CN111356468B - 包含黄漆木提取物作为有效成分的用于预防或治疗纤维化疾病的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含黄漆木提取物作为有效成分的具有抗纤维化活性的组合物，具体地，本发明的黄漆木提取物具有能够有效抑制在纤维化中起重要作用的转化生长因子‑β1（TGF‑β1）的信号传导途径的活性，从而能够抑制由转化生长因子‑β1诱导的α平滑肌肌动蛋白（α‑SMA）、结缔组织生长因子（CTGF）、纤连蛋白外部结构域A（FN‑EDA）、胶原蛋白等细胞外基质的表达及活性，并且具有高抗氧化活性，因此包含黄漆木提取物作为有效成分的本发明的组合物具有可有效地用于制备纤维化疾病的治疗剂及保健功能食品的效果。

Description

包含黄漆木提取物作为有效成分的用于预防或治疗纤维化疾 病的组合物

技术领域

本发明涉及一种包含黃漆木提取物作为有效成分的用于预防或治疗纤维化疾病的组合物。

背景技术

大多数器官在组织损伤后都会经历炎症和治愈过程，若有持续性损伤，则在治愈过程中会发生组织纤维化。在纤维化过程中，胶原或纤粘蛋白（fibronectin）等细胞外基质（ECM）在组织中积累并破坏正常组织，从而导致功能障碍。在纤维化中，由于细胞外基质源自纤维母细胞，在纤维化及抗纤维化的研究中，对于活化的成纤维细胞及位于成纤维细胞的中心的肌成纤维细胞（myofibroblast）进行了积极的研究。

并且，纤维化可发生在各种器官、组织及细胞中，已知纤维化疾病发生在皮肤（过度增殖性瘢痕、瘢痕瘤、硬皮症）、肝（纤维化及硬化）、肺（纤维化）、心脏（纤维化）、肠（粘连及狭窄）、关节（关节膜纤维化）及骨髓（纤维化症及增殖异常综合征）等。

尤其，肝纤维化为肝硬化的前驱病变，并且由于导致慢性肝病的严重肝损伤而被多种细胞因子和生长因子的作用所触发。通常，肝纤维化是可逆的，并由细纤维（thinfibril）组成，无结节形成，在肝损伤的原因为暂时性的情况下，在细胞凋亡（apoptosis）过程和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）的作用下增加的细胞外基质（xtracellular matrix，ECM）被降解并可正常恢复，然而，若肝纤维化过程反复持续，则会形成粗纤维（thick fibril），并演变为具有结节的肝硬变。并且，肝细胞由于各种引起炎症的因素而受损，并通过包括胶原蛋白的异常细胞外基质蛋白积累的肝纤维化过程来诱发肝硬变，因此，为了调节肝硬变的表达，调节细胞外基质的积累尤为重要。在肝细胞受损时引起的炎症反应中，通过活化处于休眠期的肝星状细胞来分泌细胞外基质和多种细胞因子（cytokine）及趋化因子（chemokine），其中转化生长因子-β1起到强力的生长抑制剂的作用。转化生长因子-β1为25kD的物质，与潜在转化生长因子-β1结合蛋白（latent TGF-β1-binding protein）结合，以无活性的潜在（inactive latent）形态分泌，并以与1，4型胶原质、层粘连蛋白（laminin）及核心蛋白聚糖（decorin）等细胞外基质结合的状态存在，并被各种刺激活化。转化生长因子-β1通过减少胶原酶（collagenase）的产生或增加胶原酶（胶原蛋白的抑制物的产生来调节胶原蛋白（collagen）的表达，增加巨噬细胞中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素1（IL-1）及血小板源生长因子（PDGF），并在纤维化过程中起到重要作用。目前，转化生长因子-β1仅在进行纤维化的地方表达，而在正常肝组织或不活动的地方不表达，因此已知转化生长因子-β1在肝纤维化中起重要的作用。

并且，肺纤维化（pulmonary fibrosis）为结合组织，尤其是胶原过度粘附到肺泡壁上而引起呼吸困难的疾病。肺纤维化是一种危险的病症，其中，肺组织变得坚硬，本应柔软且具弹性的组织在变硬的部位无法自由进行用于呼吸的收缩和膨胀，因此呼吸量减少，随着病症的进行，剩余的肺容量减少，肺功能下降，在最坏的情况下，可能由于呼吸困难或呼吸衰竭而导致死亡。肺纤维化预测标记物有转化生长因子-β1、α平滑肌肌动蛋白、内皮素1（endothelin-1）等，据报告，当发生肺纤维化时，这些表达增加。

作为用于治疗这种肝纤维化、肺纤维化等纤维化疾病的方法，目前所使用的大多数治疗剂是化学治疗剂，具有引起人体的各种副作用的问题，因此实际上需要开发一种具有更基本的治疗效果且来源于体内稳定天然物的新型的抗纤维化疾病的治疗剂。

另外，属于五加科的黄漆木（Dendropanax morbifera Lev.）为生长于韩国南部沿海和济州岛的常绿阔叶乔木，它是一种即使在冬天也不会落叶的树种，树皮上划开口子会流出黄色的汁液，将其称为黄漆。

自韩国的三国时代以来，黄漆一直用作稀有涂料，其散发出皇帝的铠甲、头盔、其他金属饰品的金黄色，在高丽时代撰写的《高丽史节要》、中国的《鸡林类事》、《鸡林志》、《海东历史》中记载了黄漆的采取时间、使用用途等，中国唐朝历史书《册府元龟》、《通典》中记载为其之前的百济特产品。并且，还据报道，相传黄漆木具有去除烦热、治疗眼疾、治疗黄疸、治疗烧伤及麻风的效果，且对人体无害。

为此，本发明人确认了黄漆木提取物具有调节在纤维化中起重要作用的转化生长因子-β1及纤维化相关因子的表达和活性的作用，由此通过确认黄漆木提取物可用于预防及治疗纤维化疾病来完成本发明。

发明内容

技术问题

因此，本发明的目的为提供一种包含黃漆木提取物作为有效成分的用于预防或治疗纤维化疾病的药学组合物。

并且，本发明的另一目的为提供一种包含黃漆木提取物作为有效成分的用于预防或改善纤维化疾病的保健功能食品。

解决问题的方案

为解决上述问题，本发明提供一种包含黃漆木提取物作为有效成分的用于预防或治疗纤维化疾病的药学组合物。

在本发明的一实施例中，上述黄漆木提取物可以为黄漆木的粗提取物、极性溶剂可溶性提取物或非极性溶剂可溶性提取物。

在本发明的一实施例中，上述粗提取物可以为使用选自包括纯化水在内的水、甲醇、乙醇、丁醇或它们的混合溶剂中的溶剂来获得的提取物。

在本发明的一实施例中，上述极性溶剂可溶性提取物可以为使用选自水、乙醇、丁醇或它们的混合溶剂中的溶剂来获得的提取物

在本发明的一实施例中，上述非极性溶剂可溶性提取物可以为使用己烷、三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸乙酯来获得的提取物。

在本发明的一实施例中，上述黄漆木提取物能够抑制转化生长因子-β1的信号传导途径。

在本发明的一实施例中，上述纤维化疾病可选自由增殖性瘢痕、瘢痕瘤、硬皮症、腹膜粘连、肝纤维化、肺纤维化、心脏纤维化、骨骼肌纤维化、关节膜纤维化、骨髓纤维化症和骨髓增殖异常综合征及糖尿病性网膜症组成的组中。

并且，本发明还提供一种包含黃漆木提取物作为有效成分的用于预防或改善纤维化疾病的保健功能食品。

在本发明的一实施例中，上述黄漆木提取物可以为使用选自由水、甲醇、乙醇、丁醇、己烷、三氯甲烷、二氯甲烷及乙酸乙酯组成的组中的溶剂来获得的提取物。

在本发明的一实施例中，上述纤维化疾病可选自由增殖性瘢痕、瘢痕瘤、硬皮症、腹膜粘连、肝纤维化、肺纤维化、心脏纤维化、骨骼肌纤维化、关节膜纤维化、骨髓纤维化症和骨髓增殖异常综合征及糖尿病性网膜症组成的组中。

发明的效果

本发明的黄漆木提取物具有能够有效抑制在纤维化中起重要作用的转化生长因子-β1的信号传导途径的活性，从而能够抑制由转化生长因子-β1诱导的α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、结缔组织生长因子（CTGF）、纤连蛋白外部结构域A（FN-EDA）、胶原蛋白等细胞外基质的表达及活性，并且具有高抗氧化活性，因此包含黄漆木提取物作为有效成分的本发明的组合物具有可有效地用于制备纤维化疾病的治疗剂及保健功能食品的效果。

附图说明

图1示出本发明的黄漆木提取物的制备工序。

图2示出以HS27及HHStec细胞株为对象，通过逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分析来分析根据不同溶剂的本发明的黄漆木溶剂提取物处理的转化生长因子-β1诱导的α平滑肌肌动蛋白的表达程度的结果。

图3示出以HS27及HHStec细胞株为对象，通过逆转录-聚合酶链反应及免疫印迹法分析根据本发明的黄漆木己烷提取物处理的转化生长因子-β1诱导的α平滑肌肌动蛋白的表达程度的结果。

图4示出分析HS27细胞株中根据本发明的黄漆木己烷提取物处理的转化生长因子-β1的信使核糖核酸（mRNA）的表达量和转化生长因子-β1的生成量的结果。

图5示出通过逆转录-聚合酶链反应及免疫印迹法分析HS27及HHStec细胞株中根据本发明的黄漆木己烷提取物处理的转化生长因子-β1诱导的结缔组织生长因子（CTGF，connective tissue growth factor）的表达变化的结果。

图6示出通过逆转录-聚合酶链反应及免疫印迹法分析HS27及HHStec细胞株中根据本发明的黄漆木己烷提取物处理的由转化生长因子-β1诱导的纤连蛋白外部结构域A（FN-EDA）的表达变化的结果

图7示出分析HS27及HHStec细胞株中根据不同浓度的本发明的黄漆木己烷分馏提取物处理的I型胶原蛋白及III型胶原蛋白（ECM）的表达变化的结果。

图8为示出分析HS27及HHStec细胞株中根据不同浓度的本发明的黄漆木己烷分馏提取物的溶解性胶原蛋白的分泌量的结果。

图9示出对划痕的HS27细胞株处理不同浓度的本发明的黄漆木己烷分馏提取物并培养24小时后，在显微镜下观察细胞迁移程度（恢复力）的照片和分析恢复程度的结果。

图10示出分析根据不同溶剂的本发明的黄漆木提取物的抗氧化活性的结果。

图11示出针对HS27细胞株处理不同溶剂的本发明的黄漆木提取物后，分析2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）的清除能力的结果。

图12示出针对HS27细胞株处理不同浓度的本发明的黄漆木己烷分馏提取物后，分析作为纤维化相关因子的基质金属蛋白酶1（MMP1）、肿瘤坏死因子α（TNF-a）以及金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）的信使核糖核酸的表达程度的结果。

图13示出针对HS27细胞株处理不同浓度的本发明的黄漆木己烷分馏提取物后，分析作为纤维化相关因子的基质金属蛋白酶2（MMP2）及基质金属蛋白酶9（MMP9）的信使核糖核酸的表达程度的结果。

图14示出针对HHStec细胞株处理不同浓度的本发明的黄漆木己烷分馏提取物后，分析作为纤维化相关因子的基质金属蛋白酶1及基质金属蛋白酶2的信使核糖核酸的表达程度的结果。

图15示出针对HHStec细胞株处理不同浓度的本发明的黄漆木乙醇提取物（二甲氨基乙氧基乙醇（DMEE））后，测量在上述细胞内表达的α平滑肌肌动蛋白及结缔组织生长因子的表达量的结果，SM为阳性对照组，其表示处理水飞蓟素（Silymarin）的组。

图16示出针对HHStec细胞株预处理不同浓度的本发明的黄漆木乙醇提取物（二甲氨基乙氧基乙醇）后，在划伤细胞后，测量划伤伤口距离的结果。

图17示出针对作为皮肤成纤维细胞的HS27细胞株处理不同浓度的本发明的黄漆木乙醇提取物（二甲氨基乙氧基乙醇）后，测量上述细胞内表达的α平滑肌肌动蛋白及结缔组织生长因子的表达量进行测定的结果，SM为阳性对照组，其表示处理水飞蓟素（Silymarin）的组。

图18示出针对作为皮肤成纤维细胞的HS27细胞株处理不同浓度的本发明的黄漆木乙醇提取物（二甲氨基乙氧基乙醇）后，在划伤细胞后，测量划伤伤口距离的结果。

图19示出以对作为动物模型的白鼠（SD）动物模型为对象处理本发明的黄漆木乙醇提取物时，分析根据四氯化碳注入的小鼠的体重减少抑制效果程度的结果，CTL为未做任何处理的对照组，CC14为注入四氯化碳的组，DM1＋CCl4为注入本发明的黄漆木乙醇提取物和四氯化碳的组，SM＋CCl₄为注入水飞蓟素和四氯化碳的组。

图20示出通过测量作为血清指标的谷氨酸氨基转移酶（ALT）及天冬氨酸氨基转移酶（AST）的含量来确认确认当处理本发明的黄漆木乙醇提取物时是否可以改善以白鼠（SD）动物模型根据四氯化碳注入的肝损伤的结果。

图21示出通过苏木精—伊红（HE）染色法确认当处理本发明的黄漆木乙醇提取物时是否可以改善以白鼠（SD）动物模型为对象根据四氯化碳注入的肝组织损伤（肝纤维化症状）的结果。

图22示出通过分析血管内皮生长因子（VEGF）的表达来确认当处理本发明的黄漆木乙醇提取物时是否可以改善以白鼠（SD）动物模型为对象根据四氯化碳注入的肝组织损伤（肝纤维化症状）的结果。

具体实施方式

发明的最佳实施方式

在本发明中使用的术语的定义如下。

“提取物”的特征在于，其为黄漆木的粗提取物、极性溶剂可溶性提取物或非极性溶剂可溶性提取物。

“粗提取物”包括可溶于选自包括纯化水在内的水、甲醇、乙醇、丁醇等碳数为1至4的低级醇或它们的混合溶剂中的溶剂，优选地，可溶于水及甲醇混合溶剂，更为优选地，为可溶于50％至100％甲醇的提取物。

“极性溶剂可溶性提取物”包括可溶于选自水、甲醇、丁醇或它们的混合溶剂中的溶剂，优选地，为可溶于水或甲醇，更为优选地，为可溶于甲醇的提取物。

“非极性溶剂可溶性提取物”包括可溶于己烷、三氯甲烷、二氯甲烷或乙酸乙酯，优选地，可溶于己烷、二氯甲烷或乙酸乙酯，更为优选地，为可溶于己烷或乙酸乙酯溶剂的提取物。

“药学组合物（pharmaceutical composition）”是指本发明的黄漆木提取物和其他化学成分的混合物，如稀释剂或载体。

“载体（carrier）”被定义为易于将化合物添加到细胞或组织内的化合物。例如，二甲基亚砜（DMSO）为易于将大量有机化合物渗入到生物体的细胞或组织内的常用的载体。

“稀释剂（diluent）”被定义为不仅使对象化合物的生物学活性形态稳定，而且在溶解化合物的水中被稀释的化合物。溶解于缓冲溶液的盐在本领域中用作稀释剂。通常所使用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲生理盐水，这是因为它模仿了人类溶液的盐状态。由于缓冲盐可在较低的浓度下控制溶液的pH，因此缓冲稀释剂很少改变化合物的生物活性。

“对象”或“患者”是指需要进行治疗的任何单个个体，包括人、牛、犬、豚鼠、兔、鸡、昆虫等。并且，任何参加临床研究但未显示疾病临床发现的对象或参加流行病学研究或用作对照的对象也包括在对象内。

“组织或细胞样品”是指从对象或患者的组织内获得的相似细胞的集合体。组织或细胞样品的供给源可以为新鲜、冻结和/或保存的器官或组织样品或从活检或抽吸物的的固态组织；血液或任何血液成分；处于对象的妊娠或产后任意时间点的细胞。组织样品还可为原代细胞或培养的细胞或细胞株。

“有效量”是影响有益或优选的临床或生物化学结果的适当的量。有效量可以一次给药或多次给药。为了本发明的目的，有效量是适合于暂时缓解缓解、改善、稳定、逆转、减慢或延迟疾病状态的发展的量。如果，在受惠动物能够耐受组合物的给药或组合物对该动物的给药合适的情况下，组合物表示“药学上或生理学上可接受”。在给药的量在生理学上是重要的的情况下，可以说上述制剂以“治疗学有效量”给药。若上述试剂的存在给受惠患者带来生理学上可检测的变化，则上述试剂在生理学上具有意义。

“治疗……的”的术语，除非另有说明，否则是指逆转、缓解、预防应用上述术语的疾患或疾病或者上述疾患或疾病中的一种以上的症状，或者抑制其进行。如本说明书中所述，术语“治疗”被定义为与“治疗……的”一样时，是指治疗的行为。

“功能性食品”是指在普通食品中添加本发明的黄漆木提取物来提高普通食品的功能性的食品。功能性大体上可分为物性及生理功能性，在普通食品中添加本发明的提取物的情况下，提高普通食品的物性及生理功能性，本发明将这种功能得以提高的食品总体的定义为“功能性食品”。

以下，对本发明进行详细的说明。

除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术术语均以本发明相关领域中的普通技术人员通常理解的含义来使用。并且，在本说明书中记载了优选的方法或试样，但与其相似或等同的方法或试样也包括在本发明的范畴内。在本说明书中作为参考文献记载的所有刊物的内容都被并入本发明中。

本发明涉及黄漆木提取物的抗纤维化用途，涉及与黄漆木提取物所包含的特定生理活性及功能的发挥。

黄漆木（Dendropanox morbifera LEV.）为属于五加科的常绿阔叶乔木，是生长于韩国济州岛、莞岛、甫吉岛、海南等南部和西部海岸一带的韩国特有的树种。黄漆木中的丁香成分包含少量的多萜（Terpene）类和大量的倍半萜烯（Sesquiterpene）类，根据采取时间和地点的不同而由所不同，包含右旋大根香叶烯（germacrene-d）、β-芹子烯（β-selinene）、α-紫穗槐烯（α-amorphene）、α-芹子烯（α-selinene）、δ-杜松烯（δ-cadinene）、γ-杜松烯（γ-cadinene）、T-依兰油醇（T-muurolol）、β-榄香烯（β-elemene）、双环[4，4，0]癸-1-稀-2-异丙基-5-甲基-9-亚甲基（bicyclo [4，4，0] dec-1-en-2-isopropyl-5-methyl-9-methylene）、β-杜松烯（β-cadinene）、香叶烯B（germacrene-B）、α-蒎烯（α-copaene）、α-葎草烯（α-humulene）、α-杜松烯（α-cadinene）和少量的L芳樟醇（linalool L）、α-萜品烯（α-terpinene）、α-荜澄茄烯（α-cubebene）、α-衣兰烯（α-ylangene）、（＋）-水菖蒲烯（（＋）-calarene）、3，7-guaiadine、（-）-异喇叭烯、β-荜澄茄烯（β-cubebene）、柠檬烯（limonene）、香橙烯（aromadendrene）、杜松烯-1，4-二烯（cadina-1，4-diene）等。

在本发明中可使用的黄漆木的部位为叶子、枝干、树皮等不受限制，但优选地，可使用叶子。

黄漆木可通过本领域公知的方法、其变形的方法或根据本发明的方法来制备并使用。作为一具体例，可通过如下述方法来制备。

本发明的黄漆木提取物或粗提取物可以如下获得，即，加入黄漆木重量的约1倍至30倍的体积量，优选地，加入2倍至15倍体积量（w/v％）的选自包括纯化水在内的水、甲醇、乙醇、丁醇等碳数为1至4的低级醇类或它们的混合溶剂中的溶剂，优选地，加入水及甲醇混合溶剂，更为优选地，加入50％至100％甲醇，在0℃至100℃的温度下，优选地，在室温下进行10小时至60小时，优选地，进行30小时至50小时的冷浸提取、热水提取、超声波提取、回流冷却提取或加热提取法等提取方法来获得黄漆木粗提取物。

并且，本发明的极性溶剂可溶性提取物或非极性溶剂可溶性提取物可以如下获得，即，优选地，将在上述获得的粗提取物分散于50％至100％的甲醇粗提取物重量的约1倍至150倍，优选地，5倍至100倍体积（w/v％）的水中，然后依次加入水的约1倍至10倍，优选地，1倍至5倍体积的己烷、乙酸乙酯及丁烷，并且，优选地，可以将其分馏1次至5次，优选地，2次至4次来获得本发明的极性溶剂可溶性提取物或非极性溶剂可溶性提取物。优选地，可通过获得己烷提取物来使用。

并且，在本发明中，具有抗纤维活性的黄漆木提取物不仅可以使用己烷提取物，还可以使用乙醇提取物。

上述提取物的浓缩液通过-80℃的冻结干燥或50℃的真空减压还能够以粉末状态获得。

本发明包括制备上述黄漆木提取物的方法。上述制备方法仅是其示例性方法，可以根据基于本领域的技术的多种方法适当地修改和使用。例如，通过本领域的熟练的技术人员显而易见的修改，可以成功地实施根据本发明中未示例的提取方法。

只要是本发明所属领域的普通技术人员，则可通过后述的实施例来确认用于制备本发明的黄漆木提取物的具体反应条件等，因此省略对其的详细说明。

本发明的特征在于，最先阐明黄漆木提取物的新用途，即，具有可预防、改善或治疗纤维化疾病的活性。

已知在纤维化（纤维变性）的进行中起到核心作用的因子为转化生长因子-β1，因此只要能够抑制基于转化生长因子-β1的信号传导体系，就可以抑制纤维化。

并且，作为有效抑制肝脏或胰腺的纤维化的有效手段，星状细胞已经成为重要的靶标候选物。在纤维化过程中，星状细胞被来自库普弗细胞（Kupffer cell）或浸润细胞的细胞因子活化，并转化为活化细胞后，非常清晰地产生细胞外基质。已知星状细胞为维生素A的储存细胞，属于干成纤维细胞家族。另一方面，星状细胞产生细胞外基质降解酶（MMP）、其抑制因子（TIMP）、转化生长因子β、血小板源生长因子等细胞因子以及肝生长因子（HGF）等增殖因子，在肝纤维化中发挥重要作用。活化的星状细胞的收缩能力的亢进并参与血流的调节，此外，通过增加各种细胞因子受体的表达来增加对细胞因子的感受性。

本发明人为了确认本发明的黄漆木提取物是否可预防、改善及治疗纤维化疾病，首先分析了通过各种溶剂提取的黄漆木提取物对由转化生长因子-β1诱导的α平滑肌肌动蛋白、结缔组织生长因子及胶原蛋白的表达变化的影响。

其结果可以确认，本发明的黄漆木提取物可以有效地抑制因转化生长因子-β1增加的α平滑肌肌动蛋白、结缔组织生长因子以及胶原蛋白的表达水平。

并且，在本发明的另一实施例中，不仅确认了黄漆木提取物是否刺激肝的库普弗细胞生成预纤维化细胞因子，还确认了黄漆木提取物是否抑制通过活化肝星状细胞而引起的作为纤维化的早期诱发因子的反应性活性氧类（ROS）的活性，结果显示本发明的黄漆木提取物具有有效抑制活性氧类（ROS）的活性。

上述结缔组织生长因子是主要从肝星状细胞分泌的物质，已知通过刺激肝星状细胞的增殖、存活以及胶原蛋白的生成来诱发肝纤维化，而α平滑肌肌动蛋白及胶原蛋白则在诱发纤维化时才增加。

并且，在细胞外基质的成分中，纤粘蛋白（FN，fibronectin）及作为其一部的纤连蛋白外部结构域A（FN-EDA，fibronectin extra domain A）在伤口治愈等异常状态下产生，它们的表达也因转化生长因子-β1而增加，并且它是诱发纤维化的因素。

因此，本发明的黄漆木提取物具有有效抑制纤维化诱发原因以及因子的表达的活性，最终可以有效地制备用于预防、改善及治疗纤维化疾病的医药品和保健功能食品。

由此，本发明可提供一种包含黃漆木提取物作为有效成分的用于预防或治疗纤维化疾病的药学组合物。

本发明的黄漆木提取物可预防、改善或治疗的上述纤维化疾病可以为增殖性瘢痕、瘢痕瘤、硬皮症、腹膜粘连、肝纤维化、肺纤维化、心脏纤维化、骨骼肌纤维化、关节膜纤维化、骨髓纤维化症和骨髓增殖异常综合征及糖尿病性网膜症，但不限于此。

在皮肤纤维化（skin fibrosis）中，伤口的治疗过程依次分为1）炎症步骤、2）增殖步骤、3）重塑步骤等三个步骤，皮肤纤维化包括生理学瘢痕、增殖性瘢痕（hypertrophicscars）、瘢痕瘤（keloid）及硬皮症（scleroderma）。

并且，肝纤维化是一种影响全世界一亿人的高死亡率的疾病，可通过病毒、酒精中毒、放射线、胆汁滞留、氧化压力、CCl₄、亚硝胺等毒性化学物质、由己烯雌酚（stilbestrol）和甲基多巴（methyldopa）及胆碱缺乏饮食疗法等药物引起的慢性肝损伤诱发肝纤维化，若不调节纤维化，则可发展为晚期肝硬化或肝细胞癌。在慢性肝损伤期间，肝星状细胞（HSC，肝脂肪细胞、脂肪贮存细胞、lto细胞、窦周细胞（perisinusoidal））被活化并增殖，导致诱发胶原及纤粘蛋白等细胞外基质（ECM）过度积累，从而造成肝纤维化。最近的研究结果发现，当发病的原因被削弱或消除时，肝纤维化（Liver fibrosis）出现可逆性的现象，因此，正在试图进行筛选以药用植物作为抗纤维化植物的研究，作为药理功效，已经进行了抑制肝星状细胞活性和抑制细胞外基质沉着的活性分析。

全身性硬化症患者的犯肺发生率高达90％，而与全身性硬化症有关的间质性肺部疾病是另一主要死亡原因。与肝纤维化一样，肺成纤维细胞被活化后分化为在肺纤维化中能够生成胶原蛋白等细胞外基质的肌成纤维细胞。并且，特发性肺纤维化（IPF）是一种预后较差的慢性进行性肺疾病，其特征是症状发作后的几年内因呼吸衰竭而死亡，肺移植和纤维化的抑制用作治疗特发性肺纤维化的方法。

并且，肾纤维化（Renal fibrosis）分为由炎症、免疫反应、外伤、缺氧症以及血液循环低下等各种病原性刺激诱发的肾小球硬化症和肾间质纤维化（RIF），发现肾间质纤维化存在于威胁生命的慢性肾脏疾病发展中。肾纤维化一旦发病，肾间质成纤维细胞样细胞（renal interstitial fibroblast-like cells）被活化为肌成纤维细胞，并且已知因诱发贫血而导致丧失足够的红血细胞生成因子的表达能力。

心脏纤维化（Cardiac fibrosis）化自然会导致心肌梗塞，心脏纤维化的进行会导致心脏功能的损伤受损并最终导致心脏麻痹。因此，抑制心脏纤维化对于预防心力衰竭也非常重要。

并且，还诱发腹痛、肠闭锁及腹部手术之后的不孕等并发症，为了防止肠与腹膜的粘连，因此为防止肠道和腹膜附着开发了膜片、膜、编织物、喷雾剂及水凝胶等组织粘连障壁，并且通过抑制纤维化来治疗腹膜粘连等与粘连有关的疾病的研究也在进行中。

并且，粘膜囊炎以关节囊的纤维化和屈曲为特征，由此引发了活动中出现疼痛的问题。骨髓纤维化发现于骨髓增殖性疾病及急性骨碎星白血病等多种血液疾病中，并且已知达50％的接受经皮冠状动脉腔内血管成形术（PTCA）及支架插入术的冠状动脉疾病患者中出现再粘连，已知新生内膜增殖和纤维化与受损的动脉及血管支架在粘连有关。

另一方面，尽管由纤维化疾病引起的死亡约占自然死亡的三分之一，但尚未开发出用于调节纤维性病变的有效的治疗方法，近来，正作为有效治疗肝纤维化的方案，已经进行了在安全性和成本方面有利同时具有抑制肝星状细胞活化以及抑制细胞外基质沉着功效的药用植物的研究。

如上所述，纤维化与许多疾病的发病有关，在本发明中阐明，本发明的黄漆木提取物可以有效有效地用于预防改善或治疗与这种纤维化有关的疾病。

因此，本发明可以通过提供一种通过向有需要的个体给药有效量的黄漆木提取物来阻断转化生长因子-β1的信号传导的方法，从而可提供一种使用黄漆木提取物来治疗及预防纤维化疾病的方法。

在本申请所使用的，“治疗……的”的术语，除非另有说明，否则是逆转、缓解、预防应用上述术语的疾患或疾病或者上述疾患或疾病中的一种以上的症状，或者抑制其进行。如本说明书中所述，术语“治疗”被定义为与“治疗……的”一样时，是指治疗的行为。

相对于组合物中重量，本发明的包含黃漆木提取物的用于预防或治疗纤维化疾病的组合物包含上0.1重量百分比至50重量百分比的上述提取物。

本发明的包含黄漆木提取物的药学组合物还可包含通常用于制备药学组合物的适当的载体、赋形剂及稀释剂。

并且，本发明的包含黄漆木提取物的药学组合物还可与已经使用的类固醇类药物、抗组胺剂、消炎镇痛剂及抗生素等药剂一起进行制剂化或联用。

本发明的包含黄漆木提取物的药学组合物可通过各种常规的方法来剂型化为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳液、糖浆、气雾剂等口服剂型、外用剂、佐剂及灭菌注射溶液的形态来使用。尤其，关于创伤愈合，可剂型化为皮肤外用剂的形态来使用。

作为可包含在本发明的包含提取物的组合物中的载体、赋形剂及稀释剂可列举凡士林、乳糖（lactose）、葡萄糖、蔗糖（sucrose）、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油。

在进行制剂化时，通过使用常用的填充剂、增量剂、结合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂来制备。

用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体制剂通过混入至少一种上述的赋形剂来制备，例如，淀粉、碳酸钙（calcium carbonate）、蔗糖或乳糖、明胶等进行混合来制备。并且，除简单的赋形剂外，还使用硬脂酸镁、滑石等润滑剂。用于口服的液相制剂有悬浮液、内用液剂、乳剂、糖浆剂等，除常用的作为简单稀释剂的水和液体石蜡外，还可包括多种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂、保存剂等。

用于非口服给药的制剂包括灭菌的水溶液、非水溶剂、悬浮剂、油剂、冻结干燥制剂、佐剂。非水性溶剂、悬浮剂可使用丙二醇（propylene glycol）、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射酯等。佐剂的基质可使用witepsol、聚乙二醇、吐温（tween）、可可脂、甘油三月桂酸酯、甘油明胶等。

本发明的提取物的使用量可根据患者的年龄、性别、体重而不同，可以每天给药一次或几次0.0001mg/kg至100mg/kg，优选地，给药0.001mg/kg至10mg/kg。并且，给药剂量还可根据给药途径、疾病的程度、性别、体重、年龄等进行增减。因此，上述给药剂量在任何方面均不限制本发明的范围。

上述药学组合物可通过多种途径给药于鼠、家鼠、家畜、人体等哺乳动物。可以预期所有给药方式，例如，可经皮肤、口服、直肠或静脉、肌肉、皮下、子宫内、硬膜或脑血管内、关节腔内及腹腔内给药。

本发明的组合物的药学给药形态能够以其在药学上可接受的盐形态使用，并且，不仅可以单独使用或者与其他药学活性化合物结合使用，而且还可以适当的组合使用。

另一方面，本发明从其他观点来看涉及包含黄漆木提取物作为有效成分的用于预防及改善纤维化疾病的功能性组合物。例如，作为这种功能性组合物可列举保健功能性食品组合物。

功能性大体可分为物性和生理功能性，在添加本发明的黄漆木提取物的情况下，该组合物的物性及生理功能性可能得到提高。

例如，可利用本发明的黄漆木提取物的分子机制来制备用于预防及改善纤维化疾病的功能性组合物。

本发明的黄漆木提取物在制备多种功能性食品时可用作主要成分或添加剂及辅助剂。作为一具体例，功能性组合物的上述提取物的量通常占总组合物重量的0.01重量百分比至15重量百分比，除含有上述提取物外，可根据普通食品组合物或化妆品组合物的方法适当选择使用。

并且，还可以适当地包含多种营养成分、维生素、矿物质（电解质）、合成风味剂及天然风味剂等风味剂、着色剂及填充剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇等。

由于本发明的包含黄漆木提取物的组合物为天然植物性成分，几乎没有毒性及副作用，因此，即使出于预防目的长期使用也可以放心使用。

发明的具体实施方式

以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅为例示本发明，对于本发明所属领域的普通技术人员显而易见的是本发明的范围不应解释为受这些实施例的限制。

原料及实验方法

1．黄漆木提取物的制备

从位于韩国务安的一家谷物农场收集黄漆木的叶子后进行干燥。将干燥的叶子在常温下使用甲醇提取。将使用甲醇提取的黄漆木提取物通过沃特曼1号滤纸（Whatman No.1 filter paper）过滤后，使用旋转式蒸发浓缩器在真空状态下进行浓缩。随后使用水对甲醇提取物进行悬浮，然后依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇以及水根据极性分馏。在图1中示出利用各溶剂获得黄漆木提取物的工序及根据各溶剂分馏的收率。

2．细胞培养

使用10％的热灭活的胎牛血清（FBS）和100μg/ml的含抗生素的DMEM培养基（Dulbeccos modified Eagles media）在5％的二氧化碳及37℃的温度下培养作为正常人类角质细胞株的HS27细胞。使这些细胞保持单层培养，当培养的细胞达到饱和时，进行传代培养。

3．实时定量聚合酶链式反应（PCR）

使用作为自动核酸提取系统的MFX-2100（日本大阪东洋纺公司）的MagExtractor并根据产品规格的方法获得总核糖核酸。随后，使用200单位（units）的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase）（美国英杰公司）及寡核苷酸（oligo（dT））引物在37℃的温度下对核糖核酸（1μg）进行1小时的逆转录反应。实时聚合酶链式反应使用荧光探针法（Taqman Master Mix）（罗氏公司）的Light Cycler2.0设备（德国曼海姆罗氏公司）进行，使用总共为20μl的反应液来进行，其中含有4μl的稀释5倍的互补脱氧核糖核酸（cDNA）、10pmol的各引物及探针、4μl的含预混液缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）、MgCl₂及Tag聚合酶（Tag polymerase），数据分析使用LightCycler software version 4.0（罗氏公司）来进行分析。

总细胞质核糖核酸使用TRI试剂（日本宝生公司的RNAiso Plu）来提取，提取的核糖核酸使用逆转录聚合酶链式反应（reverse transcriptionPCR）（美国英杰公司）合成互补脱氧核糖核酸。上述反应通过使用混合有4μl的以1：5稀释的互补脱氧核糖核酸、4mM的MgCl₂、10pmol的各引物、4μl的Fast Starter Mix缓冲液（dNTPs，SYBR 绿色染料和Tag聚合酶）的反应液来进行。各样品核糖核酸使用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（Moloney murineleukemia virus reverse transcriptase）（美国英杰公司）及寡核苷酸（dT）引物在37℃的温度下进行1小时的逆转录反应，合成的互补脱氧核糖核酸使用水稀释成1：5后，使用2.5单位的Tag聚合酶（美国普洛麦格公司）及10pmol的各引物，通过GeneAmp PCR9600（美国珀金埃尔默-希得公司（Perkin-Elmer-Cetus））设备进行扩增。上述本实验的聚合酶链式反应中使用的引物、探针及聚合酶链式反应条件在下述表1及表2中示出。

表1

在聚合酶链式反应中使用的引物

表2

聚合酶链式反应条件

4．蛋白印迹法

使用考马斯亮蓝法（Bradford）（Schleicher和Wieland，1978）测定蛋白质的浓度。使用牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin）的连续稀释来准备标准曲线，并将伯乐（Bio Rad）蛋白质分析染色试剂以1：4的比例稀释在水中。将4μl的标准品和样品添加到1ml的已稀释的染色试剂中，并在595nm下进行测定吸光度。从用牛血清白蛋白准备的标准曲线确定样品蛋白质的浓度。

使用磷酸盐缓冲溶液清洗细胞后，使用50mM的三（羟甲基）氨基甲烷（Tris-Cl）（pH7.4）、250mM的氯化钠、0.5％的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X100）、10％的甘油、1mM的二硫苏糖醇（DTT）、1mM的苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）及蛋白酶抑制剂混合物（protease inhibitor cocktail）（美国伊利诺伊州罗克福德PierceBiotechnology公司）进行溶解。对细胞溶解物进行离心后，使用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行电泳并进行蛋白印迹。使细胞内附着有蛋白质的膜（membrane）与抗α平滑肌肌动蛋白（美国ACAM公司）、结缔组织生长因子（美国ACAM公司）、纤连蛋白外部结构域A（美国圣克鲁斯公司）及对于甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（美国圣克鲁斯公司）的兔多克隆（rabbit polyclonal）第一抗体反应1小时，随后，与辣根过氧化物酶偶联的（horseradish peroxidase-conjugated）的第二抗体在常温下反应2小时后，使用ECL检测试剂盒（美国安玛西亚公司）进行分析。

5．细胞移动分析

将HS27细胞株以1×10⁵细胞/孔接种于6孔培养板并培养至培养板中充满细胞为止。随后，使用20μl的Erlotib刮擦，并使用磷酸盐缓冲溶液清洗培养板以去除因刮擦而破裂的细胞。随后，将细胞在含有50μg的本发明的黄漆木提取物的培养基中培养24小时，并且确认了细胞向无细胞部位迁移的速率。

6．1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）清除能力的分析

使用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼分析自由基清除能力。将本发明的各黄漆木提取物溶解于甲醇中，将含3.98ml的甲醇、20μl的各提取物以及含有1ml的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（使用甲醇溶解至0.15mM的浓度）的5ml的反应液放置在常温下30分钟后，使用分光光度计（spectrophotometer）（美国珀金埃尔公司）在517nm下测定吸光度减少程度。各实验重复三次，根据各提取物的不同处理浓度的自由基清除能力来计算半抑制浓度（IC₅₀，抑制50％的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（50％ inhibition of DPPH radicals））。此时，阳性对照组使用已知具有抗氧化活性的水飞蓟及抗坏血酸。

7．2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）分析

使用磷酸盐缓冲溶液悬浮AML-2/DX100细胞株及HS27细胞株（1×10⁵细胞/ml）后，将不同浓度的各样品（黄漆木提取物）处理于细胞后反应30分钟。随后，添加1μM的2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐及4mM的过氧化氢反应2小时后，使用分光光度计（美国珀金埃尔公司）在485nm至530nm下测量2’，7’-二氯代荧光素（DCF）。

8．黄漆木乙醇提取物（乙氧基乙醇）的制备

从位于韩国务安的一家谷物农场收集黄漆木（Dendropanax morbifera）的叶子后进行干燥，而后在干燥的叶子的中加入不同浓度的乙醇（30％、50％及70％）后，加热至90℃并获得乙醇提取物。将黄漆木的乙醇提取物通过沃特曼1号滤纸过滤后，使用旋转式蒸发浓缩器在真空状态下进行浓缩，并将其使用于下述实施例中。

9．用CCL₄诱导肝纤维化的鼠模型的制备

为了制备诱发肝纤维化的鼠模型，使4周龄的雄性白鼠（斯泼累格多雷（SpragueDawley，SD））适应1周后，分为4个组（仅处理溶剂的组（对照组）、四氯化碳处理组、本发明的黄漆木乙醇提取物（乙氧基乙醇）＋CCl₄处理的组、阳性对照组（SM＋四氯化碳处理组）），单独处理四氯化碳处理的组使用6只，而其他组各使用5只，在将CCl₄注入腹腔内（IP）30分钟之前将所有试样进行口服（PO）给药，以每周两次共给药6周。这些实验由朝鲜大学动物实验伦理委员会（Chosun University Institutional Animal Care and Use Committe）提出IRB计划书并获得批准后，进行了所有实验。

10．对肝组织的胶原的天狼星红（sirius red stain）染色

从诱发肝损伤的鼠中获得肝组织后，根据ScyTek Laboratories试剂盒的实验方法指南进行了天狼星红染色，具体地，将福尔马林固定的肝组织以常规的方法包埋在石蜡中后，使用切片机将其切成4μm的切片并贴在载玻片后去除石蜡，处理苏木红试剂并反应5分钟。随后，使用蒸馏水清洗两次，处理烤蓝试剂完全覆盖组织切片后反应15秒钟。随后，再用蒸馏水清洗两次。将组织切片浸入乙醇溶液中以终止反应。之后，处理曙红Y溶液处理并使其反应3分钟，然后使用乙醇溶液清洗含组织切片的载玻片。然后，使用乙醇溶液进行脱水处理并使用Histomount（美国National Diagnostics公司）固定以完成所有染色过程。若使用天狼星红染色，则I型胶原蛋白及III型胶原蛋白在光学显微镜下呈红色。

11．肝组织的免疫化学染色

从诱发肝纤维化的鼠作为中获得肝组织后，进行免疫化学染色，将固定在10％福尔马林中的肝组织按常规的方法包埋在石蜡中后，使用切片机将其切成4μm的切片并贴在载玻片后使用二甲苯去除石蜡，从而完成了浸水过程。抗原修复过程则是在柠檬酸盐缓冲液（Citrate buffer）（pH 6.0）中于恒温浴中浴40分钟。使用蒸馏水清洗后，在室温下处理过氧化物酶封闭缓冲液（Peroxidase blocking buffer）10分钟以去除内源性过氧化物酶。随后，将抗-SMA小鼠单克隆抗体（英国艾博抗公司）及抗血管内皮生长因子小鼠单克隆抗体以1：100的比例稀释后加入300μl，饭后在4℃的温度反应过夜。使用添加0.1％吐温20的TBS缓冲液（TBST）清洗后，使用GBI公司的Polink 2 Plus试剂盒内的300μl的小鼠增强子（mouse enhancer）在室温下反应30分钟。再使用TBST缓冲液清洗后，使用二氨基联苯胺（DAB，diaminobenzidine）显色。此时，显色时间为5分钟，在洗涤结束后，再使用梅式苏木精（Mayer's hematoxylin）反应1分钟，然后浸泡在TBST缓冲液并进行靛蓝染色（bluing）过程。将洗涤的载玻片置于乙醇和二甲苯中进行脱水，然后用Histomount密封。

在本发明的实验中分析的所有实验结果均通过重复三次实验来获得，结果数值以平均值±标准偏差（means±SE）来表示，统计学意义由配对t检验（paired Student's ttest）来确定，P值（P values）＜0.05被认为是显著的。

实施例1

黄漆木提取物对转化生长因子-β1引起的α平滑肌肌动蛋白信使核糖核酸的过表达的影响分析

在纤维化的过程中，若转化生长因子-β1被活化，则细胞内胶原在生成和积累增加，导致进行纤维化，从而使组织和器官丧失功能。并且，当细胞或组织被纤维化损伤时，失去细胞内的脂肪和类视黄醇成分，α平滑肌肌动蛋白的表达增加并引起细胞变化。因此，研究人员一直在进行用于抑制转化生长因子-β1的表达和活性来防止肝纤维化的研究。

为此，本发明人分析了本发明的黄漆木提取物是否影响对纤维化的诱导起作用的转化生长因子-β1引起的α平滑肌肌动蛋白的表达。为此，将转化生长因子-β1处理于作为人类皮肤成纤维细胞株的HS27及作为人类肝星状细胞株的HHStec（human hepatic stellatecell）后，分别处理黄漆木提取物，然后通过聚合酶链式反应及蛋白印迹法分析细胞内α平滑肌肌动蛋白的表达程度。

其结果如图2所示，通过本发明的黄芪树提取物的处理有效地抑制了处理转化生长因子-β1时HS27细胞株及HHStec细胞株中均显著增加的α平滑肌肌动蛋白的表达程度，尤其，己烷提取物相比于乙酸乙酯、正丁醇及水提取物（分馏物）具有更优秀的效果。

并且，本发明人通过改变黄漆木的己烷提取物处理浓度来处理于HS27细胞株及作为人类肝星状细胞株的HHStec后，通过聚合酶链式反应及蛋白印迹法来分析其对因转化生长因子-β1而增加的α平滑肌肌动蛋白的表达有何等程度的抑制效果，进而，分析了是否还影响转化生长因子-β1自身的表达。

其结果如图3所示，在两种细胞株中均以治疗浓度依赖性地显着抑制因转化生长因子-β1而增加的α平滑肌肌动蛋白的表达，转化生长因子-β1的表达也以浓度依赖性地被抑制（参照图4）。

本发明人通过这些结果可知，本发明的黄漆木提取物能够抑制作为纤维化促进细胞因子的转化生长因子-β1以及转化生长因子-β1促进的与纤维化有关的因子的表达及活性，尤其，黄漆木的己烷分馏物具有最强的抗纤维化活性。

实施例2

黄漆木提取物对结缔组织生长因子及纤连蛋白外部结构域A的影响分析

已知转化生长因子-β1在结缔组织生长因子的产生、作用及活性中起到重要作用，结缔组织生长因子的过度表达会诱发细胞外基质的积累并通过刺激肝星状细胞的增殖和存活及胶原蛋白的产生来诱发肝纤维化。在细胞外基质的成分中，纤粘蛋白及多种作为它的同分异构体的纤连蛋白外部结构域A（FN-EDA，fibronectin extra domain A，）会在伤口愈合等异常状态下产生，它们的表达也因转化生长因子-β1而增加。

为此，本发明人为了确认当处理黄漆木提取物时是否具有抑制因转化生长因子-β1增加的结缔组织生长因子及纤连蛋白外部结构域A表达的效果，将不同浓度的黄漆木提取物处理于HS27细胞株及作为人类肝星状细胞株的HHStec后，通过聚合酶链式反应及蛋白印迹法分析结缔组织生长因子及纤连蛋白外部结构域A的表达程度进行分。

分析结果如图5及图6所示，本发明的黄漆木提取物表现出具有有效抑制转化生长因子-β1增加的结缔组织生长因子及纤连蛋白外部结构域A的表达的活性，尤其，在使用己烷提取物的情况下，在HS27细胞株中于2μg/ml的浓度下抑制结缔组织生长因子的效果表现出5倍抑制，在10μg/ml的浓度下表现出7倍抑制效果，在50μg/ml的浓度下14倍抑制效果，而在HS27细胞株中于2μg/ml的浓度下表现出9倍抑制效果，在10μg/ml的浓度下表现出18倍抑制效果。

并且可知，本发明的黄漆木己烷提取物在HS27及HHStec细胞株中都具有有效抑制纤连蛋白外部结构域A的活性。

实施例3

黄漆木提取物对胶原的表达的影响分析

已知转化生长因子-β1为用于生成细胞外基质的主要刺激剂，在使用转化生长因子-β1小干扰核糖核酸（siRNA）来抑制转化生长因子-β1的表达的情况下，抑制纤维细胞的活性并在肝细胞中抑制胶原的积累和生成。

为此，本发明人为了确认本发明的黄漆木提取物能否抑制I型胶原蛋白A1及I型胶原蛋白3A的表达，将转化生长因子-β1及各个不同浓度的黄漆木提取物处理于HS27细胞株及HHStec细胞株来分析了细胞内表达的I型胶原蛋白及III型胶原蛋白信使核糖核酸的表达量，并分析了所生成的胶原蛋白的量。

其结果如图7及图8所示，本发明的黄漆木己烷提取物以处理浓度依赖方式均可有效地抑制I型胶原蛋白及III型胶原蛋白的表达，并且还显示出抑制因转化生长因子-β1而诱导的溶解性胶原蛋白的生成及分泌。

实施例4

黄漆木提取物对细胞移动的影响分析

为了确认本发明的黄漆木提取物是否影响细胞迁移，根据上述细胞迁移分析进行实验。

分析结果如图9所示，本发明的黄漆木提取物显示出由刮擦引起的伤口通过细胞迁移得以恢复，当处理50μg/ml浓度的己烷提取物时，显示出约50％的恢复力。

实施例5

黄漆木提取物对肝纤维化早期发病的抑制效果

抑制反应性活性氧类（ROS）不仅刺激肝的库普弗细胞（kupffer cell）生成促纤维化细胞因子，而且通过活化肝星状细胞来早期诱发纤维化的早期发病。因此，抗氧化活性可以抑制肝纤维化早期发病和发展。

为此，本发明人为了确认本发明的黄漆木提取物是否具有抑制活性氧类的功能，通过上述的<6>1，1-二苯基-2-三硝基苯肼清除能力的分析及<7>2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐分析来确认本发明的黄漆木提取物是否具有抗氧化活性的实验。

其结果如图10及图11所示，本发明的黄漆木提取物具有优秀的的抗氧化活性，尤其，确认乙酸乙酯分馏物和丁醇分馏物具有非常强的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼清除能力，乙酸乙酯分馏物具最强的2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐清除能力，这些清除能力显著优于维生素C和水飞蓟。已知水飞蓟为酒精性肝疾病、肝硬化、肝毒性等肝疾病的治疗剂，并具有抗氧化、抗纤维、抗炎症及肝再生效果，但本发明的黄漆木提取物显示出比这种水飞蓟更优秀的抗氧化活性，与现有药物相比，具有更优秀的肝纤维化预防、治疗及改善效果。

实施例6

黄漆木提取物对纤维化相关因子的表达的影响分析

6-1．黄漆木提取物对人类真皮成纤维细胞（HS27）的金属蛋白酶1、金属蛋白酶2、金属蛋白酶9、肿瘤坏死因子α、金属蛋白酶组织抑制因子1的影响分析

将转化生长因子-β1处理于HS27细胞株后，再处理本发明的黄漆木提取物，然后通过逆转录聚合酶链式反应分析在上述细胞株中表达的金属蛋白酶1、金属蛋白酶2、金属蛋白酶9、肿瘤坏死因子α、金属蛋白酶组织抑制因子1的表达量，此时，通过酶谱法分析金属蛋白酶2及金属蛋白酶9。

已知上述金属蛋白酶1为转化生长因子-β1的靶基因，作为通过转化生长因子-β1下调的因子是成为肝纤维化治疗剂靶标的分子。已知肿瘤坏死因子α通过参与纤维化组织的分解（resolution）来引起细胞凋亡的因子，并且其表达被转化生长因子-β1抑制。因此，若促进这些因子的表达及活性，则可抑制由转化生长因子-β1引起的纤维化的进行。在抑制对肝星状细胞的活化产生影响的金属蛋白酶组织抑制因子1（TIMP1）的表达的情况下，可抑制肝纤维化的进行，还分析了本发明的黄漆木提取物对金属蛋白酶组织抑制因子1的影响。

其结果如图12所示，本发明的黄漆木己烷分馏提取物显示出具有增加因转化生长因子-β1而减少的金属蛋白酶1及肿瘤坏死因子α的表达的作用，而抑制因转化生长因子-β1而增加的金属蛋白酶组织抑制因子1的表达。

并且，本发明人分析了黄漆木提取物对作为纤维化促进因子的金属蛋白酶2及金属蛋白酶9的表达的活性，其结果如图13所示，显示出浓度依赖性地已知因转化生长因子-β1而增加的金属蛋白酶2及金属蛋白酶9的表达。

6-2．黄漆木提取物对人类肝星状细胞（HHstec）的金属蛋白酶1及金属蛋白酶2的影响分析

在上述6-1的实验中，将人类肝星状细胞（HHstec）用作实验对象细胞株，并以相同的方式进行了实验。

其结果如图14所示，金属蛋白酶1的表达以本发明的黄漆木己烷分馏提取物的处理浓度依赖性地增加，表达增加程度更优于作为阳性对照组的水飞蓟处理组。并且，在金属蛋白酶2的分析中，本发明的黄漆木己烷分馏提取物处理组抑制因转化生长因子-β1而增加的金属蛋白酶2的表达，尤其，处理10μg/ml浓度时，具有最有效的抑制率。

实施例7．黄漆木乙醇提取物的抗纤维化功效分析

7-1．根据乙醇浓度的黄漆木提取物对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼及2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐自由基清除能力分析

分析了通过改变乙醇浓度来制备的本发明的黄漆木乙醇提取物（处理30％、50％、70％的乙醇）对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基及2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐自由基的清除能力。

表3

其结果如上述表3所示，通过改变乙醇浓度来获得的黄漆木提取物的情况下，30％的乙醇提取物的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基及2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐自由基的清除能力更优于50％及70％的乙醇提取物。并且，30％的乙醇提取物处理组的15-羟基前列腺素脱氢酶（15-PGDH）的抑制效果也更优于其他组。

因此，在本发明人使用乙醇获得黄漆木提取物的情况下，可知为了获得优秀的抗纤维化功效，使用30％乙醇的提取物是有效的。

7-2．肝星状细胞中黄漆木乙醇提取物对α平滑肌肌动蛋白及结缔组织生长因子表达抑制的活性分析

为了进行本发明的黄漆木乙醇提取物对抗纤维化活性的分析，分析了因肝细胞组织损伤而发生纤维化时已知表达增加的α平滑肌肌动蛋白及结缔组织生长因子的表达量是否随着本发明的黄漆木乙醇提取物而发生变化。为此，将不同浓度（20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml）的黄漆木乙醇提取物处理于肝星状细胞后，通过聚合酶链式反应分析测量了上述细胞中表达的α平滑肌肌动蛋白及结缔组织生长因子的表达量。

分析结果如图15所示，与未处理上述提取物的对照组（CTL）相比，处理本发明的黄漆木乙醇提取物（30％的乙醇提取物）的组显著抑制α平滑肌肌动蛋白及结缔组织生长因子的表达量，确认在以40μg/ml的浓度处理30％的乙醇提取物的情况下最有效。这表明，与以20μg/ml的浓度处理时相比，以40μg/ml的浓度时显示出2倍以上的抑制效果，相反，以80μg/ml的浓度处理的组与40μg/ml的浓度处理的组具有相似的效果。

7-3．黄漆木乙醇提取物对肝星状细胞刮擦恢复的测试

对本发明的黄漆木乙醇提取物进行细胞刮擦恢复测试。为此，培养肝星状细胞时，将本发明的黄漆木乙醇提取物（30％乙醇提取物）加入细胞培养基中并培养12小时，将细胞刮擦并测量细胞伤口的距离。

其结果人图16所示，刮擦伤口的距离以依赖黄漆木乙醇提取物处理浓度依赖性地增加，两次重复实验结果具有相同。以上结果表明黄漆木乙醇提取物能够抑制肝星状细胞的增殖和/或迁移。

7-4．皮肤成纤维细胞中黄漆木乙醇提取物对α平滑肌肌动蛋白及结缔组织生长因子表达抑制的活性分析

将本发明的黄漆木乙醇提取物（乙氧基乙醇）处理于作为皮肤成纤维细胞的HS27细胞后，测定黄漆木乙醇提取物对α平滑肌肌动蛋白信使核糖核酸表达的影响，其结果确认在提取物的处理浓度为20μg/ml、40μg/ml及80μg/ml时抑制α平滑肌肌动蛋白信使核糖核酸表达，并且测定黄漆木乙醇提取物对结缔组织生长因子信使核糖核酸表达的影响，其结果显示在黄漆木乙醇提取物的处理浓度为20μg/ml及40μg/ml时，具有抑制结缔组织生长因子信使核糖核酸表达的活性，而但在80μg/ml的更高浓度下没有效果（参考图17）。

7-5．黄漆木乙醇提取物对皮肤成纤维细胞刮擦恢复的测试

将黄漆木乙醇提取物（乙氧基乙醇）处理于作为皮肤成纤维细胞的HS27细胞24小时后，测试刮擦（scratch）是否恢复，其结果显示刮擦伤口的距离以浓度依赖性地增加（参照图18）。以上结果表明黄漆木乙醇提取物抑制皮肤成纤维细胞的增殖和/或迁移。

实施例8．通过动物实验的黄漆木乙醇提取物对抗纤维化活性分析

进一步地，本发明人以诱发纤维化疾病的白鼠动物模型为对象进行了用于确认本发明的黄漆木乙醇提取物的处理是否对纤维化疾病的具有改善或治疗效果的实验。为此，如下列表4所示，准备了以鼠为对象的实验组来进行了下述实验。

表4

实验组分类

实验组	处理内容	备注
			1组	羧甲基纤维素（CMC）（4ml/kg BW，PO）＋Vehide（橄榄油2ml/kg BW，IP）处理组	仅处理溶剂的对照组
2组	羧甲基纤维素（CMC）（4ml/kg BW，PO）＋CCL<sub>4</sub>（2ml/kg BW，IP，橄榄油中有30％的四氯化碳）	CCL<sub>4</sub>处理组
			3组	0天黄漆木乙醇提取物预处理（2ml/kg的含100mg/kg的BW＋四氯化碳处理）	预处理用本发明的黄漆木乙醇提取物后，CCL<sub>4</sub>处理组
4组	水飞蓟前处理（2ml/kg的含101mg/kg的BW＋CCL<sub>4</sub>处理）	与CCL<sub>4</sub>一起处理作为阳性对照组药物的水飞蓟的组

8-1．测量体重

如上所示，测量4个组的白鼠的体重并取平均值以分析每组的体重。作为参照，若诱发抗纤维化疾病，则出现体重减少的现象，因此通过这种体重减少现象来确认了本发明的提取物是否可抑制抗纤维化疾病。

其结果如图19所示，与对照组相比，处理作为抗纤维化诱发组织的CCL₄的组的体重减少现象突出，相反，处理本发明的黄漆木乙醇提取物（乙氧基乙醇）的组具有有效抑制由CCL₄引起的体重减少现象的活性，与作为阳性对照组的预处理水飞蓟的组相比，抑制体重减少的效果更优秀。

8-2．根据对由四氯化碳引起的肝组织损伤动物模型中给药黄漆木乙醇提取物的肝指标分析

以上述8-1中使用的白鼠动物实验组为对象采取血液，测量血清中含有的作为肝指标的谷氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）及天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）。已知作为肝损伤指标的谷氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶随着肝组织受到破坏游离于血液中并具有高活性，尤其，谷氨酸氨基转移酶多存在于肝，而天冬氨酸氨基转移酶多存在于心脏、肝、骨骼肌中，因此其特异性得到认可。

分析结果如图20所示，与对照组相比，在处理过四氯化碳（CCl₄）的组中，谷氨酸氨基转移酶及天冬氨酸氨基转移酶游离于血液中的含量高的活性，相反，在预处理本发明的黄漆木乙醇提取物后，预处理四氯化碳（CCl₄）的组显著较少因四氯化碳而增加的谷氨酸氨基转移酶和天冬氨酸氨基转移酶的水平，可知其能够改善及预防由四氯化碳引起的肝损伤。

8-3．根据对由四氯化碳引起的肝组织损伤动物模型给药黄漆木乙醇提取物的肝组织的改善效果分析

以上述8-1中使用的白鼠动物实验组为对象采取肝组织后，通过天狼星红（siriusred）染色分析肝胶原的表达。

分析结果如图21所示，与未处理四氯化碳（羧甲基纤维素＋油（oil））的组相比，在处理四氯化碳的组（羧甲基纤维素（CMC）＋四氯化碳）中的肝细胞中出现严重的囊泡化现象，连续的胶原纤维隔膜连接中央静脉与中央静脉之间、中央静脉与门静脉之间相互连结，从而导致发生肝纤维化现象。另一方面，与处理四氯化碳（CCl₄）的组相比，在处理本发明的黄漆木乙醇提取物的组（乙氧基乙醇＋四氯化碳）中，观察到肝细胞的囊泡化变化减少，血管周围放射的胶原隔膜薇弱且不连续，由四氯化碳引起的肝纤维化现象得到改善，这种改善效果与处理作为阳性药物的水飞蓟的组具有相似的效果。

并且，以从上述实验动物组获得的肝组织为对象进行了针对血管内皮生长因子的免疫组织化学染色方法，得知当诱发肝损伤时，血管内皮生长因子的表达会增加。为此，本发明人分析了本发明的提取物是否具有抑制肝细胞或肝组织中血管内皮生长因子的表达的活性。

其结果如图22所示，与未处理用四氯化碳的对照组（羧甲基纤维素＋油（oil））相比，在处理四氯化碳的组中，肝组织中血管内皮生长因子的表达增加，相反，尽管本发明的黄漆木乙醇提取物稍微减少了血管内皮生长因子的表达，但在阳性对照组（使用水飞蓟进行处理的组）中由四氯化碳引起的血管内皮生长因子的表达反而增加。这个事实表明与水飞蓟相比，黄漆木乙醇提取物具有更强的效果，或者它们在对血管内皮生长因子的表达的变化上具有不同的机制。

因此，通过如上所述的实验结果，本发明人可知本发明的黄漆木提取物通过调节作为纤维化相关因子的胶原之类的细胞外基质的表达及分泌可有效地预防、改善、抑制及治疗纤维化，尤其，与水飞蓟相比，黄漆木叶的乙醇提取物具有更有效的抗纤维化活性。

到此，对本发明以优选的实施例为中心进行了阐述。本领域普通技术人员将理解，在不脱离本发明的本质特征的前提下，可以由多种变形的形态来实现本发明。因此，在此公开的实施例应在描述性观点上考虑，而不是出于限制性的观点。本发明的范围在发明要求保护范围中示出，而不是在前面的描述中示出，与之同等范围内的所有差异点将被解释为都包括在本发明中。

<110> 朝鲜大学校产学协力团

<120> 包含黃漆木提取物作为有效成分的用于预防或治疗纤维化疾病的组合物

<130> NPNC63238

<160> 14

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> a-SMA F 引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> a-SMA R 引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> CTGF F 引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTGF R 引物

<400> 4

cccacaggtc ttggaac 17

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> FN-EDA F 引物

<400> 5

tccaagcgga gagagt 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> FN-EDA R 引物

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 胶原蛋白 1A1 F 引物

<400> 7

gcttcaccta cagcgtcact 20

<210> 8

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<212> DNA

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<223> 胶原蛋白 1A1 R 引物

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agaggagttt acaggaagca 20

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 胶原蛋白 3A1 F 引物

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<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 胶原蛋白 3A1 R 引物

<400> 10

actttcaccc ttgacaccct g 21

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> TGF-beta1 F 引物

<400> 11

acatcaacgg gttcactac 19

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<212> DNA

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<223> TGF-beta1 R 引物

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> GAPDH F 引物

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cgagatccct ccaaaatcaa 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> GAPDH R 引物

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tgtggtcatg agtccttcca 20

Claims (1)

1.黃漆木叶的甲醇提取物的正己烷分馏提取物在制备用于预防或治疗由TGF-β1引起的肝纤维化的药学组合物中的用途。

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