TW201542204A - 珊瑚萃取物用於製備抗發炎及抗疼痛之醫藥組合物之用途 - Google Patents
珊瑚萃取物用於製備抗發炎及抗疼痛之醫藥組合物之用途 Download PDFInfo
- Publication number
- TW201542204A TW201542204A TW103115718A TW103115718A TW201542204A TW 201542204 A TW201542204 A TW 201542204A TW 103115718 A TW103115718 A TW 103115718A TW 103115718 A TW103115718 A TW 103115718A TW 201542204 A TW201542204 A TW 201542204A
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- group
- induced
- pain
- fur
- excavatolide
- Prior art date
Links
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 title claims abstract description 65
- 241000243321 Cnidaria Species 0.000 title claims abstract description 65
- 108010087765 Antipain Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N antipain Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 SDNYTAYICBFYFH-TUFLPTIASA-N 0.000 title claims abstract description 15
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 title abstract description 20
- 239000000284 extract Substances 0.000 title abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 5
- DOJARKZHQUCCCD-UHFFFAOYSA-N excavatolide B Natural products CC(=O)OC1C2C(C)C(O)CC(OC(C)=O)C2(C)C(OC(C)=O)C(OC(=O)CCC)CC(C)=CC2OC(=O)C3(C)C21O3 DOJARKZHQUCCCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 63
- DOJARKZHQUCCCD-JFRQKETJSA-N excavatolide b Chemical compound CC(=O)O[C@@H]([C@@]1(C)[C@@H](OC(C)=O)C[C@H](O)[C@H](C)[C@@H]1[C@H]1OC(C)=O)[C@@H](OC(=O)CCC)C\C(C)=C/[C@@H]2OC(=O)[C@@]3(C)[C@]21O3 DOJARKZHQUCCCD-JFRQKETJSA-N 0.000 claims abstract description 63
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 claims abstract description 35
- 230000003356 anti-rheumatic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 claims description 59
- 206010042674 Swelling Diseases 0.000 claims description 32
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 32
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 claims description 31
- 230000036407 pain Effects 0.000 claims description 31
- 102000011779 Nitric Oxide Synthase Type II Human genes 0.000 claims description 30
- 108010076864 Nitric Oxide Synthase Type II Proteins 0.000 claims description 30
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 20
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 claims description 10
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 208000004454 Hyperalgesia Diseases 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 206010051728 Bone erosion Diseases 0.000 claims description 5
- 208000035154 Hyperesthesia Diseases 0.000 claims description 5
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 2
- 239000003435 antirheumatic agent Substances 0.000 claims description 2
- 201000003068 rheumatic fever Diseases 0.000 claims description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 79
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 79
- -1 ester polysaccharides Chemical class 0.000 description 73
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 62
- 210000002683 foot Anatomy 0.000 description 52
- 239000000679 carrageenan Substances 0.000 description 46
- 229920001525 carrageenan Polymers 0.000 description 46
- 235000010418 carrageenan Nutrition 0.000 description 46
- 229940113118 carrageenan Drugs 0.000 description 46
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 46
- UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L zinc;1-(5-cyanopyridin-2-yl)-3-[(1s,2s)-2-(6-fluoro-2-hydroxy-3-propanoylphenyl)cyclopropyl]urea;diacetate Chemical compound [Zn+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CCC(=O)C1=CC=C(F)C([C@H]2[C@H](C2)NC(=O)NC=2N=CC(=CC=2)C#N)=C1O UHVMMEOXYDMDKI-JKYCWFKZSA-L 0.000 description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 description 25
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 18
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 17
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 15
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 15
- 102000001776 Matrix metalloproteinase-9 Human genes 0.000 description 14
- 108010015302 Matrix metalloproteinase-9 Proteins 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 13
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 206010065390 Inflammatory pain Diseases 0.000 description 12
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 12
- 108010037462 Cyclooxygenase 2 Proteins 0.000 description 11
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 11
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 11
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 11
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 11
- 108090000625 Cathepsin K Proteins 0.000 description 10
- 102000004171 Cathepsin K Human genes 0.000 description 10
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 10
- 102000007591 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 9
- 108010032050 Tartrate-Resistant Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 9
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 8
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 7
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 7
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 6
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 6
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 6
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 5
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 5
- 102000002274 Matrix Metalloproteinases Human genes 0.000 description 5
- 108010000684 Matrix Metalloproteinases Proteins 0.000 description 5
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 5
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 5
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 4
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 4
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 241000009334 Singa Species 0.000 description 4
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 4
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 4
- 210000000544 articulatio talocruralis Anatomy 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 4
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 4
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 4
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 208000010731 swelling symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 4
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010023232 Joint swelling Diseases 0.000 description 3
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 3
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 3
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 3
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 description 3
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 206010020718 hyperplasia Diseases 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000000629 knee joint Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 3
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000002456 anti-arthritic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 2
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 2
- 230000000495 immunoinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 2
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 2
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 2
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 2
- 210000001226 toe joint Anatomy 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004018 waxing Methods 0.000 description 2
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FXEDIXLHKQINFP-UHFFFAOYSA-N 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate Natural products CCCCCCCCCCCCCC(=O)OC1CC2(O)C(C=C(CO)CC3(O)C2C=C(C)C3=O)C4C(C)(C)C14OC(=O)C FXEDIXLHKQINFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 2-bromophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Br VADKRMSMGWJZCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000124001 Alcyonacea Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 229930182716 Excavatolide Natural products 0.000 description 1
- FUSGIMAYXOIESS-UHFFFAOYSA-N FF.SCC1=CC=CC=C1 Chemical compound FF.SCC1=CC=CC=C1 FUSGIMAYXOIESS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000634835 Homo sapiens M1-specific T cell receptor alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000634836 Homo sapiens T cell receptor alpha chain MC.7.G5 Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 206010023203 Joint destruction Diseases 0.000 description 1
- 206010023230 Joint stiffness Diseases 0.000 description 1
- 102100029450 M1-specific T cell receptor alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010047163 Vasospasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000004721 adaptive immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 1
- 206010053552 allodynia Diseases 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 230000000947 anti-immunosuppressive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 230000010072 bone remodeling Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 229930004069 diterpene Natural products 0.000 description 1
- 125000000567 diterpene group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000017970 negative regulation of osteoblast differentiation Effects 0.000 description 1
- 208000004296 neuralgia Diseases 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 230000001582 osteoblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000026416 response to pain Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000000565 sealant Substances 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M sodium fluoride Chemical compound [F-].[Na+] PUZPDOWCWNUUKD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N sodium metavanadate Chemical compound [Na+].[O-][V](=O)=O CMZUMMUJMWNLFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- 201000004595 synovitis Diseases 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 230000036413 temperature sense Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036410 touch Effects 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 229910000166 zirconium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本發明提供一種珊瑚萃取物之皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)用於製備抗發炎之醫藥組合物的用途，其中該抗發炎係抗類風濕性關節炎。本發明亦提供一種珊瑚萃取物之皮草珊瑚內酯B用於製備抗發炎性疼痛之醫藥組合物的用途。
Description
本發明係關於一種珊瑚萃取物之新穎用途，尤其係關於該珊瑚萃取物用於製備抗發炎及抗疼痛之醫藥組合物之用途。
根據2002年到2010年的文獻回顧中指出，由1990年共23個海洋化合物抗在發炎、免疫抑制與神經系統相關前臨床研究到2009-2011年共有60個化合物進入前臨床實驗。因此說明海洋天然物在抗發炎活性研究隨海洋天然物的研究上也逐年的受到重視，成為未來在發炎疾病上很有潛力的藥物開發來源。
過去研究指出，萃取自軟珊瑚的海洋天然化合物(皮草珊瑚內酯B，Excavatolide B)對於佛波醇誘導性皮膚炎模式中(TPA induced skin inflammatory)有顯著的抑制發炎的作用，同時在相同的文獻中指出皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)在酯多醣誘發老鼠的樹突細胞(Dendritic cell)中具有減少發炎相關的細胞激素(cytokine)產生的作用。同時過去的研究亦指出Excavatolide B對於部分癌細胞沒
有顯著的細胞毒殺活性，因此說明海洋天然物Excavatolide B對於發炎相關的疾病上有極為重要的開發潛力。此外，美國專利US8530513B1號揭示皮草珊瑚內酯B可用於抑制佐波醇誘發皮膚發炎，並以誘導型一氧化氮合成酵素(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、第二型環氧化酵素(cyclooxygenase-2，COX-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-alpha)、介白素-6(IL-6)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)等因子作為治療的目標，同時過去研究證實iNOS、COX-2、TNF-alpha、IL-6、MMP9在諸多項疾病中均有表現，包含疼痛相關疾病、免疫相關疾病、癌症中均有相關因子之探討，然該專利案並無實際的實施例來說明並支持皮草珊瑚內酯B可治療所有與iNOS、COX-2、TNF-alpha、IL-6、MMP9相關之疾病的實施例與明確數據，因此將皮草珊瑚內酯B用於治療發炎相關的疾病上尚未有實際應用案例。
先前文獻說明巨噬細胞在多種發炎性疾病中佔有重要角色，在發炎組織中巨噬細胞會釋放多種細胞激素與趨化因子，造成多種的細胞集聚。其中酯多醣活化巨噬細胞中核因子-B(nuclear factor-B，NF-B)調節路徑，以誘發促發炎性蛋白質，誘導型一氧化氮合成酵素(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和第二型環氧化酵素(cyclooxygenase-2，COX-2)的表現，並釋放大量的一氧化氮與多種前列腺素的生成。然iNOS和COX-2在多種發炎疾病中均大量表現，且一氧化氮會促進COX-2的活性，將其花生四烯酸(arachidonic acid,AA)代謝，產生大量的發炎因子如前列腺素(prostaglandin)、白三烯素(leukotriene)，引起發炎性疼痛加劇發炎現象。
過去研究亦發現iNOS和COX-2發現在一些發炎動物模式如佐劑誘發類風濕性關節炎模式、鹿角菜膠誘發發炎模式等中扮演的角色為可來當作誘發發炎性細胞因子表現的媒介物，加劇發炎反應。
先前的研究說明皮草珊瑚內酯B對於酯多醣誘發樹突細胞中具有減少發炎相關的細胞激素(cytokine)產生的作用，而過去研究說明酯多醣誘發會導致樹突細胞成熟分化，由抗原吞噬能力極強的細胞，成熟分化為專職抗原呈遞細胞(antigen-presenting cells)後對於初期和適應性免疫扮演重要角色。相關的文獻說明未成熟的樹突細胞存在於骨髓之中，而受刺激成熟後的樹突細胞會移動到皮膚、淋巴組織等，藉以活化輔助型T細胞誘發專一性免疫反應。因此說明皮草珊瑚內酯B對於免疫細胞的免疫調節具有作用，然在多數的發炎疾病中巨噬細胞占有重要角色，包含急性及慢性發炎疾病。類風溼性關節炎此疾病在全球人口中占有0.5-1%，其中佔台灣人口中的0.3%，因此相關的藥物開發有其必要性。
類風濕性關節炎是一種慢性的自體免疫失調(autoimmune disorder)的疾病，其主要特徵為多點性的對稱關節炎，且伴隨著慢性發炎之骨骼腐蝕(bone erosion)、滑液內襯增生(synovial hyperplasia)及關節處的慢性腫脹症狀。而隨著疾病的形成，其關節處內襯會逐漸變質退化，並造成強烈疼痛及降低關節活動性(Firestein,2003)。此外，浸潤細胞(infiltrating cell)及滑膜細胞所製造的多種細胞活素，也是造成類風濕性關節炎病理過程的其中之一原因。目前研究發現巨噬細胞、嗜中細性白血球、肥大細胞、淋巴細胞、樹突細胞與增生的纖維母細胞形成的血管翳，
同時過去研究指出，在類風溼性關節炎中，樹突細胞對於類風濕性關節炎中會活化輔助型T細胞調控免疫反應。然在類風濕性關節炎之症狀的產生，最主要是由於蝕骨細胞的大量增生與活化，造成成骨作用的動態平衡失調(homeostasis imbalance)，進而使骨質重塑(bone remodeling)傾向於再吸收(resorption)的狀態。蝕骨細胞是由巨噬細胞單核球系統(monocyte/macrophage lineage)所分化而來。在先前研究說明皮草珊瑚內酯B對樹突細胞的免疫調節具有作用，現階段未有研究闡述皮草珊瑚內酯B對於自體免疫相關疾病相關的研究。
本發明中的實施例為鹿角菜膠誘發腳掌疼痛腫脹之動物模式與佐劑誘發類風濕性關節炎動物模式，其中於該鹿角菜膠誘發疼痛之動物模式中，該皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)可有確效的減緩發炎、鎮痛之作用，並有減少鹿角菜膠誘發之疼痛之徵狀，如減少疼痛發炎處之發炎性血球的浸潤；降低發炎性物質，如誘導型一氧化氮合成酵素(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，在發炎組織的表現；以及減緩發炎處之腫脹、痛覺及觸覺敏感。故該皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)具有抗疼痛之功效。
此外，於佐劑誘發類風濕性關節炎動物模式中進一步證實該草珊瑚內酯B(Excavatolide B)可明顯減少噬骨細胞的相關基因與蛋白表現與抑制噬骨細胞的分化作用，即可減緩慢性發炎之骨骼腐蝕；並同時減緩關節炎所誘發之關節腫脹、降低關節炎指數及避免體重下降。
而過去的研究說明除iNOS、COX-2、TNF-alpha、IL-6、MMP9外，同時相關的研究機轉上也包含更多不同的分子研究與治療標的，包含IL-1bata、IL-10、MMP2、Cathepsin K、TRA、MAPK等等諸多分子，同時噬骨細胞也被證實在類風溼性關節炎中扮演重要角色。故該皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)亦具有作為抗關節炎藥物開發的潛力。
本文中的用語「或」其意同「及/或」。
本發明提供一種皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)用於製備抗發炎之醫藥組合物的用途，其中該皮草珊瑚內酯B係具有式I之結構：
其中R1為H或C1~C6之烷基；R2為H或C1~C6之烷基。
於一較佳之具體實施例中，其中該皮草珊瑚內酯B中的該R1為C3H7，該R2為CH3。
於另一具體實施例中，該抗發炎係抗關節炎。於一較佳之具體實施例中，該抗發炎係抗類風濕性關節炎。
本文所述之「類風濕性關節炎(Rheumatoid arthritis)」包含
但不限於類風濕性關節炎之病狀及其類似病徵。本文所提之「類風濕性關節炎」一詞包含但不限於係一種自體免疫病症，其特徵為慢性且持續性發炎，此會導致進行性關節破壞、畸形、喪失能力及過早死亡。類風濕性關節炎之關鍵臨床症狀為多關節滑膜炎，其為潛在細胞及分子發炎事件之結果，從而導致疼痛、由滑膜變厚及積液引起之腫脹及關節僵硬。
於一具體實施例中，該醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。於一較佳具體實施例中，該醫藥組合物之劑型係呈膠囊、錠劑、粉劑、軟膏劑、液劑或噴劑型式。
於本文所用之術語「載劑」或「醫藥學上可接受之載劑」係指本領域一般技藝人士熟知之可用於製備醫藥組合物之稀釋劑、賦形劑、接受劑或其類似物。
於另一具體實施例中，該醫藥組合物進一步抑制該類風濕性關節炎引發之腫脹或骨骼侵蝕之症狀。於一較佳之具體實施例中，該抑制骨骼侵蝕係指抑制噬骨細胞的分化作用。於一更佳之具體實施例中，該抑制噬骨細胞的分化作用係指抑制抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、肌動蛋白環(acting ring)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP 9)或組織蛋白酶K(cathepsin K)之表現。
於一具體實施例中，該類風濕性關節炎引發之腫脹係關節腫脹。於一較佳具體實施例中，該醫藥組合物進一步降低患有類風濕性關節炎之個體之關節炎指數或避免該個體體重下降。
如本文所用之術語「個體」表示動物、尤其哺乳動物。在一較佳實施例中，術語「個體」表示人類。
於一具體實施例中，該皮草珊瑚內酯B之有效投藥劑量介於0.5毫克/公斤至200毫克/公斤。於一較佳之具體實施例中，該皮草珊瑚內酯B之有效投藥劑量介於1毫克/公斤至100毫克/公斤。於一更佳之具體實施例中，該皮草珊瑚內酯B之有效投藥劑量介於10毫克/公斤至80毫克/公斤。於另一具體實施例中，該皮草珊瑚內酯B之有效投藥劑量介於15毫克/公斤至60毫克/公斤。
本文中所提及「有效投藥劑量」一詞係指單獨或併用其他藥物之本發明醫藥組合物組份在症狀之處理上可提供治療利益之量。另外文中所提之「毫克/公斤」一詞係代表依據個體體重(每公斤)給予對應之劑量(毫克)。本發明的成分可用各種途徑服用，例如口服方式如片劑、膠囊或類似物，或者藉由腸道外、靜脈、肌肉、皮膚、口腔、皮下、栓劑或其他途徑。在一較佳具體實施例中，該醫藥組合物是以口服方式服用，如片劑、膠囊或類似物，以適於人體吸收的單位劑量形式，產生理想的用藥效果。在一更佳具體實施例中，該醫藥組合物是以注射方式進行施打。
本發明亦提供一種皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)用於製備抗疼痛之醫藥組合物的用途，其中該皮草珊瑚內酯B係具有式I之結構：
其中R1為H或C1~C6之烷基；R2為H或C1~C6之烷基。
於一較佳之具體實施例中，其中該皮草珊瑚內酯B中的該R1為C3H7，該R2為CH3。
於一具體實施例中，該醫藥組合物進一步抑制該發炎性疼痛誘發之發炎物質，其中該發炎物質包含誘導型一氧化氮合成酵素(iNOS)。上述抑制該發炎性疼痛誘發之發炎物質的效果可達到抗發炎或抗疼痛之功效。
於另一具體實施例中，該醫藥組合物進一步降低該發炎性疼痛誘發之血球浸潤現象。於一較佳之具體實施例中，該血球浸潤現象包含嗜中性白血球、單核球細胞、巨噬細胞或纖維母細胞之增生及匯集。上述降低該發炎性疼痛誘發之血球浸潤現象的效果可達到抗發炎或抗疼痛之功效
本文所提之「抗發炎」或「抗疼痛」係指包含但不限於治療或處理發炎或疼痛之病狀。於本文所用之術語「治療」或「處理」係指改善症狀。
於另一具體實施例中，該抗疼痛係抗發炎性疼痛。於一較佳具體實施例中，該抗疼痛係抗關節炎性疼痛。於一更佳之具體實施例中，該抗疼痛係抗類風濕性關節炎性疼痛。
於一具體實施例中，該疼痛係減少疼痛引發之腫脹、降低疼痛處之觸覺過敏或降低痛覺過敏。於一較佳具體實施例中，該腫脹係關節腫脹或發炎腫脹。
於一具體實施例中，該皮草珊瑚內酯B之有效投藥劑量介於0.5毫克/公斤至200毫克/公斤。於一較佳之具體實施例中，該皮草珊瑚內酯B之有效投藥劑量介於1毫克/公斤至100毫克/公斤。於一更佳之具體實施例中，該皮草珊瑚內酯B之有效投藥劑量介於10毫克/公斤至80毫克/公斤。於另一具體實施例中，該皮草珊瑚內酯B之有效投藥劑量介於15毫克/公斤至60毫克/公斤。
於一具體實施例中，該醫藥組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。於一較佳具體實施例中，該醫藥組合物之劑型係呈膠囊、錠劑、粉劑、軟膏劑、液劑或噴劑型式。
熟習此項技術者將能夠易於判定最適用於待處理之路徑及劑量。根據本發明，較佳之投藥路徑為口服或注射投藥，例如但不限於膠囊、錠劑、粉劑、軟膏劑、液劑或噴劑等。劑量將取決於待處理症狀之性質及狀態、待處理患者之年齡及總體健康狀況、投藥路徑及任何先前已可實施之治療。熟習此項技術者應瞭解，該劑量可隨患者個體而變化，視個體之年齡、大小及健康狀況及相關因子而定。此外，若需要可將其殺菌，
或與任何醫藥學上可接受之載劑或賦形劑混合。本發明之醫藥組合物之製備可由習此技藝人士根據習知方法進行。
圖1所示為皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)的化學結構式，其中-OCOPr=-OCOC3H7；-OAc=-OCOCH3。
圖2所示為利用西方點墨法分析皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對於酯多醣刺激巨噬細胞表現發炎性蛋白誘導型一氧化氮合成酵素之抑制作用。(A)皮草珊瑚內酯B對於酯多醣刺激巨噬細胞表現發炎性蛋白誘導型一氧化氮合成酵素西方點墨法之結果圖。(B)利用單因素方差分析(one way ANOVA)進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法(Duncan's Method)進行多重組間差異性比較。*P<0.05(與單純加入酯多醣組作為比較)。
圖3所示為皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對於鹿角菜膠誘發疼痛行為之影響。(A)後腳負重分布改變評估，在第2至24小時時有顯著誘發後腳負重分布情形，在實驗第1組(以鹿角菜膠誘發疼痛後，施打15mg/kg之Excavatolide B)、實驗第2組(以鹿角菜膠誘發疼痛後，施打60mg/kg之Excavatolide B)與誘發組(僅以鹿角菜膠誘發疼痛)有顯著的差異。(B)溫度感異常測試，在第3至24小時時有顯著誘發熱覺過敏情形，在實驗第1組、實驗第2組與誘發組有顯著的差異。(C)機械性觸痛反應測試，在第2至24小時時有顯著誘發觸覺過敏情形，在實驗第2組與誘發組有顯著的差異。(D)腳掌容積測量，在第1至24小時時有顯著誘
發腳掌腫脹情形，在驗第1組、實驗第2組與誘發組有顯著的差異。數值呈現方式為平均值±平均值標準誤差。(利用單因素方差分析進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法進行多重組間差異性比較。*P<0.05(與誘發組注射第0小時為比較)；# P<0.05(皮下給予皮草珊瑚內酯B與誘發組相同時間點作比較)。
圖4所示為皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對於鹿角菜膠誘發之大白鼠腳掌腫脹外觀之影響。(A)及(B)為控制組(正常之大白鼠)的腳掌組織、(C)及(D)為誘發組(僅以鹿角菜膠誘發疼痛)，第24小時的腳掌，腳掌外觀有明顯的腫脹及有嚴重的發紅情形。(E)及(F)為實驗第1組(注射鹿角菜膠經皮下給予15毫克/公斤Excavatolide B)，第24小時的腳掌，腳掌腫脹程度較為輕微。(G)及(H)為實驗第2組(注射鹿角菜膠經皮下給予60毫克/公斤Excavatolide B)，第24小時的腳掌，腳掌腫脹情形較不明顯，腳掌發紅情形亦有改善。
圖5所示為皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對於鹿角菜膠誘發之發炎性疼痛動物模式之腳掌組織病理切片。(A)為控制組(正常之大白鼠)。(B)為誘發組(僅以鹿角菜膠誘發之發炎性疼痛)之第24小時的組織切片。(C)為實驗第1組(注射鹿角菜膠後，經皮下注射給予15毫克/公斤Excavatolide B)之第24小時的組織切片。(D)為實驗第2組(注射鹿角菜膠後，經皮下注射給予60毫克/公斤Excavatolide B)之第24小時的組織切片。誘發組與控制組比較下，可觀察到腳掌組織具有大量的發炎性血球大量聚集。合併並給予Excavatolide B在濃度15毫克/公斤和60毫
克/公斤均可明顯減少發炎性血球聚集之現象。(比例尺=50μm)
圖6所示為皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對於鹿角菜膠所誘發之發炎性細胞浸潤現象之影響。(A)為控制組(正常大白鼠)，無發炎性細胞浸潤現象。(B)為誘發組(單純注射鹿角菜膠)之第24小時的組織切片，可觀察到明顯的發炎性細胞浸潤現象。(C)為實驗第1組(注射鹿角菜膠後，經皮下注射給予15毫克/公斤Excavatolide B)之第24小時的組織切片，與誘發組比較發炎性細胞浸潤現象有明顯的減少。(D)為實驗第2組(注射鹿角菜膠後，經皮下注射給予60毫克/公斤Excavatolide B)之第24小時的組織切片，與誘發組相比，發炎性細胞浸潤現象有明顯的減少。圖(E)單核球、(F)巨噬細胞、(G)嗜中性白血球、(H)纖維母細胞為細胞放大圖。同時利用400X下定量分析誘發組與控制組比較下，顯著的誘發單核球、巨噬細胞、嗜中性白血球和纖維母細胞數量的上升。在實驗第1組及實驗第2組均可顯著降低四種細胞數量的上升。數值呈現方式為平均值±平均值標準誤。(利用單因素方差分析進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法進行多重組間差異性比較。P<0.05以*表示，與單純給予鹿角菜膠組注射第0小時為比較；P<0.05以#表示，皮下給予皮草珊瑚內酯B與誘發組相同時間點作比較。A-D之比例尺=50μm，E-H之比例尺=5μm)。
圖7所示為皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對於鹿角菜膠誘發腳掌組織產生誘導型一氧化氮合成酵素蛋白質表現之影響。(A)皮草珊瑚內酯B對於鹿角菜膠引起誘導型一氧化氮合成酵素蛋白質之西方點墨法結果圖。(B)誘導型一氧化氮合成酵素蛋白質統計分析結果，注射鹿
角菜膠後合併皮下給予Excavatolide B 15毫克/公斤及60毫克/公斤組與誘發組(單純注射鹿角菜膠於腳掌組織之大白鼠)比較，誘導型一氧化氮合成酵素蛋白質生成的表現量明顯低於誘發組，具有顯著性的減少表現。肌動蛋白為內控制組(internal control)。數值呈現方式為平均值±平均值標準誤。(利用單因素方差分析進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法進行多重組間差異性比較。P<0.05以*表示，誘發組與控制組為比較；P<0.05以#表示，皮下給予Excavatolide B與誘發組作比較)。
圖8所示為皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對於酯多醣誘發類噬骨細胞培養模式之影響。(A)至(C)為正常組(未加入酯多醣)、(D)至(F)為酯多醣誘發組(單純加入酯多醣培養)、(G)至(I)為實驗組(酯多醣誘發合併給予Excavatolide B)。利用紫蘇-伊紅染色分析：(A)、(D)和(G)為酯多醣處理1天後之形態；(B)、(E)和(H)為酯多醣處理3天後之形態；(C)、(F)和(I)為酯多醣處理6天後之形態。在酯多醣誘發組與正常組比較於第3、6天可觀察到多核細胞的形態。實驗組與酯多醣誘發組比較，明顯減少多核細胞的形態的出現。(比例尺=50微米)
圖9所示為皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)蛋白質表現在酯多醣誘發類噬骨細胞培養模式之影響。利用螢光染色分析(A)正常組(未加入酯多醣)、(B)酯多醣誘發組(單純加入酯多醣培養)、(C)實驗組(酯多醣誘發合併給予Excavatolide B)及(D)實驗對照組(單純給於Excavatolide B)。(E)為利用定量分析之結果，在(B)酯多醣誘發組與(A)正常組比較有顯著的增加表現TRAP蛋
白質的細胞數量；(C)實驗組與(B)酯多醣誘發組相比有顯著的減少表現TRAP蛋白質的細胞數量；(D)實驗對照組與(A)正常組無顯著差異。(利用單因素方差分析進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法進行多重組間差異性比較。P<0.05以*表示，酯多醣誘發組與正常組為比較；P<0.05以#表示，實驗組與酯多醣誘發組作比較。比例尺=50微米)。
圖10所示為皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對肌動蛋白環蛋白質表現在酯多醣誘發類噬骨細胞培養模式之影響。利用螢光染色分析(A)正常組(未加入酯多醣)、(B)酯多醣誘發組(單純加入酯多醣培養)、(C)實驗組(酯多醣誘發合併給予Excavatolide B)及(D)實驗對照組(單純給於Excavatolide B)。利用定量分析，在(B)酯多醣誘發組中與(A)正常組比較有顯著的增加表現肌動蛋白環數量。(C)實驗組與(B)酯多醣誘發組比有顯著的減少表現肌動蛋白環數量。在實驗組與(A)正常組比較無顯著差異。(利用單因素方差分析進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法進行多重組間差異性比較。P<0.05以*表示，酯多醣誘發組與正常組為比較；P<0.05以#表示，實驗組與酯多醣誘發組作比較。比例尺=50微米)。
圖11所示為利用即時定量分析皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對組織蛋白酶K(cathepsin K)、基質金屬蛋白酶9(MMP 9)之mRNA表現在酯多醣誘發類噬骨細胞培養模式之影響。(A)為基質金屬蛋白酶9之mRNA表現；在酯多醣誘發組(單純加入酯多醣培養)與正常組(未加入酯多醣)比較下，隨時間變化顯著基質金屬蛋白酶9之
mRNA表現量上升；而實驗組(酯多醣誘發合併給予Excavatolide B)顯著減少基質金屬蛋白酶9之mRNA表現量；而實驗對照組(單純給予Excavatolide B)與正常組比較無顯著差異。(B)為組織蛋白酶K之mRNA表現，在酯多醣誘發組與正常組比較下，隨時間變化顯著誘發組織蛋白酶K之mRNA表現量上升；實驗組(酯多醣誘發合併給予Excavatolide B)顯著減少組織蛋白酶K之mRNA表現量；實驗對照組(單純給予Excavatolide B)與正常組比較無顯著差異。(利用單因素方差分析進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法進行多重組間差異性比較。P<0.05以*表示，酯多醣誘發組與正常組為比較；P<0.05以#表示，實驗組與酯多醣誘發組作比較。比例尺=50微米)。
圖12所示為皮草珊瑚內酯B對於佐劑誘發關節炎模式之影響。(A)和(D)為控制組(正常之大白鼠)；(B)和(E)為誘發組(僅以佐劑誘發類風濕性關節炎)；(C)和(F)為實驗組(佐劑誘發合併給予5毫克/公斤Excavatolide B)。在誘發組與控制組比較下，可明顯觀察到關節紅腫的病徵外觀產生；而實驗組時，有明顯減少症狀現象。在腳掌足積基測量下，(G)全後腳體積(含踝關節)和(H)腳掌體積測量測量下，實驗組與誘發組比較下，可顯著減少腳掌腫脹的現象。(利用單因素方差分析進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法進行多重組間差異性比較。P<0.05以*表示，誘發組與控制組作為比較；P<0.05以#表示，實驗組與誘發組作比較。)
圖13所示為皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對於佐劑誘
發關節炎模式之影響。(A)為膝關節腫脹測量關係圖；(B)為關節炎指數關係圖；(C)為體重改變關係圖。在誘發組(僅以佐劑誘發類風濕性關節炎)與控制組(正常之大白鼠)比較下，隨時間變化顯著的增加膝關節(A)與關節炎指數的上升(B)，同時導致體重顯著的下降(C)。在實驗組(佐劑誘發合併給予5毫克/公斤Excavatolide B)中，具有顯著抑制膝關節腫脹(A)、大白鼠體重下降(C)和降低關節炎指數(B)之作用。(利用單因素方差分析進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法進行多重組間差異性比較。P<0.05以*表示，誘發組與控制組為比較；P<0.05以#表示，實驗組與誘發組作比較。)
以下實施例是用來呈現而非限制本發明的各個面向與特色。
(一)實驗方法與材料
I. 皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)抗疼痛測試
1. 離體抗發炎活性測試：
(1)小鼠巨噬細胞培養
小鼠巨噬細胞(mouse macrophage cell line,RAW 264.7)購自於American Type Culture Collection(ATCC，No.TIB-71)，培養於DMEM(Dulcbeccos Modified Eagle Medium)培養基中，含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，並於培養基中加入青黴素G(100U/毫升)及鏈黴素(100微克/毫升)抗生素，置於10公分培養皿(culture dish)37℃，5%
二氧化碳培養箱，細胞長到八分滿時，抽乾培養液，以磷酸緩衝液(phosphate buffer saline,PBS)沖洗兩次後，利用胰蛋白酶(trypsin)切斷細胞與培養皿的附著，進行繼代培養(subculture)。繼代培養後36小時後，才能進行皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)之抗發炎測試。RAW264.7細胞於6公分培養皿，控制在3x106個細胞數，給予酯多醣((lipopolysaccharide,LPS)，0.01微克/毫升；sigma L2654)18小時後收集細胞。抗發炎實驗組，則為皮草珊瑚內酯B加入培養皿後十分鐘再加入酯多醣。
(2)西方氏墨點染色法
離體抗發炎活性測試方法：
RAW264.7細胞收集下來後，加入4℃之溶解緩衝液(lysis buffer)200μl(50毫莫耳Tris[pH 7.5]、150毫莫耳氯化鈉(NaCl)、1%TritonX-100、0.1毫莫耳乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1毫莫耳鈣離子螯合劑(EGTA)、10微克苯甲基磺醯氟(PMSF)、1微克/毫升蛋白脢抑制劑(aprotinin)、20毫莫耳氟化鈉(NaF)及0.2毫莫耳釩酸鈉(Na3VO4))。上述細胞經處理後在4℃之下以25,000g離心30分鐘，以去除掉不溶解的部分，取出上清液部分以Bio-Rad DC蛋白測定試劑盒(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA，USA)及免疫酵素測定測讀儀(ELISA reader,Thermo Electron Corporation，USA)分析吸光值，來測定各標本之蛋白質量。將經校正後取等體積加入等量之標本緩衝液(sample buffer；2%十二烷基磺酸鈉(SDS)、10%丙三醇(glycerol)、0.1%溴酚藍(bromophenol bule)、10% 2-氫硫乙醇(2-mercaptoethanol)及50毫莫耳Tris)。利用10%之聚丙烯醯胺
(polyacrylamide)的聚丙醯胺電泳分析(SDS-PAGE)分離蛋白質。再將SDS-PAGE上之蛋白質轉印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(0.45毫米孔徑大小，Immobilon-P,Millipore,Bedford,MA,USA)上(1.5安培，4度C，2.5小時)。轉印後的PVDF以含5%脫脂奶粉之TTBS(Tris-HCl 20毫莫耳、NaCl 137毫莫耳，pH 7.4及0.1% Tween 20)室溫下處理一小時，再與一級抗體誘導型一氧化氮合成酵素(iNOS)，在室溫3小時，隨後以TTBS清洗三次，再與辣根過氧化酵素(HRP)結合之抗兔子IgG抗體(1：2000)在室溫中反應一小時，以TTBS清洗三次，最後利用增強化學發光檢測試劑盒與PVDF膜反應並以X光底片曝光(Kodak X-OMAT LS,Kodak,Rochester,NY,USA)偵測蛋白質的表現量，以電腦軟體(Image-Pro plus 4.5 software，Media Cybernetics,Silver Spring，USA)偵測並計算相對量。以單獨加入酯多醣(LPS)組別為100%，最後以β-肌動蛋白(β-actin)(monoclonal,Sigma,St Louis,MO，USA)作為內部控制。
(3)使用的目標抗體
a. 誘導型一氧化氮合成酵素(iNOS)(BD Pharmingen,San Diego,CA,USA：catalog no.6103322：polyclonal antibody)，稀釋比例1：2000。
b. β-肌動蛋白(sigma,St.Louis,MO,USA；catalog no.A5316-2ML；monoclonal antibody)，稀釋比例1：2000。
2. 誘發疼痛之動物模式與動物準備：
Wista大白鼠馴養於動物房內，該動物房環境之溫度控制在22~24℃，光週期控制在12小時光照12小時黑暗週期。仿照Winter等人(1962)所建立的動物模式，於大白鼠後右腳掌注射0.1毫升1.5%鹿角菜膠(type IV Sigma,St.Louis MO,USA)誘發組織水腫(edema)及疼痛(pain)，並進行動物疼痛行為分析。過去研究說明鹿角菜膠誘發組織水腫(edema)及疼痛(pain)模式亦可用於探討一些相關的疼痛疾病，如關節炎引發的疼痛(arthritic pain)、神經源性疼痛(Neurogenic pain)等。
3. 動物發炎與疼痛行為分析：
(1)後腳負重分布改變評估：負重測試(Weight bearing)
雙足平衡測痛儀(Incapacitance Tester,Singa Technology Co.)來測試大白鼠左右腳施力之重量。將大白鼠置於一有坡度的通道內，左右腳站立於可分別量測左右腳施重的分離量秤上，待大鼠姿勢穩定及靜置穩定後，按下儀器測量鍵，紀錄三秒後之數據結果以正常肢(左腳)減去受傷肢(右腳)的兩腳負重差值計算。
(2)溫度感異常測試(Plantar Stimulator Analgesia)
溫度感覺異常測試是仿照Hargreaves等人於1988年所建立之方式以低能量之放射性熱光源照射動物腳掌量取其退縮時間。痛覺過敏行為是以熱足板法(plantar test)進行分析。熱源刺激儀器(Plantar Stimulator Analgesia Meter)(Life science,SERIES 8 IITC Model 390,USA.)熱源設定強度為25，為了避免大白鼠組織因長時間受到熱源傷害，故設定照射30
秒為截止時間點。將大白鼠置於壓克力玻璃平台上，利用熱源刺激大白鼠後腳掌中間位置，觀察並記錄其腳掌何時舉離檯面。
(3)機械性觸痛反應測試(Mechanical Allodynia)
感覺異常(allodynia)是指對一種平常為正常無害的刺激也會產生疼痛的反應，以腳底觸覺敏感度測量方法(Von Frey hairs單絲方法，Touch-Test Sensory Evaluators,NC12775,North Coast Medical Inc,USA.)的退縮反應來測量。本研究採用Von Frey monofilament hairs對大鼠進行Dixon Up-Down method測試。Von Frey monofilament hairs是利用介於2.0~28.8g大小的力，由最小2.0g之力施於大鼠腳掌下，觀察其是否有反射現象，若無反應則逐漸增加力的大小直至大鼠有反應為止並紀錄之。
(4)腳掌容積測量(Paw Edema Swelling)
在測量腳掌容積前，將大白鼠置於氣體麻醉箱中用異氟醚(isofurane)(AErrane,Baxter Caribe Inc,Guayama)氣體麻醉，用動物理毛器剔除大白鼠後腳踝的體毛後，以奇異筆在老鼠踝部畫線做記號，以確保每次測量的位置，同時利用足趾容積測量儀(Paw Volume Meter,Singa Technology Co.)測量大白鼠後腳踝部體積。
4. 組織切片分析：
(1)樣品收集固定及蘇木精-伊紅染色
於第24小時完成動物行為測試並且犠牲鹿角菜膠誘發之發炎性疼痛的大白鼠，以4℃的4%三聚甲醛(paraformaldehyde)灌流方式，
固定大白鼠身體組織，最後取下大白鼠腳掌放置於10%中性福馬林固定液中，並存放在4℃環境下固定3-4天，其間每兩天更換中性福馬林固定液確保固定效果。而後將已固定後的組織更換放置脫鈣液(100g乙二胺四乙酸二鈉(E.D.T.A.．2Na)/1000毫升Fixatives 10% Millonig’s Neutral Buffered solution)中，置於在50℃烘箱中，並每兩天跟換一次脫鈣液，以達到脫鈣之效果，維持2-3週脫鈣時間。將已固定、脫鈣的組織放置包埋盒中，以組織自動脫水處理機(Tissue-Tek,Sakura Finetek Japan Co.,Ltd,Japan)進行依序為35%酒精、75%酒精、85%酒精、85%酒精、95%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精、100%二甲苯、100%二甲苯、軟蠟、硬蠟共16個小時的程序，行組織脫水與滲蠟的步驟，再應用石蠟組織包埋機(CSA Embedding Center EC780-1；EC780-2)將組織進行包埋成蠟塊後，以石蠟切片機(Microm,HM340E,USA)進行厚度為2微米組織切片後，進以利用紫蘇-伊紅染色方法進行組織切片染色。將完成樣本玻片置於光學顯微鏡(DM 6000,Leica Inc,Germany)，利用顯微鏡數位影像輸出系統(idea SPOT,Diagncstic instruments Inc.U.S.A.)拍攝和紀錄切片結果並針對切片進行分析。將完成樣本玻片置於光學顯微鏡拍攝大白鼠整體腳掌組織在病理上之變化，再運用400X放大效率，以顯微鏡數位影像輸出系統拍攝和記錄大白鼠發炎腳掌組織，根據蘇木精-伊紅染色方法來呈現參與免疫發炎過程的細胞種類，並且換算成每平方公釐下出現的數量，並比較不同組別的差異。
5. 實驗數據分析：
所有實驗數據以平均值±平均值標準誤方式呈現。兩組間數
據比較，依照t-test進行統計分析。多組間數據比較，則利用單因素方差分析(ANOVA)進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法進行多重組間差異性比較。當p值小於0.05時，表示有顯著差異。
II. Excavatolide B抗類風濕性關節炎測試
1. 類噬骨細胞培養模式：
噬骨細胞的分化為利用小鼠巨噬細胞(mouse macrophage cell line,RAW 264.7)購自於American Type Culture Collection(ATCC,No.TIB-71)，培養於DMEM(Dulcbeccos Modified Eagle Medium)培養基中，含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，並於培養基中加入青黴素G(100U/毫升)及鏈黴素(100微克/毫升)抗生素，置於6公分培養皿37℃，5%二氧化碳培養箱。細胞控制在3x106個細胞數下，再單純加入酯多醣(0.01微克/毫升；sigma L2654)與Excavatolide B加入培養皿後十分鐘再加入酯多醣(LPS)於第1、3、6天利用蘇木精-伊紅染色進行觀察其形態變化和進行核酸即時定量分析噬骨細胞活性蛋白之mRNA表現量之變化。
2. 免疫細胞化學染色：
將欲使用之24毫米x24毫米蓋玻片(Assistant,Germany)在滅菌釜(Speedy autoclave,Tomin,Taiwan)以1.2公斤/每平方公分高壓、121℃高溫滅菌30分鐘後，置入52℃烘箱(Vacuum drying oven,Channel,Taiwan)烘乾備用。在6-well培養盤中，置入滅菌後的蓋玻片，將RAW 264.7細胞種入該盤中(5x105 cells/well)，經過24小時培養，待細胞完全與蓋玻
片貼附後，始可進行不同藥物之測試(Levites et al.,2002)。在不同組別的細胞中，分別加入不同藥物，在37℃、5%二氧化碳及95%空氣的培養箱中培養後，依據不同時間點收。先將培養液抽乾後，以適量冰的磷酸緩衝溶液(PBS)搖晃潤洗細胞，移去舊的PBS，如此重複三次。接著以4%的三聚甲醛(paraformaldehyde)於冰上固定5分鐘後，移去4%的三聚甲醛，以TTBS(Tween-20 Tris-buffered saline)溶液沖洗3次，至於抽風櫥中風乾。使用Dako筆(Dako,S2002)繞畫於蓋玻片樣本周圍後，以TTBS覆蓋樣本5分鐘，用免疫組織化學染色盒裝試劑(Vector Laboratories,VECTASTAIN ABC kit)的阻斷緩衝液覆蓋樣本，在室溫中震盪40分鐘。將分別針對目標蛋白質作用的一級抗體覆蓋樣本，並於室溫中震盪2個小時。以新鮮的TTBS溶液沖洗3次(每次10分鐘)。再次使用免疫組織化學染色盒裝試劑的阻斷緩衝液覆蓋樣本，在室溫下震盪40分鐘。以分別針對目標蛋白質作用的二級抗體覆蓋樣本，並於室溫下震盪30分鐘。接著再以TTBS溶液中震盪3次(每次10分鐘)後，使用DAPI(Invitrogen Co.,Faraday Ave.,Carlsbad,CA,USA)覆蓋樣本於室溫中震盪5分鐘，以乾淨TTBS震盪3次(每次10分鐘)，於抽風櫥中將樣本風乾後以水溶性封片膠進行封片(Immu-mount；Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA,USA)。將已完成的樣本玻片置於正立光學顯微鏡(Leica,DM6000B)下，以螢光觀測，並用顯微鏡數位影像輸出系統Xplorer-XS(Diagnostic instruments,Inc.,Sterling Heights,MI,USA)紀錄實驗結果。
3. 核酸即時定量分析：
利用ZR RNA MiniPrep(Zymo Research,Katella Ave.,CA,USA)，依照以下流程進行萃取mRNA。針對培養1、3、6天之巨噬細胞運用PBS收集至1.5毫升微量離心管中，待以3000rpm離心8分鐘後去除上清液。接著加入400微升RNA裂解緩衝液後，以12,000g離心1分鐘。將離心後的上清液移至Zymo-Spin IIIC管柱中，以8,000g離心30秒。隨後加入320微升的乙醇於離心後的液體中。接著將混和液移至Zymo-Spin IIC column，以12,000g離心1分鐘。去除上清液後，於管柱內加入400微升RNA製備緩衝液，並以12,000g離心1分鐘。之後以800微升RNA清洗緩衝液，以12,000g離心30秒後，再重複清洗一次，並以12,000g離心2分鐘，以確定完全移除RNA清洗緩衝液。最後以不含DNase/RNase的水將管柱中的RNA溶出。溶出後的RNA，利用NanoPhotometer UV/Vis分光光度計(Implen GmbH,Schatzbogen,München,Germany)進行定量後，以iScript cDNA合成試劑盒(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)進行反轉錄作用。將5X iScript Reaction Mix,iScript Reverse Transcriptase、未含核酸酶的水與1微克模板混合均勻後，依照以下步驟進行反轉錄作用：25℃進行5分鐘；42℃進行30分鐘；85℃進行5分鐘。之後即得到cDNA模板。利用反轉錄後的cDNA模板，進行即時定量PCR。將引子與iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad,Hercules,CA,USA；100毫莫耳KCl、40毫莫耳Tris-HCl,pH8.4、0.4毫莫耳的dNTP、iTaq DNA聚合酶，50units/毫升、6毫莫耳MgCl2、SYBR Green I、20nM fluoresein以及穩定劑)混合後，分別加入96孔PCR盤中。再依序加入待測之模板。封上膠膜(Microseal“B”film；Bio-Rad,Hercules,CA,USA)後，放入CFX 96即時定量PCR系統(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)
中，進行即時定量聚合酶連鎖反應(Infante et al.,2008)。
4. 佐劑誘發類風溼性關節炎與動物準備：
Lewis大白鼠馴養於動物房內，該動物房環境之溫度控制在23℃，光週期控制在12小時光照12小時黑暗週期。誘發類風溼性關節炎仿Sano等人(1992)所發表之動物模式與Ruth等人所誘發類風濕性關節炎方式，以佐劑誘發類風溼性關節炎(Sano et al.1992；Ruth et al.,2001)；其中佐劑的成份為：每毫升含0.85毫升的石蠟油和0.15毫升的二縮甘露醇單油酸酯。(catalog No.5506-10ML,FLUKA,Sigma,St.Louis,MO,USA),使用時再配置每毫升含10毫克熱殺死的結核菌Mycobacterium butyricum(catalog No.Difco-264010,DIFCO LABORATORIES,Detroit MI,USA)誘發時每隻老鼠注射0.1毫升。大白鼠出生後8週，進行誘發實驗，控制大白鼠體重為180-220公克。將大白鼠置於氣體麻醉箱中用異氟醚(AErrane,Baxter Caribe Inc,Guayama)氣體麻醉，用動物理毛器去剔除大白鼠尾巴基部與後腳踝的體毛後，利用刺青機在尾巴與踝部標記測量記號與組別編號，以確保每次測量之位置，同時利用腳掌體積測量儀(paw volume meter,Singa Technology Co.)測量基準值，並採背部皮下注射100微升Freund’s incomplete adjuvant(Sigma Chemical Co.,St.Louis，MO)內含10毫克之熱殺死結核菌Mycobacterium Butyricum(Difco Lab.,Detroit MI，USA)於大白鼠尾巴基部誘發類風濕性關節炎。
5. 腳踝容積及外觀行為分析：
在於第0天和第8天之後每隔一天利用腳掌體積測量儀，並
同時於背部皮下注射方式(Subcutaneous injection)給予Excavatolide B劑量為5毫克/公斤下，利用腳掌體積測定儀(Paw Volulme Meter,Singa,Taiwan)測量踝部體積之變化並紀錄數據，和藉由拍照方式記錄外觀。同時利用關節炎指數(arthritis index)評估大白鼠四肢關節外觀變化。其中分數評估計算方式仿Yocum等人(1986)與Baharav等人(2004)評分標準，在評估類風濕性關節炎發病程度：0分為正常沒有任何病徵出現；1分為一隻腳趾關節出現紅色腫脹病徵外觀；2分為兩隻腳趾關節以上出現紅色腫脹病徵外觀；3分為腳踝或腳掌出現紅色腫脹病徵外觀；4分為關節變形或不能彎曲，並無法正常行動，最後把四肢分數相加，每一隻大白鼠滿分為16分，且以拍照方式記錄外觀變化差異性。
6. 組織樣品收集固定及蘇木精-伊紅染色方法：
在第二十八天做最後一次測量後犠牲大白鼠，以4℃的4%三聚甲醛(paraformaldehyde)灌流方式，固定大白鼠身體組織，最後在以手術器械取下大白鼠踝關節放置於10%中性福馬林固定液中，並存放在4℃環境下固定4-5天，其間每兩天更換中性福馬林固定液確保固定效果。而後將已固定後的組織更換放置脫鈣液(100g乙二胺四醋酸二鈉，E.D.T.A.．2Na/1000毫升Fixatives 10% Millonig’s Neutral Buffered solution)中，並置於維持在50℃烘箱中，以達到脫鈣之效果，並每兩天跟換一次脫鈣液，維持2週脫鈣時間。將已固定、脫鈣的組織放置包埋盒中，以組織自動處理機(Tissue-Tek,Sakura Finetek Japan Co.,Ltd,Japan)進行依序為35%酒精、75%酒精、85%酒精、85%酒精、95%酒精、95%酒精、100%酒精、100%
酒精、100%二甲苯、100%二甲苯、軟蠟、硬蠟共15個小時的程序，行組織脫水與滲蠟的步驟，再應用石蠟組織包埋機(CSA Embedding Center EC780-1；EC780-2)將組織進行包埋成蠟塊後，以石蠟切片機(Microm,HM340E)進行厚度為2微米組織切片後，進以利用蘇木精-伊紅染色方法進行組織切片染色。將完成樣本玻片置於光學顯微鏡(DM 2500,Leica Inc,Germany)和實體顯微鏡(APO Z16,Leica Inc.Singapore)下，用顯微鏡數位影像輸出系統(idea SPOT,Diagnostic instruments Inc.U.S.A.)拍攝和紀錄切片結果並針對切片進行分析。
7. 實驗數據分析：
所有實驗數據以平均值±平均值標準誤方式呈現。兩組間數據比較，依照t-test進行統計分析。多組間數據比較，則利用單因素方差分析(單因素方差分析)進行數據統計分析，並根據鄧肯氏法進行多重組間差異性比較。當p值小於0.05時，表示有顯著差異。
(二)實驗結果
I. Excavatolide B抗疼痛測試
1. 離體抗發炎活性測試：
皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)在濃度為0.01~100微莫耳對於酯多醣刺激巨噬細胞對於誘導型一氧化氮合成酵素蛋白質表現之影響(如圖2所示)。以單純加入酯多醣組其蛋白質表現作為100%，β-肌動蛋白(β-actin)為內控制組。皮草珊瑚內酯B在濃度為5~100微莫耳時對
於誘導型一氧化氮合成酵素蛋白質表現具有顯著的抑制效果。因此，此實驗可以得知，皮草珊瑚內酯B在離體的發炎模式中，具有顯著的抗發炎效果。
2. 疼痛之動物模式：
(1)雙足負重測試結果
皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對於鹿角菜膠誘發大白鼠腳掌腫脹發炎與疼痛動物模式進行活體抗發炎方面。本發明將大白鼠分為四組：(i)控制組(n=3)：正常之大白鼠；(ii)誘發組(n=4)：僅以鹿角菜膠誘發發炎性疼痛之大白鼠；(iii)實驗第1組(n=4)：大白鼠以鹿角菜膠誘發發炎性疼痛後，施打15mg/kg之皮草珊瑚內酯B；及(iv)實驗第2組(n=5)：大白鼠以鹿角菜膠誘發發炎性疼痛後，施打60mg/kg之皮草珊瑚內酯B。上述組別之大白鼠利用雙足平衡測痛儀，針對大白鼠後肢測試其左右腳負重之平衡，其統計分析結果顯示(如圖3A所示)；在控制組之大白鼠於站立時，左右後肢負重測得的差距為0.7±0.2克。在誘發組中，於第2~24小時雙腳負重差距與控制組有顯著差異性。在實驗第1組於第2至4小時和6至24小時與誘發組有顯著差異性。於實驗第2組於第2至24小時與誘發組有顯著差異性。因此在注射鹿角菜膠後，經由皮下給予皮草珊瑚內酯B可顯著減少受傷肢負重的行為，同時再給予不同劑量下可觀察到濃度依賴的結果。
(2)溫度感異常測試
利用熱源刺激大白鼠後腳掌中間位置，針對大白鼠對於熱覺過敏反應時間，以分析皮草珊瑚內酯B對於鹿角菜膠所造成疼痛行為的影響。由統計分析結果顯示(如圖3B所示)，在控制組所測得的時間為29.2±0.2秒；在誘發組中在第3至24小時與控制組有顯著差異；在實驗第1組於第4至24小時與誘發組有顯著差異性；而在實驗第1組於第至3至24小時與誘發組有顯著差異性。因此在注射鹿角菜膠後，經由皮下給予Excavatolide B可以有效抑制鹿角菜膠所誘發大白鼠痛覺過敏反應。同時再給予不同劑量下可觀察到濃度依賴的結果。
(3)機械性觸痛反應測試
以Von Frey hairs單絲方法來偵測大白鼠的退縮反應。由統計分析結果顯示(如圖3C所示)，正常大白鼠對於von Frey單絲的縮腿閾值為6.5±1.0克。在誘發組中在第2至24小時與控制組有顯著差異；在實驗第1組於第3-6小時和第12、24小時與誘發組有顯著差異性；在實驗第2組於第2小時和第4-24小時與誘發組有顯著差異性。因此在注射鹿角菜膠後，經由皮下給予皮草珊瑚內酯B可以有效抑制鹿角菜膠所誘發大白鼠觸覺過敏反應。
(4)腳掌容積測量測試
利用腳掌容積測量測試分析分析Excavatolide B對於鹿角菜膠所造成後腳掌腫脹情形。由統計分析結果顯示(如圖3D所示)，在誘發組中，腳掌體積有外觀上在第1-24小時都有顯著的差異，同時可觀察到腳掌有嚴重的發紅和腫脹情形。在注射鹿角菜膠後，再經由皮下給予15毫克
/公斤和60毫克/公斤皮草珊瑚內酯B於第1-24小時與誘發組均有顯著差異性。
此外，本發明對於各個組別之大白鼠之腳掌進行影像拍攝，藉由影像外觀分析，如圖4所示，其中(A)及(B)為控制組的大白鼠之腳掌組織；(C)及(D)為誘發組之大白鼠，於第24小時的腳掌，腳掌外觀有明顯的腫脹及有嚴重的發紅情形；(E)及(F)為實驗第1組之大白鼠，於第24小時的腳掌，腳掌腫脹程度較為輕微。(G)及(H)為實驗第2組之大白鼠，於第24小時的腳掌，腳掌腫脹情形較不明顯，腳掌發紅情形亦有改善。上述結果顯示給予皮草珊瑚內酯B具有明顯抑制鹿角菜膠所引發腳掌腫脹的作用。
(5)組織病理切片分析
利用石蠟包埋切片與蘇木精-伊紅病理組織染色方式分析皮草珊瑚內酯B對腳掌組織發炎進行分析。由染色分析結果顯示，如圖5所示，對於鹿角菜膠所引起組織發炎變化中可明顯看到，正常組和誘發組相比較之下，腳掌組織具有明顯差異性(如圖5A及5B所示)，可觀察到誘發組中腳掌組織具有大量的發炎性白血球大量聚集及內生性水腫的情形出現；此外，於誘發疼痛後給予皮草珊瑚內酯B之組別中，在實驗第1組(15毫克公斤Excavatolide B)及實驗第2組(60毫克/公斤Excavatolide B)，相較誘發組可降低改善發炎的情形(如圖5C及5D所示)。本發明亦經由局部性放大，可觀察到誘發組與正常組比較，明顯出現有大量細胞聚集的特徵，而實驗第1組及實驗第2組均有效減緩大量細胞聚集的特徵。
此外，本發明亦針對不同種免疫發炎性細胞進行定量分析，如圖6所示，在400倍放大倍率下。在控制組的腳掌組織中，每平方公釐下是無嗜中性白血球、單核球細胞的出現與少量的巨噬細胞數量的表現狀況。在誘發組中，其嗜中性白血球、單核球細胞和巨噬細胞數量的表現狀況與與控制組比較具及數量有顯著的上升，同時伴隨增生的纖維母細胞數量上升。注射鹿角菜膠後，再經由皮下給予15毫克/公斤和60毫克/公斤皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)下之實驗第1組及實驗第2組對於嗜中性白血球、單核球細胞、巨噬細胞和纖維母細胞與誘發組比較下均有顯著的減少差異性，同時可觀察到有濃度依賴的作用(如圖6E至6H所示)。
本發明更進一步檢測皮草珊瑚內酯B對抑制腳掌組織中發炎性蛋白之誘導型一氧化氮合成酵素表現之影響。利用西方點墨法，來偵測大白鼠腳掌組織發炎內對誘導型一氧化氮合成酵素表現的情形，經西方點墨法結果顯示(如圖7所示)，在控制組中大白鼠的腳掌組織中對誘導型一氧化氮合成酵素表現為0%，誘發組(以腳掌組織注射鹿角菜膠之大白鼠)對誘導型一氧化氮合成酵素蛋白質表現量為100±4.8%；注射鹿角菜膠後合併皮下給予15毫克/公斤皮草珊瑚內酯B及60毫克/公斤皮草珊瑚內酯B之實驗第1組及實驗第2組，對誘導型一氧化氮合成酵素蛋白質表現量分別為63.9±7.9%、30.8±18.1%(如圖7B所示)。藉由統計分析結果表示，實驗第1組及實驗第2組與誘發組對誘導型一氧化氮合成酵素蛋白質生成具有顯著性的差異，因此本發明證實皮草珊瑚內酯B能有效抑制鹿角菜膠所引起組織發炎對誘導型一氧化氮合成酵素的生成表現。
II. Excavatolide B抗類風濕性關節炎測試
1. 類噬骨細胞培養模式
利用酯多醣誘發小鼠巨噬細胞產生類噬骨細胞模式分析Excavatolide B噬骨細胞活性的表現(如圖8所示)。於酯多醣誘發組(單純加入酯多醣培養，如圖8D至8F所示)中培養後第1、3、6天利用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin)染色後顯示(如圖8D至8F所示)，在第3、6天與正常組(未加入酯多醣，如圖8A至8C所示)之細胞型態上有顯著的多核且個體較大的細胞，並隨時間有明顯的型態變化。而在實驗組(加入皮草珊瑚內酯B後並續以酯多醣處理共同培養)中之細胞培養後的第1、3、6天利用蘇木精-伊紅染色後顯示(如圖8G至8I所示)，在第3、6天與酯多醣誘發組細胞型態比較上有顯著減少多核型態細胞的表現。
利用細胞螢光免疫染色分析皮草珊瑚內酯B對於噬骨細胞活性蛋白質之抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的表現(如圖9所示)。在酯多醣誘發組(單純加入酯多醣培養)與正常組(未加入酯多醣)比較上有明顯的免疫螢光表現，同時利用定量分析上在酯多醣誘發組有顯著的TRAP的蛋白質表現量上升(如圖9A及9B所示)。此外，實驗組(加入皮草珊瑚內酯B後並續以酯多醣處理共同培養)之細胞與酯多醣誘發組比較上免疫螢光活性表現下降，同時利用定量分析上在加入皮草珊瑚內酯B處理後有顯著減少抗酒石酸酸性磷酸酶之表現量(如圖9B及9C所示)。在實驗對照組(單純加入皮草珊瑚內酯B，且不加入酯多醣處理)與正常組的細胞在螢光免疫活性與定量分析抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的蛋白質表現量無
顯著差異(如圖9A及9D所示)。
本發明利用細胞螢光免疫染色分析皮草珊瑚內酯B對於酯多醣誘發類噬骨細胞模式形成的機動蛋白環(Actin ring)的型態之影響(如圖10所示)。其結果顯示，酯多醣誘發組(單純加入酯多醣培養)與正常組(未加入酯多醣培養)比較上可觀察到明顯的環狀形態形成(如圖10A及10B所示)。同時利用定量分析機動蛋白環數量上，在酯多醣誘發組的數量有顯著上升。而在實驗組(加入皮草珊瑚內酯B後並續以酯多醣處理共同培養)與酯多醣誘發組之細胞比較上，用定量分析機動蛋白環數量後與酯多醣誘發組有顯著減少的作用(如圖10B、10C及10E所示)。此外，實驗對照組(單純加入皮草珊瑚內酯B，且不加入酯多醣處理)與正常組的細胞上則無顯著差異性(如圖10A及10D所示)。
2. 核酸即時定量分析
利用酯多醣誘發小鼠巨噬細胞產生類噬骨細胞模式分析皮草珊瑚內酯B對於噬骨細胞活性蛋白mRNA(如基質金屬蛋白酶9及組織蛋白酶K)的表現。利用即時定量聚合酶連鎖反應系統分析基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP 9)之mRNA表現量結果顯示(如圖11A所示)，酯多醣誘發組(單純加入酯多醣培養)與正常組(未加入酯多醣培養)比較上基質金屬蛋白酶9(MMP 9)的mRNA有隨時間變化上顯著的上升趨勢。另外，實驗組(加入皮草珊瑚內酯B後並續以酯多醣處理共同培養)與酯多醣誘發組之細胞比較上，在第6天有下降趨勢；而在實驗對照組(單純加入皮草珊瑚內酯B，且不加入酯多醣處理)與正常組
之細胞在基質金屬蛋白酶9之mRNA表現量沒有差異性。
本發明進一步利用即時定量聚合酶連鎖反應系統分析組織蛋白酶K(cathepsin K)之mRNA表現量結果顯示(如圖11B所示)，酯多醣誘發組(單純加入酯多醣培養)與正常組(未加入酯多醣培養)比較上組織蛋白酶K的mRNA有隨時間變化上顯著的上升趨勢。實驗組(加入皮草珊瑚內酯B後並續以酯多醣處理共同培養)與酯多醣誘發組之細胞比較上，在第3、6天有顯著下降趨勢。在實驗對照組(單純加入皮草珊瑚內酯B，且不加入酯多醣處理)與正常組的細胞在組織蛋白酶K之mRNA表現量沒有差異性。
3. 佐劑誘發類風溼性關節炎
利用佐劑誘發類風濕性關節炎模式動物分析皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)對活體體抗類風濕性關節炎之影響。此次實驗，本發明將大白鼠分為三組：(i)控制組(n=6)：正常之大白鼠；(ii)誘發組(n=7)：僅以佐劑誘發類風濕性關節炎之大白鼠；及(iii)實驗組(n=6)：大白鼠以佐劑誘發類風濕性關節炎後，施打5mg/kg之皮草珊瑚內酯B。藉由影像觀察(如圖12A至12F所示)，誘發組與控制組的踝關節部分有明顯的紅腫現象，同時在部分腳趾有明顯的關節紅腫現象；而在實驗組與誘發組比較上有Excavatolide B明顯的減少踝關節與趾關節的紅色腫脹現象。本發明利用腳掌容積測量儀測量後腳掌腫脹之結果顯示(如圖12G及12H所示)，誘發組於第16至26天在腳掌腫脹現象與控制組有顯著差異性；而實驗組於第16-26與誘發組相比之下有顯著降低腫脹之現象。
利用游標尺測量膝關節腫脹之現象之結果顯示(如圖13A所示)，在誘發組於第24、26天在膝關節腫脹現象與控制組有顯著差異性。而在實驗組後，於第24、26天與誘發組相比之下有顯著降低腫脹之現象。
利用關節炎指數(如圖13B)分析皮草珊瑚內酯B對與佐劑誘發類風濕性關節炎之影響。其結果顯示在誘發類組於第14至26天之關節炎指數有顯著上升的現象。而在實驗組，於第16-26天與誘發組相比之下有減緩關節炎指數上升的作用。
本發明同時進行大白鼠之體重分析，其結果顯示(如圖13C)，在誘發組於第14-26天之體重增加有顯著減少的現象；而在實驗組之體量增加與誘發組於第14-26天重量增加相比之下有顯著差異性，與控制組無顯著差異。因此皮草珊瑚內酯B對與佐劑誘發類風濕性關節炎有明顯減緩病徵發生的作用。
4. 組織切片比較分析
以下表格為本發明與先前文獻(Topical application of marine briarane-type diterpenes effectively inhibits 12-O- tetradeca noylph orbol -13-acetate-induced inflammation and dermatitis in murine skin；W.C.Wei et al.,Journal of Biomedical Science 2011,18：94)之差異比較：
Claims (10)
- 一種皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)用於製備抗疼痛之醫藥組合物的用途，其中該皮草珊瑚內酯B係具有式I之結構：
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該皮草珊瑚內酯B中的該R1為C3H7，該R2為CH3。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抗疼痛係抗類風濕性關節炎性疼痛。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組合物進一步抑制該疼痛誘發之發炎物質，其中該發炎物質包含誘導型一氧化氮合成酵素。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該皮草珊瑚內酯B之有效投藥劑量介於1毫克/公斤至100毫克/公斤。
- 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該抗疼痛係減少疼痛引發之腫脹、降低疼痛處之觸覺過敏或降低痛覺過敏。
- 一種皮草珊瑚內酯B(Excavatolide B)用於製備抗發炎之醫藥組合物的 用途，其中該皮草珊瑚內酯B係具有式I之結構：
- 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該皮草珊瑚內酯B中的該R1為C3H7，該R2為CH3。
- 如申請專利範圍第7項所述之用途，其中該抗發炎係抗類風濕性關節炎。
- 如申請專利範圍第9項所述之用途，其中該醫藥組合物進一步抑制該類風濕性關節炎引發之腫脹或骨骼侵蝕之症狀。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW103115718A TWI604841B (zh) | 2014-05-01 | 2014-05-01 | 珊瑚萃取物用於製備抗發炎及抗疼痛之醫藥組合物之用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| TW103115718A TWI604841B (zh) | 2014-05-01 | 2014-05-01 | 珊瑚萃取物用於製備抗發炎及抗疼痛之醫藥組合物之用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201542204A true TW201542204A (zh) | 2015-11-16 |
| TWI604841B TWI604841B (zh) | 2017-11-11 |
Family
ID=55220730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW103115718A TWI604841B (zh) | 2014-05-01 | 2014-05-01 | 珊瑚萃取物用於製備抗發炎及抗疼痛之醫藥組合物之用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| TW (1) | TWI604841B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106822093A (zh) * | 2015-12-04 | 2017-06-13 | 中山大学 | 组合物用于制备血管新生异常的药物的用途 |
| TWI627952B (zh) * | 2015-12-04 | 2018-07-01 | 國立中山大學 | 組合物用於製備調控血管新生之藥物的用途 |
| TWI627953B (zh) * | 2015-12-04 | 2018-07-01 | 國立中山大學 | 組合物用於製備調控血管新生之藥物的用途 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109157611A (zh) * | 2018-09-06 | 2019-01-08 | 赵国庆 | 一种治疗骨科疼痛的大蒜素复合液、制备方法及其应用 |
| TWI736814B (zh) * | 2018-12-14 | 2021-08-21 | 國立中山大學 | 珊瑚複合萃取物、含此之組成物及其製造方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI448283B (zh) * | 2012-06-21 | 2014-08-11 | Univ Nat Sun Yat Sen | 珊瑚ＢｒＤ１雙萜化合物及其取代物於醫藥上之應用 |
-
2014
- 2014-05-01 TW TW103115718A patent/TWI604841B/zh not_active IP Right Cessation
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106822093A (zh) * | 2015-12-04 | 2017-06-13 | 中山大学 | 组合物用于制备血管新生异常的药物的用途 |
| TWI627952B (zh) * | 2015-12-04 | 2018-07-01 | 國立中山大學 | 組合物用於製備調控血管新生之藥物的用途 |
| TWI627953B (zh) * | 2015-12-04 | 2018-07-01 | 國立中山大學 | 組合物用於製備調控血管新生之藥物的用途 |
| CN106822093B (zh) * | 2015-12-04 | 2020-02-21 | 中山大学 | 组合物用于制备血管新生异常的药物的用途 |
| CN111184712A (zh) * | 2015-12-04 | 2020-05-22 | 中山大学 | 组合物用于制备治疗异位性湿疹所引起的病症的药物的用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| TWI604841B (zh) | 2017-11-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zhu et al. | Protective effects of berberine hydrochloride on DSS-induced ulcerative colitis in rats | |
| Xu et al. | Effect of compound sophorae decoction on dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice by regulating Th17/Treg cell balance | |
| Deng et al. | Inhibition of NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis in macrophage by cycloastragenol contributes to amelioration of imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice | |
| Hay et al. | A novel angiotensin-(1-7) glycosylated mas receptor agonist for treating vascular cognitive impairment and inflammation-related memory dysfunction | |
| Zeng et al. | Viola yedoensis Makino formula alleviates DNCB-induced atopic dermatitis by activating JAK2/STAT3 signaling pathway and promoting M2 macrophages polarization | |
| Cintra et al. | Interleukin-10 is a protective factor against diet-induced insulin resistance in liver | |
| Das et al. | Andrographolide-A promising therapeutic agent, negatively regulates glial cell derived neurodegeneration of prefrontal cortex, hippocampus and working memory impairment | |
| TWI604841B (zh) | 珊瑚萃取物用於製備抗發炎及抗疼痛之醫藥組合物之用途 | |
| Weng et al. | Effect of interferon-gamma on hepatic fibrosis in chronic hepatitis B virus infection: a randomized controlled study | |
| Niu et al. | Protective effect of cavidine on acetic acid-induced murine colitis via regulating antioxidant, cytokine profile and NF-κB signal transduction pathways | |
| Dai et al. | Astragalus polysaccharide inhibits isoprenaline-induced cardiac hypertrophy via suppressing Ca2+-mediated calcineurin/NFATc3 and CaMKII signaling cascades | |
| Kim et al. | Gamma linolenic acid exerts anti-inflammatory and anti-fibrotic effects in diabetic nephropathy | |
| Wang et al. | GDF11 antagonizes psoriasis-like skin inflammation via suppression of NF-κB signaling pathway | |
| Yao et al. | Protective effects of fraxin on cerebral ischemia-reperfusion injury by mediating neuroinflammation and oxidative stress through PPAR-γ/NF-κB pathway | |
| Vargas-Pozada et al. | Caffeine mitigates experimental nonalcoholic steatohepatitis and the progression of thioacetamide-induced liver fibrosis by blocking the MAPK and TGF-β/Smad3 signaling pathways | |
| Yang et al. | Astragalus extract attenuates allergic airway inflammation and inhibits nuclear factor κB expression in asthmatic mice | |
| Gong et al. | Paeoniflorin diminishes ConA-induced IL-8 production in primary human hepatic sinusoidal endothelial cells in the involvement of ERK1/2 and Akt phosphorylation | |
| TWI320714B (en) | Plant extracts for the treatment of rheumatoid arthritis | |
| Li et al. | Etanercept alleviates psoriasis by reducing the Th17/Treg ratio and promoting M2 polarization of macrophages | |
| Li et al. | Triptolide induces suppressor of cytokine signaling-3 expression and promotes lamina propria mononuclear cells apoptosis in Crohn's colitis | |
| Zhang et al. | Curcumin reduces inflammation in mice with the psoriasis model by inhibiting NLRP3 inflammatory bodies | |
| Tao et al. | Fibrinogen-like protein 2 promotes proinflammatory macrophage polarization and mitochondrial dysfunction in liver fibrosis | |
| Chen et al. | Effects of Tripterygium wilfordii glycosides on regulatory T cells and Th17 in an IgA nephropathy rat model | |
| Xu et al. | Jiangu formula: A novel osteoclast-osteoblast coupling agent for effective osteoporosis treatment | |
| CN111356468B (zh) | 包含黄漆木提取物作为有效成分的用于预防或治疗纤维化疾病的组合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees |