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TW201536302A - 適用於嬰兒過度哭鬧的益生菌 - Google Patents

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TW201536302A
TW201536302A TW103127323A TW103127323A TW201536302A TW 201536302 A TW201536302 A TW 201536302A TW 103127323 A TW103127323 A TW 103127323A TW 103127323 A TW103127323 A TW 103127323A TW 201536302 A TW201536302 A TW 201536302A
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TW
Taiwan
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thp
pediococcus pentosaceus
strain
interleukin
Prior art date
Application number
TW103127323A
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English (en)
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Castellana Jordi Cune
Mallen Elisabet Lazaro
Mazo Jordi Espadaler
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Ab Biotics Sa
Venpharma Lab S A
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Publication date
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Abstract

本發明提供一種細菌組合物，其包含104到1012菌落形成單位(cfu)/克的戊糖片球菌細胞，戊糖片球菌細胞具有誘導白細胞介素10之生成的能力，除了其他特性之外，其可以減少腸道的炎症。因此，細菌的組合物有用於嬰兒過度哭鬧的改善。特別地，戊糖片球菌細胞是來自收藏的菌株CECT8330。細菌組合物的形式可以是食物補充劑、藥物、嬰兒配方、可食用的產品和食品。特別地，該組合物的形式是油性懸浮液的嬰兒食品補充劑。

Description

適用於嬰兒過度哭鬧的益生菌
本發明有關於醫學、微生物學和營養學的領域，特別是，有關於根據戊糖片球菌細胞的新型的益生菌組合物。由於其生物功能，該組合物特別有用於嬰兒過度哭鬧的改善。
過度哭鬧是嬰兒在最初的十二個月的生活中，來看兒科醫生最常見的原因之一。其發病率可以達到的值高達40%。哭鬧超過三個月以上的嬰兒，以後進了學校會有不良後果的風險，包括焦慮，侵略，過動，過敏，睡眠障礙，以及，到了後來甚至會有精神健康狀況不佳的風險。過度哭鬧不僅對嬰幼兒是一個嚴重的問題，對家長也是。在一般情況下，對家庭生活品質也是一個嚴重的問題。過度哭鬧會使父母疲憊，而有許多有害的後果，包括集中注意力的困難，耐心的損失，無奈，無力的感覺，傷害孩子的害怕，母乳喂養的提早停止，及與孩子面對面交往的減少。此外，在某些情況下，挫折可能會導致某些來停止嬰兒的哭鬧的有害的行動，如拍打或搖動孩子。
儘管嬰兒哭鬧通常與明顯的疾病狀況相關，但對於看起來健康和用心餵養的嬰兒，由於病因不明(如嬰幼兒腸絞痛)所造 成的過度陣發性哭鬧，可能看不出其實際的原因。關於這些情況的起源，以及它們如何定義，很少有一致的看法。然而，有人提出，它們的起因來自腸胃功能的紊亂，如腸道發育不成熟，痙攣性結腸，食物過敏，腸道菌群的改變，和氣體的生產。
傳統上，不同藥物的治療已被用來減少哭鬧和吵鬧， 尤其是對“腸絞痛嬰兒。其中最常用的藥物是二甲基矽油，但臨床試驗的結果不是決定性的。其他以鹽酸雙環胺或西托溴銨的治療，已經顯示更有效，但可能會導致不想要的副作用，因而限制了它們的使用，特別是小於6個月的嬰兒。
草藥療法已被提議作為一種替代方法，雖然科學證據 是不足的。在雙盲安慰劑對照的臨床試驗中，市售的組合物ColiMil®(來自洋甘菊，小茴香，和香蜂草的植物提取物)顯示其可以減少哭鬧時間。與此相反，薄荷提取物已被報導，其對嬰兒腹痛的治療是無效的。此外，評估草藥的幾個研究，已經證實了一些不良的反應，包括嘔吐，嗜睡，便秘，及食慾不振等。
設計克服食物過敏的嬰兒配方(即低乳糖含量或部分 水解的乳清蛋白的配方)已被報導，可以降低哭鬧的發作。然而，這些配方有益於那些嬰兒的過度哭鬧，可能主要是與食物過敏有關。高纖維或富纖維的配方也已經被提出作為可能的治療，但與標準配方相 比較，其已被發現其效果並無顯著差異。
基於異常的腸道菌群可能會導致過度哭鬧的這樣的假設，益生菌作為一種很有前途的治療引起了極大的興趣。益生菌被定義為：“活的微生物，當其被攝入一定量時，其對健康的好處大於固有的基本營養”。來自雙歧桿菌屬或乳酸桿菌的幾種乳酸菌和物種就是益生菌，這意味著他們已被證明能促進特定的健康益處。益生菌必須符合幾個要求：毒性的缺乏，存活率，附著力，和有益的影響。這些益生菌的特徵是菌株相關的，即使是同種的細菌。因此，發現具有所需的益生菌的功能的菌株是重要的。
用於治療過度哭鬧的益生菌成分只有少數被研究。研究指出：含有鼠李糖乳酸桿菌GG，鼠李糖乳酸桿菌LC705，短雙歧桿菌Bbi99，和費氏丙酸桿菌SSP.，shermanii JS的益生菌配方，對嬰兒的過度哭鬧並沒有滿意的功效(Mentula，S.等人“微生物組成和腸絞痛嬰兒糞便發酵的最終產物-益生菌補充劑試驗”，Microbial Ecology in Health and Disease，2008年，第20卷，第1期，37-47頁)。另一個研究評估：富α-乳白蛋白和益生菌補充配方(鼠李糖乳桿菌，嬰兒雙歧桿菌)對腸絞痛的效果。該配方減少了相關的胃腸道副作用，煩躁及激動，但對哭鬧持續時間並沒有差異(Dupont,C.等人“適用於腸絞痛嬰兒的富含A-乳清蛋白及益生菌的嬰兒配方：成長和胃 腸道耐受性”European Journal of Clinical Nutrition，2010年，第64卷，第7期，765-767頁)。專利案WO2007142596已經披露：羅伊氏乳桿菌DSM17938對於腸絞痛相關的過度哭鬧的治療的有利作用。試驗結果顯示，該菌株對嬰兒哭鬧具有有利的效果(Savino,F.等人“羅伊氏乳桿菌(美國類型培養物收藏菌株55730)相對於二甲基矽油在嬰兒腸絞痛的治療：前瞻性隨機研究”Pediatrics，2007年，第119卷，第1期：e124-e130；Savino,F.等人“嬰兒腸絞痛用的羅伊氏乳桿菌DSM17938：隨機，雙盲，安慰劑對照試驗”Pediatrics，2010年，第126卷，第3期：e526-e533；Szajewska，H.等人“治療哺乳嬰兒之腸絞痛所用的羅伊氏乳桿菌DSM17938：隨機，雙盲，安慰劑對照試驗”Pediatrics，2012，第162卷。第2期，257-262頁)，但其不能改善腸道的生物多樣性(Roos,S.等人“對羅伊氏乳桿菌DSM17938治療嬰兒腸絞痛的隨機DBPC試驗的糞便標本的454焦磷酸測序分析”，PLoS ONE，2013，第8卷，第2期，e56710 1-5)。
在最近的關於嬰兒絞痛的腸道菌群的研究文章中，已 經提出了過度哭鬧可能是由於較多的病原體而增加了發炎，以及由於消炎乳酸菌的減少(De Weerth,C.等人“嬰兒腸絞痛的腸道菌群：發展與特定的標誌”，Pediatrics，2013，第131卷，第2期，e550-e558)。
專利案WO2007142596公開了羅伊氏乳桿菌DSM17938 的菌株有用於嬰兒腸絞痛的治療，因為它能夠促進高量的抗炎細胞因子IL-10的生成。
戊糖片球菌和乳酸片球菌通常會於蔬菜和肉類，和添 加於飼料中發酵，而作為食品防腐劑，以抑制破壞食品的細菌和食源性致病菌的生長。但是，一般相信，市場上沒有產品是基於戊糖片球菌，而用作人體的益生菌。
來自戊糖片球菌菌株的植物已經被披露是干擾素-γ 和白細胞介素IL-12 P70的分泌物的誘導物，和致敏小鼠脾臟細胞中抑制物IL-4的產生。因此，這種細菌由於這類促炎性細胞因子，能有效刺激免疫活動，並表現出過敏的抑制(Jonganurakkun，B.等人“用作益生菌的戊糖片球菌NB-17”，Journal of Bioscience and Bioengineering，2008，第106卷，第1期，69-73頁)。
在同一方向上，Igarashi T於2010年，公開了菌株戊糖 片球菌(KKM122)強烈地誘導促炎性細胞因子IL-12的產生(Igarashi T“在乳酸菌的細胞成分的變化和在鹽類增強的條件下IL-12之產生的刺激之間的關係的研究“，Bioscience,Biotechnology and Biochemistry，2010，74卷，2171至2175頁)。
Vitali等人於2012年，公開了屬於不同物種的48種乳酸 菌的菌株，其調節27種免疫介體(細胞因子，趨化因子和生長因子) 的合成的能力的研究。在這些免疫介體中，測定法可用來檢測IL-10。測定係利用Caco-2細胞和PBMC細胞在LPS刺激下來進行。結果表明，一些趨化因子被刺激。具有促炎症活性的免疫介體(IL-17，趨化因子和干擾素-γ)顯著地被所有菌株刺激，接著也被細胞因子IL-1 β，趨化因子干擾素-γ誘導的蛋白10(IP-10)，細胞因子IL-6，及趨化因子巨噬細胞炎性蛋白-1 α(MIP-1 α)等刺激，這些分離自生的水果與蔬菜，只有少數的菌株增加了具有抗炎活性的細胞因子的合成。在所測試的菌株之中，分離自番茄的戊糖片球菌菌株刺激了細胞因子IL-1 β，IL-4，IL-17，和干擾素-γ，而不是IL-10。基於免疫調節活性，在進一步的特性研究中，這種菌株沒有被選用作為一種新型益生菌的候補者(Vitali,B.等人“人類的新型益生菌候補者(Food Microbiology，2012，31卷(1期)，116-125頁)。
因此，明顯地，過度的陣發性哭鬧對於父母和嬰兒會有立即的和非常嚴重的後果。因此，安全的和有效的組合物和治療方法是必需的。在此領域中，益生菌可以被看作是一個有希望的替代目前的治療，但還需要進一步的研究。
本發明所要解決的問題是提供新的組合物及治療措施，用來改善嬰兒的過度哭鬧。
解決方法是基於本發明人發現的戊糖片球菌的新菌株，其具有相關的生物功能，可以用來改善嬰兒的過度哭鬧。
首先要注意，在益生菌之製劑中最常用的細菌來自乳桿菌和雙歧桿菌屬。因此，把片球菌屬用作益生菌是非常罕見的，且用於孩子身上更是不尋常。
正如上述，現有技術已經描述了過度哭鬧的原因，可能是病原體的增加而增加了炎症，和抗炎乳酸桿菌的減少所引起。現有技術也已經描述了羅伊氏乳桿菌DSM17938(來自羅伊氏乳桿菌ATCC55730)有用於嬰兒腸絞痛的治療，因其具有促進提高抗炎細胞因子白介素10(IL-10)的量的能力。因此，增加IL-10的量的能力似乎關係到哭鬧的改善。
但是，一般相信，現有技術並沒有描述戊糖片球菌菌株這方面的特性。事實上，相關的現有技術所描述的戊糖片球菌菌株具有的特徵完全與本發明相反。因此，誘導產生IL-10的能力不是戊糖片球菌細菌本有的或固有的特徵。例如，Igarashi T.於2010年，公開了戊糖片球菌(KKM122)的菌株，其強烈地誘導促炎性細胞因子IL-12的產生，從而引起炎症反應，此效果與本發明的效果相反。此外，Vitali等人於2012年，公開了廣泛的研究，確定了包括IL-10的27種免疫介體。然而，只有少數的菌株可以增加具有抗炎活性的的細胞因子 的合成，以及，雖然來自番茄的戊糖片球菌的菌株可以刺激細胞因子IL-1 β，IL-4，IL-17，和干擾素-γ，但其對IL-10沒有影響。需要提到，Vitali等人於2012年，用來確定IL-10的檢測，非常相似本發明中所描述的，但值得注意的是，Vitali等人於2012年，所確定的戊糖片球菌的菌株不具有誘導IL-10的生成能力。
綜上所述，遍查現有技術具有此性質的細菌時，戊糖 片球菌並沒有被發現是具有此性質的細菌物種。因此，一般相信，沒有現有技術描述了包含104到1012cfu/克的戊糖片球菌細胞的細菌組合物，如本文中所描述的，其具有誘導IL-10的產生從而減少腸道的炎症的能力。
出人意料的是，本發明人已經發現到戊糖片球菌具有 誘導IL-10的產生的能力。而遍查現有技術，現有技術並不知道戊糖片球菌的細菌具有這些特性。
因此，本發明提供菌株戊糖片球菌CECT8330。另外， 經由詳細描述的篩選方法，除了菌株CECT8330之外，可以由戊糖片球菌的細胞池中，鑑定和分離出戊糖片球菌的菌株，其具有誘導產生IL-10的相同的能力。
因此，在一個方面，本發明提供了戊糖片球菌屬的菌 株CECT8330。本發明描述了有關過度哭鬧的改善的細菌某些的生物 特性；即，誘導產生IL-10的最有關的特性的能力。本文經由例子可以顯示出，上述特性係關係到嬰兒過度哭鬧的改善。因此，雖然具有此特性的戊糖片球菌菌株已被確定(CECT8330)，但不限於理論，沒有理由將本發明的範圍限制在這樣的菌株，因為該方法的各個步驟也可以獲得其他本文所述的好菌株。因此，本發明還提供了除了菌株CECT8330之外的具有相同功能的戊糖片球菌菌株池。不是所有的屬於戊糖片球菌物種的菌株都具有誘導IL-10的能力，本發明另提供了識別它們的方法。
因此，本發明的第一個方面係涉及細菌組合物，其包 含104到1012cfu/克的戊糖片球菌細胞，其具有誘導產生白細胞介素10的能力，其中所述白細胞介素10的生產係在戊糖片球菌細胞的存在下，利用THP-1巨噬細胞來進行，其若表示為歸一化的增加，其生產量大於陰性對照的白細胞介素10的生產，後者係在沒有戊糖片球菌細胞存在下利用THP-1巨噬細胞來進行，歸一化的增加的確定步驟如下：(a)在含10%胎牛血清FBS的羅斯韋爾(Roswell)公園紀念研究所的RPMI1640介質中，用佛波醇12-肉荳蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，使來自英國公共衛生的細胞收集的目錄號88081201的THP-1單核細胞系生長，從而將THP-1單核細胞分化為巨噬細胞至0.16μM的最終濃度；； (b)在含10%FBS的RPMI1640介質的24孔的ELISA板上，使THP-1巨噬細胞生長到106個巨噬細胞/孔的最終濃度；(c)用脂多醣(LPS)培育THP-1巨噬細胞2.5小時，使其最終濃度為10奈克/毫升，並用Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水介質D-PBS來洗滌THP-1巨噬細胞；(d)在Man,Rogosa and Sharpe培養基(MRS)中，於37℃，5%CO2環境下，使THP-1巨噬細胞成長一個晚上，獲得戊糖片球菌細胞的培養物；(e)將500微升的含10%FBS和適量稀釋的戊糖片球菌細胞的RPMI1640培養基添加到每個ELISA孔內，而得到25：1的最終比率，即，2.5×107cfu的戊糖片球菌：106的THP-1巨噬細胞；(f)在戊糖片球菌細胞存在下於37℃培育THP-1巨噬細胞2.5小時，或在無戊糖片球菌細胞存在下於相同條件培育THP-1巨噬細胞2.5小時，作為陰性對照；(g)用D-PBS培養基洗滌THP-1巨噬細胞，以除去戊糖片球菌的細胞，隨後，將RPMI1640培養基添加到THP-1巨噬細胞，該RPMI1640培養基中含補充有50微克/毫升的慶大霉素，10微克/毫升的氨芐青黴素，和12微克/毫升的氯黴素的10%FBS，並取等分試樣在37℃，5-7%CO2下，各培育5小時和24小時； (h)對等分試樣進行離心，並以流式細胞儀定量測定上清液的白細胞介素10；和(i)利用公式(IL1024h-IL105h)/IL105h，計算白介素10的濃度的歸一化增加，其中IL105h和IL1024h分別是白介素10在5或24小時後的濃度，其單位為皮克/毫升。
因此，基於本文所描述的詳細的測定(參見對IL-10誘導之測定的例1)，本領域技術人員能夠常規地重複該測定，而能客觀地確定感興趣的戊糖片球菌是否符合本發明第一方面的IL-10的量。在符合IL-10誘導量的戊糖片球菌的細胞中，本發明提供菌株戊糖片球菌CECT8330。
如本文中所描述的，新型的細菌組合物有用於作為人類和特別是嬰幼兒的益生菌補充劑。因此，本發明的第二方面係涉及用來改善嬰幼兒的過度哭鬧的如本文所界定的細菌的組合物。在這個意義上，一般認為，現有技術中沒有描述用來改善嬰幼兒的過度哭鬧的戊糖片球菌的細胞。
這方面可替代地被配製，而使用於本發明第一方面所界定的細菌組合物，用來製造改善嬰幼兒的過度哭鬧的食品補充劑、藥物、嬰兒配方、可食用產品或食品生成物。這方面可替代地被配製，而成為用來改善嬰幼兒的過度哭鬧的方法，其包括給予嬰幼兒有效量 的本發明第一方面所界定的細菌組合物。
本發明的另一個方面是本發明所界定的細菌組合物可被用作藥物。
如本文所用，術語“有效量”是組合物中各菌株的菌落形成單位(cfu)的數量，在合理的醫學判斷的範圍內，其量要大到足以顯著改善被治療的情況，但也要小到可以避免嚴重的副作用(合理的效益/風險比)。
本發明的第三方面涉及長雙歧桿菌的菌株CECT7894。
最後，本發明的第四方面涉及用來篩選和分離新穎的戊糖片球菌細胞的方法，其包括以下步驟：(i)按照上面描述的IL-10的誘導測定法的步驟，檢測戊糖片球菌細胞池中的新戊糖片球菌細胞的誘導產生IL-10的能力；和(ii)由戊糖片球菌細胞池中選擇並分離出新戊糖片球菌細胞，以歸一化的增加來表示，其誘導產生IL-10的能力高於陰性對照組，該歸一化的增加係依照IL-10的測定步驟來確定。
很明顯地，一旦本發明人公開了相關的測試方法及具有IL-10的誘導量的保藏菌株CECT8330，對本領域技術人員而言，選擇其他符合本發明第一方面的標準的新戊糖片球菌細胞，將是例行的 工作。
圖1。SMA-I(左)和Not-I(右)的受限制的基因組DNA的脈衝場凝膠電泳的圖樣，從左至右依次為：鼠李糖乳桿菌GG(LGG)，戊糖片球菌CECT8330(8330)，作為對照組的兩株乳酸片球菌(1，2)和分子標記(M)。
圖2。XBA-I(左)和SPE-I(右)的受限制的基因組DNA的脈衝場凝膠電泳的圖樣，從左至右依次為：長雙歧桿菌CECT7894(7894)，長雙歧桿菌CECT4551(4551)和分子標記(M)。
圖3。平均每天哭鬧時間和每次發作持續時間的減少。a)平均每天哭鬧時間(每天哭鬧的分鐘數)的減少。b)平均每次發作的持續時間(每次發作的分鐘數)的減少。結果表示為平均值±平均值的標準誤差(SEM)，安慰劑組的n=9和益生菌配方組的n=11。PLA對應於安慰劑組。PRO對應於益生菌組。
術語“細菌組合物”應根據本領域來理解，其包括104到1012cfu/克的細菌細胞，其係具有根據第一方面的令人感興趣的特性的戊糖片球菌的細胞。細菌組合物可含有添加劑，如載體或賦形劑。細菌組合物然後被填充到合適的容器中。
術語“菌落形成單位(CFU)/克”涉及克重的組合 物，其包括存在於組合物中的有關的添加劑。其不包括用於包裝細菌組合物的合適的容器的重量。
本發明的第一方面涉及一種細菌組合物，其包含104 到1012CFU/克的戊糖片球菌的細胞，其具有利用THP-1巨噬細胞誘導生產白細胞介素10的能力。在戊糖片球菌細胞的存在下，利用THP-1巨噬細胞誘導生產IL-10的能力高於，在戊糖片球菌的細胞不存在時，利用THP-1巨噬細胞誘導生產IL-10的能力，歸一化的增加係由上面提到的步驟來確定。
IL-10，也稱為人類細胞因子合成抑制因子(CSIF)， 是一種抗炎細胞因子，其抑制了許多細胞因子，包括IFN-γ，IL-2，IL-3，TNF，和GM-CSF，其係由活化的巨噬細胞和輔助T細胞所產生。 術語“細胞因子”是指用於細胞信號轉導的小信號分子。細胞因子可以被歸類為蛋白質，肽或糖蛋白。在這種情況下，IL-10是一種具有免疫調節性能的蛋白細胞因子。
在一個具體實施例中，若以歸一化的增加來表示，在 戊糖片球菌細胞的存在下，利用THP-1巨噬細胞誘導生產IL-10的能力，比在戊糖片球菌的細胞不存在時，利用THP-1巨噬細胞誘導生產IL-10的能力，至少大二倍。歸一化的增加係依上面提到的步驟來確 定。在其他具體實施例中，與對照組比較，歸一化的增加至少是3倍，4倍，5倍或6倍。
進一步對於誘導產生IL-10的能力，戊糖片球菌細胞具 有有趣的拮抗性質，其可對抗過度哭鬧的嬰兒通常具有的不想要的分子中的許多細菌(見例2)。術語“拮抗”在本文中要被理解為抑制或減少細菌的生長。因此，在另一個具體實施例中，細菌組合物的戊糖片球菌的細胞有拮抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性腸道細菌的能力。特別地，革蘭氏陽性細菌所包括的細菌係選自難辨梭狀芽孢桿菌和糞腸球菌組成的群組。在另一具體實施例中，革蘭氏陰性細菌所包括的細菌係選自大腸埃希氏菌、產氣腸桿菌、產酸克雷伯菌和普通擬桿菌組成的群組。在另一特定實施例中，戊糖片球菌細胞具有拮抗艱難梭菌，糞腸球菌，大腸桿菌，產氣腸桿菌，產酸克雷伯菌和普通擬桿菌的能力，其中拮抗能力係由以下步驟來確定：(i)均勻拭取含有Oxoid培養基之板上的病原體菌株，並在適合各病原體生長的溫度和%CO2下，將病原體菌株生長匯合於CO2的培養箱中；(ii)置放兩個戊糖片球菌細胞均勻接種匯合的瓊脂平板的直徑為6毫米的筒節，其與病原體接種的板接觸，使其面對(a)抵著病原體接種的板的一個筒節的生長側；及(b)抵著病原體接種的板的另一 個筒節的非生長側；並在37℃培育一整夜；(iii)第二天，將瓊脂平板放在平尺上測量抑菌區間；和(iv)依公式GI=(IZD-CD)/2計算生長抑制活性，其係由以厘米為單位所測量的抑菌區直徑(IZD)減去圓筒直徑(CD)後除以2。
在一個特定的實施例中，戊糖片球菌細胞係來自保藏於西班牙類型培養物登記號為CECT 8330的戊糖片球菌。
戊糖片球菌CECT8330
新穎戊糖片球菌菌株的樣品已經被存放於CECT(Colección Española de Cultivos Tipo)，Edificio 3 CUE,Parc Científic Universitat de València,Catedrático Agustín Escardino,9,46980 Paterna,Valencia(西班牙)，存放者是AB-Biotics S.A.，位於Edifici Eureka,office P1M1.1,Campus UAB,08193-Bellaterra(西班牙)。該菌株存放的登記號為CECT8330，存放的日期為2013年4月30日，存放係在用於專利程序的目的的微生物保藏的國際認可的布達佩斯條約的條件下進行。存放者所定的鑑定參照是F3403。
如下面例子之所示，戊糖片球菌CECT8330顯示出以下的改善嬰兒過度哭鬧的有趣的性質：
‧誘導IL-10之產生的能力，如表1，例1之所示。
‧對所有研究的病原體具有抑制的活性(表2，例2)。菌株不僅可以 有效抑制革蘭氏陽性菌，也可以有效抑制革蘭陰性菌。這有極大的益處，因為其提供了對細菌，如大腸桿菌，克雷伯氏菌屬和梭菌屬的抵抗。呈現過度哭鬧的嬰幼兒具有異常多的這種細菌。
‧不會產生乙醇和二氧化碳，故不會對嬰兒造成干擾。
此外，菌株CECT8330具有被作為益生菌的特別有用的優點。益生菌必須符合幾個相關的要求：毒性缺乏，生存能力，附著力，和有益的效果。各菌株的特性是獨特的，不能外推到相同物種的其他菌株。因此，在所有的益生菌要求上，發現具有更好的性能的菌株是很重要的。為確保菌株CECT8330能夠克服胃腸(GI)道，體外協議被開發出來模仿它的條件。菌株經溶菌酶，過氧化氫，酸性環境和膽汁鹽處理後的存活要被量化。這是一個驗證性的實驗，因為菌株是從人類糞便中利用非常高的稀釋液分離出，但其存在於糞便中是濃的。結果表明，該菌株通過胃腸道後還能夠生存。
菌株CECT8330還被測定其拓殖腸道的能力。這是一個關鍵點，因為它確保了菌株可以發展所觀察到的生物功能。在實驗的發展中，使用腸粘液和Caco-2細胞，其模仿了益生菌菌株的結腸的停泊位點。菌株的粘附能力可以從氚標記的胸腺嘧啶脫氧核苷的閃爍來測量，並與那些用作對照的羅伊氏乳桿菌菌株相比較。粘液細胞的粘附能力和Caco-2細胞的粘附能力分別為1.40×106和4.5×106cfu/平方公 分(羅伊氏乳桿菌為：6.58×106和1.01×106cfu/平方公分)。因此，結果表明，CECT8330對於腸上皮細胞具有良好的粘附能力，其比得上羅伊氏乳桿菌，使得它能夠保持在腸道中，並發揮它們的益生效果。
菌株8330在工業介質中具有良好的成長。
此外，菌株8330係屬於具有安全合理推定(QPS)狀態的細菌物種(Andreoletti,O.等人“故意添加到食品或飼料的安全合理推定的微生物的名單的維護，問題編號：EFSA-Q-2008-006”，EFSA Journa，2008年，923：1-48頁)。QPS(“安全合格推定”)是由歐洲食品安全局開發的系統，其將地位授予具有公認的悠久歷史的外觀安全使用的分類學單位。
長雙歧桿菌CECT7894
在另一具體實施例中，細菌組合物還包含104到1012cfu/g的長雙歧桿菌CECT7894的細胞。
新穎的長雙歧桿菌菌株的樣品已經被存放於CECT(Colección Española de Cultivos Tipo)，Edificio 3 CUE,Parc Científic Universitat de València,Catedrático Agustín Escardino,9,46980 Paterna,Valencia(西班牙)，存放者是AB-Biotics S.A.，位於Edifici Eureka,office P1M1.1,Campus UAB,08193-Bellaterra(西班牙)。該菌株存放的登記號為CECT 7894，存放的日期為2011年3月30日，存放係在用於專利程序 的目的的微生物保藏的國際認可的布達佩斯條約的條件下進行。存放者所定的鑑定參照的是BIF F2。
如例子之所示，菌株長雙歧桿菌CECT7894也具有改善嬰兒過度哭鬧的有趣的性質：
‧誘導IL-10之產生的能力，如表1，例1之所示。
‧對所有研究的病原體的抑制活性(表2，例2)。菌株不僅可以有效抑制革蘭氏陽性菌，也可以有效抑制革蘭陰性菌。請參看對菌株CECT 8330的評論。
‧不會產生乙醇和二氧化碳，故不會對嬰兒造成干擾。
菌株長雙歧桿菌CECT7894具有過度哭鬧所示的例子的改善也有趣的性質：
‧能誘導IL-10產生如表1所示，實施例1。
‧針對病原體的所有光譜的抑制活性的研究(表2，實施例2)。該菌株是有效的抑制不僅革蘭氏陽性，而且革蘭陰性菌。見應變中電通信8330評論。
‧沒有生產乙醇和二氧化碳，從而不會造成干擾的嬰兒。
如對於戊糖片球菌菌株CECT8330，長雙歧桿菌CECT7894也測定了其克服胃腸(GI)道的能力。結果表明，該菌株通過胃腸道後還能夠生存。
按照上述對戊糖片球菌菌株的測定方法，菌株 CECT7894也被測定其拓殖腸道能力。粘液細胞的粘附能力和菌株CECT7894 Caco-2細胞的粘附能力分別為1.21×105和1.18×106cfu/平方公分，(羅伊氏乳桿菌：6.58×106和1.01×106cfu/平方公分)。因此，該結果表明，CECT7894對於腸上皮細胞具有良好的粘附能力，其比得上羅伊氏乳桿菌，這使得它能夠保持在腸道中，並發揮它們的益生效益。
菌株CECT7894還具有在工業介質中的良好成長。
因此，這兩種菌株，戊糖片球菌CECT8330和長雙歧 桿菌CECT7894具有許多功能特性，使它們適合使用於嬰兒的過度哭鬧的改善，在單個配方中可以單獨或一起使用這兩種菌株。在其他特性之中，它們都具有誘導IL-10之生成的能力，並且它們可以有效地抑制腸道細菌的生長(革蘭氏陽性菌，及革蘭氏陰性菌)。
此外，該菌株具有不產生氣體的優點。因葡萄糖的發 酵，異型細菌會產生二氧化碳和乙醇，以及乳酸。乙醇可影響腸道蠕動而使嬰兒產生腹脹絞痛。二氧化碳可導致腹脹(氣的累積)和胃腸脹氣，也是典型的嬰兒腸絞痛。已經描述過，異型菌株在絞痛嬰兒身上的存在量更高。與此相反，本發明的菌株不會產生乙醇，也不會產生二氧化碳，故不會造成嬰兒在這方面的干擾。
對本領域技術人員而言，本發明將變得顯而易見。在 一個單一的組合物中，戊糖片球菌CECT8330和長雙歧桿菌CECT7894都是有效的，不論它們自己單獨被使用，或者結合一起被使用。它們也可以被配製在兩種不同的組合物中，而同時，依次或在一定的時間週期後分開被施用。
鑑於上述之特性，細菌組合物對前述的哭鬧可以有生 理的改善，從而可以改善一些過度哭鬧的臨床症狀。因此，本發明的細菌組合物在改善過度哭鬧上特別有用。術語“過度哭鬧”在這裡要被理解為，強烈的，持續的和傷心欲絕的痛哭，對正常家庭此是個問題，這意味著，在觀察了至少一週的時間，平均每天至少60分鐘(在3次或更多次的發作中)。
術語“嬰兒”(“infant”)在本說明書中應被理 解為，人或動物的非常年輕的後代。當應用到人類時，術語被認為是與術語“嬰兒”(“baby”)同義。術語“兒童”(“child”)指的是，出生到青春期階段之間的人。“兒童”還敘述了與父母的關係，作為“兒子”和“女兒”的代名詞。然而，在此文中，術語“嬰兒”，“嬰兒”和“兒童”被認為是同義的，可以互換使用。
在一個特定的實施例中，本發明的細菌組成有用於嬰兒腸絞痛有關的過度哭鬧的改善。術語“嬰兒腸絞痛”在這裡應被理 解為；不明原因的且傷心欲絕的(“模糊”)，其會導致父母的困擾。術語“模糊”是一個非常主觀的用語，很難讓家長和醫生進行分類哭鬧的類型。此外，過度哭鬧的行為(易安靜下來與否)可能預示著腸絞痛。因此，一個最經常被引用的嬰兒腸絞痛的判斷標準是基於時間的規則(即根據韋塞爾的標準)：至少1週，每天哭鬧3個多小時(Savino,F.等人，2010年，見上文)。
在本發明的另一個實施例中，嬰兒的年齡係從三週到十二個月。
在一個以二十個嬰兒進行試驗性的臨床實驗中，菌株CECT8330和CECT7894的混合物被用來評估療效和安全性(參見例7)。每天一次(5滴/天)給予安慰劑和菌株的混合物，共進行了14天。如圖3之所示，益生菌配方使得每天平均的哭鬧時間和每次發作的持續時間有較大的下降。安慰劑或益生菌組都沒有不利的影響，此證實了益生菌配方可以被認為是安全的。因此，菌株的混合物有用於哭鬧的改善。
從如上所述的細菌組合物的有關性質，可以推導出，細菌組合物也可用於，治療因免疫系統導致的炎症的相關的胃腸道紊亂的其他病症；治療腸過敏；平衡腸中不希望的細菌的過量。
鑑於上述特性，菌株CECT8330和7894，與本領域公 知的商業菌株相比，對於過度哭鬧相關的的研究參數，具有較好的性能。如下面例子之所示，菌株CECT8330，相比於羅伊氏乳桿菌菌株之一，表現出較好的與IL-10生成的誘導有關的歸一化增加。此外，本發明的菌株顯示出，具有抑制研究的所有的病原體的活性。本發明的菌株不僅對革蘭氏陽性細菌具有有效的抑制，對革蘭氏陰性細菌也具有有效的抑制。而羅伊氏乳桿菌就不是如此，羅伊氏乳桿菌抑制大腸桿菌和普通類桿菌B的生長的效力低。這是有極大的益處的，因為如大腸桿菌的細菌的數量存在於過度哭鬧的嬰兒通常是異常多的。還值得注意的是，在一般情況下，相比於羅伊氏乳桿菌，菌株CECT8330，特別是CECT7894，對幾乎所有的病原細菌的生長的抑制更有效。此外，菌株CECT8330和CECT7894並不會產生氣體，而羅伊氏乳桿菌則會產生氣體。
量測IL-10生成之誘導的試驗
本發明的工作例1提供了一種測定法的詳細描述，其適合於測量IL-10的產生的誘導，如本發明的第一方面的步驟(a)-(i)。需要指出，公開在本發明的第一方面的步驟(a)-(i)與例1中的IL-10誘導的測定法的說明和條件，不是用來限制本發明的範圍。該測定法適合測試戊糖片球菌的細胞誘導IL-10之生成的能力。本例1的的詳細情形是較佳的檢測方法，其可以確定感興趣的戊糖片 球菌的細胞是否符合第一方面的準則。
因此，根據本文所描述的詳細的檢測方法，本領域技 術人員能夠常規地重複該檢測方法，來客觀地確定感興趣的戊糖片球菌的細胞是否符合第一方面的在IL-10之生成的誘導。
當使用所描述的測定法時，根據第一方面，在戊糖片 球菌細胞的存在下，以歸一化的增加來表示，由THP-1細胞產生的IL-10的量高於對照組。如在本文中所理解的和根據第一方面，對照組是在缺少戊糖片球菌細胞的存在下，由THP-1細胞產生的IL-10的歸一化的增加。在一個具體實施例中，在戊糖片球菌細胞的存在下，由THP-1細胞產生的IL-10的量高於對照組的量至少有2倍。在其他具體實施例中，歸一化的增加比對照高出至少是3倍、4倍、5倍或6倍。
量測對腸道細菌之拮抗能力的試驗
本發明的工作例2提供了一種測定法的詳細描述，其適合於測量戊糖片球菌細胞對腸道細菌之拮抗能力，如本發明的一個實施例之所示。需要指出，公開在例2中的測定法的說明和條件，不是用來限制本發明的範圍。該測定法適合測試戊糖片球菌的細胞拮抗腸道細菌的能力。
因此，根據本文所描述的詳細的檢測方法，本領域技術人員能夠常規地重複該檢測方法，來客觀地確定感興趣的戊糖片球 菌的細胞是否符合上面詳述的細菌譜；即，能夠拮抗難辨梭狀芽孢桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、產氣腸桿菌、產酸克雷伯菌和普通擬桿菌。
組合物和給藥的形式
在本發明一個具體的實施例中，如上所界定的細菌組合物，其形式係選自食品補充劑、藥物、嬰兒配方、可食產品和食品所組成的群組。
本發明的細菌組合物可以以任何合適的形式來製備，其不會負面地影響到形成本發明的組合物的細菌細胞的存活率。基於組合物的特定用途的製劑，賦形劑和最合適的方法的選擇是在製藥和食品技術領域的一般技術人員的範圍之內。
根據本發明的細菌組合物可被製備成一種形式，其中細菌細胞是唯一的活性劑，或混有一種或多種其他的活性劑，和/或在食品情況下，混有藥學上可接受的賦形劑或適當的添加劑或成分。在本發明一個具體的實施例中，組合物還另額外地含有一種或多種另外的活性劑。較佳地，額外的活性劑是其他的益生菌，其不會頡抗形成本發明的組合物的細菌細胞。取決於配方，細菌細胞可以以純化的細菌被加入，或以細菌培養物，或以細菌培養物的一部分，或以已被後處理的細菌培養物，以及單獨或與合適的載體或成分一起。益生素也可以被添加入。
細菌組合物可以是藥物產品的形式。在本說明書中， 術語“藥物產品”應在其廣泛的含義上被理解，其包括任何組合物，組合物含有活性成分-在這種情況下，細菌細胞-與藥學上可接受的賦形劑混在一起。術語“藥物產品”並不限於藥物。本文所用的術語“藥學上可接受的”涉及化合物，材料，組合物，和/或型劑，其在合理的醫學判斷的範圍內，其適用於接觸患者(如人類)的組織，其沒有過度的毒性，刺激性，變態反應，或其它問題，或併發症，其與合理的利益/風險比相稱。每種載體，賦形劑，等等也必須在與製劑中的其它成分在相容的意義上是“可接受的”。適合的載.體，賦形劑，等等可在標準藥學課本中找到。
根據產品的批准途徑及國家，藥品可以採用不同的形 式或名稱。例如，藥物是特定的藥劑產品。在本說明書中，醫療食品被認為是另一種特定的藥劑產品。在一些國家，術語“醫療食品”或“特殊醫療用途食品”(“medical food”or“food for special medical purposes”)是指作為疾病的飲食管理而專門制定的食品，該疾病具有獨特的營養需求，其無法經由正常飲食本身來滿足。它們已經被法規所界定，法規如美國的食品和藥物管理局的1988年的孤兒藥法案修正案，歐洲的委員會指令1999/21/EC。醫療食品不同於更廣範圍的食品添加劑，也不同於有健康聲稱的傳統食品。因此，在特定實 施例中，本發明的組合物是一種醫療食品。
通常，益生菌的組合物，如本發明所公開的，被認為 是食品補充劑。食品補充劑，也稱為膳食補充劑或營養補充劑，其被認為是另一種特定的藥物產品。其為了補充飲食和提供營養或有益的成分的目的而被製備，這些有益的成分通常在正常飲食中無法被攝取，或沒有足夠被消耗的數量。大多數情況下，食品補充劑被認為是食品，但有時它們被界定為藥品，天然保健品，或營養保健產品。在本發明的意義上，食品補充劑還包括營養補充食品。食品補充劑通常以“場外交易”(“over the counter”)，即沒有處方而被販賣。 如果食物補充劑採用丸劑或膠囊劑的形式，其包括有藥物中採用的相同的賦形劑。但是食品補充劑也可以採用食品的形式，其以一些營養物質來強化(如嬰兒配方)。
因此，在特定實施例中，本發明的組合物是食物補充劑，和更具體地，是嬰兒食品補充劑。
根據本發明的組合物之給藥的形式，其可以本身單獨或混合有合適的可食用的液體或固體、凍乾片劑、丸劑、膠囊劑、錠劑、顆粒劑、散劑、混懸劑、小藥袋、糖漿劑或通常以單位劑量的形式。其形式也可以是冷凍乾燥的組合物的單劑量的形式，其存在於單獨的液體容器中，在給藥前才混合一起。
在年齡非常小的嬰幼兒的情況下，給藥的形式只限於 少數。因此，在較佳的實施例中，本發明的細菌組合物是一種油狀懸浮液體，其可單獨給藥或混有液體。油性懸浮液包含至少一種可食用的油，如橄欖油，玉米油，大豆油，亞麻子油，葵花子油，或米糠油。 其中，油至少有70%重量/重量的量。在一個特定的實施例中，油性懸浮液還包含至少一種賦形劑，其是一種乳化劑，穩定劑，或抗結塊劑，其量為0.1~15%w/w。合適的試劑是二氧化矽，矽膠，膠態二氧化矽，沉澱二氧化矽，滑石，矽酸鎂，卵磷脂，果膠，澱粉，改性澱粉，魔芋膠，黃原膠，結冷膠，角叉菜膠，藻酸鈉，單或二酯甘油的脂肪酸，諸如甘油單硬脂酸酯或甘油單油酸酯和單或雙甘油酯的檸檬酸酯。
油性懸浮液，可按照本領域技術人員公知的技術並使 用已知的機械來製備。給定的數量的油被引入裝有攪拌和加熱裝置的容器中。隨後在攪拌下加入至少一種賦形劑，並在必要時，輕微加熱至20到50℃，以避免形成團塊和結塊，直到完全均勻。懸浮液被冷卻至室溫，並且在攪拌下，將固體形式的細菌細胞逐漸加入懸浮液，直到完全均化。
特別地，本發明的細菌組合物是油性懸浮液形式的嬰 兒食品補充劑。在特定實施例中，油狀懸浮液包括較佳地為1%重量 的葵花籽油和膠態二氧化矽，及細菌細胞。
在另一個實施例中，油狀懸浮液包括葵花籽油和試 劑，該試劑選自卵磷脂、單-或二酯甘油脂肪酸、角叉菜膠和藻酸鈉，以及細菌細胞。
本發明的細菌組合物也可包含在各種食物產品或食 用產品，如嬰兒的牛奶製品中。在本文中使用的術語“食用產品”係指其最廣泛的含義，其包括任何類型的產品，以任何形式呈現，其可以被動物攝入；即器官可接受的產品。術語“食物產品”應被理解為可食用的產品，其還提供了身體所需的營養。特別有益的食品是食品補充劑和嬰幼兒配方奶粉。食物產品較佳地包含載體材料，如燕麥粥、乳酸發酵食品、抗性澱粉、膳食纖維、碳水化合物、蛋白質和糖基化蛋白。在一個特定的實施例中，本發明的細菌細胞均勻地混有其它成分，如穀物或奶粉，以構成嬰兒配方奶粉。
因此，必需理解到，本發明的細菌組合物有用於嬰兒 過度哭鬧的處置，而不論該組合物的形式；即不管是藥物產品、藥物、食物產品、可食產品、食品補充劑或醫療食物。
細菌細胞的生長，突變體和劑量
細菌在合適的培養基中，並在合適的條件下生長。本發明的細菌細胞能夠單獨進行培養，以形成純培養物，或連同其它微 生物混合培養，或分別培養不同類型的細菌，然後將它們以所需的比例相結合。培養後，細胞懸浮液被回收並使用，或以期望的方式處理，例如經由濃縮，脫水，噴霧，或冷凍乾燥，以進一步製備成藥品或食品。有時，益生菌製劑進行固定化或封裝，以提高保存期限。幾種用於細菌的固定化或包封的方法是本領域已知的。
本發明的另一個方面涉及本文所述的新潁菌株或“其突變體”。很顯然地，使用保藏菌株作為起始材料，本領域的技術人員可以常規地，經由傳統的誘變或再分離技術，來獲得進一步的突變體或它們的衍生物，其至少保留了本文描述的形成本發明的組合物的菌株的相關的特徵和優點。因此，術語“其突變體”涉及使用保藏菌株作為起始材料而獲得的突變菌株。在一個實施例中，突變體係利用重組DNA的技術來獲得。在本發明的第一方面的另一實施例中，突變體經由隨機誘變來獲得。在本發明的第一方面的一個特定的實施例中，變體是天然存在的變體。這可以作為一種替代性的配製方法，來得到菌株，其使用本文所保藏的菌株之一作為起始菌株，來形成保藏菌株的突變體，並分離出新潁的菌株，其中突變體保留了保藏菌株的基本屬性。
細菌細胞的有效量將由本領域的技術人員來確定，並且將隨要實現的特定的目標，所治療的患者的年齡，身體狀況，相關 病症的嚴重程度，以及最終製劑而改變。當口服給藥時，本發明的菌株在每日有效劑量的組合物中的量為107至1012cfu。根據目前的立法，較佳的是109到1011cfu。術語“菌落形成單位”(“CFU”)被定義為，在瓊脂平板上微生物計數所揭示的細菌細胞的數目。當以本發明的組合物的形式使用時，不同菌株較佳的濃度比例是1：1。
本發明的菌株的一般使用，是在活細胞的形式。然 而，它也可以擴展到非活細胞，如殺死的培養物，或細胞裂解物(例如，在殺死或裂解細菌的其他手段中，暴露於改變的pH，超聲處理，輻射，溫度或壓力等來獲得)，或含有本發明的菌株所產生的有利因素的組合物。
在整個說明書和申請專利範圍中，詞語“包括”及其 變體並不是要排除其它技術特徵，添加劑，組分，或步驟。對於本領域的技術人員，經由說明書的研究或經由本發明的實施，本發明的另外的目的，優點和特徵將變得明顯。此外，本發明涵蓋了本文所述的特定的和較佳的實施例的所有可能的組合。本文所提供的下面的實施例和附圖，係用來作說明的目的，並沒有意圖要限制本發明。
例子
在一些實驗中，菌株羅伊氏乳桿菌ATCC55730被用作 對照組。
例1。以腸道粘膜模型對誘導IL-10之生成能力的體外評估
細菌菌株的免疫調節能力的研究，係從它與消化道的免疫系統(通常被稱為腸道相關淋巴組織，GALT)的相互作用來進行。更具體地講，其係測試細菌菌株是否具有誘導減少炎性腸道的抗發炎的IL-10之生成的能力。這現象的分子基礎是益生菌細胞表面受體與TLR-2和TLR-4(類Toll受體)的相互作用，其可在派伊爾氏板(Peyer's plates)的樹突狀細胞中找到。
THP-1細胞系
所選擇的模型是細胞系THP-1，其表達為TLR-2和TLR-4。這個模型對於細菌成分像脂多醣-LPS-(作為炎症反應的誘導劑)是敏感的，並且當培養基中有適合於生產抗炎細胞因子圖樣的誘導的分子時，容易調節細胞因子的產生。
根據本領域的術語“THP-1細胞系”，其涉及人類單核細胞系，人類單核細胞系係來自急性單核細胞性白血病患者。其被用來測試在蛋白質-蛋白質相互作用的免疫細胞化學分析中的白血病細胞系，和免疫組織化學。
THP-1細胞系得自公共衛生英格蘭公司的細胞收集(目錄號88081201)。在本申請案的申請日時，可以從提供者公共衛 生英格蘭公司的88081201的產品目錄(www.hpacultures.org.uk)讀取有關的THP-1細胞：“人類單核細胞白血病，來自帶有急性單核細胞白血病的1歲大男性的周邊血液“。
培養基和LPS
THP-1單核細胞生長於羅斯韋爾公園紀念研究所(RPMI)的1640培養基+10%胎牛血清(FBS)。RPMI是市售標準培養基(來自Gibco的RPMI1640，文獻目錄號61870-010)。FBS也來自Gibco公司。
將5毫克的佛波醇12-肉荳蔻酰-13-乙酸酯(來自SIGMA的PMA，文獻目錄號P8139)加入生長培養基中，且孵育約72小時，使THP-1單核細胞分化成巨噬細胞至0.16μM的終濃度。
細菌菌株生長於MRS培養基中。其是市售標準培養基，Man,Rogosa and Sharpe培養基(MRS，來自Broth Oxoid，文獻目錄號CM0359)。
以LPS刺激THP-1巨噬細胞，來誘導炎症反應。脂多醣(LPS)，也稱為脂聚醣，是含有脂類和多醣的大分子，脂類和多醣以共價鍵連接；它們被發現於革蘭氏陰性細菌的外膜，其作用如內毒素會引起動物強烈的免疫反應。在本研究中使用的LPS是市售標準的脂多醣(得自Sigma公司，文獻目錄號L4391)。
成長，孵育和IL-10的測量
THP-1巨噬細胞在24孔的ELISA板的RPMI 1640+10%FBS培養基中，成長至106巨噬細胞/孔的最終濃度。最終的細胞濃度係使用Tripan藍色染料和Neubauer-計數室來計算。
THP-1巨噬細胞與LPS共同孵育2.5小時(最終濃度10納克/毫升)。然後用Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水介質(D-PBS，來自Gibco公尺，文獻目錄號14190-094)洗滌細胞。將五百微升的RPMI 1640+10%FBS的培養基加入每個ELISA-孔中。
細菌菌株預先在MRS培養基中於37℃在5%CO2氣氛中生長一整夜。細菌菌株適當地被稀釋，以獲得25：1(2.5×107cfu的細菌：106的THP-1巨噬細胞)的最終比例，而被加入每個孔中。使用Neubauer-計數室計算其濃度。
然後THP-1巨噬細胞在37℃，在有或沒有(陰性對照)細菌菌株的情形下，被孵育2.5小時。隨後，巨噬細胞用D-PBS介質洗滌兩次，以除去細菌菌株。然後加入補充有慶大霉素(50微克/毫升)，氨芐青黴素(10微克/毫升)，和氯黴素(12微克/毫升)的RPMI1640+10%FBS的培養基，且孵育於37℃之5-7%CO2中，並在5小時和24小時之時等分取樣。
將等分試樣進行離心，利用流式細胞儀以市售的試劑 盒的人類IL-10的Flex盤(來自BD Biosciencies，Bead B7，文獻編號558274)，按照產商的說明，對上清液進行IL-10的測定。
計算
對於結果的解釋，不使用絕對值。最具參考價值的資訊是細胞因子的演變，在這種情況下，其是IL-10的濃度，以在5和24小時的歸一化的增加來表示。這反映出腸道發生了什麼事，並提供了標準值，允許實驗之間的橫向比較。歸一化的增加，以下面的公式來計算，其中IL105h和IL1024h是分別在5或24小時後IL-10的濃度，以皮克/毫升為單位：(IL1024h-IL105h)/IL105h
結果
歸一化的增加值越高，IL-10的誘導就越高。如表1所示，LPS誘導的THP-1巨噬細胞在細菌菌株的存在下誘導IL-10的產生，在菌株CECT8330的存在下，IL-10的誘導特別高。CECT8330引起的誘導比羅伊氏乳桿菌引起的誘導略高。
例2。腸道細菌的拮抗能力
其目的是要評估細菌菌株對大量存在於過度哭鬧的嬰兒中之物種中的不良分子的拮抗能力。
用於檢測和評估這些功能的協議被稱為坎貝爾協議(Campbell protocol)。這項技術涉及在Petri板上孵育要被拮抗的的細菌，其係以益生菌菌株均勻地接種匯合的瓊脂平板的筒節。然後測量筒節附近的生長抑制的光暈。
培養基
病原體菌株生長在Oxoid培養基中。其是標準市售的Oxoid培養基(Oxoid公司CM0359)。
孵育和測量
病原體菌株均勻地被擦拭在含有Oxoid培養基的平板上，並以各病原體生長的適當溫度和%CO2生長匯合至CO2培養箱中。然後，將要被測試的益生菌菌株的均勻接種匯合的瓊脂平板的兩個6毫米直徑的筒節，放置接觸病原體接種的板，使病原體接種的板面對 一個筒節的生長邊，而面對另一個筒節的非生長邊，並在37℃孵育一整夜。
計算
第二天，將瓊脂板放在平尺上，測量抑制區。然後以下列公式GI=(IZD-CD)/2來計算生長抑制活性(GI)，即，將抑制區的直徑(IZD)減去圓筒直徑(CD)再除以2，直徑係以厘米計量。將本發明的菌株的抑制能力與商業菌株羅伊氏乳桿菌的抑制能力進行比較。每種菌株的最後的抑制活性，係以兩個上述筒節的GI值的平均值來計算。
結果
菌株對研究的所有病原體顯示出有抑制活性。因此，該菌株不僅對革蘭氏陽性細菌，且對革蘭氏陰性細菌的抑制都是有效的。但羅伊氏乳桿菌的情況就不是如此，羅伊氏乳桿菌抑制大腸桿菌和普通擬桿菌的生長的效率是低下的。這是極大的益處，因為過度哭鬧的嬰兒通常存在有大量的細菌，如大腸桿菌(De Weerth,C.等人，2013，見上文；Lehtonen,L.等人“腸絞痛和無腸絞痛的嬰兒的腸道菌群：細菌培養和氣液色譜法“Journal of pediatric Gastroenterology and Nutrition，1994年，第19卷，第310-314頁)。還值得注意的是，在一般情況下，相比於羅伊氏乳桿菌，CECT8330和特別是CECT 7894，對於幾乎所有的病原細菌的生長的抑制更有效。此外，本發明的兩種菌株可提供保護，防止克雷伯氏菌和梭狀芽孢桿菌，它們大量存在於過度哭鬧的嬰兒上(De Weerth,C.等人，2013，同上；Lehtonen,L.等人，1994，同上)。
例3。未產生氣體
異型細菌產生的二氧化碳和乙醇，以及乳酸，其係葡 萄糖經由下列的代謝途徑的發酵所產生：1 Glucose(葡萄糖) → 1 Lactic acid(乳酸)+1 Ethanol/Acetic acid(乙醇/乙酸)+2 ATP(三磷酸腺苷)+1 CO2(二氧化碳)
菌株的二氧化碳的產生被測定。如反應式之所示，二氧化碳的產生也表示乙醇的產生。使用達勒姆管(Durham Tubes)技術來測定二氧化碳的產生，其是依據益生菌菌株在管內的異型菌發酵液中的孵育，該管內含有較小的和倒過來的管，其可收集產生的氣體(Pilone,G.J.等人，“葡萄酒乳酸菌的特徵：測試異型菌所用的單一發酵液培養基，來自果糖的甘露糖醇，和來自精氨酸的氨”Am J Enol Vitic，1991年，第42卷，第153-157頁)。
菌株CECT8330和CECT7894不產生氣體。作為對照組的羅伊氏乳桿菌則產生氣體。
例4。毒性測定法
相反於來自雙歧桿菌屬與片球菌屬的細菌，戊糖片球菌不常用作人類消費的益生菌。因此，雖然本發明的益生菌菌株CECT8330屬於一種具有QPS狀態的物種，其他毒性的測定要被進行，以避免任何的安全問題。
考慮到由於嬰兒不成熟的消化道的高敏感度，決定使用Wistar Han IGS Crl：WI新生大鼠(出生後10天，實驗開始的體重範 圍為18-23克)來發展急性毒性更合適的模型，以確保該菌株對嬰兒的完全的安全。
使用懷孕第19天的有孕雌性大鼠。幼鼠出生後，選用4隻雄性和4隻雌性，混合所有母鼠的幼鼠，以避免母體效應，且調整成同等大小的窩。每隻哺乳期的雌性大鼠與4隻雄性和4隻雌性的幼鼠放在一起。哺乳期的雌性大鼠被飼餵SAFE A03食物，並隨意被飼餵飲水。
實驗過程包括4組：VEHICLE-易位，VEHICLE-臨床症狀，CECT 8330-易位，和CECT8330-臨床症狀。
各小組包括在籠子裡的哺乳期的雌性大鼠與4隻雄性和4隻雌性的幼鼠。每天準備最終濃度為0.5×1010CFU/毫升的配方的CECT8330生成物。VEHICLE組被飼餵的是水而不是益生菌。所有新生大鼠以VEHICLE或CECT 8330處置5天(從研究的第0天到第4天)，經由口胃插管強飼5毫升/千克的固定體積(在CECT8330之情況是2.5×1010cfu/公斤)。口服途徑被選作研究，因為它是人體給藥的預定途徑。
在實驗過程中要觀察的是：發病率/死亡率；體重；臨床症狀(幼鼠的外觀，包括水化和身體狀況；對刺激的反應；被強迫仰躺時自然扭動的活動能力，和膚色)。
在兩個不同期間之後，動物被處死：
- “易位”組在實驗的第4天被處死(5天治療的最後一天)。
- “臨床症狀”組在研究的第11天被處死(最後口服給藥後一周)。
幼鼠被斬首處死並進行剖檢，其包括完整的動物的檢驗和它的所有表面的組織，其次是胸腔和腹腔的內部檢查。“易位”組的動物在處死之後立即取其肝臟，並維持在2-4ºC，直到細菌的易位分析。約5毫克的各肝臟樣品被均質化在1毫升的0.01%的明膠PBS中。從勻漿中取一百微升塗在McConkey板或MRS板上。在37℃孵育48小時後，對菌落進行計數。
在研究過程中沒有觀察到自發死亡或毒性相關的臨床症狀。對照組(vehicle)和CECT8330之間並無體重的不同，且所有動物的行為都正常。此外，對照組和CECT8330組之間，在肝臟中顯示出乳酸菌或腸內細菌有易位的動物的數目並沒有差異。
例5。菌株的分離
收集0-9歲的兒童的新鮮的糞便，並溶解在PBS緩衝液(pH 7.4)中，等份取樣並塗在具有各種抗生素組合物的MRS上。菌株被培養於微需氧條件(5%CO2)下，孵育時間依增長速度而定，但通常是24小時至3天。革蘭氏菌被染色，以得到第一標識。一旦生長，分離的菌株用15%脫脂奶粉稀釋成0.1倍的PBS中進行冷凍乾燥而被 保存。該菌株生長於含有10微克/毫升的萬古黴素的MRS瓊脂板上。顯微鏡檢查發現到，雙歧桿菌CECT7894是革蘭氏陽性桿菌，戊糖片球菌CECT8330也是革蘭氏陽性球菌。
屬和種的鑑定係利用如前所述的16S rRNA基因的放大(Bosch,M.等人，分離自健康兒童糞便的植物乳桿菌CECT7315和CECT7316的益生菌的性質。Lett App.Microbiol，2012，54卷，240-6頁)。SEQ ID NO：1對應於戊糖片球菌CECT8330的16S rRNA基因序列，而SEQ ID NO：2對應於長雙歧桿菌CECT7894的16S rRNA基因序列。
菌株的基因分型係以基因消化和脈衝場凝膠電泳(PFGE)來進行。
戊糖片球菌CECT8330以前面描述的而稍作修改的方案來處理(Rodas,A.M.等人，酒乳桿菌菌株的多相研究：分類學的意義。Int J Syst Evol Microbiol，2005，55(1)：197-207頁)。由於無法獲得作為對照使用的市售的戊糖片球菌菌株，兩種市售的乳酸片球菌菌株包括在試驗中(在圖1中的1和2)。菌株生長於MRS瓊脂板上並在37℃之5%CO2下孵育18小時。收取細胞，並用8毫升的PET(10毫摩爾的Tris，pH值7.6，1M的氯化鈉)洗滌3次，然後在6000轉/每分(rpm)下離心10分鐘。粒料再懸浮於700毫升的裂解緩衝液中(6毫 摩爾的Tris，1M的氯化鈉，0.1M得EDTA，0.5%的SLS，0.2%的脫氧膽酸，1毫克/毫升的溶菌酶，40U/毫升的變溶菌素，20毫克/毫升的RNA酶)。在懸浮的細胞中加入等體積的1.6%的低熔點瓊脂糖(FMC生物產品，Rockland,ME,USA)，並在4℃固化1小時。插入物轉移至2毫升的裂解緩衝液II中(0.5M，pH9.2的EDTA，1%氮-月桂酯肌氨酸，和1毫克/毫升的鏈黴蛋白酶)，且在50℃孵育48小時。然後，插入物於室溫下，用TE緩衝液(10mM的Tris，pH8.0的1mM的EDTA)洗滌。分別由SMA-I和Not-1限制性內切酶(Roche Diagnostics)進行總DNA的消化。使用CHEF DRIII儀(BioRad實驗室)進行脈衝場凝膠電泳。插入物被放入1%的瓊脂糖凝膠(SeaKem ME的瓊脂糖，FMC生物產品，ME，USA)。表3描述了每種酶的電泳情況。DNA分子重量的標記是Lambda ladder PFG標記和Low Range PFG標記(New England Biolabs)。電泳後，凝膠使用GelDoc系統(BioRad)以溴化乙錠和UV來染色。
用Xba I和Spe I作為限制酶，利用PFGE來分析長雙 歧桿菌CECT7894的特性，其是使用Xba I和Spe I作為限制酶，如Briczinski，EP等人所描述的：“技術說明：分析雙歧桿菌的快速的脈衝場凝膠電泳法”J.Dairy Sci，2006年，第89卷，2424-2427頁。所得圖案與長雙歧桿菌CECT4551的圖案進行比較。
其結果顯示於圖1和圖2，脈衝場凝膠電泳的Not-I和SMA-I的限制圖案不同於菌株戊糖片球菌CECT8330和屬於乳酸片球菌物種的市售對照菌株的限制圖案(1和2)。利用戊糖片球菌菌株作為對照組是不可能的，因為它們不是可市購的。脈衝場凝膠電泳(PFGE)可用來區別同一物種的菌株之間的差異，因而可以被用來在細菌物種中，唯一地識別給定的細菌菌株(Rodas,A.M.等人，2005，同上)。
例6。油性懸浮液的製備
400毫升的向日葵油被引入裝有攪拌裝置的容器中。再緩慢加入9.5克的膠體二氧化矽，其係在攪拌下(150轉/每分)加入，以避免形成團塊和結塊，直到完全均勻。13.3克的含有5×1012CFU的戊糖片球菌CECT8330加入到緩慢攪拌下(50轉/每分)的容器，直至完全分散。然後，42.75克的含有5×1012CFU的長雙歧桿菌CECT7894加入到緩慢攪拌下(50轉/每分)的容器，直至完全分散。最後，將向日葵油加入懸浮液，使懸浮液變成1000毫升，並攪拌使之均質化而 形成最終的懸浮液。並將懸浮液保持在室溫下。
例7。臨床研究 研究的設計
進行試驗性的臨床試驗，以評估結合戊糖片球菌CECT8330和長雙歧桿菌CECT7894的益生菌配方的療效和安全性。該研究的目的是作為一個前瞻性的雙盲，安慰劑對照，隨機化的臨床試驗，該試驗有兩個平行的部門參與，並涉及來自加泰羅尼亞(西班牙)〔Catalonia(Spain)〕的總數為8個的參與中心。本研究方案係經IDIAP Jordi Gol(巴塞羅那，西班牙)〔(Barcelona,Spain)〕及Fundació Unió Catalana d’Hospitals(巴塞羅那，西班牙)〔(Barcelona,Spain)〕的符合赫爾辛基宣言(Helsinki Declaration)的倫理委員會的認可。
招募男女二性的健康的足月的嬰兒，這些嬰兒滿足下列全部的包含標準：21到120天大；2.5千克的最低出生體重；不論是母乳喂養或餵養嬰兒配方奶粉(水解的或起始的配方)；過度哭與吵，過度哭與吵的定義為“激烈的，持久的，和傷心欲絕的痛哭，對正常家庭的運作造成問題，其意味著，觀察至少1週，有3天，每天至少60分鐘，或有3天每天更多分鐘，或有更多天，前述已排除了器質性病因，如腸套疊或其他“。排除標準為：早產兒(不足37週出生)；慢性疾病；胃腸道疾病史(不涉及腸絞痛)；免疫抑制的嬰兒；以前 的或預期的手術治療；報名前已使用一周的益生菌或抗生素；嬰兒的父母或代表未能適當地遵循研究的要求。受試者被隨機地分配到益生菌治療組或安慰劑組。治療包括在如例6中所述的組合物。安慰劑包括無益生菌的相同的油狀懸浮液。餵食前30分鐘給予組合物(5滴/天)，共進行14天。在研究過程中，家長被要求填寫問卷，記錄有關於治療，哭鬧演變，和不利的影響。
利用適於Windows的IBM®SPSS統計V20來進行數據分析，結果被表示為平均值和標準誤差。在臨床試驗中，每天哭鬧時間的平均的減少被計算，其係在研究的最後3天(第12，13和14天)中每天哭鬧的總分鐘數的平均值，和研究的最先3天(第1，2和3天)中每天哭鬧的總分鐘數的平均值之間的差值。每次發作的持續時間的平均的減少被計算，其係在研究的最後3天(第12，13和14天)中每次發作的持續時間的分鐘數的平均值，和研究的最先3天(第1，2和3天)中每天每次發作的持續時間的分鐘數的平均值之間的差值。
結果
在臨床試驗開始時，n=9的嬰兒屬於安慰劑組，而n=11的嬰兒屬於益生菌配方組，其被證實符合嬰哭鬧時間的建議定義，並因此允許繼續研究。在該研究開始時，這些嬰兒的平均哭鬧的時間介於60至240分鐘。在研究期間，安慰劑和益生菌配方組被觀察 到都有良好的耐受性，相關的補充也都無不良的影響。此外，如圖3所示，在研究過程中，安慰劑和益生菌組都減少了哭鬧時間。然而，食用益生菌的平均哭鬧時間減少了更多。每次發作的持續時間也有類似的趨勢被觀察到。
觀察到的支持益生菌特性的臨床效果係在體外觀察到的。這些結果有相關的益處，因為此研究相比於其他研究，呈現了一些長處，其中益生菌已被用於治療腸絞痛。例如，研究包括了母乳喂養的嬰兒，也包括了配方奶餵養的嬰兒，這是有相關益處的，因為目前益生菌配方都未能顯示對配方奶餵養的亞群體有任何的改善。此外，根據嬰兒腸絞痛的臨床定義和根據日常的臨床實務來招募參加的嬰幼兒更逼真，且其治療時間(14天)少於許多其他的臨床試驗(21-28天)。
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WO2007142596
【生物材料寄存】
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
西班牙、COLECCIÓN ESPAOLA DE CULTIVOS TIPO(CECT)、2011/3/30、CECT 7894
西班牙、COLECCIÓN ESPAOLA DE CULTIVOS TIPO(CECT)、2013/4/30、CECT 8330
<110> 艾比 拜耳提克斯股份有限公司維法瑪 實驗室股份有限公司
<120> 適用于嬰兒過度哭鬧的益生菌
<130> P2765PC00
<150> EP13382324
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<221> 來源
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<223> /莫耳_類型=“未指定的DNA” /注釋="16sRNA" /有機體=“戊糖片球菌”
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<210> 2
<211> 1461
<212> DNA
<213> 長雙歧桿菌
<220>
<221> 來源
<222> 1..1461
<223> /莫耳_類型=“未指定的DNA” /注釋="16sRNA" /有機體=“長雙歧桿菌”
<400> 2

Claims (14)

  1. 一種細菌組合物，其包含具有誘導產生白細胞介素10的能力的104至1012菌落形成單位(cfu)/克的戊糖片球菌細胞，其中，在戊糖片球菌細胞的存在下由THP-1巨噬細胞生成的白介素10係高於缺少戊糖片球菌細胞的存在下由THP-1巨噬細胞生成的白介素10之陰性對照組，其被表示為歸一化的增加，所述歸一化的增加係由以下步驟來確定：(a)在含10%的胎牛血清(FBS)的羅斯韋爾(Roswell)公園紀念研究所的(RPMI)1640介質中，並用佛波醇12-肉荳蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)，使來自英國公共衛生的細胞收集的目錄號為88081201的THP-1單核細胞系生長，從而將THP-1單核細胞分化為巨噬細胞至0.16μM的最終濃度；(b)在含10%的FBS的RPMI1640培養基的24孔的ELISA板上，使THP-1巨噬細胞生長到106巨噬細胞/孔的最終濃度；(c)用脂多醣(LPS)培育THP-1巨噬細胞2.5小時，使其最終濃度為10奈克(ng)/毫升，並用Dulbecco磷酸鹽緩衝鹽水介質(D-PBS)洗滌THP-1巨噬細胞；(d)在Man,Rogosa and Sharpe培養基(MRS)中，於37℃之5%CO2環境下，使THP-1巨噬細胞成長一個晚上，來得到戊糖片球菌細胞的培養物；(e)將500微升的含10%的FBS和適量稀釋的戊糖片球菌細胞的RPMI1640培養基添加到每個ELISA孔內，來得到25：1的最終比率，即，2.5×107菌落形成單位(cfu)的戊糖片球菌：106的THP-1巨噬細胞； (f)在戊糖片球菌細胞存在下於37℃培育THP-1巨噬細胞2.5小時，或在無戊糖片球菌細胞存在下於相同條件培育THP-1巨噬細胞2.5小時，作為陰性對照；(g)用D-PBS培養基洗滌THP-1巨噬細胞，以除去戊糖片球菌的細胞，隨後，將RPMI1640培養基添加到THP-1巨噬細胞，該RPMI1640培養基中補充含有50微克/毫升的慶大霉素、10微克/毫升的氨芐青黴素和12微克/毫升的氯黴素的10%的FBS，在37℃之5-7%CO2下培育，並於5小時和24小時之時取等分試樣；(h)對等分試樣進行離心，並以流式細胞儀定量測定上清液的白細胞介素10；和(i)利用公式(IL1024h-IL105h)/IL105h，計算白介素10的濃度的歸一化增加，其中IL105h和IL1024h分別是白介素10在5或24小時後的濃度，其單位為pg/毫升。
  2. 根據申請專利範圍第1項所述的一種細菌聚合物，其中在戊糖片球菌細胞的存在下由THP-1巨噬細胞生成的白介素10，相比於無戊糖片球菌細胞的存在下由THP-1巨噬細胞生成的白介素10，其被表示為歸一化的增加時，至少多2倍，前述歸一化的增加係由申請專利範圍第1項所界定的步驟(a)-(i)來確定。
  3. 根據申請專利範圍第1-2項之任一項所述的細菌組合物，其中所述戊糖片球菌細胞具有拮抗革蘭氏陽性和革蘭氏陰性腸道細菌的能力。
  4. 根據申請專利範圍第3項所述的細菌組合物，其中所述革蘭氏陽性細菌包括選自難辨梭狀芽孢桿菌和糞腸球菌組成的群組中的細菌。
  5. 根據申請專利範圍第3項所述的細菌組合物，其中所述革蘭氏陰性細菌包括選自大腸埃希氏菌、產氣腸桿菌、產酸克雷伯菌和普通擬桿菌組成的群組中的細菌。
  6. 根據申請專利範圍第3項所述的細菌組合物，其中所述戊糖片球菌細胞具有拮抗難辨梭狀芽孢桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、產氣腸桿菌、產酸克雷伯菌和普通擬桿菌的能力，其中拮抗能力是由以下步驟來確定：(i)均勻拭取含有Oxoid培養基之板上的病原體菌株，且在適合各病原體生長的溫度和CO2百分比下，將病原體菌株生長並匯合於CO2的培養箱中；(ii)置放與病原體接種的板接觸的戊糖片球菌細胞的均勻接種匯合的瓊脂平板的兩個直徑6毫米的筒節，並使其面對(a)病原體接種的板的一筒節的生長側；及面對(b)病原體接種的板的另一筒節的非生長側；並在37℃培育一整夜；(iii)第二天，將瓊脂平板放在平尺上測量抑菌區；以及(iv)依公式GI=(IZD-CD)/2來計算生長抑制活性，其係由以厘米為單位所測量的抑菌區直徑(IZD)減去圓筒直徑(CD)後除以2。
  7. 根據申請專利範圍第1-6項之任一項所述的細菌組合物，其中戊糖片球菌是保藏於西班牙類型培養物收集的戊糖片球菌，其登記號為CECT8330。
  8. 根據申請專利範圍第1-7項之任一項所述的細菌組合物，其中還包括104到1012菌落形成單位(cfu)/克的長雙歧桿菌CECT7894的細胞。
  9. 根據申請專利範圍第1-8項之任一項所界定的細菌組合物，其用來改善 嬰兒的過度哭鬧。
  10. 根據申請專利範圍第9項所述的細菌組合物，其用來改善與嬰兒腸絞痛有關的過度哭鬧。
  11. 根據申請專利範圍第9項所述的細菌組合物，其中嬰兒之年齡係從3週到12個月。
  12. 根據申請專利範圍第1-8項之任一項所述的細菌組合物，其形式係選自下列各項組成之群組：食品補充劑、藥物、嬰兒配方、可食用的產品和食品。
  13. 根據申請專利範圍第12項所述的細菌組合物，其形式是油性懸浮液的嬰兒食品補充劑。
  14. 一種篩選和分離新型戊糖片球菌的細胞的方法，其包括以下的步驟：(i)依據申請專利範圍第1項所述的步驟，來檢測戊糖片球菌細胞池中的新的戊糖片球菌細胞的誘導白細胞介素10之生成的能力；以及(ii)從戊糖片球菌細胞池中選擇並分離出誘導白細胞介素10之生成的新的戊糖片球菌細胞誘導白細胞介素10之生成的能力係高於陰性對照組誘導白細胞介素10之生成的能力，其被表示為歸一化的增加，所述歸一化的增加係由申請專利範圍第1項所界定的步驟來確定。
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