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TW201620925A - 用於製備人類血漿蛋白質的方法 - Google Patents

用於製備人類血漿蛋白質的方法 Download PDF

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TW201620925A
TW201620925A TW104107803A TW104107803A TW201620925A TW 201620925 A TW201620925 A TW 201620925A TW 104107803 A TW104107803 A TW 104107803A TW 104107803 A TW104107803 A TW 104107803A TW 201620925 A TW201620925 A TW 201620925A
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戴米恩 巴泰爾
雅碧德薩塔 西特羅
派屈克 桑塔邊
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法國分裂暨生物科技實驗室
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Abstract

本發明係關於一種藉由多管柱層析自血漿製備血漿蛋白質濃縮物之方法。

Description

用於製備人類血漿蛋白質的方法
本發明係關於一種用於自血漿或血漿部分製備治療用途之人類血漿蛋白質之方法。
目前諸多病變用富含一或多種血漿蛋白質之血漿部分治療。因此，一般在替補療法中使用凝血因子來預防或治療與凝血因子缺乏相關的出血。血纖維蛋白原為最常開的處方以治療與先天性或重度無纖維素原血症及出血性症候群相關的併發症或與低纖維素原血症相關的出血風險。白蛋白意欲恢復且維持循環血量(確診的低血容量症)。類似地，諸多病變目前用富含免疫球蛋白，尤其富含免疫球蛋白G(IgG)(一般包含超過95%之Ig)之血漿部分治療。
舉例而言，富含免疫球蛋白G或IgG濃縮物之血漿部分用於矯正抗體產生缺乏之主要免疫缺陷及諸如白血病、骨髓瘤或反覆感染等之某些繼發性免疫缺乏症。投與Ig亦可在治療青少年及成人特發性血小板減少性紫癜(ITP)、格林-巴利症候群(Guillain-Barré syndrome)、脫髓鞘多發性神經病、多灶性運動神經病、慢性發炎性脫髓鞘多神經根神經病(CIDP)、川崎氏疾病(Kawasaki's disease)、多發性硬化症、類固醇抵抗型皮肌炎、急性肌無力、鳥槍彈樣視網膜脈絡膜炎(Birdshot's retinochoroiditis)、歸因於胎兒母本ABO不相容性之新生兒黃疸(歸因於ABO不相容性之新生兒之溶血性疾病)等方面具有有利作 用。
多種治療適應症及在某些病例中可開出之極高劑量處方(高達2g免疫球蛋白/公斤/天)已導致極高之供應壓力，直至歐洲及美利堅合眾國短缺之程度。
此外，對於自血漿純化血漿蛋白質已研發出諸多方法。使得有可能提取治療用途之血漿蛋白質之工業製程稱為「血漿分餾」。現今使用之分餾技術一般以冷沈澱步驟開始，該技術在於在低溫下解凍血漿以分離富含因子VIII、馮威里氏因子(von Willebrand factor)、血纖維蛋白原及纖維結合蛋白之冷沈澱物。上清液部分(冷上清液)之蛋白質可隨後藉由在乙醇存在下依序沈澱來分離(Cohn等人1946,J.Am.Chem.Soc.68,459)。
已描述亦使用乙醇分餾之原始科恩(Cohn)方法之若干變化形式。因此，Tanaka K.等人，2000(Braz J Med Bio Res 2000,33(1)：27-30)之公開案描述一種藉由三種類型凝膠(兩種離子交換凝膠(Q-瓊脂糖FF及Cm-瓊脂糖FF)及凝膠過濾步驟(Sephacryl S-300 HR))之層析分離自根據科恩方法之乙醇分餾後獲得之部分「I+II+II」及「II+III」純化免疫球蛋白G的方法。
Steinbuch等人(Rev.Franc.Et.Clin，及Biol.1969,XIV,1054)已描述使用辛酸(或辛酸/辛酸鹽)進行沈澱之乙醇沈澱替代路徑。後者使來自血漿之大多數蛋白質沈澱且使免疫球蛋白保留在上清液中。此等免疫球蛋白藉由吸附(以「分批」方式)於陰離子交換樹脂、DEAE-纖維素上來進行純化，其亦使免疫球蛋白留在上清液中。後者隨後藉由超過濾濃縮。
然而，此等乙醇或辛酸沈澱可引起某種蛋白質變性及蛋白質聚集物形成(尤其免疫球蛋白聚合物)，其可引起過敏性反應。因此需要例如用丙內酯或用還原劑及烷基化劑或在pH 4下或用PEG繼續進行後 續加工步驟以使聚集物沈澱。此等額外步驟往往會降低血漿蛋白質產率。
因此，大多數製造方法主張每公升分餾血漿介於3.5g IgG與5.5g IgG之間的IgG產率(「A modified caprylic acid method for manufacturing immunoglobulin G from human plasma with high yield and efficient virus clearance」-Vox Sang.2006年2月；90(2)：97-104及「A new methodology for polyvalent intravenous immunoglobulin solution production with a two-stage process of viral inactivation」-Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences第46卷，第4期，2010年10月/12月)。
此外，使用乙醇分餾成本相對較高。實際上，一公升血漿之分餾需要使用2l乙醇。因此，為加工幾千公升血漿，必需直接在生產現場儲存極其大量乙醇且冷卻乙醇分餾專用之系統。此外，工業機構必須適用於儲存、處理、消除且可能地回收較大體積溶劑，其代表顯著技術限制及成本。
血漿蛋白質之純度為保證其在使用期間之最大功效及安全性之重要問題。因此，必須藉由其他純化步驟補充乙醇或辛酸分餾以便達到所需純度，但歸因於產物之額外損耗，進行此等操作損害產率。對於此等額外步驟，愈來愈常使用層析技術，因為其特徵在於較高程度之純化以及較高產率。因此宜使此等層析技術之位置儘可能接近初始血漿以便提高產率及純度，同時保持相關蛋白質完整性。此已應用於捕獲相對稀有的血漿蛋白質，諸如因子XI、因子IX、因子VIII、馮威里氏因子、蛋白C、抗凝血酶III等。但對於諸如多價免疫球蛋白、白蛋白及血纖維蛋白原之大量蛋白質，捕獲此等分子所需的層析凝膠體積將過大且將導致無利可圖的工業工具(設備尺寸及凝膠成本)。儘管一些描述層析循環之積聚用於加工大量蛋白質(「Description and assessment of an industrial chromatography unit for preparing human plasma albumin」-Biotechnology of Blood Proteins 1993，第227卷，第176至181頁)，但此等操作並非最佳且仍發展不足。
因此，仍非常需要提高治療用途之血漿蛋白質及尤其免疫球蛋白、白蛋白及/或血纖維蛋白原之產物產率，同時保證最終產物具有較高純度且不含可能有害的污染物。
一般而言，本發明係關於一種用於製備較高產率且尤其高於技術人員已知之方法之產率之經純化人類血漿蛋白質部分的方法。為此目的，本申請人研發出一種用於自血漿製備經純化人類血漿蛋白質濃縮物之方法，其包含至少一個藉由多管柱層析，且尤其藉由多管柱親和或離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析的純化步驟。更精確而言，根據本發明之方法提出藉由將通常所用之層析管柱分成若干串聯置放或獨立控制之較小管柱來進行層析步驟。實施多管柱層析之此類步驟一方面使得有可能最大可能程度使用層析凝膠中所存在之官能基且另一方面大大減少每批血漿蛋白質製品待要使用之層析凝膠之體積。
本發明亦關於一種用於製備與技術人員已知之方法相比具有更高產率之人類免疫球蛋白(Ig)濃縮物的方法。為此目的，本申請人研發出一種用於製備經純化Ig之方法，其中使用多管柱層析且尤其使用多管柱親和或離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析的捕獲步驟替換使用乙醇及/或辛酸之初始分餾步驟。在層析之前未進行藉由沈澱消除蛋白質污染物之步驟。血漿或血漿冷上清液直接經該多管柱層析。若多管柱層析為陰離子交換層析，則根據本發明之方法在該層析後宜包含使用辛酸及/或乙醇之分餾步驟。
因此，本發明係關於一種用於自血漿製備治療用途之經純化血漿蛋白質濃縮物之方法，其包含純化步驟，其中血漿或血漿部分經多管柱層析。
特定而言，本發明係關於一種自血漿製備治療用途之人類免疫球蛋白濃縮物之方法，其包含免疫球蛋白純化步驟，其中血漿或冷沈澱血漿上清液經多管柱親和層析。
在另一實例實施例中，免疫球蛋白純化步驟藉由使血漿或冷沈澱血漿上清液經多管柱陰離子交換層析進行。隨後可能設想使用辛酸之後續沈澱步驟，在其結束時收集含有免疫球蛋白之上清液。
本發明亦關於一種用於自血漿製備治療用途之人類白蛋白及/或血纖維蛋白原濃縮物之方法，其包含白蛋白及/或血纖維蛋白原純化步驟，其中血漿或冷沈澱血漿上清液經多管柱層析且尤其經多管柱親和或離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析。
根據本發明之特定實施例，多管柱親和或離子交換層析捕獲可隨後溶離之相關蛋白質(血纖維蛋白原及/或白蛋白)。根據本發明之另一特定實施例，多管柱親和或離子交換層析捕獲污染物以便收集未保留部分中之相關蛋白質(白蛋白及/或血纖維蛋白原)。根據本發明，此類方法亦可包含後續額外步驟，其中含有白蛋白及/或血纖維蛋白原之部分經藉由沈澱之純化步驟，在其結束時污染物仍留在溶液中。
一般而言，根據本發明，有可能藉由多管柱層析直接自血漿或冷上清液或乙醇或辛酸部分(視情況病毒安全)或由中間純化步驟且尤其過濾、另一層析或多管柱層析等產生之任何產物繼續進行治療用途之血漿蛋白質之純化步驟。
在本發明之特定實施例中，冷沈澱血漿上清液或血漿直接經第一多管柱層析以便捕獲血漿蛋白質，隨後此層析之未保留部分經第二 多管柱層析以便捕獲第二血漿蛋白質。
隨後，第二多管柱層析之未保留部分可經層析，尤其多管柱層析或沈澱步驟以便純化第三血漿蛋白質。
在一特定實例實施例中，根據本發明之方法在於一種用於自血漿製備治療用途之白蛋白及/或血纖維蛋白原濃縮物之方法，其包含藉由多管柱親和或離子交換層析純化冷沈澱血漿上清液之步驟，視情況後接例如藉由用乙醇沈澱包含白蛋白及/或血纖維蛋白原之部分來消除該部分中所存在之污染物的步驟。在另一實例實施例中，藉由多管柱離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析對免疫球蛋白耗盡血漿部分進行純化步驟。有利地，在用於製備免疫球蛋白濃縮物之方法之後，視情況藉由多管柱層析，使用在該方法結束時收集到之血漿部分進行用於製備白蛋白及/或血纖維蛋白原濃縮物之方法。
因此，本發明亦關於一種用於分餾血漿之方法，其包含在於使血漿或冷沈澱血漿上清液直接依次經以下步驟： - 多管柱離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析，在其結束時收集含有免疫球蛋白之部分；隨後 - 多管柱離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析，在其結束時收集含有白蛋白之部分；隨後 - 多管柱離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析，在其結束時收集含有血纖維蛋白原之部分。
三個步驟之順序可視情況改變，以便視需要促進蛋白質中之一者相對於兩種其他蛋白質之提取。
因此，本發明亦關於一種用於分餾血漿之方法，其包含在於使血漿或冷沈澱血漿上清液直接依次經以下步驟： - 多管柱離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析，在其結束時收集含有免疫球蛋白之部分；隨後 - 多管柱離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析，在其結束時收集含有血纖維蛋白原之部分；隨後 - 多管柱離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析，在其結束時收集含有白蛋白之部分。
因此，血漿部分依次經三種多管柱層析，在其結束時其依次耗盡免疫球蛋白、白蛋白且隨後血纖維蛋白原或按另一順序耗盡。
在一特定實例實施例中，根據本發明之方法由用於自血漿製備治療用途之免疫球蛋白濃縮物之方法組成，該方法依次包含：(a)藉由物理化學處理(諸如用溶劑/清潔劑或單獨的清潔劑或單獨的溶劑之處理，但不限於相對實體之可能組合)使血漿第一病毒不活化或消除步驟；(b)藉由多管柱親和層析步驟(a)所產生之不活化血漿來純化冷沈澱血漿上清液之步驟；(c)視情況，尤其藉由多管柱抗A及抗B親和層析自步驟(b)所產生之免疫球蛋白濃縮物消除抗血球凝集素抗體之步驟，(d)視情況，藉由奈米過濾使步驟(b)或步驟(c)所產生之免疫球蛋白濃縮物第二病毒不活化或消除之步驟；及(e)將一或多種醫藥學上可接受之穩定劑添加至步驟(b)、步驟(c)或步驟(d)所產生之免疫球蛋白濃縮物中之步驟。
在另一特定實例實施例中，根據本發明之方法在於一種用於自血漿製備治療用途之免疫球蛋白濃縮物之方法，該方法依次包含：(a')藉由多管柱親和層析純化冷沈澱血漿上清液之步驟； (b')藉由清潔劑/溶劑使步驟(a')中所獲得之免疫球蛋白濃縮物病毒不活化或消除之第一步驟；(c')視情況，尤其藉由多管柱親和層析自步驟(b')所產生之免疫球蛋白濃縮物消除抗A及抗B抗體之步驟；(d')視情況，藉由奈米過濾使步驟(b')或步驟(c')所產生之免疫球蛋白濃縮物第二病毒不活化或消除之步驟；及(e')將一或多種醫藥學上可接受之穩定劑添加至步驟(b')、步驟(c')或步驟(d')所產生之免疫球蛋白濃縮物中之步驟。
在另一特定實例實施例中，根據本發明之方法在於一種用於自血漿製備治療用途之免疫球蛋白濃縮物之方法，該方法依次包含：(A)冷沈澱血漿上清液之乙醇及/或辛酸分餾之步驟；(B)視情況，藉由溶劑/清潔劑使步驟(A)中所獲得之溶液病毒不活化或消除之第一步驟；(C)藉由多管柱陰離子交換層析步驟(A)或步驟(B)中所獲得之溶液之純化步驟；(D)視情況，尤其藉由多管柱親和層析自步驟(C)結束時所獲得之免疫球蛋白濃縮物消除抗A及抗B抗體之步驟；(E)視情況，藉由奈米過濾使步驟(C)或步驟(D)結束時所獲得之免疫球蛋白濃縮物第二病毒不活化或消除之步驟；及(F)將一或多種醫藥學上可接受之穩定劑添加至步驟(C)、步驟(D)或步驟(E)所產生之免疫球蛋白濃縮物中之步驟。
本發明亦關於一種用於分餾血漿之方法，其包含在於使血漿或冷沈澱血漿上清液直接依次經以下步驟：- 多管柱親和層析，其中至少一種親和配位體為特異性結合免疫球蛋白之配位體，在其結束時收集含有免疫球蛋白之部分；及/或- 多管柱離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合 (多模式)之多管柱層析(稱為混合模式層析，視情況為高鹽耐受性)，在其結束時收集含有血纖維蛋白原及/或白蛋白之部分。
本發明亦關於一種用於分餾血漿之方法，其包含在於使血漿或冷沈澱血漿上清液直接依次經以下步驟：- 多管柱親和層析，其中至少一種親和配位體為特異性結合免疫球蛋白之配位體，在其結束時收集含有免疫球蛋白之部分；及/或- 多管柱親和層析，其中至少一種親和配位體為特異性結合血纖維蛋白原之配位體，在其結束時收集含有血纖維蛋白原之部分；及/或- 多管柱離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析(稱為混合模式層析，視情況為高鹽耐受性)，在其結束時收集含有白蛋白之部分。
有利地，首先進行靶向免疫球蛋白之多管柱親和層析，對此第一分餾步驟所產生之部分進行靶向血纖維蛋白原及/或白蛋白之多管柱親和及離子交換層析且使G型免疫球蛋白耗盡。用於捕獲白蛋白之多管柱層析宜在第三位置進行。
本發明亦關於具有與血漿中之免疫球蛋白分佈概況類似或相同之免疫球蛋白分佈概況的G型免疫球蛋白濃縮物。
優先地，根據本發明之免疫球蛋白濃縮物為具有50%與70%之間的IgG1、25%至35%之IgG2、2%至8%之IgG3及1%至8%之IgG4的IgG免疫球蛋白濃縮物。
本發明進一步關於具有與血漿之抗原譜類似或相同之抗原譜的免疫球蛋白濃縮物。優先地，根據本發明之免疫球蛋白濃縮物具有類似於及/或優於先前技術濃縮物之抗原譜的抗原譜。
圖1(圖1A至圖1D)圖解表示當在根據本發明之方法中實施時多管 柱層析之原理。
圖2圖解表示根據實施根據本發明之方法之一實例，藉助於一連串多管柱層析連續純化大量血漿蛋白質的步驟之工序。
圖3為在非還原條件及庫馬斯藍(Coomassie blue)染色實例2、實例3及實例4中所進行之多管柱層析結束時獲得之部分下之SDS-PAGE凝膠之圖像。
定義
根據本發明，「血漿蛋白質」意謂血漿中所含有之任何蛋白質且更尤其具有工業或治療利益之任何蛋白質。血漿蛋白質包括白蛋白、α/巨球蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、抗凝血酶、抗胰蛋白酶、Apo A、Apo B、Apo C、Apo D、Apo E、Apo F、Apo G、β XIIa、C1抑制劑、C反應蛋白、C7、C1r、C1s、C2 C3、C4、C4bP、C5、C6、C1q、C8、C9、羧肽酶N、血漿銅藍蛋白、因子B、因子D、因子H、因子I、因子IX、因子V、因子VII、因子VIIa、因子VIII、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、血纖維蛋白原、纖維結合蛋白、結合球蛋白、凝血酶、肝素輔因子II、富含組胺酸GP、IgA、IgD、IgE、IgG、ITI、IgM、激肽酶II、激肽原HPM、溶菌酶、PAI 2、PAI I、PCI、纖維蛋白溶酶、纖維蛋白溶酶抑制劑、纖維蛋白溶酶原、前白蛋白、前激肽釋放素、備解素、蛋白酶連接蛋白INH、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、凝血酶原、血清澱粉樣蛋白(SAP)、TFPI、硫醇蛋白酶、凝血調節蛋白、組織因子(TF)、TPA、鈷胺載運蛋白II、皮質素載運蛋白、運鐵蛋白、玻璃連結蛋白及馮威里氏因子。
特定而言，血漿蛋白質包括凝血蛋白，亦即，涉及導致血凝塊形成之鏈反應級聯之血漿蛋白質。凝血蛋白包括因子I(血纖維蛋白原)、因子II(凝血酶原)、因子V(促凝血球蛋白原)、因子VII(前轉化 素)、因子VIII(抗血友病因子A)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(斯圖爾特因子(Stuart factor))、因子XI(羅森塔爾因子(Rosenthal factor)或PTA)、因子XII(哈格曼因子(Hageman factor))、因子XIII(纖維蛋白穩定化因子或FSF)、PK(前激肽釋放酶)、HMWK(較高分子量激肽原)、因子III(凝血活酶或組織因子)、肝素輔因子II(HCII)、蛋白C(PC)、凝血調節蛋白(TM)、蛋白質S(PS)、馮威里氏因子(WF)及組織因子路徑抑制劑(TFPI)或組織因子。
在某些實施例中，血漿蛋白質由具有酶活性之凝血蛋白組成。具有酶活性之凝血蛋白質包括因子II(凝血酶原)、因子VII(前轉化素)、因子IX(抗血友病因子B)、因子X(斯圖爾特因子)、因子XI(羅森塔爾因子或PTA)、因子XII(哈格曼因子)、因子XIII(纖維蛋白穩定化因子或FSF)及PK(前激肽釋放酶)之活化形式。
在本發明中，術語「人類免疫球蛋白」或「人類Ig」係指多價免疫球蛋白，其可為免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白M(IgM)或免疫球蛋白G(IgG)。根據本發明之人類免疫球蛋白宜為IgG，不管子類別(IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。其可為整個免疫球蛋白或在多價免疫球蛋白製造製程期間獲得之任何中間部分。
「血漿部分」意謂已經一或多個純化步驟之血漿之任何部分或子部分。因此，血漿部分包括冷沈澱血漿上清液、血漿冷沈澱物(再懸浮)、藉由乙醇分餾(根據科恩或祁斯特勒及聶克文方法(Kistler & Nitschmann method))獲得之部分I至V、用辛酸及/或辛酸鹽沈澱後獲得之上清液及沈澱物、層析管柱(包括多管柱層析)之層析溶離液及未吸附部分，及濾液。
根據本發明，「冷沈澱血漿上清液」或「冷上清液」對應於冷凍血漿(冷沈澱)解凍後獲得之液相。特定而言，冷上清液可藉由在-10℃與-40℃之間的溫度冷凍血漿，隨後在0℃與+6℃之間，較佳在0℃與+1 ℃之間的溫度溫和解凍，繼而離心解凍之血漿以分離冷沈澱物與冷上清液而獲得。冷沈澱物集中血纖維蛋白原、纖維結合蛋白、馮威里氏因子及因子VIII，而冷上清液含有補體因子；維生素K依賴性因子，諸如蛋白C、蛋白S、蛋白Z、因子II、因子VII、因子IX及因子X；血纖維蛋白原，及免疫球蛋白，及白蛋白。
「純化步驟」意謂使得有可能在給定部分中富集相關產物且尤其血漿蛋白質的方法之任何步驟。
根據本發明之製備方法大體上在於使用多管柱層析步驟自血漿或任何血漿部分純化治療用途之血漿蛋白質。實施此類多管柱層析步驟尤其適合於製備免疫球蛋白濃縮物。實際上，根據本發明，有可能使人類血漿或人類血漿冷上清液直接經多管柱層析。當然，在多管柱層析純化上游亦有可能設想過濾及/或乙醇/辛酸分餾之步驟。
使用此類多管柱層析一般會在工業規模上降低治療用途之血漿蛋白質之成本。特定而言，多管柱層析使得有可能在該等管柱總體飽和狀態下使用層析載體，與習知層析相比，其需要更少量之凝膠，其慣例為一旦偵測到相關分子滲漏10%就限制容量。類似地，因為溶離、沖洗及消毒階段係在較小管柱上進行，所以相比於習知層析，溶液及緩衝液之需要大大減少。儘管已描述藉由層析級聯分餾血漿分子之原理(2005年5月PPB會議之John Curling等人「A comparative study of Cohn and chromatographic fractionation using a novel affinity「Cascade Process」」)，但其由於聯合的較低容量及生產率而僅具有有限的工業利益。以尤其出人意料且有利的方式，使用根據本發明之多管柱層析藉由允許在每單位時間及凝膠體積所提取之產物質量單元中表現更大捕獲容量及/或更高生產率使得級聯層析原理更具吸引力。
多管柱層析原理圖解表示於圖1中。此類多管柱層析允許將層析 中習知使用之管柱(層析載體)分化成若干具有較小尺寸且彼此連接以使得一者出口與另一者入口連接之管柱(具有相同層析載體)。
一般而言，多管柱層析不包括具有不同性質之若干層析管柱之併接(串聯或並聯式)。
總而言之，將待純化之部分注入出口與管柱2串聯連接之管柱1(圖1A)上。因此，離開管柱1之相關血漿蛋白質之漏出物並非進入「未吸附」收集部分，而是收集於管柱2(保護管柱)上，殘餘相關血漿蛋白質將能夠吸附於其上。串聯置放於管柱1之後的保護管柱2、保護管柱3、保護管柱4等之數目視待收集到之相關蛋白質之漏出比例而定(在此處所描述之實例中，展現了3個保護管柱2至4)。在裝載且隨後管柱1之沖洗已完成後(圖1A及圖1B)，其可與其他管柱2至管柱4分離以便單獨地進行溶離(圖1C)、再生(圖1D)及視情況平衡(未表示)步驟。在管柱1已再次平衡後，其可再次串聯置放作為最終保護管柱等。
隨後將部分裝載之並聯管柱2移動至第一位置且轉而經歷血漿部分之裝載，在以下保護管柱3及保護管柱4等上再次收集其漏出物。
因此，多管柱層析使得有可能在不因打破而損失材料的情況下使凝膠飽和度最佳化，因為漏出物被收集於保護管柱上。
根據本發明，可使用若干多管柱層析技術。特定而言，已知受激移動床(SMB)技術，自其衍生出尤其適用於實施根據本發明之方法之依序多管柱層析(SMCC)技術。多管柱層析之實施例之實例描述於專利申請案WO2007/144476及WO2009/122281中。
根據本發明，多管柱層析可為親和、離子交換(陰離子或陽離子)、疏水相互作用、混合模式或尺寸排阻層析。優先地，多管柱層析為多管柱親和、混合模式或陰離子交換層析。
在本發明之一特定實例實施例中，多管柱層析為徑向層析，亦 即，使用徑向管柱。根據本發明，有可能使用較大外徑(入口側)表面積與較小內徑(出口側)表面積之間的比率至少為2之徑向管柱。此等管柱使得有可能提高負載流動速率，使得在存在較大體積待加工血漿時及/或必須快速純化諸如免疫球蛋白之相關血漿蛋白質以便保存其分子完整性時該方法為尤其有利的。類似地，此使得有可能減少純化步驟之持續時間且因此使每單位時間之批次數量增加。
視需要且更尤其視待加工血漿之體積而定，可使用幾毫升(例如針對實驗室規模之實施例)，例如5ml至20ml至幾百或幾千公升(工業規模)，例如200l至2000l之層析管柱。對於各種範圍之管柱，亦有可能將形成固定相之凝膠床高度調適至例如6cm、12cm或18cm。技術人員已知如何視待加工體積及/或所需流動速率而對管柱數目、其尺寸及凝膠高度進行調適。
在一特定實例且尤其用於直接自冷上清液製備免疫球蛋白濃縮物之實例中，宜使用多管柱親和層析。
已知大多數親和凝膠(形成親和層析之固定相)，尤其工業上所使用之彼等凝膠具有比離子交換凝膠小四至五倍之最大免疫球蛋白(Ig)裝載量(20g/l至30g/l相對於80g/l至100g/l)。因此，一般已確認加工較大體積血漿所需的親和凝膠量使得該方法在經濟上不可行。
然而，本申請人發現可藉由將層析管柱分成若干較小管柱，尤其分成3至8個管柱，優先3至5個管柱來抵消此不足之處。使用多個層析管柱使得有可能串聯置放一或多個主要管柱、在裝載相關蛋白質期間將捕獲漏出主要管柱之相關血漿蛋白質之保護管柱。此(此等)主要管柱中所存在之親和配位體隨後飽和以達到層析凝膠之最大容量。隨後自系統中取出此(此等)管柱以單獨溶離且允許收集相關蛋白質。隨後保護管柱轉而變為主要管柱。3至50次連續循環，較佳5至30次且更佳7至15次連續循環使得有可能使親和配位體之用途最大化且因此減 少捕獲及溶離相關分子所需的凝膠總體積。
有利地，親和配位體係選自抗體；抗體片段；抗體衍生物；或化學配位體，諸如肽、模擬肽、類肽、奈米非汀(nanofitin)；或寡核苷酸配位體，諸如適體。
舉例而言，使得有可能在較高流動速率之情況下運行的包含經交聯之瓊脂糖基質之凝膠可與能夠結合相關蛋白質之親和配位體組合使用。在一特定實施例中，親和配位體使得有可能結合人類Ig之Fc片段或免疫球蛋白內之任何保守序列。
在另一特定實施例中，所使用之親和配位體為識別Ig之Fc片段且偶合至例如來自GE Healthcare之IgSelect凝膠之基質的重組蛋白。
有利地，可選擇配位體以特異性識別一類免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G)及/或特異性識別一或多種免疫球蛋白子類別(例如IgG1及/或IgG2及/或IgG3及/或IgG4)。在另一特定實施例中，所使用之親和配位體為蛋白G，其對IgG具有親和性且有利地對IgA不具有親和性。在再一特定實施例中，所使用之親和配位體為蛋白A，其特異性結合IgG1、IgG2及IgG4但並不捕獲IgG3。
在一特定實例實施例中，多管柱親和層析之親和配位體對免疫球蛋白G具有親和性且宜選自對IgG1、IgG2、IgG3及IgG4具有親和性之配位體。更特定而言，根據本發明方法獲得之IgG濃縮物宜具有類似於血漿之IgG子類別分佈概況。尤其，根據本發明之IgG濃縮物宜包含50%與70%之間的IgG1、25%至35%之IgG2、2%至8%之IgG3及1%至8%之IgG4，或更佳60%與70%之間的IgG1、30%至35%之IgG2、3%至6%之IgG3及2%至5%之IgG4。在一特定實施例中，根據本發明方法獲得之濃縮物相比於血漿，IgG3及/或IgG4子類別可能略微減少，儘管如此，殘餘產物在治療功效方面仍可與具有類似於血漿之IgG子類別譜之產物相當。
在另一特定實例實施例中，多管柱親和層析之親和配位體對血纖維蛋白原或白蛋白具有親和性。更特定而言，本發明亦關於一種用於直接自血漿製備人類血纖維蛋白原及/或白蛋白濃縮物之方法，其中該血漿或冷沈澱血漿上清液經多管柱親和層析，其中親和配位體對血纖維蛋白原及/或白蛋白具有親和性。所使用之配位體尤其可為任何市售配位體，例如CaptureSelect HSA(Life Technologies)親和配位體或CaptureSelect血纖維蛋白原(Life Technologies)親和基質配位體。
有利地，針對本發明方法所選之親和配位體對消毒條件及/或與工業用途相容之密集再使用具有抗性。因此，在一特定實施例中，親和配位體宜選自肽及/或類肽(由諸如噬菌體呈現之組合生物學產生)、奈米非汀(提取自嗜極端細菌)及/或適體。
在一特定實例中，親和配位體為適體，且尤其為核酸適體。如本文所使用之術語「適體」係指單鏈核酸分子、DNA或RNA，且尤其指能夠藉由結合至人類Ig之Fc片段或免疫球蛋白之保守序列來特異性結合至例如免疫球蛋白之相關蛋白質的單鏈核酸分子。有利地，可選擇適體以特異性識別一類免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G)及/或特異性識別一或多種免疫球蛋白子類別(例如IgG1及/或IgG2及/或IgG3及/或IgG4)。適體一般包含5個與120個之間的核苷酸且可藉由所謂的SELEX(指數富集配位體系統進化)方法活體外進行選擇。根據本發明，「核酸適體」意謂單鏈核酸，且尤其意謂特異性結合至人類IgG之Fc片段之單鏈核酸。
適體具有諸多優點。歸因於其寡核苷酸性質，適體具有較低免疫原性及對嚴格的物理化學條件(存在DMSO、極酸性或極鹼性pH、使用有機溶劑或高溫)之較高抗性，允許在用作親和配位體之情況下改變消毒策略。因此有可能藉由進行至消毒步驟以便清潔層析管柱且限制其積垢且減少病毒或朊病毒污染之風險來延長親和凝膠之壽命， 儘管相比於習知層析循環多次且裝載量較高。適體藉助於其核酸類型結構尤其適用於鹼性pH下之消毒，允許再使用100至200次循環。
在以本申請人名義的專利申請案FR 2 970 003中描述用於使用固定核酸適體製造親和載體之方法。特定而言，本申請案描述一種藉由在其表面具有經活化羧酸基團之固體載體上進行接枝來使包含至少一個反應性胺官能基之核酸固定的方法。
在一特定實施例中，多管柱層析宜應用至使用連續層析管柱之一或多個連續純化步驟。因此，第一多管柱層析未保留之部分可以最適合順序用於純化其他相關血漿蛋白質。在一特定實例實施例中，對血漿或冷沈澱物進行第一多管柱層析以便純化免疫球蛋白。由此第一純化產生之血漿部分經第二多管柱層析以便純化白蛋白。免疫球蛋白及白蛋白耗盡之由此第二多管柱層析產生之血漿部分可隨後經第三多管柱層析以便純化血纖維蛋白原等。尤其有可能尤其在不活化凝血級聯之情況下在連續流中處理血漿以持續純化免疫球蛋白、白蛋白及/或血纖維蛋白原。
在另一特定實例實施例中，對血漿或冷沈澱物進行第一多管柱層析以便純化免疫球蛋白。由此第一純化產生之血漿部分經第二多管柱層析以便純化血纖維蛋白原。免疫球蛋白及血纖維蛋白原耗盡之由此第二多管柱層析產生之血漿部分可隨後經第三多管柱層析以便純化白蛋白等。尤其有可能尤其在不活化凝血級聯之情況下在連續流中處理血漿以持續純化免疫球蛋白、血纖維蛋白原及/或白蛋白。
根據本發明，用於製備治療用途之人類血漿蛋白質濃縮物之方法亦可包含以下步驟中之至少一者：(i)病毒不活化或病毒消除步驟；(ii)離子交換層析步驟；(iii)尤其藉由親和層析之抗A及抗B抗體消除步驟； (iv)使用辛酸及/或辛酸鹽之沈澱步驟；(v)藉由超過濾之濃縮步驟；(vi)調配步驟。
有利地，根據本發明之製備方法使得有可能獲得治療用途之人類蛋白質濃縮物且可在步驟(i)至步驟(vi)中包含至少一個後續步驟。
在一特定實例實施例中，製備方法使得有可能獲得治療用途之人類免疫球蛋白濃縮物，其視情況在步驟(i)至步驟(vi)中包含一或多個後續步驟。
在另一特定實例實施例中，製備方法使得有可能獲得治療用途之白蛋白濃縮物，該方法視情況在步驟(i)至步驟(vi)中包含一或多個後續步驟。
在另一特定實例實施例中，製備方法使得有可能獲得治療用途之血纖維蛋白原濃縮物，該方法視情況在步驟(i)至步驟(vi)中包含一或多個後續步驟。
舉例而言，藉由使血漿或冷上清液直接經多管柱層析，尤其多管柱親和或陰離子交換層析獲得之人類血漿蛋白質濃縮物及/或免疫球蛋白濃縮物宜進行至少一個消除或不活化至少一種感染物之步驟。
在步驟(i)所靶向之感染物中，可提及諸如朊病毒之病毒及UTA(非習知可傳染物)。
病毒不活化通常包含用化學物質，例如溶劑及/或清潔劑及/或在加熱(巴氏殺菌(pasteurisation)及/或乾燥加熱)之情況下及/或藉由照射(γ及/或UV-C)及/或藉由pH處理(在酸性pH下之處理)來進行處理。
較佳地，根據本發明之步驟(i)包含使用溶劑及清潔劑之至少一種處理。使用溶劑及清潔劑之處理(一般稱為溶劑/清潔劑或S/D處理)尤其包含使用磷酸三正丁酯(TnBP)及/或選自Triton X-100、Tween(較佳Tween 80)、膽酸鈉及2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇(辛 苯昔醇(Octoxinol))之清潔劑進行之處理。
奈米過濾亦可用於移除感染物，尤其病毒及UTA。在血漿蛋白質之情況下，奈米過濾一般係指經由孔徑小於80nm之過濾器過濾相關蛋白質濃縮物。舉例而言，以下過濾器為可獲得的：BioEx,Pianova® 75nm、Planova® 35nm、Planova® 20nm或Planova® 15nm(Asahi corporation)、Ultipor DV 50或DV 20(Pall Corporation)、Virosart CPV(Sartorius)、Viresolve NFR或NFP(Millipore)。奈米過濾宜在單一過濾器上或在具有相同或減小之孔徑之若干串聯過濾器上進行。
亦可藉助於深度過濾移除感染物。可獲得的過濾器為例如由再生纖維素構成之過濾器，其中可添加Cuno(Zeta+ VR系列過濾器)、Pall-Seitz(P系列深度過濾器)或Sartorius(Virosart CPV,Sartoclear P深度過濾器)銷售之過濾助劑(諸如矽藻土(Celite)、波來鐵(pearlite)或矽藻土(kieselguhr))。
在一特定實施例中，宜直接對血漿或冷沈澱血漿上清液或再懸浮血漿冷沈澱物進行病毒不活化步驟以使得待純化之全部蛋白質受益於多管柱層析上游之處理。
在另一特定實施例中，粗血漿及/或冷沈澱血漿上清液及/或再懸浮血漿冷沈澱物可例如在多管柱層析上游之6μm、1μm隨後0.45μm至0.2μm聚丙烯過濾器或等效介質上經深度過濾或過濾工序。此類預備步驟有利地使得有可能防止及/或減少用於多管柱層析之管柱之過早積垢。在另一特定實施例中，所使用之深度過濾器為脫脂深度過濾器(例如Cuno或Pall-Seitz)，其減少經加工血漿部分中之脂質。
有利地，病毒不活化或消除步驟(i)後接離子交換層析步驟(ii)。
在一特定實例中，離子交換層析步驟(ii)為陰離子或陽離子交換層析。此類陰離子或陽離子交換層析步驟描述於以本申請人名義的專利申請案EP 0 703 922及WO 99/64462中。
在一特定實例中，可對經交聯之多醣凝膠或接枝有DEAE或TMAE或QAE基團之乙烯或丙烯酸聚合物凝膠實施陰離子交換層析步驟(ii)，如以本申請人名義的專利申請案WO2002/092632及WO2013/007740中所描述。
在另一特定實例中，對高鹽耐受性基質進行多管柱陰離子交換及/或混合模式層析，使得有可能捕獲具有較高鹽度之介質(諸如層析未保留之血漿或部分)中之血漿蛋白質。有利地，對來自PALL BIOSEPRA之STAr AX凝膠、來自GE Healthcare之Capto MMC凝膠或來自Merck之ESHMUNO HCX凝膠或技術人員已知之任何等效凝膠進行高鹽耐受性多管柱陰離子交換及/或混合模式層析。
特定而言，對於治療用途之免疫球蛋白濃縮物之製備，陰離子交換層析步驟(ii)可包含：- 將已經歷溶劑-清潔劑處理(步驟(i))之溶液之pH調節至8至10；- 將其裝載於預先在緩衝液中平衡至pH 8至10之層析管柱上，其允許吸附免疫球蛋白且使流出物中之未吸附蛋白質通過；- 用相同緩衝液沖洗直至移除所有未吸附蛋白質及溶劑/清潔劑混合物為止；- 及用適合緩衝液溶離免疫球蛋白。
此溶離可用磷酸鹽緩衝液在4與7之間的pH且較佳pH 6.2下進行以溶離免疫球蛋白。
根據本發明之方法亦可包含抗A及/或抗B抗體消除步驟(iii)。在一個特定實例中，對步驟(ii)結束時獲得之溶液進行抗A及/或抗B抗體消除步驟(iii)。此步驟可例如根據本申請人名義的專利申請案WO 2007/077365中所描述之方法進行。因此，在製備治療用途之免疫球蛋白濃縮物之情況下，步驟(ii)中所獲得之溶液可藉由免疫親和層析藉由在基質接枝有抗原類似於血型A及/或B之寡醣基團之載體上或在 基質接枝有抗原類似於血型A及/或B之寡醣基團之載體混合物上滲濾該多價免疫球蛋白濃縮物進行抗A及抗B抗體消除步驟。在一個特定實施例中，抗A及/或抗B抗體消除步驟(iii)藉由多管柱親和層析進行。
在某些情況下，根據本發明之方法可包含使用辛酸及/或辛酸鹽之沈澱步驟(iv)。一般而言，在略酸性介質中添加辛酸及/或辛酸鹽可沈澱血漿蛋白質，但Ig留在上清液中。根據本發明，可在藉由多管柱層析純化步驟之前或之後進行此辛酸沈澱步驟(iv)。
在一個特定實例實施例中，相關血漿蛋白質藉由多管柱陰離子交換層析之純化步驟後接著後續辛酸及/或辛酸鹽沈澱步驟。此多管柱離子交換層析/辛酸沈澱之組合對於製備Ig濃縮物(尤其IgG濃縮物)及/或白蛋白及/或血纖維蛋白原濃縮物可能特別有利。
特定而言，對於製備治療用途之免疫球蛋白濃縮物，使用辛酸之沈澱步驟(iv)可包含以下步驟：- 視情況將血漿部分之pH調節至3.0與6.0之間的值，較佳調節至pH 4；- 將辛酸添加至血漿部分中；- 離心或過濾以收集富含IgG之上清液。
根據本發明之方法宜包含一或多個藉由超過濾之濃縮步驟(v)。舉例而言，在製備Ig濃縮物期間，有可能使由多管柱層析步驟產生之富含Ig之部分(視情況預先經步驟(i)至(iv)中之一者及/或其他)經薄膜超過濾。
亦有可能設想將一或多種醫藥學上可接受之穩定劑添加至人類血漿蛋白質濃縮物中之步驟(vi)。根據本發明，有可能設想在調配步驟(vi)之前藉由奈米過濾之額外病毒安全步驟(i)。
醫藥學上可接受之穩定劑意謂適用於血漿蛋白質濃縮物之調配 物，尤其為如申請案FR 03 08403中所描述之賦形劑，且優先意謂適用於免疫球蛋白濃縮物之調配物，且尤其為如以本申請人名義的申請案FR 03 04388、FR 08 59117、FR10 54721及FR 10 55825中所描述之賦形劑。
調配步驟(vi)可視情況後接冷凍或冷凍乾燥步驟(vi)中所獲得之該醫藥製劑之步驟(vii)。
有利地，根據本發明之方法尤其藉由避免冷儲存步驟允許製備免疫球蛋白濃縮物及/或血纖維蛋白原及/或白蛋白濃縮物。
有利地，根據本發明之方法使得有可能獲得產率大於5g/l血漿，較佳產率大於6g/l血漿之免疫球蛋白濃縮物。在極其有利的方式中，根據本發明之方法最佳化以便獲得產率接近7-8g/l初始血漿之免疫球蛋白。
有利地，根據本發明之方法使得有可能獲得產率大於30g/l，極其有利地大於35g/l之白蛋白濃縮物。關於血纖維蛋白原，因為血漿水準為約3g/l，所以親和捕獲步驟宜使得有可能在一個步驟中捕獲其80%。較佳地，連續層析使得有可能達到大於90%之產率。
在有利的方式中，根據本發明之方法所獲得之免疫球蛋白濃縮物具有與血漿之抗原譜類似或相同之抗原譜。在一特定實施例中，根據本發明之方法所獲得之免疫球蛋白濃縮物具有類似於及/或優於先前技術濃縮物之抗原譜的抗原譜。實際上，在根據本發明之方法期間免疫球蛋白之有限損耗宜使得有可能保留類似於血漿之免疫球蛋白分佈且保存較寬抗原板。
因此，根據本發明之方法對於產生針對特定抗原靶之免疫球蛋白部分而言尤其有利。
同樣地，根據本發明之方法對於尤其自免疫球蛋白已耗盡之血漿部分製備白蛋白濃縮物而言尤其有利。根據本發明之多管柱層析步 驟實現大於90%之捕獲產率。雖然在習知層析步驟期間凝膠容量一般為在25g/l與30g/l之間的凝膠，但使用根據本發明之多管柱陰離子交換或疏水相互作用層析或化學配位體組合(多模式)層析使得有可能獲得大於50g/l凝膠之容量，亦即，載體之動態容量之總飽和度。
以下實例說明本發明，然而不限制其範疇。
實例1：藉由對冷上清液進行多管柱親和層析來製備免疫球蛋白濃縮物 材料及方法 冷上清液
將包含8g/l與10g/l之間的IgG之約5公升人類血漿冷上清液之兩個批次(批次13500-13L-06002及13500-13L-06007)等分成700ml部分，隨後在-80℃下冷凍。所使用之批次之特徵呈現於以下表1中。
在測試期間，在37℃水浴中在產物不超過25℃內部溫度之情況下使所需體積之冷上清液解凍20至30分鐘。
緩衝溶液
親和層析方法之各步驟期間所使用之緩衝溶液之組成概述於以下表2中。
離子交換層析方法之各步驟期間所使用之緩衝溶液之組成概述 於以下表3中。
層析凝膠
對於親和層析，使用來自GE Healthcare之IgSelect®凝膠(批次編號10035817及10017479)。所使用之親和配位體為來自BAC(BioAffinityCompany)之配位體，其特異性結合人類IgG之Fc片段。此配位體為14kD重組蛋白，其經由促進Ig吸附之長鏈碳間隔物與基質基底偶合。Ig經由多點醯胺鍵與間隔物偶合。
對於離子交換層析，使用強力陰離子交換凝膠Fractogel® EMD TMAE(批次編號09L03583)。此凝膠由經交聯之聚甲基丙烯酸酯樹脂(其上接枝三甲基胺基乙基(TMAE))組成。
管柱
對於多管柱親和層析，與BioSc Lab自動化系統(Novasep)組合使用3至5個來自Proxcys公司之徑向管柱、參考物μ-RFC 5.0-6.0(批次1303B014-凝膠體積：10ml；凝膠高度：12cm；入口直徑與出口直徑之比率：2：1)。
對於TMAE層析，與AKTA純化器10自動化系統(GE Healthcare)一起使用凝膠體積為41ml，高度為20.4cm且表面積為2.0cm2之XK 16管柱(GE Healthcare)。
超過濾
使用截留值為30kDa且表面積為50cm2(參考C1PA45544)之 Millipore Biomax 30(PES)盒。
滅菌過濾
使用表面積為5cm2且孔隙度為0.45μm及0.2μm(參考16537及16532)之Sartorius Minisart過濾器。
測試 多管柱親和層析
在凝膠吸附及沖洗階段期間，在4個依次串聯連接的管柱上進行測試，其中裝載量為26g IgG/l凝膠，接觸時間為5分鐘，結合pH在7.3與7.8之間，溶離用0.1M甘胺酸溶液進行(pH為3)。
在每次層析後再生凝膠。
再生在於穿過2CV之2M氯化鈉溶液。
藉由在280nm處記錄OD且藉由計算IgG產率(濁度測定法分析)監測層析。
在吸附期間，工作流動速率為2.3ml/min，其對應於2分鐘之接觸時間。
多管柱親和層析步驟如以下表4中所概述進行。
CV：管柱體積
S/D處理及TMAE層析
進行S/D處理持續約30分鐘以使包膜病毒不活化。隨後調節產物 pH及傳導性，之後注射於TMAE凝膠上。
隨後收集TMAE凝膠之未吸附部分(移除部分)；在返回至基線且沖洗管柱後，收集凝膠溶離液用於以下階段。
超過濾
超過濾步驟使得有可能在80g/l至120g/l之中間濃度下滲析且濃縮TMAE管柱之溶離液。
調配
藉由添加調配緩衝液(甘露糖醇、甘胺酸、聚山梨醇酯80)調配產物。將產物之最終濃度調節至50g/l。
在一連串0.45μm及0.22μm過濾器上無菌過濾所獲得之產物。隨後取樣且以液態形式儲存在4.0℃至7.0℃之溫度下。
結果
對最終產物進行分析以與根據具有使用乙醇之分餾作為第一純化步驟之方法獲得之50g/l免疫球蛋白IgG(參考產物)進行比較。
- 藉由濁度測定法分析總IgG及子類別(表6)。
- 藉由ELISA(酶聯結免疫吸附劑分析法)分析IgA、IgM及IgE(表7)。
應注意，自冷上清液直接純化IgG之此等條件產生品質等效於參考產物之產物。此外，如以上表6所指示，觀測到所有IgG子類別得以 保存，其中其分佈接近血漿之分佈。
更有趣的是，使用IgSelect凝膠之多管柱親和層析具有大於90%及每公升冷上清液7.4g收集到之IgG的步驟產率。注意到來自親和凝膠之未吸附部分中之完全IgG消耗。
總之，藉由多管柱層析直接自血漿冷上清液純化IgG在工業規模上為絕對有可能的，尤其用於每天加工幾千公升體積之血漿。
舉例而言，為加工4500公升人類血漿之工業批次，可使用以下各者：4個50l管柱及12cm凝膠高度，其中冷上清液裝載量對應於每公升凝膠27g IgG，線性吸附流動速率在100cm/h與300cm/h之間，且凝膠沖洗及溶離步驟之較高線性流動速率在200厘米/小時與600厘米/小時之間。
由3個具有70公升凝膠之管柱或5個具有40公升凝膠之管柱構成之組態為可能的，藉由所使用之原料體積測定加工全部批次之循環進行次數。
此類實施例(即使在工業規模上)使得有可能獲得符合管理需求且具有醫藥用途所需的所有品質(純度、生物安全性、IgG子類別分佈等)之免疫球蛋白濃縮物。特定而言，觀測到血漿之四個IgG子類別得以保存。為消除溶劑/清潔劑混合物，可隨後設想IgA及IgE、TMAE層析。
此外，有可能為沖洗凝膠之步驟提供80%聚山梨醇酯，其與使用NaCl之預溶離同時或作為尿素/乙酸部分中之混合物。
實例2：藉由對血漿進行多管柱親和層析來捕獲免疫球蛋白 材料及方法
在37℃水浴中在產物未超過25℃內部溫度之情況下使得有可能形成約30l血漿庫、包含8g/l與10g/l之間的IgG之人類血漿袋解凍以便經由第一多管柱層析提取免疫球蛋白。
緩衝溶液
親和層析方法之各步驟中所使用之緩衝溶液之組成概述於以下表2中。
層析之凝膠
對於親和層析，使用來自Life Technologies公司之CaptureSelect FcXL親和凝膠(參考19432801L，批次編號200814-03)。所使用之親和配位體為來自BAC公司(BioAffinityCompany)之配位體，其特異性結合4個人類IgG子類別之CH3結構域。此配位體為14kD重組蛋白。
管柱
對於多管柱親和層析，與BioSc M試驗性自動化系統(Novasep)組合使用4個來自Proxcys公司之徑向管柱(MD 122 MK III-凝膠體積：對於具有1.0l凝膠之總親和凝膠體積而言為每管柱250ml；凝膠高度：12cm；入口直徑/出口直徑比：2/1)。
測試 多管柱親和層析
在4個依次受自動化系統控制的管柱上進行測試，其中血漿裝載量對應於21g IgG/l凝膠，接觸時間為3分鐘至4分鐘，未改質血漿吸附pH在7.1與7.8之間，溶離用乙酸溶液在pH 3.0下進行。在各層析後再生凝膠。
藉由在280nm處記錄OD且藉由計算溶離液庫之IgG產率(濁度測定法分析)監測層析。多管柱親和層析步驟如以下表10中所概述進行。
為限制在過度酸性pH下IgG聚集之風險，使用1M氫氧化鈉溶液將所獲得之親和管柱溶離液調節至pH 4.8。
多管柱FcXL親和層析溶離液之透濾作用濃縮
於水中透濾溶離液且在截留閾值為30kDa之薄膜上濃縮以便獲得約70g/l之濃縮物。
結果
對超過濾濃縮多管柱層析溶離液進行分析。
- 藉由濁度測定法分析總IgG及IgG子類別(表11)。
- 藉由ELISA(酶聯結免疫吸附劑分析法)分析IgA、IgM及IgE(表12)。
應注意，自血漿直接純化IgG之此等條件產生品質極好之產物。此外，如以上表11所指示，觀測到所有IgG子類別得以保存，其中其分佈接近血漿之分佈。
更有利地，使用FeXL凝膠之多管柱親和層析具有大於90%之步驟產率，亦即，每公升經加工血漿收集大於7.5g之IgG。注意到來自親和凝膠之未吸附部分中之完全IgG消耗。另外，在來自凝膠之未吸附部分中完全收集白蛋白及血纖維蛋白原。
總之，可完全在工業規模上設想藉由多管柱層析直接自血漿純化IgG，尤其用於每天處理幾千公升體積之血漿。
此類實施例(即使在工業規模上)使得有可能極其有效地捕獲血漿中所存在之免疫球蛋白。其亦使得有可能在單一步驟中獲得極大純度之溶離液，其保留治療性免疫球蛋白庫之預期品質。特定而言，觀測到血漿之四個IgG子類別得以保存且IgA、IgM及IgE得以充分消除。為消除殘餘痕量IgA、IgM及IgE，可隨後設想TMAE類型(Merck)之離子交換層析。
實例3：藉由多管柱離子交換層析、疏水相互作用層析或化學配位體組合(多模式)捕獲白蛋白 材料及方法
使用根據實例2之IgG純化方法結束時收集到之IgG耗盡血漿，白蛋白完全未與所使用之親和凝膠結合。
血漿部分之特徵為：在16.15g/l、pH=6.5、傳導性為12mS/cm下，於0.01M檸檬酸鹽緩衝液中之人類白蛋白。
層析方法之各步驟中所使用之緩衝液溶液之組成概述於以下表15中。
混合模式層析凝膠
對於白蛋白層析，使用HEA Hypercel類型之鹽耐受性混合模式凝膠。
管柱
與BioSc Lab自動化系統(Novasep)組合使用5個串聯徑向管柱，各為10ml。進行各164分鐘之六次循環，亦即約17小時之連續操作。
在此實例中所應用之多管柱層析條件使得有可能確認白蛋白之幾乎完全捕獲，極少白蛋白殘留於未吸附部分中。下表概述所收集到之各部分之產率及相關經純化部分中所達到之最小純度。
相比於習知測試，在多管柱層析測試期間觀測到容量增加至少70%，其中當在管柱出口處達到10%漏出物時停止裝載。表17概述針對2種條件所計算之增量。
表17：比較習知層析與多管柱層析(等效層析緩衝液)中之HEA凝膠之
表17之結果展示僅有約3.4%之白蛋白未被吸附。觀測到約80%之電泳純度。
在pH=3.9下溶離後，獲得88%之產率。此測試展示藉由層析根據HEA-HyperCel載體上之多管柱層析模式捕獲到至少96%之血漿白蛋白且在溶離時收集到至少88%之此白蛋白，其對應於至少80%之捕獲/溶離平衡。在此凝膠上之多管柱層析使得有可能將凝膠容量自習知層析中之30g/l變為52g/l，亦即，批次所需總凝膠體積減少70%。
因為人類血漿由約40g/l之白蛋白構成，所以根據此實例可純化至少33g/l。
實例4：藉由多管柱親和層析捕獲血纖維蛋白原 材料及方法 血漿部分
在已在-80℃下冷凍且儲存後，使用根據實例3之純化白蛋白方法(通過兩個多管柱層析持續14小時)結束時收集到之IgG及白蛋白耗盡之血漿，且隨後在藉由層析捕獲血纖維蛋白原當天解凍。
血漿部分之特徵：抗原血纖維蛋白原：0.32g/l。
緩衝溶液
層析方法之各步驟中所使用之緩衝溶液之組成概述於以下表18中。
親和層析凝膠
對於層析，使用CaptureSelect血纖維蛋白原親和凝膠(Life Technologies參考191291050，批次171013-01)，其血纖維蛋白原捕獲特徵概述於以下表19中。
管柱
使用5ml軸向管柱(參考Tricorn 5/100(GE Healthcare)，管柱體積：1.6ml；管柱高度：8cm)。
親和純化
在無改質之情況下將解凍之免疫球蛋白及白蛋白耗盡之血漿注入經平衡之血纖維蛋白原CaptureSelect親和管柱上。施用約10g/l之裝載量。藉由ELISA方法分析溶離液之血纖維蛋白原含量。
結果
在該方法結束時，血纖維蛋白原產率為70%。所獲得產物之抗原血纖維蛋白原濃度為1.3mg/ml。
此測試清楚地表明，藉由依次使用唯一層析步驟(除病毒不活化及過濾步驟之外)有可能捕獲血漿之三種豐富蛋白質。
在此實例中，兩種連續多管柱層析及習知層析相繼進行，其中依次再加工未吸附部分。歷經超過10小時之此層析工序(圖2)對所捕獲之分子(且非常尤其已最後經純化之分子，其在本發明情況下為血纖維蛋白原)品質無害。後者極其主要在整個純化方法中保留其完整性，如由SDS-PAGE在捕獲免疫球蛋白，繼而捕獲白蛋白且最後繼而捕獲血纖維蛋白原之各連續層析之非還原條件及庫馬斯藍染色下所示 (圖3)。
在此圖3中，起始血漿及隨後溶離液及未保留部分展示相對於所捕獲之分子的血漿之連續消耗及溶離液之所捕獲分子之富集。
槽1對應於分子量標記且槽2對應於未純化正常血漿。
槽3及槽4對應於實例2中所獲得之部分。
槽5及槽6對應於實例3中所獲得之部分。
槽7及槽8對應於實例4中所獲得之部分。
分子量為340kDa之血纖維蛋白原主要保留其在多管柱免疫球蛋白捕獲層析之未保留部分中且隨後多管柱白蛋白捕獲層析之未保留部分中之分子完整性。觀測到血纖維蛋白原捕獲親和層析之未保留部分中不存在血纖維蛋白原，該血纖維蛋白原被完全捕獲且發現在此層析之溶離液中具有顯著完整的結構。

Claims (35)

  1. 一種用於自血漿製備治療用途之經純化血漿蛋白質濃縮物的方法，其包含純化步驟，其中血漿或血漿部分經多管柱層析(multicolumn chromatography)。
  2. 如請求項1之方法，其中該血漿部分係選自冷沈澱血漿上清液、再懸浮血漿冷沈澱物、由乙醇分餾(fractionation)所獲得之部分I至V、用辛酸及/或辛酸鹽沈澱後獲得之上清液及沈澱物、層析未保留之溶離液或部分、濾液。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該治療用途之經純化血漿蛋白質濃縮物含有選自以下之血漿蛋白質：免疫球蛋白；白蛋白；凝血因子，諸如血纖維蛋白原(因子I)、因子VII、因子VIII、因子IX、因子XI、因子XIII；馮威里氏因子(von Willebrand factor)；凝血酶原複合物或PPSB(因子II、VII、IX、X)；經活化凝血酶原複合物；生物黏合劑；及蛋白酶抑制劑，諸如α-1抗胰蛋白酶、C1-酯酶抑制劑或抗凝血酶(單獨或混合物)；α/巨球蛋白、抗胰凝乳蛋白酶、抗胰蛋白酶、Apo A、Apo B、Apo C、Apo D、Apo E、Apo F、Apo G、βXIIa、C反應蛋白、C7、C1r、C1s、C2 C3、C4、C4bP、C5、C6、C1q、C8、C9、羧肽酶N、血漿銅藍蛋白、因子B、因子D、因子H、纖維結合蛋白、結合球蛋白(haptoglobin)、凝血酶(haemopexin)、肝素輔因子II、富含組胺酸GP、激肽酶II、激肽原HPM、溶菌酶、PAI 2、PAI I、PCI、纖維蛋白溶酶、纖維蛋白溶酶抑制劑、纖維蛋白溶酶原、前白蛋白、前激肽釋放酶(prekallikrein)、備解素(properdin)、蛋白酶連接蛋白(nexin)INH、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、血清澱粉樣蛋白(SAP)、TFPI、硫醇蛋白酶、凝血調節蛋白 (thrombomodulin)、組織因子(TF)、TPA、鈷胺載運蛋白II、皮質素載運蛋白、運鐵蛋白、玻璃連結蛋白(vitronectin)。
  4. 如請求項1或2之方法，其中該治療用途之經純化血漿蛋白質濃縮物為免疫球蛋白濃縮物。
  5. 如請求項1或2之方法，其中該治療用途之經純化血漿蛋白質濃縮物為白蛋白及/或血纖維蛋白原濃縮物。
  6. 如請求項1或2之方法，其中該治療用途之經純化血漿蛋白質濃縮物為血纖維蛋白原及/或白蛋白及免疫球蛋白濃縮物。
  7. 如請求項1或2之方法，其中該多管柱層析為多管柱親和層析。
  8. 如請求項1或2之方法，其中血漿或冷沈澱血漿上清液直接進行由多管柱親和層析組成之人類免疫球蛋白純化步驟。
  9. 如請求項8之方法，其中該多管柱親和層析之親和配位體係選自對IgG1、IgG2、IgG3及IgG4具有親和性之配位體。
  10. 如請求項7之方法，其中該多管柱親和層析使用選自以下之親和配位體：抗體；抗體片段；抗體衍生物；化學配位體，諸如肽、模擬肽、類肽、奈米非汀(nanofitins)；及寡核苷酸配位體，諸如適體(aptamers)。
  11. 如請求項7之方法，其中該多管柱親和層析使用選自對消毒條件及/或與工業用途相容之密集再使用具有抗性之親和配位體，尤其選自肽、類肽、奈米非汀及適體之親和配位體。
  12. 如請求項1或2之方法，其中該多管柱層析為多管柱離子交換層析，諸如多管柱陰離子或陽離子交換層析，或多管柱疏水相互作用層析，或多管柱混合模式層析，或多管柱尺寸排阻層析。
  13. 如請求項12之方法，其中在交聯之多醣凝膠或接枝有DEAE或TMAE或QAE基團之乙烯或丙烯酸聚合物凝膠上實施該多管柱陰離子交換層析。
  14. 如請求項13之方法，其中在高鹽耐受性基質上進行該多管柱陰離子交換及/或混合模式層析以捕獲在具有高鹽度之介質(諸如層析未保留之血漿或部分)中之血漿蛋白質。
  15. 如請求項1或2之方法，其中血漿或冷沈澱血漿上清液直接進行由多管柱陰離子交換層析組成之人類免疫球蛋白純化步驟，且視情況其中含有該等人類免疫球蛋白之部分進行後續用辛酸沈澱之純化步驟，且收集含有該等免疫球蛋白之上清液。
  16. 如請求項1或2之方法，其中血漿或冷沈澱血漿上清液直接進行多管柱親和層析或多管柱陰離子交換層析之白蛋白及/或血纖維蛋白原之純化步驟，且視情況其中含有白蛋白及/或血纖維蛋白原之部分進行後續用辛酸沈澱之純化步驟，且收集含有白蛋白及/或血纖維蛋白原之部分。
  17. 如請求項1或2之方法，其中該多管柱層析包含3至8個串聯管柱，較佳3至5個管柱，及/或其中該多管柱層析管柱為徑向管柱(radial columns)。
  18. 如請求項1或2之方法，其包含以下額外步驟中之至少一者：脫脂及/或過濾步驟；使用辛酸之沈澱步驟；病毒不活化或消除步驟，視情況包括溶劑-清潔劑處理及/或奈米過濾；離子交換層析步驟，且尤其陰離子或陽離子交換層析步驟，該陰離子交換層析步驟較佳在交聯之多醣凝膠或接枝有DEAE或TMAE或QAE基團之乙烯聚合物凝膠上實施；抗A及抗B抗體消除步驟，尤其藉由親和層析，諸如多管柱親和層析；藉由超過濾之濃縮步驟； 調配步驟。
  19. 如請求項1或2之方法，其進一步包含調配步驟，其包含將一或多種醫藥學上可接受之穩定劑添加至該治療用途之經純化血漿蛋白質濃縮物中；及視情況該調配步驟結束時獲得之醫藥製劑之冷凍或冷凍乾燥步驟。
  20. 如請求項1或2之方法，其依次包含：(a)藉由溶劑/清潔劑使血漿不活化之第一步驟；(b)藉由多管柱親和層析自步驟(a)中所獲得之不活化血漿純化免疫球蛋白之步驟；隨後(c)視情況，尤其藉由親和層析，自步驟(b)所產生之免疫球蛋白濃縮物消除抗A及抗B抗體之步驟；隨後(d)視情況，藉由奈米過濾步驟(b)或步驟(c)所產生之免疫球蛋白濃縮物之第二病毒消除步驟；及(e)將一或多種醫藥學上可接受之穩定劑添加至步驟(b)、步驟(c)或步驟(d)所產生之免疫球蛋白濃縮物中之步驟。
  21. 如請求項1或2之方法，其依次包含：(a')藉由多管柱親和層析自冷沈澱血漿上清液純化免疫球蛋白之步驟；隨後(b')藉由溶劑/清潔劑使步驟(a')中所獲得之免疫球蛋白濃縮物不活化之第一步驟；隨後(c')視情況，尤其藉由親和層析，自步驟(b')所產生之免疫球蛋白濃縮物消除抗A及抗B抗體之步驟；隨後(d')視情況，藉由奈米過濾步驟(b')或步驟(c')所產生之免疫球蛋白濃縮物之第二病毒消除步驟；及(e')將一或多種醫藥學上可接受之穩定劑添加至步驟(b')、步驟(c')或步驟(d')所產生之免疫球蛋白濃縮物中之步驟。
  22. 如請求項1或2之方法，其依次包含：(A)冷沈澱血漿上清液之乙醇及/或辛酸分餾之步驟；隨後(B)視情況，步驟(A)中所獲得之溶液藉由溶劑/清潔劑之病毒不活化或消除之第一步驟；隨後(C)步驟(A)或步驟(B)中所獲得之溶液藉由多管柱陰離子交換層析純化免疫球蛋白之步驟；隨後(D)視情況，尤其藉由親和層析，自步驟(C)結束時所獲得之免疫球蛋白濃縮物消除抗A及抗B抗體之步驟；隨後(E)視情況，藉由奈米過濾步驟(C)或步驟(D)結束時所獲得之免疫球蛋白濃縮物之第二病毒消除之步驟；及(F)將一或多種醫藥學上可接受之穩定劑添加至步驟(C)、步驟(D)或步驟(E)所產生之免疫球蛋白濃縮物中之步驟。
  23. 如請求項1或2之方法，其包含使血漿或冷沈澱血漿上清液經以下步驟：多管柱親和層析，其中至少一種親和配位體特異性結合免疫球蛋白，在其結束時收集含有免疫球蛋白之部分；及/或多管柱離子交換層析或經由疏水相互作用或化學配位體組合(多模式)之多管柱層析，在其結束時收集含有血纖維蛋白原及/或白蛋白之部分，及視情況，藉由用辛酸沈澱含有白蛋白及/或血纖維蛋白原之部分之後續純化步驟，及/或視情況以下後續步驟中之至少一者：病毒不活化或病毒消除步驟，離子交換層析步驟，抗A及抗B抗體消除步驟，尤其藉由親和層析，藉由超過濾之濃縮步驟， 調配步驟。
  24. 如請求項1或2之方法，其中該冷沈澱血漿上清液係預先藉由在-10℃與-40℃之間的溫度沈澱血漿，隨後在0℃與+1℃之間的溫度溫和解凍，繼而離心解凍之血漿以分離該冷沈澱物與該上清液而獲得。
  25. 如請求項1或2之方法，其中血漿或冷沈澱血漿上清液直接經第一多管柱層析以捕獲第一血漿蛋白質，隨後其中來自該第一多管柱層析之未保留部分經第二多管柱層析以捕獲第二血漿蛋白質。
  26. 如請求項1或2之方法，其中來自該第二多管柱層析之未保留部分經第三層析，較佳多管柱層析，或經沈澱步驟以純化第三血漿蛋白質。
  27. 如請求項1或2之方法，其中來自該多管柱親和或離子交換層析之保留部分為相關血漿蛋白質，較佳血纖維蛋白原及/或白蛋白，該相關血漿蛋白質隨後視情況溶離。
  28. 如請求項1或2之方法，其中來自該多管柱親和或離子交換層析之保留部分含有污染物，該未保留部分包含相關蛋白質，較佳白蛋白及/或血纖維蛋白原。
  29. 一種用於分餾(fractionating)血漿之方法，其包含使血漿或冷沈澱血漿上清液或血漿部分直接經以下步驟：多管柱親和層析，其中至少一種親和配位體為特異性結合免疫球蛋白之配位體，在其結束時收集含有該等免疫球蛋白之部分；及多管柱離子交換及/或混合模式層析(視情況為高鹽耐受性)，在其結束時收集含有白蛋白及/或血纖維蛋白原之部分；及視情況 藉由沈澱及/或層析純化前述多管柱層析未保留之該含有血纖維蛋白原及/或白蛋白之部分之步驟。
  30. 一種用於分餾血漿之方法，其包含使血漿或冷沈澱血漿上清液或血漿部分直接經以下步驟：多管柱親和層析，其中至少一種親和配位體為特異性結合免疫球蛋白之配位體，在其結束時收集含有免疫球蛋白之部分；及/或多管柱親和層析，其中至少一種親和配位體為特異性結合血纖維蛋白原之配位體，在其結束時收集含有血纖維蛋白原之部分；及/或多管柱親和層析，其中至少一種親和配位體為特異性結合白蛋白之配位體，在其結束時收集含有白蛋白之部分。
  31. 如請求項29或30之分餾之方法，其中該結合免疫球蛋白之多管柱親和層析係在該或該等結合白蛋白及/或血纖維蛋白原之多管柱層析上游進行。
  32. 一種免疫球蛋白濃縮物，其具有與血漿中之免疫球蛋白分佈概況(profile)類似或相同之免疫球蛋白分佈概況。
  33. 如請求項32之免疫球蛋白濃縮物，其中該濃縮物為免疫球蛋白G濃縮物，其具有50%至70%之IgG1、25%至35%之IgG2、2%至8%之IgG3及1%至8%之IgG4。
  34. 一種免疫球蛋白濃縮物，其具有與血漿之抗原譜(repertoire)類似或相同之抗原譜。
  35. 如請求項34之免疫球蛋白濃縮物，其中該濃縮物之抗原譜類似於及/或優於先前技術濃縮物之抗原譜。
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