CN113652414B - 一种高纯人凝血酶的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯人凝血酶的制备方法，属于生物制药领域。本发明从去冷沉淀人血浆中提取人凝血酶的方法，包括新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀；DEAE Sephadex A‑50凝胶吸附；超滤后料液激活；S/D病毒灭活；离子交换层析；除菌过滤；纳米膜除病毒过滤；分装；冷冻干燥。本发明通过改善人凝血酶的提取工艺，制得的人凝血酶，稳定性好，产品纯度高，安全可靠，比活可达2600IU/mg蛋白质以上，满足市场的需求，也提高了珍贵血浆资源的利用价值。

Description

一种高纯人凝血酶的制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及血液制品的提取工艺，特别涉及一种人凝血酶的提取方法。

背景技术

人凝血酶是丝氨酸蛋白酶，分子量约37kd，白色无定形粉末，溶于水，不溶于有机溶剂。包含有两条由二硫键连接的两条链，轻链和重链的分子量分别为6000和31000，其活性部位在重链上。因为在血浆中存在高浓度的抗凝血酶，凝血酶只能存在几分钟，它是以凝血酶原的形式存在于血浆中，凝血酶原的含量很少，在正常血浆中含量在0.11～0.30mg/mL。因子Xa、V、钙离子和磷脂形成“凝血酶原酶复合物”，它是由凝血酶原在凝血酶原酶复合物的作用下，分别在精氨酸274一苏氨酸275和精氨酸323一异亮氨酸324两肽键处先后断裂形成的。因子Xa是此复合物的活性中心，单独因子Xa也能缓慢裂解凝血酶原。因子V经凝血酶和因子Xa激活成Va，比因子V活性更强，在激活凝血酶原的过程中起辅助因子作用。钙离子将因子Xa和凝血酶原连接于磷脂，Va通过其疏水区也连接与磷脂，磷脂的主要作用是提供活性表面。

凝血酶为止血药，临床上主要适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管以及实质性脏器出血的止血；用于外伤、手术、口腔、耳、鼻、喉、泌尿、烧伤、骨科、神经外科、眼科、妇产科以及消化道等部位出血的止血。凝血酶直接作用于血液凝固过程的最后一步，促使血浆中的可溶性纤维蛋白原转变成不溶的纤维蛋白，从而达到速效止血的目的。而且还能促进上皮细胞的有丝分裂，加速创伤愈合，是一种速效的局部止血药。凝血酶适用于结扎止血困难的小血管、毛细血管、实质性脏器的出血及其他各种出血。

凝血酶局部止血效果好，且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料，将广泛应用于临床。同时，除了传统的凝血作用外，凝血酶在脑血管病中的作用也日益受到重视，目前的研究表明，凝血酶不仅在脑出血、脑缺血中有毒性作用，在中枢神经系统正常发育和损伤保护中也有重要作用。临床研究体现出小剂量可产生神经保护作用，而大剂量则具有细胞毒性作用。因此，由于该药临床使用日渐广泛，将使目前十分紧俏的凝血酶更趋紧缺，生产前景看好。

目前常见的血浆中人凝血酶提取工艺为层析法，原料为去冷沉淀血浆或Cohn组分Ⅲ。国内现有相关发明专利两种原料提取工艺均有涉及，如专利《一种人凝血酶的制备方法》(申请号201610614283.8)，工艺为Cohn组分Ⅲ复溶、病毒灭活、阴离子交换层析、加入钙离子激活、阳离子交换层析、纳滤；专利《一种从去冷胶血浆中制备人凝血酶的方法》(申请号201510586400.X)，工艺为阴离子树脂吸附去冷胶血浆中凝血酶原，洗脱过滤得凝血酶原溶液，加入氯化钙溶液激活得凝血酶溶液，S/D病毒灭活，阳离子层析得纯化凝血酶溶液，再经过超滤透析浓缩，纳滤，除菌过滤，分装冻干，干热灭活得人凝血酶成品；专利《制备冻干人凝血酶的方法》(申请号201510520812.3)，工艺为以Cohn组分Ⅲ为原料，经等电点沉淀法制的人凝血酶原，氯化钙激活得人凝血酶粗品，S/D病毒灭活，SP-Sephadex C-50层析纯化得精制的人凝血酶，再经过超滤浓缩，添加稳定剂，纳滤，除菌过滤，冻干和干热得目标物。

本发明开发一种新的优化工艺提取人凝血酶，开发出适合于工业生产规模的人凝血酶制剂制备工艺，具有稳定性好，纯度高，病毒去除效果更好的特点的人凝血酶提取工艺。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种人凝血酶的提取方法，所制得的人凝血酶制剂纯度高，稳定性高，病毒灭活效果好。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种高纯人凝血酶的制备方法，包括如下步骤：

(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；

(2)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50凝胶，干凝胶的加入量为0.5-1.5g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.0-2.0小时，收集凝胶，采用平衡缓冲液洗涤5次左右，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液并用0.45μm滤芯过滤，凝胶经过再生后保存可以重复使用；

(3)超滤：将步骤(2)所得的滤液先超滤浓缩，将洗脱液Ⅱ因子效价调整至5-20IU/mL，通过透析将电导调整至0.5-4.5ms/cm；

(4)激活：将步骤(3)所得料液进行除菌过滤，调整pH至6.5-7.5，然后再将配好的氯化钙母液经过除菌过滤后按比例加入料液中，使钙离子浓度保持在30-80mM，2-8℃激活5-15天；

(5)压滤：向步骤(4)所得激活后悬浮液按5-20g硅藻土/kg料液比例添加硅藻土，三分之一硅藻土预铺板框，其余加入料液中，压滤收集上清液，用0.45μm滤芯进行过滤；

(6)S/D病毒灭活：温和搅拌下将S/D灭活液缓慢加入步骤(5)所得滤液中，添加完毕后，搅拌15-30min，添加时间≤30min，调整液温至24-26℃，灭活6小时，每30min记录一次温度；

(7)离子交换层析：离子交换层析柱先用平衡液充分平衡，将步骤(6)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用洗涤缓冲液冲10个左右柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，然后用稀释液调整凝血酶效价约500IU/mL；

(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；

(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；

(10)分装；

(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人凝血酶冻干粉。

所述步骤(2)中所述的DEAE Sephadex A-50凝胶吸附，采用的是本公司的血浆吸附过滤装置(中国发明专利CN201810248696.8一种用于凝血因子类血液制品生产的血浆吸附过滤装置)。

所述步骤(2)中所述的平衡缓冲液配方为：0.01-0.02M枸橼酸钠，0.15-0.25M氯化钠，pH为7.0-8.0。

所述步骤(6)中所述的S/D病毒灭活液配方为：吐温-80溶度为1％(w/w)，TNBP浓度为0.3％(w/w)。

所述步骤(7)所述的平衡缓冲液配方为：0.1-0.5M丙氨酸，0.05-0.1M氯化钠，pH6.5-7.5；洗涤缓冲液配方为：0.1-0.5M丙氨酸，0.1-0.3M氯化钠，pH 6.5-7.5；洗脱缓冲液配方为：0.1-0.5M丙氨酸，0.3-0.5M氯化钠，pH 6.5-7.5；稀释液配方为：0.1-0.5M丙氨酸，0.05-0.15M氯化钠，pH 6.5-7.5。

本发明的优点：

(1)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附，中试规模采用的是本公司的血浆吸附过滤装置(中国发明专利CN201810248696.8一种用于凝血因子类血液制品生产的血浆吸附过滤装置)。可以实现凝胶自动过滤和收集的流水化处理，大大降低工作人员劳动强度，同时整个过滤过程中压差稳定可控，对后续制作的凝血因子成分和凝胶颗粒起到了较好的保护作用，适用于工业生产规模。

(2)本发明所提供的人凝血酶的提取方法，流程不复杂且易操作，相较于其它工艺如额外添加稳定剂或除杂剂(如聚乙二醇等)，减少了对制品的影响以及引入更多杂质的可能。

(3)采用15纳米纳滤除病毒，保证更好的病毒过滤效果，安全性更高。

(4)用该工艺制备的人凝血酶采用丙氨酸作为稳定剂，稳定性好，产品纯度高，安全可靠，与国内公开的去冷沉淀人血浆中提取工艺数据相比每吨血浆凝血酶效价回收率高出约50％，比活可达2600IU/mg蛋白质以上。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆10kg融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；

(2)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50凝胶，干凝胶的加入量为0.5g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.0小时，收集凝胶，采用平衡缓冲液洗涤5次，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液并用0.45μm滤芯过滤，收集滤液1L，凝胶经过再生后保存可以重复使用，平衡缓冲液配方为：0.02M枸橼酸钠，0.2M氯化钠，pH为7.0；

(3)超滤：将步骤(2)所得的滤液先超滤浓缩，将洗脱液Ⅱ因子效价调整至18IU/mL，通过透析将电导调整至3ms/cm；

(4)激活：将步骤(3)所得料液进行除菌过滤，调整pH至6.8，然后再将配好的氯化钙母液经过除菌过滤后按比例加入料液中，使钙离子浓度保持在60mM，2-8℃激活7天；

(5)压滤：向步骤(4)所得激活后悬浮液加入10g硅藻土，用5g硅藻土预铺板框，压滤收集上清液，用0.45μm滤芯进行过滤；

(6)S/D病毒灭活：温和搅拌下将S/D灭活液缓慢加入步骤(5)所得滤液中，添加完毕后，搅拌15min，调整液温至25℃，灭活6小时，每30min记录一次温度；

(7)离子交换层析：离子交换层析柱先用平衡液充分平衡，将步骤(6)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用洗涤缓冲液冲10个柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱，按洗脱液总体换算每公斤血浆可以收约6.2万单位人凝血酶效价，然后用稀释液调整凝血酶效价约500IU/mL，平衡缓冲液配方为：0.3M丙氨酸，0.07M氯化钠，pH6.8；洗涤缓冲液配方为：0.3M丙氨酸，0.2M氯化钠，pH6.8；洗脱缓冲液配方为：0.3M丙氨酸，0.5M氯化钠，pH6.8；稀释液配方为：0.3M丙氨酸，0.1M氯化钠，pH6.8；

(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；

(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；

(10)分装；

(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人凝血酶冻干粉。

实施例2

(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆15kg融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；

(2)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50凝胶，干凝胶的加入量为1g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌1.5小时，收集凝胶，采用平衡缓冲液洗涤4次，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液并用0.45μm滤芯过滤，收集滤液1.3L，凝胶经过再生后保存可以重复使用，平衡缓冲液配方为：0.015M枸橼酸钠，0.2M氯化钠，pH为7.5；

(3)超滤：将步骤(2)所得的滤液先超滤浓缩，将洗脱液Ⅱ因子效价调整至8IU/mL，通过透析将电导调整至4ms/cm；

(4)激活：将步骤(3)所得料液进行除菌过滤，调整pH至7.0，然后再将配好的氯化钙母液经过除菌过滤后按比例加入料液中，使钙离子浓度保持在55mM，2-8℃激活15天；

(5)压滤：向步骤(4)所得激活后悬浮液加入12g硅藻土，用6g硅藻土预铺板框，压滤收集上清液，用0.45μm滤芯进行过滤；

(6)S/D病毒灭活：温和搅拌下将S/D灭活液缓慢加入步骤(5)所得滤液中，添加完毕后，搅拌30min，调整液温至24℃，灭活6小时，每30min记录一次温度；

(7)离子交换层析：离子交换层析柱先用平衡液充分平衡，将步骤(6)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用洗涤缓冲液冲10个柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱，按洗脱液总体换算每公斤血浆可以收约6.1万单位人凝血酶效价，然后用稀释液调整凝血酶效价约500IU/mL，平衡缓冲液配方为：0.3M丙氨酸，0.08M氯化钠，pH7.0；洗涤缓冲液配方为：0.3M丙氨酸，0.1M氯化钠，pH 7.0；洗脱缓冲液配方为：0.3M丙氨酸，0.4M氯化钠，pH 7.0；稀释液配方为：0.3M丙氨酸，0.12M氯化钠，pH 7.0；

(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；

(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；

(10)分装；

(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人凝血酶冻干粉。

实施例3

(1)新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆20kg融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；

(2)DEAE Sephadex A-50凝胶吸附：在步骤(1)所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50凝胶，干凝胶的加入量为1.5g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速(确保凝胶在溶液中混合分布均匀同时不宜太快)搅拌2.0小时，收集凝胶，采用平衡缓冲液洗涤5次，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液并用0.45μm滤芯过滤，收集滤液1.8L，凝胶经过再生后保存可以重复使用，平衡缓冲液配方为：0.015M枸橼酸钠，0.2M氯化钠，pH为7.5；

(3)超滤：将步骤(2)所得的滤液先超滤浓缩，将洗脱液Ⅱ因子效价调整至20IU/mL，通过透析将电导调整至3.5ms/cm；

(4)激活：将步骤(3)所得料液进行除菌过滤，调整pH至7.2，然后再将配好的氯化钙母液经过除菌过滤后按比例加入料液中，使钙离子浓度保持在65mM，2-8℃激活8天；

(5)压滤：向步骤(4)所得激活后悬浮液加入18g硅藻土，用9g硅藻土预铺板框，压滤收集上清液，用0.45μm滤芯进行过滤；

(6)S/D病毒灭活：温和搅拌下将S/D灭活液缓慢加入步骤(5)所得滤液中，添加完毕后，搅拌25min，调整液温至24℃，灭活6小时，每30min记录一次温度；

(7)离子交换层析：离子交换层析柱先用平衡液充分平衡，将步骤(6)所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用洗涤缓冲液冲10个左右柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱，按洗脱液总体换算每公斤血浆可以收约6.4万单位人凝血酶效价，然后用稀释液调整凝血酶效价约500IU/mL，平衡缓冲液配方为：0.25M丙氨酸，0.06M氯化钠，pH 7.2；洗涤缓冲液配方为：0.25M丙氨酸，0.15M氯化钠，pH 7.2；洗脱缓冲液配方为：0.25M丙氨酸，0.45M氯化钠，pH 7.2；稀释液配方为：0.25M丙氨酸，0.08M氯化钠，pH 7.2。

(8)除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；

(9)纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；

(10)分装；

(11)冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人凝血酶冻干粉。

上述实施例仅为本发明的较佳实施方式之一，并非以此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的工艺所做的等效变化，只要在本发明的要旨范围内，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种高纯人凝血酶的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）新鲜冰冻人血浆去除冷沉淀：将新鲜冰冻人血浆融化混合均匀后，经过流式离心机去除冷沉淀，取得离心后的血浆上清液；

（2）DEAE Sephadex A-50 凝胶吸附：在步骤（1）所得到的血浆上清液中加入DEAESephadex A-50 凝胶，干凝胶的加入量为0.5-1.5g/kg料液，干凝胶预先用70℃以上热注射用水进行溶胀，再用25℃以下冷注射用水进行冷却，最后用平衡缓冲液平衡，适当转速搅拌1.0-2.0小时，确保凝胶在溶液中混合均匀，转速不易太快，收集凝胶，采用平衡缓冲液洗涤5次，再用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液并用0.45μm滤芯过滤，凝胶经过再生后保存可以重复使用；

平衡缓冲液采用为：0.01-0.02M枸橼酸钠，0.15-0.25M氯化钠，pH为7.0-8.0；

（3）超滤：将步骤（2）所得的滤液先超滤浓缩，将洗脱液Ⅱ因子效价调整至5-20IU/mL，通过透析将电导调整至0.5-4.5ms/cm；

（4）激活：将步骤（3）所得料液进行除菌过滤，调整pH至6.5-7.5，然后再将配好的氯化钙母液经过除菌过滤后按比例加入料液中，使钙离子浓度保持在30-80mM，2-8℃激活5-15天；

（5）压滤：向步骤（4）所得激活后悬浮液按5-20g硅藻土/kg料液比例添加硅藻土，三分之一硅藻土预铺板框，其余加入料液中，压滤收集上清液，用0.45μm滤芯进行过滤；

（6）S/D病毒灭活：温和搅拌下将S/D灭活液缓慢加入步骤（5）所得滤液中，添加完毕后，搅拌15-30min，添加时间≤30min，调整液温至24-26℃，灭活6小时，每30min记录一次温度；

S/D病毒灭活液采用为：吐温-80溶度为1%(w/w)，TNBP浓度为0.3%(w/w)；

（7）离子交换层析：离子交换层析柱先用平衡液充分平衡，将步骤（6）所得料液用0.45μm滤芯过滤后上样，上样后先用洗涤缓冲液冲10个左右柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，然后用稀释液调整凝血酶效价500IU/mL；

平衡缓冲液采用为：0.1-0.5M 丙氨酸， 0.05-0.1M氯化钠，pH 6.5-7.5；洗涤缓冲液采用为：0.1-0.5M 丙氨酸， 0.1-0.3M氯化钠，pH 6.5-7.5；洗脱缓冲液采用为：0.1-0.5M 丙氨酸， 0.3-0.5M氯化钠，pH 6.5-7.5；稀释液配方为：0.1-0.5M 丙氨酸， 0.05-0.15M氯化钠，pH 6.5-7.5，其中丙氨酸也作为保护剂；

（8）除菌过滤：用0.22μm滤芯对制品进行除菌过滤；

（9）纳米膜除病毒过滤：先用0.1μm滤芯预过滤，再用15纳米滤芯进行除病毒过滤；

（10）分装；

（11）冷冻干燥：采取预冷，速冻、退火及一次干燥与二次干燥，最后得到人凝血酶冻干粉。