CN113754757B - 一种人纤维蛋白原的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人纤维蛋白原的制备方法，包括：S1、向组分I的沉淀物中加入3.0‑5.0倍(V/M)第一溶解液，溶解1.0‑3.0h后过滤，加入灭活剂后调pH至6.80‑7.20，搅拌灭活至少6h；S2、经醇沉后用第二溶解液复溶或超滤透析过程中用第二溶解液进行溶液置换，使氨丁三醇浓度至0.01～0.1mol/L，pH8.0‑9.0，电导率0.1～2ms/cm，澄清过滤待用，所述第二溶解液为0.01‑0.1mol/L、pH为8.0‑9.0的氨丁三醇溶液；S3、用阴离子交换层析凝胶介质进行层析纯化；S4、用聚醚砜超滤膜包(截留分子量：100KD)超滤透析至蛋白含量≥20g/L，用3‑5倍(V/V)的透析液等体积超滤透析；S5、分装、入柜冻干、轧盖后干热灭活病毒处理。本发明利用阴离子交换层析凝胶，单步层析即可有效去除多种关键杂质成分，工艺精简，得到的人纤维蛋白原制品纯度高、杂质少、灭活剂残留含量低。

Description

一种人纤维蛋白原的制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体而言，涉及一种人纤维蛋白原的制备方法。

背景技术

人纤维蛋白原(分子量340KD，即凝血因子Ⅰ)，是血浆中含量最高的凝血因子，也是凝血系统中的“中心”蛋白质；人纤维蛋白原是由肝脏合成的，具有对称的二聚体结构，两个单体氨基酸形成中心E结构域，羧基端形成两个膨大的末端D结构域。在凝血酶的作用下，E、D结构域活化并暴露出结合位点；每个E结构域与两个相邻的人纤维蛋白原的D结构结合，最终形成网状结构，实现凝血功能。适用于先天性纤维蛋白原减少或缺乏症、严重肝脏损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、产后大出血以及大手术、外伤、内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍，是临床上用于大出血、止血的必备急救药品。

目前人纤维蛋白原的生产主要采用低温乙醇法(CN102286095A)，以血浆为原料，共经过3-4次乙醇沉淀得到人纤维蛋白原。该方法对纤溶酶原、纤维结合蛋白等关键杂质去除效果较差，导致制品稳定性差。为此，层析法逐渐成为制备人纤维蛋白原的常用方法之一。如申请号200910237204.6的中国专利公开了人纤维蛋白原的生产方法，利用纤维蛋白原的分子特性，采用纤维蛋白原流穿的模式进行制备；但需要配合多步沉淀工艺以除去病毒灭活时添加的有机溶剂，工艺较为冗杂。申请号201711104891.5的中国专利公开了一种人纤维蛋白原的制备方法，利用亲和层析去除纤溶酶原，得到高纯度、稳定性佳的人纤维蛋白原制品；但由于亲和层析介质昂贵，低温乙醇沉淀组分易堵塞滤板且过滤量小，只能利用高速离心机分离，设备、耗材成本高；且工艺步骤冗杂，时间长。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明解决的问题是如何同时高效的去除蛋白杂质、制备过程中添加的灭活剂以得到高纯度、稳定性好的人纤维蛋白原。

为解决上述问题，本发明提供一种人纤维蛋白原的制备方法，包括：S1、向组分I的沉淀物中加入3.0-5.0倍(V/M)第一溶解液，溶解1.0-3.0h后过滤，加入灭活剂后调pH至6.80-7.20，搅拌灭活≥6h；S2、经醇沉后用第二溶解液复溶或超滤透析过程中用第二溶解液进行溶液置换，使氨丁三醇浓度至0.01～0.1mol/L，pH8.0-9.0，澄清过滤待用；所述第二溶解液为0.01-0.1mol/L、pH为8.0-9.0的氨丁三醇溶液，为层析准备样品，保持制品pH值稳定；S3、用阴离子交换层析凝胶进行层析纯化；S4、用聚醚砜超滤膜包(截留分子量：100KD)超滤透析至蛋白含量≥20g/L，用3-5倍(V/V)的透析液等体积超滤透析；S5、分装、入柜冻干、轧盖后干热灭活病毒处理。

优选的，所述第一溶解液为0.01-0.1mol/L枸橼酸钠+7.0-9.0g/L氯化钠溶液pH为6.8-7.2；其作用是在杂质含量较多的情况下溶解沉淀提取纤维蛋白原，同时保持纤维蛋白原稳定；所述灭活剂为聚山梨酯80和磷酸三丁酯，其终浓度分别为9-11g/L、2-4g/L；所述透析液为0.01-0.1mol/L枸橼酸钠+7-9g/L氯化钠+15-20g/L精氨酸，溶液pH为6.5-7.5。例如，所述第一溶解液为17.8g/L枸橼酸钠+8.5g/L氯化钠，溶液pH为6.97；所述灭活剂为聚山梨酯80和磷酸三丁酯，其溶液中的终浓度分别为10g/L、3g/L；所述透析液为1.5g/L枸橼酸钠+9.0g/L氯化钠+17.5g/L精氨酸，溶液pH为7.00。

优选的，步骤S2中的醇沉操作为：降温至0±2℃，加入预冷的50％(V/V)乙醇溶液，使溶液中乙醇终含量为6-9％(V/V)；调pH至6.8-7.0，降至0℃-0.5℃离心收集沉淀；所述复溶操作为：用15-25倍(V/M)的第二溶解液复溶沉淀。例如，降温至1.0℃，加入预冷至-5℃以下的50％(V/V)乙醇溶液，使溶液中乙醇终含量为8％(V/V)；调pH至6.97，0℃下200rpm搅拌1h，静置1h后离心收集沉淀；用20倍(V/M)的第二溶解液在25℃下溶解1h。优选的，上述离心采用杯式离心机，3500rpm离心20min，操作温度为-2.0℃。

优选的，所述阴离子交换层析凝胶介质为DEAE 650M、FRACTGEL EMD TMAE(M)或Eshmuno Q。优选的，阴离子交换层析凝胶介质为Fractgel EMD TMAE(M)凝胶。

优选的，步骤S2中的溶液置换具体为：用100KD膜包进行超滤透析4-8倍体积，去除聚山梨酯80和磷酸三丁酯。。

优选的，所述步骤S3中的层析纯化操作包括：S31、依次用3-6CV的0.5mol/L氢氧化钠溶液、3-6CV的注射用水、1-10CV的0.05-0.5mol/L、pH8.0-9.0的氨丁三醇缓冲溶液，对凝胶进行预处理，流速80-120cm/h，其中所述凝胶的柱体积为1CV；S32、用滤液进行上柱，流速为80-120cm/h，上样量19.8-21.4g蛋白/L凝胶；S33、结束后用0.05mol/L、pH7.0-7.5的氨丁三醇溶液进行洗脱；当洗脱液在OD2_80nm≤50mAU下收集4-5CV的洗脱液。

作为本发明的一个示例，所述层析操作包括S31、依次用4CV的0.5mol/L氢氧化钠溶液、4CV的注射用水、1.1CV的0.5mol/L氨丁三醇缓冲溶液，pH9.0、2CV的0.05mol/L氨丁三醇缓冲溶液，pH9.0，对凝胶进行预处理，流速100cm/h，其中所述凝胶的柱体积为1CV；S32、用滤液进行上柱，流速为100cm/h，上样量20.8g蛋白/L凝胶；S33、结束后用0.05mol/L氨丁三醇溶液(pH7.37)进行洗脱；当洗脱液在280nm下的OD值为0-50mAU下收集4CV，过滤、收集。

优选的，所述步骤S33还包括：用2-6CV的0.05mol/L、pH8.0-9.0的氨丁三醇缓冲溶液,对凝胶进行顶洗。例如，用4CV的0.05mol/L氨丁三醇缓冲溶液,pH9.00对凝胶进行顶洗。

优选的，所述步骤S5的冻干条件为：S51、分装后降温至-2～3℃预冷4-6h，降温至-43～-50℃保持10-12h；S52、抽真空至18Pa以下并保持2.1-2.5h；S53、维持真空度在18Pa以下，升温至-20℃--24℃保持18-20h；再升温至8-10℃保持25-29h；升温至31～35℃保持15-17h；S54、恒温保持结束时控制箱体内真空度小于等于7Pa；压塞封口、放气。

将冻干工艺分为预冷、冻结、升华干燥和一次解析干燥、二次解析干燥共五个分阶段，避免制品冻干条件剧烈变化，有利于制品稳定和降低水分含量。具体的，本申请制备的人纤维蛋白原的冰点约为-3℃，共晶点温度约为-18℃。在预冷阶段保持-2～3℃，以略高于冰点提前预冷，然后迅速降温至-43～-50℃，该温度远低于其共晶点-18℃，可达到快速降温的目的，从而减少冰晶的数量和大小，降低冰晶形成对蛋白质的损伤，达到保护制品的目的。制品冻结以后，升温至-20℃--24℃，低于共晶点，升华去除结晶水分。再升温至8-10℃，去除结合水分；再升温至31～35℃，进一步去除残余水分；通过梯度升温去除结合水分，制品温度变化趋于缓和，提高制品稳定性，制品水分含量小于1％，去除水分更彻底。

作为本发明的一个示例，所述冻干条件为S51、分装后降温至-2～3℃预冷4h，降温至-43～-50℃保持10h；S52、抽真空至18Pa以下并保持2.1h；S53、维持真空度在18Pa以下，升温至-20℃保持20h；再升温至10℃保持29h；升温至31～35℃保持17h；S54、恒温保持结束时控制箱体内真空度小于等于7Pa；压塞封口、放气。

优选的，步骤S1中所述组分I的沉淀采用下述方法制备：S11、取健康人血浆于0-4℃融合后，离心去除冷沉淀，收集上清液；S12、用DEAES EPHADEX A 50凝胶搅拌吸附20-60min；S13、将吸附后上清液调温至1.0-1.5℃，按照200-400ml/min的速度滴加95％乙醇(V/V)同时调温至-2.4℃-2℃，使乙醇的终浓度为8％(V/V)，保温2-4h后板框过滤收集沉淀。

例如：S11、取健康人血浆于0.3℃融合后，离心去除冷沉淀，收集上清液；S12、取DEAE SEPHADEX A 50凝胶，加入S11步骤的上清液，搅拌吸附40min；S13、将吸附后上清液调温至1.0℃，按照200ml/min的速度滴加95％乙醇(V/V)同时调温至-2.4℃，使乙醇的终浓度为8％(V/V)，保温2h后板框过滤，收集沉淀。

通过离心去除冷沉淀，冷沉淀用来生产人凝血因子VIII；同时DEAE-SEPHADEX-A-50凝胶吸附用来去除杂质蛋白凝血酶原。预处理后的制品分离组分I沉淀后，可通过板框快速过滤，且不需要加入对人纤维蛋白原有激活副作用的助滤剂。

相对于现有技术，本发明所述的人纤维蛋白原的制备方法具有下述有益效果：(1)本发明利用Fractgel EMD TMAE(M)等凝胶，单步层析即可除纤溶酶原、纤维结合蛋白和灭活剂，得到高纯度(≥95％)、低纤溶酶原(≤5μg/mg)、低灭活剂(聚山梨酯80≤100μg/mg；磷酸三丁酯≤3μg/mg)、稳定性好的人纤维蛋白原制品，工艺精简；(2)本发明制备的人纤维蛋白原与凝血酶成胶凝固后，置于37℃可稳定至少3天不发生水解；(3)本发明通过对人血浆进行预处理，提高了板框过滤工艺分离组分I沉淀的单位滤板过滤量，解决了板框过滤工艺分离组分I沉淀时堵塞滤板的问题，使之适合规模化生产，与目前主流的板框过滤法分离组分沉淀相适应，无需额外购置离心机，降低企业生产成本。

附图说明

图1为本发明所述人纤维蛋白原的制备方法的流程示意图；

图2为本发明实施例中实施例1在层析前后制品还原电泳图；

图3为本发明实施例中实施例2在层析前后制品还原电泳图；

图4为本发明实施例中实施例3在层析前后制品还原电泳图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。

提取后的人纤维蛋白原以溶液状态存在，通常需进行冻干；目前冻干工艺是将溶液冷冻后，在低温环境下抽真空干燥，存在产品质量差，如冻干成品水分残留偏高、复溶时间长等不足。为此，申请人对人纤维蛋白原的冻干工艺进行优化。

研究发现，本申请的生产工艺制备的纤维蛋白原的冰点为-3℃、共晶点约为-18℃；由表1可知，通过在略高于冰点的温度进行预冷，再迅速降温至-50℃，该温度远低于其共晶点温度，减少冰晶的数量和大小，降低冰晶形成对蛋白质的损伤，达到保护制品的目的；制品冷冻后，升温至-20℃--24℃，该温度略低于共晶点，便于升华去除结晶水分；之后再升温至8-10℃，去除结合水分；再升温至31～35℃，进一步去除残余水分；通过梯度升温去除结合水分，制品温度变化趋于缓和，提高制品稳定性，制品水分含量低，去除水分更彻底。当采用传统工艺制备时，直接降温至-45℃抽真空，则难以去除结合水，同时大量形成的结晶会对蛋白活性造成破坏，甚至存在一定的降解；通过将冻干分为预冷、冻结、升华干燥和一次解析干燥、二次解析干燥共五个分阶段，通过略高于接近点温度进行预冷、快速降至低温进行冻结来冰晶的数量和大小，降低冻干对蛋白活性的破坏；同时通过分阶段干燥，分别去除结晶水分、结合水及残余水，降低制品的含水量，提高稳定性且复溶效果好。

实施例1

如图1所示，一种人纤维蛋白原的制备方法，包括：

S1、取组分I共35.4kg，加入3.5倍(V/M)第一溶解液在25.5℃溶解1.5小时，澄清过滤，加入3000g聚山梨酯80和900g磷酸三丁酯，调pH至6.89，25℃下恒温搅拌，灭活6h。

所述第一溶解液为25.8g/L枸橼酸钠+9.0g/L氯化钠，pH6.85。

所述组分I为本技术领域通用名称，其主要成分为纤维蛋白原80％、γ-球蛋白10％、凝血酶原5％、β-球蛋白2％、碘结合蛋白2％等。优选的，所述组分I采用下述方法制备：

S11、取健康人血浆2015.53kg于2℃融合后，14000rpm离心去除冷沉淀，收集上清液；

S12、取DEAE SEPHADEX A 50凝胶48kg，将S11上清液1918L加入凝胶中，6.0℃下搅拌吸附40min。

S13、将吸附后上清液降温至3.0℃，以300ml/分钟的速度滴加95％乙醇(V/V)同时降温至0℃，使溶液中乙醇终浓度为8％(V/V)，保温3h后板框过滤，收集组分I的沉淀11.5kg。重复上述操作两次，分别得到沉淀11.3kg和12.6kg。优选的，所述板框滤材为773×773mm型E1000滤板。

S2、降温至-1.0℃，加入预冷至-5℃以下的50％(V/V)乙醇溶液，使溶液中乙醇终含量为9％(V/V)；调pH至6.97，0.5℃下200rpm搅拌1h，静置2h后离心收集沉淀。

所述离心采杯式离心机，转速为3500rpm，温度为-2.0℃，离心20min。

S3、步骤S2的沉淀用20倍(V/M)的第二溶解液在25℃下溶解1h，澄清过滤后用Fractgel EMD TMAE(M)凝胶进行层析纯化；优选的，所述第二溶解液为0.1mol/L、pH9.00的氨丁三醇溶液。

所述层析纯化包括：

S31、依次用4CV的0.5mol/L氢氧化钠溶液、4CV的注射用水、1CV的0.5mol/L、pH9.0的氨丁三醇缓冲溶液，1CV的0.5mol/L氨丁三醇缓冲溶液，pH9.0，对凝胶进行预处理，流速120cm/h，其中所述Fractgel EMD TMAE(M)凝胶的柱体积为1CV；

S32、用滤液进行上柱，流速为120cm/h，上样量20.8g蛋白/L凝胶；

S33、结束后用4CV的0.5mol/L氨丁三醇缓冲溶液,pH9.00对凝胶进行顶洗，再用0.5mol/L、pH8.00氨丁三醇溶液进行洗脱；当洗脱液的OD_280nm为28mAU收集4CV，0.22μm滤芯过滤。

层析的纯化效果见表1及图2，其中图2代表纤维结合蛋白去除效果。由表1可知，洗脱液中人纤维蛋白原的纯度为95.8％，纤溶酶原残留量为0.08μg/mg蛋白，磷酸三丁酯残留量＜3μg/mL，聚山梨酯80的残留量为8μg/mL。

表1层析前后目标物的纯度和杂质含量对比

S4、用聚醚砜超滤膜包(截留分子量：100KD)超滤透析至蛋白含量为25g/L，用4倍(V/V)的透析液等体积超滤透析后，除菌过滤；

所述透析液为：15g/L枸橼酸钠+9.0g/L氯化钠+20g/L精氨酸，pH7.00。优选的，所述超滤透析在室温下进行，如25℃。

S5、分装、入柜冻干、轧盖后干热灭活病毒处理。所述干热灭活为现有技术，如沸水浴99.5℃±0.5℃下保温31min，在此不进行赘述。

优选的，所述冻干条件为：S51、分装后降温至-2℃预冷4h，降温至-45℃保持10h；S52、抽真空至18Pa以下并保持2.1h；S53、维持真空度在18Pa以下，以1℃/h升温至-20℃保持20h；再以2℃/h的速度升温至10℃保持29h；以4-5℃/h的速度升温至31～35℃保持17h；S54、恒温保持结束时控制箱体内真空度小于等于7Pa；压塞封口、放气。

经检定，冻干样品的质量指标均符合药典标准，其中人纤维蛋白原的纯度为96.2％，纤维蛋白原与凝血酶成胶后可保持5天不水解，纤溶酶原残留量为1.3μg/mL，磷酸三丁酯残留量＜3μg/mL，聚山梨酯80残留量为45μg/mL。

实施例2

一种人纤维蛋白原的制备方法，包括：

S1、取组分I的沉淀33.9kg，加入3.0倍(V/M)第一溶解液溶解1.0h，用30LP滤堆结合1.0um滤芯过滤，用第一溶解液顶出至总体积为300L，加入3000g的聚山梨酯80和900g的磷酸三丁酯，调pH至6.93，灭活6h。

优选的，上述操作均为在室温下进行，如25℃。所述第一溶解液为12.4g/L枸橼酸钠+7.0g/L氯化钠，pH6.97。

优选的，所述组分I采用下述方法制备：

S11、取健康人血浆2015.97kg于0℃融合后，离心去除冷沉淀，收集上清液；

S12、取DEAE SEPHADEX A 50凝胶48kg，加入S11步骤的上清液，搅拌吸附40min。

S13、将吸附后上清液调温至1.0℃，按照200ml/min的速度滴加95％乙醇(V/V)同时调温至-2.4℃，使乙醇的终浓度为8％(V/V)，保温2h后板框过滤，收集组分I沉淀12.5kg。重复上述操作S11-S13，分别得到沉淀10.6kg和10.8kg。

S2、100KD膜包进行超滤透析进行溶液置换，如用3-5倍(V/V)第二溶解液进行置换，使溶液中氨丁三醇浓度至0.05mol/L，pH值为8.5，60LP滤堆澄清过滤；

S3、用Eshmuno Q凝胶进行层析纯化；

具体的，包括：

S31、依次用3.9CV的0.5mol/L氢氧化钠溶液、3.9CV的注射用水、1.5CV的0.5mol/L、pH8.5的氨丁三醇缓冲溶液、2CV的0.05mol/L、pH8.5氨丁三醇缓冲溶液，对凝胶进行前处理，流速100cm/h，其中所述Eshmuno Q凝胶的柱体积为1CV；

S32、用过滤液上样层析，上样速度为100cm/h，上样载量21.4g蛋白/L凝胶；

S33、结束后用2CV的0.05mol/L、pH8.5的氨丁三醇缓冲溶液对凝胶进行顶洗，流穿液和顶洗出的缓冲液废弃处理；再用0.05mol/L、pH7.50氨丁三醇进行洗脱至50mAU(OD_280nm)开始收集4.5CV的洗脱液，过滤至300L超滤罐内；

层析纯化的效果见表2及图3，其中图3代表纤维结合蛋白去除效果。由表2可知，洗脱液中人纤维蛋白原的纯度为95.5％，纤溶酶原残留量为0.09μg/mg蛋白，磷酸三丁酯残留量＜3μg/mL，聚山梨酯80残留量为7μg/mL。

表2层析前后纯度和杂质含量对比

S4、用聚醚砜超滤膜包(截留分子量100KD)进行超滤透析至蛋白含量为25g/L，用4倍(V/V)透析液进行等体积超滤透析，除菌过滤，调整蛋白质含量至21g/L。

所述透析液为25.8g/L枸橼酸钠+7.0g/L氯化钠+17.5g/L精氨酸，pH7.5。优选的，所述超滤透析在室温下操作，如25℃。

S5、分装、入柜冻干、轧盖、干热灭活病毒处理。所述干热灭活病毒为现有技术，在此不进行赘述。

优选的，所述冻干条件为：S51、分装后降温至-2～3℃预冷4h，再降温至-43～-50℃保温10h；S52、抽真空至18Pa以下后，保持2.1h；优选的，待降温捕水器温度至-40℃以下后抽真空；S53、维持真空度在18Pa以下，升温至-20℃，保持20h；再升温至10℃，保持29h；最后升温至31～35℃，保持17h；S54、恒温保持结束时控制箱体内真空度小于等于7Pa，压塞封口、放气。

经检定，冻干样品的质量指标均符合药典标准，其中人纤维蛋白原的纯度为98.0％，纤溶酶原残留量为1.4μg/mL，纤维蛋白原与凝血酶成胶后可保持4天不水解，磷酸三丁酯残留量＜3μg/mL，聚山梨酯80残留量为62μg/mL。

实施例3

一种人纤维蛋白原的制备方法，包括：

S1、取组分I的沉淀物30.6kg，加入5倍(V/M)第一溶解液在25.0℃溶解3.0h，用30LP滤堆结合1.0um滤芯过滤；用第一溶解液顶出至276L，加入2760g聚山梨酯80和828g磷酸三丁酯，调pH至7.2，25℃下灭活6h。

其中，所述第一溶解液为2.59g/L枸橼酸钠+8.5g/L氯化钠，pH7.2。

所述组分I为本技术领域通用名称，其主要成分为纤维蛋白原80％、γ-5球蛋白10％、凝血酶原5％、β-球蛋白2％、碘结合蛋白2％等。优选的，所述组分I采用下述方法制备：

S11、取健康人血浆2015.65kg于4℃融合后，离心去除冷沉淀，收集上清液；

S12、取DEAE SEPHADEX A 50凝胶48kg，加入步骤S11的上清液，搅拌吸附60min；

其中，吸附后的VII因子效价为35IU/ml，凝血酶效价为51IU/ml，适合作为制备凝血酶原复合物的原料。

S13、将吸附后的上清液调至1.0℃，按照400ml/min的速度滴加95％乙醇(V/V)同时降温至2.0℃使溶液中乙醇浓度为8％(V/V)，保温4h板框过滤，收集组分I沉淀10.2kg。

重复上述操作两次，分别得到组分I的沉淀9.0kg和11.4kg。优选的，所述板框滤材为773×773mm型E1000滤板。

S2、降温至1.2℃，加入预冷至－5℃以下的50％(V/V)乙醇溶液，使溶液中乙醇终含量为7％；调pH值至6.8，0℃条件下100rpm搅拌反应2h，静置1h后离心收集沉淀。

优选的，所述离心采用杯式离心机，转速为4000rpm，温度-2.0℃，离心20min。

S3、将步骤S2的沉淀用25倍(V/M)的第二溶解液在25℃下溶解1h，过0.25μm滤膜后用DEAE 650M凝胶进行层析纯化；

优选的，所述第二溶解液为0.01mol/L、pH8.0的氨丁三醇溶液。具体的，所述层析纯化包括下属包括：

S31、依次用3CV的0.5mol/L氢氧化钠溶液、3CV的注射用水、2.0CV的0.5mol/L氨丁三醇缓冲溶液(pH8.0)、2CV的0.01mol/L氨丁三醇缓冲溶液(pH8.0)对凝胶进行前处理,流速为80cm/h，其中所述DEAE 650M凝胶的柱体积为1CV；

S32、用滤液进行上柱层析，流速为80cm/h，上样载量19.8g蛋白/L凝胶；

S33、结束后用6CV的0.01mol/L、pH8.0的氨丁三醇缓冲溶液对凝胶进行顶洗，流穿液和顶洗出的缓冲液废弃处理；用0.01mol/L、pH7.0的氨丁三醇溶液进行洗脱，50mAU(OD_280nm)开始收集5CV的洗脱液，过滤至300L超滤罐内。

DEAE 650M凝胶的层析效果见表3及图4，其中图4代表纤维结合蛋白去除效果。由表3可知，洗脱液中人纤维蛋白原的纯度为97.7％，纤溶酶原残留量为0.09μg/mg蛋白，磷酸三丁酯残留量＜3μg/mL，聚山梨酯80残留量为8μg/mL。

表3层析前后纯度和杂质含量对比

S4、用聚醚砜超滤膜包(截留分子量100KD)进行超滤透析，调整蛋白质含量至25g/L，用4倍透析液等体积超滤透析，除菌过滤，调整蛋白质含量至20g/L。

优选的，所述透析液为3.5g/L枸橼酸钠+8.0g/L氯化钠+17.5g/L精氨酸，pH6.5。优选的，所述超滤透析在室温下进行，如25℃。

S5、分装、入柜冻干、轧盖后干热灭活病毒处理。所述干热灭活为现有技术，如沸水浴99.5℃±0.5℃下保温31min，在此不进行赘述。

优选的，所述冻干条件为：

S51、分装后降温至-2～3℃预冷4h，再降温至-43～-50℃保持10h；

S52、抽真空至18Pa以下后，保持2.1h；优选的，待降温捕水器温度至-40℃以下后抽真空；

S53、维持真空度在18Pa以下，升温至-20℃，保持20h；再升温至10℃，保持29h；升温至31～35℃，保持17h；

S54、恒温保持结束时控制箱体内真空度小于等于7Pa，压塞封口、放气。

经检定，制备的冻干样品的质量指标均符合药典标准，其中人纤维蛋白原的纯度为97.8％，纤溶酶原残留量为1.3μg/mL，纤维蛋白原与凝血酶成胶后可保持5天不水解，磷酸三丁酯残留量＜3μg/mL，聚山梨酯80残留量为63μg/mL。

对比例1

采用现有生产中的低温乙醇工艺，即申请号CN02103825.2的中国专利中实施例的制备方法，分别制备3个样品。

采用单因素方差进行对比分析实施例1、2、3及对比例1、2的样品，结果见表4。需要说明的是：成胶方法为纤维蛋白原组分与凝血酶组分1:1混合后成胶凝固，属于现有技术，在此不进行赘述。

表4不同组别下的灭活剂的残留及稳定性数据

由表4可知，本发明实施例的纤维蛋白原纯度、纤溶酶原残留量、与凝血酶成胶后稳定时间均优于多步低温乙醇工艺，通过单步阴离子吸附层析，聚山梨酯80残留量、磷酸三丁酯残留量与多步低温乙醇工艺无明显差别，单步阴离子吸附层析去除灭活剂效果与多步乙醇沉淀相同。

虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (3)

1.一种人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，包括：

S1、向组分I的沉淀物中加入3.0-5.0倍(V/M)第一溶解液，所述第一溶解液为0.01-0.1mol/L枸橼酸钠+7.0-9.0g/L氯化钠，溶液pH为6.8-7.2，溶解1.0-3.0h后过滤，加入灭活剂后调pH至6.80-7.20，所述灭活剂为聚山梨酯80和磷酸三丁酯组成，其终浓度分别为9-11g/L、2-4g/L，搅拌灭活至少6h；

所述组分I的沉淀物采用下述方法制备：

S11、取健康人血浆于0-4℃融合后，离心去除冷沉淀，收集上清液；

S12、用DEAES EPHADEX A 50凝胶搅拌吸附20-60min；

S13、将吸附后上清液调温至1.0-1.5℃，按照200-400ml/min的速度滴加95％乙醇(V/V)同时调温至-2.4℃-2℃，使乙醇的终浓度为8％(V/V)，保温2-4h后板框过滤收集沉淀；

S2、经醇沉后用第二溶解液复溶或超滤透析过程中用第二溶解液进行溶液置换，使氨丁三醇浓度至0.01～0.1mol/L，pH8.0-9.0，澄清过滤待用，所述第二溶解液为0.01-0.1mol/L、pH为8.0-9.0的氨丁三醇溶液；

S3、用阴离子交换层析凝胶介质进行层析纯化，包括：

S31、依次用3-6CV的0.5mol/L氢氧化钠溶液、3-6CV的注射用水、1-10CV的0.05-0.5mol/L、pH8.0-9.0的氨丁三醇缓冲溶液，对凝胶进行预处理，其中所述凝胶的柱体积为1CV，其中所述阴离子交换层析的凝胶为FRACTOGEL EMD TMAE(M)；

S32、用滤液进行上柱，上样量≤100g蛋白/L凝胶；

S33、结束后用2-6CV的0.05mol/L、pH8.0-9.0的氨丁三醇缓冲溶液进行顶洗，再用pH7.0-8.0的0.01-0.1mol/L mol/L的氨丁三醇溶液进行洗脱，收集洗脱液；

S4、用截留分子量为100KD的聚醚砜超滤膜包超滤透析至蛋白含量为≥20g/L，用3-5倍(V/V)的透析液等体积超滤透析，所述透析液为0.01-0.1mol/L枸橼酸钠+7-9g/L氯化钠+15-20g/L精氨酸，溶液pH为6.5-7.5；

S5、分装、入柜冻干、轧盖后干热灭活病毒处理；所述冻干方法为：

S51、分装后降温至-2～3℃预冷4-6h，降温至-43～-50℃保持10-12h；

S52、抽真空至18Pa以下并保持2.1-2.5h；

S53、维持真空度在18Pa以下，升温至-20℃--24℃保持18-20h；再升温至8-10℃保持25-29h；升温至31～35℃保持15-17h；

S54、恒温保持结束时控制箱体内真空度小于等于7Pa；压塞封口、放气。

2.根据权利要求1所述的人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，步骤S2中的醇沉操作为：降温至0±2℃，加入预冷的50％(V/V)乙醇溶液，使溶液中乙醇终含量为6-9％(V/V)；调pH至6.8-7.0，降至0-0.5℃离心收集沉淀；所述复溶操作为：用15-25倍(V/M)的第二溶解液复溶沉淀。

3.根据权利要求1所述的人纤维蛋白原的制备方法，其特征在于，步骤S2中的溶液置换具体为：用100KD膜包进行超滤透析4-8倍，透析除去聚山梨酯80和磷酸三丁酯。