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TW201622732A - 寡核酸組合物及其製備方法 - Google Patents

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TW201622732A TW104113709A TW104113709A TW201622732A TW 201622732 A TW201622732 A TW 201622732A TW 104113709 A TW104113709 A TW 104113709A TW 104113709 A TW104113709 A TW 104113709A TW 201622732 A TW201622732 A TW 201622732A
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Abstract

本揭露內容提供一種經由連續偶合循環來製備寡核苷酸之固相方法，該等循環包括至少一次二核苷酸二聚物次單元偶合於增長鏈之游離3'-末端基團。寡核苷酸包括至少兩個藉由N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯接合之核苷次單元。該方法可包括以下步驟：(a)使連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與3'-經保護胺基-二核苷酸-5'-亞磷醯胺酯二聚物在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯；以及(c)使該鍵聯氧化(例如硫化)。藉由標的方法產生之組合物可包括降低量之一或多種(N-x)寡核苷酸產物。亦提供包括標的寡核苷酸組合物之醫藥組合物。

Description

寡核酸組合物及其製備方法 〔相關申請案之交叉參照〕
依據35 U.S.C.§ 119(e)，本申請案主張2014年5月1日申請之美國臨時申請案序列號61/987,396以及2015年4月23日申請之美國臨時申請案序列號[62/151,909](代理人參考編號185/002X)之申請日期的優先權，該等臨時申請案之揭露內容以引用的方式併入本文中。
本發明關於寡核苷酸組合物及其製備方法。
核酸聚合物化學已在醫藥、診斷及分析領域中，且更特定言之在反義及抗基因治療學、組合化學、分支DNA信號放大以及陣列基DNA診斷及分析之次領域中之許多發展中技術中起作用。此聚合物化學部分涉及改進諸如DNA之天然核酸聚合物之結合強度、特異性及核酸酶抗性。肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷醯胺酯核苷間鍵聯為已應用於寡核苷酸來提供一或多種合乎 需要之性質，諸如核酸酶抗性、細胞攝取及可溶性之一些聚合物化學的實例。
寡核苷酸N3'→P5'磷醯胺酯可與互補DNA及RNA股形成穩定雙鏈體，以及與DNA雙鏈體形成穩定三鏈體，且對核酸酶具有抗性。寡核苷酸N3'→P5'硫代磷醯胺酯在活體外與活體內皆可用作有效反義劑。舉例而言，抑制端粒酶活性之含寡核苷酸化合物可用於治療端粒酶介導之病症，諸如癌症，因為癌細胞表現端粒酶活性，而正常人類體細胞在生物相關層面上不具有端粒酶活性。因此，製備及分離此等寡核苷酸之方法受到關注。
本揭露內容提供一種經由連續偶合循環來製備寡核苷酸之固相方法，該等循環包括至少一次二核苷酸二聚物次單元偶合於增長鏈之游離3’-末端基團(例如3’-羥基或3’-胺基)。標的方法包括製備其中至少兩個核苷次單元係藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合之寡核苷酸。該方法可包括以下步驟：(a)使連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與3'-經保護胺基-二核苷酸-5'-亞磷醯胺酯二聚物在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯；以及(c)使該鍵聯氧化。在一些情況下，使鍵聯氧化包括硫化以產生核苷間N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯。
本揭露內容之態樣包括藉由標的方法產生之包括降低量之一或多種(N-x)寡核苷酸產物的寡核苷酸組合物。在一些情況下，以一或多種(N-x)產物相對於N產物之重量計，降低量小於(1.9 x N)份至100。根據標的方法製備之寡核苷酸包括具有N個與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列之寡核苷酸，其中至少兩個核苷次單元係藉由N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。亦提供包括標的寡核苷酸組合物之醫藥組合物。
定義
除非另外指示，否則以下術語具有以下含義。任何未定義之術語皆具有其此項技術認可之含義。
如本文所用，術語聚核苷酸及寡核苷酸可互換使用。每當寡核苷酸由諸如「ATGUCCTG」之字母序列表示時，除非另外指示，否則應瞭解核苷酸係以自左至右之5'→3'順序，且「A」表示去氧腺苷，「C」表示去氧胞苷，「G」表示去氧鳥苷，「T」表示胸苷，且「U」表示去氧尿苷。
如本文所用，「核苷」包括天然核苷，包括2'-去氧基及2'-羥基形式，例如如Kornberg及Baker,DNA Replication，第2版(Freeman,San Francisco,1992)中所述。關於核苷之「類似物」包括具有經修飾鹼基部分及/或經修飾糖部分之合成核苷，例如由Scheit,Nucleotide Analogs(John Wiley,New York,1980)大體描述。此等類 似物包括經設計以增強結合性質，例如穩定性、特異性或其類似性質之合成核苷，諸如由Uhlmann及Peyman(Chemical Reviews,90：543-584,1990)所揭露。在一些實施例中，核苷或核苷類似物包括3’-羥基或3’-胺基。
術語「鹼基」及「核苷鹼基」可互換使用，且在本文中定義包括(i)習知DNA及RNA鹼基(尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤及胞嘧啶)，及(ii)經修飾鹼基或鹼基類似物(例如5-甲基-胞嘧啶、5-溴尿嘧啶或肌苷)。鹼基類似物為分子結構模擬習知DNA或RNA鹼基之分子結構之化學物質。
如本文所用，「嘧啶」意謂存在於天然核苷中之嘧啶，包括胞嘧啶、胸腺嘧啶及尿嘧啶；及其常見類似物，諸如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羥基、胺基、硫基、鹵基及類似取代基之類似物。如本文所用之該術語進一步包括連接有常見保護基之嘧啶，諸如N4-苯甲醯基胞嘧啶。其他常見嘧啶保護基係由Beaucage及Iyer Tetrahedron 48：2223-2311(1992)揭露。
如本文所用，「嘌呤」意謂存在於天然核苷中之嘌呤，包括腺嘌呤、鳥嘌呤及次黃嘌呤；及其常見類似物，諸如含有氧基、甲基、丙炔基、甲氧基、羥基、胺基、硫基、鹵基及類似取代基之類似物。如本文所用之該術語進一步包括連接有常見保護基之嘌呤，諸如N2-苯甲醯基鳥嘌呤、N2-異丁醯基鳥嘌呤、N6-苯甲醯基腺嘌呤及其類似物。其他常見嘌呤保護基係由Beaucage及Iyer Tetrahedron 48：2223-2311(1992)揭露。如本文所用，作為化學名稱之組成部分之術語「-經保護-」係指此項技術認可之用於化合物之特定部分的保護基，例如關於核苷之「5'-經保護-羥基」包括三苯基甲基(亦即三苯甲基)、對大茴香基二苯基甲基(亦即單甲氧基三苯甲基或MMT)、二-對大茴香基苯基甲基(亦即二甲氧基三苯甲基或DMT)及其類似基團；且關於核苷鹼基之經保護核苷鹼基包括用諸如二甲基胺基甲脒(DMF)、苯甲醯基(Bz)、異丁醯基及其類似基團之基團保護雜原子。此項技術認可之保護基包括以下參考文獻中所述之保護基：Gait編輯，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Amarnath及Broom,ChemicalReviews,77：183-217,1977；Pon等人，Biotechniques,6：768-775,1988；Ohtsuka等人，Nicleic Acids Research,10：6553-6570,1982；Eckstein編輯，Oligonucleotides.and Analogues：A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Greene及Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis，第2版(John Wiley & Sons,New York,1991)；Narang編輯，Synthesis and Applications of DNA and RNA(Academic Press,New York,1987)；Beaucage及Iyer Tetrahedron 48：2223-2311(1992)及類似參考文獻。
如本文所用，「寡核苷酸N3'→P5'磷醯胺酯」意謂具有藉由至少一個N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯連接之核苷次單元之通常直鏈寡聚物。一般而言，核苷次單元包含 核苷或核苷類似物，但亦可包含具有可相容化學之更一般性部分，諸如無鹼基糖及其他烴部分，諸如以下參考文獻中所述：Newton等人，Nucleic Acids Research,21：1155-1162(1993)；Griffin等人，J.Am.Chem.Soc.,114：7976-7982(1992)；Jaschke等人，Tetrahedron Letters,34：301-304(1992)；Ma等人，國際申請案PCT/CA92/00423；Zon等人，國際申請案PCT/US90/06630；Durand等人，Nucleic Acids Research,18：6353-6359(1990)；Salunkhe等人，J.Am.Chem.Soc.,114：8768-8772(1992)；及其類似參考文獻。在一些情況下，該術語意謂其中所有核苷間鍵聯皆置換為N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯之寡核苷酸，亦即該術語包括部分以及完全「醯胺化」寡聚物。在一些情況下，其意謂其中所有核苷間鍵聯皆置換為N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯，且其中核苷次單元為天然核苷或其類似物之寡核苷酸。其中每個鍵聯皆為N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯之標的寡核苷酸N3'→P5'磷醯胺酯(「完全醯胺化」)可包埋於其他寡核苷酸或聚核苷酸中或連接於其他寡核苷酸或聚核苷酸以形成「部分醯胺化」較大寡聚物。標的寡核苷酸N3'→P5'磷醯胺酯可包括任何適宜3’及/或5’末端基團。在一些實施例中，寡核苷酸N3'→P5'磷醯胺酯包括3’-羥基末端基團或3’-胺基末端基團。
如本文所用，術語「磷酸酯」及「磷酸酯基」意欲涵蓋硫代磷酸酯基及側氧基磷酸酯基。
如本文所用，術語「亞磷醯胺酯胺基」係指 連接於亞磷醯胺酯基團之磷原子之胺基--NR4R5，且術語「亞磷醯胺酯氮」係指亞磷醯胺酯胺基之氮原子。
「烷基」係指具有1至10個碳原子，且諸如1至6個碳原子(例如「具有1至6個碳原子之烷基」)、或1至5(例如「具有1至5個碳原子之烷基」)、或1至4(例如「具有1至4個碳原子之烷基」)、或1至3個碳原子(例如「具有1至3個碳原子之烷基」)之單價飽和脂族烴基。此術語例如包括直鏈及分支鏈烴基，諸如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、異丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、異丁基((CH3)2CHCH2-)、第二丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、第三丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)及新戊基((CH3)3CCH2-)。
術語「經取代烷基」係指如本文定義之烷基，其中烷基鏈中之一或多個碳原子已視情況經諸如-O-、-N-、-S-、-S(O)n-(其中n為0至2)、-NR-(其中R為氫或烷基)之雜原子置換，且具有1至5個選自由以下組成之群之取代基：烷氧基、經取代烷氧基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、醯基、醯基胺基、醯基氧基、胺基、胺基醯基、胺基醯基氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫基芳基氧基、硫基雜芳基氧基、硫基雜環氧基、硫醇、硫基烷氧基、經取代硫基烷氧基、芳基、芳基氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺 基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-芳基、-SO2-雜芳基及-NRaRb，其中Ra及Rb可相同或不同，且選自氫、視情況經取代烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基及雜環。在一些情況下，「經取代烷基」係指如本文定義之具有1至5個選自由以下組成之群之取代基的烷基：烷氧基、環烷基、環烯基、醯基、醯基胺基、醯基氧基、胺基、胺基醯基、胺基醯基氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、羧基、羧基烷基、硫醇、硫基烷氧基、芳基、芳基氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、磺醯胺基及-NRaRb，其中Ra及Rb可相同或不同，且選自氫、烷基、環烷基、烯基、環烯基、炔基、芳基、雜芳基及雜環。
「伸烷基」係指較佳具有1至6、且更佳1至3個碳原子之為直鏈或分支鏈，且視情況間插有一或多個選自-O-、-NR10-、-NR10C(O)-、-C(O)NR10-及其類似基團之基團的二價脂族烴基。此術語例如包括亞甲基(-CH2-)、伸乙基(-CH2CH2-)、正伸丙基(-CH2CH2CH2-)、異伸丙基(-CH2CH(CH3)-)、(-C(CH3)2CH2CH2-)、(-C(CH3)2CH2C(O)-)、(-C(CH3)2CH2C(O)NH-)、(-CH(CH3)CH2-)及其類似基團。
「經取代伸烷基」係指1至3個氫經如在以下「經取代」之定義中對於碳所述之取代基置換的伸烷基。
術語「烷」係指如本文定義之烷基及伸烷基。
術語「烷基胺基烷基」、「烷基胺基烯基」及「烷基胺基炔基」係指基團R’NHR”，其中R’為如本文定義之烷基，且R”為如本文定義之伸烷基、伸烯基或伸炔基。
術語「烷芳基」或「芳烷基」係指基團-伸烷基-芳基及-經取代伸烷基-芳基，其中伸烷基、經取代伸烷基及芳基係在本文中所定義。
「烷氧基」係指基團-O-烷基，其中烷基係如本文所定義。烷氧基例如包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、第三丁氧基、第二丁氧基、正戊氧基及其類似基團。術語「烷氧基」亦指基團烯基-O-、環烷基-O-、環烯基-O-及炔基-O-，其中烯基、環烷基、環烯基及炔基係如本文所定義。
術語「經取代烷氧基」係指基團經取代烷基-O-、經取代烯基-O-、經取代環烷基-O-、經取代環烯基-O-及經取代炔基-O-，其中經取代烷基、經取代烯基、經取代環烷基、經取代環烯基及經取代炔基係如本文所定義。
術語「烷氧基胺基」係指基團-NH-烷氧基，其中烷氧基係在本文中所定義。
術語「鹵烷氧基」係指基團烷基-O-，其中烷基上之一或多個氫原子已經鹵基取代，且例如包括諸如三 氟甲氧基及其類似基團之基團。
術語「鹵烷基」係指如上所述之經取代烷基，其中烷基上之一或多個氫原子已經鹵基取代。此等基團之實例不加限制地包括氟烷基，諸如三氟甲基、二氟甲基、三氟乙基及其類似基團。
術語「烷基烷氧基」係指基團-伸烷基-O-烷基、伸烷基-O-經取代烷基、經取代伸烷基-O-烷基及經取代伸烷基-O-經取代烷基，其中烷基、經取代烷基、伸烷基及經取代伸烷基係如本文所定義。
術語「烷基硫基烷氧基」係指基團-伸烷基-S-烷基、伸烷基-S-經取代烷基、經取代伸烷基-S-烷基及經取代伸烷基-S-經取代烷基，其中烷基、經取代烷基、伸烷基及經取代伸烷基係如本文所定義。
「烯基」係指具有2至6個碳原子、且較佳2至4個碳原子，且具有至少1個、且較佳1至2個雙鍵不飽和位點之直鏈或分支鏈烴基。此術語例如包括雙乙烯基、烯丙基及丁-3-烯-1-基。此術語內包括順式及反式異構物或此等異構物之混合物。
術語「經取代烯基」係指如本文定義之具有1至5個選自以下之取代基、或1至3個選自以下之取代基的烯基：烷氧基、經取代烷氧基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、醯基、醯基胺基、醯基氧基、胺基、經取代胺基、胺基醯基、胺基醯基氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫酮 基、羧基、羧基烷基、硫基芳基氧基、硫基雜芳基氧基、硫基雜環氧基、硫醇、硫基烷氧基、經取代硫基烷氧基、芳基、芳基氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-經取代烷基、-SO2-芳基及-SO2-雜芳基。
「炔基」係指具有2至6個碳原子、且較佳2至3個碳原子，且具有至少1個、且較佳1至2個參鍵不飽和位點之直鏈或分支鏈單價烴基。此等炔基之實例包括乙炔基(-C≡CH)及炔丙基(-CH2C≡CH)。
術語「經取代炔基」係指如本文定義之具有1至5個選自以下之取代基、或1至3個選自以下之取代基的炔基：烷氧基、經取代烷氧基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、醯基、醯基胺基、醯基氧基、胺基、經取代胺基、胺基醯基、胺基醯基氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫基芳基氧基、硫基雜芳基氧基、硫基雜環氧基、硫醇、硫基烷氧基、經取代硫基烷氧基、芳基、芳基氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-經取代烷基、-SO2-芳基及-SO2-雜芳基。
「炔基氧基」係指基團-O-炔基，其中炔基係如本文所定義。炔基氧基例如包括乙炔基氧基、丙炔基氧 基及其類似基團。
「醯基」係指基團H-C(O)-、烷基-C(O)-、經取代烷基-C(O)-、烯基-C(O)-、經取代烯基-C(O)-、炔基-C(O)-、經取代炔基-C(O)-、環烷基-C(O)-、經取代環烷基-C(O)-、環烯基-C(O)-、經取代環烯基-C(O)-、芳基-C(O)-、經取代芳基-C(O)-、雜芳基-C(O)-、經取代雜芳基-C(O)-、雜環基-C(O)-及經取代雜環基-C(O)-，其中烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環及經取代雜環係如本文所定義。舉例而言，醯基包括「乙醯基」CH3C(O)-。
「醯基胺基」係指基團-NR20C(O)烷基、-NR20C(O)經取代烷基、NR20C(O)環烷基、-NR20C(O)經取代環烷基、-NR20C(O)環烯基、-NR20C(O)經取代環烯基、-NR20C(O)烯基、-NR20C(O)經取代烯基、-NR20C(O)炔基、-NR20C(O)經取代炔基、-NR20C(O)芳基、-NR20C(O)經取代芳基、-NR20C(O)雜芳基、-NR20C(O)經取代雜芳基、-NR20C(O)雜環及-NR20C(O)經取代雜環，其中R20為氫或烷基，且其中烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環及經取代雜環係如本文所定義。
「胺基羰基」或術語「胺基醯基」係指基團 -C(O)NR21R22，其中R21及R22獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環及經取代雜環，且其中R21及R22視情況與其結合之氮接合在一起以形成雜環或經取代雜環基團，且其中烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環及經取代雜環係如本文所定義。
「胺基羰基胺基」係指基團-NR21C(O)NR22R23，其中R21、R22及R23係獨立地選自氫、烷基、芳基或環烷基，或其中兩個R基團接合以形成雜環基。
術語「烷氧基羰基胺基」係指基團-NRC(O)OR，其中各R獨立地為氫、烷基、經取代烷基、芳基、雜芳基或雜環基，其中烷基、經取代烷基、芳基、雜芳基及雜環基係如本文所定義。
術語「醯基氧基」係指基團烷基-C(O)O-、經取代烷基-C(O)O-、環烷基-C(O)O-、經取代環烷基-C(O)O-、芳基-C(O)O-、雜芳基-C(O)O-及雜環基-C(O)O-，其中烷基、經取代烷基、環烷基、經取代環烷基、芳基、雜芳基及雜環基係如本文所定義。
「胺基磺醯基」係指基團-SO2NR21R22，其中R21及R22獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基、經取 代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環、經取代雜環，且其中R21及R22視情況與其結合之氮接合在一起以形成雜環或經取代雜環基團，且烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環及經取代雜環係如本文所定義。
「磺醯基胺基」係指基團-NR21SO2R22，其中R21及R22獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、芳基、經取代芳基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環及經取代雜環，且其中R21及R22視情況與其結合之原子接合在一起以形成雜環或經取代雜環基團，且其中烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環及經取代雜環係如本文所定義。
「芳基」或「Ar」係指具有6至18個碳原子之具有單環(諸如存在於苯基中)或具有多個稠合環之環系統(此等芳族環系統之實例包括萘基、蒽基及茚滿基)的單價芳族碳環基團，該等稠合環可為或可不為芳族，其限制條件為連接點係經由芳族環之原子來達成。此術語例如包括苯基及萘基。除非另外由芳基取代基之定義約束，否則 此等芳基可視情況經1至5個選自以下之取代基或1至3個選自以下之取代基取代：醯基氧基、羥基、硫醇、醯基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、經取代烷基、經取代烷氧基、經取代烯基、經取代炔基、經取代環烷基、經取代環烯基、胺基、經取代胺基、胺基醯基、醯基胺基、烷芳基、芳基、芳基氧基、疊氮基、羧基、羧基烷基、氰基、鹵素、硝基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、胺基醯基氧基、氧基醯基胺基、硫基烷氧基、經取代硫基烷氧基、硫基芳基氧基、硫基雜芳基氧基、-SO-烷基、-SO-經取代烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-經取代烷基、-SO2-芳基、-SO2-雜芳基及三鹵甲基。在此等情況下，經1至5個取代基(例如，如本文所述)取代之芳基稱為「經取代芳基」。
「芳基氧基」係指基團-O-芳基，其中芳基係如本文所定義，例如包括苯氧基、萘氧基及其類似基團，包括亦如本文定義之視情況經取代芳基。
「胺基」係指基團-NH2。
術語「經取代胺基」係指基團-NRR，其中各R係獨立地選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代烷基、環烷基、經取代環烷基、烯基、經取代烯基、環烯基、經取代環烯基、炔基、經取代炔基、芳基、雜芳基及雜環基，其限制條件為至少一個R不為氫。
術語「疊氮基」係指基團-N3。
「羧基(Carboxyl)」、「羧基(carboxy)」或「羧酸鹽」係指-CO2H或其鹽。
「羧基酯(Carboxyl ester)」或「羧基酯(carboxy ester)」或術語「羧基烷基(carboxyalkyl)」或「羧基烷基(carboxylalkyl)」係指基團-C(O)O-烷基、-C(O)O-經取代烷基、-C(O)O-烯基、-C(O)O-經取代烯基、-C(O)O-炔基、-C(O)O-經取代炔基、-C(O)O-芳基、-C(O)O-經取代芳基、-C(O)O-環烷基、-C(O)O-經取代環烷基、-C(O)O-環烯基、-C(O)O-經取代環烯基、-C(O)O-雜芳基、-C(O)O-經取代雜芳基、-C(O)O-雜環及-C(O)O-經取代雜環，其中烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環及經取代雜環係如本文所定義。
「(羧基酯)氧基」或「碳酸酯」係指基團-O-C(O)O-烷基、-O-C(O)O-經取代烷基、-O-C(O)O-烯基、-O-C(O)O-經取代烯基、-O-C(O)O-炔基、-O-C(O)O-經取代炔基、-O-C(O)O-芳基、-O-C(O)O-經取代芳基、-O-C(O)O-環烷基、-O-C(O)O-經取代環烷基、-O-C(O)O-環烯基、-O-C(O)O-經取代環烯基、-O-C(O)O-雜芳基、-O-C(O)O-經取代雜芳基、-O-C(O)O-雜環及-O-C(O)O-經取代雜環，其中烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳 基、雜環及經取代雜環係如本文所定義。
「氰基」或「腈」係指基團-CN。
「環烷基」係指具有3至10個碳原子之具有單環或多環，包括稠合環系統、橋接環系統及螺環系統的環狀烷基。適合環烷基之實例例如包括金剛烷基、環丙基、環丁基、環戊基、環辛基及其類似基團。此等環烷基例如包括單環結構，諸如環丙基、環丁基、環戊基、環辛基及其類似基團；或多環結構，諸如金剛烷基及其類似基團。
術語「經取代環烷基」係指具有1至5個選自以下之取代基、或1至3個選自以下之取代基之環烷基：烷基、經取代烷基、烷氧基、經取代烷氧基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、醯基、醯基胺基、醯基氧基、胺基、經取代胺基、胺基醯基、胺基醯基氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫基芳基氧基、硫基雜芳基氧基、硫基雜環氧基、硫醇、硫基烷氧基、經取代硫基烷氧基、芳基、芳基氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-經取代烷基、-SO2-芳基及-SO2-雜芳基。
「環烯基」係指具有3至10個碳原子之具有單環或多環，且具有至少一個雙鍵、且較佳1至2個雙鍵的非芳族環狀烷基。
術語「經取代環烯基」係指具有1至5個選自以下之取代基、或1至3個選自以下之取代基之環烯基：烷氧基、經取代烷氧基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、醯基、醯基胺基、醯基氧基、胺基、經取代胺基、胺基醯基、胺基醯基氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、酮基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫基芳基氧基、硫基雜芳基氧基、硫基雜環氧基、硫醇、硫基烷氧基、經取代硫基烷氧基、芳基、芳基氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-經取代烷基、-SO2-芳基及-SO2-雜芳基。
「環炔基」係指具有5至10個碳原子之具有單環或多環，且具有至少一個參鍵的非芳族環烷基。
「環烷氧基」係指-O-環烷基。
「環烯基氧基」係指-O-環烯基。
「鹵基」或「鹵素」係指氟基、氯基、溴基及碘基。
「羥基(Hydroxy)」或「羥基(hydroxyl)」係指基團-OH。
「雜芳基」係指在環內具有1至15個碳原子(諸如1至10個碳原子)及1至10個選自由氧、氮及硫組成之群之雜原子的芳族基團。此等雜芳基可具有單個環(諸如吡啶基、咪唑基或呋喃基)或於環系統中多個稠合環 (例如如在諸如吲哚嗪基、喹啉基、苯并呋喃、苯并咪唑基或苯并噻吩基之基團中)，其中該環系統內之至少一個環為芳族，且該環系統內之至少一個環為芳族，其限制條件為連接點係經由芳族環之原子來達成。在某些實施例中，雜芳基之氮及/或硫環原子視情況經氧化以提供N-氧化物(N→O)、亞磺醯基或磺醯基部分。此術語例如包括吡啶基、吡咯基、吲哚基、苯硫基及呋喃基。除非另外由雜芳基取代基之定義約束，否則此等雜芳基可視情況經1至5個選自以下之取代基或1至3個選自以下之取代基取代：醯基氧基、羥基、硫醇、醯基、烷基、烷氧基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、經取代烷基、經取代烷氧基、經取代烯基、經取代炔基、經取代環烷基、經取代環烯基、胺基、經取代胺基、胺基醯基、醯基胺基、烷芳基、芳基、芳基氧基、疊氮基、羧基、羧基烷基、氰基、鹵素、硝基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、胺基醯基氧基、氧基醯基胺基、硫基烷氧基、經取代硫基烷氧基、硫基芳基氧基、硫基雜芳基氧基、-SO-烷基、-SO-經取代烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-經取代烷基、-SO2-芳基及-SO2-雜芳基及三鹵甲基。在此等情況下，經1至5個取代基(例如，如本文所述)取代之雜芳基稱為「經取代雜芳基」。
術語「雜芳烷基」係指基團-伸烷基-雜芳基，其中伸烷基及雜芳基係在本文中所定義。此術語例如包括吡啶基甲基、吡啶基乙基、吲哚基甲基及其類似基團。
「雜芳基氧基」係指-O-雜芳基。
「雜環(Heterocycle)」、「雜環(heterocyclic)」、「雜環烷基」及「雜環基」係指具有單個環或多個稠合環，包括稠合環系統、橋接環系統及螺環系統，且具有3至20個環原子，包括1至10個雜原子的飽和或不飽和基團。此等環原子係選自由氮、硫或氧組成之群，其中在稠合環系統中，一或多個環可為環烷基、芳基或雜芳基，其限制條件為連接點係經由非芳族環來達成。在某些實施例中，雜環基團之氮及/或硫原子視情況經氧化以提供N-氧化物、-S(O)-或-SO2-部分。
雜環及雜芳基之實例包括但不限於氮雜環丁烷、吡咯、咪唑、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲哚嗪、異吲哚、吲哚、二氫吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹啉、喹啉、酞嗪、萘基吡啶、喹喏啉、喹唑啉、啉、喋啶、咔唑、咔啉、啡啶、吖啶、啡啉、異噻唑、啡嗪、異噁唑、啡噁嗪、啡噻嗪、咪唑啶、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、酞醯亞胺、1,2,3,4-四氫異喹啉、4,5,6,7-四氫苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑啶、噻吩、苯并[b]噻吩、嗎啉基、硫代嗎啉基(亦稱為噻嗎啉基)、1,1-二側氧基硫代嗎啉基、哌啶基、吡咯啶、四氫呋喃基及其類似基團。
除非另外由雜環取代基之定義約束，否則此等雜環基團可視情況經1至5、或1至3個選自以下之取代基取代：烷氧基、經取代烷氧基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、醯基、醯基胺基、醯基氧 基、胺基、經取代胺基、胺基醯基、胺基醯基氧基、氧基胺基醯基、疊氮基、氰基、鹵素、羥基、側氧基、硫酮基、羧基、羧基烷基、硫基芳基氧基、硫基雜芳基氧基、硫基雜環氧基、硫醇、硫基烷氧基、經取代硫基烷氧基、芳基、芳基氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環基、雜環氧基、羥基胺基、烷氧基胺基、硝基、-SO-烷基、-SO-經取代烷基、-SO-芳基、-SO-雜芳基、-SO2-烷基、-SO2-經取代烷基、-SO2-芳基、-SO2-雜芳基及稠合雜環。
「雜環基氧基」係指基團-O-雜環基。
術語「雜環基硫基」係指基團雜環-S-。
術語「伸雜環基」係指由如本文定義之雜環形成之二價基團。
術語「羥基胺基」係指基團-NHOH。
「硝基」係指基團-NO2。
「側氧基」係指原子(=O)。
「磺醯基」係指基團SO2-烷基、SO2-經取代烷基、SO2-烯基、SO2-經取代烯基、SO2-環烷基、SO2-經取代環烷基、SO2-環烯基、SO2-經取代環烯基、SO2-芳基、SO2-經取代芳基、SO2-雜芳基、SO2-經取代雜芳基、SO2-雜環及SO2-經取代雜環，其中烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環及經取代雜環係如本文所定義。磺醯基例如包括甲基-SO2-、苯基-SO2-及4-甲基苯基-SO2-。
「磺醯基氧基」係指基團-OSO2-烷基、OSO2-經取代烷基、OSO2-烯基、OSO2-經取代烯基、OSO2-環烷基、OSO2-經取代環烷基、OSO2-環烯基、OSO2-經取代環烯基、OSO2-芳基、OSO2-經取代芳基、OSO2-雜芳基、OSO2-經取代雜芳基、OSO2-雜環及OSO2經取代雜環，其中烷基、經取代烷基、烯基、經取代烯基、炔基、經取代炔基、環烷基、經取代環烷基、環烯基、經取代環烯基、芳基、經取代芳基、雜芳基、經取代雜芳基、雜環及經取代雜環係如本文所定義。
術語「胺基羰基氧基」係指基團-OC(O)NRR，其中各R獨立地為氫、烷基、經取代烷基、芳基、雜芳基或雜環，其中烷基、經取代烷基、芳基、雜芳基及雜環係如本文所定義。
「硫醇」係指基團-SH。
「硫基」或術語「硫酮基」係指原子(=S)。
「烷基硫基」或術語「硫基烷氧基」係指基團-S-烷基，其中烷基係如本文所定義。在某些實施例中，硫可經氧化成-S(O)-。亞碸可以一或多種立體異構物形式存在。
術語「經取代硫基烷氧基」係指基團-S-經取代烷基。
術語「硫基芳基氧基」係指基團芳基-S-，其中該芳基係如本文所定義，包括亦在本文中定義之視情況經取代芳基。
術語「硫基雜芳基氧基」係指基團雜芳基-S-，其中該雜芳基係如本文所定義，包括亦如本文定義之視情況經取代芳基。
術語「硫基雜環氧基」係指基團雜環基-S-，其中該雜環基係如本文所定義，包括亦如本文定義之視情況經取代雜環基。
除本文揭露內容之外，術語「經取代」在用於修飾指定基團時亦可指該指定基團之一或多個氫原子各自獨立於彼此經如下定義之相同或不同取代基置換。
除本文關於個別術語揭露之基團之外，除非另外規定，否則用於取代指定基團中之飽和碳原子上之一或多個氫(單一碳上之任何兩個氫可經=O、=NR70、=N-OR70、=N2或=S置換)的取代基為-R60、鹵基、=O、-OR70、-SR70、-NR80R80、三鹵甲基、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、=N2、-N3、-SO2R70、-SO2O-M+、-SO2OR70、-OSO2R70、-OSO2O-M+、-OSO2OR70、-P(O)(O-)2(M+)2、-P(O)(OR70)O-M+、-P(O)(OR70)2、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-C(O)O-M+、-C(O)OR70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OC(O)O-M+、-OC(O)OR70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70CO2 -M+、-NR70CO2R70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70及-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60係選自由以下組成之群：視情況經取代烷基、環烷基、雜烷 基、雜環烷基烷基、環烷基烷基、芳基、芳基烷基、雜芳基及雜芳基烷基，各R70獨立地為氫或R60；各R80獨立地為R70，或者兩個R80’連同其所鍵結之氮原子一起形成5、6或7員雜環烷基，其可視情況包括1至4個選自由O、N及S組成之群之相同或不同其他雜原子，其中N可具有-H或C1-C3烷基取代；且各M+為具有淨單一正電荷之相對離子。各M+可獨立地為例如鹼離子，諸如K+、Na+、Li+；銨離子，諸如+N(R60)4；或鹼土離子，諸如[Ca2+]0.5、[Mg2+]0.5或[Ba2+]0.5(下標0.5意謂此等二價鹼土離子之一個相對離子可為本發明化合物之離子化形式，且另一相對離子為諸如氯根之相對離子，或本文揭露之兩個離子化化合物可充當此等二價鹼土離子之相對離子，或本發明之雙重離子化化合物可充當此等二價鹼土離子之相對離子)。作為具體實例，-NR80R80意欲包括-NH2、-NH-烷基、N-吡咯啶基、N-哌嗪基、4N-甲基-哌嗪-1-基及N-嗎啉基。
除本文揭露內容之外，除非另外規定，否則「經取代」烯、炔、芳基及雜芳基中之不飽和碳原子上之氫的取代基為-R60、鹵基、-O-M+、-OR70、-SR70、-S-M+、-NR80R80、三鹵甲基、-CF3、-CN、-OCN、-SCN、-NO、-NO2、-N3、-SO2R70、-SO3 -M+、-SO3R70、-OSO2R70、-OSO3 -M+、-OSO3R70、-PO3 -2(M+)2、-P(O)(OR70)O-M+、-P(O)(OR70)2、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-CO2 -M+、-CO2R70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、 -C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OCO2 -M+、-OCO2R70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70CO2 -M+、-NR70CO2R70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70及-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60、R70、R80及M+係如先前所定義，其限制條件為在經取代烯或炔之情況下，取代基不為-O-M+、-OR70、-SR70或-S-M+。
除關於本文個別術語揭露之基團之外，除非另外規定，否則「經取代」雜烷基及環雜烷基中之氮原子上之氫的取代基為-R60、-O-M+、-OR70、-SR70、-S-M+、-NR80R80、三鹵甲基、-CF3、-CN、-NO、-NO2、-S(O)2R70、-S(O)2O-M+、-S(O)2OR70、-OS(O)2R70、-OS(O)2O-M+、-OS(O)2OR70、-P(O)(O-)2(M+)2、-P(O)(OR70)O-M+、-P(O)(OR70)(OR70)、-C(O)R70、-C(S)R70、-C(NR70)R70、-C(O)OR70、-C(S)OR70、-C(O)NR80R80、-C(NR70)NR80R80、-OC(O)R70、-OC(S)R70、-OC(O)OR70、-OC(S)OR70、-NR70C(O)R70、-NR70C(S)R70、-NR70C(O)OR70、-NR70C(S)OR70、-NR70C(O)NR80R80、-NR70C(NR70)R70及-NR70C(NR70)NR80R80，其中R60、R70、R80及M+係如先前所定義。
除本文揭露內容之外，在某一實施例中，經取代基團具有1、2、3或4個取代基、1、2或3個取代基、1或2個取代基、或1個取代基。
應瞭解在以上定義之所有經取代基團中，藉由用其自身之其他取代基定義取代基達成之聚合物(例如經取代芳基具有經取代芳基作為取代基，該取代基自身經經取代芳基取代，該經取代芳基進一步經經取代芳基取代等)不欲包括在本文中。在此等情況下，此等取代之最大數目為三。舉例而言，本文明確涵蓋之經取代芳基之連續取代形式限於經取代芳基-(經取代芳基)-經取代芳基。
除非另外指示，否則對未在本文中明確定義之取代基之命名係藉由依次命名官能基之末端部分及鄰近於連接點之官能基來達成。舉例而言，取代基「芳基烷基氧基羰基」係指基團(芳基)-(烷基)-O-C(O)-。
關於本文揭露之含有一或多個取代基之任何基團，當然應瞭解此等基團不含有在空間上不切實際及/或在合成上非可行之任何取代或取代樣式。此外，標的化合物包括由取代此等化合物產生之所有立體化學異構物。
術語「醫藥學上可接受之鹽」意謂可為向諸如哺乳動物之患者投與所接受之鹽(具有相對離子之鹽對於既定劑量方案具有可接受之哺乳動物安全性)。此等鹽可來源於醫藥學上可接受之無機或有機鹼以及由醫藥學上可接受之無機或有機酸。「醫藥學上可接受之鹽」係指化合物之醫藥學上可接受之鹽，該等鹽係來源於此項技術中熟知且僅舉例而言包括鈉及其類似物之多種有機及無機相對離子；且當分子含有鹼性官能基時，該等鹽為有機或無機酸之鹽，諸如鹽酸鹽及其類似物。相關醫藥學上可接受 之鹽包括但不限於鋁、銨、精胺酸、鋇、苯乍生(benzathine)、鈣、膽茶鹼、乙二胺、賴胺酸、鋰、鎂、葡甲胺、普魯卡因、鉀、鈉、緩血酸胺、N-甲基葡糖胺、N,N'-二苯甲基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、乙醇胺、哌嗪、鋅、二異丙胺、二異丙基乙胺、三乙胺及三乙醇胺鹽。
術語「其鹽」意謂當酸之質子經諸如金屬陽離子或有機陽離子及其類似物之陽離子置換時形成之化合物。當適用時，鹽為醫藥學上可接受之鹽，但此不為不欲向患者投與之中間化合物之鹽所需。舉例而言，本發明化合物之鹽包括其中化合物由無機或有機酸質子化以形成陽離子之鹽，其中無機或有機酸之共軛鹼作為鹽之陰離子組分。相關鹽包括但不限於鋁、銨、精胺酸、鋇、苯乍生、鈣、銫、膽茶鹼、乙二胺、鋰、鎂、葡甲胺、普魯卡因、N-甲基葡糖胺、哌嗪、鉀、鈉、緩血酸胺、鋅、N,N'-二苯甲基乙二胺、氯普魯卡因、二乙醇胺、乙醇胺、哌嗪、二異丙胺、二異丙基乙胺、三乙胺及三乙醇胺鹽。應瞭解，對於本文描繪之包括具有核苷間鍵聯之骨架的任何寡核苷酸結構，此等寡核苷酸亦可包括任何適宜鹽形式。在一些實施例中，為簡單起見，描繪核苷間鍵聯的酸性形式。在一些情況下，標的化合物之鹽為單價陽離子鹽。在某些情況下，標的化合物之鹽為二階陽離子鹽。在一些情況下，標的化合物之鹽為三價陽離子鹽。「溶劑合物」係指藉由組合溶劑分子與溶質之分子或離子形成之複合物。 溶劑可為有機化合物、無機化合物、或兩者之混合物。溶劑之一些實例包括但不限於甲醇、N,N-二甲基甲醯胺、四氫呋喃、二甲亞碸及水。當溶劑為水時，形成之溶劑合物為水合物。
「立體異構物」係指具有相同原子連接性，但在空間中之原子排列不同之化合物。立體異構物包括順式-反式異構物、E及Z異構物、鏡像異構物及非鏡像異構物。
「互變異構物」係指分子之僅在原子之電子鍵結方面及/或在質子之位置方面不同之替代性形式，諸如烯醇-酮及亞胺-烯胺互變異構物、-NH-P(=S)(OH)-O-及-NH-P(=O)(SH)-O-、或含有-N=C(H)-NH-環原子排列之雜芳基之互變異構形式，諸如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三唑及四唑。一般技藝人士將認識到本文所述之基團之其他互變異構排列為可能的。舉例而言，應瞭解藉由以下結構所述之寡核苷酸：
亦涵蓋顯示鍵聯基團之一種可能之替代性互變異構排列的以下結構：
其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯(-NH-P(=O)(SH)-O-或-NH-P(=S)(OH)-O-)。應瞭解即使未明確指示，標的化合物之所有互變異構形式亦皆由其中描述該化合物之基團之一種可能之互變異構排列的結構涵蓋。標的化合物之基團之任何適宜互變異構排列皆可用於描述該等化合物。
應瞭解術語「或其鹽或溶劑合物或立體異構物」意欲包括鹽、溶劑合物及立體異構物之所有排列，諸如標的化合物之立體異構物之醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物。應瞭解術語「或其鹽」意欲包括鹽之所有排列。應瞭解術語「或其醫藥學上可接受之鹽」意欲包括鹽之所有排列。應瞭解術語「或其溶劑合物」意欲包括溶劑合物之所有排列。應瞭解術語「或其立體異構物」意欲包括立體異構物之所有排列。應瞭解術語「或其互變異構物」意欲 包括互變異構物之所有排列。因此，舉例而言，由此可見意欲包括標的化合物之立體異構物之互變異構物的醫藥學上可接受之鹽之溶劑合物。
「醫藥有效量」及「治療有效量」係指化合物足以治療指定病症或疾病或其一或多種症狀及/或預防該疾病或病症之發生的量。關於致腫瘤增生性病症，醫藥或治療有效量包含尤其足以導致腫瘤萎縮或降低腫瘤之生長速率的量。
「患者」係指人類及非人類受試者，尤其哺乳動物受試者。
如本文所用之術語「治療」意謂治療諸如哺乳動物(特別是人類)之患者之疾病或醫學病狀，此包括：(a)預防該疾病或醫學病狀發生，諸如防治性治療受試者；(b)改善該疾病或醫學病狀，諸如消除患者之該疾病或醫學病狀或導致患者之該疾病或醫學病狀之消退；(c)例如藉由減緩或遏止患者之該疾病或醫學病狀之進展來遏制該疾病或醫學病狀；或(d)減輕患者之該疾病或醫學病狀之症狀。
如本文所用，術語「分離」意欲描述相關化合物所處之環境不同於該化合物天然存在所處之環境。「分離」意欲包括化合物處於實質上富含相關化合物及/或其中相關化合物經部分或實質上純化之樣品內。
如本文所用，術語「實質上純化」係指化合物自其天然環境移除，且至少60%、至少75%、至少80%、 至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或超過98%與其天然與之相伴之其他組分分離。
術語「生理條件」意欲涵蓋可與活細胞相容之彼等條件，例如可與活細胞相容之具有一定溫度、pH、鹽度等之主要水性條件。
在進一步描述本發明之前，應瞭解本發明不限於所述特定實施例，因此所述實施例當然可變化。也應瞭解本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，並且不意欲具有限制性，因為本發明之範疇將僅受限於隨附申請專利範圍。
當提供數值範圍時，應瞭解在彼範圍之上限與下限之間的直至下限之十分之一單位之各間插值(除非上下文另外明確規定)以及在彼陳述之範圍內之任何其他陳述值或間插值皆涵蓋在本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括在較小範圍中，且亦涵蓋在本發明內，屬於陳述之範圍內之任何明確排除之界限。當陳述之範圍包括一個或兩個界限時，排除彼等包括之界限中之任一者或兩者的範圍亦包括在本發明中。
應瞭解，為明確起見在單獨實施例之情形下描述之本發明之某些特徵亦可於單一實施例中組合提供。相反，為簡潔起見在單一實施例之情形下描述之本發明之各種特徵亦可單獨或以任何適合子組合提供。關於本發明之實施例之所有組合皆由本發明明確包括，且就如同各個及每個組合個別地及明確地在此等組合包括例如為作為穩定 化合物(亦即可製備、分離、表徵以及測試生物活性之化合物)之化合物之標的物的程度上經揭露一般來揭露於本文中。此外，各種實施例及其要素(例如描述此等變數之實施例中所列之化學基團的要素)之所有子組合亦由本發明明確包括，且就如同各個及每個此子組合個別地及明確地在本文中揭露一般來揭露於本文中。
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆與本發明所屬之技術中之一般技藝人士通常所理解具有相同含義。儘管類似或等效於本文所述之方法及材料之任何方法及材料皆亦可用於實施或測試本發明，但現描述相關方法及材料。本文提及之所有出版物皆以引用的方式併入本文中以揭露及描述與出版物引用之內容關聯之方法及/或材料。
必須注意的是，除非上下文另外明確規定，否則如本文及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一」及「該」包括複數個指示物。應進一步注意申請專利範圍可經起草以排除任何視情況選用之要素。因此，此陳述意欲充當與敘述申請專利範圍要素關聯使用諸如「唯一」、「僅」及其類似術語之排除性術語或使用「否定性」限制的前提基礎。
應瞭解，為明確起見在單獨實施例之情形下描述之本發明之某些特徵亦可於單一實施例中組合提供。相反，為簡潔起見在單一實施例之情形下描述之本發明之各種特徵亦可單獨或以任何適合子組合提供。
本文論述之出版物僅因其揭露內容在本申請案之申請日期之前而加以提供。本文中沒有內容應解釋為承認本發明由於先前發明而無權先於此出版物。此外，提供之公開日期可不同於可能需要獨立確認之實際公開日期。
[詳述]
如上所概述，本揭露內容提供一種經由連續偶合循環來製備寡核苷酸之固相方法，該等循環包括二核苷酸二聚物偶合於增長鏈之游離3’末端基團(例如3’-羥基或3’-胺基)。一般而言，合成自目標寡核苷酸序列之5’末端進行至3’末端，且包括至少一次二核苷酸二聚物偶合。二聚物可經由任何適宜化學偶合於增長鏈之3’末端基團。在一些情況下，二聚物為3’-經保護-二核苷酸-5'-亞磷醯胺酯二聚物，其中該二核苷酸可包括任何適宜核苷間鍵聯。寡核苷酸可包括一或多個磷醯胺酯次單元間鍵聯(例如側氧基-磷醯胺酯或硫代磷醯胺酯鍵聯)。
在一些實施例中，寡核苷酸包括含有至少一個由下式定義之次單元之核苷次單元的序列：
其中B為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶、或其類似物；X為O或S；R係選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基、磷酸酯保護基；且R3係選自由以下組成之群：氫、O-R2及鹵素，其中R2為H、烷基、經取代烷基(例如-(CH2)nW(CH2)mH，其中n在1-10之間，m在0-10之間，且W為O、S或NH)或羥基保護基。應瞭解包括藉由上式所述之次單元之一些寡核苷酸亦可以鹽形式存在。此等形式只要其可存在即意欲包括在本揭露內容之範疇內。
相對於僅涉及核苷單體次單元偶合之方法，標的方法使得偶合循環之數目降低，且使得合成之非目標寡核苷酸產物之量降低。可視諸如目標寡核苷酸之長度及序列之多種因素來選擇用於製備目標寡核苷酸序列之逆向合成策略以便使合成之特定非目標寡核苷酸產物之量最小。
在一些實施例中，標的方法提供製備一或多種(N-x)產物相對於相關目標寡核苷酸之量降低之組合物。
在某些實施例中，一或多種(N-x)產物相對於相關目標寡核苷酸之量降低的本文所述之任何組合物皆為未純化的。
如本文所用，術語「(N-x)產物」(其中x為整數1至N-1，且N為目標寡核苷酸中之核苷殘基之數目)係指在標的製備方法期間產生之相較於長度為N個殘基之 目標寡核苷酸之序列，缺乏x個核苷殘基之非目標寡核苷酸。目標寡核苷酸為標的製備方法經設計以產生之產物。因此，(N-1)產物為缺乏出自目標寡核苷酸之序列之任一核苷殘基的非目標寡核苷酸。因此，在一些情況下，術語「(N-1)產物」係指多種非目標寡核苷酸產物，其各自相較於目標寡核苷酸之序列，缺乏一個核苷殘基。類似地，術語「(N-x)產物」係指多種非目標寡核苷酸產物，其各自相較於目標寡核苷酸之序列，缺乏x個核苷殘基。舉例而言，(N-2)產物為缺乏出自目標寡核苷酸之序列之任何兩個核苷殘基的非目標寡核苷酸。在一些情況下，相對於目標寡核苷酸序列，x個殘基彼此鄰接。在其他情況下，相對於目標寡核苷酸序列，x個殘基彼此不鄰接。x個核苷殘基可自目標序列之任何位置缺乏，且可在偶合循環期間由未反應之3’-末端基團產生。標的方法之(N-x)產物可包括一或多種由標的合成方法獲得之其他修飾，例如部分脫保護修飾、損失核苷鹼基(例如脫嘌呤)、末端基團加帽、經由合成試劑衍生(例如由硫化試劑達成苯基乙醯化)及其類似修飾。視所用寡核苷酸合成及試劑之化學性質而定，多種經修飾寡核苷酸為可能的。除非另外指示，否則所有此等修飾皆意欲由術語(N-x)產物涵蓋。
在一些實施例中，標的方法導致寡核苷酸合成之一或多種選自以下之非目標產物降低：部分經保護產物或部分經保護(N-x)產物，例如包括一或多種核苷鹼基保護基之寡核苷酸產物。在標的寡核苷酸組合物中，目標 寡核苷酸序列可更易於與方法之其他含寡核苷酸產物(例如(N-x)產物及缺乏核苷鹼基之產物)分離或純化。
標的方法及組合物之實施例更詳細描述於以下章節中。
製備寡核苷酸之方法
本揭露內容提供一種製備寡核苷酸之方法。標的方法可包括二核苷酸二聚物至少一次偶合於增長寡核苷酸鏈之游離3’末端基團。任何適宜寡核苷酸合成方法及化學皆可用於標的製備方法中。可適合於在標的方法中使用之相關寡核苷酸合成化學及方法包括但不限於亞磷醯胺酯、H-膦酸酯、磷酸二酯、磷酸三酯、亞磷酸三酯及由Fearon等人在U.S.5,824,793中所述者，該專利之揭露內容以全文引用的方式併入本文中。本發明化合物之寡核苷酸組分可藉由適合於所選化學類型之習知方案來合成。用於合成具有N3'→P5'磷醯胺酯化學之寡核苷酸之相關方法包括但不限於McCurdy等人，(1997)Tetrahedron Letters,38：207-210以及Pongracz及Gryaznov,(1999)Tetrahedron Letters,49：7661-7664中所述之彼等方法。
相關寡核苷酸可使用標的方法，經由自目標寡核苷酸序列之5’-末端開始，且進行至3’-末端來進行連續偶合加以製備。5’-末端核苷次單元可經由視情況選用之連接基團或5’-末端基團連接於任何適宜固體支撐物。接著，可使用二聚物亞磷醯胺酯或單體亞磷醯胺酯達成次 單元偶合於增長寡核苷酸鏈。或者，5’-末端二核苷酸次單元可經由視情況選用之連接基團或5’-末端基團連接於任何適宜固體支撐物。一旦第一次單元(例如單體或二聚物次單元)連接於固體支撐物，即可將次單元脫保護以產生固定之游離3’-末端基團。在一些情況下，方法包括使支撐物結合之3’-末端基團與3’-經保護-二核苷酸-5'-亞磷醯胺酯二聚物偶合。在某些實施例中，3’-末端基團為3’-羥基。在某些實施例中，3’-末端基團為3’-胺基。
在一些情況下，方法包括以下步驟：(a)使連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與3'-經保護胺基-二核苷酸硫代磷醯胺酯或亞磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯；以及(c)使該鍵聯氧化。
目標寡核苷酸序列可使用逆向合成策略來合成，該策略包括二聚物次單元與單體次單元兩者連續偶合於增長寡核苷酸鏈之3’末端基團。因此，在一些實施例中，方法進一步包括以下步驟：(a)使連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯單體在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯；以及(c)使該鍵聯氧化以產生N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯。
如本文所用，術語「N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵 聯」係指N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯之磷(III)中間物。一般而言，N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯係藉由使N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯氧化成磷(V)產物(例如可包括側氧基(P=O)或硫基(P=S)之N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯)來形成。在一些情況下，氧化步驟可描述為使N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯硫化以產生N3'→P5'硫代磷醯胺酯鍵聯。
如本文所用，「N3'→P5'磷醯胺酯」、「P5'→N3'磷醯胺酯」及「磷醯胺酯」係指由下式描述之核苷間次單元鍵聯：3’-NH-P(=X)(OR)-O-5’
或其互變異構物，其中3’及5’係指藉助於鍵聯連接之連續核苷之糖部分的碳原子，且其中R為氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基或磷酸酯保護基，且X為硫族元素，諸如氧或硫。應瞭解，當R為氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基或磷酸酯保護基時，藉由上式所述之一些核苷間次單元鍵聯亦可以鹽形式存在。此等形式只要其可存在即意欲包括在本揭露內容之範疇內。在一些情況下，當X為硫時，磷醯胺酯可稱為硫代磷醯胺酯。在一些情況下，當X為氧時，「磷醯胺酯」可稱為「側氧基磷醯胺酯」。在一些情況下，當R為磷酸酯保護基時，其可為烷基、烯基、芳基、芳烷基、環烷基或其經取代形式。在一些情況下，R為含有10個或小於10個碳原子之磷酸酯保護基。在某些情況下，當R為磷酸酯保護基時，其為具有1至6個碳原子之烷基；吸電子β-經取代乙基 (例如β-三鹵甲基-、β-氰基-、β-磺基-或β-硝基-取代之乙基)；吸電子經取代苯基(例如鹵基-、磺基-、氰基-或硝基-取代之苯基)；或吸電子經取代苯基乙基。在一些實施例中，當R為磷酸酯保護基時，其為甲基、β-氰基乙基或4-硝基苯基乙基。在某些實施例中，R為氫、甲基或β-氰基乙基。相關吸電子取代基包括但不限於鹵基、氰基、硝基、磺基或單鹵甲基、二鹵甲基或三鹵甲基及其類似基團。鹵素原子取代基通常為氟基、氯基、溴基或碘基；且在一些情況下，其為氟基或氯基。「吸電子」表示取代基傾向於吸引它作為其一部分之分子的價電子，亦即它為電負性的，例如March,Advanced Organic Chemistry，第16-18頁(John Wiley,New York,1985)。用於選擇磷酸酯保護基之指導提供於Beaucage及Iyer,Tetrahedron 48：2223-2311(1992)中。為方便起見，核苷酸磷醯胺酯有時在本文中由分別用於N3'→P5'磷醯胺酯及P3'→N5'磷醯胺酯之下標「np」或「pn」指示。因此，「UnpU」為其中3'-胺基尿苷及尿苷藉由N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯連接之二核苷酸。當鍵聯為側氧基-磷醯胺酯時，核苷酸側氧基-磷醯胺酯有時在本文中由分別用於N3'→P5'硫代磷醯胺酯及P3'→N5'硫代磷醯胺酯之下標「npo」或「opn」指示。類似地，核苷酸硫代磷醯胺酯有時在本文中由分別用於N3'→P5'磷醯胺酯及P3'→N5'磷醯胺酯之下標「nps」或「spn」指示。類似地，2'-氟取代基由上標「f」指示。因此，「Uf.npU」為二核苷酸，其中最5' 3'-胺基-2'-氟尿苷 藉由N3'→P5'磷醯胺酯鍵聯連接於尿苷。單一先導下標「p」指示5'單磷酸酯，且單一拖尾下標「n」指示3'-胺基。
在一些情況下，核苷間次單元鍵聯係藉由下式所述：3’-NH-P(=X)(OR)-O-5’
或其互變異構物，其中3’及5’係指藉由鍵聯方式連接之連續核苷之糖部分的碳原子，且其中R為氫，且X為氧或硫。應瞭解對於本文所述之包括該種核苷間鍵聯之任何寡核苷酸，此等寡核苷酸亦可包括鍵聯之任何適宜鹽形式。因此，核苷間鍵聯可呈包括任何適宜相對離子之鹽形式。
任何適宜保護基策略皆可用於標的方法中以保護鹼基、亞磷醯胺酯、磷醯胺酯、5’、2’及/或3’基團。相關保護基包括但不限於藉由Ohkubo等人，Org.Lett.,2010,12(11)，第2496-2499頁；以及Beaucage及Iyer,Tetrahedron 48：2223-2311(1992)所述之彼等保護基。
如本文所用，術語「磷酸酯保護基」係指可連接於寡核苷酸之含磷次單元間鍵聯之保護基。當存在時，磷酸酯保護基可阻止(亦即阻斷)在連接磷酸酯保護基所處之位置處之含磷鍵聯的反應。任何適宜含磷次單元間鍵聯(例如P(III)及P(V)鍵聯)皆可由標的磷酸酯保護基保護，包括但不限於亞磷醯胺酯、側氧基磷醯胺酯、硫代磷醯胺酯、磷酸酯、硫代磷酸酯、磷酸二酯鍵聯及其類似鍵 聯。磷酸酯保護基可連接於含磷次單元間鍵聯之可用氧原子。任何適宜保護基皆可用作磷酸酯保護基。相關磷酸酯保護基包括但不限於烷基、烯基、芳基、芳烷基、環烷基或其經取代形式，諸如具有1至6個碳原子之烷基，諸如吸電子β-經取代乙基(β-三鹵甲基、β-氰基-、β-磺基-或β-硝基-取代之乙基)；吸電子經取代苯基(例如鹵基-、磺基-、氰基-或硝基-取代之苯基)；或吸電子經取代苯基乙基、甲基、β-氰基乙基或4-硝基苯基乙基。在某些實施例中，磷酸酯保護基為甲基或β-氰基乙基。相關吸電子取代基包括但不限於鹵基(例如氯基或氟基)、氰基、硝基、磺基或單鹵甲基、二鹵甲基或三鹵甲基及其類似基團。
增長寡核苷酸鏈之3’-末端基團可包括3’-羥基、3’-胺基或其經保護形式。任何適宜羥基及/或胺基保護基皆可在寡核苷酸合成期間在3’-末端基團處利用。在一些實施例中，3’末端基團為經保護3’-胺基，且方法包括脫除或移除保護基以產生游離3’胺基。
如本文所用，關於單體及二聚物的術語「游離胺基」意謂可用於與進入之單體或二聚物之亞磷醯胺酯基團反應的胺基。在一些實施例中，游離胺基為一級胺。在脫保護(例如去三苯甲基)步驟之後，胺基可呈鹽形式(例如用於去三苯甲基之酸之共軛鹼的鹽)。此鹽視情況可在去三苯甲基步驟之後用諸如含2%三乙胺或吡啶之乙腈的鹼性溶液中和。
在一些實施例中，3’-末端基團為經保護3’-羥 基，且方法包括脫除或移除保護基以產生游離3’-羥基。在一些實施例中，3’-末端基團為經保護3’-胺基，且方法包括脫除或移除保護基以產生游離3’-胺基。經保護3’-胺基或3’-羥基可用三苯甲基保護基保護。在某些實施例中，三苯甲基保護基為三苯基甲基(Tr、Ph3C-)。在某些實施例中，三苯甲基保護基為4,4’-二甲氧基三苯甲基(DMT)。
將3’-末端胺基或羥基脫保護可使用任何適宜方法來達成。相關方法包括但不限於藉由Beaucage及Iyer,Tetrahedron 48：2223-2311(1992)所述之彼等方法。在一些情況下，將末端核苷之經保護3'胺基脫保護包括去三苯甲基以產生游離3’末端基團，例如酸催化之去三苯甲基。
一般而言，二聚物或單體次單元亞磷醯胺酯包括與連接於固體支撐物之末端核苷之3’末端基團相同的經保護3’-羥基或3’-胺基。3’保護進入之次單元亞磷醯胺酯會阻止鏈之不合需要之聚合。
任何適宜固相支撐物皆可用於標的方法中。相關固體支撐物包括但不限於由可控孔徑玻璃(CPG)製得之微粒、高度交聯聚苯乙烯(例如NittoPhase HL 400或GE Primer 350)、丙烯酸共聚物、纖維素、耐綸、葡聚糖、乳膠、聚丙烯醛及其類似物，諸如以下示範性參考文獻中揭露者：Meth.Enzymol.，章節A，第11-147頁，第44卷(Academic Press,New York,1976)；美國專利第 4,678,814號；第4,413,070號；及第4,046；720號；以及Pon，第19章，Agrawal編輯，Methods in Molecular Biology，第20卷，(Humana Press,Totowa,N.J.,1993)。其他相關支撐物包括聚苯乙烯珠粒；接枝有聚乙二醇之聚苯乙烯(例如TentaGelTM,Rapp Polymere,Tubingen Germany)；及其類似物。對諸如材料、孔隙度、尺寸、形狀及其類似特徵之支撐物特徵以及所用連接部分之類型的選擇取決於多種因素，諸如所用保護基、最終產物之長度、最終產物之量及其類似因素。示範性連接部分揭露於Pon等人，Biotechniques,6：768-775(1988)；Webb，美國專利第4,659,774號；Barany等人，國際專利申請案PCT/US91/06103；Brown等人，J.Chem.Soc.Commun.,1989：891-893；Damha等人，Nucleic Acids Research,18：3813-3821(1990)；Beattie等人，Clinical Chemistry,39：719-722(1993)；Maskos及Southern,Nucleic Acids Research,20：1679-1684(1992)；及其類似文獻中。
在一些實施例中，適用於標的方法中之固體支撐物包括CPG及接枝有聚乙二醇且具有末端胺基之聚苯乙烯(例如TentaGel-NH2 TM,Rapp Polymere,Tubingen Germany)。胺基丙基可用作CPG與核苷鍵聯之間的間隔子。在一些情況下，與第一核苷之5'-羥基鍵聯的是丁二醯基，其提供可在合成之後用氨水溶液裂解之鹼不穩定性酯鍵聯。
在脫保護之後，支撐物結合之核苷能夠與二 聚物或單體次單元亞磷醯胺酯反應以形成核苷間鍵聯。應瞭解支撐物結合之核苷可指連接於固體支撐物之單一殘基，或可指寡核苷酸鏈之連接於支撐物之末端殘基。
任何適宜偶合化學、偶合試劑及方法皆可用於標的方法中。在標的方法之情形下進行涉及偶合條件、保護基、固相支撐物、連接基團、脫保護試劑、用以自固相支撐物裂解產物之試劑、產物純化及其類似方面之選擇的大量指導可見於例如以下之文獻中：Gait編輯，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Amarnath及Broom,Chemical Reviews，第77卷，第183-217頁(1977)；Pon等人，Biotechniques，第6卷，第768-775頁(1988)；Ohtsuka等人，Nucleic Acids Research，第10卷，第6553-6570頁(1982)；Eckstein編輯Oligonucleotides.and Analogues：A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1991)；Greene及Wuts「Protective Groups in Organic Synthesis」，第3版，Wiley,New York 1999；Narang編輯，Synthesis and Applications of DNA and RNA(Academic Press,New York,1987)；Beaucage及Iyer,Tetrahedron 48：2223-2311(1992)及類似參考文獻。
標的方法之偶合步驟可在-20至200攝氏度之溫度範圍內進行。在一些情況下，反應係在環境溫度(約15-30攝氏度)下進行。反應可藉由向含有(寡)核苷酸之共價連接於固體支撐物之游離胺基的反應容器中添加亞磷醯 胺酯二聚物或單體之溶液及活化劑之溶液(或含有亞磷醯胺酯二聚物或單體及活化劑之溶液)來進行。通常，相關活化劑包括親核催化劑，其置換更穩定亞磷醯胺酯胺基以形成高度反應性(及較小穩定性)中間物，該中間物又與固體支撐之寡核苷酸N3'→P5'磷醯胺酯之游離3'胺基反應。接著藉由諸如機械渦旋、用惰性氣體噴射等之方法來混合混合物。或者，可使二聚物或單體及活化劑之溶液流過含有固體支撐之具有游離3'-末端基團之(寡)核苷酸的反應容器(或管柱)。單體及活化劑可經預混合，在適合合成儀之閥體中混合，在預活化容器中混合且必要時經預平衡，或其可分別添加至反應容器中。
可用於標的方法中之相關活化劑包括但不限於四唑、5-(乙基硫基)四唑、5-(4-硝基苯基)四唑、5-(2-噻吩)四唑、三唑、氯化吡啶鎓及其類似物，例如如由Beaucage及Iyer Tetrahedron 48：2223-2311(1992)；Berner等人，Nucleic Acids Research,17：853-864(1989)；Benson,Chem.Rev.41：1-61(1947)所述之活化劑。如本文所用，術語「四唑活化劑」係指為四唑或四唑之衍生物之活化劑。在一些實施例中，活化劑為四唑。適宜溶劑包括但不限於乙腈、四氫呋喃、二氯甲烷及其類似物。可小心使用無水(不含水)二聚物或單體、活化劑以及用於偶合步驟之溶劑及用於在偶合步驟之前即刻洗滌固體支撐物之溶劑。
在偶合之後，寡核苷酸之支撐物結合之增長 鏈的未反應之3'-胺基可視情況在下一脫保護步驟(例如去三苯甲基步驟)之前用適宜加帽劑加帽以使其對隨後偶合步驟具有惰性。此加帽步驟可改進製備之HPLC概況以使得純化更容易，且亦可改進產物之總體產率。適用於標的方法中之加帽試劑包括親電子試劑(諸如乙酸酐及異丁酸酐)、酸氯化物(諸如金剛烷基羰基氯化物、三甲基乙醯氯及其類似物)、異硫氰酸酯、氯甲酸酯等。亦適用的是亞磷醯胺酯連同活化劑一起，且繼之以氧化，且諸如異丙基-H-膦酸三乙銨之H-膦酸鹽連同酸氯化物(諸如三甲基乙醯氯或金剛烷基羰基氯化物)一起使用。
在一些實施例中，方法包括使核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯氧化。如本文所用，關於含磷核苷間鍵聯之術語「氧化」及其類似術語意謂用於使鍵聯之磷原子自磷(III)形式轉化成磷(V)形式之過程或處理。核苷酸間鍵聯之氧化可使用任何適宜方法在合成中之任何適宜時點來進行。在一些實施例中，氧化係以逐步方式例如在每個偶合循環期間進行。在其他實施例中，多個核苷酸間鍵聯之氧化係在合成結束時進行。在一些情況下，使N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯氧化(例如使用基於碘/水之氧化劑)會產生側氧基-磷醯胺酯鍵聯。在其他情況下，使N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯氧化包括硫化以產生硫代磷醯胺酯鍵聯。硫化可使用任何適宜方法來進行。相關硫化方法包括由Gryazonov等人，WO2001018015所述之方法，該專利之揭露內容以全文引用的方式併入本文中。用於本發 明中之硫化劑包括元素硫、二硫化秋蘭姆(諸如二硫化四乙基秋蘭姆)、醯基二硫化物(諸如苯甲醯甲基二硫化物)、硫膦基二硫化物(諸如S-TetraTM)及1,1-二側氧基-3H-1,2-苯并二硫醇-3-酮。在一些實施例中，硫化可使用元素硫(S8)來進行。在某些實施例中，硫化可使用如由Iyer等人，J.Organic Chemistry 55：4693-4699,1990所述之方法，利用Beaucage試劑來進行。
適用於方法中之氧化劑包括碘、氯、溴、過酸(諸如間氯苯甲酸)、氫過氧化物(諸如第三丁基氫過氧化物、乙基氫過氧化物、甲基氫過氧化物及其類似物)、臭氧、混合醯基-亞磺酸酐(諸如3H-2,1-苯并氧硫雜環戊烷-3-酮-1-氧化物)、過硫酸鹽(諸如過硫酸鈉、過硫酸銨及過硫酸四丁銨及其類似物)、單過氧硫酸鹽(諸如oxoneTM)、次氯酸鈉及/或其他次氯酸鹽、過氧化物(諸如二乙基過氧化物或雙(三甲基矽烷基)過氧化物、或過氧化氫或非水性過氧化氫等效物(諸如脲/過氧化氫複合物))等。可用於使磷(III)轉化成磷(V)之其他適用氧化劑描述於Beaucage及Iyer Tetrahedron 48：2223-2311(1992)中。
在一些情況下，氧化劑或硫化劑可具有經歷與所要氧化併行之非所要Arbuzov副反應之傾向(Beaucage及Iyer，以上引用)。Arbuzov副反應可產生脫保護之磷醯胺酯，其對隨後去三苯甲基步驟之酸性條件不穩定，且導致寡核苷酸斷裂。在某些實施例中，過氧化氫用作氧化劑以使Arbuzov副反應最小。在某些實施例中， 氧化包括使寡核苷酸與1.5%過氧化氫、3.5%水、20%吡啶及75% THF之溶液接觸。
在一些實施例中，方法包括以下步驟：(a)使連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與：(i)3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物；或(ii)3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯單體；在親核催化劑存在下反應以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯；(c)使該鍵聯氧化；以及(d)重複步驟(a)至(c)直至合成聚核苷酸，其中重複步驟(a)至(c)包括進行步驟(b)(i)至少一次。
在一些實施例中，重複步驟(a)至(c)包括進行步驟(b)(i)兩次或兩次以上。在某些實施例中，重複步驟(a)至(c)包括進行步驟(b)(i)3次或3次以上，諸如4次或4次以上、5次或5次以上、6次或6次以上、7次或7次以上、8次或8次以上、9次或9次以上、10次或10次以上、15次或15次以上、20次或20次以上、或甚至30次或30次以上。在某些實施例中，重複步驟(a)至(c)包含在每個偶合步驟時進行步驟(b)(i)。在某些實施例中，重複步驟(a)至(c)包含在除一個偶合步驟之外的每個偶合步驟時進行步驟(b)(i)。在某些實施例中，重複步驟(a)至(c) 包括進行步驟(b)(ii)一次，且僅一次。在某些實施例中，重複步驟(a)至(c)包括進行步驟(b)(ii)兩次，且僅兩次。
如本文所述，應瞭解術語磷醯胺酯鍵聯意欲涵蓋側氧基-磷醯胺酯鍵聯與硫代磷醯胺酯鍵聯兩者(例如如式I中所描繪)。在方法之某些實施例中，使核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯氧化會產生側氧基-磷醯胺酯鍵聯。在方法之一些實施例中，使核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯氧化包括硫化以產生硫代磷醯胺酯鍵聯。
在方法之一些實施例中，寡核苷酸係藉由式(I)所描述：
其中：各B獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶、或其類似物；各X獨立地為氧或硫；各R3為氫、氟基、羥基、烷氧基、經取代烷氧基或經保護羥基； R6為胺基、羥基、經保護胺基、經保護羥基、-O-L-Z或-NH-L-Z；各L獨立地為視情況選用之連接子；各Z獨立地為H、脂質、支撐物、載體、寡核苷酸、聚合物、多肽、可偵測標記或標籤；R為氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基或磷酸酯保護基；且n為整數1至1000。當R為氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基或磷酸酯保護基時，應瞭解一些式(I)寡核苷酸亦可以鹽形式存在。此等形式只要其可存在即意欲包括在本揭露內容之範疇內。
在式(I)之一些實施例中，各R3為氫。在式(I)之一些實施例中，各R3為氟基。在式(I)之一些實施例中，各R3為羥基。
在式(I)之一些實施例中，R6為胺基。在式(I)之某些實施例中，R6為羥基。
在式(I)之一些實施例中，各R為氫。應瞭解當R為氫時，磷酸酯鍵聯在諸如生理條件之水性條件下可帶電荷。因此，應瞭解式(I)寡核苷酸亦可包括鍵聯之任何適宜鹽形式。因此，式(I)之核苷間鍵聯可呈包括任何適宜相對離子之鹽形式。在式(I)之一些實施例中，各R為烷基或經取代烷基。在式(I)之一些實施例中，各R為芳基或經取代芳基。在式(I)之一些實施例中，各R為磷酸酯保護基。
在式(I)之一些實施例中，Z為H。在式(I)之一些實施例中，Z為脂質(例如，如本文所述)。在某些情況下，脂質為脂肪酸(例如，如本文所述)。在式(I)之一些實施例中，Z為支撐物。在式(I)之一些實施例中，Z為載體。在式(I)之一些實施例中，Z為寡核苷酸。在式(I)之一些實施例中，Z為聚合物。在某些情況下，聚合物為PEG。在式(I)之一些實施例中，Z為多肽。在式(I)之一些實施例中，Z為可偵測標記。在式(I)之一些實施例中，Z為標籤。
在式(I)之一些實施例中，L不存在。
在一些實施例中，各B係獨立地選自A、C、G、T及U或其經保護形式。
在式(I)之某些實施例中，n為在1與500之間，諸如在1與100之間、在1與75之間、在1與50之間、在1與40之間、在1與30之間、在1與20之間、在1與15之間、在1與10之間、或在4與10之間的整數。在某些實施例中，n為在1與100之間，諸如在5與50之間、在10與50之間、在10與40之間、在10與30之間、在10與25之間、在10與20之間、在12與18之間、或在12與16之間的整數。在某些實施例中，n為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。
在方法之某些實施例中，寡核苷酸包含具有與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列，且其 中至少兩個核苷次單元係藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。
在方法之一些實施例中，寡核苷酸包括具有在3個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷連續次單元，諸如在5個與40個之間、在10個與40個之間、在10個與30個之間、在10個與25個之間、在10個與20個之間、在12個與18個之間、或在12個與16個之間的核苷次單元的序列。在某些實施例中，寡核苷酸包括具有10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之連續核苷次單元的序列。在某些實施例中，寡核苷酸包括具有7個或7個以上連續核苷次單元，諸如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個連續核苷次單元之序列。在某些實施例中，寡核苷酸包括具有在11個與18個之間，諸如在11個與16個之間的互補於人類端粒酶之RNA組分之連續核苷次單元的序列。
在方法之一些情況下，N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯係藉由以下結構所描述：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’
其中R係選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基。應瞭解，當R係選自由氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基組成之群時，藉由上式所述之一些核苷間次單元鍵聯亦可以鹽形式存在。此等形式只要其可存在即意欲包括在本揭露內容之範疇內。
在方法之一些情況下，N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯係藉由以下結構所述：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’
其中R為氫。應瞭解對於本文所述之包括該種次單元間鍵聯之任何寡核苷酸，此等寡核苷酸亦可包括鍵聯之任何適宜鹽形式。因此，次單元間鍵聯可呈包括任何適宜相對離子之鹽形式。
在方法之一些實施例中，寡核苷酸包括序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)。在某些實施例中，TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)序列之所有核苷酸間次單元間鍵聯皆為N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯。在某些情況下，序列之所有N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯皆為N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯(例如nps鍵聯)。在某些情況下，序列之所有N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯皆為N3'→P5'側氧基-磷醯胺酯次單元間鍵聯(例如np鍵聯)。
在方法之一些實施例中，聚核苷酸包括3’-胺基或3’-羥基末端基團。在方法之某些實施例中，聚核苷酸包括3’-胺基末端基團。在方法之某些實施例中，聚核苷酸包括3’-羥基末端基團。
在方法之一些實施例中，寡核苷酸係藉由以下結構所描述：
其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯(例如-NH-P(=O)(SH)-O-或其互變異構物)。
應瞭解關於寡核苷酸之所有實施例皆亦可適用於該寡核苷酸之鹽形式。
在方法之一些實施例中，寡核苷酸係藉由以下結構所描述：
或其鹽；其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷 之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯(例如-NH-P(=O)(SH)-O-或其互變異構物或其鹽)。在某些實施例中，組合物包括化合物之醫藥學上可接受之鹽。在某些情況下，組合物包括化合物之鈉鹽。在某些實施例中，組合物包括化合物之二階陽離子鹽，諸如化合物之鎂鹽。在某些實施例中，組合物包括化合物之三價陽離子鹽，諸如化合物之鋁鹽。
在方法之某些實施例中，寡核苷酸係藉由以下結構所述，其中各Mx+獨立地為氫或鹽之任何適宜相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為整數5至13，諸如5、6、7、8、9、10、11、12或13，諸如n為13：
在某些情況下，各x為1。在某些情況下，各x獨立地為1或2。在某些情況下，各x獨立地為1或3。在某些情況下，Mx+為氫。
在方法之某些實施例中，寡核苷酸係藉由以下結構所述，且可包括鹽之任何適宜陽離子相對離子：
在方法之某些實施例中，寡核苷酸係藉由以下結構所述：
在方法之某些實施例中，TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)序列之C11核苷酸殘基來源於3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯單體。就「來源於」而言，其意謂相關殘基係在合成期間經由特定次單元引入。在某些情況 下，TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)序列之T1至A10、A12及A13殘基來源於3'-經保護胺基-二核苷酸硫代磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物。
在一些情況下，方法包括使以下3'-經保護胺基-二核苷酸硫代磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物及3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯單體連續偶合於固相支撐物之末端基團：TA、GG、GT、TA、GA、C及AA。應瞭解，為簡單起見，適用於標的方法之偶合中之經保護亞磷醯胺酯次單元可經由符號X1或X1X2來描繪，其中X1及X2獨立地為經由任何適宜核苷間鍵聯(例如如本文所述)連接之任何適宜核苷。任何適宜合成策略皆可用於標的方法中。以下顯示一些相關策略以說明寡核苷酸目標序列之製備可如何向特定二聚物及/或單體次單元分配。
提供示範性目標寡核苷酸序列TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)之由連續二聚物及/或單體次單元之以下清單表示的示範性逆向合成策略。應瞭解此策略清單並非為詳盡的，且可針對向任何適宜目標寡核苷酸合成之應用加以修改。在一些實施例中，方法包括使以下一個系列之3'-經保護胺基-二核苷酸硫代磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物及/或3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯單體連續偶合於固相支撐物之末端基團：TA、G、G、G、T、T、A、G、A、C、A、A T、AG、G、G、T、T、A、G、A、C、A、A T、A、GG、G、T、T、A、G、A、C、A、A T、A、G、GG、T、T、A、G、A、C、A、A T、A、G、G、GT、T、A、G、A、C、A、A T、A、G、G、G、TT、A、G、A、C、A、A T、A、G、G、G、T、TA、G、A、C、A、A T、A、G、G、G、T、T、AG、A、C、A、A T、A、G、G、G、T、T、A、GA、C、A、A T、A、G、G、G、T、T、A、G、AC、A、A T、A、G、G、G、T、T、A、G、A、CA、A T、A、G、G、G、T、T、A、G、A、C、AA TA、GG、G、T、T、A、G、A、C、A、A TA、G、GG、T、T、A、G、A、C、A、A TA、G、G、GT、T、A、G、A、C、A、A TA、G、G、G、TT、A、G、A、C、A、A TA、G、G、G、T、TA、G、A、C、A、A TA、G、G、G、T、T、AG、A、C、A、A TA、G、G、G、T、T、A、GA、C、A、A TA、G、G、G、T、T、A、G、AC、A、A TA、G、G、G、T、T、A、G、A、CA、A TA、G、G、G、T、T、A、G、A、C、AA T、AG、GG、T、T、A、G、A、C、A、A T、AG、G、GT、T、A、G、A、C、A、A T、AG、G、G、TT、A、G、A、C、A、A T、AG、G、G、T、TA、G、A、C、A、A T、AG、G、G、T、T、AG、A、C、A、A T、AG、G、G、T、T、A、GA、C、A、A T、AG、G、G、T、T、A、G、AC、A、A T、AG、G、G、T、T、A、G、A、CA、A T、AG、G、G、T、T、A、G、A、C、AA T、A、GG、GT、T、A、G、A、C、A、A T、A、GG、G、TT、A、G、A、C、A、A T、A、GG、G、T、TA、G、A、C、A、A T、A、GG、G、T、T、AG、A、C、A、A T、A、GG、G、T、T、A、GA、C、A、A T、A、GG、G、T、T、A、G、AC、A、A T、A、GG、G、T、T、A、G、A、CA、A T、A、GG、G、T、T、A、G、A、C、AA T、A、G、GG、TT、A、G、A、C、A、A T、A、G、GG、T、TA、G、A、C、A、A T、A、G、GG、T、T、AG、A、C、A、A T、A、G、GG、T、T、A、GA、C、A、A T、A、G、GG、T、T、A、G、AC、A、A T、A、G、GG、T、T、A、G、A、CA、A T、A、G、GG、T、T、A、G、A、C、AA T、A、G、G、GT、TA、G、A、C、A、A T、A、G、G、GT、T、AG、A、C、A、A T、A、G、G、GT、T、A、GA、C、A、A T、A、G、G、GT、T、A、G、AC、A、A T、A、G、G、GT、T、A、G、A、CA、A T、A、G、G、GT、T、A、G、A、C、AA T、A、G、G、G、TT、AG、A、C、A、A T、A、G、G、G、TT、A、GA、C、A、A T、A、G、G、G、TT、A、G、AC、A、A T、A、G、G、G、TT、A、G、A、CA、A T、A、G、G、G、TT、A、G、A、C、AA T、A、G、G、G、T、TA、GA、C、A、A T、A、G、G、G、T、TA、G、AC、A、A T、A、G、G、G、T、TA、G、A、CA、A T、A、G、G、G、T、TA、G、A、C、AA T、A、G、G、G、T、T、AG、AC、A、A T、A、G、G、G、T、T、AG、A、CA、A T、A、G、G、G、T、T、AG、A、C、AA T、A、G、G、G、T、T、A、GA、CA、A T、A、G、G、G、T、T、A、GA、C、AA TA、GG、GT、T、A、G、A、C、A、A TA、GG、G、TT、A、G、A、C、A、A TA、GG、G、T、TA、G、A、C、A、A TA、GG、G、T、T、AG、A、C、A、A TA、GG、G、T、T、A、GA、C、A、A TA、GG、G、T、T、A、G、AC、A、A TA、GG、G、T、T、A、G、A、CA、A TA、GG、G、T、T、A、G、A、C、AA TA、G、GG、TT、A、G、A、C、A、A TA、G、GG、T、TA、G、A、C、A、A TA、G、GG、T、T、AG、A、C、A、A TA、G、GG、T、T、A、GA、C、A、A TA、G、GG、T、T、A、G、AC、A、A TA、G、GG、T、T、A、G、A、CA、A TA、G、GG、T、T、A、G、A、C、AA等。TA、GG、GT、TA、G、A、C、A、A TA、GG、GT、T、AG、A、C、A、A TA、GG、GT、T、A、GA、C、A、A TA、GG、GT、T、A、G、AC、A、A TA、GG、GT、T、A、G、A、CA、A TA、GG、GT、T、A、G、A、C、AA等TA、GG、GT、TA、GA、C、A、A TA、GG、GT、TA、G、AC、A、A TA、GG、GT、TA、G、A、CA、A TA、GG、GT、TA、G、A、C、AA等TA、G、GG、TT、AG、AC、A、A TA、G、GG、TT、AG、A、CA、A TA、G、GG、TT、AG、A、C、AA TA、G、G、GT、TA、GA、CA、A TA、G、G、GT、TA、GA、C、AA TA、G、G、GT、TA、GA、CA、A TA、G、G、G、TT、AG、AC、AA TA、G、GG、T、TA、GA、CA、A TA、G、GG、T、TA、GA、C、AA TA、G、GG、T、TA、G、AC、AA等T、A、G、GG、TT、AG、AC、AA T、A、GG、G、TT、AG、AC、AA T、AG、G、G、TT、AG、AC、AA TA、G、G、G、TT、AG、AC、AA T、AG、G、GT、T、AG、AC、AA等T、AG、GG、T、T、AG、AC、AA等T、AG、GG、TT、A、G、AC、AA等T、AG、GG、TT、AG、A、C、AA等T、AG、GG、TT、AG、AC、A、A T、AG、GG、TT、AG、AC、AA TA、G、GG、TT、AG、AC、AA TA、GG、G、TT、AG、AC、AA TA、GG、GT、T、AG、AC、AA TA、GG、GT、TA、G、AC、AA TA、GG、GT、TA、GA、C、AA或TA、GG、GT、TA、GA、CA、A。
在一些實施例中，方法包括使一系列3'-經保護胺基-二核苷酸硫代磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物及/或3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯單體連續偶合於固相支撐物之末端基團，其中至少合成之末次偶合為二聚物偶合。在某些實施例中，倒數第二次偶合及末次偶合為二聚物偶合。在某些情況下，當N為偶數時，方法包括N/2次 二聚物偶合。在某些情況下，當N為偶數時，方法包括N/2-1次二聚物偶合。在某些情況下，當N為偶數時，方法包括N/2-2次二聚物偶合。在某些情況下，當N為偶數時，方法包括N/2-3次二聚物偶合。在某些情況下，當N為偶數時，方法包括N/2-4次二聚物偶合。在某些情況下，當N為偶數時，方法包括N/2-5次二聚物偶合。在某些情況下，當N為奇數時，方法包括N/2-1次二聚物偶合。在某些情況下，當N為奇數時，方法包括N/2-2次二聚物偶合。在某些情況下，當N為奇數時，方法包括N/2-3次二聚物偶合。在某些情況下，當N為奇數時，方法包括N/2-4次二聚物偶合。在某些情況下，當N為奇數時，方法包括N/2-5次二聚物偶合。在某些情況下，當N為奇數時，方法包括N/2-6次二聚物偶合。舉例而言，使以下系列之3'-經保護胺基-二核苷酸硫代磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物及/或3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯單體連續偶合於固相支撐物之末端基團：T、A、G、G、G、T、T、A、G、A、C、AA T、A、G、G、G、T、T、A、G、AC、AA T、A、G、G、G、T、T、A、GA、C、AA T、A、G、G、G、T、T、AG、A、C、AA T、A、G、G、G、T、TA、G、A、C、AA T、A、G、G、G、TT、A、G、A、C、AA T、A、G、G、GT、T、A、G、A、C、AA T、A、G、GG、T、T、A、G、A、C、AA T、A、GG、G、T、T、A、G、A、C、AA T、AG、G、G、T、T、A、G、A、C、AA TA、G、G、G、T、T、A、G、A、C、AA等T、A、G、G、G、T、T、AG、AC、AA T、A、G、G、G、TT、AG、AC、AA T、A、G、GG、TT、AG、AC、AA T、AG、GG、TT、AG、AC、AA TA、G、GG、TT、AG、AC、AA TA、GG、G、TT、AG、AC、AA TA、GG、GT、T、AG、AC、AA TA、GG、GT、TA、G、AC、AA TA、GG、GT、TA、GA、C、AA。
在方法之一些實施例中，3'-經保護胺基-二核苷酸硫代磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物係藉由式X1X2所描述，其中X1及X2係獨立地選自經保護腺嘌呤、經保護胞嘧啶、經保護鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶。
脂質修飾之寡核苷酸
視所選鍵聯之性質而定，多種合成方法可用於使脂質部分L'結合於寡核苷酸，包括Mishra等人，(1995)Biochemica et Biophysica Acta,1264：229-237；Shea等人，(1990)Nucleic Acids Res.18：3777-3783；以及Rump等人，(1998)Bioconj.Chem.9：341-349中所述之方法。其中脂質部分係結合在寡核苷酸之5'或3'末端之化合 物的合成可經由在適當末端使用可與羧酸、酸氯化物、酸酐及活性酯反應之適合官能基，在一些情況下使用胺基來達成。硫醇基團亦可用作官能基(參見Kupihar等人，(2001)Bioorganic and Medicinal Chemistry 9：1241-1247)。具有不同鏈長度之胺基修飾劑與硫醇修飾劑兩者均可購得以用於寡核苷酸合成。具有N3'→P5'磷醯胺酯(例如N3'→P5'硫代磷醯胺酯)鍵聯之寡核苷酸含有3'-胺基(而非見於大多數習知寡核苷酸化學中之3'-羥基)，且因此此等寡核苷酸為脂質基團結合於寡核苷酸之3'末端提供獨特機會。
各種方法可用於使脂質基團連接於具有N3'→P5'磷醯胺酯(例如N3'→P5'硫代磷醯胺酯)化學之寡核苷酸之末端(參見例如表2之3-棕櫚醯胺基-1-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2-O-丁二醯基丙二醇連接子)。對於連接於3'末端，可藉由使完全經保護之固體支撐物結合之寡核苷酸的游離3'-胺基與相應酸酐反應，隨後用氨脫保護並純化來合成結合之化合物。或者，使用諸如碳化二亞胺、HBTU或碘化2-氯-1-甲基吡啶鎓之偶合劑使脂質之羧酸偶合於支撐物結合之寡核苷酸之游離3'-胺基可用於結合脂質基團。此兩種方法在脂質與寡核苷酸之間形成醯胺鍵。亦可使用在鏈延長期間偶合於寡核苷酸之脂質之亞磷醯胺酯衍生物使脂質連接於寡核苷酸。此方法產生連接脂質及寡核苷酸之磷醯胺酯(例如硫代磷醯胺酯)鍵聯(由丙基-棕櫚醯基及2-羥基-丙基-棕櫚醯基化合物示範)。另一方法 涉及完全經保護之支撐物結合之寡核苷酸的游離3'-胺基與適合脂質醛反應，隨後用氰基硼氫化鈉還原，此產生胺鍵聯。
對於連接於5'末端，可使用經改質含脂質固體支撐物，隨後如Pongracz及Gryaznov(1999)中所述在5’至3’方向上合成寡核苷酸來合成寡核苷酸。以下提供經改質支撐物之一實例。在其中n=14之情況下，脂肪酸為棕櫚酸：3-胺基-1,2-丙二醇與棕櫚醯氯反應，隨後二甲氧基三苯甲基化及丁二醯基化提供用於偶合於固體支撐物之中間物。R可為長鏈烷基胺可控孔徑玻璃。
適用於製備寡核苷酸之二聚物
在製備寡核苷酸之方法之一些實施例中，方法包括使支撐物結合之游離3'-末端基團(例如3'-羥基或3'-胺基)與二核苷酸二聚物次單元接觸以形成次單元間鍵聯。一般而言，二核苷酸二聚物之3’經保護，且包括能夠與3’-末端基團偶合之5’-基團。在一些實施例中，二核苷酸二聚物包括5’-亞磷醯胺酯。二核苷酸二聚物可包括3’-經保護胺基或3’-經保護羥基。在一些實施例中，二核苷 酸係藉由式X1X2所描述，其中X1及X2獨立地為經由任何適宜核苷間鍵聯(例如如本文所述)連接之任何適宜核苷(例如A、C、G、T或U或其經保護形式)。二核苷酸可在兩個核苷之間包括任何適宜核苷間鍵聯。適用於二核苷酸二聚物中之相關核苷間鍵聯包括但不限於磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、磷醯胺酯(例如硫代磷醯胺酯)及硫代磷酸酯鍵聯。
在一些情況下，二核苷酸二聚物為3’-經保護-二核苷酸-5'-亞磷醯胺酯二聚物或其合成前驅體，其中該二核苷酸係藉由式X1X2所描述，其中X1及X2係獨立地選自A、C、G、T及U或其經保護形式，且其中X1及X2係經由磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、磷醯胺酯(例如硫代磷醯胺酯)或硫代磷酸酯鍵聯或其經保護形式連接。
在製備寡核苷酸之方法之一些實施例中，方法包括使支撐物結合之游離3'-胺基與3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物接觸以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯。任何適宜3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物或其合成前驅體皆可適用於標的方法中。在一些情況下，二聚物可由以下一個序列表示：AA、AC、AG、AT、AU、CA、CC、CG、CT或CU、GA、GC、GG、GT或GU、TA或UA、TC或UC、TG或UG及TT或UU。在一些情況下，二聚物包括經保護2’-羥基。
在某些實施例中，二核苷酸二聚物為藉由式(II)所描述之二核苷酸硫代磷醯胺酯化合物：
其中B1及B2各自獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶、或其類似物；R11為氫、保護基或亞磷醯胺酯基團；R12為氫或保護基；且R13為氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基或保護基。在一些情況下，B1及/或B2包括核苷鹼基保護基。應瞭解，當R13為氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基或保護基時，藉由式(II)所述之一些二核苷酸二聚物亦可以鹽形式存在。此等形式只要其可存在即意欲包括在本揭露內容之範疇內。
在式(II)之一些實施例中，R11為氫。在式(II)之一些實施例中，R11為保護基。任何適宜保護基皆可適用於式(II)標的二聚物中。在式(II)之一些實施例中，R11為基於乙醯丙酸酯之保護基。在式(II)之一些實施例中， R11為乙醯丙酸酯保護基(即-COCH2CH2COCH3)。在式(II)之一些實施例中，R11為5’-亞磷醯胺酯基團。
在式(II)之一些實施例中，R12為氫。在式(II)之一些實施例中，R12為保護基。在某些實施例中，R12為三苯甲基(例如三苯基甲基(Trt)、單甲氧基三苯甲基(MMT)或二甲氧基三苯甲基(DMT))。在式(II)之一些實施例中，R12為Trt保護基。
在式(II)之一些實施例中，R12為光可裂解保護基。任何適宜光可裂解保護基皆可適用於製備標的二核苷酸二聚物及其合成前驅體。在式(II)之一些實施例中，R12為經取代9-苯基黃嘌呤-9-基保護基，諸如硝基、氟基、甲基、三氟甲基及/或甲氧基取代之9-苯基黃嘌呤-9-基保護基。在式(II)之一些實施例中，R12為9-苯基黃嘌呤-9-基保護基(即9-(9-苯基)氧雜蒽基)。
在式(II)之一些實施例中，R11為乙醯丙醯基保護基，且R12為三苯甲基保護基。
在式(II)之一些實施例中，R13為氫。在式(II)之一些實施例中，R13為保護基。在某些實施例中，R13為2-氰基-乙基。
在某些實施例中，3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物係藉由式(III)所描述：
其中B1及B2各自獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶或其類似物。在一些情況下，B1及/或B2包括核苷鹼基保護基。
在某些實施例中，3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺二聚物係藉由式(III)所述：
其中B1及B2各自獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶或其類似物；且R18為三苯甲基保護基(諸如Trt、DMT或MMT)或9-苯基黃嘌呤-9-基保護基。
在式(II)或(III)之一些實施例中，B1及B2係各自獨立地選自經保護腺嘌呤、經保護胞嘧啶、經保護鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1及B2係各自獨立地選自A(Bz)、A(DMF)、C(Bz)、G(異丁醯基)、T及U。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為A(Bz)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為A(DMF)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為C(Bz)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為G(異丁醯基)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為T或U。在式(II)或(III)之一些實施例中，B2為A(Bz)或A(DMF)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B2為C(Bz)。在式(II)或(III) 之一些實施例中，B2為G(異丁醯基)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B2為T或U。
在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為A(Bz)或A(DMF)且B2為A(Bz)或A(DMF)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為A(Bz)或A(DMF)且B2為C(Bz)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為A(Bz)或A(DMF)且B2為G(異丁醯基)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為A(Bz)或A(DMF)且B2為T或U。
在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為C(Bz)且B2為A(Bz)或A(DMF)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為C(Bz)且B2為C(Bz)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為C(Bz)且B2為G(異丁醯基)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為C(Bz)且B2為T或U。
在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為G(異丁醯基)且B2為A(Bz)或A(DMF)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為G(異丁醯基)且B2為C(Bz)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為G(異丁醯基)且B2為G(異丁醯基)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為G(異丁醯基)且B2為T或U。
在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為T或U且B2為A(Bz)或A(DMF)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為T或U且B2為C(Bz)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為T或U且B2為G(異丁醯基)。在式(II)或(III)之一些實施例中，B1為T或U且B2為T或U。應瞭 解，本文所述之任何式(II)或(III)之實施例皆亦可應用於式(IV)。
本文所述之任何二聚物皆可適合於在標的方法中使用。標的二聚物可根據任何適宜方法自任何適宜核苷單體製備。適用於製備標的核苷二聚物之相關核苷單體包括但不限於描繪於本文揭露之合成流程中之單體16、17、12及13。相關二核苷酸二聚物包括適用於製備標的亞磷醯化二核苷酸二聚物之非亞磷醯化二聚物，諸如適用於製備諸如20之亞磷醯化二核苷酸二聚物之二聚物18及19、或適用於製備諸如15之亞磷醯化二核苷酸二聚物之二聚物14。
在一些實施例中，式(III)及(IV)二聚物係經由以下流程中描繪之方法製備：
其中B1及B2各自獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶或其類似物；R15為氫或胺基保護基；R17為胺基保護基；且R16為羥基保護基。在某些實施例中，R15為氫。在單體16之某些實施例中，R16為矽烷基。在單體16之某些實施例中，R16為TBDMS(第三丁基二甲基矽烷基)。在單體17之某些實施例中，R17為三苯甲基(Trt)。在單體17之某些實施例中，R17為單甲氧基三苯甲基 (MMT)。
在單體17之某些實施例中，R17為二甲氧基三苯甲基(DMT)。在單體17之某些實施例中，R17為9-苯基黃嘌呤-9-基。在二聚物18-20之某些實施例中，R17為三苯甲基(Trt)。在二聚物18-20之某些實施例中，R17為單甲氧基三苯甲基(MMT)。在二聚物18-20之某些實施例中，R17為二甲氧基三苯甲基(DMT)。在二聚物18-20之某些實施例中，R17為9-苯基黃嘌呤-9-基。
在一些實施例中，式(III)及(IV)二聚物係經由以下流程中描繪之方法製備，其中單體13係經由單體12自11製備，且與核苷亞醯胺化物偶合以產生二聚物14，其經轉化成二聚物15：
其中B1及B2各自獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶或其類似物；且R13及R14各自獨立地為保護基。在單體12及13之某些實施例中，R13為三苯甲基。在單體12及13之某些實施例中，R13為9-苯基黃嘌呤-9-基。在二聚物14及15之某些實施例中，R14為三苯甲基。在二聚物14及15之某些實施例中，R14為二甲氧基三苯甲基。在二聚物14及15之某些實施例中，R14為單甲氧基三苯甲基。在二聚物14及15之某些實施例中，R14為9-苯基黃嘌呤-9-基。
適用於根據本文所述之方法製備標的二核苷酸二聚物之相關單體包括但不限於：
其中B為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶或其類似物，且R為氫或烷基(例如甲基)或鹵素(例如溴基)。在某些情況下，B係選自A(Bz)、G(iBu)、T、A(DMF)、C(Bz)或U。
寡核苷酸組合物
除目標寡核苷酸之外，可在寡核苷酸合成期間產生多種非目標寡核苷酸合成產物。可存在於寡核苷酸製劑中之次要產物包括但不限於缺失產物(例如缺乏一或多個核苷殘基之產物)、包括一或多種保護基之產物、終止產物(例如包括加帽寡核苷酸鏈之產物)、缺乏一或多個核苷鹼基之產物、包括部分氧化亞磷醯胺酯鍵聯之產物及包括部分硫化鍵聯之產物。如本文所用，目標寡核苷酸係指相關寡核苷酸序列，其為製備方法之目標產物。如本文所用，術語「非目標產物」及「次要產物」可互換使用，且係指不為目標產物，且可在目標寡核苷酸合成之循環期間及之後存在之任何含寡核苷酸產物。
標的方法提供包括純度提高之目標寡核苷酸之組合物。在一些實施例中，組合物包括50重量%或50重量%以上之目標寡核苷酸，諸如約55重量%或55重量%以上、約60重量%或60重量%以上、約65重量%或65重量%以上、約70重量%或70重量%以上、約75重量%或75重量%以上、約80重量%或80重量%以上、約85重量%或85重量%以上、約90重量%或90重量%以上、或甚至約95重量%或95重量%以上之目標寡核苷酸。在某些實施例中，組合物包括50重量%或50重量%以上之目標寡核苷酸。在某些實施例中，組合物包括55重量%或55重量%以上之目標寡核苷酸。在某些實施例中，組合物包括60重量%或60重量%以上之目標寡核苷酸。在 某些實施例中，組合物包括65重量%或65重量%以上之目標寡核苷酸。在某些實施例中，組合物包括70重量%或70重量%以上之目標寡核苷酸。在某些實施例中，組合物包括75重量%或75重量%以上之目標寡核苷酸。在某些實施例中，組合物包括80重量%或80重量%以上之目標寡核苷酸。在某些實施例中，組合物包括85重量%或85重量%以上之目標寡核苷酸。在某些實施例中，組合物包括90重量%或90重量%以上之目標寡核苷酸。在某些實施例中，組合物包括95重量%或95重量%以上之目標寡核苷酸。
在一些實施例中，標的方法提供95%或95%以上，諸如96%或96%以上、97%或97%以上、98%或98%以上、或甚至98%或98%以上之偶合效率。
在一些實施例中，標的方法提供比僅使用單體次單元進行之對照合成之平均偶合效率高0.5%或0.5%以上，諸如0.75%或0.75%以上、1.0%或1.0%以上、1.25%或1.25%以上、1.5%或1.5%以上、1.75%或1.75%以上、2.0%或2.0%以上、2.5%或2.5%以上、或甚至3.0%或3.0%以上的平均偶合效率。在某些實施例中，標的方法提供96%或大於96%之偶合效率。在某些實施例中，標的方法提供比僅使用單體次單元進行之對照合成之偶合效率高2%或大於2%的偶合效率。
在合成之後，標的組合物可經受一或多個純化步驟(例如HPLC層析、親和層析、離子交換層析、凝 膠過濾等)例如以自目標寡核苷酸移除一或多種次要產物。應瞭解，在標的組合物中，藉由標的製備方法提供之次要產物之量降低及/或目標寡核苷酸之量增加可指在合成後即刻以及在已進行任何進一步純化或分離步驟(例如HPLC層析)之前獲得之此等量及純度。因此，在一些情況下，標的組合物可稱為合成製劑，例如未純化之合成製劑。就未純化而言，其意謂未已對組合物進行層析純化步驟。層析純化係指包括使目標聚核苷酸吸附於層析支撐物，以及隨後溶離目標聚核苷酸之任何適宜純化方法。在一些情況下，層析純化係指反相層析純化。
標的方法提供包括降低量之一或多種次要產物之組合物。就降低量而言，其意謂相對於對照合成，例如其中寡核苷酸係僅使用單體偶合製備之合成，次要產物相對於目標寡核苷酸，在組合物中之以重量計之量得以降低。在一些實施例中，降低量之次要產物為目標寡核苷酸之以重量計之量的約20%或小於20%，諸如目標寡核苷酸之以重量計之量的約15%或小於15%、約10%或小於10%、或約5%或小於5%。在某些實施例中，降低量之次要產物為目標寡核苷酸之以重量計之量的20%或小於20%，諸如目標寡核苷酸之以重量計之量的15%或小於15%、10%或小於10%、9%或小於9%、8%或小於8%、7%或小於7%、6%或小於6%、5%或小於5%、4%或小於4%、3%或小於3%、2%或小於2%、或甚至1%或小於1%。在某些實施例中，次要產物為(N-x)產物。
標的製備方法可提供一或多種(N-x)產物相對於相關目標寡核苷酸之量降低之組合物，其中x為整數1至N-1，且N為目標寡核苷酸中之核苷殘基之數目。因此，(N-1)產物可指相較於目標寡核苷酸(例如N產物)，缺乏任一核苷酸殘基之任何及所有寡核苷酸產物。因此，(N-2)產物係指相較於目標寡核苷酸(例如N產物)，缺乏任何兩個核苷酸殘基之任何及所有寡核苷酸產物。在某些實施例中，次要產物為(N-1)產物。在某些實施例中，次要產物為(N-2)產物。在某些實施例中，次要產物為(N-3)產物。在某些實施例中，次要產物為(N-4)產物。在某些實施例中，次要產物為(N-5)產物。在某些實施例中，次要產物為(N-6)產物。在某些實施例中，次要產物為(N-7)產物。
在某些實施例中，一或多種(N-x)產物相對於相關目標寡核苷酸之量降低的本文所述之任何組合物為未純化的。
在一些實施例中，標的組合物包括(N-1)產物與目標寡核苷酸產物之低比率。在一些情況下，以(N-1)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，低比率為小於(2.0 x N)份至100份，其中N係指目標寡核苷酸序列中之核苷酸殘基之數目。在某些實施例中，以(N-1)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，比率為小於(1.9 x N)份至100份，諸如以(N-1)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，小於(1.8 x N)份至100、小於(1.7 x N)份至100、小於(1.6 x N)份至 100、小於(1.5 x N)份至100、小於(1.4 x N)份至100、小於(1.3 x N)份至100，小於(1.2 x N)份至100、小於(1.1 x N)份至100、小於(1.0 x N)份至100、小於(0.9 x N)份至100、小於(0.8 x N)份至100、小於(0.7 x N)份至100、小於(0.6 x N)份至100、小於(0.5 x N)份至100、小於(0.4 x N)份至100、小於(0.3 x N)份至100、小於(0.2 x N)份至100、或甚至小於(0.1 x N)份至100份。在某些實施例中，以(N-1)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，標的組合物包括小於(1.5 x N)份至100份之低比率。在某些實施例中，以(N-1)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，標的組合物包括小於(1.2 x N)份至100份之低比率。在某些實施例中，以(N-1)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，標的組合物包括小於(1.0 x N)份至100份之低比率。在某些實施例中，以(N-1)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，標的組合物包括小於(0.5 x N)份至100份之低比率。
在一些實施例中，標的組合物包括(N-2)產物與目標寡核苷酸產物之低比率。在一些情況下，以(N-2)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，低比率為小於(2.0 x N)份至100份，其中N係指目標寡核苷酸序列中之核苷酸殘基之數目。在某些實施例中，以(N-2)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，比率為小於(1.9 x N)份至100份，諸如以(N-2)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，小於(1.8 x N)份至100、小於(1.7 x N)份至100、小於(1.6 x N)份至100、小於(1.5 x N)份至100、小於(1.4 x N)份至100、小 於(1.3 x N)份至100、小於(1.2 x N)份至100、小於(1.1 x N)份至100、小於(1.0 x N)份至100、小於(0.9 x N)份至100、小於(0.8 x N)份至100、小於(0.7 x N)份至100、小於(0.6 x N)份至100、小於(0.5 x N)份至100、小於(0.4 x N)份至100、小於(0.3 x N)份至100、小於(0.2 x N)份至100、或甚至小於(0.1 x N)份至100份。在某些實施例中，以(N-2)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，標的組合物包括小於(1.5 x N)份至100份之低比率。在某些實施例中，以(N-2)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，標的組合物包括小於(1.2 x N)份至100份之低比率。在某些實施例中，以(N-1)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，標的組合物包括小於(1.0 x N)份至100份之低比率。在某些實施例中，以(N-2)產物相對於目標寡核苷酸之重量計，標的組合物包括小於(0.5 x N)份至100份之低比率。
在一些實施例中，標的組合物包括之(N-1)產物之量為組合物中之總非目標寡核苷酸的20%或小於20%，諸如總非目標寡核苷酸之15%或小於15%、10%或小於10%、或甚至5%或小於5%。
可使用本文所述之方法製備廣泛多種寡核苷酸組合物中之任一者。多種類別及類型之寡核苷酸係為使用標的方法(例如如本文所述)進行製備所關注。適於根據標的方法製備之寡核苷酸包括但不限於反義寡核苷酸、RNA寡核苷酸、siRNA寡核苷酸、RNAi寡核苷酸、DNA適體、微小RNA及其類似物。
與端粒酶之RNA組分互補之寡核苷酸
本揭露內容之態樣包括包括與人類端粒酶之RNA組分互補之寡核苷酸的化合物及組合物及其製備方法。化合物可以高效能抑制細胞中之端粒酶活性，且具有細胞攝取特徵。
如上所概述，標的方法提供合成之非目標寡核苷酸產物之量降低。在某些情況下，標的方法提供合成之目標寡核苷酸產物之量增加。在一些實施例中，標的方法提供製備一或多種(N-x)產物相對於相關目標寡核苷酸之量降低之組合物。表1闡述一些非目標寡核苷酸產物之相關量。
在某些實施例中，一或多種(N-x)產物相對於相關目標寡核苷酸之量降低的本文所述之任何組合物為未純化的。
在某些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於(2.0 x N)重量份至100重量份之(N-1)產物，其中該化合物包括具有含N個與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列之聚核苷酸，其中至少兩個核苷次單 元係藉由N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。在某些實施例中，以(N-1)產物相對於N產物之重量計，比率為小於小於(1.9 x N)份至100份，諸如以(N-1)產物相對於N產物之重量計，小於(1.8 x N)份至100、小於(1.7 x N)份至100、小於(1.6 x N)份至100、小於(1.5 x N)份至100、小於(1.4 x N)份至100、小於(1.3 x N)份至100、小於(1.2 x N)份至100、小於(1.1 x N)份至100、小於(1.0 x N)份至100、小於(0.9 x N)份至100、小於(0.8 x N)份至100、小於(0.7 x N)份至100、小於(0.6 x N)份至100、小於(0.5 x N)份至100、小於(0.4 x N)份至100、小於(0.3 x N)份至100、小於(0.2 x N)份至100、或甚至小於(0.1 x N)份至100份。
在一些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每4重量份1重量份之(N-1)產物(諸如相對於化合物，小於每5重量份1重量份、小於每6重量份1重量份、小於每7重量份1重量份、小於每8重量份1重量份、小於每9重量份1重量份、小於每10重量份1重量份、小於每15重量份1重量份、小於每20重量份1重量份、小於每25重量份1重量份、小於每50重量份1重量份、小於每100重量份1重量份之(N-1)產物)，其中該化合物包含具有含10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列之聚核苷酸，其中至少兩個核苷次單元係藉由N3'→P5'硫代磷醯胺酯或側氧基磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。在某些實施例中，聚核苷酸具有含 10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元，諸如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個或20個以上核苷次單元的序列。
在某些情況下，聚核苷酸包括含13個或13個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元，諸如15個或15個以上、20個或20個以上、30個或30個以上、50個或50個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列。
在某些實施例中，聚核苷酸包括具有7個或7個以上互補於人類端粒酶之RNA組分之核苷次單元，諸如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個互補於人類端粒酶之RNA組分之核苷次單元的序列。在某些實施例中，聚核苷酸包括具有在11個與18個之間的互補於人類端粒酶之RNA組分之核苷次單元，諸如在11個與16個之間的互補於人類端粒酶之RNA組分之連續核苷次單元的序列。
在一些實施例中，聚核苷酸包括在3個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補之連續核苷次單元，諸如在5個與40個之間、在10個與40個之間、在10個與30個之間、在10個與25個之間、在10個與20個之間、或在12個與15個之間的核苷次單元。在某些實施例中，寡核苷酸包括具有10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之連續核苷次單元的序列。在某些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每10重量份1 重量份之(N-1)產物。在某些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每20重量份1重量份之(N-1)產物。在某些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每25重量份1重量份之(N-1)產物。在某些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每30重量份1重量份之(N-1)產物。在某些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每50重量份1重量份之(N-1)產物。
在一些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每4重量份1重量份之任何(N-x)產物，諸如相對於化合物，小於每5重量份1重量份、小於每6重量份1重量份、小於每7重量份1重量份、小於每8重量份1重量份、小於每9重量份1重量份、小於每10重量份1重量份、小於每20重量份1重量份、小於每25重量份1重量份、小於每30重量份1重量份、或甚至小於每50重量份1重量份之任何(N-x)產物。
在一些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於總共每100重量份40重量份之(N-x)含聚核苷酸產物，諸如相對於化合物，小於每100重量份35重量份、小於每100重量份30重量份、小於每100重量份25重量份、小於每100重量份20重量份、或甚至小於每100重量份15重量份之(N-x)含聚核苷酸產物。
在一些實施例中，組合物具有相對於化合物，至少每100重量份5重量份之(N-2)及(N-3)產物，諸如相對於化合物，至少每100重量份10重量份、至少每 100重量份12重量份、至少每100重量份14重量份、至少每100重量份15重量份、至少每100重量份20重量份、至少每100重量份30重量份、或至少每100重量份40重量份之(N-2)及(N-3)產物。
在一些實施例中，組合物具有(N-x)含聚核苷酸產物之以下概況：相對於N產物，小於每4重量份1重量份之(N-1)產物；及相對於N產物，至少每100重量份10重量份之(N-2)及(N-3)產物。
在某些實施例中，寡核苷酸N產物包含在(N-1)產物中不存在之3’-末端核苷次單元。
寡核苷酸化合物可藉由下式所描述：O-(x'-L')n
其中O表示包括具有與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列之寡核苷酸，x'為視情況選用之連接子基團，L'表示脂質部分，且n為整數1-5。
因此，化合物之設計需要選擇兩種實體O及L'，以及確定此等實體之間的結構鍵聯，此可涉及視情況選用之連接子基團x'。
在一些實施例中，寡核苷酸化合物可藉由下式所述：O-(x'-L')n
其中O表示包括具有互補於人類端粒酶之RNA組分 之核苷次單元的序列之寡核苷酸，x'為視情況選用之連接子基團，L'表示脂質部分，且n為1，諸如式(I)寡核苷酸或其鹽，其中在式(I)中，Z為脂質部分，L為視情況選用之連接子，且B基團對應於具有互補於人類端粒酶之RNA組分之核苷次單元的序列。
寡核苷酸組分O可視為化合物之「效應物」組分，因為此組分藉由結合端粒酶之RNA組分來實現對端粒酶之抑制。因此，選擇O之序列以使其包括與端粒酶RNA之序列(其顯示於SEQ ID NO：1中)互補之區域。在理論上可使與端粒酶RNA組分互補之區域靶向端粒酶RNA之任何部分，但端粒酶RNA之特定區域為抑制性寡核苷酸之較佳目標。一個較佳目標區域為跨越SEQ ID NO：1之核苷酸30-67之區域，其包括「模板區域」，亦即具有跨越SEQ ID NO：1之核苷酸46-56之序列5'-CUAACCCUAAC-3'(SEQ ID NO：2)的含11個核苷酸之區域。模板區域起指定端粒酶添加至染色體末端，且為端粒酶之活性所必需之端粒重複序列的作用(參見Chen等人，Cell 100：503-514,2000；Kim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 98(14)：7982-7987,2001)。因此，含有包含與模板區域之全部或一部分互補之序列的寡核苷酸部分之本發明化合物為特別較佳的。另一較佳目標區域為跨越hTR之核苷酸137-179之區域(參見Pruzan等人，Nucl.Acids Research,30：559-588,2002)。在此區域內，跨越141-153之序列為較佳目標。PCT公開案WO 98/28442描述長度 為至少7個核苷酸之寡核苷酸抑制端粒酶之用途，其中寡核苷酸經設計以互補於hTR序列之在模板區域外部之可及部分，包括hTR之核苷酸137-196、290-319、及350-380。
O之靶向hTR序列之區域較佳精確互補於相應hTR序列。儘管可容忍錯配，但在某些情況下，預期其會降低所得寡核苷酸結合物之特異性及活性。在特定實施例中，因此選擇寡核苷酸O之鹼基序列以包括具有至少5個與端粒酶RNA精確互補之核苷酸之序列，且若採用長度增加之互補序列，諸如至少8個、至少10個、至少12個、至少13個或至少15個與端粒酶RNA精確互補之核苷酸，則可獲得對端粒酶之抑制作用增強。在其他實施例中，寡核苷酸之序列包括具有至少5個至20個、至少8個至20個、至少10個至20個、或至少10個至15個與端粒酶RNA序列精確互補之核苷酸的序列。當寡核苷酸O之全長經選擇以與端粒酶RNA互補時，可獲得最佳端粒酶抑制活性。然而，寡核苷酸組分之全長不必精確互補於目標序列，且寡核苷酸序列可包括不互補於目標序列之區域。可添加此等區域例如以對化合物賦予其他性質，該等區域諸如有助於純化之序列。若寡核苷酸組分O欲包括不與目標序列互補之區域，則此等區域可位於5'末端或3'末端中之一者或兩者。在使具有精確互補性之區域靶向模板區域之情況下，可用在5'末端接合有端粒酶樣(富含G)序列之具有精確互補性之短(5-8個核苷酸)區域達成有效 端粒酶抑制。
與人類端粒酶RNA互補，且可作為寡核苷酸組分O之一部分包括，或可用作整個寡核苷酸組分O之示範性序列包括以下：
hTR互補序列(美國公開案2012329858之寡核苷酸序列SEQ ID NO：1之區域)
(SEQ ID NO：1)
GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGCAGG 137-166(SEQ ID NO：6)
GTGGAAGGCGGCAGG 137-151(SEQ ID NO：7)
GGAAGGCGGCAGG 137-149(SEQ ID NO：8)
GTGGAAGGCGGCA 139-151(SEQ ID NO：9)
GTGGAAGGCGG 141-151(SEQ ID NO：10)
CGGTGGAAGGCGG 141-153(SEQ ID NO：11)
ACGGTGGAAGGCG 142-154(SEQ ID NO：12)
AACGGTGGAAGGCGGC 143-155(SEQ ID NO：13)
ATGAACGGTGGAAGGCGG 144-158(SEQ ID NO：14)
ACATTTTTTGTTTGCTCTAG 160-179(SEQ ID NO：15)
TAGGGTTAGACAA 42-54(SEQ ID NO：3)
GTTAGGGTTAG 46-56(SEQ ID NO：4)
GTTAGGGTTAGAC 44-56(SEQ ID NO：16)
GTTAGGGTTAGACAA 42-56(SEQ ID NO：17)
GGGTTAGAC 44-52
CAGTTAGGG 50-58
CCCTTCTCAGTT 54-65(SEQ ID NO：18)
CGCCCTTCTCAG 56-67(SEQ ID NO：19)
在一些實施例中，聚核苷酸包含選自由以下組成之群之序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)；TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)；及CAGTTAGGGTTAG (SEQ ID NO：5)。
O組分之合成中使用之核苷間鍵聯的類型可選自任何可用寡核苷酸化學，包括但不限於磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、P3'→N5'磷醯胺酯、N3'→P5'磷醯胺酯、N3'→P5'硫代磷醯胺酯及硫代磷酸酯鍵聯。
在一些實施例中，寡核苷酸組分O具有至少一個N3'→P5'磷醯胺酯(例如N3'→P5'硫代磷醯胺酯)鍵聯。在某些實施例中，與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元係皆藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。在某些情況下，N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯為N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯。在某些情況下，N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯為N3'→P5'側氧基-磷醯胺酯次單元間鍵聯。
在某些情況下，N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯具有以下結構：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’
其中R係選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基。應瞭解包括藉由上式所述之次單元間鍵聯之一些寡核苷酸組分O亦可以鹽形式存在，其中R係選自由氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基組成之群。此等形式只要其可存在即意欲包括在本揭露內容之範疇內。
在一些情況下，N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯係藉由以下結構所述： 3'-NH-P(S)(OR)-O-5’
其中R為氫。應瞭解對於本文所述之包括該種次單元間鍵聯之任何寡核苷酸組分O，此等寡核苷酸組分O亦可包括鍵聯之任何適宜鹽形式。因此，次單元間鍵聯可呈包括任何適宜相對離子之鹽形式。
本發明化合物在於細胞中產生端粒酶抑制方面比非結合於脂質組分之相應寡核苷酸更有效。咸信脂質組分L'起增強細胞攝取化合物之作用，特別是在促進穿過細胞膜方面。儘管此發生所依之機制尚未完全闡明，但一種可能性為脂質組分可促進化合物與細胞膜結合成單一分子或聚集體(微胞)形式，隨後進行內化。然而，對精確機制之理解不為利用本發明所需。
脂質組分可為相較於未修飾寡核苷酸，提供細胞攝取增強之任何脂質或脂質衍生物。較佳脂質為烴、脂肪(例如甘油酯、脂肪酸及脂肪酸衍生物，諸如脂肪醯胺)及固醇。當脂質組分為烴時，L組分可為經取代或未經取代之環烴或脂族直鏈或分支烴，該烴可為飽和或不飽和的。較佳實例為完全飽和或多不飽和之直鏈未分支烴。烴鏈之長度可自C2-C30變化，但最佳端粒酶抑制可用C8-C22碳鏈獲得。以下列出飽和烴(烷)之較佳實例：系統名稱/碳鏈十四烷 C14H30十五烷 C15H32十六烷 C16H34 十七烷 C17H36十八烷 C18H38十九烷 C19H40二十烷 C20H42
亦可選擇烴之單不飽和及多不飽和形式(烯及多烯，諸如二烯及三烯)，其中具有一個至三個雙鍵之化合物為較佳的，但可採用具有更多雙鍵之化合物。亦可利用炔(含有一或多個參鍵)及烯炔(參鍵及雙鍵)。
烴之經取代形式可用於本發明化合物中，其中在活體內及在活體外為惰性之取代基為較佳的。一特別較佳之取代基為氟。多氟化烴之示範性通用結構包括：CF3(CF2)n-(CH2)m-其中m為至少1，較佳至少2，且n=1-30，諸如氟十三烷：CF3(CF2)9(CH2)3；以及CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)c-其中a、b及c獨立地為1-30。
其他適合脂質組分包括簡單脂肪酸及脂肪酸衍生物、甘油酯以及更複雜脂質，諸如固醇，例如膽固醇。脂肪酸及其衍生物可為完全飽和的或單不飽和或多不飽和的。碳鏈之長度可自C2-C30變化，但最佳端粒酶抑制可用C8-C22碳鏈獲得。以下列出飽和脂肪酸之較佳實例：系統名稱/俗名/碳鏈十四酸 肉豆蔻酸 14：0十六酸 棕櫚酸 16：0十八酸 硬脂酸 18：0 二十酸 花生酸 20：0
亦可採用脂肪酸之單不飽和及多不飽和形式，其中具有一個至三個雙鍵之化合物為較佳的，但亦可採用具有更多雙鍵之化合物。可採用之常見單不飽和及多不飽和脂肪酸之實例包括：系統名稱/俗名/碳鏈順式-9-十六酸 棕櫚油酸 16：1(n-7)順式-6-十八酸 芹子酸 18：1(n-12)順式-9-十八酸 油酸 18：1(n-9)9,12-十八碳二烯酸 亞麻油酸 18：2(n-6)6,9,12-十八碳三烯酸 γ-亞麻油酸 18：3(n-6)9,12,15-十八碳三烯酸 α-亞麻油酸 18：3(n-3)5,8,11,14-二十碳四烯酸 花生油酸 20：4(n-6)
在碳鏈中具有一或多個參鍵之脂肪酸以及分支脂肪酸亦可用於本發明化合物中。脂肪酸之經取代形式可用於本發明化合物中。如同烴基團一般，在活體內及在活體外為惰性之取代基為較佳的，其中氟為特別較佳的。適用於本發明中之脂肪酸之多氟化衍生物的示範性通用結構為：CF3(CF2)n-(CH2)mCO-其中m為至少1，較佳至少2，且n=1-30；以及CH3(CH2)a(CF2)b(CH2)cCO-其中a、b及c獨立地為1-30。
在一些情況下，在一個與五個之間的L'組分(n=1-5)係視情況經由連接子共價連接於O組分。更通常地，利用1個或2個L'組分(n=1或2)。當一個以上L'組 分連接於O組分時，各L'組分係獨立地加以選擇。
應瞭解描述為具有指定烴作為L'部分之本發明化合物及描述為具有指定脂肪酸(具有與指定烴相同之碳原子數目)之化合物係密切相關的，且僅在使L'部分接合於寡核苷酸之鍵結之性質方面而在結構上不同，此又為用於產生化合物之合成程序之結果。舉例而言，且如以下更詳細所描述，當合成具有結合於寡核苷酸(具有磷醯胺酯或硫代磷醯胺酯核苷間鍵聯)之3'-胺基末端之L'部分的化合物時，使用脂肪酸之醛形式(脂肪醛)作為起始物質導致在脂質鏈與寡核苷酸之間形成胺鍵聯，以使脂質基團以烴形式呈現。相反，使用相同脂肪酸之羧酸、酸酐或酸氯化物形式導致形成醯胺酯鍵聯，以使脂質基團以脂肪酸衍生物形式呈現，詳言之在此情況下以脂肪醯胺形式呈現(如以上定義章節中所指示，為簡單起見，術語「脂肪酸」在描述結合之L'基團時在本文中廣泛用於包括脂肪酸衍生物，包括脂肪醯胺)。此說明於描繪磷醯胺酯寡核苷酸之3'-胺基末端接合於C14脂質組分之以下示意圖中。在示意圖A中，L'為十四酸(肉豆蔻酸)，其中L'基團與O基團之間的連接為醯胺。在示意圖B中，L'為十四烷，且L'基團與O基團之間的連接為胺。
O組分與L'組分之間的鍵聯可為直接鍵聯，或可經由視情況選用之連接子部分，例如x'或式(I)之視情況選用之連接子L。連接子基團可用於促進化合物之化學合成。無論連接子基團是否用於介導O組分及L'組分之結合，在寡核苷酸組分O上皆存在L'組分可適宜地結合之多個位點。適合鍵聯點包括寡核苷酸之5'及3'末端、一或多個糖環、核苷間骨架及核苷鹼基。在一些情況下，L'部分係連接於寡核苷酸之3'或5'末端。
若L'組分欲連接於3'末端，則可直接連接於3'取代基，在較佳磷醯胺酯及硫代磷醯胺酯寡核苷酸之情況下，該3'取代基為3'-胺基，且在諸如習知磷酸二酯寡核苷酸之其他情況下，該3'取代基為3-羥基。或者，L'部分可經由3'-連接之磷酸酯基團連接，其中十六烷烴係經由O-烷基連接子連接於硫代磷醯胺酯寡核苷酸之3'磷酸酯基。若L'部分欲連接於5'末端，則其可經由5'-連接之磷酸酯基團連接。與O部分上之鹼基連接可經由任何適合原子達成，例如與鳥苷之N2胺基連接。當n>1以使複數個脂質部分欲連接於O組分時，個別選擇之L'組分可連接在任何適合位點處。舉例而言，一個L'基團可連接於各末端，各個L'基團可連接於鹼基，或兩個或兩個以上L'基團可連接在一個末端。
視情況選用之連接子組分x可用於接合化合物之O組分及L組分。應理解，視情況選用之連接子(例如，x'或式(I)之L)可經由末端磷酸之基連接至聚核苷酸 (例如，O)，例如3’-連接或5’-連接之磷酸酯基。若欲採用連接子，則將其併入如本文所述之合成程序中。適合連接子基團之實例包括分別可由以下通用結構描繪之胺基甘油及O-烷基甘油型連接子：
其中R'=H、OH、NH2或SH；Y=O、S或NR；R=H、烷基或經取代烷基；且n及m獨立地為在1-18之間的整數。
適合連接子之具體實例為胺基甘油連接子，其中R'=OH，Y=O，且m及n各自為1：
雙-胺基甘油連接子，其中R'=OH，Y=NH，且m及n各自為1：
以及O-烷基甘油連接子，其中R=H：
可根據標的方法製備之示範性脂質修飾之寡核苷酸包括Gryaznov等人之美國申請案US20120329858「Modified oligonucleotides for telomerase inhibition」之圖1(例如圖1A-1DD)中所述的彼等化合物，該申請案之揭 露內容以全文引用的方式併入本文中。
在某些實施例中，組合物包括藉由以下結構所描述之化合物：
其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯(例如-NH-P(=O)(SH)-O-)。
應瞭解關於化合物之所有實施例皆亦可適用於該化合物之鹽形式。
在某些實施例中，組合物包括藉由以下結構所描述之化合物：
或其鹽；其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯(例如-NH-P(=O)(SH)-O-或其互變異構物或其鹽)。在某些實施例中，組合物包括化合物之醫藥學上可接受之鹽。在某些情況下，組合物包括化合物之鈉鹽。在某些實施例中，組合物包括化合物之二階陽離子鹽，諸如化合物之鎂鹽。在某些實施例中，組合物包括化合物之三價陽離子鹽，諸如化合物之鋁鹽。
在某些實施例中，組合物包括藉由以下結構所述之寡核苷酸，其中各Mx+獨立地為氫或鹽之任何適宜相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為整數5至13，諸如5、6、7、8、9、10、11、12或13，諸如n為13：
在某些情況下，各x為1。在某些情況下，各x獨立地為1或2。在某些情況下，各x獨立地為1或3。在某些情況下，Mx+為氫。
在某些實施例中，組合物包括藉由以下結構所述之寡核苷酸，且可包括鹽之任何適宜陽離子相對離子：
在某些實施例中，組合物包括藉由以下結構所描述之化合物：
亦提供包括含寡核苷酸化合物之化合物活性醫藥成分組合物。如本文所用，活性醫藥成分係指使用標的製備方法產生之組合物，其中該組合物可視情況在合成後經受一或多個進一步純化步驟。一般而言，活性醫藥成 分為適於調配成藥物組合物之組合物。在一些情況下，在合成後不純化化合物活性醫藥成分組合物，以使組合物之含寡核苷酸組分反映在寡核苷酸合成期間產生之彼等產物。
在一些實施例中，化合物活性醫藥成分具有小於9重量%之(N-1)產物，其中化合物包含具有含10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元之序列的聚核苷酸，其中至少兩個核苷次單元係藉由N3'→P5'硫代磷醯胺酯或側氧基磷醯胺酯次單元間鍵聯(例如如本文所述)接合。
在一些實施例中，化合物活性醫藥成分具有小於9重量%之(N-1)產物，其中化合物或其醫藥學上可接受之鹽包含具有含10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元之序列的聚核苷酸，其中至少兩個核苷次單元係藉由N3'→P5'硫代磷醯胺酯或側氧基磷醯胺酯次單元間鍵聯(例如如本文所述)接合。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元係皆藉由N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯具有以下結構：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’
其中R係選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基。當R係選自由 氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基組成之群時，應瞭解藉由上式所述之一些次單元間鍵聯亦可以鹽形式存在。此等形式只要其可存在即意欲包括在本揭露內容之範疇內。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯具有以下結構：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’
其中R為氫。應瞭解對於本文所述之包括該種次單元間鍵聯之任何化合物活性醫藥成分，此等化合物活性醫藥成分亦可包括鍵聯之任何適宜醫藥學上可接受之鹽形式。因此，次單元間鍵聯可呈包括鹽之任何適宜相對離子之醫藥學上可接受之鹽形式。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，聚核苷酸包含在10個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補之連續核苷次單元(例如如本文所述)。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，聚核苷酸包含選自由以下組成之群之序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)；TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)；及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，聚核苷酸包括3’胺基或3’-羥基末端基團。在化合物活性醫藥成分之某些實施例中，聚核苷酸包括3’胺基末端基團。在化合物活性醫藥成分之某些實施例中，聚核苷酸包括3’-羥基末端基團。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，化合物具有結構：
其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯-NH-P(=O)(SH)-O-。
應瞭解關於化合物活性醫藥成分之所有實施例皆亦可適用於該化合物活性醫藥成分之鹽形式。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，化合物具有結構：
或其醫藥學上可接受之鹽； 其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯-NH-P(=O)(SH)-O-(或如本文所述的其互變異構物或其醫藥學上可接受之鹽)。在化合物活性醫藥成分之某些實施例中，組合物包括化合物之鈉鹽。在某些實施例中，組合物包括化合物之二階陽離子鹽，諸如化合物之鎂鹽。在某些實施例中，組合物包括化合物之三價陽離子鹽，諸如化合物之鋁鹽。
在化合物活性醫藥成分之某些實施例中，化合物係藉由以下結構所述，其中各Mx+獨立地為氫或鹽之任何適宜相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為整數5至13，諸如5、6、7、8、9、10、11、12或13，諸如n為13：
在某些情況下，各x為1。在某些情況下，各x獨立地為1或2。在某些情況下，各x獨立地為1或3。在某些情況下，Mx+為氫。
在化合物活性醫藥成分之某些實施例中，化合物係藉由以下結構所述，且可包括鹽之任何適宜陽離子相對離子：
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，化合物係藉由以下結構所描述：
在一些實施例中，化合物活性醫藥成分具有小於9重量%之(N-1)產物，諸如小於8重量%、小於7重量%、小於6重量%、小於5重量%、小於4重量%、小於3重量%、小於2重量%、或甚至小於1重量%之(N-1)產 物。在某些實施例中，化合物活性醫藥成分具有小於5重量%之(N-1)產物。在某些實施例中，化合物活性醫藥成分具有小於2重量%之(N-1)產物。
在一些實施例中，活性醫藥成分具有小於9重量%之任何(N-x)產物，諸如小於8重量%、小於7重量%、小於6重量%、小於5重量%、小於4重量%、小於3重量%、小於2重量%、或甚至小於1重量%之任何(N-x)產物。
在一些實施例中，化合物活性醫藥成分具有小於總共9重量%之(N-x)含聚核苷酸產物，諸如小於總共8重量%、小於總共7重量%、小於總共6重量%、小於總共5重量%、小於總共4重量%、小於總共3重量%、小於總共2重量%、或甚至小於總共1重量%之(N-x)含聚核苷酸產物。
在一些實施例中，化合物活性醫藥成分具有(N-x)含聚核苷酸產物之以下概況：相對於N產物，小於每4重量份1重量份之(N-1)產物；及相對於N產物，至少每100重量份10重量份之(N-2)及(N-3)產物。
調配物
亦提供包括寡核苷酸組合物(例如如本文所述)之醫藥組合物。寡核苷酸組合物(例如如本文所述)亦可調 配成醫藥組合物以抑制與目標基因之過度表現相關之疾病病狀中的細胞中之轉錄或轉譯。
在一些實施例中，醫藥組合物包括於醫藥學上可接受之賦形劑中調配之寡核苷酸組合物(例如如本文所述)。在某些實施例中，寡核苷酸組合物為具有小於9重量%之(N-1)產物之化合物活性醫藥成分，其中化合物包含具有含10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元之序列的聚核苷酸，其中至少兩個核苷次單元係藉由N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。
本發明提供可特異性且有效抑制端粒酶活性，且可因此用於抑制諸如腫瘤細胞之端粒酶陽性細胞之增殖的化合物。極廣泛多種癌細胞已顯示呈端粒酶陽性，包括來自以下癌症之細胞：皮膚癌、結締組織癌、脂肪癌、乳癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、腎癌、膀胱癌、結腸癌、前列腺癌、中樞神經系統(CNS)癌、視網膜癌及血液學腫瘤(諸如骨髓瘤、白血病及淋巴瘤)。相關癌症包括但不限於骨髓纖維化、血小板增多症、脊髓發育不良症候群及骨髓性白血病。
標的化合物可用於治療血液學惡性腫瘤及骨髓增生性病症，包括但不限於原發性血小板增多症(ET)、真性紅細胞增多症(PV)、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓纖維化(MF)、慢性中性粒細胞白血病、慢性嗜酸性白血病及急性骨髓性白血病(AML)。標的化合物可用於治療骨髓發育不良症候群，其包括諸如以下之疾病：難治性貧血、 伴有母細胞過量之難治性貧血、伴有多譜系發育不良之難治性血細胞減少症、伴有單譜系發育不良之難治性血細胞減少症及慢性骨髓單核細胞性白血病(CMML)。標的化合物可用於治療血液學疾病，諸如2013年11月15日申請之PCT專利申請案第PCT/US13/070437號中所述之疾病，該申請案之揭露內容以全文引用的方式併入本文中。
因此，本文提供之化合物廣泛適用於治療廣泛範圍之惡性腫瘤。更重要的是本發明化合物可有效提供在較高程度上區分惡性細胞與正常細胞之治療，從而避免伴隨依賴於不加區分地殺死分裂細胞之藥劑之大多數當前化學治療方案存在的許多不良副作用。此外，本發明化合物比等效未結合寡核苷酸更有效，此意謂其可在較低劑量下投與，從而提供安全性增強及治療成本顯著降低。因此，本發明之一個態樣為一種治療患者之癌症之方法，其包含向該患者投與治療有效劑量之本發明化合物。包括本發明化合物之端粒酶抑制劑可連同包括手術移除原發性腫瘤、化學治療劑及放射治療之其他癌症治療方法一起加以採用。因此，本發明係關於本文提供之用作藥劑之化合物及組合物。本發明亦係關於本文提供之用於治療或預防上文提及之任一惡性腫瘤的化合物及組合物。
對於治療應用，本發明化合物係以治療有效量與醫藥學上可接受之載劑一起調配。一或多種本發明化合物(例如具有不同L'或O組分)可包括在任何既定調配物中。醫藥載劑可為固體或液體。液體載劑可用於製備溶 液、乳液、懸浮液及加壓組合物。將化合物溶解或懸浮於醫藥學上可接受之液體賦形劑中。用於非經腸投與寡核苷酸製劑之液體載劑之適合實例包括水(其可含有添加劑，例如纖維素衍生物，較佳羧甲基纖維素鈉溶液)、磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS)、醇(包括一元醇及多元醇，例如二醇)及其衍生物、以及油(例如分餾椰子油及花生油)。液體載劑可含有其他適合醫藥添加劑，包括但不限於以下：增溶劑、懸浮劑、乳化劑、緩衝劑、增稠劑、著色劑、黏度調控劑、防腐劑、穩定劑及容積莫耳滲透濃度調控劑。
對於非經腸投與化合物，載劑亦可為油性酯，諸如油酸乙酯及肉豆蔻酸異丙酯。無菌載劑適用於供非經腸投與之無菌液體形式組合物中。
無菌液體醫藥組合物、溶液或懸浮液可藉由例如腹膜內注射、皮下注射、靜脈內或以表面方式來利用。寡核苷酸亦可血管內或經由血管支架來投與。
用於加壓組合物之液體載劑可為鹵素化烴或其他醫藥學上可接受之推進劑。此等加壓組合物亦可經脂質囊封以經由吸入進行傳遞。對於藉由鼻內或支氣管內吸入或吹入進行之投與，寡核苷酸可調配成可接著以氣霧劑形式利用之水溶液或部分水溶液。
化合物可藉由與醫藥學上可接受之含有活性化合物之媒劑一起調配以溶液、乳膏劑或洗劑形式局部投與。
本發明之醫藥組合物可以任何可接受之劑型 經口投與，包括但不限於呈膠囊、錠劑、散劑或顆粒劑形式以及呈於水或非水性介質中之懸浮液或溶液形式之調配物。包含本發明之寡核苷酸之醫藥組合物及/或調配物可包括載劑、潤滑劑、稀釋劑、增稠劑、調味劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。在供經口使用之錠劑之情況下，通常使用之載劑包括乳糖及玉米澱粉。亦可添加潤滑劑，諸如硬脂酸鎂。對於以膠囊形式進行之經口投與，適用稀釋劑包括乳糖及乾燥玉米澱粉。當水性懸浮液為經口使用所需時，使活性成分與乳化劑及懸浮劑組合。必要時，亦可添加某些甜味劑、調味劑或著色劑。
儘管本發明化合物具有優越細胞及組織滲透特徵，但其可經調配以提供甚至更大益處，例如於脂質體載劑中調配。使用脂質體來促進細胞攝取係例如描述於美國專利第4,897,355號及美國專利第4,394,448號中。眾多出版物描述脂質體之調配及製備。化合物亦可藉由與其他滲透增強劑，諸如上述脂質部分之未結合形式，包括脂肪酸及其衍生物混合來調配。實例包括油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、二癸酸酯、三癸酸酯、蓖麻醇酸酯、單油酸甘油酯(亦稱為1-單油醯基-外消旋-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、1-單癸酸甘油酯、1-十二基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、單甘油酯及二甘油酯及其生理可接受之鹽(亦即油酸鹽、月桂酸鹽、癸酸鹽、肉豆蔻酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、亞油酸鹽等)。
可使用包含一或多種滲透增強劑之複雜調配物。舉例而言，膽鹽可與脂肪酸組合用於製備複雜調配物。示範性組合包括通常在約0.5至2%之濃度下使用之鵝去氧膽酸(CDCA)與通常在約0.5至5%之濃度下使用之癸酸鈉或月桂酸鈉組合。
包含本發明之寡核苷酸之醫藥組合物及/或調配物亦可包括螯合劑、界面活性劑及非界面活性劑。螯合劑包括但不限於乙二胺四乙酸(EDTA)二鈉、檸檬酸、水楊酸鹽(例如水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽及高香蘭酸鹽)、膠原蛋白之N-醯基衍生物、月桂基聚氧乙烯醚-9(laureth-9)及β-二酮之N-胺基醯基衍生物(烯胺)。界面活性劑包括例如月桂基硫酸鈉、聚氧化乙烯-9-月桂基醚及聚氧化乙烯-20-十六基醚；及全氟化學乳液，諸如FC-43。非界面活性劑包括例如不飽和環脲、1-烷基-氮雜環-烷酮及1-烯基氮雜環-烷酮衍生物、以及非類固醇消炎劑，諸如雙氯芬酸鈉、吲哚美辛(indomethacin)及苯基丁氮酮。
因此，在本發明之另一態樣中，提供一種調配醫藥組合物之方法，該方法包括提供如本文所述之化合物，以及組合該化合物與醫藥學上可接受之賦形劑。較佳地，化合物係在如下定義之醫藥純度下提供。方法可進一步包含在添加賦形劑之前或之後向化合物中添加滲透增強劑。
醫藥組合物可符合醫藥純度標準。在一些情 況下，對於用作醫藥製劑中之活性成分，標的化合物係經純化以離開於其中製備其之混合物中存在的反應性或潛在免疫原性組分。
醫藥組合物可以單劑量單位或多劑量單位加以等分及包裝。用寡核苷酸化合物治療之劑量要求隨採用之特定組合物、投與途徑、呈現之症狀之嚴重性、化合物之形式及所治療之特定受試者而變化。
本發明之醫藥組合物可以有效達成在臨床上合乎需要之結果的調配物及量向受試者投與。對於治療癌症，合乎需要之結果包括腫瘤團塊減小(如藉由觸診或成像所確定；例如藉由放射線攝影術、放射核苷酸掃描、CAT掃描或MRI)、腫瘤生長速率降低、轉移形成速率降低(如例如藉由對生檢體試樣之組織化學分析所確定)、生物化學標記降低(包括諸如ESR之一般性標記及諸如血清PSA之腫瘤特異性標記)、以及生活品質改進(如藉由例如Karnofsky計分之臨床評估所確定)、進展時間增加、無疾病存活及總體存活。
為達成此等效應所需之每劑化合物之量及劑量之數目將視許多因素而變化，該等因素包括疾病指征、所治療之患者之特徵及投與模式。在一些情況下，調配物及投與途徑將提供在疾病部位處之化合物局部濃度在1μM與1nM之間。
一般而言，化合物係在提供有效結果，而不導致任何有害或不良副作用之濃度下投與。該種濃度可藉 由投與單一單位劑量，或藉由全天在適合間隔下投與分成適宜次單位之劑量來達成。
效用
本發明之例如如上所述之方法及組合物適用於多種應用中。相關應用包括但不限於：治療應用、診斷應用、研究應用及篩檢應用，如以下更詳細所評述。
標的化合物適用於多種治療應用中。在一些實施例中，產生寡核苷酸之方法應用於製備提供治療益處之寡核苷酸。可使用本發明組合物治療之疾病之類型為無限的。舉例而言，組合物可用於治療許多遺傳性疾病。在一些實施例中，標的方法及組合物具有反義應用。在一些實施例中，標的方法及組合物具有抗基因應用。在某些實施例中，標的方法及組合物具有端粒酶抑制應用，諸如美國專利6,835,826及美國公開案20120329858中所述之應用，該專利及該公開案之揭露內容以全文引用的方式併入本文中。
標的化合物及方法可用於多種診斷應用中，包括但不限於開發臨床診斷劑，例如活體外診斷劑或活體內腫瘤成像劑。此等應用適用於診斷或確認對疾病病狀或其易感性之診斷。方法亦適用於監測先前已診斷有疾病之患者之疾病進展及/或對治療之反應。
圖1A及1B顯示TA二聚物硫代磷醯胺酯(化合物7e，流程1)之HPLC層析圖(A)及31P NMR光譜(B)。
圖2A及2B顯示AA二聚物硫代磷醯胺酯(化合物7a，流程1)之HPLC層析圖(A)及31P NMR光譜(B)。
圖3A及3B顯示GG二聚物硫代磷醯胺酯(化合物7c，流程1)之HPLC層析圖(A)及31P NMR光譜(B)。
圖4A及4B顯示GT二聚物硫代磷醯胺酯(化合物7d，流程1)之HPLC層析圖(A)及31P NMR光譜(B)。
圖5A及5B顯示GA二聚物硫代磷醯胺酯(化合物7b，流程1)之HPLC層析圖(A)及31P NMR光譜(B)。
圖6A及6B顯示二聚物醯胺化物TA、AA、GA、GT及GG之LCMS跡線。
圖7顯示使用單體偶合策略在140μmol規模上合成伊美司他(imetelstat)之產物之HPLC層析圖。
圖8顯示使用二聚物嵌段偶合策略在140μmol規模上合成伊美司他之產物之HPLC層析圖。
提供以下實例以便向一般技藝人士提供如何 製備及使用本發明物之完全揭露及描述，且以下實例不欲限制發明者視為其發明物之事物的範疇，亦不欲表示以下實驗為進行之所有或僅有實驗。已努力確保關於所用數值(例如量、溫度等)之準確性，但應慮及一些實驗誤差及偏差。除非另外指示，否則份為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度係以攝氏度表示，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。就「平均」而言，其意謂算術平均值。可使用標準縮寫，例如bp，鹼基對；kb，千鹼基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分鐘；h或hr，小時；aa，胺基酸；kb，千鹼基；bp，鹼基對；nt，核苷酸；i.m.，肌肉內；i.p.，腹膜內；s.c.，皮下；及其類似縮寫。
一般性合成程序
提供通常已知之適用於合成揭露之化合物的化學合成流程及條件之許多一般性參考書目為可用的(參見例如Smith及March,March’s Advanced Organic Chemistry：Reactions,Mechanisms,and Structure，第5版，Wiley-Interscience,2001；或Vogel,A Textbook of Practical Organic Chemistry,Including Qualitative Organic Analysis，第4版，New York：Longman,1978)。
如本文所述之化合物可藉由此項技術中已知之任何純化方案純化，包括層析，諸如HPLC、製備型薄層層析、急驟管柱層析及離子交換層析。可使用任何適合固定相，包括正相及逆相以及離子樹脂。在某些實施例 中，揭露之化合物係經由矽膠及/或氧化鋁層析純化。參見例如Introduction to Modern Liquid Chromatography，第2版，L.R.Snyder及J.J.Kirkland編，John Wiley and Sons,1979；以及Thin Layer Chromatography,E.Stahl編，Springer-Verlag,New York,1969。
在用於製備標的化合物之任何方法期間，可能有必要及/或需要保護涉及之任何分子上之敏感性或反應性基團。此可藉助於如標準著作中所述之習知保護基來達成，該等著作諸如J.F.W.McOmie,「Protective Groups in Organic Chemistry」,Plenum Press,London and New York 1973；T.W.Greene及P.G.M.Wuts,「Protective Groups in Organic Synthesis」，第3版，Wiley,New York 1999；「The Peptides」；第3卷(編輯：E.Gross及J.Meienhofer),Academic Press,London and New York 1981；「Methoden der organischen Chemie」,Houben-Weyl，第4版，第15/l卷，Georg Thieme Verlag,Stuttgart 1974；H.-D.Jakubke及H.Jescheit,「Aminosauren,Peptide,Proteine」,Verlag Chemie,Weinheim,Deerfield Beach,and Basel 1982；及/或Jochen Lehmann,「Chemie der Kohlenhydrate：Monosaccharide and Derivate」,Georg Thieme Verlag,Stuttgart 1974。保護基可在適宜隨後階段使用此項技術中已知之方法來移除。
標的化合物可使用市售起始物質及/或藉由習 知合成方法製備之起始物質，經由多種不同合成途徑來合成。在以下流程中描述可用於合成本文揭露之化合物之合成途徑的多個實例。
實例1
使用二聚亞磷醯胺酯合成伊美司他鈉。
伊美司他鈉係使用固體支撐物(可控孔徑玻璃或聚合物固體支撐物)及單體亞磷醯胺酯(諸如ABz或Admf、C、GiBu及T亞醯胺化物)按以下序列合成：5’R-TAGGGTTAGACAA-NH2-3’(SEQ ID NO：3)，其中R=脂質連接子基團
伊美司他骨架為類似於起始亞磷醯胺酯之NPS，且因此偶合效率為約92%。利用二聚物亞磷醯胺酯使得偶合步驟較少，此可導致在合成之後在中間階段之產率及純度較高。使用如合成流程1中所述之方法如以下所示來製備以下二聚物亞磷醯胺酯。
TA、AA、GA、GG及GT。
合成二聚物亞磷醯胺酯需要A、G及T核苷之三種單體醯胺化物(4a至4c，流程1)及三種5’-TBDMS-3’胺基核苷中間物(3a至3c，流程1)。TBDMS為第三丁基二甲基矽烷基。自以下兩個種類之起始物質製備中間物(3a至3c，流程1)：5’-OH-3’-NH-Tr-2’-去氧-N-苯甲醯基腺苷(1a)、5’-OH-3’-NH-Tr-2’-去氧-N-異丁醯基鳥苷(1b)及5’-OH-3’-胺基-胸苷(2)。Tr或Trt係指三苯甲基。
使用第三丁基二甲基矽烷基氯化物及咪唑在DMF(N,N-二甲基甲醯胺)中用TBDMS基團保護1a及1b之5’-羥基，接著藉由用乙酸在水中處理來使在3’-胺基位置處之三苯甲基脫保護。使用苯甲基巰基四唑(BMT)作為活化劑在二甲基甲醯胺中使所得中間物3a至3c與相應醯胺化物4a至4c偶合，且隨後使用蒼耳烷氫化物及吡啶進行硫化(P III至P V)(流程1)。一般而言，硫化反應易於完成。偶合反應之結果視水分、反應時間及醯胺化物之當量而變化。使用氮氣或氬氣及快速偶合反應之無水條件為合乎需要的，因為較長反應時間會產生更多副產物，諸如P(V)氧化產物。二聚物之P(III)中間物具有不同穩定性。TA中間物足夠穩定用以藉由TLC及HPLC來監測反應完成。其他P(III)中間物不足夠穩定用以監測偶合反應，且在硫化完成之後檢查反應完成(流程1)。二聚物AA、GA、GG及GT之P(V)物質更穩定。對於TA二聚物(5e)，1.3當量之醯胺化物(4c)用於偶合，而其他四種二聚 物(5a~5d)需要約3當量之醯胺化物(4a及4b)(流程1)。醯胺化物單體4a-4c係藉由修改美國專利5,859,233中所述之方法製備。
使用HF˙吡啶在乙腈中使在5’-羥基處之TBDMS保護基脫保護，且在BMT及N-甲基咪唑(NMI)存在下用亞磷醯化試劑進行最終亞磷醯化以製備二聚物硫代磷醯胺酯7a至7e(流程1)。藉由管柱層析純化最終產物(7)及三種中間物(3、5、6)。用各種量的所得最終醯胺化物進行之反應的步驟產率及總體產率列於表3中。五種二 聚物醯胺化物之分析結果之概述顯示於表4中。
二聚物硫代磷醯胺酯之合成程序
1)製備5’-TBDMS-3’-胺基核苷(針對腺苷及鳥苷)。
a)將5’-OH-3’-NH-Tr-2’-去氧核苷(1.0當量)及咪唑(5.0當量)溶解於DMF中，且加熱至60℃。
b)添加TBDMSCl(1.2當量)至加熱溶液中，接著在60℃下攪拌1小時。
c)添加飽和NaHCO3水溶液至反應混合物中，接著用乙酸乙酯萃取。
d)有機層用飽和NaHCO3水溶液及鹽水溶液洗滌。
e)添加無水Na2SO4至分離之有機層中以進行乾燥，接著過濾。
f)濃縮濾液。
g)添加80%乙酸水溶液至濃縮反應混合物中，接著在環境溫度下攪拌1小時。
h)藉由過濾移除產物固體，接著添加飽和NaHCO3水溶液至濾液中，接著藉由乙酸乙酯萃取四次。
i)有機層經無水Na2SO4乾燥，接著藉由過濾移除固體。
j)濃縮濾液，接著藉由管柱層析(溶離劑：乙酸乙酯：甲醇=9：1→5：1)純化。
k)獲得呈白色固體狀之5’-TBDMS-3’-胺基-2’-去氧核苷。
2)製備5’-TBDMS-3’-胺基核苷(針對胸苷)。
a)將5’-OH-3’-胺基-2’-去氧核苷(1.0當量)及咪唑(5.0當量)溶解於DMF中，且加熱至60℃。
b)添加TBDMSCl(1.2當量)至加熱溶液中，接著在60℃下攪拌1小時。
c)添加飽和NaHCO3水溶液至反應混合物中，接著用乙酸乙酯萃取四次。
d)添加無水Na2SO4至有機層中以進行乾燥，且過濾。
e)濃縮濾液。
f)濃縮粗混合物藉由管柱層析(溶離劑：乙酸乙酯：甲醇=15：1→5：1)純化。
g)獲得呈白色固體狀之5’-TBDMS-3’-胺基胸苷。
3)製備5’-TBDMS-3’-NH-Tr二聚物
a)為移除水分，使5’-TBDMS-3’-胺基核苷(1.0當量)及BMT(苯甲基巰基四唑，1.0~5.0當量)與乙腈共沸三次，接著在環境溫度下在N2氛圍下溶解於DMF中。
b)逐滴添加含單體醯胺化物(3.0當量)之DMF(使用最小量以溶解單體醯胺化物)至反應溶液中，接著在環境溫度下在氮氣氛圍下攪拌1小時。根據美國專利5,859,233中所述之方法製備單體醯胺化物。
c)添加蒼耳烷氫化物(2.0當量)及吡啶(4.0當量)至反應溶液中，接著在環境溫度下在氮氣氛圍下攪拌1小時。
d)添加飽和NaHCO3水溶液至反應混合物中，接著用乙酸乙酯萃取。
e)水層用乙酸乙酯萃取。
f)合併分離之有機層，接著用飽和NaHCO3水 溶液及鹽水溶液洗滌。
g)添加無水Na2SO4至有機層中以進行乾燥，且過濾，接著濃縮濾液。
h)濃縮粗混合物藉由管柱層析(溶離劑：乙酸乙酯：甲醇=1.5：1→僅EA)純化。
i)獲得呈淺黃色固體狀之5’-TBDMS-3’-NH-Tr二聚物。
4)製備5’-OH-3’-NH-Tr二聚物
a)在氮氣氛圍下將5’-TBDMS-3’-NH-Tr二聚物(1.0當量)溶解於ACN(20mL)中，接著在環境溫度下在攪拌下添加HF-吡啶溶液，持續1.5小時。
b)添加飽和NaHCO3水溶液至反應混合物中，接著用乙酸乙酯萃取。
c)分離之有機層用飽和NaHCO3水溶液及鹽水溶液洗滌。
d)添加無水Na2SO4至有機層中以進行乾燥及過濾，接著濃縮濾液。
e)濃縮粗混合物藉由管柱層析(溶離劑：乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷共溶劑)純化
f)獲得呈白色固體狀之5’-OH-3’-NH-Tr二聚物。
5)製備二聚物硫代磷醯胺酯(二聚物醯胺化物)
A)為移除任何水分，使5’-羥基-3’-NH-Tr二聚物與乙腈共沸三次，接著在環境溫度下在氮氣氛圍下溶 解於ACN中。
b)添加BMT(1.3當量)、NMI(N-甲基咪唑，0.3當量)及亞磷醯化試劑(2.0當量)至反應溶液中，接著在環境溫度下攪拌1小時。
c)添加飽和NaHCO3水溶液至反應混合物中，接著用乙酸乙酯萃取。
d)分離之有機層用鹽水溶液洗滌。
e)添加無水Na2SO4至有機層中以進行乾燥及過濾，接著濃縮濾液。
f)將濃縮反應混合物溶解於二氯甲烷(10mL)中，接著添加己烷以沈澱固體。
g)傾析上層溶液以移除過量亞磷醯化試劑。(重複傾析過程5次)。
h)剩餘固體藉由管柱層析(溶離劑：乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷共溶劑)純化
i)獲得呈白色固體狀之二聚物。
利用二聚物醯胺化物進行之伊美司他合成
五種二聚物醯胺化物替代單體醯胺化物用作用於合成伊美司他之構築嵌段，且將結果與自單體之醯胺化物獲得之結果進行比較。對於C核苷偶合至伊美司他中，如以下序列中所描繪使用單體構築嵌段。使用Akta Oligopilot 100在140μmol規模下進行合成。
5’R-TAGGGTTAGA C AA-NH2 3’(SEQ ID NO：3)
二聚物醯胺化物用作用以製備伊美司他之構築嵌段。使用表5A及5B中所列之試劑及合成參數，使如上所示之五種二聚物醯胺化物(AA、TA、GG、GA及GT)及一種單體醯胺化物(C)偶合以在低裝載量CPG(PALM 0051，64.6μmol/g)上製備伊美司他序列。偶合時間為500秒，且使用10當量之亞醯胺化物。在固相合成之後，支撐物用乙醇銨溶液(NH4OH：EtOH=3：1(v/v))在65℃下處理15小時。粗產物藉由蒸發溶劑加以分離，且藉由UV光譜術及HPLC加以分析。
使用Akta Oligopilot 100，利用單體嵌段方法及二聚物嵌段方法在140μmol規模上進行合成操作。用於合成操作之合成條件類似於表5A-B中所列之條件。
藉由HPLC-MS對寡核苷酸分析顯示當五種二聚物嵌段用於合成時，FLP(全長產物)純度得以顯著提高，根據HPLC得到72%純度，如表7及8中所概述。使用單體嵌段製備之粗寡聚物僅顯示45% FLP純度。此外，總OD(光密度)自5,299增加超過兩倍達到11,623，從而得到粗產量3.34g/mmol。(N-1)產物含量及PO含量分別自11.2%及20%降低至2.4%及5%。
使用二聚物嵌段之一優勢包括產生時間縮短，且在固相合成期間使用之溶劑之量降低。
自5’-羥基-3’-胺基核苷或5’-羥基-3’-三苯甲基胺基核苷成功完成五種二聚物醯胺化物之合成，其中產率為9%至19%，從而得到1.7公克至3.4公克。未充分研究各步驟之反應條件之最佳化。在140μmol規模上進行伊美司他之二聚物嵌段合成，且將結果與自使用單體醯胺化物進行之合成獲得之資料進行比較。顯示用於製備伊美司他之二聚物嵌段策略會提供實質性改進，因為例如在140μmol規模上，純度及產率得以顯著改進(HPLC純度：二聚物74.0%(圖8)，單體44.4%(圖7)，根據TOD(總光密度)之粗產量：二聚物468mg，單體213mg)。此外，產生較低量之npo鍵聯，因為在使用二聚物進行之合成中存在較少偶合步驟。
二聚物之偶合效率(140μmol規模合成)顯示二 聚物合成具有96%偶合效率，而單體合成為94%。因為對於二聚物，僅存在七次偶合，所以二聚物之FLP為71.6%，此接近於在72%下之理論計算之全長產物，且偶合13次之單體報導FLP 45.6%對在44%下之理論預測值。
「+苯基乙醯基」表示由用氧化試劑進行之反應獲得之產物
利用較少偶合步驟進行之伊美司他合成提供之全長產物純度與產率兩者均實質上較高。對雜質之解析提供較易於純化伊美司他，其中在HPLC中存在較小量之緊密接近於主峰流動之次要產物以產生伊美司他之純度較高之組合物。此提高合乎降低用於製造伊美司他鈉之商品成本之需要，例如當在製造規模下執行時，商品成本可減少30-40%。
根據本文所述之方法，經由流程2中所示之步驟，自300g APG2製備85g TBAG。
根據本文所述之方法，經由流程3中所示之步 驟，自800g粗APA1(純度：46%)獲得430g TBAPA1。
已根據本文所述之方法，經由流程4中所示之步驟，在自100mg至1g之合成規模下製備TA二聚物醯胺化物(5)。
在化合物之一些實施例中，B1為T或U，且B2為U。
儘管本發明已關於其具體實施例加以描述，但熟習此項技術者應瞭解的是可在不脫離本發明之真實精神及範疇下進行各種變化且可用等效物進行替代。此外，可進行許多修改以使特定情況、材料、物質組成、方法、一或多個方法步驟適合於本發明之目標、精神及範疇。所有此等修改皆意欲在隨附於此之申請專利範圍之範疇內。
實施例
本揭露內容提供一種組合物，其具有相對於化合物或其鹽，小於每4重量份1重量份之(N-1)產物，其中該化合物包括具有含10個或10個以上核苷次單元之序列之聚核苷酸，且至少兩個該等核苷次單元係藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。在組合物之一些實施例中，N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯為具有結構：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’之N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯，其中R係選自由氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基組成之群；或其鹽。
在組合物之一些實施例中，化合物包括具有含 10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列之聚核苷酸。在組合物之一些實施例中，聚核苷酸包括含有13個或13個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列。在組合物之一些實施例中，聚核苷酸包括在3個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補之連續核苷次單元。在組合物之一些實施例中，與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元係皆藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。在組合物之一些實施例中，聚核苷酸包括選自由以下組成之群之序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。在組合物之一些實施例中，聚核苷酸包括3’胺基或3’-羥基末端基團。
在組合物之一些實施例中，化合物具有結構：
或其鹽；其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯-NH-P(=O)(SH)- O-。在組合物之一些實施例中，鹽為醫藥學上可接受之鹽。
在組合物之一些實施例中，化合物具有結構：
其中各Mx+獨立地為氫或鹽之相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為整數5至13。在某些情況下，Mx+為氫。
在組合物之一些實施例中，化合物具有結構：
在一些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每6重量份1重量份之(N-1)產物。在一些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每10重量份1重量 份之(N-1)產物。在一些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每20重量份1重量份之(N-1)產物。在一些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每4重量份1重量份之任何(N-x)產物。在一些實施例中，組合物具有相對於化合物，小於每100重量份40總重量份之(N-x)含聚核苷酸產物。在一些實施例中，組合物具有(N-x)含聚核苷酸產物之以下概況：相對於產物，小於每4重量份1重量份之(N-1)產物；相對於化合物，至少每100重量份10重量份之(N-2)及(N-3)產物。
本揭露內容提供一種小於11重量%之(N-1)產物之化合物活性醫藥成分，其中化合物或其醫藥學上可接受之鹽包括具有含10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元之序列的聚核苷酸，其中至少兩個核苷次單元係藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元係皆藉由N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯為具有結構：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’之硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯，其中R係選自由氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基組成之群；或其醫藥學上可接受之鹽。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，聚核 苷酸包括在10個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補之連續核苷次單元。在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，聚核苷酸包括選自由以下組成之群之序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)；TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)；及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，聚核苷酸包括3’胺基或3’-羥基末端基團。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，化合物具有結構：
或其醫藥學上可接受之鹽；其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯-NH-P(=O)(SH)-O-。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，化合物具有結構：
其中各Mx+獨立地為氫或醫藥學上可接受之鹽之相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為整數5至13。在某些情況下，Mx+為氫。
在化合物活性醫藥成分之一些實施例中，化合物具有結構：
在一些實施例中，化合物活性醫藥成分具有小於9重量%之(N-1)產物。在一些實施例中，化合物活性醫藥成分具有小於5重量%之(N-1)產物。在一些實施例中，化合物活性醫藥成分具有小於11%之任何(N-x)產物。在 一些實施例中，化合物活性醫藥成分具有小於45總重量%之(N-x)含聚核苷酸產物。在一些實施例中，化合物活性醫藥成分具有(N-x)含聚核苷酸產物之以下概況：小於5重量%之(N-1)產物；以及至少10重量%之(N-2)及(N-3)產物。
亦提供一種醫藥組合物，其包括於醫藥學上可接受之賦形劑中調配之組合物(例如本文所述之任一實施例之組合物)。亦提供一種醫藥組合物，其包括於醫藥學上可接受之賦形劑中調配之化合物活性醫藥成分(例如本文所述之任一實施例之化合物活性醫藥成分)。
本揭露內容提供一種合成聚核苷酸之方法。在一些實施例中，方法包括以下步驟：(a)將連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺二聚物在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺鍵聯；以及(c)使該鍵聯氧化。
在一些實施例中，方法還包括：(a)將連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺單體在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺鍵聯；以及(c)使該鍵聯氧化。在方法之一些實施例中，使鍵聯氧化包括硫化以產生硫代磷醯胺酯鍵聯。在方法之一些實施例中，使鍵聯氧化產生側氧基磷醯胺酯鍵聯。
在方法之一些實施例中，3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺二聚物具有式：
其中X為O或S，且B1及B2各自獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶或其類似物。在方法之一些實施例中，B1及B2係各自獨立地選自經保護腺嘌呤、經保護胞嘧啶、經保護鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶。在方法之一些實施例中，B1及B2係各自獨立地選自A(Bz)、A(DMF)、C(Bz)、G(異丁醯基)、T及U。在方法之一些實施例中，X為S。
在方法之一些實施例中，聚核苷酸具有式：
其中：各B獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶或其類似物；各X獨立地為氧或硫；各R3為氫、氟基或羥基、烷氧基、經取代烷氧基或經保護羥基；L為視情況選用之連接子；Z為H、脂質、支撐物、載體、寡核苷酸、PEG、多肽、可偵測標記或標籤；R6為胺基、羥基、經保護胺基、經保護羥基、-O-L-Z或-NH-L-Z；R為氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基；且n為整數1至1000；或其鹽；且方法包含以下步驟：(a)將連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺二聚物；或(ii)3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺單體；在親核催化劑存在下反應以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺鍵聯；(c)使該鍵聯氧化；以及(d)重複步驟(a)至(c)直至合成該聚核苷酸，其中重複步驟(a)至(c)包括進行步驟(b)(i)至少一次。
在方法之一些實施例中，使鍵聯氧化包含硫化 以產生硫代磷醯胺酯鍵聯。在方法之一些實施例中，使鍵聯氧化產生側氧基磷醯胺酯鍵聯。在方法之一些實施例中，聚核苷酸包含具有與互補人類端粒酶之RNA組分之核苷次單元的序列，且其中至少兩個核苷次單元係藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。在方法之一些實施例中，N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯為具有結構：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’之N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯，其中R係選自由氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基組成之群；或其鹽。
在方法之一些實施例中，聚核苷酸包括序列TAGGGTTAGACAA。在方法之一些實施例中，TAGGGTTAGACAA序列之所有核苷酸間次單元間鍵聯皆為N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯。在方法之一些實施例中，聚核苷酸具有結構：
或其鹽；其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯-NH-P(=O)(SH)- O-。
在方法之一些實施例中，聚核苷酸具有結構：
其中各Mx+獨立地為氫或醫藥學上可接受之鹽之相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為整數5至13。在某些情況下，Mx+為氫。
在方法之一些實施例中，聚核苷酸具有結構：
在方法之一些實施例中，TAGGGTTAGACAA序列之C11核苷酸殘基由3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺單體獲得。在一些實施例中，方法包括使以下3'-經保護胺基-二核苷酸硫代磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺二聚物TA、 GG、GT、TA、GA和AA以及3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺單體C連續偶合於固相支撐物。在方法之一些實施例中，3'-經保護胺基-二核苷酸亞磷醯胺-5'-亞磷醯胺二聚物係藉由式X1X2所述，其中X1及X2係獨立地選自經保護腺嘌呤、經保護胞嘧啶、經保護鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶。在方法之一些實施例中，3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺二聚物係選自經保護腺嘌呤、經保護胞嘧啶、經保護鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶。
本揭露內容提供一種藉由式(II)所述之二核苷酸硫代磷醯胺酯化合物：
其中：B1及B2各自獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶或其類似物；R11為氫、保護基或亞磷醯胺基團；且R12及R13各自獨立地為氫或保護基；或其鹽。
在化合物之一些實施例中，B1及B2係各自獨立地選自經保護腺嘌呤、經保護胞嘧啶、經保護鳥嘌呤、 胸腺嘧啶及尿嘧啶。在化合物之一些實施例中，B1及B2係各自獨立地選自A(Bz)、A(DMF)、C(Bz)、G(異丁醯基)、T及U。在化合物之一些實施例中，R11為5’-亞磷醯胺；R12為保護基，且R13為保護基。在化合物之一些實施例中，B1為A(Bz)或A(DMF)，且B2為A(Bz)或A(DMF)。在化合物之一些實施例中，B1為A(Bz)或A(DMF)，且B2為C(Bz)。在化合物之一些實施例中，B1為A(Bz)或A(DMF)，且B2為G(異丁醯基)。在化合物之一些實施例中，B1為A(Bz)或A(DMF)，且B2為T。在化合物之一些實施例中，B1為A(Bz)或A(DMF)，且B2為U。在化合物之一些實施例中，B1為C(Bz)，且B2為A(Bz)或A(DMF)。在化合物之一些實施例中，B1為C(Bz)，且B2為C(Bz)。在化合物之一些實施例中，B1為C(Bz)，且B2為G(異丁醯基)。在化合物之一些實施例中，B1為C(Bz)，且B2為T。在化合物之一些實施例中，B1為C(Bz)，且B2為U。在化合物之一些實施例中，B1為G(異丁醯基)，且B2為A(Bz)或A(DMF)。在化合物之一些實施例中，B1為G(異丁醯基)，且B2為C(Bz)。在化合物之一些實施例中，B1為G(異丁醯基)，且B2為G(異丁醯基)。在化合物之一些實施例中，B1為G(異丁醯基)，且B2為T。在化合物之一些實施例中，B1為G(異丁醯基)，且B2為U。在化合物之一些實施例中，B1為T或U，且B2為A(Bz)或A(DMF)。在化合物之一些實施例中，B1為T或U，且B2為C(Bz)。在化合物之一些實施 例中，B1為T或U，且B2為G(異丁醯基)。在化合物之一些實施例中，B1為T或U，且B2為T。在化合物之一些實施例中，B1為T或U，且B2為U。
以上指示之實施例之所有可能的組合皆視為納入本發明之範疇內。
<110> 傑龍公司(Geron Corporation)
<120> 寡核苷酸組合物及其製備方法
<140> TW 104113709
<141> 2015-04-29
<150> US 61/987,396
<151> 2014-05-01
<150> US 62/151,909
<151> 2015-04-23
<160> 19
<170> 用於Windows之FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 451
<212> RNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 1
<210> 2
<211> 11
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 2
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 3
<210> 4
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 4
<210> 5
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 5
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 6
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 7
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 8
<210> 9
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 9
<210> 10
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 10
<210> 11
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 11
<210> 12
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 12
<210> 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成聚核苷酸
<400> 13
<210> 14
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成聚核苷酸
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<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成聚核苷酸
<400> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 16
<210> 17
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成聚核苷酸
<400> 18
<210> 19
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成聚核苷酸
<400> 19

Claims (79)

  1. 一種組合物，其具有相對於化合物或其鹽，小於每4重量份1重量份之(N-1)產物，其中該化合物包含具有含10個或10個以上核苷次單元之序列之聚核苷酸，且至少兩個該等核苷次單元係藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。
  2. 如申請專利範圍第1項之組合物，其中該N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯為具有以下結構之N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’其中R係選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基；或其鹽。
  3. 如申請專利範圍第1項至第2項中任一項之組合物，其中該化合物包含具有含10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列之聚核苷酸。
  4. 如申請專利範圍第3項之組合物，其中該聚核苷酸包含含有13個或13個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列。
  5. 如申請專利範圍第3項之組合物，其中該聚核苷酸包含在3個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補之連續核苷次單元。
  6. 如申請專利範圍第3項至第5項中任一項之組合物，其中與人類端粒酶之RNA組分互補之該等核苷次單元係皆藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。
  7. 如申請專利範圍第1項至第6項中任一項之組合物，其中該聚核苷酸包含選自由以下組成之群之序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)、TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
  8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之組合物，其中該聚核苷酸包含3’胺基或3’-羥基末端基團。
  9. 如申請專利範圍第7項之組合物，其中該化合物具有結構： 或其鹽；其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯-NH-P(=O)(SH)-O-。
  10. 如申請專利範圍第9項之組合物，其中該鹽為醫藥學上可接受之鹽。
  11. 如申請專利範圍第7項之組合物，其中該化合物具有結構： 其中各Mx+獨立地為氫或鹽之相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為整數5至13。
  12. 如申請專利範圍第7項之組合物，其中該化合物具有結構：
  13. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之組合物，其具有相對於該化合物，小於每6重量份1重量份之(N-1)產物。
  14. 如申請專利範圍第13項之組合物，其具有相對 於該化合物，小於每10重量份1重量份之(N-1)產物。
  15. 如申請專利範圍第14項之組合物，其具有相對於該化合物，小於每20重量份1重量份之(N-1)產物。
  16. 如申請專利範圍第1項至第15項中任一項之組合物，其具有相對於該化合物，小於每4重量份1重量份之任何(N-x)產物。
  17. 如申請專利範圍第16項中任一項之組合物，其具有相對於該化合物，小於每100重量份總共40重量份之(N-x)含聚核苷酸產物。
  18. 如申請專利範圍第1項至第12項中任一項之組合物，其具有(N-x)含聚核苷酸產物之以下概況：相對於該化合物，小於每4重量份1重量份之(N-1)產物；相對於該化合物，至少每100重量份10重量份之(N-2)及(N-3)產物。
  19. 一種化合物活性醫藥成分，具有小於11重量%之(N-1)產物，其中該化合物或其醫藥學上可接受之鹽包含具有含10個或10個以上與人類端粒酶之RNA組分互補之核苷次單元的序列之聚核苷酸，其中至少兩個該等核苷次單元係藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。
  20. 如申請專利範圍第19項之化合物活性醫藥成分，其中與人類端粒酶之RNA組分互補之該等核苷次單元係皆藉由N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。
  21. 如申請專利範圍第19項至第20項中任一項之化 合物活性醫藥成分，其中該N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯為具有以下結構之N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’其中R係選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基；或其醫藥學上可接受之鹽。
  22. 如申請專利範圍第19項至第21項中任一項之化合物活性醫藥成分，其中該聚核苷酸包含在10個與50個之間的與人類端粒酶之RNA組分互補之連續核苷次單元。
  23. 如申請專利範圍第19項至第22項中任一項之化合物活性醫藥成分，其中該聚核苷酸包含選自由以下組成之群之序列：GTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：4)；TAGGGTTAGACAA(SEQ ID NO：3)；及CAGTTAGGGTTAG(SEQ ID NO：5)。
  24. 如申請專利範圍第19項至第23項中任一項之化合物活性醫藥成分，其中該聚核苷酸包含3’胺基或3’-羥基末端基團。
  25. 如申請專利範圍第19項至第23項中任一項之化合物活性醫藥成分，其中該化合物具有結構： 或其醫藥學上可接受之鹽；其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯-NH-P(=O)(SH)-O-。
  26. 如申請專利範圍第19項至第23項中任一項之化合物活性醫藥成分，其中該化合物具有結構： 其中各Mx+獨立地為氫或醫藥學上可接受之鹽之相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為整數5至13。
  27. 如申請專利範圍第26項之化合物活性醫藥成分，其中該化合物具有結構：
  28. 如申請專利範圍第19項至第27項中任一項之化合物活性醫藥成分，其具有小於9重量%之該(N-1)產物。
  29. 如申請專利範圍第28項之化合物活性醫藥成分，其具有小於5重量%之該(N-1)產物。
  30. 如申請專利範圍第19項至第29項中任一項之化 合物活性醫藥成分，其具有小於11%之任何(N-x)產物。
  31. 如申請專利範圍第19項至第30項中任一項之化合物活性醫藥成分，其具有小於總共45重量%之(N-x)含聚核苷酸產物。
  32. 如申請專利範圍第19項之化合物活性醫藥成分，其具有(N-x)含聚核苷酸產物之以下概況：小於5重量%之(N-1)產物；及至少10重量%之(N-2)及(N-3)產物。
  33. 一種醫藥組合物，其包含於醫藥學上可接受之賦形劑中調配之如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之組合物。
  34. 一種合成聚核苷酸之方法，該方法包括以下步驟：(a)使連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯；以及(c)使該鍵聯氧化。
  35. 如申請專利範圍第34項之方法，其進一步包括：(a)使連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯 胺酯單體在親核催化劑存在下接觸以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯；以及(c)使該鍵聯氧化。
  36. 如申請專利範圍第34項及第35項中任一項之方法，其中使該鍵聯氧化包括硫化以產生硫代磷醯胺酯鍵聯。
  37. 如申請專利範圍第34項及第35項中任一項之方法，其中使該鍵聯氧化產生側氧基磷醯胺酯鍵聯。
  38. 如申請專利範圍第34項至第37項中任一項之方法，其中該3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物具有式： 其中X為O或S，且B1及B2各自獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶、或其類似物。
  39. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該B1及B2 係各自獨立地選自經保護腺嘌呤、經保護胞嘧啶、經保護鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶。
  40. 如申請專利範圍第39項之方法，其中該B1及B2係各自獨立地選自A(Bz)、A(DMF)、C(Bz)、G(異丁醯基)、T及U。
  41. 如申請專利範圍第38項至第40項中任一項之方法，其中X為S。
  42. 如申請專利範圍第34項至第41項中任一項之方法，其中該聚核苷酸具有式： 其中：各B獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶、或其類似物；各X獨立地為氧或硫；各R3為氫、氟基、或羥基、烷氧基、經取代烷氧基或經保護羥基；L為視情況選用之連接子；Z為H、脂質、支撐物、載體、寡核苷酸、PEG、多 肽、可偵測標記或標籤；R6為胺基、羥基、經保護胺基、經保護羥基、-O-L-Z或-NH-L-Z；R為氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基或磷酸酯保護基；且n為整數1至1000；或其盐；且該方法包括以下步驟：(a)使連接於固相支撐物之末端核苷之經保護3'胺基脫保護，該脫保護形成游離3'胺基；(b)使該游離3'胺基與：(i)3'-經保護胺基-二核苷酸磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物；或(ii)3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯單體；在親核催化劑存在下反應以形成核苷間N3'→P5'亞磷醯胺酯鍵聯；(c)使該鍵聯氧化；以及(d)重複步驟(a)至(c)直至合成該聚核苷酸，其中重複步驟(a)至(c)包括進行步驟(b)(i)至少一次。
  43. 如申請專利範圍第42項之方法，其中使該鍵聯氧化包括硫化以產生硫代磷醯胺酯鍵聯。
  44. 如申請專利範圍第42項之方法，其中使該鍵聯氧化產生側氧基磷醯胺酯鍵聯。
  45. 如申請專利範圍第41項至第44項中任一項之方法，其中該聚核苷酸包含具有與人類端粒酶之RNA組分 互補之核苷次單元的序列，且其中至少兩個該等核苷次單元係藉由N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯接合。
  46. 如申請專利範圍第45項之方法，其中該N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯為具有以下結構之N3'→P5'硫代磷醯胺酯次單元間鍵聯：3'-NH-P(S)(OR)-O-5’其中R係選自由以下組成之群：氫、烷基、經取代烷基、芳基、經取代芳基及磷酸酯保護基；或其鹽。
  47. 如申請專利範圍第42項至第45項中任一項之方法，其中該聚核苷酸包含序列TAGGGTTAGACAA。
  48. 如申請專利範圍第47項之方法，其中該TAGGGTTAGACAA序列之所有該等核苷酸間次單元間鍵聯皆為N3'→P5'磷醯胺酯次單元間鍵聯。
  49. 如申請專利範圍第42項至第48項中任一項之方法，其中該聚核苷酸具有結構： 或其鹽；其中「nps」表示使一個核苷之3'-碳連接於鄰近核苷之5'-碳之硫代磷醯胺酯鍵聯-NH-P(=O)(SH)-O-。
  50. 如申請專利範圍第42項至第49項中任一項之方法，其中該聚核苷酸具有結構： 其中各Mx+獨立地為氫或醫藥學上可接受之鹽之相對離子，各x獨立地為1、2或3，且n為整數5至13。
  51. 如申請專利範圍第50項之方法，其中該聚核苷酸具有結構：
  52. 如申請專利範圍第47項之方法，其中該TAGGGTTAGACAA序列之C11核苷酸殘基來源於3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯單體。
  53. 如申請專利範圍第47項之方法，其中該方法包 括使以下3'-經保護胺基-二核苷酸硫代磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物TA、GG、GT、TA、GA及AA以及3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯單體C連續偶合於該固相支撐物。
  54. 如申請專利範圍第34項至第38項中任一項之方法，其中該3'-經保護胺基-二核苷酸亞磷醯胺酯-5'-亞磷醯胺酯二聚物係藉由式X1X2所描述，其中X1及X2係獨立地選自經保護腺嘌呤、經保護胞嘧啶、經保護鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶。
  55. 如申請專利範圍第34項之方法，其中該3'-經保護胺基核苷-5'-亞磷醯胺酯二聚物係選自經保護腺嘌呤、經保護胞嘧啶、經保護鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶。
  56. 一種二核苷酸硫代磷醯胺酯化合物，其藉由式(II)所描述： 其中：B1及B2各自獨立地為嘌呤、經保護嘌呤、嘧啶或經保護嘧啶、或其類似物；R11為氫、保護基或亞磷醯胺酯基團；且R12及R13各自獨立地為氫或保護基；或其鹽。
  57. 如申請專利範圍第56項之化合物，其中B1及B2係各自獨立地選自經保護腺嘌呤、經保護胞嘧啶、經保護鳥嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶。
  58. 如申請專利範圍第57項之化合物，其中B1及B2係各自獨立地選自A(Bz)、A(DMF)、C(Bz)、G(異丁醯基)、T及U。
  59. 如申請專利範圍第56項之化合物，其中R11為5’-亞磷醯胺酯；R12為保護基，且R13為保護基。
  60. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為A(Bz)或A(DMF)，且B2為A(Bz)或A(DMF)。
  61. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為A(Bz)或A(DMF)，且B2為C(Bz)。
  62. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為A(Bz)或A(DMF)，且B2為G(異丁醯基)。
  63. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為A(Bz)或A(DMF)，且B2為T。
  64. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為A(Bz)或A(DMF)，且B2為U。
  65. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為 C(Bz)，且B2為A(Bz)或A(DMF)。
  66. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為C(Bz)，且B2為C(Bz)。
  67. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為C(Bz)，且B2為G(異丁醯基)。
  68. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為C(Bz)，且B2為T。
  69. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為C(Bz)，且B2為U。
  70. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為G(異丁醯基)，且B2為A(Bz)或A(DMF)。
  71. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為G(異丁醯基)，且B2為C(Bz)。
  72. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為G(異丁醯基)，且B2為G(異丁醯基)。
  73. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為G(異丁醯基)，且B2為T。
  74. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為G(異丁醯基)，且B2為U。
  75. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為T或U，且B2為A(Bz)或A(DMF)。
  76. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為T或U，且B2為C(Bz)。
  77. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為T 或U，且B2為G(異丁醯基)。
  78. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為T或U，且B2為T。
  79. 如申請專利範圍第58項之化合物，其中B1為T或U，且B2為U。
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