KR20250020300A - 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 명세서에는 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액 또는 상기 배양액에서 추출된 엑소좀을 포함하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법을 개시한다. 일 측면에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액, 이의 추출물 또는 상기 배양액에서 추출된 엑소좀을 포함하여 망막세포 (retina cell)의 아폽토시스(apoptosis)를 유발하는 물질의 독성을 효과적으로 억제할 수 있으며 망막변성질환의 예방, 개선 또는 치료에 우수한 효능을 가질 수 있다.
Description
본 명세서에는 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액, 이의 추출액 또는 상기 배양액에서 추출된 엑소좀을 포함하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 제조방법을 개시한다.
본 발명을 지원한 연구개발사업 정보는 하기와 같습니다.
[이 발명을 지원한 연구개발사업]
[과제고유번호] 18-2020-006
[연구사업명] 재생의학센터 첨단바이오의약품 비임상 공동연구
[연구과제명] 망막변성질환 치료를 위한 줄기세포 유래 세포외소포체의 망막세포 재생 치료 효과 규명
[기여율] 100/100
[과제수행기관명] 분당서울대학교병원
[연구기간] 2020.07.01~2021.06.30
망막변성(retinal degeneration) 질환은 안구의 신경 조직인 망막과, 망막에서 가장 중요한 기능을 담당하는 황반에 유전적 이상, 노화, 염증, 혈관질환 등에 의한 병적인 변화가 발생하여 결국 실명에 이르는 질환을 총칭한다. 망막세포의 변성은 황반변성, 유전성 망막질환 등 중요 안과질환의 병리 기전이다. 망막세포는 신경계의 다른 세포와 마찬가지로 분열 및 재생 능력이 떨어지기 때문에, 망막세포가 소실될 경우 재생시키거나 손상된 세포를 대체할 수 있는 효과적인 방법이 없어서 현재까지 망막세포 변성에 대한 치료방법은 없는 상황이다. 망막세포의 변성을 막거나 지연시키는 치료 기술에 대한 연구가 절실히 요구되고 있다.
종래에 망막변성질환을 치료하기 위해 줄기세포를 안구 내에 직접 주사하는 줄기세포 치료가 시도되었으나, 안구 내 주사된 줄기세포가 섬유아세포 (fibroblast)로 전환(transformation)되어 실명을 초래한 사례가 다수 보고된 바 있다. 따라서, 안전성을 이유로 줄기세포 치료를 임상에 바로 적용하기는 어렵다.
본 발명의 일 목적은 신규한 망막변성질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 망막변성질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 일 측면에서 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액, 이의 추출액 또는 상기 배양액에서 추출된 엑소좀을 포함하는 망막변성질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
일 실시예에서, 상기 엑소좀은 1Х107 내지 1Х 1012 particles/ml의 농도로 함유될 수 있다.
일 실시예에서, 상기 엑소좀은 10 내지 250nm의 평균 크기를 가질 수 있다.
일 실시예에서, 상기 망막변성질환은 망막색소변성증(retinitis pigmentosa, RP), 황반변성(macular degeneration, MD), 유전성 황반변성, 연령 관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 염증으로 발병된 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 유전성 망막질환, 노른자모양황반이상증 (Vitelliform macular dystrophy), 스타가르트병 (Stargardt disease), X유전자연관 망막층간분리 (X-linked retinoschisis), 원뿔 세포 이상증(cone dystrophy), 원뿔세포-막대세포 이상증 (cone-rod dystrophy), 포도막염, 망막혈관폐쇄, 시신경질환 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나일 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 전술한 망막변성질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조 방법으로서, 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계 및 상기 줄기세포 배양액에서 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는 망막변성질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액, 이의 추출액 또는 상기 배양액에서 추출된 엑소좀을 포함하여 망막세포 (retina cell)의 아폽토시스(apoptosis)를 유발하는 물질의 독성을 효과적으로 억제할 수 있으며 다양한 망막변성질환의 예방, 개선 또는 치료에 우수한 효능을 가질 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 안구 내에 주사하기 때문에, 줄기세포 치료에 기인한 잠재적 위험을 방지할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물에 포함된 엑소좀은 줄기세포의 분비 인자를 전달 하는 매개체인 세포외소포체(extracellular vesicles, EV)로서, 항혈관, 항염증, 항섬유화, 면역조절, 신경보호 등의 효능을 가질 수 있다.
도 1은 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 추출된 엑소좀(T-MSC EV)의 특성을 나타낸다. 도 1A는 T-MSC EV의 극저온 투과 전자 현미경 이미지(축척 막대: 50nm), 도 1B는 나노입자 추적 분석을 사용하여 측정된 T-MSC EV의 크기 분포, 도 1C는 T-MSC EV의 제타 전위, 도 1D는 편도 유래 중간엽 줄기 세포의 배양 배지에서 추출된 T-MSC EV의 수를 나타낸다.
도 2는 T-MSC EV에 대한 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2에서, 대조군(None)으로 엑소좀(EV)을 처리하지 않은 RPE19 cell을 배양한 well의 OD값을 100%로 정하고 이를 기준으로 나머지 실험군의 OD값을 환산하였다(RPE: Retinal pigment epithelial cell.)
도 3은 atRAL 처리 시 T-MSC EV에 의한 RPE19 cell의 세포 생존능을 측정한 그래프이다. 도 3에서, 대조군(None)으로 엑소좀(Extracellular vesicles, EV)을 처리하지 않은 RPE19 cell을 배양한 well의 OD값을 100%로 정하고 이를 기준으로 나머지 실험군의 OD값을 환산하였다.
도 4는 도 2의 RPE19 cell을 WST-1 assay로 처리하기 전에 현미경으로 관찰 한 사진이다.
도 5는 T-MSC EV에 의한 atRAL 독성의 억제 효과를 측정한 그래프이다.
도 6은 형광 표지된 T-MSC EV의 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 다양한 조건의 배양한 망막색소상피세포(RPE-1 s)에서 추출한 RNA를 이용하여 얻은 전사체 시퀀싱(transcriptome sequencing) 데이터의 K-means 클러스터링(clustering) 및 농축 분석에 관한 것이다.
도 8은 Pde6b 유전자 녹아웃 쥐 모델에서 외과립층(ONL)과 내과립층(INL)의 두께를 측정한 그래프이다. 두께 측정 시 객관성 유지를 위해 시료 번호를 가리고 blind로 측정하였으며, 각 부위별로 3번씩 측정하여 평균 값을 도출하였다. 엑소좀(EV)을 주사하지 않은 좌안을 대조군(#2-25L, #2-29L, #2 30L)으로 사용하였고, 실험군(#2-25R, #2-29R, #2-30R)으로 사용된 우안에만 엑소좀(EV)을 주사하였다.
도 9는 다양한 망막변성질환을 예방, 개선 또는 치료를 위해 T-MSC EV를 적용하는 방법의 개략도이다.
도 2는 T-MSC EV에 대한 독성 실험 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2에서, 대조군(None)으로 엑소좀(EV)을 처리하지 않은 RPE19 cell을 배양한 well의 OD값을 100%로 정하고 이를 기준으로 나머지 실험군의 OD값을 환산하였다(RPE: Retinal pigment epithelial cell.)
도 3은 atRAL 처리 시 T-MSC EV에 의한 RPE19 cell의 세포 생존능을 측정한 그래프이다. 도 3에서, 대조군(None)으로 엑소좀(Extracellular vesicles, EV)을 처리하지 않은 RPE19 cell을 배양한 well의 OD값을 100%로 정하고 이를 기준으로 나머지 실험군의 OD값을 환산하였다.
도 4는 도 2의 RPE19 cell을 WST-1 assay로 처리하기 전에 현미경으로 관찰 한 사진이다.
도 5는 T-MSC EV에 의한 atRAL 독성의 억제 효과를 측정한 그래프이다.
도 6은 형광 표지된 T-MSC EV의 현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 7은 다양한 조건의 배양한 망막색소상피세포(RPE-1 s)에서 추출한 RNA를 이용하여 얻은 전사체 시퀀싱(transcriptome sequencing) 데이터의 K-means 클러스터링(clustering) 및 농축 분석에 관한 것이다.
도 8은 Pde6b 유전자 녹아웃 쥐 모델에서 외과립층(ONL)과 내과립층(INL)의 두께를 측정한 그래프이다. 두께 측정 시 객관성 유지를 위해 시료 번호를 가리고 blind로 측정하였으며, 각 부위별로 3번씩 측정하여 평균 값을 도출하였다. 엑소좀(EV)을 주사하지 않은 좌안을 대조군(#2-25L, #2-29L, #2 30L)으로 사용하였고, 실험군(#2-25R, #2-29R, #2-30R)으로 사용된 우안에만 엑소좀(EV)을 주사하였다.
도 9는 다양한 망막변성질환을 예방, 개선 또는 치료를 위해 T-MSC EV를 적용하는 방법의 개략도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 용어 "중간엽 줄기세포"는 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포(예를 들어, 뼈 세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포 등)로 분 화하는 능력을 가진 미분화된 줄기세포를 의미한다. 본 발명의 "중간엽 줄기세포" 는 인체 유래, 동물 유래 또는 식물 유래 줄기일 수 있고, 바람직하게는 인체 유래 중간엽 줄기세포일 수 있고, 더욱 바람직하게는 편도 유래 중간엽 줄기세포 (Tonsil-derived Mesenchymal Stem Cell, T-MSC)일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "편도 유래 중간엽 줄기세포"는 목의 안쪽과 코의 뒷부분 에 위치하여 외부에서 침입하는 세균 등의 물질로부터 일차적으로 우리 몸을 방어 함과 동시에 림프상피 면역조직으로 작용을 수행하는 조직인 편도에서 유래된 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 새로운 세포로 분화하는 능력을 가진 미분화된 줄기세포를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "엑소좀(exosome)"은 세포외소포체(extracellular vesicles, EV)로서 단백질, 지방, 대사물질(metabolite), 핵산 등과 같은 생체 유래 물질을 수용 세포로 전달하는 역할을 한다.
본 명세서에서 용어 "적용"은 임의의 적절한 방법으로 적용 대상에 상기 조성물을 제공하는 것을 의미하며, 투여, 도포, 흡수 및 섭취 등을 포함하는 의미이다. 이때, 적용 대상은 상기 조성물을 적용할 수 있는 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
본 명세서에서 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하여 망막변성질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 본 발명 에 따른 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 적용하여 망막변성질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 명세서에서 용어 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 적용하여 망막변성질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "망막변성질환"이란 안구의 신경 조직인 망막과, 망막 에서 가장 중요한 기능을 담당하는 황반에 유전적 이상, 노화, 염증, 혈관질환 등 에 의한 병적인 변화가 발생하여 결국 실명에 이르는 질환을 총칭한다. 예를 들어, 망막변성질환으로는 황반변성(macular degeneration, MD), 유전성 황반변성, 연령 관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 염증으로 발병된 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 유전성 망막질환, 망막색소변성증(retinitis pigmentosa, RP), 노른자모양황반이상증 (Vitelliform macular dystrophy), 스타가르트병 (Stargardt disease), X유전자연관 망막층간분리 (X-linked retinoschisis), 원뿔 세포 이상증(cone dystrophy), 원뿔세포-막대세포 이상증 (cone-rod dystrophy), 포도막염, 망막혈관폐쇄, 시신경질환, 녹내장 등이 있다.
본 발명은 일 관점에서 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액, 이의 추출액 또는 상기 배양액에서 추출된 엑소좀을 포함하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양하는 단계 및 상기 줄기세포 배양액에서 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는 망막변성질환 예방 또는 치료용 조성물 제조방법에 관한 것이다.
구체적인 일 실시예에 있어서, 상기 편도 유래 중간엽 줄기세포는 인간 유래일 수 있다.
구체적인 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 상기 엑소좀을 1Х107 내지 1Х 1012 particles/ml의 농도로, 바람직하게는 1Х1010 내지 1Х1012 particles/ml의 농도로, 더욱 바람직하게는 1Х1010 내지 5Х1011 particles/ml의 농도로 포함할 수 있다. 상기 엑소좀을 1Х107보다 적은 농도로 포함하는 경우 망막변성질환 예방 또는 치료 효과가 미비하며, 1Х 1012보다 높은 농도로 포함하는 경우 독성 등의 문제점이 발생 할 수 있다.
구체적인 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 상기 엑소좀은 10 내지 250nm, 바람직하게는 50 내지 200 nm, 더 바람직하게는 100 내지 150 nm의 평균 크기(또는 평균 직경)을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 엑소좀은 123.9 ± 45.8 nm 또는 114.2 ± 7.2 nm의 평균 크기를 가질 수 있다.
구체적인 일 실시예에 있어서, 상기 망막변성질환은 황반변성(MD), 당뇨병성 망막병증, 유전성 망막질환, 포도막염, 망막혈관폐쇄, 시신경질환 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 황반 변성은 연령 관련 황반변성(age-related macular degeneration, AMD) 또는 베체트포도막염 (Behcet's uveitis)으로 인해 발생한 황반변성일 수 있고, 상기 유전성 망막질환은 망막색소변성증(retinitis pigmentosa, RP), 노른자모양황반이상증 (Vitelliform macular dystrophy), 스타가르트병 (Stargardt disease), X유전자연관 망막층간분리 (X-linked retinoschisis), 원뿔 세포 이상증(cone dystrophy), 원뿔세포-막대세포 이상증 (cone-rod dystrophy)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 atRAL에 의해 유발된 세포 사멸을 억제할 수 있으므로, atRAL에 따른 세포독성에 대한 세포보호효능을 나타낼 수 있으며, 망막세포 (retina cell)의 atRAL에 의해 유발된 세포 사멸을 억제가 필요한 대상체에 투여하기 위한 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 항혈관, 항염증, 항섬유화, 면역조절 및/또는 신경보호가 필요한 대상체에 투여하기 위한 것일 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물, 의약외품 조성물 및 건강기능식품 조성물 중 어느 하나 이상일 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 적용에 적합한 단위적용형의 제제로 제형화시켜 적용할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구적용 제제로서 주사제 또는 국소 적용용 제제 등이 바람직하다. 주사용 제형은 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 그러나, 이때, 일반적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 함께 사용할 수 있다. 이렇게 제조된 본 발명의 제제는 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 특정 부위에 직접 적용할 수 있다. 이때, 조성물의 주입은 주사기를 이용하여 이루어질 수 있다. 유효성분의 실제 적용량은 적용경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 상기 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는 데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 예를 들어 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 황산화제, 완충액, 정균제와 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 약학적 조성물의 적용량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 적용량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 적용량은 약 0.1~2000㎎/일의 범위이다. 더 바람직한 적용량은 0.1~1000㎎/일이다. 적용은 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 의약외품 조성물은 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 의약외품 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 유효성분 이외에 의약외품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들어 연마제, 습윤제, 결합제, 기포제, 감미제, 방부제, 약효성분, 향미제, 색소, 용제, 증백제, 가용화제 또는 pH 조정제를 포함할 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다.
예시적인 일 구현예에 있어서, 상기 건강기능식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
통계 분석
Windows용 SPSS 소프트웨어(ver. 21.0, SPSS Inc., Chicago, Ill)를 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 비모수 통계의 경우 Mann-Whitney U 테스트를 수행하여 그룹 간의 차이를 확인하였으며, 차이는 p≤0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
[실시예]
편도 유래 중간엽 줄기세포(T-MSC) 배양 및 엑소좀 추출 방법
본 실시예에 사용된 조건배지는 이화의료원 IRB(Institutional Review Board)에서 승인(EUMC2021-09-036)을 받은 인체 유래물을 사용하여 (주)셀 라토즈테라퓨틱스에서 제조한 편도 유래 중간엽 줄기세포(Tonsil derived Mesenchymal Stem Cellew, T-MSCew)의 조건배지를 사용하였다.
상기 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양 배지(DMEM: Dulbecco's modified eagle medium)에 배양한 다음, 무혈청 및 무항생제 배지에서 계대배양하고, 세포 배양 상층액을 회수하고, 회수한 세포 배양 상층액을 원심분리하고 220nm pore membrane filter로 여과하여 엑소좀을 분리하여 추출하였다. 구체적으로, 배양배지를 300 x g, 10분간 그리고 2000 x g, 10분간 원심 분리하여 세포 파쇄물(cell debris)를 제거하고 220nm bottle-top membrane(Millipore, Burlington, MA, USA)으로 여과를 진행하였다 (세포 파쇄물 제거 단계). 이어서 DI water(Deionized Water) 250 ml로 플러싱(Flushing)하여 storage agent를 제거하였다 (플러싱 단계). DPBS(Ca2+ , Mg2+) 250 ml 이상으로 플러싱하여 장치 내에 버퍼(buffer) 환경을 조성하였다 (버퍼 컨디셔닝 단계). 250 ml 배지를 300 kDa MWCO(Molecular-weight-cut-off) TFF(Tangential flow filtration) filter를 이용하여 5 내지 10ml 부피까지 농축(concentration)을 진행하였다 (농축 단계). 이 때 공급 압력(feed pressure)가 0.5bar를 넘지 않도록 제어하였다. 농축된 부피(Concentrated volume)의 7 내지 10배 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)를 추가하고 다시 5 내지 10 ml 부피까지 정용외과(diafiltration)을 진행하였다 (정용외과 단계). 이 때 7배 이상 희석 시 99% 이상의 저분자 제거(small molecule removal)가 가능하였다. 시료(sample) 회수 후, 220nm bottle-top membrane으로 여과를 진행하였다(회수 단계). 이와 같이 추출된 엑소좀의 정보는 아래 도 1 및 표 1과 같다.
엑소좀 독성 실험(Exosome toxicity test in vitro, RPE19)
망막색소상피(retinal pigment epithelium, RPE) 세포인 인간 RPE19(ARPE-19, CRL-2302TM) cell을 96 well plate에 각각 5Х103 cells/well로 분주하고 DMEM/F12(10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) 세포 배양배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 기존 배양배지를 제거하고 새로운 세포 배양배지로 교환한 후, 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(이를 'MSC derived EV' 또는 'EV'라 약칭함)을 0 또는 1Х108부터 5Х1010 particles/ml까지 다양한 농도(1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, or 5Х108 particles/ml)로 상기 well에 처리하였다. 엑소좀(EV) 처리 후 24, 48, 72 시간 뒤에 EZ-cytox 세포생존율 분석 시약(WST-1 cell viability assay kit; DoGenBio, Seoul, Korea)을 추가하고, 배양기에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 450nm에서 OD(optical density)값을 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 본 실험군의 경우 엑소좀(EV)을 다양한 농도로 24, 48, 72시간 동안 처리하였으나 대조군(None)에 비해 약 90% 이상의 세포 생존능(cell viability)를 나타내는 것으로 확인되어 세포 독성은 관찰되지 않았다.
엑소좀의 atRAL에 의한 망막 독성 억제 효능 실험(Efficacy test in vitro, RPE19)
RPE19 cell을 96 well plate에 각각 5Х103 cells/well로 분주하고DMEM/F12(10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) 세포 배양배지에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후, 기존 배양배지를 제거하고 새로운 세포 배양배지로 교환한 후, 망막세포(retina cell)의 아폽토시스(apoptosis)를 유발하는 독성물질인 all-trans-retinal(이를 'atRAL'이라 약칭함)을 25 μM 및 50 μM로 처리하였다. 여기에 추가로 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(MSC derived EV)을 0 또는 1Х107부터 1Х1010 particles/ml까지 10배수의 농도로 well에 처리하였다. 이로부터 3시간 뒤에 EZ-cytox 세포생존율 분석 시약(WST-1 cell viability assay kit; DoGenBio, Seoul, Korea)을 추가하고, 배양기에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 OD값을 측정하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 엑소좀(EV)을 추가하지 않고 atRAL 25 μM을 처리한 실험군은 대조군(None)에 비해 약 30%의 세포 생존능(cell viability)를 가지는 것으로 확인되었고, 엑소좀(EV)을 추가하지 않고 atRAL 50 μ M을 처리한 실험군은 대조군(None)에 비해 약 10%의 세포 생존능(cell viability) 를 가지는 것으로 확인되었다. 반면 엑소좀(EV)을 추가하여 처리한 경우 이러한 세포 생존능의 감소 현상은 약화되는 것으로 확인되었다. 특히 atRAL 25 μM에 엑소좀(EV)을 1Х1010 particles/ml로 처리한 실험군의 세포 생존능(cell viability)은 약 85%로 나타났으며, atRAL 50μM에 엑소좀(EV)을 1Х1010 particles/ml로 처리한 실험군의 세포 생존능(cell viability)은 약 90%로 나타났다. 따라서 위 실험을 통해 atRAL에 의한 망막 독성이 본 발명의 엑소좀(EV)에 의해 억제되는 것이 확인되었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 엑소좀(EV) 처리 없이 atRAL만 처리한 실험군의 경우 세포의 수도 적어지고 세포의 모양이 둥글게 바뀌었으나, 엑소좀(EV)을 1Х1010 particles/ml로 atRAL과 함께 처리한 경우 대조군(None) well과 비교하여 세포 모양에 큰 차이가 없는 것이 확인되었다.
엑소좀의 atRAL에 의한 망막 독성 억제 효능 실험(Efficacy test in vitro, RPE1)
RPE1 cell을 96 well plate에 각각 5Х103 cells/well로 분주하고 DMEM/F12(10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) 세포 배양배지에서 24시간 동 안 배양하였다. 상기 배양 후 기존 배양배지를 제거하고, 사멸된 세포에 염색되는 CytoTox Green dye(Incucyte CytoTox Green, Sartorius, cat#4633) 50 nM을 포함한 새로운 세포 배양배지로 교환한 후, atRAL을 50 μM로 처리하였다. 여기에 추가로 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(MSC derived EV)을 0 또는 1Х107부터 1Х1010 particles/ml까지 10배수의 농도로 well에 처리하였다.
이를 Incucyte live cell imaging 장비(Sartorius)를 사용하여 한 시간마다 bright field로 live cell을 관찰하였고, green fluorescence 관찰로 총 24시간 동안 사멸 세포를 확인하였다. 도 4는 본 발명의 엑소좀에 의한 atRAL 독성 의 억제 효과를 측정한 그래프로서, 시간 별로 Green dye intensity 값을 측정한 결과이다.
도 5에 나타난 바와 같이, 엑소좀(EV)을 추가하지 않고 atRAL 시약을 처 리한 실험군(B)의 경우 한 시간 후부터 사멸 세포의 증가로 green dye intensity 값이 약 18시간까지 꾸준히 증가하였다. 엑소좀(EV)을 추가 처리한 실험군(C, D, E, F)의 경우 엑소좀(EV)의 농도가 증가함에 따라 green dye intensity 값의 증가 기울기가 감소한 것이 확인되었다. 특히 엑소좀(EV)을 1Х1010 particles/ml로 처리 한 경우 약 14시간까지는 대조군(None)과 유사하게 안정적이었고 그 후 세포독성 (cytotoxicity)이 상대적으로 약하게 발생하는 것이 확인되었다.
Far-red로 표지된 엑소좀의 위치화(Localization of F(red)-tagged EV with RPE1)
RPE1 cell을 8 well chamber slide에 각각 1Х104 cells/well로 분주하고 DMEM/F12(10% FBS, Penicillin-Streptomycin added) 세포 배양배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후 기존 배양배지를 제거하고 새로운 세포 배양 배지로 교환한 후, far-red fluorescence로 표지(tagging)된 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(MSC derived EV)을 5Х109 particles/ml로 처리하였다. 3시간, 6시간, 16시간 및 24시간 후 배양배지 제거하고, 4% paraformaldehyde(PFA)를 사용하여 세포를 고정시킨 뒤 DAPI(40,6-Diamidino-2-phenylindole) 염색 후 형광현미경(Axio Observer 7, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 엑소좀(EV) 처리 24시간 후에도 세포 내 엑소좀(EV)이 존재 하는 것이 확인되었다. 즉, 본 실시예를 통해 엑소좀이 RPE1 세포질 내로 직접 이동하여 치료 효과를 내는 것이 확인되었다.
atRAL과 공배양된 RPE 유전자 발현에 대한 엑소좀 효능
편도 유래 중간엽 줄기세포에서 추출한 엑소좀(2Х109 particles/ml) 및 atRAL(25 μM)을 RPE-1(Human immortalized RPE) 세포(2.5Х106 세포)에 동시에 처리한 1시간 및 6시간 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 RPE-1에서 RNA를 추출하였다. RNA 전사체 시퀀싱(transcriptome sequencing)은 Macrogen (Korea)에서 수행하였다. 정렬된 읽기를 생성하기 위해 HISAT2 소프트웨어를 사용하여 Paired-ended transcriptome 읽기를 인간 참조 게놈 GRCh38에 매핑하였다. 이 데이터를 사용하여 StringTie 소프트웨어를 사용하여 transcript assembly를 수행하였다. K-means 클러스터링 및 농축 분석은 iDEP 웹 애플리케이션을 사용하여 수행하였다.
상기 배양 조건의 RPE-1 세포에서 atRAL 및 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 추출한 엑소좀에 따른 유전자 발현의 차이를 평가하기 위해 RPE-1 세포에서 추출한 RNA를 사용하여 전사체 시퀀싱 및 k-means 클러스터링을 수행하였다. 상위 2000개의 유전자를 선택하여 클러스터링 분석을 위한 그룹으로 나누었고, 차별적으로 발현되는 유전자(differentially expressed gene, DEG)가 풍부한 GO 생물학적 프로세스 용어를 조사하였다. 그 결과는 도 7에 나타난 바와 같다. 1시간 배양에서는 다양한 배양 조건에서 그룹 간에 유의한 차이가 없었지만 atRAL 및 엑소좀의 효과는 배양 6시간 후에 더 분명해졌다. 클러스터 A 및 B의 유전자는 외부 화학 자극(atRAL)에 대한 세포 반응과 관련이 있으며, 상기 유전자들은 atRAL과 함께 6시간 동안 배양된 그룹에서 상향 조절되었다. 성장 조건 동안 RPE는 다양한 표현형을 나타낼 수 있고 배양 배지에서 혈청에 의해 자극된 증식 과정을 거쳐 다양한 유형의 분화를 일으킬 수 있다. 이러한 성향은 클러스터 C의 유전자 발현으로 볼 수 있으며 비교적 짧은 시간(1시간) 동안 배양된 그룹과 atRAL 없이 배양된 그룹에서 상기 유전자들의 상향 조절과 관련이 있다. 흥미롭게도, 클러스터 D는 지방 세포 분화에 관여하는 경로를 포함하고 있으며, 클러스터 D의 유전자는 atRAL 및 엑소좀을 함께 배양된 그룹에서보다 ATRAL로 배양된 그룹에서 상대적으로 상향 조절되었다(배양 시간: 6시간).
Pde6b 유전자 녹아웃 쥐 모델(in vivo Pde6b knockout rat)에서 엑소좀의 효능 실험
망막색소변성증(retinitis pigmentosa, RP)의 병인과 관련된 원인 유전자 중 하나인 PDE6b 유전자는 망막 광전도에 중요한 역할을 하는 효소인 rod cGMP phosphodiesterase type 6을 암호화한다. PDE6b 유전자의 돌연변이는 막대형 광수용기 막에서 cGMP-개폐 양이온 채널의 기능을 방해하여 채널의 영구적인 개방을 통한 세포외 이온의 과도한 유입으로 인해 세포 사멸을 초래한다. 본 발명자들은 앞선 in vitro 실시예를 바탕으로 in vivo에서 PDE6b knockout rat(IACUC no. BA-2008-302-075-07)을 사용하여 편도 유래 중간엽 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 효능을 확인하였다. CRISPR-Cpf1 매개 Pde6b 녹아웃 쥐는 울산대학교 의과대학 서울아산병원 안과로부터 제공받았다. PDE6b knockout rat을 마취한 후 엑소좀(EV) 3Х1011 particles/ml를 초자체내주사(intravitreous injection)한 후 안저촬영(fundus photography)을 실시하였다. 쥐 유리체(vitreous volume: 13-20 μl) 내 엑소좀(EV)의 농도는 1.5Х 107 내지 2.3Х107 particles/μl이다. 엑소좀(EV)을 주사한 후 15일 뒤 쥐 안구 (rat eye ball)를 적출하여 paraffin block을 제작하였다. Paraffin block으로 만 든 쥐 안구를 4 μm 두께로 section하여 slide를 제작 후 H&E staining을 진행하였다. 슬라이드 스캐너(slide scanner)를 이용하여, 시신경 유두(optic disc)를 기준으로 좌우로 망막(retina)의 500, 750, 1000, 1500 μm 지점의 외과립층(outer nuclear layer, ONL)과 내과립층(inner nuclear layer, INL)의 두께를 측정하였다. 광수용체의 핵을 포함하는 망막 내 구조인 ONL은 광수용체의 기능과 밀접한 관련이 있기 때문에 ONL 두께는 광수용체의 건강 상태와 망막변성질환(Retinal degenerative disease, RDD)의 중증도를 나타내는 실용적인 바이오마커로 여겨지고 있다.
도 8에 나타난 바와 같이, 대조군인 좌안과 비교하여 엑소좀 (EV)을 주사한 우안의 외과립층(ONL)의 두께가 증가된 것이 확인되었다. 실험군에서 시신경 유도(optic disc)를 기준으로 한쪽에만 외과립층(ONL)의 두께가 증가한 것은 해당 방향으로만 엑소좀(EV)을 주사하였기 때문이다. 또한, 엑소좀이 망막에 고르지 않게 분포함에도 불구하고 PDE6b 녹아웃 쥐의 망막 조직의 보호 효과가 유의하다는 것을 확인하였다.
편도 유래 중간엽 줄기세포에서 추출된 엑소좀의 망막변성질환 치료 메커니즘은 항산화 효과와 연결될 수 있다. 전사체 시퀀싱 및 k-means 클러스터링 분석 결과를 기반으로 고려할 때 Pde6b 유전자의 돌연변이와 조절되지 않은 산화 스트레스 사이의 잠재적 관계를 생각해 볼 수 있다. 또한, 항산화 방어 시스템의 손상과 과도한 ROS 수준으로 인한 산화 스트레스는 황반변성(MD), 당뇨병성 망막병증, 유전성 망막질환, 포도막염, 망막혈관폐쇄, 시신경질환 및 녹내장 등의 망막변성질환의 발병에 결정적인 역할을 하기 때문에, 상기 결과들을 통해 편도 유래 중간엽 줄기세포에서 추출된 엑소좀은 다양한 망막변성질환 치료에 활용될 수 있다.
Claims (9)
- 편도 유래 중간엽 줄기세포 배양액, 이의 추출액 또는 상기 배양액에서 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 망막변성질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 상기 엑소좀을 1Х107 내지 1Х 1012 particles/ml의 농도로 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 엑소좀은 직경이 10 내지 250nm인, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 망막변성질환은 망막색소변성증(retinitis pigmentosa, RP), 황반변성 (macular degeneration, MD), 유전성망막질환 (inherited retinal diseases), 나이관련황반변성(age-related macular degeneration, AMD), 안염증으로 발병된 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 유전성 망막질환, 노른자모양황반이상증 (Vitelliform macular dystrophy), 스타가르트병 (Stargardt disease), X유전자연관 망막층간분리 (X-linked retinoschisis), 원뿔 세포 이상증(cone dystrophy), 원뿔세포-막대세포 이상증 (cone-rod dystrophy), 포도막염, 망막혈관폐쇄, 시신경질환 및 녹내장으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 안구 내 투여용인, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 망막세포 (retina cell)의 아폽토시스(apoptosis)를 유발하는 물질의 독성을 억제할 필요가 있는 대상체에 투여하기 위한 것인, 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 아폽토시스는 atRAL에 의해 유발된 것인, 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 항혈관, 항염증, 항섬유화, 면역조절 및/또는 신경보호가 필요한 대상체에 투여하기 위한 것인, 조성물. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 망막변성질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조 방법으로서, 편도 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계 및 상기 줄기세포 배양액에서 엑소좀을 추출하는 단계를 포함하는, 망막변성질환 예방, 개선 또는 치료용 조성물의 제조방법.
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| PA0109 | Patent application |
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| PA0201 | Request for examination |
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