性或構象表位)。映射抗原結合分子所結合表位之詳細實例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。在實例性競爭分析中，在包含結合至抗原之第一經標記抗原結合分子及第二未經標記抗原結合分子之溶液中培育固定抗原，其中測試該第二未經標記抗原結合分子與該第一抗原結合分子競爭結合至該抗原之能力。第二抗原結合分子可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗原結合分子但不包含第二未經標記抗原結合分子之溶液中培育固定抗原。在允許第一抗體結合至抗原之條件下培育後，移除過量未結合抗體，且量測與固定抗原締合之標記的量。若在測試樣品中與固定抗原締合之標記之量相對於對照樣品實質上減少，則此指示第二抗原結合分子與第一抗原結合分子競爭結合至抗原。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。

如本文所述製備之本發明抗體可藉由業內已知之技術來純化，例如高效液相層析、離子交換層析、凝膠電泳、親和層析、粒徑篩析層析及諸如此類。用於純化具體蛋白質之實際條件將部分地取決於諸如淨電荷、疏水性、親水性等因素，且為熟習此項技術者所明瞭。對於親和層析純化而言，可使用含TNF配體三聚體之抗原結合分子所結合之抗體、配體、受體或抗原。舉例而言，對於本發明融合蛋白之親和層析純化而言，可使用具有蛋白質A或蛋白質G之基質。可基本上如實例中所述連續使用蛋白質A或G親和層析及粒徑篩析層析來分離抗原結合分子。可藉由各種熟知分析方法中之任一者來測定含TNF配體三聚體之抗原結合分子或其片段之純度，包括凝膠電泳、高壓液相層析及諸如此類。舉例而言，如實例中所述表現之抗原結合分子顯示為完整蛋白質且經適當組裝，如藉由還原及非還原SDS-PAGE所展示。

分析

可藉由業內已知之各種分析來鑑別本文所提供之抗原結合分子、篩選或表徵其物理/化學性質及/或生物活性。

1.親和力分析

抗原結合分子對標的細胞抗原之親和力亦可藉由表面電漿共振(SPR)、使用標準儀器(例如BIAcore儀器(GE Healthcare))來測定，且受體或靶蛋白例如可藉由重組表現來獲得。用於量測結合親和力之特定說明性及實例性實施例闡述於實例4中。根據一態樣，K_D係在25℃下藉由表面電漿共振使用BIACORE® T100機器(GE Healthcare)來量測。

2.結合分析及其他分析

在一態樣中，例如，藉由已知方法(例如ELISA或西方墨點(Western blot))測試如本文所報告抗體之抗原結合活性。

3.活性分析

在一態樣中，提供分析以鑑別具有生物活性之抗人類CD19抗體。生物活性可包括例如抑制B細胞增殖或殺死B細胞。亦提供在活體內及/或活體外具有該生物活性之抗體。

在某些實施例中，測試如本文所報告抗體之該生物活性。

醫藥組合物、調配物及投與途徑

在另一態樣中，本發明提供包含本文所提供之任一抗體之醫藥組合物，其例如用於下述治療方法中之任一者中。在一實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之抗體及至少一種醫藥上可接受之賦形劑。在另一實施例中，醫藥組合物包含本文所提供之抗體及至少一種其他治療劑，例如如下文所述。

本發明之醫藥組合物包含治療有效量之一或多種溶解或分散於醫藥上可接受之賦形劑中之抗體。片語「醫藥或藥理學上可接受」係指如下分子實體及組合物：在視需要投與諸如人類等動物時，在所用劑量及濃度下通常對接受者無毒，即並不產生不良、過敏或其他不適反應。熟習此項技術者根據本揭示內容已知含有至少一種抗體及視情況另一活性成份之醫藥組合物之製備，如藉由Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990(以引用方式併入本文中)所例示。具體而言，組合物係凍乾調配物或水溶液。如本文所用「醫藥上可接受之賦形劑」包括任何及所有溶劑、緩衝液、分散介質、包衣、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(例如，抗細菌劑、抗真菌劑)、等滲劑、鹽、穩定劑及其組合，如熟習此項技術者已知。

非經腸組合物包括經設計用於藉由注射(例如皮下、皮內、病灶內、靜脈內、動脈內、肌內、鞘內或腹膜內注射)投與之彼等。對於注射而言，可將本發明之抗原結合分子調配於水溶液、較佳生理上相容之緩衝液(例如漢克氏溶液(Hank's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理緩衝鹽水)中。該溶液可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑等調配劑。或者，融合蛋白可呈粉末形式，以便在使用之前使用適宜媒劑(例如無菌無致熱源水)構造。藉由將所需量之本發明融合蛋白與(視需要)下文列示之各種其他成份一起納入適當溶劑中來製備無菌可注射溶液。無菌性可容易地例如經由無菌過濾膜過濾來實現。通常，分散液係藉由將各種經滅菌活性成份納入含有基本分散介質及/或其他成份之無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液、懸浮液或乳液之無菌粉末之情形下，較佳製備方法為真空乾燥或冷凍乾燥技術，其自先前經滅菌過濾之液體介質產生活性成份及任何其他期望成份之粉末。液體介質視需要應經適當緩衝且液體稀釋劑首先在注射之前使用足夠鹽水或葡萄糖調節為等滲。組合物在製造及儲存條件下必須穩定，且必須防止受到諸如細菌及真菌等微生物之污染作用。應瞭解，內毒素污染應保持最小在安全量，例如小於0.5ng/mg蛋白質。適宜醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)：緩衝液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；氯苄烷銨；氯化本索寧(benzethonium chloride)；苯酚；丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽相對離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液黏度之化合物，例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、葡聚糖或諸如此類。視情況，該懸浮液亦可含有適宜穩定劑或增加該等化合物之溶解度之試劑以容許製備高濃度溶液。另外，該等活性化合物之懸浮液可製備成適宜的油性注射懸浮液。適宜親脂性溶劑或媒劑包括脂肪油(例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或三酸甘油酯)或脂質體。

活性成份可分別裝入藉由例如凝聚技術或藉由介面聚合製備之微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或粗滴乳液中。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，Mack Printing Company,1990)。可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有多肽之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成型物品之形式，例如膜或微膠囊。在具體實施例中，可藉由在組合物中使用延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁、明膠或其組合)來延長可注射組合物之吸收。

本文之實例性醫藥上可接受之賦形劑進一步包括間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20透明質酸酶醣蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX®,Baxter International,Inc.)。某些實例性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一態樣中，將sHASEGP與一或多種其他糖胺聚醣酶(例如軟骨素酶)組合。

實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括闡述於美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中之彼等，後一些調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。

除先前所述之組合物外，融合蛋白亦可調配為儲積製劑形式。可藉由植入(例如經皮下或經肌內)或藉由肌內注射投與該等長效調配物。因此，舉例而言，可使用適宜聚合或疏水性材料(例如調配為可接受油中之乳液)或離子交換樹脂來調配融合蛋白，或調配為難溶性衍生物，例如調配為難溶性鹽。

可藉助習用混合、溶解、乳化、囊封、包埋或凍乾製程來製造包含本發明融合蛋白之醫藥組合物。醫藥組合物可以習用方式使用一或多種生理上可接受且有利於將蛋白質處理成可用於醫藥之製劑的載劑、稀釋劑、賦形劑或助劑來調配。適宜調配物端視所選投與途徑而定。

可將本發明抗體調配成呈游離酸或鹼、中性或鹽形式之組合物。醫藥上可接受之鹽係實質上保留游離酸或鹼之生物活性之鹽。該等鹽包括酸加成鹽，例如使用蛋白質性組合物之游離胺基形成之彼等，或使用無機酸(例如鹽酸或磷酸)或有機酸(例如乙酸、草酸、酒石酸或苦杏仁酸)形成者。使用游離羧基形成之鹽亦可源自諸如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵等無機鹼或諸如異丙胺、三甲胺、組胺酸或普魯卡因(procaine)等有機鹼。醫藥鹽往往比相應游離鹼形式更可溶於水性及其他質子溶劑。

本文之組合物亦可視需要含有一種以上用於所治療之具體適應症之活性成份，較佳為具有彼此不會產生不良影響之補充活性之彼等。該等活性成份適宜地以可有效地用於預期目的之量以組合形式存在。

欲用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可容易地例如經由無菌過濾膜過濾來實現。

治療方法及組合物

本文所提供之任一抗人類CD19抗體可作為單特異性抗體或作為多特異性抗體單獨或以組合形式用於治療方法中。

CD19在大多數B細胞(泛B細胞標記物)上表現，幹細胞及漿細胞除外，且通常在大多數人類B細胞惡性病(腫瘤相關抗原)(例如淋巴瘤及白血病，多發性骨髓瘤除外，例如非霍奇金氏淋巴瘤及急性淋巴母細胞性白血病)上表現。

識別不同細胞群上之兩種細胞表面蛋白質之雙特異性抗體保持重定向細胞毒性免疫細胞以破壞病原性標的細胞之能力。

在一態樣中提供抗人類CD19抗體用作藥劑。在其他態樣中提供抗人類CD19抗體用於治療B細胞癌。在某些實施例中，提供抗人類CD19抗體用於治療方法中。在某些實施例中，本文提供抗人類CD19抗體用於治療患有B細胞癌之個體之方法中，該方法包含向個體投與有效量之抗人類CD19抗體。在一個該實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑。在其他實施例中，本文提供抗人類CD19抗體用於消耗B細胞。在某些實施例中，本文提供抗人類CD19抗體用於消耗個體之B細胞之方法中，該方法包含向個體投與有效量之抗人類CD19抗體來消耗B細胞。上述實施例中任一者之「個體」較佳係人類。在一實施例中，B細胞癌係B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。在一實施例中，B細胞癌係非霍奇金氏淋巴瘤或急性淋巴母細胞性白血病。

在其他態樣中提供抗人類CD19抗體用於癌症免疫療法。在某些實施例中提供抗人類CD19抗體用於癌症免疫療法之方法中。上述實施例中任一者之「個體」較佳係人類。

在另一態樣中，本文提供抗人類CD19抗體在製造或製備藥劑中之用途。在一實施例中，藥劑用於治療B細胞癌。在另一實施例中，藥劑用於治療B細胞癌之方法中，該方法包含向患有B細胞癌之個體投與有效量之藥劑。在一該實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑，例如如下文所述。在另一實施例中，藥劑用於消耗B細胞。在另一實施例中，藥劑用於消耗個體之B細胞之方法中，該方法包含向個體投與有效量之藥劑來消耗B細胞。上述實施例中任一者之「個體」可為人類。在一實施例中，B細胞癌係B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。在一實施例中，B細胞癌係非霍奇金氏淋巴瘤或急性淋巴母細胞性白血病。

在另一態樣中，本文提供治療B細胞癌之方法。在一實施例中，該方法包含向患有該B細胞癌之個體投與有效量之抗人類CD19抗體。在一該實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種其他治療劑，如下文所述。上述實施例中任一者之「個體」可為人類。在一實施例中，B細胞癌係B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。在一實施例中，B細胞癌係非霍奇金氏淋巴瘤或急性淋巴母細胞性白血病。

在另一態樣中，本文提供消耗個體之B細胞之方法。在一實施例中，該方法包含向個體投與有效量之抗人類CD19抗體來消耗B細胞。在一實施例中，「個體」係人類。在一實施例中，B細胞癌係B細胞淋巴瘤或B細胞白血病。在一實施例中，B細胞癌係非霍奇金氏淋巴瘤或急性淋巴母細胞性白血病。

在另一態樣中，本文提供包含如本文所報告之任一抗人類CD19抗體之醫藥調配物，其例如用於上述治療方法中之任一者中。在一實施例中，醫藥調配物包含如本文所報告之任一抗人類CD19抗體及醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含如本文所報告之任一抗人類CD19抗體及至少一種其他治療劑。

如本文所報告之抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。例如，如本文所報告之抗體可與至少一種其他治療劑共投與。

上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於同一或單獨調配物中)及單獨投與(在該情形下，可在投與一或多種其他治療劑之前、同時及/或之後投與如本文所報告之抗體)。在一實施例中，抗人類CD19抗體之投與及另一治療劑之投與彼此發生於約一個月內或約一週、兩週或三週內或約一天、兩天、三天、四天、五天或六天內。

如本文所報告之抗體(及任一其他治療劑)可藉由任何適宜方式來投與，包括非經腸、肺內及鼻內以及(若期望用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑(例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射)來投藥，此部分端視投與係簡短抑或長期而定。本文涵蓋多種投藥方案，包括(但不限於)在各個時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。

如本文所報告之抗體將以與良好醫療實踐一致之方式調配、投藥及投與。在此上下文中需考慮之因素包括所治療之具體病症、所治療之具體哺乳動物、個體患者之臨床病況、病因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與時間表及從業醫師所知之其他因素。抗體無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於調配物中所存在抗體之量、病症或治療之類型以及上文所論述之其他因素。該等藥劑通常係以相同劑量且以如本文所述之投與途徑或本文所述劑量之約1%至99%或以任一劑量及藉由在經驗上/臨床上確定為適當之任一途徑來使用。

對於疾病之預防或治療而言，如本文所報告之抗體之適當劑量(當單獨使用或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將端視欲治療疾病之類型、抗體之類型、疾病之嚴重程度及病程、投與抗體係用於預防目的抑或治療目的、先前療法、患者之臨床病史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。將抗體適宜地一次性或經一系列治療投與患者。端視疾病之類型及嚴重程度，不論例如係藉由一或多次分開投與抑或藉由連續輸注來投與，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.5mg/kg至10mg/kg)抗體可為投與患者之初始候選劑量。端視上文所提及之因素，一個典型日劑量可介於約1μg/kg至100mg/kg範圍內或更高。對於經若干天或更長時間重複投與而言，端視病況，治療通常將持續至出現對疾病症狀之期望抑制為止。抗體之一個實例性劑量將介於約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。因此，可向患者投與一或多個約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任一組合)之劑量。該等劑量可間歇性投與，例如每週或每三週(例如，應使得患者接受約二至約二十或例如約六個劑量之抗體)。可在投與初始較高負荷劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展容易地藉由習用技術及分析來監測。

本文進一步提供治療發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、狼瘡、牛皮癬及骨病之方法，其包含向經診斷患有該疾病(且因此需要該療法)之患者投與如本文所報告特異性結合至人類CD19之抗體。抗體可單獨、於醫藥組合物中或者與其他藥劑組合投與來治療發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、狼瘡、牛皮癬或骨病。抗體係以醫藥有效量來投與。

本文進一步提供如本文所報告抗體之用途，其用於治療發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、狼瘡、牛皮癬或骨病，且用於製造包含如本文所報告抗體之醫藥組合物。另外，本文提供製造包含如本文所報告抗體之醫藥組合物之方法。

本文進一步提供如本文所報告抗體用於治療發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、狼瘡、牛皮癬或骨病。

本文進一步提供如本文所報告抗體之用途，其用於製造用來治療發炎性疾病、自體免疫疾病、類風濕性關節炎、狼瘡、牛皮癬或骨病之醫藥組合物。抗體係以醫藥有效量來使用。

應理解，可使用如本文所報告之免疫偶聯物替代抗人類CD19抗體或與抗人類CD19抗體一起來實施任一上述調配物或治療方法。

其他藥劑及治療

本發明之抗原結合分子可與一或多種其他藥劑組合投與療法中。例如，本發明之抗原結合分子可與至少一種其他治療劑共投與。術語「治療劑」涵蓋經投與以治療需要該治療之個體之症狀或疾病之任一藥劑。該其他治療劑可包含適用於所治療之具體適應症之任何活性成份，較佳係具有不會不利地彼此影響之互補活性之彼等。在某些實施例中，其他治療劑係另一抗癌劑。

該等其他藥劑適於以對預期目的有效之量以組合形式存在。該等其他藥劑之有效量端視所用抗原結合分子之量、病症或治療之類型及上文所論述之其他因素而定。抗原結合分子通常係以相同劑量且以如本文所述之投與途徑或本文所述劑量之約1%至99%或以任一劑量及藉由經驗/臨床上確定為適當之任一途徑來使用。

上述該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括於同一或單獨組合物中)及單獨投與(在該情形下，可在投與其他治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投與本發明之抗原結合分子)。

製品

在本發明之另一態樣中，提供含有可用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。該製品包含容器及位於該容器上或與該容器締合之標記或包裝插頁。適宜容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可自諸如玻璃或塑膠等眾多種材料形成。容器裝有自身或與另一組合物組合用於有效地治療、預防及/或診斷病況之組合物，且可具有無菌存取埠(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑係本發明之含TNF配體三聚體之抗原結合分子。

標記或包裝插頁指示組合物用於治療所選病況。另外，製品可包含(a)含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗原結合分子；及(b)含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療具體病況之包裝插頁。

或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，該容器包含醫藥上可接受之緩衝液，例如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者角度來看合意之其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。

關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊在以下文獻中給出：Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。抗體鏈之胺基酸係根據如上文所定義之Kabat之編號系統編號並提及(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。

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實例

以下係本發明方法及組合物之實例。應理解，鑒於上文所提供之一般描述可實踐各種其他實施例。

重組DNA技術

使用標準方法來操縱DNA，如Sambrook等人，A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989中所述。根據製造商之說明書來使用分子生物學試劑。關於人類免疫球蛋白輕鏈及重鏈之核苷酸序列之一般資訊在以下文獻中給出：Kabat,E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH公開案第91-3242號。

DNA測序

藉由雙鏈測序來測定DNA序列。

基因合成

期望基因區段係藉由PCR使用適當模板來生成，或藉由Geneart AG(Regensburg,Germany)自合成寡核苷酸及PCR產物藉由自動基因合成來合成。在沒有精確基因序列可用之情形下，基於來自最近同源物之序列來設計寡核苷酸引子，且藉由RT-PCR自源自適當組織之RNA分離基因。將側接有獨特限制性內切酶裂解位點之基因區段選殖至標準選殖/測序載體中。自經轉化細菌純化質體DNA並藉由UV光譜測定濃度。藉由DNA測序來確認亞選殖基因片段之DNA序列。使用適宜限制性位點來設計基因區段以容許亞選殖至各別表現載體中。所有構築體經設計具有編碼前導肽之5’端DNA序列，該前導肽用於靶向真核細胞中進行分泌之蛋白質。

細胞培養技術

使用如以下文獻中所述之標準細胞培養技術：Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.、Dasso,M.、Harford,J.B.、Lippincott-Schwartz,J.及Yamada,K.M.(編輯),John Wiley & Sons,Inc。

蛋白質純化

參照標準方案自經過濾細胞培養上清液純化蛋白質。簡言之，將抗體施加至蛋白質A Sepharose管柱(GE healthcare)並用PBS洗滌。在pH 2.8下達成抗體之溶析，之後立即中和樣品。在PBS中或在20mM組胺酸、150mM NaCl(pH 6.0)中藉由粒徑篩析層析(Superdex 200,GE Healthcare)將聚集蛋白質與單體抗體分離。彙集單體抗體部分，使用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30 MWCO)離心濃縮器濃縮(若需要)，冷凍並儲存在-20℃ 或-80℃下。一部分樣品隨後用於藉由例如SDS-PAGE、粒徑篩析層析(SEC)或質譜進行蛋白質分析及分析型表徵。

SDS-PAGE

根據製造商之說明書使用NuPAGE® Pre-Cast凝膠系統(Invitrogen)。具體而言，使用10%或4%-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast凝膠(pH 6.4)及NuPAGE® MES(還原凝膠，含有NuPAGE®抗氧化劑運行緩衝液添加劑)或MOPS(非還原凝膠)運行緩衝液。

分析型粒徑篩析層析

用於測定抗體之聚集及寡聚狀態之粒徑篩析層析(SEC)係藉由HPLC層析來實施。簡言之，將蛋白質A純化之抗體施加至Agilent HPLC 1100系統上之Tosoh TSKgel G3000SW管柱之300mM NaCl、50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄(pH 7.5)中，或施加至Dionex HPLC系統上之Superdex 200管柱(GE Healthcare)之2×PBS中。藉由UV吸光度及峰面積積分來量化所溶析蛋白質。BioRad凝膠過濾標準品151-1901係用作標準品。

使用表面電漿共振(SPR)(BIACORE)測定抗體與各別抗原之結合及結合親和力

藉由表面電漿共振使用BIACORE儀器(GE Healthcare Biosciences AB,Uppsala,Sweden)研究所生成抗體與各別抗原之結合。簡言之，對於親和力量測，經由胺偶合將山羊抗人類IgG(JIR 109-005-098抗體)固定在CM5晶片上以呈現針對各別抗原之抗體。在25℃(或者在37℃下)在HBS緩衝液(HBS-P(10mM HEPES、150mM NaCl、0.005% Tween 20，pH 7.4)中量測結合。在溶液中添加不同濃度之抗原(R&D Systems或經內部純化)。藉由80秒至3分鐘之抗原注射來量測締合；藉由用HBS緩衝液將晶片表面洗滌3-10分鐘來量測解離，且使用1：1 Langmuir結合模型來估計KD值。自樣品曲線減去陰性對照數據(例如緩衝液曲線)以校正系統固有基線漂移及減少雜訊。使用各別Biacore評估軟體來分析感測圖並計算親和力數據。

實例1 用於噬菌體展示運動之抗原Fc融合物之製備、純化及表徵

為表現及純化呈單體狀態之人類及食蟹猴CD19胞外結構域(表1)，將各別DNA片段融合至含有「凸起」突變之人類IgG1 Fc基因區段(人類：SEQ ID NO：4；食蟹猴：SEQ ID NO：7)，且用「Fc孔洞」(SEQ ID NO：3)對應體轉染(Merchant等人(1998)Nat Biotechnol 16,677-681)。在抗原胞外結構域與Fc凸起鏈之間引入IgA裂解位點(PTPPTP)。在抗原-Fc凸起鏈之C末端引入定向生物素化之Avi標籤，且在Fc孔洞中引入突變H435R及Y436F用於純化目的(Jendeberg L.等人，J.Immunological methods,1997)。含有S354C/T366W突變之抗原-Fc凸起鏈(人類：SEQ ID NO：6；食蟹猴：SEQ ID NO：8)與含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突變之Fc孔洞鏈(SEQ ID NO：5)之組合容許生成異二聚Fc融合片段，其包括單拷貝之CD19胞外結構域。表2列示抗原Fc融合構築體之cDNA及胺基酸序列。

為產生單體抗原/Fc融合分子，用編碼融合蛋白之兩種組份(凸起及孔洞鏈)之兩種質體使用標準方法共轉染呈指數生長之懸浮CHO細胞。

自細胞培養上清液使用蛋白質A藉由親和層析、然後藉由粒徑篩析層析來純化所分泌蛋白質。對於親和層析，將上清液裝載於經磷酸鈉(20mM)、檸檬酸鈉(20mM)、0.5M氯化鈉緩衝液(pH 7.5)平衡之MabSelect Sure(管柱體積(CV)=5-15mL，來自GE Healthcare之樹脂)上。藉由用至少6管柱體積之相同緩衝液洗滌來移除未結合之蛋白質。使用線性梯度來溶析所結合蛋白質；步驟1，10CV，0至60%溶析緩衝液(20mM檸檬酸鈉、500mM氯化鈉緩衝液(pH 2.5))；步驟2，2CV，60%至100%溶析緩衝液。對於線性梯度，用100%溶析緩衝液再施加2管柱體積階段溶析。

藉由添加1/40(v/v)之2M Tris(pH8.0)來調節所收集部分之pH。將蛋白質濃縮且過濾，然後裝載於經2mM MOPS、150mM氯化鈉、0.02%(w/v)疊氮化鈉溶液(pH 7.4)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。

表3匯總單體人類及食蟹猴CD19 Fc(kih)融合蛋白之產量及最終單體含量。

根據製造商之說明書使用BirA生物素-蛋白質聯接酶標準反應套組(Avidity，目錄號BirA500)將經純化抗原之一部分在活體外生物素化。含人類CD19之融合物之生物素化程度為94%，各別食蟹猴CD19構築體之生物素化程度為100%。然後使用生物素化蛋白質來選擇、篩選及表徵不含去醯胺化熱點N27d及N28之親和力成熟8B8源純系。

實例2 親和力成熟CD19特異性抗體之選擇

位於人類化純系8B8之輕鏈之CDR1中之位置27d及28之天冬醯胺殘基的去醯胺化(闡述於WO 2011/147834中)可顯著降低生物活性。因此，生成2個噬菌體展示文庫，其中a)消除位置27d及28之天冬醯胺殘基二者，及b)重鏈及輕鏈之其他CDR隨機化以選擇具有經改良親和力之8B8變體。

2.1不含LCDR1熱點之8B8親和力成熟文庫之生成

不含位於LCDR1中之去醯胺化位點N27d及N28之親和力成熟8B8源抗體之生成係藉由噬菌體展示使用標準方案來實施(Silacci等人，2005)。在第一步驟中，將人類化親代純系8B8之VL及VH DNA序列(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)選殖至噬菌粒中，然後使用該噬菌粒作為隨機化之模板。在下一步驟中，藉由噬菌體展示生成兩個文庫以選擇有利純系。為消除上文所提及之熱點位置，將僅容許位置27d及28之胺基酸S T Q E之LCDR1隨機化引子(SEQ ID NO：11)用於兩個文庫。將成熟文庫1之輕鏈及重鏈二者之CDR1及2隨機化，同時將成熟文庫2之輕鏈CDR1及3以及重鏈CDR3隨機化。各別CDR區中之隨機化位置顯示於圖1中。為生成成熟文庫1，隨機化輕鏈及重鏈二者之CDR1及2，「藉由重疊延伸剪接」(SOE)PCR組裝三個片段且將其選殖至噬菌體載體中(圖2)。使用以下引子組合來生成文庫片段：片段1(LMB3(SEQ ID NO：16)及CD19 L1反向隨機(SEQ ID NO：11)、片段2(CD19 L2正向隨機(SEQ ID NO：12)及CD19 H1反向隨機(SEQ ID NO：13)及片段3(CD19 H2正向隨機(SEQ ID NO：14)及CD19 H3反向恆定(SEQ ID NO：15)(表4)。在組裝足夠量之全長隨機化片段後，用NcoI/NheI將其消化，同時以相同方式處理受體噬菌粒載體。聯接3倍莫耳濃度過量之文庫插入物與10μg噬菌粒載體。使用經純化聯接物進行20次轉化，獲得2×10exp9個轉化體。拯救展示8B8親和力成熟文庫之噬菌粒粒子且藉由PEG/NaCl純化來純化以用於選擇。

以類似方式生成輕鏈CDR1及3以及重鏈CDR3經隨機化之第二文庫。使用以下引子組合來生成文庫片段：片段1(LMB3(SEQ ID NO：16)及CD19 L1反向隨機(SEQ ID NO：11)、片段2(CD19 L1正向恆定(SEQ ID NO 223)及CD19 L3反向隨機(SEQ ID NO 224)及片段3(CD19 L3正向恆定(SEQ ID NO：225)及CD19 H3反向隨機(SEQ ID NO：226)(表5)。在組裝足量之全長隨機化片段後，用NcoI/KpnI將其消化，同時以相同方式處理受體噬菌粒載體。聯接3倍莫耳濃度過量之文庫插入物與20μg噬菌粒載體。使用經純化聯接物進行40次轉化，獲得2×10exp9個轉化體。拯救展示8B8親和力成熟文庫之噬菌粒粒子且藉由PEG/NaCl純化來純化以用於選擇。

2.2不含LCDR1熱點N27d及N28之親和力成熟8B8源純系之選擇

為選擇不含LCDR1熱點N27d及N28之親和力成熟純系，藉由噬菌體展示實施兩種選擇方法：

在第一方法中，使用兩個噬菌體展示文庫對人類CD19-Fc融合蛋白執行選擇。根據以下模式在溶液中實施淘選週期：1.使約10¹²個噬菌粒粒子與30nM生物素化CD19-Fc蛋白以1ml之總體積結合0.5h，2.藉由添加5.4×10⁷個鏈黴抗生物素蛋白包覆之磁珠經10min捕獲生物素化CD19-Fc蛋白及特異性結合之噬菌體粒子，3.使用5×1ml PBS/Tween20及5×1ml PBS洗滌珠粒，4.藉由添加1ml 100mM TEA經10min溶析噬菌體粒子且藉由添加500μl 1M Tris/HCl pH 7.4來中和，5.呈指數生長之大腸桿菌TG1細菌之再感染，及6.用輔助噬菌體VCSM13進行感染，且隨後對噬菌粒粒子進行PEG/NaCl沈澱以用於後續選擇週期。使用遞減之抗原濃度(30×10^-9M、10×10^-9M及3×10^-9M)實施3輪選擇。在第2輪及第3輪中，使用中性親和素蛋白板替代鏈黴抗生物素蛋白珠粒來實施抗原：噬菌體複合物之捕獲。用5×PBS/Tween20及5×PBS洗滌中性親和素蛋白板。在第3輪中，在2升PBS中將中性親和素蛋白板培育過夜用於「解離速率」選擇，然後自板溶析噬菌體。此外，在第2輪中使用食蟹猴CD19-Fc蛋白以富集交叉反應性結合劑。

在第二選擇方法中，對在細胞表面上瞬時表現人類或食蟹猴CD19ECD之細胞執行噬菌體淘選。對於HEK細胞之瞬時轉染，生成具有以下蛋白質區段之DNA序列(5’至3’)之表現質體：Flag標籤、SNAP標籤、人類或食蟹猴來源之CD19 ECD及血小板源生長因子受體(PDGFR)之跨膜區域(SEQ ID NO：21及22)。藉由流式細胞術確認細胞表面上各別蛋白質(SEQ ID NO：23及24)之表現，使用抗Flag抗體來檢測。將兩個文庫在第一輪選擇中暴露於表現含人類或食蟹猴CD19 ECD之蛋白質融合物之細胞。對於後續淘選週期，相應地交替CD19 ECD之物種。使用經不相關膜蛋白瞬時轉染之細胞進行預清除。

根據以下模式實施淘選週期：1.根據先前所述之標準程序用表現CD19 ECD或不相關跨膜蛋白之構築體轉染HEK細胞，2.在37℃下在含有5% CO₂氣氛之培育器中將細胞培育總共48h，3.藉由離心(在250×g下保持3min)分離細胞，且將1×10E7個CD19 ECD陽性細胞及1×10E7個陰性細胞分別重懸浮於PBS/5% BSA中，3.藉由在4℃下使用溫和旋轉之管式旋轉器將噬菌體文庫與1×107個CD19陰性細胞一起培育60min來預清除非特異性噬菌體，4.將細胞在250×g下離心3min且將上清液轉移至新管中。添加1×10E7個CD19陽性細胞且在4℃下藉由在管式旋轉器上溫和旋轉培育60min，5.藉由在250×g下離心1min、抽吸上清液且重懸浮於1ml PBS中來洗滌細胞(8次)，6.用1ml 100mM TEA溶析噬菌體，在室溫下培育5min，且用500μl 1M Tris-HCl(pH7.6)中和溶析物，7.呈指數生長之大腸桿菌TG1細菌之再感染，及8.用輔助噬菌體VCSM13感染，且隨後對噬菌粒粒子進行PEG/NaCl沈澱以用於後續選擇週期。實施3輪選擇。

對於兩種選擇方法，藉由ELISA如下鑑別特異性結合劑：將100μl 30nM生物素化CD19-Fc蛋白/孔塗覆於中性親和素蛋白板上。添加含Fab之細菌上清液且經由其Flag標籤使用抗Flag/HRP二級抗體來檢測結合Fab。

在基於細胞之ELISA中使用經含人類CD19 ECD之表現質體(SEQ ID NO：227)瞬時轉染之細胞進一步測試對重組人類CD19呈ELISA陽性之純系。此分析係如下實施：轉染48h後，收穫HEK細胞且在250×g下離心5 min。然後將細胞於冰冷PBS BSA 2%中重懸浮至4×10⁶個細胞/ml，且在冰上培育20min以阻斷非特異性結合位點。將100μl中之4×10⁵個細胞分配至96孔板之每孔且在250×g及4℃下離心3min。抽吸掉上清液且用50μl冰冷PBS/BSA 2%稀釋50μl含有可溶性Fab片段之細菌上清液，添加至板中，與細胞混合且在4℃下培育1h。此後，用冰冷PBS將細胞洗滌3次，然後向每孔中添加100μl含有抗Fab-HRP抗體之1：2000稀釋之PBS BSA 2%。1h之培育時間後，用冰冷PBS將細胞再洗滌3次。對於顯影，向每孔中添加100μl「1步ultra TMB-ELISA」受質。10分鐘之培育時間後，將上清液轉移至含有40μl H₂SO₄ 1M/孔之新96孔板且量測450nM下之吸光度。藉由SPR分析使用ProteOn XPR36使展現背景上之顯著信號之純系經受動力學篩選實驗。

2.3藉由SPR鑑別親和力成熟8B8源變體

為進一步表徵ELISA陽性純系，藉由表面電漿共振使用ProteOn XPR36機器來量測解離速率且與親代人類化純系8B8進行比較。

對於此實驗，藉由胺偶合(NaAcetate pH4.5,25μl/min,240s)將7000RU之多株抗人類Fab抗體固定在GLM晶片之所有6個通道上(垂直取向)。將每一含抗體之細菌上清液過濾並用PBS進行2倍稀釋，且然後以25μl/分鐘注射360s以在垂直取向上達成介於100個與400個反應單位(RU)之間之固定量。單體CD19-Fc之注射：對於一步法動力學量測，使注射方向變成水平取向，同時以50μl/min沿單獨通道1-4注射經純化單體CD19-Fc之3倍稀釋系列(濃度範圍在150nM與6nM之間變化)，其中締合時間為180s，且解離時間為300s。在通道5中注射人類IgG Fc片段(150nM)作為特異性結合至單體CD19-Fc之陰性對照。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供用於參照之「在線」空白。藉由以90μl/min持續30s之10mM甘胺酸(pH 1.5)及50mM NaOH之兩個脈衝(水平取向)來實施再生。使用簡單的1：1 Langmuir結合模型在ProteOn Manager v3.1軟體中藉由同時擬合感測圖來計算解離速率常數(k_解離)。鑑別出表現Fab且具有最小解離速率常數之純系(表6)。應注意，純系5A07及5B08之解離速率常數因不充分擬合而無法確定。然而，選擇兩個純系之原因在於所獲得之結果表明極緩慢之解離。對相應噬菌粒之可變結構域測序。重要的是，LCDR1(位置27d及28)中之兩個天冬醯胺殘基經絲胺酸或蘇胺酸替代，此證實兩個去醯胺化位點被移除。比對顯示於圖3中。最佳純系之CDR列示於表7(輕鏈之可變區)及表8(重鏈之可變區)中(純系5H09：(SEQ ID NO：25-30)；純系7H07：(SEQ ID NO：31-36)；純系2B03：(SEQ ID NO：37-42)；純系2B11：(SEQ ID NO：43-48)；純系5A07：(SEQ ID NO：49-54)；純系5B08：(SEQ ID NO：55-60)；純系5D08：(SEQ ID NO：61-66))。

實例3 親和力成熟8B8源抗體之表徵

3.1可變抗體結構域至表現載體中之選殖

所選抗CD19結合劑之重鏈及輕鏈DNA序列之可變區框內亞選殖有人類IgG1之恆定重鏈或恆定輕鏈。在重鏈中，已根據國際專利申請公開案第WO 2012/130831 A1號中所述之方法引入Pro329Gly、Leu234Ala及 Leu235Ala突變以消除與Fc γ受體之結合。

抗CD19 IgG之cDNA及胺基酸序列分別顯示於表9及表10中。將所有抗體編碼序列選殖至表現載體中，該表現載體使用嵌合MPSV啟動子驅動插入物之轉錄且含有位於CDS之3’末端之合成聚A信號序列。另外，該載體含有用於質體之游離型維持之EBV OriP序列。

3.2藉由SPR之所選抗體之親和力測定

為藉由SPR精確測定親和力，藉由使用聚乙烯亞胺用哺乳動物表現載體共轉染HEK293-EBNA細胞來產生所選抗CD19抗體。根據標準程序用相應表現載體以1：1比率(「載體重鏈」：「載體輕鏈」)轉染細胞。在轉染後7天，量測上清液中之抗體效價且將所有效價平衡至10μg/ml。

在25℃下藉由SPR使用ProteOn XPR36儀器(Biorad)來量測親代抗體8B8以及其衍生物之親和力(K_D)。藉由胺偶合(NaAcetate pH4.5,25μl/min, 240s)將7000RU之多株抗人類Fab抗體固定在GLM晶片之所有6個通道上(垂直取向)。將每一含抗體之HEK上清液過濾，用PBST(10mM磷酸鹽、150mM氯化鈉(pH 7.4)、0.005% Tween 20)稀釋至10μg/ml之濃度，且然後以25μl/分鐘注射360s以在垂直取向上達成介於500個與800個反應單位(RU)之間之固定量。單體CD19-Fc之注射：對於一步法動力學量測，使注射方向變成水平取向，同時以50μl/min沿單獨通道1-4注射經純化單體CD19-Fc之3倍稀釋系列(濃度範圍在150nM與6nM之間變化)，其中締合時間為180s，且解離時間為300s。在通道5中注射人類IgG Fc片段(150nM)作為特異性結合至單體CD19-Fc之陰性對照。沿第六通道注射緩衝液(PBST)以提供用於參照之「在線」空白。各別感測圖之概圖顯示於圖4A至4H中。藉由以90μl/min持續30s之10mM甘胺酸(pH 1.5)及50mM NaOH之兩個脈衝(水平取向)來實施再生。使用簡單的1：1 Langmuir結合模型在ProteOn Manager v3.1軟體中藉由同時擬合締合及解離感測圖來計算締合速率常數(k_締合)及解離速率常數(k_解離)。平衡解離常數(K_D)計算為比率k_解離/k_締合。動力學及熱力學數據之匯總顯示於表11中。所有親和力成熟純系之解離常數與其親代純系8B8相比經改良。

實例4 抗CD19 IgG1 P329G LALA之製備及純化

所選抗CD19抗體係藉由使用聚乙烯亞胺用哺乳動物表現載體共轉染HEK293-EBNA細胞來產生。用相應表現載體以1：1比率(「載體重鏈」：「載體輕鏈」)轉染細胞。

對於產生，在轉染前24小時將4億個HEK293 EBNA細胞接種於500mL搖瓶中。在轉染前，將細胞以210×g離心5分鐘，且將上清液更換為預加熱之CD CHO培養基。將表現載體(200μg總DNA)混合於20mL CD CHO培養基中。添加540μL PEI後，將溶液渦旋15秒且在室溫下培育10分鐘。此後，將細胞與DNA/PEI溶液混合，轉移至500mL搖瓶，且在37℃下在含有5% CO₂氣氛之培育器中培育3小時。培育後，添加160mL F17培養基且將細胞培養24小時。在轉染後一天，添加1mM丙戊酸及含有補充物之7%進料。在培養7天後，藉由以210×g離心15分鐘收集上清液。將溶液無菌過濾(0.22μm過濾器)，補充疊氮化鈉至0.01%(w/v)之最終濃度，且保持在4℃下。

藉由親和層析使用如上文針對抗原Fc融合物之純化所述之蛋白質A自細胞培養上清液純化抗體分子。將蛋白質濃縮且過濾，然後裝載於經20mM組胺酸、140mM NaCl溶液(pH 6.0)平衡之HiLoad Superdex 200管柱(GE Healthcare)上。

藉由使用基於胺基酸序列計算之莫耳消光係數量測280nm下之OD來測定經純化抗體之蛋白質濃度。在還原劑(Invitrogen,USA)存在及不存在下使用LabChipGXII(測徑器)藉由CE-SDS來分析抗體之純度及分子量。在25℃下使用於25mM K₂HPO₄、125mM NaCl、200mM L-精胺酸單鹽酸鹽、0.02%(w/v)NaN₃(pH 6.7)運行緩衝液中平衡之TSKgel G3000 SW XL分析型粒徑篩析管柱(Tosoh)來分析抗體樣品之聚集物含量(表12)。

為製備雙特異性構築體，選擇純系2B11之原因在於其缺少三個去醯胺熱點。

實例5 表現CD19之腫瘤細胞上之結合

為檢查IgG1純系與表現CD19之細胞之結合，使用源自患有B細胞非霍奇金氏淋巴瘤之41歲高加索(Caucasian)男性之胸膜滲出液的WSU-DLCL2細胞(DSMZ編號ACC 575)。將重懸浮於DPBS(來自Life Technologies之Gibco，目錄號14190 326)中之0.1×10⁶個腫瘤細胞添加至圓底懸浮細胞96孔板(greiner bio-one,cellstar，目錄號650185)之每一孔中。用200μL DPBS將細胞洗滌一次。將細胞重懸浮於100μL/孔之含有1：5000稀釋之可固定活力染料eFluor 660(eBioscience，目錄號65-0864-18)之4℃冷DPBS緩衝液中，且在4℃下將板培育30分鐘。用200 μL/孔4℃冷DPBS緩衝液將細胞洗滌一次且重懸浮於50μL/孔之含有一系列濃度之CD19結合劑的4℃冷FACS緩衝液(補充有2% FBS、5mM EDTA pH8(Amresco，目錄號E177)及7.5mM疊氮化鈉(Sigma-Aldrich S2002)之DPBS)中，然後在4℃下培育1小時。充分洗滌後，在4℃下用50μL/孔之含有5μg/mL PE偶聯之AffiniPure抗人類IgG F(ab`)2片段特異性山羊F(ab`)2片段(Jackson ImmunoResearch，目錄號109 116 098)之4℃冷FACS緩衝液將細胞進一步染色30分鐘。然後用200μL/孔4℃ FACS緩衝液將細胞洗滌兩次且將細胞固定於50μL/孔含有1%甲醛(Sigma,HT501320-9.5L)之DPBS中。將細胞重懸浮於100μL/孔FACS緩衝液中且使用FACS LSR II(BD Biosciences)獲取。使用FlowJo V10(FlowJo,LLC)及GraphPad Prism 6.04(GraphPad Software,Inc)分析數據。

圖5顯示CD19 IgG1純系與表現人類CD19之WSU-DLCL2細胞之結合。表13顯示所量測之EC₅₀值。

<110> 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司

<120> 具高親和力之抗人類CD19抗體

<130> P33118-WO

<150> EP15188262,8

<151> 2015-10-02

<150> EP16167893,3

<151> 2016-05-02

<160> 115

<170> PatentIn version 3,5

<210> 1

<211> 273

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 274

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 2

<210> 3

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc孔洞鏈之核苷酸序列

<400> 3

<210> 4

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類CD19抗原Fc凸起鏈avi標籤之核苷酸序列

<400> 4

<210> 5

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Fc孔洞鏈

<400> 5

<210> 6

<211> 534

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人類CD19抗原Fc凸起鏈avi標籤

<400> 6

<210> 7

<211> 1605

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 食蟹猴CD19抗原Fc凸起鏈avi標籤之核苷酸序列

<400> 7

<210> 8

<211> 535

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 食蟹猴CD19抗原Fc凸起鏈avi標籤

<400> 8

<210> 9

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列CD19(8B8)VH親代純系DNA

<400> 9

<210> 10

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 核苷酸序列CD19(8B8)VL親代純系DNA

<400> 10

<210> 11

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 43-45：40% Y,6% A/S/T/G/P/D/N/E/Q/V,49-51：40% N,6% A/S/T/Y/G/P/D/E/Q/V,55-57：25% S/T/Q/E,61-63：25% S/T/Q/E

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(45)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(51)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(57)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(63)

<223> n係a、c、g或t

<400> 11

<210> 12

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 40-42：30% R,20% E,5% A/S/T/Y/G/P/D/N/Q/V,49-51：30% K,20% S, 5% A/N/T/Y/G/P/D/E/Q/V,55-57：40% F,5% A/S/T/Y/G/P/D/E/Q/V/I/L, 58-60：40% S,6.6% A/T/Y/G/P/D/E/Q/V,67-69：50% P,50% L

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(42)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(51)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(57)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (58)..(60)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (67)..(69)

<223> n係a、c、g或t

<400> 12

<210> 13

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 40-42：52% H,4% G/A/S/P/T/N/Y/D/E/Q/V/I,46-48：30% I,15% Y,5% G/A/S/T/P/N/H/D/E/Q/V,49-51：52% Y,4% G/A/S/P/T/N/H/D/E/Q/V/I, 52-54：30% D,15% G,5% A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I,55-57：52% T,4% G/A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I,61-63：52% T,4% G/A/S/P/Y/N/H/D/E/Q/V/I

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(42)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(48)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(51)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (52)..(54)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(57)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(63)

<223> n係a、c、g或t

<400> 13

<210> 14

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 34-36：45% Y,5%其他各項，40-42：52% N,4%其他各項，46-48：40% Y, 5%其他各項，49-51：30% N,15% S,5%其他各項，52-54：30% D,15% G, 5%其他各項，55-57：52% G,4%其他各項，61-63：30% K,15% N,4% 其他各項，70-72：30% E,15% Q,5%其他各項

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(36)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(42)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(48)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(51)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (52)..(54)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (55)..(57)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (61)..(63)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (70)..(72)

<223> n係a、c、g或t

<400> 14

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 H3反向恆定

<400> 15

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> LMB3

<400> 16

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 L1正向恆定

<400> 17

<210> 18

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 34-36：52% Y,4%其他各項，37-39：52% P,4%其他各項，40-42：42% V, 10% L,4%其他各項，43-45；52% H,4%其他各項，46-48：42% T,10% I, 4%其他各項，49-51：45% L,11% G,4%其他各項

<220>

<221> misc_feature

<222> (34)..(36)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (37)..(39)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (40)..(42)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (43)..(45)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(48)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (49)..(51)

<223> n係a、c、g或t

<400> 18

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 L3正向恆定

<400> 19

<210> 20

<211> 107

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pos.59-61：50% L,3.8%其他各項，62-64：50% A,4.2%其他各項，65-67： 50% S,4.2%其他各項，68-70：50% G,4.2%其他各項，71-73：50% Y,4.2% 其他各項，74-76：50% Y,4.2%其他各項，77-79：50% Y,4.2%其他各項， 80-82：50% T,4.2%其他各項，83-85：50% G,4.2%其他各項.

<220>

<221> misc_feature

<222> (54)..(58)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (59)..(61)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (62)..(64)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(67)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (68)..(70)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (71)..(73)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (74)..(76)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (77)..(79)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (80)..(82)

<223> n係a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (83)..(85)

<223> n係a、c、g或t

<400> 20

<210> 21

<211> 1615

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SNAP標籤人類CD19 ECD-PDGFR DNA

<400> 21

<210> 22

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SNAP標籤食蟹猴CD19 ECD-PDGFR DNA

<400> 22

<210> 23

<211> 539

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SNAP標籤人類CD19 ECD-PDGFR

<400> 23

<210> 24

<211> 540

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> SNAP標籤食蟹猴CD19 ECD-PDGFR

<400> 24

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)CDR-L1

<400> 25

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)CDR-L2

<400> 26

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)CDR-L3

<400> 27

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)CDR-H1

<400> 28

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)CDR-H2

<400> 29

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR(8B8-5H09)CDR-H3

<400> 30

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)CDR-L1

<400> 31

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)CDR-L2

<400> 32

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)CDR-L3

<400> 33

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)CDR-H1

<400> 34

<210> 35

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)CDR-H2

<400> 35

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)CDR-H3

<400> 36

<210> 37

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)CDR-L1

<400> 37

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)CDR-L2

<400> 38

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)CDR-L3

<400> 39

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)CDR-H1

<400> 40

<210> 41

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)CDR-H2

<400> 41

<210> 42

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)CDR-H3

<400> 42

<210> 43

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)CDR-L1

<400> 43

<210> 44

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)CDR-L2

<400> 44

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)CDR-L3

<400> 45

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)CDR-H1

<400> 46

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)CDR-H2

<400> 47

<210> 48

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)CDR-H3

<400> 48

<210> 49

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)CDR-L1

<400> 49

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)CDR-L2

<400> 50

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)CDR-L3

<400> 51

<210> 52

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)CDR-H1

<400> 52

<210> 53

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)CDR-H2

<400> 53

<210> 54

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)CDR-H3

<400> 54

<210> 55

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)CDR-L1

<400> 55

<210> 56

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)CDR-L2

<400> 56

<210> 57

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)CDR-L3

<400> 57

<210> 58

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)CDR-H1

<400> 58

<210> 59

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)CDR-H2

<400> 59

<210> 60

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)CDR-H3

<400> 60

<210> 61

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)CDR-L1

<400> 61

<210> 62

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)CDR-L2

<400> 62

<210> 63

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)CDR-L3

<400> 63

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)CDR-H1

<400> 64

<210> 65

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)CDR-H2

<400> 65

<210> 66

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)CDR-H3

<400> 66

<210> 67

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8)親代輕鏈DNA

<400> 67

<210> 68

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8)親代重鏈DNA

<400> 68

<210> 69

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8)親代輕鏈

<400> 69

<210> 70

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8)親代重鏈

<400> 70

<210> 71

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)輕鏈DNA

<400> 71

<210> 72

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)重鏈DNA

<400> 72

<210> 73

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)輕鏈

<400> 73

<210> 74

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)重鏈

<400> 74

<210> 75

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)輕鏈DNA

<400> 75

<210> 76

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)重鏈DNA

<400> 76

<210> 77

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)輕鏈

<400> 77

<210> 78

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)重鏈

<400> 78

<210> 79

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)輕鏈DNA

<220>

<221> misc_feature

<222> (320)..(321)

<223> n係a、c、g或t

<400> 79

<210> 80

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)重鏈DNA

<400> 80

<210> 81

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)輕鏈

<220>

<221> misc_feature

<222> (107)..(107)

<223> Xaa可為任一天然胺基酸

<400> 81

<210> 82

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)重鏈

<400> 82

<210> 83

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)輕鏈DNA

<400> 83

<210> 84

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)重鏈DNA

<400> 84

<210> 85

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)輕鏈

<400> 85

<210> 86

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)重鏈

<400> 86

<210> 87

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)輕鏈DNA

<400> 87

<210> 88

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)重鏈DNA

<400> 88

<210> 89

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)輕鏈

<400> 89

<210> 90

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)重鏈

<400> 90

<210> 91

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)輕鏈DNA

<400> 91

<210> 92

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)重鏈DNA

<400> 92

<210> 93

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)輕鏈

<400> 93

<210> 94

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)重鏈

<400> 94

<210> 95

<211> 657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)輕鏈DNA

<400> 95

<210> 96

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)重鏈DNA

<400> 96

<210> 97

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)輕鏈

<400> 97

<210> 98

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)重鏈

<400> 98

<210> 99

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)VH

<400> 99

<210> 100

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B11)VL

<400> 100

<210> 101

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)VH

<400> 101

<210> 102

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-7H07)VL

<400> 102

<210> 103

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)VH

<400> 103

<210> 104

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-2B03)VL

<220>

<221> misc_feature

<222> (107)..(107)

<223> Xaa可為任一天然胺基酸

<400> 104

<210> 105

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)VH

<400> 105

<210> 106

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5A07)VL

<400> 106

<210> 107

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)VH

<400> 107

<210> 108

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5D08)VL

<400> 108

<210> 109

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)VH

<400> 109

<210> 110

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5B08)VL

<400> 110

<210> 111

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)VH

<400> 111

<210> 112

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8-5H09)VL

<400> 112

<210> 113

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8)VH

<400> 113

<210> 114

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19(8B8)VL

<400> 114

<210> 115

<211> 556

<212> PRT

<213> 智人

<400> 115

Claims

一種抗體，其特異性結合至人類CD19之親和力高於包含包括SEQ ID NO：113之胺基酸序列的可變重鏈及包括SEQ ID NO：114之胺基酸序列的可變輕鏈之抗體。
一種特異性結合至人類CD19之抗體，其中該抗體包含(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列，(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列，(d)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列，(e)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列，及(f)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體係單株抗體。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體係人類、人類化或嵌合抗體。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體係特異性結合至人類CD19之抗體片段。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體包含包括SEQ ID NO：99之胺基酸序列的VH結構域及包括SEQ ID NO：100之胺基酸序列的VL結構域。
如請求項1或2之抗體，其係全長IgG1抗體。
如請求項1或2之抗體，其係具突變L234A、L235A及P329G之全長IgG1抗體(編號係根據Kabat之EU索引)。
如請求項1或2之抗體，其中該抗體對人類及食蟹猴CD19具有交叉反應性。
一種雙特異性抗體，其中該抗體特異性結合至人類CD19及第二抗原結合部分，其中該抗體包含(a)CDR-L1，其包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列，(b)CDR-L2，其包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列，(c)CDR-L3，其包含SEQ ID NO：45之胺基酸序列，(d)CDR-H1，其包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列，(e)CDR-H2，其包含SEQ ID NO：47之胺基酸序列，及(f)CDR-H3，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列。
一種多核苷酸，其編碼如請求項1至10中任一項之抗體。
一種載體、具體而言表現載體，其包含如請求項11之多核苷酸。
一種宿主細胞，其包含如請求項11之多核苷酸或如請求項12之載體。
一種產生如請求項1至10之抗體之方法，其包含以下步驟：(i)在適於表現該抗體之條件下培養如請求項13之宿主細胞，及(ii)回收該抗體。
一種醫藥調配物，其包含如請求項1至10中任一項之抗體及醫藥上可接受之載劑。
如請求項1或2之抗體，其用作藥劑。
如請求項1或2之抗體，其用於治療B細胞癌。
如請求項1或2之抗體，其用於消耗B細胞。
如請求項1或2之抗體，其用於治療自體免疫疾病、類風濕性關節炎、狼瘡、牛皮癬或骨病。
一種如請求項1至10中任一項之抗體之用途，其用於製造藥劑，具體而言用於治療B細胞癌之藥劑。