TW201609115A - 以外源性粒線體爲有效成份之組合物、其用途及修復細胞之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係揭露一種所揭以外源性粒線體為有效成份之組合物、其用途及修復細胞之方法，其中，該組合物係具有高度安全性，而藉由投予有效量之該組合物至一個體，得將外源性粒線體完整地送至細胞內，達到修復受損細胞、改善或預防細胞老化之功效，
Description
本發明係有關於抗老化及修復粒線體受損細胞之方法，特別係指一種以外源性粒線體為有效成份之組合物、其用途及修復細胞之方法。
粒線體為細胞內負責提供細胞能量，產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)。粒線體會因為細胞內能量需求或細胞壓力之不同，而進行動態變化，並非一直處於單一粒線體狀態。具體來說，當細胞能量需求增加時，粒線體會持續地分裂(fission)，以快速地產生三磷酸腺苷；相反地，當細胞處於飢餓狀態時，粒線體會進行融合(fusion)，以降低能量之生產及利用，維持細胞正常生理功能。此外，粒線體於遭遇如膜電位降低、粒線體DNA突變(mtDNA)等受損時，亦會進行融合反應，藉由同源性重組(homologous recombination)之方式，置換受損之粒線體DNA，而當粒線體內突變之DNA累積過多，以致無法進行修復時，粒線體會被自噬體(autophagosome)清除，僅留下正常之粒線體(Lamb CA et al.,2013)。是以，當細胞內同時具有過多受損之粒線體而無法被清除時，會使細胞走向細胞凋亡(Mukhopadhyay S et al.,2014)。
粒線體之缺損與功能不全係與許多疾病相關，例如：Leber遺傳性視神經萎縮症(Leber's hereditary optic neuropathy)類中風發作症候群(Mitochondrial Enephalomyopathy,Lactic Acidosis,and Strokelike
Episodes,MELAS)、肌抽躍癲癇合併紅色襤褸肌纖維症(Myoclonic Epilepsy Associated With Ragged-Red Fibers,MERRF)等。另外，神經退化性疾病，例如亨丁頓舞蹈症、阿茲海默症、帕金森氏症等疾病亦與粒線體分裂融合之能力失調相關(Ghavami S et al.,2014)。此外，老化現象或年紀增長係會使粒線體中突變DNA增長並且累積，而導致相關疾病之產生，例如老年黃斑部病變(age-related macular degeneration,AMD)(Brennan LA et al.,2014；Jarrett SG et al.,2010)與皮膚老化等(Blatt T et al.,2005；Makrantonaki E et al.,2007)。
為能延緩皮膚老化，人們會使用許多美容保養產品，例如玻尿酸、維生素A與維生素C、抗氧化劑、防曬劑等，或是尋求醫學美容診所改善老化現象，例如雷射、肉毒桿菌、電波拉皮等。惟，目前現有之美容方法皆無法自根本改善或延緩皮膚老化現象之發生。另有研究證實，注射間質幹細胞能有效地改善皮膚皺紋等老化現象，而使幹細胞療法被認為是延緩皮膚老化之契機。然而實際上，幹細胞取得不容易，大量培養須耗費過多時間與金錢，並且，幹細胞移植具有突變產生腫瘤或是產生排斥反應等風險。因此，目前仍未有一種安全性高且能確實有效地改善皮膚老化現象之方法。
於1989年之研究指出，給予外源性粒線體與細胞共同培養，必須經由直接注射或膜融合後，粒線體始能進入細胞內，使帶有基因缺陷之粒線體之細胞恢復正常功能(King MP et al.,1988；King MP et al.,1989)。許多研究亦證實，單純將細胞與粒線體共培養，無法使粒線體進入細胞內(Chang JC et al.,2013；Spees JL et al.,1989)，因而亦無法得知
直接給予外源性粒線體是否能進入細胞。而由先前技術之內容可知，不同細胞對於攝入外來粒線體之能力可能不同，因此，於粒線體進入細胞之途徑不明前，研究人員係無法透過調整實驗條件，使與粒線體相關之實驗加以重複實施。
再者，雖然細胞得經由吞噬作用(phagocytosis)攝入外源物質，如細菌等，但是，經吞噬途徑被攝入之外源物質會與溶脂體形成吞噬溶解小體(phagolysosome)，而使外源物質降解。因此，一般認為，外源粒線體無法經由吞噬作用，而保留於細胞內，並修復內生性粒線體。而近期研究係利用如美國專利第8648034號所揭細胞穿膜胜肽，或如美國專利公開第20130022666號所揭微脂體包覆粒線體，用以幫助粒線體與細胞膜融合而易於進入細胞內，提高細胞之氧化呼吸作用。惟，上述方法雖然可以促進粒線體送入細胞中，但其所使用之載體，如穿膜胜肽與微脂體，可能會引起粒線體與細胞膜破裂，造成粒線體的損傷與目標細胞的毒性。
本發明之主要目的即在於提供一種組合物，其係包含有效量之外源性粒線體。
本發明之次一目的係在於提供該組合物之用途，其係用以修復受損粒線體或改善細胞老化。
本發明之另一目的在於提供一種修復細胞之方法，其係將有效量之外源性粒線體投予至一個體中，使該外源性粒線體完整地被送至細胞內，據以達成修復受損細胞、改善或預防細胞老化之功效。
為能達成上述目的，本發明之一實施例所揭一種組合物，其
包含有一外源性粒線體，以及至少一藥學上或美容上可接受之載體。
較佳地，該組合物更包含有一輔劑，而該輔劑係為血清、血漿、補體或至少上述二成份之組合。
較佳地，該外源性粒線體係由細胞中萃取而得。
較佳地，該外源性粒線體係藉由離心純化之方法自細胞中獲得。
於本發明之另一實施例中，上述醫藥組合物之用途係用以改善皮膚細胞之老化現象。
於本發明之又一實施例中，上述組合物之用途係用以修復受損細胞。
本發明之一實施例中所揭一種修復細胞之方法，其係將一有效量之外源性粒線體投予至一個體，使該外源性粒線體進入細胞中，取代受損或老化之粒線體。
較佳地，該外源性粒線體於投予至該個體前，係以由血清、血漿及補體所組成之群中至少一成分進行前處理。
第一圖係為具有紅色螢光標定之粒線體與經綠色螢光lysotracker染色之BHK細胞，共同培養一小時後，攝入的粒線體與細胞內溶酶體(lysosome)相對位置之結果。
第二圖係為具有紅色螢光標定之粒線體與BHK細胞共同培養四小時後，攝入的粒線體與細胞內溶酶體相對位置之結果。
第三圖A及B係以掃描式電子顯微鏡觀察外源性粒線體被細胞吞噬之情形，其中，A圖中之方框表示，低倍率下正被吞噬之粒線體；B圖中之箭號指出，高倍率下正被細胞偽足吞噬之粒線體。
第四圖係為具有紅色螢光標定之粒線體與以鬼筆環肽(phalloidin)-FITC染色之BHK細胞共同培養四小時後，觀察粒線體進入BHK細胞之結果，其中，白色橫條標示10μm。
第五圖係為以抗生素actinomycin D(ActD)處理BHK細胞後，紅色粒線體進入BHK細胞之結果。白色橫條標示10μm。
第六圖係為第四圖與第五圖，處理或不處理AcD之BHK細胞，具有外源性粒線體的細胞比例之統計結果。
第七圖A係為未經補體處理之外源性紅色粒線體與帶有綠色螢光粒線體的BHK細胞共同培養四小時後，攝入的粒線體與細胞內粒線體相對位置之結果，其中，箭頭標示黃色螢光，代表外源性與內生性粒線體於細胞內位置重疊。
第七圖B係為以經C3補體10μg/mL處理之外源性粒線體與帶有綠色螢光粒線體的BHK細胞共同培養四小時後，攝入的粒線體與細胞內粒線體相對位置之結果，其中，箭頭標示黃色螢光，代表外源性與內生性粒線體於細胞內位置重疊。
第七圖C係以共軛焦顯微鏡觀察並分析第七圖B中之紅色線性區域，表示外源性粒線體之紅色螢光及代表內生性粒線體之綠色螢光訊號重疊之情形。
第八圖A係以電子顯微鏡觀察未經處理之粒線體之外觀。
第八圖B係以電子顯微鏡觀察經血清處理之粒線體之外觀。
第八圖C係以電子顯微鏡觀察經C3補體處理之粒線體之外觀。
第八圖D係以電子顯微鏡觀察經Pep-1穿膜胜肽處理之粒線體之外觀。
第九圖A係為外源性粒線體與HUVEC細胞共同培養後，該粒線體進入HUVEC細胞之結果。
第九圖B至D係分別為經不同處理之各組HUVEC細胞進行SA β-gal染色後之結果。
第十圖係以共軛焦顯微鏡觀察帶有紅色螢光蛋白之外源性粒線體進入小鼠真皮層纖維母細胞之情形。
第十一圖A至D係分別為以顯微鏡觀察，經外源性粒線體處理後，第一至四組裸鼠之皮膚表面之影像。
第十二圖係為經外源性粒線體處理後，各組裸鼠之表皮皺紋之粗糙度分析結果。
第十三圖A至D係為各組裸鼠之皮膚組織切片以梅生三色(Masson’s trichome)染色後之結果。
除非另有定義，於本發明之說明書及申請專利範圍所使用之技術及科學名詞之意義，其係與本發明所屬技術領域且具通常知識者之一般理解者相同。若有矛盾之情形，以本發明內容為準。
所謂「有效量」乙詞係指欲產生所求特定效果所需化合物或活性成份之量，得以其在組合物中所佔重量百分比表示。如同本發明所屬
技術領域中具有通常知識者所瞭解者，該有效量會因為欲引起特定效果之投予途徑而有所不同。一般來說，活性成分或化合物於組合物中之量可佔該組合物重量之約1%至約100%，較佳者係為約30%至約100%。
所謂「藥學或美容產品上能接受之載體」乙詞係包含任何標準於醫藥或美容產品上所使用之載體，而該載體係依據組合物之型態，得為固態、半固態或液態。舉例來說，載體包含，但不限於，明膠、乳化劑、烴類混合物、水、甘油、生理食鹽水、緩衝生理鹽水、羊毛脂、石蠟、蜂蠟、二甲基硅油、乙醇。
所謂「組合物」乙詞係包含一有效量之欲產生特定效果之所需化合物或活性成份，以及至少一載體。而如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，組合物之型態得隨著欲引起特定效果之投予途徑有所不同，如錠劑、粉劑、針劑等，並且，該載體亦隨著組合物之型態而得為固態、半固態或液態。
所謂「投予」乙詞係指將一物遞送至一個體特定部位、特定細胞、特定靶點之方式，或其與個體接觸作用之途徑，一般來說，投予途徑係包含有，但不限於，口服、塗抹、噴灑、吸入、注射等。
以下，為能更進一步說明本發明之功效，將茲舉若干實例作詳細說明，惟，該等實例係為用以解說之例示，其中所使用之任何詞彙並不限制本發明說明書及申請專利範圍之範圍及意義。
實例一：螢光標定粒線體
將帶有粒線體訊號胜肽(mitochondria signal peptide)之紅色螢光蛋白DsRed或是綠色螢光蛋白(green fluorescent protein)轉染
至幼倉鼠腎臟纖維母細胞(baby hamster kidney fibroblast cells，BHK-21 cells，以下簡稱BHK細胞)中，經由G418抗生素及流式細胞分選儀之篩選，得到能夠持續表現紅色螢光蛋白之RedM-BHK細胞或GFP-BHK細胞。
實例二：自BHK細胞分離粒線體
當BHK細胞之細胞數養至2X108時，細胞培養皿加入SEH緩衝液(0.25M之蔗糖、0.5mM之EGTA及3mM之HEPES-NaOH，PH值7.2)清洗，並且以1000xg離心3分鐘，移去上清液後，加入2毫升之SEH緩衝液，於Dounce均質器中研磨約15次，並於冰上操作，以降低對於細胞及粒線體之傷害。研磨完成後，將均質液進行離心，以1000x g離心15分鐘，除去沈澱物，再以9000xg離心10分鐘，最後沈澱物以50μL之SEH緩衝液溶解後，加入蛋白質分解酵素之抑制劑，於4℃保存。
實例三：確定粒線體進入細胞內之途徑
於本實例中，為追蹤粒線體進入細胞內之移動路徑，將藉由加入外源性粒線體，於不同時間觀察粒線體移動之位置與溶酶體之關係。
首先，以紅色螢光蛋白DsRed標定粒線體，並且，以帶有綠色螢光之溶酶體染劑(LysoTracker)轉染BHK細胞，用以確定細胞內溶酶體之位置。給予5μg之標定紅色螢光蛋白之外源粒線體，與已處理溶酶體染劑之BHK細胞於室溫下共同培養，於培養一小時及四小時時，於共軛焦顯微鏡觀察外源性粒線體進入BHK細胞之情形以及其與溶酶體之相對位置，結果如第一圖及第二圖所示。
由第一圖可知，帶有紅色螢光之外源性粒線體於培養一小時後，其係分佈於BHK細胞外圍。而由第二圖可知，於培養四小時後，部份
帶有紅色螢光之外源性粒線體與綠色螢光之溶酶體染劑訊號重疊。藉由上述結果可知，外源性粒線體進入細胞後會與溶酶體位於細胞內之同一位置，得推知外源性粒線體係經由吞噬作用進入細胞內。
更進一步地以掃描式電子顯微鏡觀察外源性粒線體進入BHK細胞之情形，如第三圖A及B所示，其中，第三圖A為於低倍率下之觀察結果，而由其內方框顯示正在被細胞吞噬之粒線體；而第三圖B為於高倍率下觀察之結果，圖中箭頭指出正在被細胞偽足吞噬之粒線體。因此，由第三圖之結果顯示BHK細胞係藉由伸出偽足(pseudopodia)包覆外來粒線體，證實外源性粒線體進入細胞之路徑係為吞噬作用。
再者，將BHK細胞以鬼筆環肽(phalloidin)-FITC染色，用以標定細胞內之肌動蛋白，以及顯示細胞型態。將上述已染色之BHK細胞與以紅色螢光標定之外源性粒線體於37℃下培養4小時後，可發現大量粒線體體入細胞內，如第四圖所示。然而，以20μM之抗生素actinomycin D(簡稱ActD)處理BHK細胞，使BHK細胞之吞噬作用被抑制，則可發現外源性粒線體完全無法進入細胞內，如第五圖所示。而將外源性粒線體進入上述依據不同處理後之細胞內之數目加以統計，結果如第六圖所示。
由上述結果可知，當單純將外源性粒線體給予細胞，細胞會藉由吞噬作用攝入粒線體，使粒線體得以進入細胞內。
實例四：血清係有助於粒線體進入細胞
取稀釋後的市售胎牛血清(GIBCO)將以標定紅色蛋白之外源性粒線體與血清混合一小時，經離心去除上清液中之血清，再將沈澱後之粒線體以SEH緩衝液回溶至原本之體積。將BHK細胞以鬼筆環肽
(phalloidin)-FITC染色，藉由該染劑與F-肌動蛋白之特異性結合，界定出細胞膜之界線。
將BHK細胞分為四組，其中，第一組為空白組；第二組係混合稀釋1000倍之血清；第三組係混合稀釋500倍之血清；第四組係混合稀釋100倍之血清。再自上述SEH溶液中抽取其中之粒線體，將之與各組之BHK細胞於37℃下共同培養4小時，以雷射共軛焦顯微鏡觀察帶有紅色螢光之粒線體進入細胞之情形，並且分析單一細胞內含有紅色粒線體之數量，結果如下表一所示，其中，表一係以one-way ANOVA檢驗之統計方法進行分析。星號表示p值小於0.05，代表與第一組控制組間具有統計上之顯著差異。
由上表一之結果可知，於血清存在之條件下，具有外源性粒線體之細胞數量以及其進入單個細胞內之數量係分別較於未經血清處理時顯著增加。由此可知，透過血清處理外源性粒線體或細胞係有助於提昇外
源性粒線體進入細胞之效率。
實例五：補體係有助於粒線體進入細胞
將經紅色螢光蛋白標定之外源性粒線體與一預定濃度之C3補體混合一小時，經離心去除上清液中之C3補體，將沈澱後之該外源性粒線體之SEH緩衝液回溶至原本體積。
第一組係為未處理組。第二組至第五組分別以濃度為0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL及20μg/mL之C3補體(Sigma-Aldrich)處理之外來粒線體5μg，於37℃下共同培養4小時後，以雷射共軛焦顯微鏡分別觀察各該組細胞中之紅色螢光，並且藉由流式細胞儀計算出各該組細胞中含有該外源性粒線體之比例，並且進一步進行量化統計。外來粒線體進入細胞後，與內生性粒線體融合的情形如第七圖A至C所示。
請參第七圖A及B中，各該圖中箭頭所指處為黃色螢光，表示外源性粒線體與內生性粒線體於細胞內重疊。因此，由第七圖之結果可知，無論有無處理補體，被細胞攝入之該外源性粒線體係與細胞內原本之粒線體位於細胞內同一位置，顯示外源性粒線體與內源性粒線體彼此間有融合之現象，並且能夠逃脫吞噬體(phagolysosome)而進入細胞質當中。
再者，藉由流氏細胞儀分析之結果可知，於未經C3補體處理之第一組中，平均約有26.16±4.75%之細胞被偵測到具有紅色螢光；第二組中係平均約有43.43±3.5%之細胞被偵測到具有紅色螢光；於第三組之細胞中，平均約有65.13±7.5%之細胞被偵測到具有紅色螢光；於第四組之細胞中，平均約有78.97±13.35%之細胞被偵測到具有紅色螢光；於第五組之細胞中，則約有80%之細胞被偵測到具有紅色螢光；並且，第二至五組
係分別與第一組間具有顯著差異(p<0.05)。
由上述結果證實，透過給予補體至外源性粒線體，可顯著提昇該外源性粒線體進入細胞之比例，並且，被攝入之外源性粒線體得與內源性粒線體融合，此外，隨著給予補體之濃度增加，亦得使進入細胞內之外源性粒線體數量增加。
實例六：血清或補體不會破壞分離出之粒線體
將分離出之外源性粒線體分為四組，各組5μg。其中，第一組係為空白組，第二組係以100倍稀釋之胎牛血清處理該外源性粒線體，第三組係以濃度10μg/mL之C3補體處理該外源性粒線體，第四組係以100nM之穿膜胜肽(cell penetrating peptide)Pep-1處理該外源性粒線體。將各組於37℃下培養4小時，以穿透式電子顯微鏡分別觀察各組外源性粒線體之外觀，結果如第八圖A至D所示。
由第八圖之結果可知，第二組及第三組之粒線體之外觀係分別類似於未經任何處理之第一組粒線體之外觀。而相較於第一組，第四組中經穿膜胜肽處理之外源性粒線體則明顯腫大，並且具有破裂之情形。因此，相較於穿膜胜肽，血清或是補體之毒性較低，並且不會破壞粒線體之外觀，而能維持粒線體進入細胞後之完整性。
實例七：培養人類臍帶內皮細胞
人類臍帶內皮細胞(human umbilical vascular endothelial cells，下稱HUVEC細胞)購自新竹食品工業發展研究所。HUVEC細胞培養於M199培養基，並加入10%之胎牛血清、0.1%之肝素以及0.03%之內皮細胞生長因子(endothelial cell growth supplement)。HUVEC細胞可
於0.1重量百分比之明膠被覆(gelatin-coated)之培養皿上生長。
實例八：粒線體可延緩細胞老化
先自人類纖維母細胞HS68抽出粒線體，用以作為外源性粒線體之來源。各組5μg。再將該粒線體以補體處理後，以紅色螢光之粒線體追蹤染劑(Mitotracker)將該粒線體染色。
另，以過氧化氫處理初代培養之HUVEC細胞，使其老化。培養到第8代之該HUVEC細胞(8×105cell/well)以100μM過氧化氫於37℃處理2小時，以磷酸鹽緩衝液清洗，除去過氧化氫，並以正常細胞培養液培養一天後，分為三組，其中，第一組係為未加入粒線體的空白組，第二組係加入未經補體處理之該粒線體，第三組係加入經補體處理之該粒線體。而各該組細胞係分別培養4小時後，分別進行SA β-gal(Senescence-associated β-galatosidase)染色，以及Ki67及BrdU之染色分析。
而Ki67及BrdU之染色流程係為本發明所屬技術領域且具通常知識者之一般周知技術，故於此不加以贅述。
SA β-gal染色之流程如下：細胞先以磷酸鹽緩衝液清洗，以2%之多聚甲醛(paraformaldehyde)、0.2%之戊二醛(glutaraldehyde)固定5分鐘，再以染色液於37℃下作用12小時，其中，該染色液包含有1mg/mL之5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，BCIG或X-gal)、40mM之檸檬酸磷酸鹽緩衝液(citric acid/phosphate buffer)(pH 6.0)、5mM之鐵氰化鉀(potassium ferricyanide)、5mM之亞鐵氰化鉀
(sodiumferricyanide)、150mM之氯化鈉及2mM之二氯化鎂。而後，以0.5%之伊紅(Eosin)將細胞染色，於顯微鏡下進行觀察。
以SA β-gal染色後之結果如第九圖A至D所示。由第九圖A可知外源性粒線體係能進入HUVEC細胞。由第九圖B至D可知，第一組之HUVEC細胞係有明顯染上SA β-gal。第二組之HUVEC細胞雖然有被SA β-gal染色，但是相較於第一組，第二組中被染色之HUVEC細胞數量係明顯下降。而相較於第一組或第二組，第三組中之HUVEC細胞則幾乎未染上SA β-gal。更進一步地將染色結果進行統計分析，得知第一組細胞中約有85±12.3%之細胞被染色，第二組細胞中約有60.1±6.8%之細胞被染色，而第三組細胞中係有25±6.2%之細胞被染色。
再者，將Ki67及BrdU之染色結果進行計數後可知，第一組之HUVEC細胞中染上Ki67及BrdU之比例為13.3%及13%。相較於第一組，第二組之HUVEC細胞中染上Ki67及BrdU之比例增加，分別為35%及33%。而第三組中之HUVEC細胞染上Ki67及BrdU之比例係為最高，分別為71%及59.6%。並且，當所投予之粒線體以胎牛血清處理時，亦能達到與以補體處理時之一樣功效。
由上述結果可知，外源性粒線體進入細胞係能有效降低細胞老化之程度、增加細胞生長以及提高細胞複製之效率，並且，隨著外源性粒線體進入細胞之數量增加而能更顯著地降低細胞老化之程度，使處於分裂狀態之細胞增加，以增加細胞複製與生長。據此，藉由投予本發明所揭含有外源性粒線體之醫藥組合物至一個體，係能有效改善或延緩其細胞老化之程度，並且當該醫藥組合物中具有促進粒線體進入細胞之成份時，如
血清、血漿或補體，更能顯著提昇其功效。
實例九：動物實驗(一)
自RedM-BHK細胞抽取帶有紅色螢光之粒線體，並且以100倍稀釋的胎牛血清或10μg/mL C3補體加以處理。取48週齡之自然老化裸鼠，將該粒線體注射至該裸鼠之皮下組織，待一小時後，取該裸鼠之全皮，以4%多聚甲醛固定5分鐘後，靜置於0.1M之磷酸鹽緩衝液至該樣品沉下，再以冷凍包埋劑(O.C.T)浸潤及包埋樣品，進行冷凍切片，而切片之厚度約為12μm。封片後以共軛焦顯微鏡觀察，結果如第十圖所示。
第十圖為粒線體移植後，於裸鼠的真皮層區域。藍色螢光為經DAPI染色之纖維母細胞細胞核，紅色螢光係為自RedM-BHK細胞所分離出之粒線體，由第十圖之結果顯示，移植後該粒線體係能進入真皮內之纖維母細胞中。
實例十：自肝臟細胞分離粒線體
首先，將小鼠深度麻醉後犧牲，以生理食鹽灌流該小鼠全身，待其肝臟中之血液去除乾淨。取出約1立方公分之肝組織，加入約6毫升之SEH緩衝液，經過組織研磨機研磨後，離心1000xg，離心15分鐘，再取其上清液。並且，同時於離心管中依次加入濃度為55%、40%、30%之蔗糖液，獲得一30~55%蔗糖梯度離心管。將經離心步驟所獲得之該上清液加到該梯度離心管之上層，經過35000rpm離心30分鐘，於40%與55%之分層間形成一透白層。吸取該透白層出來約有1毫升而收集於15毫升之離心管中，再加入5毫升之SEH緩衝液，離心13000xg，離心3分鐘後，去除上清液，並且，重複上述離心步驟三次，最後，以200μL之SEH緩衝液回溶
粒線體沉澱物，再加入蛋白質分解酵素之抑制劑，於4℃保存。
實例十一：動物實驗(二)
取32隻48週齡之自然老化裸鼠，分為4組，每組8隻，分別以不同條件處理12週，其中，第一組係為無治療組，第二組係為每週注射1000μg之肝臟粒線體至各該小鼠，第三組為每週注射1000μg經補體處理之肝臟粒線體至各該小鼠，第四組係為每週注射1000μg經血清處理之肝臟粒線體至各該小鼠。而第二組至第四組小鼠之皮下注射方式為將約5000μg/mL之肝臟粒線體平均注射於各該裸鼠背部上之20個點，於每個點注射0.01毫升，總注射量為0.2毫升。為除去單純補體與血清對皺紋的影響，施打補體與血清處理的粒線體前，實驗以高速離心兩次的方式去除殘留於上清液中的補體與血清。
試驗完成後，如實例九中所述流程將取自各該組裸鼠之全皮進行照相、組織冷凍切片及染色。皮膚照相結果如第十一圖A至D所示，並且，更進一步分析各該組裸鼠之表皮皺紋粗糙度，結果如第十二圖所示，其中，*表示與第一組間具有顯著差異。另以梅生三色染色法(Masson’s trichrome)將各該組裸鼠之皮膚組織進行切片染色，用以顯示其真皮膠原蛋白層之含量，結果如第十三圖A至D所示。
由第十二圖之結果可知，有注射外源性粒線體之第二組至第四組所觀察到之皺紋皆較無處理的第一組明顯降低，其中，第三組及第四組裸鼠皮膚上之皺紋係分別較第二組更為輕微。再者，由第十三圖之結果可知，第一組表皮層厚度最厚，而第二組至第四組之表皮層厚度皆較第一組下降，並且，其膠原蛋白層之染色分別較第一組變深。
綜合第十一圖至第十三圖之結果可知，投予本發明所揭外源粒線體係能進入活體細胞，並能有效降低皺紋之產生，以及提昇表皮纖維母細胞內產生膠原蛋白之能力，並且，由於血清或補體能促使外源粒線體進入細胞中，是以，經血清或補體處理過之外源粒線體係具有更加抗老化之能力。由此可知，本發明所揭含有外源性粒線體之醫藥組合物確實能達到延緩或改善皮膚老化之功效。
由上述實例結果可知，本發明所揭外源性粒線體及以其為活性成份之醫藥組合物係具有以下優點：其一、使用外源性粒線體係能克服習知技術中，以異體細胞移植所引發之排斥；其二、外源性粒線體得由一般細胞株或活體取得，來源廣泛，並且不會對人體健康有所危害，例如，習知之細胞移植技術，可能會導致癌症或腫瘤之發生；其三、外源性粒線體能直接進入細胞，與內生性粒線體融合，取代老化細胞或受損細胞中之受損粒線體，達到減低細胞的氧化壓力以及恢復細胞正常功能之功效，並且能夠提供細胞長久直接之保護；其四、外源性粒線體以血清或補體處理後，能夠完整地進入細胞，並且避免以如穿膜胜肽或微脂體(liposome)處理所引起之細胞毒性；其五、外源性粒線體係能根本性地改善皺紋及皮膚老化之現象，並且有效地促使膠原蛋白合成增加。
據此，本發明所揭醫藥組合物係具有高度安全性，而藉由投
予有效量之醫藥組合物至一個體，透過外源性粒線體進入細胞中，而能達到修復粒線體受損細胞及改善老化現象之功能。
以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明，熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。
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Claims (8)
- 一種組合物，其包含有外源性粒線體，以及至少一藥學上或美容上可接受之載體。
- 依據申請專利範圍第1項所述組合物，其更包含有一輔劑，而該輔劑係選自由血清、血漿、補體及至少上述二成份之組合所組成之群。
- 依據申請專利範圍第1項所述組合物，其中，該外源性粒線體係由細胞中萃取而得。
- 依據申請專利範圍第1項所述組合物，其中，該外源性粒線體係藉由離心純化之方法自細胞中獲得。
- 一種如申請專利範圍第1項所述組合物之用途，其係用以改善或預防皮膚細胞之老化現象。
- 一種如申請專利範圍第1項所述組合物之用途，其係用以修復粒線體受損細胞。
- 一種修復細胞之方法，其係將一有效量之外源性粒線體投予至一個體，使該外源性粒線體進入細胞中，取代受損或老化之粒線體。
- 依據申請專利範圍第7項所述抗細胞老化之方法，其中，該外源性粒線體於投予至該個體前，係以由血清、血漿及補體所組成之群中至少一成分進行前處理。
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