KR102084825B1 - 유아의 과도한 울음용 프로바이오틱 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다른 특징 가운데 장관에서 감염을 감소시키는 인터루킨-10의 생성을 유도하는 능력을 갖는 10⁴ 내지 10¹² cfu/g의 페디오코쿠스 펜토사세우스 세포를 포함하는 박테리아 조성물을 제공한다. 따라서, 박테리아 조성물은 유아의 과도한 울음을 개선하는데 유용하다. 특히, 페디오코쿠스 펜토사세우스 세포는 CECT 8330으로서 기탁된 균주로부터 초래한다. 박테리아 조성물은 식품 보조제, 약제, 유아용 조제분유, 식용 제품 및 식료품의 형태일 수 있다. 특히, 조성물은 유성 현탁액의 형태로 유아용 식품 보조제의 형태일 수 있다.

Description

유아의 과도한 울음용 프로바이오틱{PROBIOTIC FOR INFANTILE EXCESSIVE CRYING}

본 발명은 의학, 미생물학 및 영양학에 그리고, 특히, 페디오코쿠스 펜토사세우스 세포에 기반한 신규한 프로바이오틱 조성물에 관한 것이다. 생체기능성으로 인해, 조성물은 유아의 과도한 울음을 개선하는데 특히 유용하다.

과도한 울음은 유아 시기 중 처음 12개월에서 소아과 의사를 방문하는 가장 중요한 이유 중 하나이다. 그 발생 비율은 40%까지의 수치에 도달할 수 있다. 3개월이 지나도 울음을 그치지 않는 유아는 나중에 커서 불안, 공격성, 과잉 행동, 알레르기, 수면 장애 및 심지어 심각한 정신 건강의 위험을 포함하는 학창 시절의 부정적 결과의 위험에 처한다. 과도한 울음은 단지 유아에게만 심각한 문제가 아니라 부모에게 그리고 일반적으로 가족 삶의 질에 있어서도 그러하다. 과도한 울음은 부모를 탈진으로 유도하고 집중의 어려움, 인내심 부족, 욕구불만, 무기력한 기분, 어린이를 해칠 위험, 모유수유의 이른 중단 및 어린이와의 면대면 상호작용의 감소를 포함하는 많은 유해한 결과를 가진다. 또한, 일부 경우에 욕구불만은 어린이를 때리거나 흔드는 것과 같은 울음을 멈추기 위해 다소 해로운 행동을 초래할 수 있다.

유아의 울음은 흔히 명백한 병적 상태와 연관되고, 과도한 발작성 울음은 알려지지 않은 병인(예, 유아 산통)의 다른 상태의 결과로서 분명히 건강하고 영양이 충분한 유아에서 어떠한 분명한 이유 없이 나타날 수 있다. 그러한 상태의 기원 및 어떻게 그들이 정의될 수 있는지에 관한 동의는 거의 없다. 그러나 그들이 내장의 미성숙, 경직 결장, 식품 과민증, 바뀐 내장 미생물상 및 가스 생성과 같은 위장 교란에 의해 자주 일어날 수 있다는 것이 제안되었다.

종래적으로, 여러 약물 치료법이 특히 '산통이 있는 유아'에서 울음 및 소란의 감소를 위해 사용되어왔다. 가장 흔히 사용된 약물 중 하나는 시메티콘이지만, 임상적 시도의 결과는 결정적이지 않다. 디사이클로민 하이드로클로라이드 또는 시메트로피움 브로마이드에 기반한 다른 치료는 더 효과적으로 나타났지만, 원치 않는 부작용으로 유도할 수 있어서, 특히 6개월 미만의 유아에서 사용을 제한한다.

과학적 근거가 부족함에도 허브 치료가 제안되었다. 상업적으로 이용가능한 조성물 콜리밀®(마트리카리아 레쿠티아, 포에니컬럼 불가레 및 멜리사 오피시날리스로부터의 식물 추출물을 갖음)은 이중 맹검 플라세보-제어된임상 시험에서 울음 시간을 감소시키는 것으로 나타났다. 반대로, 멘타 피페리타는 유아 산통의 치료에 효과적이지 않은 것으로 보고되어왔다. 게다가, 구토, 수면부족, 변비 및 식욕 감퇴를 포함하는 여러 부작용이 허브 보조제를 평가하는 여러 연구에서 식별되었다.

식품 알레르기를 극복하도록 설계된 유아 조제분유(즉, 낮은 락토오스 함량 또는 부분적으로 가수분해된 유청 단백질을 갖는 조제분유)는 울음 에피소드를 감소시키는 것으로 보고되었다. 그러나, 이들 조제분유는 과도한 울음이 주로 식품 알레르기와 연관된 유아에게 유익할 수 있다. 고섬유 또는 섬유 강화된 조제분유 역시 가능한 치료제로서 제안되어왔지만, 표준 조제분유와 비교해서 증상에서 어떠한 현저한 차이도 발견되지 않았다.

이상 장 미생물상이 과도한 울음 상태에 영향을 줄 수 있다는 가설에 기반해서, 유망한 치료제로서 프로바이오틱스에 관한 큰 관심이 생겨났다. 프로바이오틱스는 특정 양으로 섭취 시에, 내재하는 기본 영양을 뛰어넘는 건강 혜택을 나타내는 "살아있는 미생물"로서 정의된다. 여러 락트산 박테리아 및 속 비피도박테리움 또는 락토바실러스로부터의 종은 특정 건강 혜택을 촉진하는 것으로 나타남을 함축하는 프로바이오틱이다. 프로바이오틱 박테리아는 독성의 부족, 생존 능력, 점착력 및 유리한 효과에 관련된 여러 요구사항을 충족해야만 한다. 이들 프로바이오틱 특징은 동일한 종의 박테리아 사이에서조차 균주 의존적이다. 그러므로, 요구되는 프로바이오틱 기능을 나타내는 이들 균주를 발견하는 것은 중요하다.

과도한 울음의 치료를 위한 몇몇 프로바이오틱 조성물만이 연구되었다. 락토바실러스 람노수스 GG, 락토바실러스 람노수스 LC705, 비피도박테리움 브레베 Bbi99 및 프로피오니박테리움 프레우덴레이치 ssp. 셔마니 JS를 포함하는 프로바이오틱 조제분유의 효험이 울음 패턴에 대한 만족스런 결과 없이 연구되었다(멘툴라, S. 등 "미생물 조성물 및 산통 유아로부터의 분변 발효 최종 생성물-프로바이오틱 보조제 파일럿", 건강 및 질병에서의 미생물 생태학 2008, 20권, 1호, 37-47쪽). 또 다른 연구는 알파-락트알부민-강화된 그리고 프로바이오틱-보충된 조제분유의 산통에 대한 효과를 평가했다(락토바실러스 람노수스, 비피도박테리움 인판티스). 조제분유는 수유 관련된 위장 부작용, 과민성 및 불안이 감소되었지만, 어떠한 차이도 울음 기간에서 발견되지 않았다(뒤퐁, C. 등 "산통을 갖는 유아에서의 A-락트알부민 강화된 및 프로바이오틱-보충된 유아 조제분유: 성장 및 위장 내성" 유럽 임상 영양학지 2010, 64권, 7호, 765-767쪽). 산통 관련된 과도한 울음의 치료를 위한 락토바실러스 레우테리 DSM 17938의 유리한 효과는 WO2007142596에 개시되어있다. 이러한 균주의 효험은 유아 울음에 대한 유리한 결과로 분석되었지만(사비노, F. 등 "락토바실러스 레우테리(미국 타입 배양 수집 균주 55730) 대 유아 산통의 치료에서 시메시콘: 유망한 무작위 추출 연구" 소아학 2007, 119권, 1호: e124-e130; 사비노, F 등 "유아의 산통에서 락토바실러스 레우테리 DSM 17938: 무작위 추출, 이중 맹검, 플라세보-제어된 시도" 소아학 2010, 126권, 3호: e526-e533; 스자제우스카, H 등 "모유수유 유아에서 유아의 산통의 관리를 위한 락토바실러스 레우테리 DSM 17938: 무작위 추출, 이중 맹검, 플라세보 제어된 시도", 소아학지 2012, 162권, 2호, 257-262쪽), 장의 생물다양성을 개선할 수 없었다(루스, S. 등 "락토바실러스 레우테리 DSM 17938로 치료된 산통 유아의 무작위 추출된 DBPC 시도로부터의 분변 샘플에 대한 454 피로시퀀싱 분석", PLoS ONE 2013, 8권, 2호, e56710 1-5).

산통을 갖는 유아의 장 미생물상의 연구에 관한 최근 논문에서, 과도한 울음이 더 높은 레벨의 병원균 및 소염 락토바실리에서의 감소로 인해 증가된 감염에 의해 야기될 수 있다(드 위르스, 씨. 등 "산통을 갖는 유아의 장 미생물상: 전개 및 특정 시그니처" 소아학 2013, 131권, 2호, e550-e558).

WO2007142596은 락토바실러스 레우테리 DSM 17938의 균주는 고량의 소염 사이토킨 IL-10을 촉진하는 능력으로 인해 유아 산통의 치료에서 유용하다.

페디오코쿠스 펜토사세우스 및 페디오코쿠스 아시디락티시는 흔히 야채와 육류의 발효에 흔히 사용되고 식품 부패 박테리아 및 식품매개 병원균의 성장을 억제하는 식품 방부제로서 사료에 첨가된다. 그러나, 인간에서 프로바이오틱으로서 사용을 위한 페디오코쿠스 펜토사세우스에 기반한 마켓에서의 제품이 없다는 것이 믿어진다.

페디오코쿠스 펜토사세우스 균주 유도된 식물은 난백알부민 민감성 쥐의 비장 세포에서 인터페론-감마 및 인터루킨 IL-12 p70, 및 억제인자 IL-4 생성의 분비 레벨의 유도물질로서 개시되어 있다. 그러므로 박테리아는 면역 활동을 효과적으로 자극할 수 있고 그러한 전염증성 사이토킨의 유도로 인한 알레르기 억제 효과를 나타냈다(종아누라쿤, B. 등 "프로바이오틱 용도를 위한 페디오코쿠스 펜토사세우스 NB-17", 생명과학 및 생명공학지 2008 106권, 1호, 69-73쪽).

동일한 방향으로, 이가라시 T. 2010은 균주 페디오코쿠스 펜토사세우스(KKM122)는 전염증성 사이토킨 IL-12의 생성을 강하게 유도한다(이가라시 T. "락트산 박테리아 세포 성분에서의 변화와 염 스트레스 조건 하에 IL-12 생성의 자극 사이의 관계 연구", 생명과학, 생명공학 및 생화학 2010, 74, 2171-2175쪽).

비탈리 등 2012는 27개의 면역 매개체(사이토킨, 케모카인 및 성장 인자)의 합성을 조절하는 능력을 관한, 다른 종에 속하는 락트산 박테리아의 48개의 균주의 연구를 개시한다. 그러한 면역 매개체 가운데, 분석이 IL-10을 검출하도록 준비되었다. 분석은 Caco-2로 수행되었고 PBMC 세포는 LPS로 자극되었다. 결과는 몇몇 케모카인이 자극되었음을 나타냈다. 전염증성 활성을 갖는 면역 매개체(IL-17, 에오탁신 및 인터페론-감마)는 사이토카인 IL-1베타, 케모카인 인터페론-감마-유도된 단백질-10(IP-10), 사이토카인 IL-6, 및 케모카인 매크로파지 염증성 단백질-1알파(MIP-1알파)에 의해 이어지는, 모든 균주에 의해 현저하게 자극되었다. 몇몇 균주만이 소염 활동을 갖는 사이토카인의 합성을 증가시켰다. 테스트된 균주 가운데, 토마토로부터 분리된 페디오코커스 펜토사세우스의 균주는 IL-10을 제외한, 사이토카인 IL-1베타, IL-4, IL-17, 및 인터페론-감마를 자극했다. 면역-조절 활성에 기반해서, 이러한 균주는 신규한 프로바이오틱 균주 후보로서 또 다른 특징화를 위한 연구에서 선택되지 않았다(비탈리, B. 등 "생과일 및 야채로부터 분리된 인간을 위한 신규한 프로바이오틱 후보", 식품 미생물학 2012, 31(1), 116-125쪽).

그러므로, 과도한 발작성 울음은 부모와 유아 모두에게 즉각적이고 매우 심각한 결과를 가질 수 있다. 따라서, 안전하고 효과적인 조성물 및 치료가 요구된다. 이러한 분야에서, 프로바이오틱은 현재의 치료법에 대한 유망한 대안으로서 간주될 수 있지만, 또 다른 조사가 필요하다.

본 발명에 의해 해결될 수 있는 문제는 유아에서 과도한 울음의 개선에 유용한 신규한 조성물 및 치료법을 제공하는 것이다.

해법은 유아의 과도한 울음 개선에 유용한 관련된 생체기능성을 갖는 본 발명자가 발견한 신규한 균주 페디오코쿠스 펜토사세우스에 기반한다.

프로바이오틱 조제분유에서 가장 흔히 사용된 박테리아가 락토바실러스 및 비피도박테리아 속으로부터 비롯된다는 것을 처음에 언급하는 것은 중요하다. 따라서, 페디오코쿠스 속은 프로바이오틱으로서 사용하기에 매우 희귀하고 어린이에게는 더욱 더 드물다.

위에 언급된 바와 같이 선행 기술은 과도한 울음이 증가된 레벨의 병원균에 의해 그리고 소염 락토바실리에서의 감소에 의해 증가된 감염에 의해 야기될 수 있다. 락토바실러스 레우테리 DSM 17938(L. 레우테리 ATCC 55730)이 다량의 소염 사이토카인 인터루킨-10(IL-10)을 촉진하는 능력에 의해 유아 산통의 치료에 유용하다는 것 역시 설명되었다. 따라서, IL-10의 양을 증가시키는 능력은 울음의 개선에 관련된 것처럼 보인다.

그러나, 선행 기술은 이러한 특징을 갖는 페디오코쿠스 펜토사세우스 균주를 설명하지 않았다는 것이 믿어진다. 사실상, 관련된 선행 기술은 본 발명에 완전히 반대 방향에 있는 특징을 갖는 페디오코쿠스 펜토사세우스 균주를 설명한다. 따라서, IL-10의 생성을 유도하는 능력은 페디오코쿠스 펜토사세우스 박테리아의 내재적 또는 고유한 특징이 아니다. 예를 들어, 이가라시 T. 2010은 전염증성 사이토카인 IL-12의 생성을 강력히 유도하는 페디오코쿠스 펜토사세우스(KKM122)의 균주를 개시하고, 따라서 본 발명의 것과는 반대 효과인 감염을 야기한다. 또한, 비탈리 등 2012는 IL-10을 포함하는 27개의 면역 매개체의 결정을 가능하게 하는 광범위한 연구를 개시한다. 그러나, 몇몇 균주만이 소염 활성을 갖는 사이토카인의 합성을 증가시켰고 토마토로부터 분리된 페디오코쿠스 펜노사세우스의 균주가 사이토카인 IL-1베타, IL-4, IL-17, 및 인터페론-감마를 자극했음에도, IL-10에 대해서는 어떠한 효과도 없었다. IL-10을 결정하는 비탈리 등 2012에 사용된 분석이 본 발명에 설명된 것보다 매우 작지만, 현저하게 페디오코쿠스 펜토사세우스의 어떠한 균주도 IL-10을 유도하는 능력을 갖는 비탈리 등 2012에서 식별되지 않는다는 것을 언급하는 것에 관련된다.

요약해서, 이러한 특징을 갖는 박테리아를 위한 선행 기술을 찾을 때, 페디오코쿠스 펜토사세우스는 이러한 특징을 갖는 박테리아 종 가운데 발견되지 않았다. 따라서, 어떠한 선행 기술도 여기에 설명된 바와 같은 장관에서 감염을 감소시키도록 IL-10의 생성을 유도하는 능력을 갖는 10⁴ 내지 10¹² cfu/g의 페디오코쿠스 펜토사세우스 세포를 포함하는 박테리아 조성물을 설명한다는 것이 믿어진다.

놀랍게도, 본 발명자는 IL-10의 생성을 유도하는 능력을 갖는 페디오코쿠스 펜토사세우스의 균주를 발견했다. 선행 기술을 살필 때, 페디오코쿠스 펜토사세우스가 이러한 특징을 가진다는 것은 공지되어 있지 않다.

그러므로, 균주 페디오코쿠스 펜토사세우스 CECT 8330이 여기에 제공된다. 또한, 구체적으로 설명된 스크리닝 방법에 의해, IL-10의 생성을 유도하는 동일한 능력을 갖는, 페디오코쿠스 펜토사세우스 세포의 풀 내의 균주 CECT 8330과는 다른 페디오코쿠스 펜토사세우스의 균주를 식별하고 분리하는 것은 타당성이 있다.

그러므로, 본 발명은 일 측면으로서, 페디오코쿠스 펜토사세우스 CECT 8330의 균주를 제공한다. 본 발명은 과도한 울음의 개선에 관련한 박테리아에서 특정 생물학적 특징; 즉, 가장 관련된 특징으로서 IL-10의 생성을 유도하는 능력을 설명한다. 여기에서 언급된 특징은 유아에서 과도한 울음의 개선에 타당성 있게 관련되어 있다는 것이 실시예에 의해서 나타나 있다. 따라서, 이러한 특징을 갖는 페디오코커스 펜토사세우스의 하나의 균주가 이론에 한정되지 않고 식별됨에도(CECT 8330), 다른 양호한 균주를 얻기 위한 방법의 모든 단계가 여기에 타당성있게 설명되기 때문에 그러한 균주로 본 발명의 범위를 한정할 어떠한 근거도 없다. 그러므로, 본 발명은 또한 동일한 특징을 갖는 균주 CECT 8330과는 다른 페디오코쿠스 펜토사세우스의 균주의 풀을 제공한다. 페디오코쿠스 펜토사세우스 종에 속하는 모든 균주가 IL-10을 유도하는 능력을 갖는 것은 아니다. 본 발명은 그들을 인식하는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명의 제 1측면은 인터루킨-10의 생성을 유도하는 능력을 갖는 10⁴ 내지 10¹² cfu/g의 페디오코쿠스 펜토사세우스 세포를 포함하는 박테리아 조성물에 관한 것이고, 정상화된 증가로서 표현된 페디오코쿠스 펜토사세우스 세포의 존재 하에 THP-1 매크로파지(Tamm-Horsfall Protein-1 macrophages)에 의한 인터루킨-10의 생성은 정상화된 증가가 다음의 단계에 의해 결정될 때, 페디오코쿠스 펜토사세우스 세포의 존재 하에 THP-1 매크로파지인 음성 대조군에 의해 인터루킨-10의 생성보다 더 높다:

(a) 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)를 갖는, 그리고 최종 농도 0.16μM으로 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(Phorbol 12-myristate 130acetate, PMA)를 갖는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute, RPMI) 1640 배지에서, 퍼블릭 헬스 잉글랜드(Public Health England), 카탈로그 넘버 88081201의 세포 수집으로부터 얻어진 THP-1 모노사이트 세포 라인을 성장시키는 것에 의해 매크로파지와 THP-1 모노사이트를 구분짓는 단계;

(b) 최종 농도 10⁶ 매크로파지/웰로 24-웰 엘리사(Enzyme Linked Immunoassay, ELISA) 플레이트에서 10% FBS를 갖는 RPMI 1640 배지에서 THP-1 매크로파지를 성장시키는 단계;

(c) 최종 농도 10ng/ml에서 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)를 갖는 THP-1 매크로파지를 2.5 시간 동안 배양하고, 둘베코의 인산 완충 살린 배지(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline medium, D-PBS)로 THP-1 매크로파지를 세정하는 단계;

(d) 5% CO₂ 대기에서 37℃에서 맨, 로고사 및 샤프(Man, Rogosa and Sharpemedium, MRS)에서 밤새 그것을 성장시키는 것에 의해 준비된 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 배양을 얻는 단계;

(e) 최종 비율 25:1, 즉, 2.5×10⁷cfu의 페디오코커스 펜토사세우스 세포: 10⁶ THP-1 매크로파지를 얻기 위해 10% FBS 및 적절한 양의 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 희석액을 갖는 각각의 엘리사-웰 500㎕의 RPMI 1640 배지에 첨가하는 단계;

(f) 음성 대조군과 동일한 조건에서 37℃에서 2.5 시간 동안 페디오코커스 펜토사세우스 세포를 갖거나 페디오코커스 펜토사세우스 세포 없이 THP-1 매크로파지를 배양하는 단계;

(g) 페디오코커스 펜토사세우스 세포를 제거하도록 D-PBS 배지로 THP-1 매크로파지를 세정하고, 이어서 50㎍/ml 겐타마이신(Gentamicin), 10㎍/ml 암피실린(ampicillin) 및 12㎍/ml 클로람페니콜(chloramphenicol)로 보충된 10% FBS를 갖는 THP-1 매크로파지 RPMI 1640 배지에 첨가하며, 5-7% CO₂에서 37℃에서 배양하고, 그리고 5 및 24시간에서 부분 표본을 얻는 단계;

(h) 부분 표본을 원심분리하고 유동 세포분석법에 의한 인터루킨-10 양화 동안 상청액을 분석하는 단계; 및

(i) 식 (IL10_24h-IL10_5h)/IL10_5h으로 인터루킨-10 농축의 정상화된 증가를 계산하는 단계; IL10_5h 및 IL10_24h는 각각 5 또는 24시간에서 pg/ml에서 인터루킨-10의 농도이다.

따라서, 여기 설명된 구체적 분석을 토대로(IL-10 유도 분석에 관한 실시예 1 참조) 해당 기술분야의 당업자는 관심 있는 페디오코커스 펜토사세우스가 본 발명의 제 1 측면의 IL-10 레벨에 일치하는지 여부를 객관적으로 결정하도록 일상적으로 이러한 분석을 반복할 수 있다. IL-10 유도 레벨에 일치하는 페디오코커스 펜토사세우스 세포 내에서, 기탁된 균주 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330이 여기에 제공된다.

여기에 설명된 신규한 박테리아 조성물은 인간을 위한 그리고 특히 유아를 위한 프로바이오틱 보충제로서 유용하다. 따라서, 본 발명의 제 2 측면은 유아에서 과도한 울음의 개선에 사용을 위해 여기 정의된 바와 같은 박테리아 조성물에 관한 것이다. 이러한 관점에서 어떠한 선행 기술도 유아에서 과도한 울음의 개선에 사용하기 위한 페디오코커스 펜토사세우스 세포를 설명하지 않았다는 것이 믿어진다.

이러한 측면은 유아에서 과도한 울음의 개선을 위해 식품 보충제, 약제, 유아 조제분유, 식용 식품 또는 식료품의 제조를 위한 본 발명의 제 1 측면에서 정의된 바와 같은 박테리아 조성물의 사용으로서 대안적으로 조제될 수 있다. 이것은 본 발명의 제 1 측면에 정의된 바와 같은 유효량의 박테리아 조성물을 언급된 유아에 투여하는 단계를 포함하는, 유아에서 과도한 울음을 개선하기 위한 방법으로서 대안적으로 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 약제로서의 사용을 위해 여기에 정의된 바와 같은 박테리아 조성물이다.

여기에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 긍정적인 방식으로 치료되는 상태를 현저하게 수정할 만큼 높지만 심각한 부작용을 회피할 만큼 낮은(적절한 혜택/위험 비율에서) 조성물에서 각각의 균주에 대한 유닛(cfu)을 형성하는 균락 양이다.

본 발명의 제 3 측면은 비피도박테리움 론검 CECT 7894의 균주에 관한 것이다.

최종으로, 본 발명의 제 4 측면은 다음의 단계를 포함하는 신규한 페디오코커스 펜토사세우스 세포를 스크리닝하고 분리하기 위한 방법에 관한 것이다:

(ⅰ) 위에 설명된 IL-10 유도 분석의 단계에 이어서 IL-10의 생성을 유도하는 능력에 관해 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 풀로부터 신규한 페디오코커스 펜토사세우스 세포를 분석하는 단계; 및

(ⅱ) 정상화된 증가가 IL-10 유도 분석의 단계에 이어서 판단될 때, 음성 대조군의 정상화된 증가보다 더 높은 정상화된 증가로서 표현된 IL-10의 생성을 유도하는 풀로부터 신규한 페디오코커스 펜토사세우스 세포를 선택하고 분리하는 단계.

발명자가 관련된 테스트 분석 더하기 IL-10 레벨의 유도에 일치하는 기탁된 균주 CECT 8330을 개시하면, 해당 기술분야의 당업자가 본 발명의 제 1 측면의 기준에 일치하는 다른 신규한 페디오코커스 펜토사세우스 세포를 선택하는 것이 일상적일 것임은 해당 기술분야의 당업자에게 자명하다.

본 발명은 의학, 미생물학 및 영양학에 그리고, 특히, 페디오코쿠스 펜토사세우스 세포에 기반한 신규한 프로바이오틱 조성물을 제공한다. 생체기능성으로 인해, 조성물은 유아의 과도한 울음을 개선하는데 특히 유용하다.

도 1은 대조군(1, 2) 및 분자 마커(M)로서 페디오코커스 아시디락티시(acidilactici)의 두 개의 균주, 락토바실러스 람노수스 GG(Lactobacillus rhamnosus, LGG), 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus) CECT 8330(8330):의 왼쪽에서 오른쪽으로 Sma-Ｉ(왼쪽) 및 Not-Ｉ(오른쪽) 제한된 유전체 DNA의 펄스-장 겔 전기영동 패턴이다.
도 2는 비피도박테리움 론검 CECT 7894(7894), 피비도박테리아 론검 CECT 4551(4551), 및 분자 마커(M):의 오른쪽에서 왼쪽으로 Xba-Ｉ(왼쪽) 및 Spe-Ｉ(오른쪽) 제한된 유전체 DNA의 펄스-장 겔 전기영동 패턴이다.
도 3은 평균 매일 울음 시간에서 그리고 각각의 에피소드의 기간에서 감소이다. A) 평균 매일 울음 시간에서 감소(일 당 총 울은 분). B) 각각의 에피소드의 평균 기간에서 감소(에피소드 당 분). 플라세보 그룹에서 n=9 및 프로바이오틱 조제분유 그룹에서 n=11에 대해 평균(SEM)의 수단±표준 오차로서 표현된 결과. PLA는 플라세보 그룹에 상응한다. PRO는 프로바이오틱 그룹에 상응한다.

용어 "박테리아 조성물"은 다수의 박테리아 세포를 포함하는 조성물로서 기술분야에 따라 이해될 수 있고 여기서 10⁴ 내지 10¹² cfu/g는 제 1 측면에 따른 관심의 특징을 갖는 페디오코커스 펜토사세우스 세포로부터이다. 박테리아 조성물은 부형제 또는 첨가제와 같은 첨가물을 포함할 수 있다. 그런 후에 박테리아 조성물이 적절한 용기에 포장된다.

용어 "cfu/g"는 조성물에 존재하는 관련 첨가제를 포함하는 바와 같은 조성물의 그램 중량에 관한 것이다. 그것은 박테리아 조성물을 포장하기 위해 사용된 적합한 용기의 중량을 포함하지는 않는다.

본 발명의 제 1 측면은 정상화된 증가가 위에 언급된 단계에 의해 결정될 때 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 존재 하에 THP-1 매크로파지 세포에 의한 IL-10의 생성보다 더 높은 THP-1 매크로파지 세포에 의한 인터루킨-10의 생성을 유도하는 능력을 갖는 10⁴ 내지 10¹² cfu/g의 페디오코커스 펜토사세우스 세포를 포함하는 박테리아 조성물에 관한 것이다.

인간 사이토킨 합성 억제 인자(CSIF)로도 공지된 IL-10은 활성화된 매크로파지에 의해 그리고 헬퍼 T 세포에 의해 생성된 IFN-감마, IL-2, IL-3, TNF, 및 GM-CSF를 포함하는, 다수의 사이토킨의 합성을 억제하는 소염 사이토킨이다. 용어 사이토킨은 세포 시그널링을 위해 사용된 작은 시그널링 분자를 말한다. 사이토킨은 단백질, 펩타이드 또는 글리코단백질로서 분류될 수 있다. 이러한 경우에, IL-10은 면역 조절 특징을 갖는 단백질 사이토킨이다.

특정 실시예에서, 정상화된 증가로서 표현된 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 존재 하에 THP-1 세포에 의한 IL-10의 생성은 정상화된 증가가 위에 언급된 단계에 의해 결정될 때 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 존재 하의 THP-1 세포에 의한 IL-10의 생성보다 적어도 2배 더 높다. 다른 특정 실시예에서, 정상화된 증가는 대조군보다 적어도 3-배, 4-배, 5-배 또는 6-배 더 높다.

또한, IL-10의 생성을 유도하는 능력으로서, 페디오코커스 펜토사세우스 세포는 과도하게 우는 유아에 흔히 풍부한 원치않는 박테리아 종의 원치않는 멤버에 대한 흥미로운 길항작용 특징을 가진다(실시예 2 참조). 용어 "길항작용"은 박테리아 성장의 억제 또는 감소로서 여기에 이해된다. 따라서, 또 다른 특정 실시예에서, 박테리아 조성물의 페디오코커스 펜토사세우스 세포는 그램 양성 및 그램 음성 장 박테리아를 길항하는 능력을 가진다. 특히, 그램 양성 박테리아는 클로스트리디움 디피실 및 엔테로코커스 패칼리스로 구성되는 그룹으로부터 선택된 박테리아를 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 그램 음성 박테리아는 에스케리키아 콜리, 엔테로박터 에어로게네스, 클레프시엘라 옥시토카 및 박테로이데스 불가투스로 구성되는 그룹으로부터 선택된 박테리아를 포함한다. 또 다른 특정 실시예에서, 페디오코커스 펜토사세우스 세포는 클로스트리디움 디피실, 엔테로코커스 패칼리스, 에스케리키아 콜리, 엔테로박터 에어로게네스, 클레프시엘라 옥시토카 및 박테로이데스 불가투스를 길항하는 능력을 갖고, 여기서 길항하는 능력은 다음의 단계에 의해 결정된다:

(ⅰ) 옥소이드 배지를 포함하는 플레이트에서 균일하게 병원균 균주를 닦아내고 각각의 병원균의 성장 동안 적절한 온도 및 %CO₂에서 CO₂ 배양기에 일치하여 성장하는 단계;

(ⅱ) (a) 병원균 시드된 플레이트에 대해 하나의 실린더 섹션의 성장 측면; 및 (b) 병원균 시드된 플레이트에 대해 다른 실린더 섹션의 비성장된 측면 모두를 대면하는 병원균 시드된 플레이트와 접촉하는 페디오코쿠스 펜토사세우스 세포의 균일하게 시드된 융합 아가 플레이트의 두 개의 6mm 직경 실린더 섹션을 위치시키고; 37℃에서 밤새 배양하는 단계;

(ⅲ) 평평한 룰에 걸쳐 아가 플레이트를 위치시키는 것에 의해 억제 구역을 다음날 측정하는 단계; 및

(ⅳ) 식 GI=(IZD-CD)/2가 이어지는, 센티미터로 측정된 억제 구역 직경(IZD)으로부터 실린더 직경(CD)을 감산하는 것에 의해 성장 억제 활성을 계산하고 2로 이러한 차이를 나누는 단계.

특정 실시예에서, 페디오코커스 펜토사세우스 세포는 수탁 번호 CECT 8330 하에 스페인 타입 배양 수집에 기탁된 페디오코커스 펜토사세우스로부터 비롯된다.

페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330

신규한 페디오코커스 펜토사세우스 균주의 샘플은 스페인, 08193-벨라테라, 캠퍼스 유에이비, 오피스 피1M1.1, 에디피시 유레카에 위치된 기탁자 AB-바이오틱스 에스.에이.에 의한 스페인, 발렌시아, 파테르나 46980, 9, 카테드라티코 오거스틴 에스카르디노, 파르크 시엔티픽 유니베르시타트 드 발렌시아, 에디피시오 3 큐에서 CECT(콜레시온 에스파놀라 드 컬티보스 티포)에 기탁되었다. 균주는 2013년 4월 30일의 기탁 일자를 갖는 수탁 번호 CECT 8330 하에 기탁되었다. 기탁은 특허 절차상의 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약의 조건 하에 이루어졌다. 기탁자에 의해 주어진 식별 부호는 F3403이었다.

아래의 예시에 나타난 바와 같은, 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330은 유아에서 과도한 울음의 개선을 위한 다음의 흥미로운 특징을 나타낸다:

표 1, 실시예 1에 도시된 바와 같은 IL-10 생성을 유도하는 능력.

연구된 병원균의 모든 스펙트럼에 대한 억제 활성(표 2, 실시예 2). 균주는 그램 양성뿐만 아니라 그램 음성 박테리아를 억제하기에 효과적이다. 이것은 과도한 울음을 나타내는 유아에서 비정상적으로 풍부한 이. 콜리, 클레프시엘라 및 클로스트리디움 spp.와 같은 박테리아에 대한 보호를 제공함에 따라 커다란 관심이 있다.

에탄올 및 CO₂의 어떠한 생성도 없고, 따라서 유아에 교란을 야기하지 않는다.

또한, 균주 CECT 8330은 프로바이오틱으로서 특히 유용한 이점을 가진다. 프로바이오틱 박테리아는 독성의 부족, 생존력, 점착력 및 이로운 효과에 관련된 여러 요구사항을 충족시켜야만 한다. 각각의 박테리아 균주의 특징은 고유하고 동일한 종의 다른 균주로 추정될 수 있다. 그러므로, 모든 프로바이오틱 요구사항에서 더 양호한 성능을 갖는 이들 균주를 발견하는 것이 중요하다. 균주 CECT 8330이 위장(GI)관을 극복할 수 있다는 것을 보장하기 위해, 인 비트로 프로토콜은 조건을 모방하도록 개발되었다. 리소자임, 과산화수소, 산성 환경 및 담즙산염으로의 처리 후에 생존이 정량화되었다. 균주가 매우 높은 희석액을 사용하여 인간의 분변으로부터 분리되고 분변에서 그들의 존재가 높기 때문에 확증적인 실험이다. 결과는 그 균주가 GI관을 통과하여 생존할 수 있다는 것을 나타낸다.

균주 CECT 8330은 또한 장관을 균락화하는 능력에 대해 분석되었다. 이것은 관찰된 생체기능이 균주에 의해 전개될 수 있다는 것을 보장하기 때문에 중요한 포인트이다. 실험 개발에서 장 점막 및 카코-2 세포가 사용되었고, 그것은 프로바이오틱 균주의 결장 앵커리지 사이트를 모방한다. 균주의 점착 능력은 트리티움-라벨링된 티미딘의 신틸레이션으로부터 측정되고 대조군으로서 사용된 락토바실러스 레우테리 균주의 이들과 비교되었다. 점액 세포 점착력 및 카코-2 세포 점착력은 각각 1.40×10⁶ 및 4.5×10⁶ cfu/cm²(L. 레우테리: 6.58×10⁶ 및 1.01×10⁶ cfu/cm²)였다. 따라서, 결과는 CECT 8330이 L. 레우테리에 비해, 장 상피에 대한 양호한 점착력을 가져서, 그것이 장관에 남고 프로바이오틱 효과를 나타내는 것을 허용함을 나타낸다.

균주 CECT 8330은 산업 배지에서 양호한 성장을 가진다.

또한, 균주 CECT 8330은 QPS 상태를 갖는 박테리아 종에 속한다(안드레오레티, O. 등 "식품 또는 사료에 의도적으로 첨가된 QPS 미생물의 목록의 유지. 질문 번호: EFSA-Q-2008-006", EFSA 저널 2008. 923: p.1-48). QPS("안전에 관한 검증된 추정")는 명백한 안전 사용의 증명된 긴 역사를 갖는 분류학적 단위에 상태를 부여하는 유럽 식품 안전 협회에 의해 개발된 시스템이다.

비피도박테리움 론검 CECT 7894

또 다른 특정 실시예에서, 박테리아 조성물은 비피도박테리움 론검 CECT 7894의 10⁴ 내지 10¹² cfu/g 세포를 더 포함한다.

신규한 비피도박테리움 론검 균주의 샘플은 스페인, 08193-벨라테라, 캠퍼스 유에이비, 오피스 피1M1.1, 에디피시 유레카에 위치된 기탁자 AB-바이오틱스 에스.에이.에 의한 스페인, 발렌시아, 파테르나 46980, 9, 카테드라티코 오거스틴 에스카르디노, 파르크 시엔티픽 유니베르시타트 드 발렌시아, 에디피시오 3 큐에서 CECT(콜레시온 에스파놀라 드 컬티보스 티포)에 기탁되었다. 균주는 2011년 3월 20일의 기탁 날짜를 갖는 수탁 번호 CECT 7894 하에 기탁되었다. 기탁은 특허 절차상의 미생물기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트조약의 조건 하에 이루어졌다. 기탁자에 의해 주어진 식별 부호는 Bif F2였다.

균주 비피도박테리움 론검 CECT 7894는 또한 실시예에 도시된 바와 같이 유아에서 과도한 울음의 개선을 위한 흥미로운 특징을 가진다:

표 1, 실시예 1에 도시된 바와 같은 IL-10 생성을 유도하는 능력.

연구된 병원균의 모든 스펙트럼에 대한 억제 활성(표 2, 실시예 2). 균주는 그램 양성뿐만 아니라 그램 음성 박테리아를 억제하기에 효과적이다. 균주 CECT 8330에 관한 언급을 참조하자.

에탄올 및 CO₂의 생성이 없고, 따라서 유아에게 교란을 일으키지 않는다.

페디오코커스 펜토사세우스 균주 CECT 8330에 대해서 말하면, 비피도박테리움 론검 CECT 7894는 또한 위장(GI)관을 극복하는 능력에 대해 분석되었다. 결과는 균주가 GI관의 통과하여 생존할 수 있다는 것을 나타냈다.

균주 CECT 7894는 또한 장관을 균락화하는 능력에 대해 분석되었고 페디오코커스 펜토사세우스에 대해 위에 언급된 분석이 이어졌다. 균주 CECT 7894에 관한 점액 세포 점착력 및 카코-2 세포 점착력은 각각 1.21×10⁵ 및 1.18×10⁶ cfu/cm²였다(L. 레우테리: 6.58×10⁶ 및 1.01×10⁶ cfu/cm²). 따라서, 결과는 CECT 7894가 L. 레우테리에 비해, 장 상피에 대해 양호한 점착력을 가져서, 그것이 장관에 남아있고 프로바이오틱 효과를 나타내는 것을 허용함을 나타낸다.

균주 CECT 7894는 또한 산업적 배지에서 양호한 성장을 가진다.

그러므로, 모든 균주, 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330 및 비피도박테리움 론검 CECT 7894는 단일 식에서 분리해서 또는 함께 균주를 사용하는 것에 의해, 그들을 유아에서 과도한 울음의 개선에서 사용하기에 적합하게 하는 다양한 기능적 특징을 공유한다. 다른 특징 가운데, 그들 모두는 IL-10 생성을 유도하는 능력을 갖고, 그들은 장 박테리아의 성장을 억제하기에 효율적이다(그램 양성뿐만 아니라 그램 음성 박테리아).

또한, 균주는 가스를 생성하지 않는다는 이점을 가진다. 헤테로발효 박테리아는 글루코스 발효에 의해, 락트산은 물은, CO₂ 및 에탄올을 생성한다. 에탄올은 산통 유아의 복부 팽만 특징을 생성하는 장운동에 영향을 줄 수 있다. CO₂는 산통 유아에 역시 일반적인, 고장(가스의 축적) 및 속이 부글거림을 유도할 수 있다. 산통 유아에서 헤테로발효 균주의 더 높은 존재가 설명되었다. 반대로, 본 발명의 균주는 CO₂는 물론 에탄올을 생성하지 않고 따라서 이러한 관점에서 유아에 교란을 일으키지 않는다.

해당 기술분야의 당업자에게 명백할 바와 같이, 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330 및 비피도박테리움 론검 CECT 7894는 단독으로 사용될 때 또는 단일 조성물로 결합될 때 효과적이다. 그들은 또한 시간의 특정 기간 후에 동시에, 순차적으로 또는 분리하여 투여된 2개의 다른 조성물로 투여될 수 있다.

위에 설명된 특징을 고려할 때, 박테리아 조성물은 과도한 울음에 관련된 임상적 증상의 일부의 개선으로 유도하는 울음의 앞서 언급된 발생에서 생리적 개선을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 박테리아 조성물은 유아에서 과도한 울음의 개선에 특히 유용하다. 용어 "과도한 울음"은 적어도 1주 동안 관찰된 (3 이상의 에피소드에서) 일당 적어도 60분을 함축하는 정상 가족 단위 기능화에 문제적인, 극심한, 지속적인 그리고 매우 슬픈 울음로서 이해된다.

용어 "유아"는 인간 또는 동물의 매우 젊은 자손으로서 본 설명에서 이해될 수 있다. 인간에 적용될 때, 용어는 용어 "아기"와 동의어로 간주된다. 용어 "어린이"는 탄생 및 사춘기의 단계 사이의 인간을 말한다. "어린이"는 또한 "아들" 및 "딸"의 동의어로서 부모와의 관계를 설명한다. 그러나 이러한 설명에서, 용어 "유아", "아기" 및 "어린이"는 동의어로 간주되고 상호교환적으로 사용된다.

특정 실시예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 유아 산통에 연관된 과도한 울음의 개선에 유용하다. 용어 "유아 산통"은 부모에게 고통을 일으키는 설명할 수 없는 그리고 매우 슬픈 울음("신경질적인")으로서 여기에 이해된다. 용어 "신경질적인"은 부모 및 의사가 울음의 타입을 카테고리화하는 어려움 때문에 매우 주관적 측정이다. 게다가, 과도한 울음 행위(진정시키기 쉽든 그렇지 않든)는 산통을 나타낼 수 있다. 결과적으로, 산통 유아의 가장 자주 언급된 포함 기준 중 하나는 적어도 1주 동안 하루에 3시간 이상의 울음과 같은 시간 규칙(즉, 웨슬의 기준)에 기반한다(사비노, 에프. 등 2010 수프라).

본 발명의 또 다른 실시예에서, 유아는 3주 내지 12개월의 나이를 가진다.

20명의 유아로 이루어진 시험적 임상 실험이 균주 CECT 8330 및 CECT 7894의 혼합물에 기반한 제품의 효험 및 안전성을 평가하기 위해 수행되었다(실시예 7 참조). 플라세보 및 균주의 혼합물은 14일 동안 하루에 한번(5 방울/일) 투여되었다. 도 3에 보여질 수 있는 바와 같이, 프로바이오틱 조제분유는 평균 매일 울음 시간에서 그리고 각각의 에피소드의 기간에서 더 큰 감소를 야기했다. 어떠한 부작용도 플라세보 또는 프로바이오틱 그룹에서 관찰되지 않아서, 프로바이오틱 조제분유가 안전한 것으로 간주될 수 있다는 것을 확인했다. 그렇기 때문에, 균주의 혼합물은 울음 패턴을 개선하기에 유용하다.

위에 설명된 박테리아 조성물의 관련된 특징으로부터, 박테리아 조성물의 투여가 유도되고, 그것은 또한 면역 시스템의 미성숙화의 결과로서 감염에 연관된 위장 교란에 의해 특징화된 다른 상태를 치료하기에; 장 과민증을 치료하기에 그리고 장에서 원치않는 박테리아의 균형 초과에 유용하다.

위에 언급된 특징을 고려할 때, 균주 CECT 8330 및 7894는 해당 기술분야에 공지된 상업적 균주와 비교할 때 과도한 울음에 관련해서 연구된 파라미터에 대해 양호한 성능을 가진다. 아래의 실시예에 도시된 바와 같이, 균주 CECT 8330은 락토바실러스 레우테리 균주 중 하나와 비교해서, IL-10 생성의 유도에 관련된 양호한 정상화된 증가를 나타냈다. 또한, 본 발명의 균주는 모든 연구된 병원균의 스펙트럼에 대해 억제 활성을 나타냈다. 본 발명의 균주는 그램 양성뿐만 아니라 그램 음성 박테리아를 억제하기에 효과적이었다. 이것은 E. 코일 및 B. 불가투스의 성장을 억제하기에 효율적이지 않은 L. 레우테리의 경우에는 아니었다. 이것은 과도한 울음을 나타내는 유아에 흔히 존재하는 E. 콜리와 같은 비정상적인 양의 박테리아로서 큰 관심이 있다. 일반적으로, CECT 8330 및 특히 CECT 7894는 L. 레우테리에 비해 거의 모든 병원균 박테리아의 성장을 억제하기에 더 효율적이라는 것 역시 언급될 가치가 있다. 게다가, 균주 CECT 8330 및 CECT 7894가 가스를 생성하지 않는 반면에 L. 레우테리는 가스를 생성했다.

IL-10 생성의 유도를 측정하기 위한 분석

여기서 실시예 1을 작동하는 것은 본 발명의 제 1 측면의 단계 (a)-(i)에 대해 언급됨에 따라, IL-10 생성의 유도를 측정하기에 적합한 분석의 구체적인 설명을 제공한다. 제 1 측면의 단계 (a)-(i)에 그리고 실시예 1에 개시된 IL-10 유도 분석의 설명 및 조건은 본 발명의 범위를 한정하지 않는다는 것을 언급하는 것에 관련된다. 분석은 IL-10 생성을 유도하는 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 능력을 시험하기에 적합한 것이다. 이러한 실시예 1의 구체적인 조건은 관심의 페디오코커스 펜토사세우스 세포가 제 1 측면의 기준에 일치하는지 여부를 결정하는 바람직한 분석을 여기에 형성한다.

따라서, 여기에 설명된 구체적인 분석에 기반해서, 해당 기술분야의 당업자는 관심의 페디오코커스 펜토사세우스 세포가 제 1 측면의 IL-10 생성에 일치하는지 여부를 주관적으로 결정하는 이러한 분석을 반복적으로 반복할 수 있다.

설명된 분석이 사용될 때, 제 1 측면에 따라서, 정상화된 증가로서 표현된 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 존재에서 THP-1 세포에 의해 생성된 IL-10의 레벨은 대조군보다 더 높다. 여기에 이해된 바와 같은 그리고 제 1 측면에 따른 대조군은 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 부재 하에 THP-1 세포에 의해 생성된 IL-10의 정상화된 증가이다. 특정 실시예에서 페디오코커스 펜토사세우스의 존재에서 THP-1 세포에 의해 생성된 IL-10의 레벨은 대조군의 적어도 2배 레벨이다. 다른 특정 실시예에서, 정상화된 증가는 대조군보다 적어도 3배, 4배, 5배 또는 6배 더 높다.

장 박테리아에 대한 길항작용 능력을 측정하는 분석

여기에 실시예 2를 작동하는 것은 본 발명의 일 실시예에 언급된 바와 같이, 장 박테리아를 길항하는 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 능력을 측정하기에 적합한 분석의 구체적인 설명을 제공한다. 실시예 2에 개시된 분석의 설명 및 조건은 본 발명의 범위를 한정하지 않는다는 것을 언급하는 것에 관련된다. 그 분석은 장 박테리아를 길항하는 페디오코커스 펜토사세우스 세포의 능력을 시험하기에 적합한 것이다.

따라서, 여기에 구체적인 분석 설명에 기반해서 해당 기술분야의 당업자는 관심의 페디오코커스 펜토사세우스 세포가 위에 설명된 박테리아 스펙트럼에 일치하는지 여부를 주관적으로 결정하는 이러한 분석을 일상적으로 반복할 수 있다; 즉 클로스트리디움 디피실, 엔테로코커스 패칼리스, 에스케리키아 콜리, 엔테로박터 에어로게네스, 클레프시엘라 옥시토카 및 박테로이데스 불가투스를 길항할 수 있다.

조성물 및 투여 형태

본 발명의 특정 실시예에서, 위에 정의된 바와 같은 박테리아 조성물은 식품 보충제, 약제, 유아 조제분유, 식용 제품 및 식료품으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 형태이다.

본 발명의 박테리아 조성물은 본 발명의 조성물을 형성하는 박테리아 세포의 생존력에 부정적 영향을 주지 않는 임의의 적합한 형태로 제조될 수 있다. 조성물의 특정 목적의 관점에서 제조를 위한 첨가제의 선택 및 가장 적절한 방법은 약학적 그리고 식품 기술의 분야에서 통상의 기술자의 범위 내에 있다.

본 발명에 따른 박테리아 조성물은 박테리아 세포는 활성제이거나 하나 이상의 다른 활성제와 혼합되거나 그리고/또는 식료품의 경우에 약학적으로 적합한 첨가제 또는 적절한 첨가물 또는 성분과 혼합되는 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 특정 실시예에서, 조성물은 하나 이상의 또 다른 활성제를 추가로 포함한다. 바람직하게, 추가적인 활성제 또는 제제는 본 발명의 조성물을 형성하는 박테리아 세포에 길항하지 않는 다른 프로바이오틱 박테리아이다. 제제에 따라, 박테리아 세포는 정제된 박테리아로서, 박테리아 배양으로서, 박테리아 배양의 일부로서, 후 처리된 박테리아 배양으로서, 그리고 단독으로 또는 적절한 부형제 또는 성분과 함께 첨가될 수 있다.

박테리아 조성물은 약학 제품의 형태일 수 있다. 용어 "약학 제품"은 활성 성분, 본 경우에, 약학적으로 적절한 첨가제와 함께 박테리아 세포를 포함하는 임의의 조성물을 포함하는 본 설명에서 넓은 의미로 이해된다. 용어 "약학 제품"은 약제를 말하는 것으로 한정되지 않는다. 여기에 사용된 바와 같은 용어 "약학적으로 허용가능한"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 타당한 혜택/위험 비율에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 대상(예, 인간)의 조직에 접촉해서 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 용량 형태에 속한다. 각각의 부형제, 첨가제 등은 또한 본 제제의 다른 성분과 호환하는 관점에서 "허용가능해야"만 한다. 적절한 부형제, 첨가제 등은 표준 약학 텍스트에서 발견될 수 있다.

약학 제품은 제품 승인 루트에 따라 그리고 또한 국가에 따라 다른 형태 또는 이름을 채택할 수 있다. 예를 들어, 약제는 특정 약제품이다. 의료 식품은 또 다른 특정 약제품으로서 본 설명에서 간주된다. 용어 "의료 식품" 또는 "특별한 의료 목적을 위한 식품"은 일부 국가에서 정상 식사 단독에 의해 충족될 수 없는 독특한 영양적 필요를 갖는 질병의 식사 관리를 위해 특수하게 제조되고 의도된 식품을 말하도록 사용된다. 그들은 미국 식품의약국의 1988 희귀의약품 조례 조정, 및 유럽에서 커미션 디렉티브 1999/21/EC와 같은 조절에서 정의된다. 의료 식품은 식품 보조제의 더 넓은 카테고리와 그리고 건강 문제를 포함하는 전통 식품과 구분된다. 따라서, 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 의료 식품이다.

종종, 여기 개시된 것과 같은 프로바이오틱 박테리아 조성물은 식품 보충제로서 간주된다. 식사 보충제 또는 영양 보충제로도 공지된 식품 보충제는 또 다른 특정 약제품으로 간주된다. 이것은 일반적으로 정상 식사에서 섭취되지 않거나 충분한 양으로 소비되지 않을 수 있는 식사를 보충하고 영양 또는 유익한 성분을 제공하도록 의도된 준비이다. 대체로, 식품 보충제는 식제품으로서 간주되지만, 때때로 그들은 약물, 천연 건강 제품, 또는 건강기능성 제품으로서 정의된다. 본 발명의 관점에서, 식품 보충제는 또한 약효식품을 포함하다. 식품 보충제는 일반적으로 "일반의약품"으로, 즉, 처방전 없이 판매된다. 식품 보충제가 알약 또는 캡슐의 형태를 채택한다면, 그것은 약제에 사용된 바와 동일한 첨가제를 포함한다. 그러나 식품 보충제는 또한 일부 영양소가 첨가된 식료품의 형태를 채택할 수 있다(예, 유아 조제분유).

따라서, 특정 실시예에서, 본 발명의 조성물은 식품 보충제 그리고 더 구체적으로 유아 식품 보충제이다.

본 발명에 따른 조성물은 적절한 식용 액체 또는 고체로서 투여되거나 그들과 혼합되거나, 정제, 알약, 캡슐, 캔디, 그래뉼, 분말, 현탁액, 사세, 시럽의 형태로 또한 일반적으로 단위 용량의 형태로 동결 건조될 수 있다. 그것은 또한 투여 전에 혼합되는 분리 액체 컨테이너와 함께 나타난 동결 건조된 조성물의 모노도세스의 형태일 수 있다.

매우 어린 나이의 유아의 맥락에서, 투여는 몇몇 투여 형태로 제한된다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 본 발명의 박테리아 조성물은 단독으로 투여되거나 액체와 혼합되는 유성 현탁액의 형태이다. 유성 현탁액은 올리브 오일, 옥수수 오일, 대두유, 아마인유, 해바라기유 또는 겨기름과 같은 적어도 하나의 식용 오일을 포함한다. 오일은 적어도 70% weight/weight의 양으로 존재한다. 특정 실시예에서, 유성 현탁액은 또한 0.1-15% w/w의 양으로, 유화제, 안정제 또는 해산제인 적어도 하나의 첨가제를 포함한다. 적절한 제제는 실리콘 다이옥사이드, 실리카겔, 콜로이달 실리카, 침전 실리카, 탈크, 마그네슘 실리케이트, 레시틴, 펙틴, 스타치, 수정된 스타치, 곤약 검, 크산탄 검, 젤란검, 카리기닌, 알긴산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트 또는 글리세롤 모노올레이트 및 모노- 또는 디글리세리드의 시트르산 에스테르와 같은 지방산의 모노- 또는 디글리세리드이다.

유성 현탁액은 해당 기술분야의 당업자에게 공지된 기법에 따라 공지된 기계류를 사용하여 제조된다. 주어진 양의 오일이 교반 및 가열 수단이 제공된 컨테이너에 도입된다. 이어서 적어도 하나의 첨가제가 교반 하에 첨가되고 필요하다면 완전한 균질화까지 덩어리 및 집합체의 형성을 회피하도록 20 내지 50℃의 온도로 약간의 가열한다. 현탁액이 실온까지 냉각되고 고체 형태로 박테리아 세포가 현탁액의 완전한 균질화까지 교반 하에 점차로 첨가된다.

특히, 본 발명의 박테리아 조성물은 유성 현탁액의 형태로 유아 식품 보충제의 형태이다. 특정 실시예에서 유성 현탁액은 바람직하게 1중량%의 해바라기유 및 콜로이드 실리카, 및 박테리아 세포를 포함한다.

또 다른 실시예에서 유성 현탁액은 해바라기유 및 레시틴, 지방산의 모노- 또는 디글리세리드, 카라기닌 및 알긴산 나트륨, 및 박테리아 세포로부터 선택된 제제를 포함한다.

본 발명의 박테리아 조성물은 또한 유아의 경우에 유제품과 같은 다양한 식료품 또는 식용 제품에 포함될 수 있다. 용어 "식용 제품"은 동물에 의해 섭취될 수 있는 임의 형태의 제시에서, 임의 유형의 제품을 포함하는, 가장 넓은 의미에서 여기에 사용된다; 즉, 감각기관에 의해 허용가능한 제품. 용어 "식료품"은 또한 신체를 위한 영양 지지를 제공하는 식용 제품으로서 이해된다. 특히 흥미로운 식료품은 식품 보충제 및 유아 조제분유이다. 식제품은 바람직하게 오트밀 죽, 락트산 발효 식품, 저항성 전분, 식이 섬유, 탄수화물, 단백질 및 당화 단백질과 같은 부형제 물질을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명의 박테리아 세포는 유아 조제분유를 구성하는 시리얼 또는 분유와 같은 다른 성분으로 균질화된다.

따라서, 본 발명의 박테리아 조성물이 조성물의 형태에 상관없이; 즉, 약학 제품, 약제, 식료품, 식용 제품, 식품 보조제, 또는 의료 제품인 것에 상관없이 유아에서 과도한 울음의 관리에 유용하다는 것이 이해되어야만 한다.

박테리아 세포 성장, 돌연변이 및 용량

박테리아는 적절한 배지에서 그리고 적절한 조건 하에 그들을 배양하는 것에 의해 성장된다. 본 발명의 박테리아 세포는 순배양을 형성하도록 단독으로, 또는 다른 미생물과 함께 혼합된 배양으로서, 또는 분리하여 다른 타입의 박테리아를 배양하고 그런 후에 원하는 비율로 그들을 결합하는 것에 의해 배양될 수 있다. 배양 후에, 세포 현탁액이 회수되고 약학 또는 식료품의 제조에 더 사용되도록 예를 들어, 농축, 탈수, 분무- 또는 동결-건조하는 것에 의해 그와 같이 사용되거나 원하는 방식으로 처리된다. 때때로 프로바이오틱 제조는 유통기한을 개선하기 위해 부동화 또는 캡슐화 공정을 목적으로 한다. 박테리아의 부동화 또는 캡슐화를 위한 여러 기법이 해당 기술분야에 공지되어 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 여기에 설명된 신규한 균주 또는 "그것의 돌연변이"에 관한 것이다. 출발 물질로서 기탁된 균주를 사용하는 것에 의해, 해당 기술분야의 당업자가 일상적으로 종래의 돌연변이유발 또는 재분리 기법에 의해, 본 발명의 조성물을 형성하는 균주의 여기 설명된 관련 특징 및 이점을 적어도 유지하는 또 다른 돌연변이 또는 그것의 유도체를 얻을 수 있다는 것은 명백하다. 따라서, 용어 "그것의 돌연변이"는 출발 물질로서 기탁된 균주를 사용하는 것에 의해 얻어진 돌연변이 균주에 관한 것이다. 일 실시예에서, 돌연변이는 재조합 DNA 기술을 사용하는 것에 의해 얻어진다. 본 발명의 제 1 측면의 또 다른 실시예에서, 돌연변이는 무작위 돌연변이유발에 의해 얻어진다. 본 발명의 제 1 측면의 특정 실시예에서, 변종은 자연적으로 발생하는 변종이다. 이것은 출발 균주로서 여기 기탁된 균주 중 하나를 사용하고, 기탁된 균주의 돌연변이를 구성하며 그리고 신규한 균주를 분리하는 단계를 포함하는 대안적으로 균주를 얻기 위한 방법으로서 제조될 수 있고, 여기서 균주는 기탁된 균주의 핵심적 특징을 유지한다.

박테리아 세포의 유효량은 해당 기술분야의 당업자에 의해 결정될 수 있고 얻어지는 특정 목적, 치료받는 환자의 나이 및 물리적 상태, 근본적인 장애의 심각성, 및 최종 제형에 따라 변할 것이다. 경구로 투여될 때, 본 발명의 균주는 현재의 제정법에 따라 10⁷ 내지 10¹² cfu, 바람직하게 10⁹ 내지 10¹¹ cfu의 유효한 매일 용량이 주어지는 양으로 조성물에 존재한다. 표현 "집락 형성 단위"("cfu")는 아가 플레이트 상의 미생물 수에 의해 드러난 바와 같이 박테리아 세포의 수로서 규정된다. 본 발명의 조성물의 형태에서 사용될 때, 다른 균주는 바람직하게 1:1의 농도 비율로 있다.

본 발명의 균주의 일반적인 사용은 생균의 형태로 있다. 그러나, 그것은 또한 죽은 배양 또는 세포 용해물과 같은 비생균(예를 들어, 죽은 또는 용해 박테리아의 다른 수단 가운데 변경된 pH, 초음파 분해, 방사선, 온도 또는 압력에 대한 노출에 의해 얻어짐) 또는 본 발명의 균주에 의해 생성된 유리한 요소를 포함하는 조성물로 확장될 수 있다.

설명 및 청구항에 걸쳐 단어 "포함하다" 및 그것의 변형은 다른 기술적 특징, 부가, 구성요소, 또는 단계를 배제하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 부가적 목적, 이점 및 특징은 설명의 검토 시에 해당 기술분야의 당업자에게 명백해질 것이고 또는 본 발명의 실시에 의해 얻어질 수 있다. 또한, 본 발명은 여기에 설명된 특정 및 바람직한 실시예의 모든 가능한 조합을 다룬다. 다음의 실시예 및 도면은 도시의 목적을 위해, 그리고 본 발명을 한정하도록 의도하지 않고 여기에 제공된다.

실시예

균주 락토바실러스 레우테리 ATCC 55730은 일부 실험에서 대조군으로서 사용된다.

실시예 1. 장 점막 모델에서 IL-10 생성을 유도하는 능력의 인 비트로 평가

소화관의 면역 시스템과의 상호작용을 초래하는 박테리아 균주의 면역조절 능력(종종 소화관 연관된 림프양조직, GALT로 언급됨)이 연구되었다. 더 구체적으로, 박테리아 균주가 염증성 장관을 감소시키는 소염 IL-10의 생성을 유도하는 능력을 가지는지 여부를 테스트하는 것이 추구되었다. 이를 위한 분자 토대는 페이에르판에 존재하는 수상돌기세포 상에 발견될 수 있는 TLR-2 및 TLR-4를 갖는 프로바이오틱 세포 표면 수용체(톨 유사 수용체)의 상호작용이다.

THP-1 세포 라인

선택된 모델은 TLR-2 및 TLR-4를 나타내는 세포 라인 THP-1이었다. 이러한 모델은 리포폴리사카라이드- LPS-(염증성 반응의 유도인자로서)와 같은 박테리아 구성요소에 민감하고, 소염제 사이토킨 패턴의 생성의 유도에 적합한 배지에 분자가 있을 때 사이토킨 생성을 조절하는데 민감하다.

해당 기술분야에 따른 용어 "THP-1 세포 라인"은 급성 단구성 백혈병 환자로부터 유도된 인간 단구성 세포 라인에 관한 것이다. 그것은 단백질-단백질 상호작용의 면역 조직 화학 분석, 및 면역 조직 화학에서 백혈병 세포 라인을 테스트하도록 사용된다.

THP-1 세포 라인은 퍼블릭 헬스 잉글랜드(카탈로그 번호 88081201)의 세포 수집으로부터 얻어졌다. 본 출원의 출원 날짜에 제공자 퍼블릭 헬스 잉글랜드(www.hpacultures.org.uk)로부터의 88081201에 관한 제품 카탈로그는 THP-1 세포: "인간 단구성 백혈병. 급성 단구성 백혈병을 갖는 1살 된 남아의 말초 혈액으로부터 유도된다"에 관련해서 읽힌다.

배지 및 LPS

THP-1 단핵구는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI) 1640 배지 + 10% 소태아혈청(FBS)에서 성장되었다. RPMI는 표준 상업적으로 이용가능한 RPMI 1640, 지브코로부터의 참조번호 61870-101)이었다. FBS는 또한 지브코로부터였다.

THP-1 단핵구는 최종 농도 0.16μM으로 성장 배지 5mg의 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA, 시그마로부터 참조번호 P8139)에 첨가하고 대략적으로 72시간 동안 배양하는 것에 의해 매크로파지로 분류되었다.

박테리아 균주는 MRS 배지에서 성장되었다. 표준 상업적으로 이용가능한 맨, 로고사 및 샤프 MRS, 브로스 옥소이드 참조번호 CM0359)였다.

THP-1 매크로파지는 염증성 반응을 유도하는 LPS로 자극되었다. 리포글리칸으로도 공지된, 리포폴리사카라이드(LPS)는 공유 결합에 의해 결합된 리피드 및 폴리사카라이드로 구성되는 큰 분자이고; 그들은 그램 음성 박테리아의 외막에서 발견되고, 내독소로서 작용하며 동물에서 강한 면역 반응을 끌어낸다. 본 연구에 사용된 LPS는 표준 상업적으로 이용가능한 리포폴리사카라이드(시그마로부터 참조번호 L4391)였다.

성장, 배양 및 IL-10 측정

THP-1 매크로파지는 최종 농도 10⁶ 매크로파지/웰로 24-웰 엘리사 플레이트에서 RPMI 1640+10% FBS 배지에서 성장되었다. 최종 세포 농도는 트리판 블루 다이 및 뉴바우어 계수판을 사용하는 것에 의해 계산되었다.

THP-1 매크로파지는 2.5 시간 동안 LPS(최종 농도 10 ng/ml)로 공동 배양되었다. 그런 후에 세포는 둘베코의 인산 완충 살린 D-PBS, 지브코로부터의 참조번호 14190-094)로 세정되었다. 500 ㎕의 RPMI 1640+10% FBS 배지가 각각의 엘리사-웰에 첨가되었다.

박테리아 균주가 5% CO₂ 대기에서 37℃에서 MRS 배지에서 밤새 미리 성장되었다. 최종 비율 25:1을 얻도록 적절히 희석된 박테리아 균주(2.5×10⁷ cfu의 박테리아: 10⁶ THP-1 매크로파지)가 각각의 웰에 첨가되었다. 농도가 뉴바우어 계수판을 사용하여 계산되었다.

그런 후에 THP-1 매크로파지가 (음성 대조군) 박테리아 균주로 또는 그들 없이 37℃에서 2.5시간 동안 배양되었다. 이어서, 매크로파지가 박테리아 균주를 제거하도록 D-PBS 배지로 두 번 세정되었다. 그런 후에 겐타마이신(50㎍/ml), 암피실린(10㎍/ml) 및 클로람페니콜(12㎍/ml)로 보충된 RPMI 1640 + 10% FBS 배지가 첨가되고, 5-7% CO²에서 37℃에서 배양되고, 그리고 부분 표본이 5 및 24시간에서 얻어졌다.

부분 표본이 원심분리되고 상청액이 제조자 지시에 따라서 상업적 키트 휴먼 IL-10 플렉스 세트(BD 바이오사이언스로부터의 비드 B7 참조 번호 558274)를 사용하는 것에 의한 유동 세포계수법에 의해 IL-10에 대해 분석되었다.

계산

결과의 해석을 위해, 절대값은 사용되지 않았다. 가장 유익한 값은 5 및 24h에서 값을 취하는 정상화된 증가로서 표현된 사이토킨의 진전, 이 경우에 IL-10 농도이다. 이것은 소화관에서 무엇이 일어났는지를 반영하고 실험 사이에 횡방향 비교를 허용하는 표준값을 제공한다. 정상화된 증가가 식에 따라서 계산되고, IL10_5h 및 IL10_24h는 각각 5 또는 24시간에서 pg/ml에서의 IL-10의 농도이다:

(IL10_24h-IL10_5h)/IL10_5h

결과

값이 더 높아질수록, IL-10의 유도가 더 높아진다. 표 1에 도시된 바와 같이, LPS-유도된 THP-1 매크로파지는 박테리아 균주의 존재 하에 IL-10의 생성을 유도했고, IL-10 유도는 균주 CECT 8330의 존재에서 특히 높다. CECT 8330에 의해 야기된 유도는 L. 레우테리에 의해 야기된 것보다 약간 더 높다.

실시예 2. 장 박테리아에 대한 길항작용 능력

목적은 과도하게 우는 유아에서 흔히 풍부한 종의 원치않는 멤버를 길항하는 박테리아 균주의 능력을 평가하는 것이다.

이러한 능력을 검출하고 평가하기 위해 사용된 프로토콜은 캠벨 프로토콜로 공지되어 있다. 이러한 기법은 프로바이오틱 균주의 균일하게 시드된 융합 아가 플레이트의 실린더 섹션을 갖는 페트리의 플레이트에서 길항되는 박테리아를 배양하는 단계를 포함한다. 실린더 섹션 주위의 성장 억제의 후광이 측정된다.

배지

병원균 균주는 옥소이드 배지에서 성장되었다. 그것은 표준 상업적으로 이용가능한 옥소이드 옥소이드 CM0359)였다.

배양 및 측정

병원균 균주는 옥소이드 배지를 포함하는 플레이트에서 균일하게 닦여졌고 각각의 병원균의 성장 동안 적절한 온도 및 %CO₂에서 CO₂ 배양기에서 융합하도록 성장되었다. 그런 후에, 테스트될 프로바이오틱 균주의 균일하게 시드된 융합 아가 플레이트의 두 개의 6mm 직경 실린더 섹션이 병원균 시드된 플레이트와 접촉해서 위치되고, 실린더 섹션 중 하나의 성장 측면을 갖고 그리고 다른 실린더 섹션의 비성장측면을 갖는 병원균 시드된 플레이트를 마주하고 37℃에서 밤새 배양한다.

계산

다음날, 억제 구역이 평평한 룰 걸쳐 아가 플레이트를 위치시키는 것에 의해 측정되었다. 그런 후에 식 GI=(IZD-CD)/2에 따라서, 성장 억제 활성(GI)이 센티미터로 측정된 억제 구역 직경(IZD)으로부터 실린더 직경(CD)을 감산하고 2로 이러한 차이를 나누는 것에 의해 계산되었다. 본 발명의 억제 능력은 상업적 균주 엘. 레우테리의 것과 비교되었다. 최종 억제 활성은 각각의 균주에 대해 두 개의 위에 언급된 실린더 섹션에 관한 GI 값의 평균으로서 계산되었다.

결과

균주는 연구된 병원균의 모든 스펙트럼에 대해 억제 활성을 나타냈다. 그러므로, 균주는 그램 음성 박테리아는 물론 그램 양성을 억제하는데 효과적이었다. 이것은 E. 콜리 및 B. 불가투스의 성장을 억제하기에 비효율적인 L. 레우테리의 경우에는 아니었다. 이것은 E. 콜리가 과도한 울음을 나타내는 유아에 흔히 존재하는 바와 같은 비정상적인 양의 박테리아로서 큰 관심이 있다(드 위리스, 씨. 등 2013 수프라; 레토넨, L. 등 "산통 및 비산통 유아에서 장 미생물상; 박테리아 배양 및 가스-액체 크로마토그래피", 소아 위장병학 및 영양학지 1994, 19권, 310-314쪽). 일반적으로 CECT 8330 및 특히 CECT 7894는 L. 레우테리에 비해 거의 모든 병원균 박테리아의 성장을 억제하기에 더 효율적이었음 역시 언급할 가치가 있다. 게다가, 그것은 본 발명의 양 균주가 과도한 울음을 나타내는 유아의 장에 역시 풍부한 클레프시엘라 및 클로스트리디움에 대한 보호를 제공한다는 것에 관련된다(드 위르스, C. 등 2013 수프라; 레토넨, L. 등 1994 수프라).

실시예 3. 어떠한 가스 생성도 없음

헤테로발효 박테리아는 글루코스 발효에 의해 락트산은 물론, CO₂ 및 에탄올을 생성하고 대사 경로가 이어진다:

1 글루코스-> 1 락트산 + 1 에탄올/아세트산 + 2 ATP + 1CO₂

균주에 의한 CO₂의 생성이 결정되었다. 식에 나타난 바와 같이, CO₂의 생성 역시 에탄올 생성에 유익하다. CO₂의 생성은 내부에 더 작은 그리고 반전된 튜브를 포함하는 튜브에 헤테로발효 브로스에서 프로바이오틱 균주의 배양에 기반한 더람관 기법을 사용하여 결정되고, 여기서 가스는 생성될 때 축적된다(필롱, G.J., 등, "와인 락트산 박테리아의 특징화: 헤테로발효, 프룩토오스로부터의 마니톨, 및 아르기닌으로부터 암모니아의 테스트를 위한 단일 브로스 배양" 에이엠 제이 엔올 비틱 1991, 42권, 153-157쪽).

균주 CECT 8330 및 CECT 7894는 가스를 생성하지 않았다. 대조군으로서 사용된 L. 레우테리는 가스를 생성했다.

실시예 4. 독성 분석

비피도박테리움 및 락토바실러스 속으로부터의 박테리아와는 반대로, 페디오코커스 펜토사세우스는 인간 소비를 위한 프로바이오틱으로서 흔히 사용되지 않는다. 따라서, 본 발명의 프로바이오틱 균주 CECT 8330이 QPS 상태를 갖는 종에 속함에도 추가적인 독성 분석은 어떠한 안전 관심도 회피하도록 수행되었다.

미숙한 소화관으로 인해 아기가 과민해짐을 고려해서, 유아에서 균주의 완전한 안전을 보장하기 위해, 위스타 한 IGS Crl:WI 네오나탈 쥐(출생 후 10일, 실험의 시작에서 18-23g의 체중 범위를 갖음)를 사용하여 급성 독성의 더 적합한 모델을 개발하는 것이 결정되었다.

임신 19일째의 임신한 암컷이 얻어졌다. 탄생 후, 한 배에서 난 새끼들이 4마리의 수컷과 4마리의 암컷으로 조절되고, 모체 효과를 피하고 동일한 크기의 한 배에서 난 새끼를 얻도록 모든 어미는 새끼들을 혼합했다. 각각의 비유 암컷이 4마리의 수컷과 4마리의 암컷과 함께 배치되었다. 비유 암컷에는 임의로 세이프 A03 사료와 물이 공급되었다.

실험 절차는 4개의 그룹을 포함했다: 비이클-전좌, 비이클-임상 증상, CECT 8330-전좌 및 CECT 8330-임상 증상.

각각의 그룹은 비유 암컷 및 4마리의 수컷 및 4마리의 암컷의 한 배에서 난 새끼를 갖는 케이지를 포함했다. CECT 8330 생성물은 최종 농도 0.5×10¹⁰ cfu/ml 제조에서 매일 준비되었다. 비이클 그룹은 프로바이오틱 대신에 물을 수용했다. 모든 네오나탈 쥐에는 5ml/kg(CECT 8330의 경우에 2.5×10¹⁰ cfu/kg)의 고정된 볼륨에서 오로가스트릭 캐뉼라로 경구 위관영양법에 의해 5일 동안(연구 0일에서 4일까지) 비이클 또는 CECT 8330 치료제가 투여되었다. 경구 루트는 인간에서 투여의 의도된 루트이기 때문에 연구를 위해 선택되었다.

실험 동안의 관찰은: 이환율/사망율; 체중; 임상 증상이었다(수화 및 신체 조건을 포함하는 새끼의 외관; 자극에 대한 반응; 반듯이 눕는다면 꿈틀거리는 자연 활동 -능력 및 피부 색상).

동물은 두 개의 다른 시간의 기간 후에 안락사되었다:

-"전좌"의 그룹은 실험의 4일에 안락사되었다(5일 치료의 마지막 날)

-"임상 증상"의 그룹은 연구의 11일에 안락사되었다(마지막 경구 투여 후 일주일).

새끼들은 단두술에 의해 안락사되었고 온전한 동물 및 모든 표면 조직의 검시를 포함하는 부검이 수행되고 가슴 또는 복강의 내부 검시가 이어졌다. "전좌" 그룹에 속하는 동물에서, 안락사 후에 즉시, 동물의 간이 수집되고 박테리아 전좌 분석까지 2-4℃에서 유지되었다. 대략적으로 5mg의 각각의 간 샘플이 1ml 0.01% 젤라틴 PBS에서 균질화되었다. 이러한 균질액으로부터 100㎕이 맥콘키 플레이트 또는 MRS 플레이트 상에 플레이트되었다. 균락이 48시간 동안 37℃에서 배양 후에 계수되었다.

어떠한 자연 사망률 또는 독성 관련된 임상 증상도 연구 동안 관찰되지 않았다. 대조군(비이클)과 CECT 8330 사이의 체중에 대한 어떠한 차이도 검출되지 않았고 모든 동물의 거동은 정상이었다. 게다가, 간에서 락트산 박테리아 또는 엔테로박테리아의 전좌를 나타내는 동물의 수에서 대조군과 CECT 8330 그룹 사이에 어떠한 차이도 관찰되지 않았다.

실시예 5. 균주의 분리

프레쉬 스툴은 0-9세 어린이로부터 수집되고 PBS 버퍼(pH 7.4)에 용해되고, 부분표본화되고, 다양한 항생제 조합으로 보충된 MRS 상에 플레이트되었다. 균주는 37 또는 30℃에서 미호기성 조건(5% CO₂) 하에 배양되었다. 배양 시간은 성장률에 따르지만, 일반적으로 24시간 내지 3일 작동한다. 그램 스테이닝은 제 1 식별을 얻기 위해 수행되었다. 성장하면, 분리된 균주는 15% 탈지 분유를 갖는 PBS 0.1×에서 동결건조에 의해 저장되었다. 균주는 10㎍/㎖ 반코마이신으로 보충된 MRS 아가 상에 성장되었다. 현미경을 이용한 검시는 비피도박테리움 론검 CECT 7894는 그램 양성 바실리이고, 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330은 그램 양성 코커스임이 드러났다.

속 및 종 식별은 앞서 설명된 바와 같은 16S rRNA 유전자의 확대에 의해 수행되었다(보슈, M 등, 건강한 어린이의 분변으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 CECT 7315 및 CECT 7316의 프로바이오틱 특징. Lett App. 미생물학, 2012, 54권, 240-6쪽). SEQ ID NO:1은 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330의 16S rRNA 시퀀스에 대응하고 SEQ ID NO:2는 비피도박테리움 론검 CECT 7894의 16S rRNA 시퀀스에 대응한다.

균주 유전자형은 게놈 소화 및 펄스-장 겔 전기영동(PFGE)에 의해 수행되었다.

페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330은 사소한 수정을 갖는 앞서 설명된 프로토콜(로다스, A.M., 등, 와인 락토바실러스 균주의 다상 연구: 분류상의 함축. 조직적이고 진보적인 국제 미생물학지, 2005. 55(1): 197-207쪽)을 대상으로 한다. 대조군으로서 사용하도록 이용가능한 페디오코커스 펜토사세우스의 상업적 균주가 없기 때문에, 페디오코커스 악시딜악티시의 두 개의 상업적 균주가 분석에 포함되었다(도 1에 1 및 2). 균주는 MRS 아가 플레이트 상에 성장되었고 18시간 동안 37℃ 5% CO₂에서 배양되었다. 세포는 회수되고 8ml PET(10mM 트리스 pH 7.6, 1M NaCl)에서 3회 세정되고 그런 후에 10분간 6000rpm에서 원심분리되었다. 펠릿은 700ml 용해 버퍼에서 재현탁되었다(6mM 트리스, 1M NaCl, 0.1 M EDTA, 0.5% SLS, 0.2% 디옥시콜산; 1mg/ml 리소자임; 40 U/ml 뮤타놀리신; 20mg/ml RNase). 동일한 부피의 1.6% 저용융점 아가로스(미국, 메인, 록랜드, FMC 바이오프로덕트)가 재현탁된 세포에 첨가되고 응고가 1시간 동안 4℃에서 허용되었다. 삽입물은 2ml 용해 버퍼 Ⅱ(0.5M EDTA pH 9.2, 1% N-라우릴 사르코신 및 1mg/ml 프로나아제)에 전달되고 48시간 동안 50℃에서 배양되었다. 그런 후에 삽입물은 TE 버퍼로 실온에서 세정되었다(10mM 트리스, 1mM EDTA pH 8.0). 총 DNA 소화는 Sma-Ｉ 및 Not-1 제한 효소에 의해 분리하여 수행되었다(로슈 진단법). 펄스-장 겔 전기영동은 쉐프 드릴 장치(바이오라드 라보라토리)를 사용하여 수행되었다. 삽입물은 1% 아가로스 겔에 로드되었다(미국, 메인, FMC 바이오프로덕트, 시켐 ME 아가로스). 표 3은 각각의 에 대해 전기영동 조건을 설명한다. DNA 분자 중량 마커는 람다 래더 PFG 마커 및 낮은 범위 PFG 마커였다(뉴잉글랜드 바이오랩스). 전기영동 후에, 겔은 GelDoc 시스템을 사용하여 브롬화 에티듐 및 UV로 스테이닝되었다(바이오라드).

비피도박테리움 론검 CECT 7894는 브릭진스키, E.P. 등 "기술 노트: 비피도박테리아의 분석을 위한 신속한 펄스 장 겔 전기영동 방법" 낙농학지 2006, 89권, 2424-2427쪽에 의해 설명된 바와 같이 제한 효소로서 XbaＩ 및 SpeＩ를 사용하여 PFGE에 의해 특징화되었다. 결과 패턴이 B. 론검 CECT 4551의 이들과 비교되었다.

결과가 도 1 및 도 2에 나타난다. 펄스-장 겔 전기영동 Not-Ｉ 및 Sma-Ｉ 제한 패턴은 균주 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330 및 페디오코커스 아시딜악티시 종에 속하는 상업적 대조군 균주(1 및 2)에 있어서 달랐다. 그들은 상업적으로 이용가능하지 않기 때문에 대조군으로서 페디오코커스 펜토사세우스 균주를 포함하는 것은 가능하지 않았다. PFGE는 동일한 종의 균주 사이를 구분하는 것을 허용하고, 그리고 따라서 박테리아 종 내의 주어진 박테리아 균주를 고유하게 식별하도록 사용될 수 있다(로다스, A.M., 등 2005 수프라).

실시예 6. 유성 현탁액의 제조

400ml의 해바라기유가 교반 수단이 제공되는 용기에 도입되었다. 9.5g의 콜로이드 실리카가 완전한 균질화까지 덩어리 및 응집의 형성을 피하도록 교반(150 rpm) 하에 천천히 첨가되었다. 5×10¹² cfu를 포함하는 13.3g의 페디오코커스 펜토사세우스 CECT 8330이 완전한 분산까지 느린 교반(50rpm) 하에 용기에 첨가되었다. 그런 후에, 5×10¹² cfu를 포함하는 42.75g의 비피도박테리움 론검 CECT 7894가 완전한 분산까지 느린 교반(50rpm) 하에 용기에 첨가되었다. 현탁액은 최종으로 해바라기유로 1000ml까지 채워졌고 최종 현탁액을 균질화하도록 교반되었다. 현탁액은 실온에서 유지되었다.

실시예 7. 임상 연구

연구의 설계

실험 임상 시험이 P. 펜토사세우스 CECT 8330과 B. 론검 CECT 7894를 결합하는 프로바이오틱 조제분유의 효험 및 안정성을 평가하기 위해 수행되었다. 연구는 스페인 카탈로니아로부터 총 8개의 참여 센터를 포함하는 유망한 이중-맹검, 플라세보-제어된, 두 개의 평행한 아암을 갖는 무작위 임상 시험으로서 설계되었다. 연구 프로토콜은 헬싱키 선언에 일치하는 IDIAP 조르디 골(스페인, 바르셀로나)로부터 그리고 푼다시오 유니오 카탈라나 드'호스피탈스(스페인, 바르셀로나)로부터 윤리 위원회에 의해 승인되었다.

이어지는 포함 기준의 모두를 충족하는 양 성별의 건강한 기간 유아가 모집되었다: 21일 내지 120일; 최저 탄생 중량 2.5Kg; 모유 수유되거나 유아 조제분유(가수분해된 또는 개시 조제분유)가 먹여짐; 정의 "장의 중적증 또는 다른 것과 같은, 유기 병인을 먼저 다스리는 적어도 1주 동안 관찰된 3일 이상에서 3개 이상의 에피소드에서 적어도 일당 60분을 포함하는 정상 가족 단위 기능화에 문제적인 심각하고, 지속적이며 그리고 매우 슬픈울음"에 따른 과도한 울음 및 소란. 배제 기준은: 조산 유아(37주 전에 태어남); 만성 질병; 위장 질환(산통과 관련없음)의 히스토리; 면역반응억제된 유아; 이전의 또는 기대된 외과 수술; 등록 일주일 전에 프로바이오틱스 또는 항생제를 복용; 부모 또는 대리인이 적절하게 연구 요구사항을 따를 수 없는 유아이다. 대상은 무작위로 프로바이오틱 치료 그룹 또는 플라세보 그룹에 할당되었다. 치료제는 실시예 6에 설명된 바와 같이 조성물로 구성되었다. 플라세보는 프로바이오틱 없이 동일한 유성 현탁액으로 구성되었다. 조성물은 14일 동안 먹이기(5 방울/일) 30분 전에 투여되었다. 연구 동안, 부모는 치료, 울음 진전 및 부작용에 대한 정도를 기록하는 질문지를 채우도록 요청되었다.

데이타 분석이 평균 및 표준 에러로서 표현된 윈도우용 IBM^® SPSS 통계 v20 및 결과로 수행되었다. 임상 시험 동안 매일 우는 시간에서 평균 감소는 연구의 마지막 3일 동안(12, 13 및 14일) 일 당 울음의 총 분 수의 평균과 연구의 처음 3일 동안(1, 2 및 3일) 일 당 총 분 수의 평균 사이의 차이로서 계산되었다. 각각의 에피소드의 기간에서 평균 감소는 연구의 마지막 3일 동안(12, 13 및 14일) 각각의 에피소드가 지속하는 분 수의 평균과 연구의 처음 3일 동안(1, 2 및 3일) 각각의 에피소드를 지속하는 평균 분 사이의 차이로서 계산되었다.

결과

임상 시험의 시작에서 플라세보 그룹에 속하는 n=9 유아 및 프로바이오틱 조제분유 그룹에 속하는 n=11은 울음 시간의 제안된 정의를 충족하고 그러므로 연구를 지속하도록 허용되었음이 확인되었다. 연구의 시작에서 이러한 모집단의 평균 울음 시간은 60분 내지 240분의 범위에 있었다. 연구 동안, 플라세보와 프로바이오틱 조제분유 모두는 잘 용인되고 보충제와 관련된 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다. 게다가, 도 3에 도시된 바와 같이, 울음 시간이 연구 동안 플라세보와 프로바이오틱 그룹에서 감소되었다. 그러나, 프로바이오틱 소비는 평균 울음 시간에서 더 높은 감소를 야기했다. 더 작은 경향이 각각의 에피소드의 기간 동안 관찰되었다.

관찰된 임상 효과는 인 비트로 관찰된 프로바이오틱 특징을 지지한다. 이들 결과는 본 연구가 다른 연구에 비해 일부 강도를 나타남에 따라 관련된 관심이 있고 프로바이오틱스는 산통을 치료하기 위해 사용되었다. 예를 들어, 연구는 모유수유된 유아와 현재의 프로바이오틱 조제분유가 조제분유가 먹여진 부분 모집단에서 어떠한 개선도 나타내지 못함에 따라 관련된 관심을 받는 조제분유가 먹여진 유아 모두를 포함했다. 게다가, 참여 유아는 매일 임상 실험에 따라 더 현실적인 유아 산통의 임상 정의에 기반해서 모집되었고 치료 기간(14일)은 많은 다른 임상 시험(21-28일)의 것보다 더 짧았다.

문헌 참조

안드레오레티, O. 등 "식품 또는 사료에 의도적으로 첨가된 QPS 미생물의 목록의 유지. 질문 번호: EFSA-Q-2008-006", EFSA 저널 2008. 923: p.1-48(Andreoletti, O. et al. 'The maintenance of the list of QPS microorganisms intentionally added to food or feed. Question no: EFSA-Q-2008-006", The EFSA Journal 2008, vol. 923, pp. 1-48.)

보슈, M 등, 건강한 어린이의 분변으로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 CECT 7315 및 CECT 7316의 프로바이오틱 특징. Lett App. 미생물학, 2012, 54권, 240-6쪽(Bosch, M. et al., "Probiotic properties of Lactobacillus plantarum CECT 7315 and CECT 7316 isolated from faeces of healthy children". Lett App. Microbiol, 2012. 54, 240-6)

브릭진스키, E.P. 등 "기술 노트: 비피도박테리아의 분석을 위한 신속한 펄스 장 겔 전기영동 방법" 낙농학지 2006, 89권, 2424-2427쪽(Briczinski, E.P. et al. "Technical note: a rapid pulsed-field gel electrophoresis method for analysis of bifidobacteria" J. Dairy Sci. 2006, vol. 89, pp. 2424-2427.)

드 위르스, 씨. 등 "산통을 갖는 유아의 장 미생물상: 전개 및 특정 시그니처" 소아학 2013, 131권, 2호, e550-e55(De Weerth, C. et al. "Intestinal Microbiota of Infants with colic: Development and specific signatures" Pediatrics 2013, vol. 131 , Issue 2, e550-e558.)

뒤퐁, C. 등 "산통을 갖는 유아에서의 A-락트알부민 강화된 및 프로바이오틱-보충된 유아 조제분유: 성장 및 위장 내성" 유럽 임상 영양학지 2010, 64권, 7호, 765-767쪽(Dupont, C. et al. "A-Lactalbumin-Enriched and Probiotic-Supplemented Infant Formula in Infants with Colic: Growth and Gastrointestinal Tolerance." European Journal of Clinical Nutrition. 2010, vol. 64, Issue 7, pp. 765-767.)

이가라시 T. "락트산 박테리아 세포 성분에서의 변화와 염 스트레스 조건 하에 IL-12 생성의 자극 사이의 관계 연구", 생명과학, 생명공학 및 생화학 2010, 74, 2171-2175쪽(Igarashi T. "Study of the relationship between changes in lactic acid bacterial cell components and stimulation of IL-12 production under salt-stressed conditions", Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 2010, vol. 74, pp. 2171-2175)

종아누라쿤, B. 등 "프로바이오틱 용도를 위한 페디오코쿠스 펜토사세우스 NB-17", 생명과학 및 생명공학지 2008 106권, 1호, 69-73쪽(Jonganurakkun, B. et al. "Pediococcus pentosaceus NB-17 for probiotic use", Journal of Bioscience and Bioengineering 2008 vol.106, Issue 1, pp. 69-73)

레토넨, L. 등 "산통 및 비산통 유아에서 장 미생물상; 박테리아 배양 및 가스-액체 크로마토그래피", 소아 위장병학 및 영양학지 1994, 19권, 310-314쪽(Lehtonen, L. et al. "Intestinal Microflora in colicky and noncolicky infants: Bacterial Cultures and Gas-Liquid Chromatography", Journal of pediatric Gastroenterology and Nutrition 1994, vol. 19, pp. 310-314.)

멘툴라, S. 등 "미생물 조성물 및 산통 유아로부터의 분변 발효 최종 생성물-프로바이오틱 보조제 파일럿", 건강 및 질병에서의 미생물 생태학 2008, 20권, 1호, 37-47쪽(Mentula, S. et al. "Microbial composition and fecal fermentation end products from colicky infants - A probiotic supplementation pilot", Microbial Ecology in Health and Disease, 2008, vol. 20, no. 1 , pp. 37-47.)

루스, S. 등 "락토바실러스 레우테리 DSM 17938로 치료된 산통 유아의 무작위 추출된 DBPC 시도로부터의 분변 샘플에 대한 454 피로시퀀싱 분석", PLoS ONE 2013, 8권, 2호, e56710 1-5(Roos, S. et al. "454 Pyrosequencing Analysis on Faecal Samples from a Randomized DBPC Trial of Colicky Infants Treated with Lactobacillus reuteri DSM 17938", PLoS ONE 2013, vol. 8, no. 2, e56710 1-5)

사비노, F. 등 "락토바실러스 레우테리(미국 타입 배양 수집 균주 55730) 대 유아 산통의 치료에서 시메시콘: 유망한 무작위 추출 연구" 소아학 2007, 119권, 1호: e124-e130(Savino, F. et al. "Lactobacillus reuteri (American Type Culture Collection Strain 55730) Versus Simethicone in the Treatment of Infantile Colic: A Prospective Randomized Study" Pediatrics 2007, vol. 1 19, Issue 1, e124-e130.)

사비노, F 등 "유아의 산통에서 락토바실러스 레우테리 DSM 17938: 무작위 추출, 이중 맹검, 플라세보-제어된 시도" 소아학 2010, 126권, 3호: e526-e533(Savino, F. et al. "Lactobacillus reuteri DSM 17938 in Infantile Colic: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial." Pediatrics 2010, vol 126, Issue 3, e526-e533.)

스자제우스카, H 등 "모유수유 유아에서 유아의 산통의 관리를 위한 락토바실러스 레우테리 DSM 17938: 무작위 추출, 이중 맹검, 플라세보 제어된 시도", 소아학지 2012, 162권, 2호, 257-262쪽(Szajewska, H. et al. "Lactobacillus reuteri DSM 17938 for the Management of Infantile Colic in Breastfed Infants: A Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial", Journal of Pediatrics 2012, vol. 162, Issue 2, pp. 257-262.)

비탈리, B. 등 "생과일 및 야채로부터 분리된 인간을 위한 신규한 프로바이오틱 후보", 식품 미생물학 2012, 31(1), 116-125쪽(Vitali, B. et al. "Novel probiotic candidates for humans isolated from raw fruits and vegetables", Food Microbiology 2012, vol. 31, Issue 1, pp. 116-125)

필롱, G.J., 등, "와인 락트산 박테리아의 특징화: 헤테로발효, 프룩토오스로부터의 마니톨, 및 아르기닌으로부터 암모니아의 테스트를 위한 단일 브로스 배양" 에이엠 제이 엔올 비틱 1991, 42권, 153-157쪽(Pilone, G.J., et al., "Characterization of wine lactic acid bacteria: single broth culture for tests of heterofermentation, mannitol from fructose, and ammonia from arginine" Am J Enol Vitic 1991, vol. 42, pp. 153-157)

WO2007142596

SEQUENCE LISTING <110> AB-Biotics, S.A. Venpharma Laboratorios, S.A. <120> Probiotic for infantile excessive crying <130> P2765PC00 <150> EP13382324 <151> 2013-08-09 <160> 2 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 1502 <212> DNA <213> Pediococcus pentosaceus <220> <221> source <222> 1..1502 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="16sRNA" /organism="Pediococcus pentosaceus" <400> 1 ggatgaacgc tggcggcgtg cctaatacat gcaagtcgaa cgaacttccg ttaattgatt 60 atgacgtact tgtactgatt gagattttaa cacgaagtga gtggcgaacg ggtgagtaac 120 acgtgggtaa cctgcccaga agtaggggat aacacctgga aacagatgct aataccgtat 180 aacagagaaa accgcatggt tttcttttaa aagatggctc tgctatcact tctggatgga 240 cccgcggcgt attagctagt tggtgaggta aaggctcacc aaggcagtga tacgtagccg 300 acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 360 agcagtaggg aatcttccac aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgagtgaa 420 gaagggtttc ggctcgtaaa gctctgttgt taaagaagaa cgtgggtaag agtaactgtt 480 tacccagtga cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 540 atacgtaggt ggcaagcgtt atccggattt attgggcgta aagcgagcgc aggcggtctt 600 ttaagtctaa tgtgaaagcc ttcggctcaa ccgaagaagt gcattggaaa ctgggagact 660 tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt gaaatgcgta gatatatgga 720 agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctgg tctgcaactg acgctgaggc tcgaaagcat 780 gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg taaacgatga ttactaagtg 840 ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt aagtaatccg cctggggagt 900 acgaccgcaa ggttgaaact caaaagaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 960 tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcttc tgacagtcta 1020 agagattaga ggttcccttc ggggacagaa tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1080 gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttattac tagttgccag 1140 cattaagttg ggcactctag tgagactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggacgac 1200 gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg atggtacaac 1260 gagtcgcgaa accgcgaggt taagctaatc tcttaaaacc attctcagtt cggactgtag 1320 gctgcaactc gcctacacga agtcggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1380 gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgagagttt gtaacaccca 1440 aagccggtgg ggtaaccttt taggagctag ccgtctaagg tgggacagat gattagggtg 1500 aa 1502 <210> 2 <211> 1461 <212> DNA <213> Bifidobacterium longum <220> <221> source <222> 1..1461 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="16sRNA" /organism="Bifidobacterium longum" <400> 2 tggctcagga tgaacgctgg cggcgtgctt aacacatgca agtcgaacgg gatccatcag 60 gctttgcttg gtggtgagag tggcgaacgg gtgagtaatg cgtgaccgac ctgccccata 120 caccggaata gctcctggaa acgggtggta atgccggatg ctccagttga tcgcatggtc 180 ttctgggaaa gctttcgcgg tatgggatgg ggtcgcgtcc tatcagcttg acggcggggt 240 aacggcccac cgtggcttcg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacattggga 300 ctgagatacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca caatgggcgc 360 aagcctgatg cagcgacgcc gcgtgaggga tggaggcctt cgggttgtaa acctctttta 420 tcggggagca agcgagagtg agtttacccg ttgaataagc accggctaac tacgtgccag 480 cagccgcggt aatacgtagg gtgcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagggctcg 540 taggcggttc gtcgcgtccg gtgtgaaagt ccatcgctta acggtggatc cgcgccgggt 600 acgggcgggc ttgagtgcgg taggggagac tggaattccc ggtgtaacgg tggaatgtgt 660 agatatcggg aagaacacca atggcgaagg caggtctctg ggccgttact gacgctgagg 720 agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg 780 gatgctggat gtggggcccg ttccacgggt tccgtgtcgg agctaacgcg ttaagcatcc 840 cgcctgggga gtacggccgc aaggctaaaa ctcaaagaaa ttgacggggg cccgcacaag 900 cggcggagca tgcggattaa ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctggg cttgacatgt 960 tcccgacggc cgtagagata cggcttccct tcggggcggg ttcacaggtg gtgcatggtc 1020 gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca accctcgccc 1080 cgtgttgcca gcggattatg ccgggaactc acgggggacc gccggggtta actcggagga 1140 aggtggggat gacgtcagat catcatgccc cttacgtcca gggcttcacg catgctacaa 1200 tggccggtac aacgggatgc gacgcggcga cgcggagcgg atccctgaaa accggtctca 1260 gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaaggcgga gtcgctagta atcgcgaatc 1320 agcaacgtcg cggtgaatgc gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca agtcatgaaa 1380 gtgggcagca cccgaagccg gtggcctaac cccttgtggg atggagccgt ctaaggtgag 1440 gctcgtgatt gggactaagt c 1461

Claims (14)

10⁴ 내지 10¹² cfu/g의 페디오코커스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaceus)를 포함하는 박테리아 조성물이고, 상기 페디오코커스 펜토사세우스는 수탁 번호 CECT 8330 하에 스페인 타입 배양 수집에 기탁된 페디오코쿠스 펜토사세우스인 것을 특징으로 하는 박테리아 조성물.

제 1 항에 있어서,
10⁴ 내지 10¹² cfu/g의 비피도박테리움 론검(Bifidobacterium longum) CECT 7894의 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 조성물.

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

Images