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TW201446803A - 抗升糖素受體之抗體及其使用方法 - Google Patents

抗升糖素受體之抗體及其使用方法 Download PDF

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TW201446803A
TW201446803A TW103116190A TW103116190A TW201446803A TW 201446803 A TW201446803 A TW 201446803A TW 103116190 A TW103116190 A TW 103116190A TW 103116190 A TW103116190 A TW 103116190A TW 201446803 A TW201446803 A TW 201446803A
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antibody
receptor
amino acid
seq
acid sequence
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TW103116190A
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Riggers Javier Fernando Chaparro
Alison Jane Forgie
Chia-Yang Lin
Edward Roland Lavallie
Lidia Mosyak
Andrea Rossi
Blarcom Thomas John Van
Original Assignee
Rinat Neuroscience Corp
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Abstract

本發明提供結合至升糖素受體之拮抗抗體及其使用方法。該抗升糖素受體之抗體在治療學上可用於降低血液中葡萄糖含量，且可用於預防及/或治療葡萄糖相關病症，包括糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常、血脂異常或代謝症候群。

Description

抗升糖素受體之抗體及其使用方法 【序列表引用】
本申請案係以電子方式經由EFS-Web申請且包括以電子方式提交之呈.txt格式之序列表。.txt檔案含有2014年4月16日創建之名為「SequenceListing_PC33992_02」且大小為72KB的序列表。此.txt檔案中所含之序列表為本說明書之一部分且以全文引用的方式併入本文中。
本發明係關於結合升糖素受體之抗體，例如全長抗體。本發明進一步係關於包含針對升糖素受體之抗體之組合物，及使用抗升糖素受體之抗體作為藥劑之方法。抗升糖素受體之抗體可在治療學上用於降低血液中之葡萄糖含量，且可用於預防及/或治療葡萄糖相關病症，包括糖尿病。
糖尿病由於其流行率及相關健康風險不斷增加而成為一項重大的公共健康問題。該疾病之特徵為碳水化合物之產生及利用中之代謝缺陷，此導致無法維持適當血漿葡萄糖含量。識別出糖尿病之兩種主要形式。I型糖尿病(T1D)或胰島素依賴性糖尿病為胰島素絕對缺乏之結果。II型糖尿病(T2D)或非胰島素依賴性糖尿病常常伴有正常或甚至升高之胰島素含量且似乎為組織及細胞不能對胰島素適當起反應之 結果。用藥物積極控制T2D為必要的；否則其可進展至β-細胞衰竭及胰島素依賴。
升糖素為二十九個胺基酸之肽，其自胰臟之α細胞分泌至肝門靜脈中，藉此使肝相比非肝組織暴露於較高含量之此激素。血漿升糖素含量回應於高血糖症、高胰島素血症、升高之血漿非酯化脂肪酸含量及生長抑素而降低，而升糖素分泌回應於低血糖症及升高之血漿胺基酸含量而增加。升糖素經由其受體活化而成為藉由活化肝糖分解及葡糖新生而產生肝葡萄糖之有效活化劑。在T2D個體中，基礎升糖素含量較高且受高血糖症及高胰島素血症抑制不足。
升糖素受體為62kDa蛋白質，其由升糖素活化且為B類G蛋白偶合受體家族之成員。升糖素受體係由人類中之GCGR基因編碼，且此等受體主要表現於肝臟中，而在腎臟、心臟、脂肪組織、脾臟、胸腺、腎上腺、胰臟、大腦皮質及胃腸道中發現表現量較少。刺激升糖素受體引起腺苷酸環化酶活化及細胞內cAMP含量增加。
小鼠(Gcgr-/-)中升糖素受體表現之基因中斷降低空腹及餐後葡萄糖含量且改良血糖控制。然而，Gcgr-/-小鼠發展出高升糖素血症、胰臟α細胞增生及胰臟神經內分泌腫瘤(Gelling,R.W.等人，2003,「Lower plasma glucose,hyperglucagonemia,and pancreatic alpha cell hyperplasia in glucagon receptor knockout mice」Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：1438-1443；Yu,R.等人，2011,「Pancreatic neuroendocrine tumors in glucagon receptor-deficient mice」Plos ONE 6(8)：e23397)。類似地，天生帶有同種接合子不活化GCGR突變(P86S)之人類患者發展出胰臟神經內分泌腫瘤且展現高升糖素血症及胰臟α細胞增生(Yu,R.等人，2008,「Nesidioblastosis and hyperplasia of alpha cells,microglucagonoma,and nonfunctioning islet cell tumor of the pancreas」Pancreas 36：428-431)。
五種主要類別(各類別由不同機制起作用)中之若干藥物可用於治療高血糖症且隨後可用於治療T2D(Moller,D.E.,2011,「New drug targets for Type 2 diabetes and the metabolic syndrome」Nature 414：821-827)：(A)胰島素促分泌劑，包括磺醯基脲(例如格列吡嗪(glipizide)、格列美脲(glimepiride)、格列本脲(glyburide))及美格替耐(meglitinide)(例如納格列定(nateglidine)及瑞格列奈(repaglinide))，藉由作用於胰臟β-細胞而增強胰島素之分泌。儘管此療法可降低血漿葡萄糖含量，但其具有有限功效及耐受性，引起體重增加且常常誘發低血糖症。(B)雙胍(例如二甲雙胍(metformin))據信主要藉由減少肝葡萄糖產生而起作用。雙胍常常導致胃腸紊亂及乳酸酸中毒，從而進一步限制其使用。(C)α-葡糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖(acarbose))減少腸葡萄糖吸收。此等藥劑常常導致胃腸紊亂。(D)噻唑啶二酮(例如吡格列酮(pioglitazone)、羅格列酮(rosiglitazone))作用於肝臟、肌肉及脂肪組織中之特定受體(過氧化體增殖物活化受體-γ)。其調控脂質代謝，隨後增強此等組織對胰島素作用之反應。頻繁使用此等藥物可導致體重增加且可誘發水腫及貧血。(E)胰島素單獨或與上述藥劑組合用於更嚴重之狀況。
自此項技術中可用之資訊及在本發明之前，尚不清楚的是，將抗升糖素受體之拮抗劑抗體引入血液循環中以選擇性地拮抗升糖素受體是否將安全且有效地降低血漿葡萄糖含量及預防及/或治療糖尿病，且倘若如此，則抗升糖素受體之抗體之何種特性為該活體內安全性及有效性所需。
提供選擇性地與升糖素受體相互作用之抗體。已證實，某些抗升糖素受體之抗體在活體內有效預防及/或治療糖尿病。有利地，本文所提供之抗升糖素受體之抗體不會不利地影響肝功能或血漿脂質。 亦有利地，本文所提供之抗升糖素受體之抗體在活體內有效降低血液中之C肽含量。
本文提供經分離之拮抗劑抗體，其特異性地結合至升糖素受體且預防或降低升糖素受體之生物效應。在一些實施例中，拮抗劑抗體可為例如人類、人類化或嵌合抗體。
在一些實施例中，經分離之拮抗劑抗體可包含例如重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含具有SEQ ID NO：3、5、7、9或11所示之胺基酸序列之VH的VH互補決定區1(CDR1)、VH CDR2及VH CDR3；及/或輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含具有SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示之胺基酸序列之VL的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。抗體之各CDR可根據例如CDR之Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義與Chothia定義之組合、AbM定義及/或接觸定義來定義。
在一些實施例中，抗體可包含例如選自由以下組成之群的重鏈可變區(VH)：(a)包含具有SEQ ID NO：3所示之胺基酸序列之VH的VH互補決定區1(CDR1)、VH CDR2及VH CDR3之VH；(b)包含具有SEQ ID NO：5所示之胺基酸序列之VH的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3之VH；(c)包含具有SEQ ID NO：7所示之胺基酸序列之VH的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3之VH；(d)包含具有SEQ ID NO：9所示之胺基酸序列之VH的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3之VH；及(e)包含具有SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列之VH的VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3之VH；及選自由以下組成之群的輕鏈可變區(VL)：(f)包含具有SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列之VL的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之VL；(g)包含具有SEQ ID NO：4所示之胺基酸序列之VH的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之VL；(h)包含具有SEQ ID NO：6所示之胺基酸序列之VH的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之VL；(i)包含具有SEQ ID NO：8所示之胺基酸序列之VH的VL CDR1、 VL CDR2及VL CDR3之VL；及(j)包含具有SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列之VH的VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3之VL。
在一些實施例中，抗體可包含例如包含SEQ ID NO：24、16或25之胺基酸序列之VH CDR1，包含SEQ ID NO：18或26之胺基酸序列之VH CDR2，包含SEQ ID NO：41所示之胺基酸序列之VH CDR3，包含SEQ ID NO：40所示之胺基酸序列之VL CDR1，包含SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列之VL CDR2，及/或包含SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列之VL CDR3。
在一些實施例中，抗體可包含例如包含SEQ ID NO：3、5、7、9或11所示之胺基酸序列之VH或其變異體，該變異體在不處於CDR內之殘基中具有一個或數個保守胺基酸取代。在一些實施例中，抗體可包含例如包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示之胺基酸序列之VL或其變異體，該變異體在不處於CDR內之胺基酸中具有一個或數個胺基酸取代。
在一些實施例中，抗體可包含例如包含SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列之VH及/或包含SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列之VL。在一些實施例中，抗體可包含例如包含SEQ ID NO：87或88所示之胺基酸序列之重鏈及/或包含SEQ ID NO：89所示之胺基酸序列之輕鏈。
在一些實施例中，抗體可包含免疫惰性恆定區。在一些實施例中，恆定區可為例如去糖基化Fc。在一些實施例中，抗體可包含選自由IgG2、IgG2△a、IgG4、IgG4△b、IgG4△c、IgG4S228P、IgG4△b S228P及IgG4△c S228P組成之群的同型。
本文亦提供經分離之抗升糖素受體之拮抗劑抗體，其特異性地結合至與由單株抗體mAb1、mAb2、mAb3、mAb4或mAb5識別之升糖素受體上之抗原決定基相同或重疊之抗原決定基。在一些實施例中，抗體可包含：包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之VH CDR1、包 含SEQ ID NO：93之胺基酸序列之VH CDR2、包含SEQ ID NO：94所示之胺基酸序列之VH CDR3、包含SEQ ID NO：90所示之胺基酸序列之VL CDR1、包含SEQ ID NO：91所示之胺基酸序列之VL CDR2，及/或包含SEQ ID NO：92所示之胺基酸序列之VL CDR3。在一些實施例中，抗原決定基為結構抗原決定基。在一些實施例中，抗原決定基包含SEQ ID NO：1所示之升糖素受體胺基酸序列之胺基酸殘基31、33-38、40-42、44-45、48、62及64。在一些實施例中，抗原決定基為功能性抗原決定基。在一些實施例中，功能性抗原決定基包含SEQ ID NO：1所示之升糖素受體胺基酸序列之胺基酸殘基33、36、38、41、44及45。在一些實施例中，功能性抗原決定基包含SEQ ID NO：1所示之升糖素受體胺基酸序列之胺基酸殘基33、36、38、41、44、45及60。
亦提供細胞株，其產生一或多種本文所提供之抗體。
亦提供經分離之核酸，其編碼本文所提供之抗體。在一些實施例中，經分離之核酸可可操作地連接至控制序列。在一些實施例中，經分離之核酸可包含編碼本文所提供之抗體之輕鏈可變域、重鏈可變域或兩者之聚核苷酸序列。
亦提供重組表現載體，其包含本文所提供之核酸。亦提供宿主細胞，其包含本文所提供之表現載體中之任一者。亦提供融合瘤，其能夠產生本文所提供之抗體中之任一者。
亦提供產生本文所提供之抗升糖素受體之拮抗劑抗體之方法。在一些實施例中，該方法包含：在抗體產生之條件下培養產生抗體之細胞株；及回收該抗體。在一些實施例中，該方法包含：在抗體產生之條件下培養包含編碼抗體之核酸的細胞株，該抗體包含有包含SEQ ID NO：87或88所示之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：89所示之胺基酸序列之輕鏈；及回收該抗體。在一些實施例中，重鏈及輕鏈係 在各別載體上編碼。在其他實施例中，重鏈及輕鏈係在同一載體上編碼。
亦提供醫藥組合物，其包含一或多種本文所提供之抗體，及醫藥學上可接受之載劑。亦提供用於治療由升糖素受體介導之病狀的套組，其包含有包含一或多種本文所提供之抗體之醫藥組合物。
亦提供在有需要之個體中降低血糖、改良葡萄糖耐受性、降低C肽含量、防止血液之C肽含量顯著增加及/或治療或預防由升糖素受體介導之病狀的方法。在一些實施例中，該方法包含投與個體有效量之本文所提供之抗升糖素受體之拮抗劑抗體，以使得該個體中之血糖含量降低、葡萄糖耐受性改良及/或一或多種與病狀相關之症狀改善。在其他實施例中，該方法包含投與個體有效量之本文所提供之抗升糖素受體之拮抗劑抗體，以使得該個體中之C肽含量降低。在其他實施例中，該方法包含投與個體有效量之本文所提供之抗升糖素受體之拮抗劑抗體及mTor抑制劑，以使得該個體中之血糖含量降低、葡萄糖耐受性改良及/或一或多種與病狀相關之症狀改善。個體可為例如(但不限於)哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體減少個體之體重增加。
在一些實施例中，病狀為例如1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常、血脂異常、糖尿病酮酸症、與糖尿病相關之長期併發症、代謝症候群，或部分特徵為血糖含量升高之其他代謝障礙。
在一些實施例中，在個體中抗升糖素受體之拮抗劑抗體之含量降至最小有效臨限值以下之後，在抗升糖素受體之拮抗劑抗體治療後胰島之α細胞中之變化得以逆轉。
在一些實施例中，在個體中抗升糖素受體之拮抗劑抗體之含量降至最小有效臨限值以下之後，在抗升糖素受體之拮抗劑抗體治療後 肝細胞中肝糖積聚之變化得以逆轉。
在一些實施例中，該方法可進一步包含投與有效量之第二治療劑。在一些實施例中，第二治療劑為例如胰島素、mTor抑制劑、雙胍、磺醯基脲、PPARγ促效劑、α葡糖苷酶抑制劑、EXENATIDE®、SYMLIN®、升糖素拮抗劑或第二升糖素受體拮抗劑。在一些實施例中，雙胍為例如二甲雙胍。在一些實施例中，mTor抑制劑為例如雷帕黴素(rapamycin)、西羅莫司(sirolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)、依維莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)或ATP競爭性mTOR激酶抑制劑(TKI)。在一些實施例中，TKI為例如Torin1、Torin 2、PP242、PP30、KU0063794、WAY-600、WYE-687、WYE-354、OSI-027、AZD-8055、KU-BMCL-200908069-1、Wyeth-BMCL-200908069-2、XL-388、INK-128及AZD-2014。在一些實施例中，與mTOR抑制劑組合治療減少藉由阻斷升糖素受體活性引發之肥大及/或增生。
亦提供本文所提供之抗升糖素受體之拮抗劑抗體中之任一者的用途，其係用於製造用以治療或預防人類之1型或2型糖尿病或用以達成人類之體重減輕之藥劑。在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體減少個體之體重增加。
亦提供抗升糖素受體之拮抗劑抗體，其係用於治療由升糖素受體介導之病狀。在一些實施例中，病狀為例如1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常、血脂異常或代謝症候群。
圖1描繪概述cAMP分析之結果之圖。
圖2A描繪概述在投與抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb5(開口圓)或PBS(封閉圓)之動物中之丙胺酸胺基轉移酶(ALT)測試之結果之 圖。圖2B描繪概述在投與mAb5(開口圓)或PBS(封閉圓)之動物中之天冬胺酸胺基轉移酶(AST)測試之結果之圖。
圖3A描繪概述在投與mAb5(開口圓)或PBS(封閉圓)之動物中之鹼性磷酸酶(ALP)測試之結果之圖。圖3B描繪概述在投與mAb5(開口圓)或PBS(封閉圓)之動物中之γ-麩胺醯基轉移酶(GGT)測試之結果之圖。
圖4A描繪概述在投與mAb5(開口圓)或PBS(封閉圓)之動物中之總膽固醇含量之圖。圖4B描繪概述在投與mAb5(開口圓)或PBS(封閉圓)之動物中之LDL-C含量之圖。
圖5A描繪概述在投與mAb5(開口圓)或PBS(封閉圓)之動物中之HDL-C含量之圖。圖5B描繪概述在投與mAb5(開口圓)或PBS(封閉圓)之動物中之三酸甘油酯含量之圖。
本文揭示特異性地結合至升糖素受體之抗體。提供製造抗升糖素受體之抗體之方法、包含此等抗體之組合物，及使用此等抗體作為藥劑之方法。抗升糖素受體之抗體可用於降低血漿葡萄糖含量，且可用於預防及/或治療T1D、T2D或相關病症，包括高血糖症、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常、血脂異常、肥胖症、腎病變、視網膜病變、白內障、中風、動脈粥樣硬化、創傷癒合不良、糖尿病酮酸症、高血糖高滲壓症候群、圍手術期高血糖症、加護病房患者之高血糖症、胰島素抗性症候群及代謝症候群。
一般技術
除非另有指示，否則本發明之實施將採用處於此項技術內之分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術。該等技術在文獻中充分說明，諸如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Methods in Molecular Biology,Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney編，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather及P.E.Roberts,1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths及D.G.Newell編，1993-1998)J.Wiley and Sons；Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir及C.C.Blackwell編)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller及M.P.Calos編，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人編，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人編，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人編，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway及P.Travers,1997)；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：a practical approach(D.Catty.編，IRL Press,1988-1989)；Monoclonal antibodies：a practical approach(P.Shepherd及C.Dean編，Oxford University Press,2000)；Using antibodies：a laboratory manual(E.Harlow及D.Lane,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M.Zanetti及J.D.Capra編，Harwood Academic Publishers,1995)。
定義
除非另有指示，否則以下術語應理解為具有以下含義：如關於分子(其中該分子為例如多肽、聚核苷酸或抗體)之術語「經分離之分子」鑒於其衍生起源或來源(1)與伴隨其原生狀態出現之天然相關之組分不相關，(2)實質上不含來自相同來源(例如物種、表現其之細胞、文庫等)之其他分子，(3)由來自不同物種之細胞表現，或(4)不存 在於自然界中。因此，以化學方式合成或表現於與其天然來源之系統不同之細胞系統中之分子將與其天然相關之組分「分離」。藉由使用此項技術中熟知之純化技術進行分離，亦促使分子實質上不含天然相關之組分。分子純度或同質性可藉由此項技術中熟知之許多方式分析。舉例而言，多肽樣品之純度可使用聚丙烯醯胺凝膠電泳及凝膠染色來分析以使用此項技術中熟知之技術觀測多肽。出於某些目的，可藉由使用HPLC或此項技術中熟知之用於純化之其他方式來提供較高解析度。
「抗體」為免疫球蛋白分子，其能夠經至少一個位於免疫球蛋白分子之可變區中之抗原識別位點而特異性地結合至標靶，諸如碳水化合物、聚核苷酸、脂質、多肽等。如本文所用之該術語不僅涵蓋完整多株抗體或單株抗體，而且除非另有規定，否則亦涵蓋與完整抗體競爭進行特異性結合之其任何抗原結合部分、包含抗原結合部分之融合蛋白質，及包含抗原識別位點之免疫球蛋白分子之任何其他經修飾組態。抗原結合部分包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、域抗體(dAb，例如鯊魚抗體及駱駝抗體)、包括互補決定區(CDR)之片段、單鏈可變片段抗體(scFv)、最大抗體、微型抗體、胞內抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及bis-scFv，及含有足以賦予多肽以特異性抗原結合之免疫球蛋白之至少一部分的多肽。抗體包括任何種類之抗體，諸如IgG、IgA或IgM(或其子類)，且該抗體無需為任何特定種類。視其重鏈之恆定域之抗體胺基酸序列而定，可將免疫球蛋白指定為不同種類。存在五大類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等者中之若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同種類之免疫球蛋白之重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。免疫球蛋白之不同種類之次單元結構及三維組態為熟知的。
抗體之「可變區」係指單獨或呈組合形式之抗體輕鏈之可變區或抗體重鏈之可變區。如此項技術中所知，重鏈及輕鏈之可變區各自由經三個亦稱為高變區之互補決定區(CDR)連接之四個構架區(FR)組成，且促成抗體之抗原結合位點形成。若需要主題可變區之變異體，尤其關於在CDR區外部(亦即，在構架區中)之胺基酸殘基之取代，則適當胺基酸取代，較佳為保守胺基酸取代，可藉由比較主題可變區與含有與主題可變區相同之典型種類中之CDR1及CDR2序列的其他抗體之可變區來鑑別(Chothia及Lesk,J Mol Biol 196(4)：901-917,1987)。
在某些實施例中，藉由解析抗體之結構及/或解析抗體-配位體複合物之結構來達成CDR之定義性描述及構成抗體之結合位點之殘基的鑑別。在某些實施例中，可藉由熟習此項技術者已知之多種技術中之任一者，諸如X射線結晶法來達成彼目的。在某些實施例中，可採用各種分析方法來鑑別或粗略估計CDR區。在某些實施例中，可採用各種分析方法來鑑別或粗略估計CDR區。該等方法之實例包括(但不限於)Kabat定義、Chothia定義、AbM定義、接觸定義及構形定義。
Kabat定義為用於編碼抗體中之殘基之標準且通常用於鑑別CDR區。參見例如Johnson及Wu,2000,Nucleic Acids Res.,28：214-8。Chothia定義類似於Kabat定義，但Chothia定義考慮到某些結構環區之位置。參見例如Chothia等人，1986,J.Mol.Biol.,196：901-17；Chothia等人，1989,Nature,342：877-83。AbM定義使用由Oxford Molecular Group生產之模擬抗體結構之電腦程式的整合套件。參見例如Martin等人，1989,Proc Natl Acad Sci(USA),86：9268-9272；「AbMTM,A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies」,Oxford,UK；Oxford Molecular,Ltd。AbM定義使用知識資料庫與全始算法之組合模擬來自一級序列之抗體之三級結構，該等方法為諸如Samudrala等人，1999,「Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach」,PROTEINS,Structure,Function and Genetics Suppl.,3：194-198所述之方法。接觸定義係基於可用複雜晶體結構之分析。參見例如MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.,5：732-45。在另一方法中，本文中稱作CDR之「構形定義」，CDR之位置可鑑別為對抗原結合作出焓貢獻之殘基。參見例如Makabe等人，2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166。其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但將仍然與Kabat CDR之至少一部分重疊，不過其鑒於特定殘基或殘基組不會顯著影響抗原結合之預測或實驗性發現而可縮短或延長。如本文所用之CDR可指由此項技術中已知之任何方法(包括方法之組合)定義之CDR。本文所用之方法可利用根據此等方法中之任一者定義之CDR。對於含有一個以上CDR之任何既定實施例，CDR可根據Kabat定義、Chothia定義、延伸定義、AbM定義、接觸定義及/或構形定義中之任一者來定義。
如此項技術中所知，抗體之「恆定區」係指單獨或呈組合形式之抗體輕鏈之恆定區或抗體重鏈之恆定區。
如本文所用之「單株抗體」係指自實質上同質抗體之群體獲得之抗體，亦即，構成該群體之個別抗體除可以微量存在之可能天然產生之突變以外為相同的。單株抗體針對單一抗原位點具高度特異性。此外，與通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑成對比，各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。修飾語「單株」指示抗體係自實質上同質之抗體群體獲得之特徵，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，欲根據本發明使用之單株抗體可藉由Kohler及Milstein,1975,Nature 256：495首次描述之融合瘤方法製得，或可藉由重組DNA方法，諸如美國專利第4,816,567號中所述之方法製得。單株抗體亦可使用例如McCafferty等人，1990, Nature 348：552-554中所述之技術自噬菌體文庫中分離。如本文所用之「人類化」抗體係指作為嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)且含有來源於人類免疫球蛋白之最小序列之非人類(例如鼠類)抗體之形式。較佳地，人類化抗體為來自接受者之CDR之殘基經來自諸如小鼠、大鼠或兔之非人類物種(供體抗體)之CDR之殘基置換的人類免疫球蛋白(接受者抗體)，其具有所要特異性、親和力及能力。人類化抗體可包含既未在接受者抗體中亦未在輸入CDR或構架序列中發現之殘基，但將其包括在內以進一步改進及優化抗體效能。
「人類抗體」為具有對應於由人類產生之抗體之胺基酸序列的胺基酸序列及/或已使用如本文所揭示之用於製造人類抗體之技術中之任一者製得之抗體。人類抗體之此定義特定地排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
術語「嵌合抗體」欲指可變區序列來源於一個物種且恆定區序列來源於另一物種之抗體，諸如可變區序列來源於小鼠抗體且恆定區序列來源於人類抗體之抗體。
術語「抗原決定基」係指在抗體之一或多個抗原結合區中能夠由抗體識別且與抗體結合之分子的彼部分。抗原決定基通常由分子之表面群組(諸如胺基酸或糖側鏈)組成且具有特定三維結構特徵以及特定電荷特徵。在一些實施例中，抗原決定基可為蛋白質抗原決定基。蛋白質抗原決定基可為線性或構形的。在線性抗原決定基中，蛋白質與相互作用分子(諸如抗體)之間的相互作用之所有點沿著蛋白質之一級胺基酸序列成線性地出現。「非線性抗原決定基」或「構形抗原決定基」包含對抗原決定基具特異性之抗體所結合之抗原性蛋白質內的非連續多肽(或胺基酸)。如本文所用之術語「抗原性抗原決定基」定義為如此項技術中所熟知之任何方法，例如習知免疫分析所確定，抗 體可特異性地結合之抗原的一部分。一旦確定抗原上之所要抗原決定基，則例如使用本發明中所述之技術可能產生針對彼抗原決定基之抗體。或者，在發現過程中，抗體之產生及表徵可闡明關於所需抗原決定基之資訊。根據此資訊，則可能競爭性地篩選結合至相同抗原決定基之抗體。一種達成此目的之方法為進行競爭及交叉競爭研究以發現彼此競爭或交叉競爭結合至升糖素受體之抗體，例如競爭結合至抗原之抗體。
如本文所用之術語「升糖素受體」係指保留升糖素受體之活性之至少一部分的升糖素受體及其變異體之任何形式。除非有不同指示，諸如特定提及人類升糖素受體，否則升糖素受體包括原生序列升糖素受體之所有哺乳動物種類，例如人類、犬、貓、馬及牛。一種例示性人類升糖素受體係以Uniprot寄存編號P47871(SEQ ID NO：1)查得。
術語「拮抗劑抗體」係指結合至標靶且預防或降低彼標靶之生物效應的抗體。在一些實施例中，該術語可表示防止其所結合之標靶(例如升糖素受體)執行生物功能之抗體。
如本文所用之「抗升糖素受體之拮抗劑抗體」係指能夠抑制升糖素受體之生物活性及/或由升糖素受體介導之下游事件的抗體。抗升糖素受體之拮抗劑抗體涵蓋如下抗體：其阻斷、拮抗、抑制或降低(至任何程度，包括顯著程度)升糖素受體之生物活性，包括由升糖素受體介導之下游事件，諸如升糖素結合及下游信號傳導、腺苷酸環化酶活化、細胞內cAMP之含量增加、肝糖分解刺激、葡糖新生活化、肝糖生成抑制、糖酵解抑制及肝葡萄糖產生。就本發明而言，應明確瞭解，術語「抗升糖素受體之拮抗劑抗體」(可互換地稱為「拮抗劑升糖素受體抗體」、「拮抗劑抗升糖素受體之抗體」或「升糖素受體拮抗劑抗體」)涵蓋所有先前鑑別之術語、名稱及功能狀態及特徵，藉 此升糖素受體本身、升糖素受體生物活性(包括(但不限於)其結合升糖素、增加細胞內cAMP、刺激肝糖分解、活化葡糖新生及促進肝葡萄糖釋放之能力)或生物活性之結果實質上消除、降低或中和至任何有意義之程度。在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體結合升糖素受體且降低血漿葡萄糖含量。抗升糖素受體之拮抗劑抗體之實例提供於本文中。
術語「多肽」、「寡肽」、「肽」及「蛋白質」在本文中可互換使用以指任何長度之胺基酸鏈。該鏈可為線性或分支的，其可包含經修飾之胺基酸及/或可間雜有非胺基酸。該等術語亦涵蓋已天然或藉由介入而修飾之胺基酸鏈；例如，雙硫鍵形成、糖基化、脂化、乙醯化、磷酸化，或任何其他操作或修飾(諸如與標記組分結合)。該定義內亦包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)以及此項技術中已知之其他修飾的多肽。應瞭解，多肽可以單鏈或相關鏈之形式出現。
如此項技術中所知，如本文中可互換使用之「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸鏈，且包括DNA及RNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾之核苷酸或鹼基及/或其類似物，或可由DNA或RNA聚合酶併入鏈中之任何受質。聚核苷酸可包含經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。若存在，則可在裝配鏈之前或之後賦予核苷酸結構以修飾。核苷酸之序列可間雜有非核苷酸組分。聚核苷酸可在聚合後，諸如藉由與標記組分結合來進一步修飾。其他類型之修飾包括例如一或多個天然存在之核苷酸經類似物「封端」取代；核苷酸間修飾，諸如具有不帶電鍵(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯、胺基甲酸酯等)及具有帶電鍵(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)之聚核苷酸，含有諸如蛋白質(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚-L-離胺酸等)之側位部分之聚核苷酸，具有嵌 入劑(例如吖啶、補骨脂素(psoralen)等)之聚核苷酸，含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)之聚核苷酸，含有烷化劑之聚核苷酸，具有經修飾鍵之聚核苷酸(例如α變旋異構核酸等)以及未經修飾形式之聚核苷酸。此外，通常存在於糖中之任何羥基可例如經膦酸酯基、磷酸酯基置換，經標準保護基保護，或經活化以製備與其他核苷酸之其他鍵，或可結合至固體支撐物。5'及3'端OH可經磷酸化或經1至20個碳原子之胺或有機封端基團部分取代。其他羥基亦可衍生成標準保護基。聚核苷酸亦可含有此項技術中一般已知之類似形式之核糖或脫氧核糖，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-變旋異構糖或β-變旋異構糖、差向異構糖(諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖(sedoheptulose))、非環狀類似物及脫鹼基核苷類似物，諸如甲基核苷。一或多個磷酸二酯鍵可經替代性鍵聯基置換。此等替代性鍵聯基包括(但不限於)磷酸酯經P(O)S(「硫醇酯」)、P(S)S(「二硫醇酯」)、(O)NR2(「醯胺化物」)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(「甲縮醛」)置換之實施例，其中各R或R'獨立地為H或視情況含有醚(-O-)鍵之經取代或未經取代之烷基(1-20個C)、芳基、烯基、環烷基、環烯基或芳烷基。聚核苷酸中之所有鍵無需均相同。上述描述適用於本文中所提及之所有聚核苷酸，包括RNA及DNA。
如本文所用，當如本文實例1中揭示之方法所量測之平衡解離常數等於或小於20nM、較佳小於約6nM、更佳小於約1nM、最佳小於約0.2nM時，抗體與升糖素受體「相互作用」。
「優先結合」或「特異性結合」(本文中可互換使用)至抗原決定基之抗體為此項技術中充分瞭解之術語，且測定該特異性或優先結合之方法在此項技術中亦為熟知的。與分子與替代性細胞或物質之反應或締合相比，若分子更頻繁、更快速、以更長持續時間及/或以更高 親和力與特定細胞或物質反應或締合，則稱該分子展現「特異性結合」或「優先結合」。與抗體結合至其他物質相比，若抗體以更高親和力、親合力、更容易及/或以更長持續時間結合至標靶，則該抗體「特異性結合」或「優先結合」至該標靶。舉例而言，特異性或優先結合至升糖素受體抗原決定基之抗體為與其結合至其他升糖素受體抗原決定基或非升糖素受體抗原決定基相比，以更高親和力、親合力、更容易及/或以更長持續時間結合此抗原決定基之抗體。藉由閱讀此定義亦瞭解，例如，特異性或優先結合至第一標靶之抗體(或部分或抗原決定基)可能或可能不特異性或優先結合至第二標靶。因此，「特異性結合」或「優先結合」未必需要(儘管其可包括)排他性結合。一般但未必，提及結合意謂優先結合。
如本文所用之「實質上純」係指至少50%純(亦即，不含污染物)、更佳至少90%純、更佳至少95%純、甚至更佳至少98%純且最佳至少99%純之物質。
「宿主細胞」包括可為或已為用於併入聚核苷酸插入物之載體之接受者的個別細胞或細胞培養物。宿主細胞包括單一宿主細胞之子代，且該子代由於天然、偶然或有意突變而可能未必與原始親本細胞完全相同(在形態或基因組DNA補體方面)。宿主細胞包括經本發明之聚核苷酸活體內轉染之細胞。
如此項技術中所知，術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈之C端區。「Fc區」可為原生序列Fc區或變異Fc區。儘管免疫球蛋白重鏈之Fc區之邊界可能變化，但人類IgG重鏈Fc區通常界定為自位置Cys226或自Pro230處之胺基酸殘基延伸至其羧基端。Fc區中殘基之編號為如Kabat中EU索引之編號。Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991。免疫球蛋白之Fc區一般包含 兩個恆定域CH2及CH3。如此項技術中所知，Fc區可以二聚體或單體形式存在。
如此項技術中所用之「Fc受體」及「FcR」描述結合至抗體之Fc區之受體。較佳FcR為原生序列人類FcR。此外，較佳FcR為結合IgG抗體之FcR(γ受體)且包括FcγRI、FcγRII及FcγRIII子類之受體，包括此等受體之對偶基因變異體及交替剪接形式。FcγRII受體包括FcγRIIA(「活化受體」)及FcγRIIB(「抑制受體」)，其具有主要在其細胞質域中不同之類似胺基酸序列。FcR評述於Ravetch及Kinet,1991,Ann.Rev.Immunol.,9：457-92；Capel等人，1994,Immunomethods,4：25-34；及de Haas等人，1995,J.Lab.Clin.Med.,126：330-41中。「FcR」亦包括新生受體FcRn，其負責將母體IgGs轉移至胎兒(Guyer等人，1976,J.Immunol.,117：587；及Kim等人，1994,J.Immunol.,24：249)。
如本文中關於抗體所用之術語「競爭」意謂第一抗體或其抗原結合部分以充分類似於第二抗體或其抗原結合部分之結合的方式結合至抗原決定基，使得在第二抗體存在下第一抗體與其同源抗原決定基之結合的結果與不存在第二抗體之情況下第一抗體之結合相比可偵測地減少。第二抗體與其抗原決定基之結合在第一抗體存在下亦可偵測地減少之替代情況可為但未必為實情。亦即，第一抗體可抑制第二抗體與其抗原決定基之結合，而第二抗體不抑制第一抗體與其相應抗原決定基之結合。然而，在各抗體可偵測地抑制另一抗體與其同源抗原決定基或配位體之結合的情況下，無論相同、較大或較小程度地抑制，該等抗體據稱為彼此「交叉競爭」結合其相應抗原決定基。競爭抗體與交叉競爭抗體均由本發明所涵蓋。與該競爭或交叉競爭發生之機制(例如位阻、構形變化或結合至共同抗原決定基或其部分)無關，熟習此項技術者基於本文所提供之教示將瞭解，該等競爭及/或交叉 競爭抗體涵蓋在內且可適用於本文所揭示之方法。
「功能性Fc區」具有原生序列Fc區之至少一種效應功能。例示性「效應功能」包括C1q結合；補體依賴性細胞毒性；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調等。該等效應功能一般需要Fc區與結合域(例如抗體可變域)組合且可使用此項技術中已知之用於評估該等抗體效應功能之各種分析來評估。
「原生序列Fc區」包含與自然界中所見之Fc區之胺基酸序列一致之胺基酸序列。「變異Fc區」包含由於至少一個胺基酸修飾而不同於原生序列Fc區，但仍保留原生序列Fc區之至少一種效應功能的胺基酸序列。較佳地，變異Fc區與原生序列Fc區或親本多肽之Fc區相比具有至少一個胺基酸取代，例如原生序列Fc區或親本多肽之Fc區中約1個至約10個胺基酸取代且較佳約1個至約5個胺基酸取代。本文中之變異Fc區將與原生序列Fc區及/或與親本多肽之Fc區較佳具有至少約80%序列一致性，且最佳與其具有至少約90%序列一致性，更佳與其具有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%序列一致性。
如本文所用之「治療」為用於獲得有益或所要臨床結果之方法。就本發明而言，有益或所要臨床結果包括(但不限於)以下一或多者：血糖含量降低、葡萄糖清除率改良(葡萄糖耐受性改良)，及由以下疾病引起之異常血漿葡萄糖含量之發生率下降或改善：T1D、T2D、高血糖症、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常、血脂異常、肥胖症、腎病變、視網膜病變、白內障、中風、動脈粥樣硬化、創傷癒合不良、糖尿病酮酸症、高血糖高滲壓症候群、圍手術期高血糖症、加護病房患者之高血糖症、胰島素抗性症候群及代謝症候群。
「改善」意謂與未投與抗升糖素受體之拮抗劑抗體相比，一或 多種症狀減輕或改良。「改善」亦包括縮短或減少症狀之持續時間。
如本文所用之藥物、化合物或醫藥組合物之「有效劑量」或「有效量」為足以實現任何一或多個有益或所要結果之量。在更特定態樣中，有效量預防、減輕或改善疾病之症狀及/或延長所治療之個體之存活期。對於預防性用途，有益或所要結果包括消除或降低疾病之風險、減輕疾病之嚴重程度或延遲疾病之發作，該疾病包括疾病之生物化學、組織學及/或行為症狀，其併發症，及在疾病發展期間呈現之中間病理學表型。對於治療性用途，有益或所要結果包括臨床結果，諸如減輕T1D、T2D、高血糖症、高胰島素血症、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常、血脂異常或代謝症候群之一或多種症狀，減少治療疾病所需之其他藥物之劑量，增強另一藥物之作用，及/或延遲患者之疾病進程。有效劑量可以一或多次投藥來投與。就本發明而言，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量為足以直接或間接實現預防性或治療性治療之量。如在臨床背景中所瞭解，藥物、化合物或醫藥組合物之有效劑量可能與或可能不與另一藥物、化合物或醫藥組合物聯合達成。因此，在投與一或多種治療劑之情形中可考慮「有效劑量」，且若與一或多種其他藥劑聯合可達成或達成所需結果，則單一藥劑可視為以有效量給出。
「個體(individual/subject)」為哺乳動物，更佳為人類。哺乳動物亦包括(但不限於)農畜(例如乳牛、豬、馬、雞等)、競技動物、寵物、靈長類動物、馬、犬、貓、小鼠及大鼠。
如本文所用之「載體」意謂能夠傳遞且較佳表現宿主細胞中相關之一或多個基因或序列之構築體。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、質體、黏質體或噬菌體載體、與陽離子性縮合劑相關之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體，及某些真核細胞(諸如生產細胞)。
如本文所用之「表現控制序列」意謂引導核酸轉錄之核酸序列。表現控制序列可為啟動子(諸如組成性或誘導性啟動子)或強化子。表現控制序列可操作地連接至待轉錄之核酸序列。
如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」或「醫藥學上可接受之賦形劑」包括當與活性成分組合時使該成分保留生物活性且與個體之免疫系統不起反應的任何物質。實例包括(但不限於)諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)及各種類型之濕潤劑的標準醫藥載劑中之任一者。用於氣霧劑或非經腸投藥之較佳稀釋劑為磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理鹽水(0.9%)。包含該等載劑之組合物係藉由熟知之習知方法來調配(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，A.Gennaro編，Mack Publishing Co.,Easton,PA,1990；及Remington,The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing,2000)。
如本文所用之術語「kon」係指抗體與抗原締合之速率常數。特定而言，速率常數(kon及koff)及平衡解離常數係使用全長抗體及/或Fab抗體片段(亦即單價)及升糖素受體來量測。
如本文所用之術語「koff」係指抗體自抗體/抗原複合物解離之速率常數。
如本文所用之術語「KD」係指抗體-抗原相互作用之平衡解離常數。
本文中對「約」某一值或參數之提及包括(及描述)針對彼值或參數本身之實施例。舉例而言，提及「約X」之描述包括「X」之描述。數值範圍將界定該範圍之數值包括在內。
應瞭解，在任何情況下本文中以語言「包含」描述實施例，否則亦提供依據「由......組成」及/或「基本上由......組成」描述之類似實施例。
在依據馬庫什群組(Markush group)或其他替代群組描述本發明之態樣或實施例之情況下，本發明不僅涵蓋作為整體列出之整個群組，而且涵蓋個別群組之各成員及主群組之所有可能子組，以及不存在群組成員中之一或多者之主群組。本發明亦設想明確排除所主張之發明中之任何群組成員中之一或多者。
除非另有規定，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。在相矛盾之狀況下，將以本說明書(包括定義)為準。貫穿本說明書及申請專利範圍，詞語「包含」應理解為意指包括所述整數或整數群組，但不排除任何其他整數或整數群組。除非本文另有要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。術語「例如」之後之任何實例並不意謂詳盡的或限制性的。
本文描述例示性方法及材料，不過類似於或等效於本文所述者之方法及材料亦可用於本發明之實施或測試。材料、方法及實例僅為說明性的且不欲作限制。
預防或治療由升糖素受體介導之病狀之方法
本文提供一種降低有需要之個體中之血糖的方法，該方法包含將治療有效量之抗升糖素受體之拮抗劑抗體投與該個體。
亦提供一種改良有需要之個體中之葡萄糖耐受性之方法，該方法包含將治療有效量之抗升糖素受體之拮抗劑抗體投與該個體。
亦提供一種治療或預防個體之由升糖素受體介導之病狀的方法，該方法包含投與有需要之個體有效量之抗升糖素受體之拮抗劑抗體。在一些實施例中，病狀為T1D。在其他實施例中，病狀為T2D。在其他實施例中，病狀為高血糖症。在其他實施例中，病狀為高胰島素血症。在其他實施例中，病狀為空腹葡萄糖異常。在其他實施例中，病狀為葡萄糖耐受性異常。在其他實施例中，病狀為血脂異常。 在其他實施例中，病狀為代謝症候群。
在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體之治療性投藥有利地降低血清葡萄糖。較佳地，血清葡萄糖比投藥前降低至少約10%或15%。更佳地，血清葡萄糖比抗體投藥前降低至少約20%。甚至更佳地，血清葡萄糖比抗體投藥前降低至少30%。有利地，血清葡萄糖比抗體投藥前降低至少40%。更有利地，血清葡萄糖比抗體投藥前降低至少50%。極佳地，血清葡萄糖比抗體投藥前降低至少60%。最佳地，血清葡萄糖比抗體投藥前降低至少70%。
罹患T2D或處於T2D風險下之個體可用抗升糖素受體之拮抗劑抗體治療。適合於抗升糖素受體之拮抗劑抗體療法之個體係使用臨床準則及此項技術中熟知之T2D之預後性指示來選擇。T2D嚴重程度之評估可基於此項技術中已知之測試來進行，包括例如空腹血漿葡萄糖測試、隨機血漿葡萄糖測試、口服葡萄糖耐受性測試、餐後兩小時測試、隨機血糖、糖化血色素(A1C)測試、尿液測試、擴張眼睛檢查及足部檢查。在一些實施例中，改善T2D及/或T2D症狀、控制T2D及/或T2D症狀、降低T2D及/或T2D症狀之發生率或延遲T2D及/或T2D症狀之發展或進程係藉由空腹血漿葡萄糖測試來量測。
在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體之治療性投藥有利地降低T2D之一或多種症狀之發生率及/或改善T2D之一或多種症狀，該一或多種症狀包括例如高血糖症、口渴感增加、饑餓感增加、口乾、尿頻、不明體重減輕、疲勞、視力模糊、頭痛、意識喪失、視網膜病變、腎損傷、不良血液循環、神經損傷、感染增加、潰瘍、噁心、嘔吐及腹瀉。
罹患T1D或處於T1D風險下之個體可用抗升糖素受體之拮抗劑抗體治療。適合於抗升糖素受體之拮抗劑抗體療法之個體係使用臨床準則及此項技術中熟知之T1D之預後性指示來選擇。T1D嚴重程度之評 估可基於此項技術中已知之測試來進行，包括例如A1C測試、空腹血漿葡萄糖測試、口服葡萄糖耐受性測試、隨機血漿葡萄糖測試、果糖胺測試、酮測試及尿液測試。在一些實施例中，改善T1D及/或T1D症狀、控制T1D及/或T1D症狀、降低T1D及/或T1D症狀之發生率或延遲T1D及/或T1D症狀之發展或進程係藉由空腹血漿葡萄糖測試來量測。
在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體之治療性投藥有利地降低T1D之一或多種症狀之發生率及/或改善T1D之一或多種症狀，該一或多種症狀包括例如高血糖症、口渴感增加、饑餓感增加、口乾、尿頻、不明體重減輕、疲勞、視力模糊、頭痛、意識喪失、視網膜病變、腎損傷、不良血液循環、神經損傷、感染增加、潰瘍、噁心、嘔吐、腹瀉、麻刺感、麻痹、手部或足部疼痛、皮膚乾燥、皮膚瘙癢及傷口癒合緩慢。
關於本文所述之所有方法，提及抗升糖素受體之拮抗劑抗體亦包括包含一或多種其他藥劑之組合物。此等組合物可進一步包含適合之賦形劑，諸如此項技術中熟知的醫藥學上可接受之賦形劑，包括緩衝劑。本發明可單獨或與其他治療方法組合使用。
抗升糖素受體之拮抗劑抗體可經由任何適合途徑投與個體。熟習此項技術者應顯而易知，本文所述之實例不欲限制而是說明可利用之技術。因此，在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體係根據已知方法投與個體，諸如靜脈內投藥，例如呈大丸劑形式或藉由經一定時段連續輸注，藉由肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、經皮、皮下、關節內、舌下、滑膜內、經由吹入、鞘內、經口、吸入或局部途徑。投藥可為全身性的(例如靜脈內投藥)或局部的。包括噴射式噴霧器及超音波噴霧器的用於液體調配物之市售噴霧器適用於投藥。可將液體調配物直接霧化且可在復原後將凍乾粉末霧化。或者，抗升糖素受體之拮抗劑抗體可使用氟碳化物調配物及定劑量吸入器氣霧化，或以經凍 乾及研磨之粉末形式吸入。
在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體係經由定位或靶向局部傳遞技術投與。定位或靶向局部傳遞技術之實例包括抗升糖素受體之拮抗劑抗體之各種可植入儲槽來源或局部傳遞導管，諸如輸注導管、留置導管或針管、合成移植物、外膜敷包、分流器及血管內支架或其他可植入裝置、定位載體、直接注射或直接施用。參見例如PCT公開案第WO 00/53211號及美國專利第5,981,568號。
抗升糖素受體之拮抗劑抗體之多種調配物可用於投藥。在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體可以純的形式投與。在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體及醫藥學上可接受之賦形劑可呈多種調配物形式。醫藥學上可接受之賦形劑在此項技術中為已知的，且為有助於投與藥理學上有效之物質的相對惰性物質。舉例而言，賦形劑可賦予形態或稠度，或充當稀釋劑。適合之賦形劑包括(但不限於)穩定劑、濕潤劑及乳化劑、用於改變容積滲透濃度之鹽、囊封劑、緩衝劑及皮膚穿透增強劑。用於非經腸及經腸藥物傳遞之賦形劑以及調配物闡述於Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing,2000中。
在一些實施例中，此等藥劑經調配以供注射投藥(例如腹膜內、靜脈內、皮下、肌肉內投藥等)。因此，此等藥劑可與醫藥上可接受之媒劑組合，該等媒劑為諸如鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及其類似物。特定給藥方案(亦即劑量、時序及重複)將視特定個體及彼個體之病史而定。
抗升糖素受體之拮抗劑抗體可使用任何適合方法投與，包括藉由注射(例如腹膜內、靜脈內、皮下、肌肉內等)。如本文所述，抗升糖素受體之抗體亦可局部或經由吸入投與。一般而言，對於抗升糖素受體之抗體的投藥，初始候選劑量可為約2mg/kg。就本發明而言， 視上文所提及之因素而定，典型日劑量可在約3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg、至30mg/kg、至100mg/kg或100mg/kg以上中之任一者之範圍內。舉例而言，可使用約1mg/kg、約2.5mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg及約25mg/kg之劑量。對於經數天或更長時間重複投藥，視病狀而定，治療持續進行直至症狀受到所要抑制或直至達成足夠治療水準，例如減輕與升糖素相關病症相關之症狀。此療法之進程易於藉由習知技術及分析監測。給藥方案(包括所用抗升糖素受體之拮抗劑抗體)可隨時間變化。
就本發明而言，抗升糖素受體之拮抗劑抗體之適當劑量將視以下而定：所採用之抗升糖素受體之拮抗劑抗體(或其組合物)、欲治療之症狀之類型及嚴重程度、藥劑出於預防性抑或治療性目的投與、先前療法、患者之臨床病史及對藥劑之反應、患者之血糖含量、患者對於葡萄糖之合成及清除率、患者對於所投與藥劑之清除率，及主治醫師之判斷。臨床醫師通常將投與抗升糖素受體之拮抗劑抗體直至達到達成所要結果之劑量。劑量及/或頻率可隨治療過程而變化。諸如半衰期之經驗性考慮因素一般將有助於確定劑量。舉例而言，與人類免疫系統相容之抗體，諸如人類化抗體或完全人類抗體，可用於延長抗體之半衰期且防止抗體受宿主之免疫系統攻擊。投藥頻率可隨治療過程確定及調整，且一般但未必基於症狀之治療及/或抑制及/或改善及/或延遲。或者，抗升糖素受體之拮抗劑抗體之持續連續釋放調配物可為適當的。用於達成持續釋放之多種調配物及裝置在此項技術中為已知的。
在一個實施例中，拮抗劑抗體之劑量可在已給與拮抗劑抗體之一或多次投藥之個體中以經驗確定。向個體給與抗升糖素受體之拮抗劑抗體的遞增劑量。為評估功效，可追蹤疾病之指標。
視例如接受者之生理狀況、投藥目的為治療性抑或預防性的及 熟練從業者已知之其他因素而定，根據本發明之方法投與抗升糖素受體之拮抗劑抗體可為連續或間歇的。抗升糖素受體之拮抗劑抗體的投藥可在預選時段上基本上為連續的，或可呈一系列間隔劑量。
在一些實施例中，可存在一種以上抗升糖素受體之拮抗劑抗體。可存在至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種或五種以上不同拮抗劑抗體。一般而言，彼等抗升糖素受體之拮抗劑抗體可具有彼此無不利影響之互補活性。抗升糖素受體之拮抗劑抗體亦可與其他抗體及/或其他療法聯合使用。抗升糖素受體之拮抗劑抗體亦可與用以增強藥劑有效性及/或補充藥劑有效性之其他藥劑聯合使用。
在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體可與一或多種其他治療劑之投藥組合投與。此等投藥包括(但不限於)投與mTOR抑制劑、美格替耐(例如瑞格列奈、那格列奈(nateglinide)等)、磺醯基脲(例如格列吡嗪、格列美脲、格列本脲等)、二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制劑(例如沙格列汀(saxagliptin)、西他列汀(sitagliptin)、利拉利汀(linagliptin)等)、雙胍(例如二甲雙胍等)、噻唑啶二酮(例如羅格列酮、吡格列酮等)、α-葡糖苷酶抑制劑(例如醣祿(acarbose)、伏格列波糖(voglibose)、米格列醇(miglitol)等)、澱粉素(amylin)模擬物(例如普蘭林肽(symlin))及內分泌素(incretic)模擬物(例如EXENATIDE®、利拉魯肽(liraglutide)等)。其他治療包括可注射劑治療，諸如SYMLIN®(普蘭林肽(pramlintide))。
在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體與一或多種mTOR抑制劑聯合使用，諸如(但不限於)雷帕黴素、西羅莫司、替西羅莫司、依維莫司、地磷莫司及/或ATP競爭性mTOR激酶抑制劑(TKI)。在一些實施例中，TKI為Torin1、Torin 2、PP242、PP30、KU0063794、WAY-600、WYE-687、WYE-354、OSI-027、AZD-8055、KU-BMCL- 200908069-1、Wyeth-BMCL-200908069-2、XL-388、INK-128及/或AZD-2014。在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體與二甲雙胍、噻唑啶二酮、磺醯基脲及/或雙醣抑制劑聯合使用。或者，療法可在另一藥劑治療之前或之後進行，時間間隔在數分鐘至數週之範圍內。在各別地投與其他藥劑及/或蛋白質或聚核苷酸之實施例中，吾人將一般確保在各次傳遞之間不會中斷顯著長的時段，以使得本發明之藥劑及組合物仍將能夠對個體發揮有利組合之作用。在該等情況下，預期吾人可在彼此間隔約12-24小時內，且更佳在彼此間隔約6-12小時內投與兩種模態。在一些情況下，然而，在各別投藥之間流逝數天(2、3、4、5、6或7天)至數週(1、2、3、4、5、6、7或8週)時，可能需要顯著延長投藥時段。
在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體組合物包含選自由以下組成之群的第二藥劑：非磺醯基脲促泌素、胰島素、胰島類似物、腸促胰島素類似物-4(exendin-4)多肽、β3腎上腺素受體促效劑、PPAR促效劑、二肽基肽酶IV抑制劑、抑制素(statin)及含抑制素組合、膽固醇攝入及/或膽汁酸再吸收之抑制劑、LDL-膽固醇拮抗劑、膽固醇酯轉移蛋白拮抗劑、內皮素(endothelin)受體拮抗劑、生長激素拮抗劑、胰島素增敏劑、澱粉素模擬物或促效劑、大麻素(cannabinoid)受體拮抗劑、升糖素樣肽-1促效劑、黑皮素(melanocortin)及黑色素濃集激素受體促效劑。
根據本發明使用之抗升糖素受體之拮抗劑抗體之治療性調配物係藉由將具有所要純度之抗體與視情況選用之醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing,2000)以凍乾調配物或水溶液之形式混合而製備以供儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所採用之劑量及濃度下對接受者無毒，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他 有機酸；鹽，諸如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六羥季銨(hexamethonium chloride)；氯苄烷銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子性界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
含有抗升糖素受體之拮抗劑抗體之脂質體係藉由此項技術中已知之方法製備，諸如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；及美國專利第4,485,045號及第4,544,545號中所述之方法。具有提高之循環時間的脂質體揭示於美國專利第5,013,556號中。尤其適用之脂質體可藉由逆相蒸發法，使用包含磷脂醯膽鹼、膽固醇及PEG衍生之磷脂醯乙醇胺(PEG-PE)之脂質組合物產生。脂質體經具有規定孔徑之過濾器擠出以得到具有所要直徑之脂質體。
亦可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成分圈閉於所製備之微囊中，例如羥甲基纖維素或明膠微囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊分別圈閉於膠狀藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。該等技術揭示於Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing(2000) 中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質呈成形物品(例如薄膜或微囊)之形式。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美國專利第3,773,919號)、L-麩胺酸與7-乙基-L-麩胺酸酯之共聚物、不可降解之乙烯-乙酸乙烯酯、可降解之乳酸-乙醇酸共聚物(諸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)構成之可注射微球體))、乙酸異丁酸蔗糖酯及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
欲用於活體內投藥之調配物必須無菌。此易於藉由例如經無菌過濾膜過濾來實現。治療性抗升糖素受體之拮抗劑抗體組合物一般置放於具有無菌進入孔之容器中，例如靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之瓶塞的小瓶。
本發明之組合物可呈單位劑型，諸如錠劑、丸劑、膠囊、粉末、顆粒、溶液或懸浮液或栓劑，以供經口、非經腸或經直腸投藥，或藉由吸入或吹入投藥。
為製備諸如錠劑之固體組合物，將主要活性成分與醫藥載劑(例如習知製錠成分，諸如玉米澱粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或膠)及其他醫藥稀釋劑(例如水)混合，以形成含有本發明化合物或其醫藥學上可接受之無毒鹽之同質混合物的固體預調配組合物。當將此等預調配組合物稱作同質時，意謂活性成分均勻分散於整個組合物中，以使得該組合物可易於細分成同等有效之單位劑型，諸如錠劑、丸劑及膠囊。此固體預調配組合物接著細分成上述類型之單位劑型，其含有約0.1至約500mg之本發明活性成分。新穎組合物之錠劑或丸劑可包覆包衣或以其他方式混配以提供具有延長作用之優勢的劑型。舉例而言，錠劑或丸劑可包含內部劑量及 外部劑量組分，後者呈包覆前者之包膜形式。可藉由用以抵抗在胃中崩解且允許內部組分完整地進入十二指腸中或延遲釋放的腸溶層將兩種組分隔離。多種材料可用於該等腸溶層或包衣，該等材料包括許多聚合酸及聚合酸與諸如蟲膠、十六烷醇及乙酸纖維素之材料的混合物。
適合之表面活性劑尤其包括非離子劑，諸如聚氧乙烯脫水山梨糖醇(例如TweenTM 20、40、60、80或85)及其他脫水山梨糖醇(例如SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性劑之組合物宜包含0.05%與5%之間的表面活性劑，且可介於0.1%與2.5%之間。應瞭解，必要時可添加其他成分，例如甘露糖醇或其他醫藥學上可接受之媒劑。
適合之乳液可使用市售脂肪乳液製備，諸如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM及LipiphysanTM。活性成分可溶解於預混合乳液組合物中，或者，其可溶解於油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)中且在與磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水混合後形成乳液。應瞭解，可添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以調整乳液之張力。適合之乳液將通常含有至多20%之油，例如介於5%與20%之間。脂肪乳液可包含介於0.1μm與1.0μm之間、尤其0.1μm與0.5μm之間的脂肪滴，且具有在5.5到8.0範圍內之pH值。
乳液組合物可為藉由將抗升糖素受體之拮抗劑抗體與IntralipidTM或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)混合而製備之乳液組合物。
用於吸入或吹入之組合物包括於醫藥學上可接受之水性或有機溶劑或其混合物中之溶液及懸浮液，及粉末。液體或固體組合物可含有如上文所陳述之適合的醫藥學上可接受之賦形劑。在一些實施例中，組合物係藉由經口或經鼻呼吸途徑投與以達成局部或全身作用。 於較佳無菌之醫藥學上可接受之溶劑中之組合物可藉由使用氣體霧化。霧化溶液可自噴霧裝置直接呼吸，或可使噴霧裝置附接至面罩、塞條或間歇性正壓呼吸機。溶液、懸浮液或粉末組合物可自以適當方式傳遞調配物之裝置，較佳經口或經鼻投與。
抗升糖素受體之拮抗劑抗體
本發明之方法使用抗升糖素受體之拮抗劑抗體，其阻斷、抑制或降低(包括顯著降低)升糖素受體之生物活性，包括由升糖素受體介導之下游事件。抗升糖素受體之拮抗劑抗體應展現以下特徵中之任何一或多者：(a)結合至升糖素受體且阻斷下游信號傳導事件；(b)阻斷升糖素結合至升糖素受體；(c)阻斷腺苷酸環化酶活化；(d)阻斷細胞內cAMP增加；(e)阻斷肝糖分解；(f)阻斷葡糖新生；及(g)阻斷肝葡萄糖產生。
就本發明而言，抗體較佳以抑制升糖素受體信號傳導功能之方式與升糖素受體反應。在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體特異性地識別靈長類動物升糖素受體。
適用於本發明之抗體可涵蓋單株抗體、多株抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、異結合抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分(例如域抗體)之融合蛋白質、人類化抗體，及包含具有所需特異性之抗原識別位點之免疫球蛋白分子的任何其他經修飾組態，包括抗體之糖基化變異體、抗體之胺基酸序列變異體及經共價修飾之抗體。抗體可具有鼠類、大鼠、人類或任何其他起源(包括嵌合抗體或人類化抗體)。在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體為單株抗體。在一些實施例中，抗體為人類或人類化抗體。
抗升糖素受體之拮抗劑抗體可藉由此項技術中已知之任何方法製得。用於產生人類及小鼠抗體之一般技術在此項技術中為已知的及 /或描述於本文中。
抗升糖素受體之拮抗劑抗體可使用此項技術中已知之方法鑑別或表徵，藉此偵測及/或量測升糖素受體之生物活性之降低、改善或中和。在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體係藉由將候選藥劑與升糖素受體一起培育及監測結合及/或升糖素受體之生物活性的伴隨降低或中和來鑑別。結合分析可使用例如經純化之升糖素受體多肽或使用天然表現(例如各種菌株)或經轉染以表現升糖素受體多肽之細胞來進行。在一個實施例中，結合分析為競爭結合分析，其中評估候選抗體與已知抗升糖素受體之拮抗劑抗體競爭結合升糖素受體之能力。該分析可以多種格局進行，包括ELISA格局。在一些實施例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體係藉由將候選抗體與升糖素受體一起培育及監測結合來鑑別。
在初始鑑別之後，可藉由已知用以測試靶向生物活性之生物分析來進一步確認及改進候選抗升糖素受體之拮抗劑抗體之活性。在一些實施例中，使用活體外細胞或細胞毒性分析進一步表徵候選抗升糖素受體之拮抗劑抗體。舉例而言，將候選抗體與表現升糖素受體之CHO細胞一起培育，且添加升糖素，且監測細胞內cAMP含量。或者，可使用生物分析直接篩選候選物。
本發明之抗升糖素受體之拮抗劑抗體展現以下特徵中之一或多者：(a)結合至升糖素受體且阻斷下游信號傳導事件；(b)阻斷升糖素結合至升糖素受體；(c)阻斷腺苷酸環化酶活化；(d)阻斷細胞內cAMP增加；(e)阻斷肝糖分解；(f)阻斷葡糖新生；及(g)阻斷肝葡萄糖產生。較佳地，抗升糖素受體之抗體具有此等特徵中之兩者或兩者以上。更佳地，抗體具有該等特徵中之三者或三者以上。更佳地，抗體具有該等特徵中之四者或四者以上。更佳地，抗體具有該等特徵中之五者或五者以上。更佳地，抗體具有該等特徵中之六者或六者以上。 最佳地，抗體具有全部七種特徵。
抗升糖素受體之拮抗劑抗體可使用此項技術中熟知之方法表徵。舉例而言，一種方法用以鑑別其所結合之抗原決定基或「抗原決定基定位」。存在許多在此項技術中已知之用於定位及表徵蛋白質上抗原決定基之位置的方法，包括解析抗體-抗原複合物之晶體結構、競爭分析、基因片段表現分析及基於合成肽之分析，如例如Harlow及Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1999之第11章所述。在另一實例中，抗原決定基定位可用於確定抗升糖素受體之拮抗劑抗體所結合之序列。抗原決定基定位可購自多種來源，例如Pepscan Systems(Edelhertweg 15,8219 PH Lelystad,The Netherlands)。抗原決定基可為線性抗原決定基(亦即，含於胺基酸之單一延伸段中)或由可能未必含於單一延伸段中之胺基酸之三維相互作用形成的構形抗原決定基。具有不同長度(例如至少4-6個胺基酸長)之肽可經分離或合成(例如以重組方式)且用於與抗升糖素受體之拮抗劑抗體之結合分析。在另一實例中，抗升糖素受體之拮抗劑抗體所結合之抗原決定基可在系統篩選中藉由使用來源於升糖素受體序列之重疊肽及確定由抗升糖素受體之拮抗劑抗體之結合來確定。根據基因片段表現分析，將編碼升糖素受體之開放閱讀框架隨機或藉由特異性遺傳構築而片段化，且確定升糖素受體之經表現片段與待測試之抗體的反應性。可例如藉由PCR產生基因片段，接著在放射性胺基酸存在下活體外轉錄及轉譯至蛋白質中。接著藉由免疫沈澱及凝膠電泳來確定抗體與經放射性標記之升糖素受體片段之結合。亦可藉由使用呈現於噬菌體粒子表面(噬菌體文庫)或酵母(酵母呈現)上之隨機肽序列之大文庫來鑑別某些抗原決定基。或者，可在簡單結合分析中針對與測試抗體之結合來測試重疊肽片段之規定文庫。在另一實例中，可進行抗原之突變誘發、結構 域交換實驗及丙胺酸掃描突變誘發來鑑別抗原決定基結合所需、足以用於抗原決定基結合及/或抗原決定基結合所必需之殘基。舉例而言，可使用突變型升糖素受體來進行丙胺酸掃描突變誘發實驗，在該突變型升糖素受體中升糖素受體多肽之多種殘基已經丙胺酸置換。藉由評估抗體與突變型升糖素受體之結合，可評估特定升糖素受體殘基對抗體結合之重要性。
另一種可用於表徵抗升糖素受體之拮抗劑抗體之方法在於使用與已知結合至相同抗原(亦即，升糖素受體之多種片段)之其他抗體的競爭分析，以判定抗升糖素受體之拮抗劑抗體是否與其他抗體會結合至相同抗原決定基。競爭分析為熟習此項技術者所熟知。
抗升糖素受體之拮抗劑抗體與升糖素受體之結合親和力(KD)可為約0.001至約200nM。在一些實施例中，結合親和力為約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約60pM、約50pM、約20pM、約15pM、約10pM、約5pM、約2pM或約1pM中之任一者。在一些實施例中，結合親和力小於約250nM、約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約50pM、約20pM、約10pM、約5pM或約2pM中之任一者。
因此，本發明提供以下具有如表1A或1B中所見之部分輕鏈序列及部分重鏈序列之抗體或其變異體中之任一者，或包含該抗體或其變異體之組合物(包括醫藥組合物)。在表1A及1B中，加底線序列為根據Kabat之CDR序列，且粗體序列為根據Chothia之CDR序列。
本發明亦提供針對升糖素受體之抗體之CDR部分。CDR區之確定充分處於此項技術內。應瞭解，在一些實施例中，CDR可為Kabat與 Chothia CDR之組合(亦稱為「組合CDR」或「延伸CDR」)。在另一方法中，本文中稱作CDR之「構形定義」，CDR之位置可鑑別為對抗原結合作出焓貢獻之殘基。參見例如Makabe等人，2008,Journal of Biological Chemistry,283：1156-1166。一般而言，「構形CDR」包括Kabat CDR及游標區(Vernier zone)中之殘基位置，該等殘基位置受限制以維持適當環結構以供抗體結合特異性抗原。構形CDR之確定充分處於此項技術內。在一些實施例中，CDR為Kabat CDR。在其他實施例中，CDR為Chothia CDR。在其他實施例中，CDR為延伸CDR、AbM CDR、構形CDR或接觸CDR。換言之，在具有一個以上CDR之實施例中，CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR、延伸CDR、AbM CDR、構形CDR、接觸CDR或其組合中之任一者。
在一些實施例中，抗體包含表1A或1B中所示之重鏈可變區中之任一者的三個CDR。在一些實施例中，抗體包含表1A或1B中所示之輕鏈可變區中之任一者的三個CDR。在一些實施例中，抗體包含表1A或1B中所示之重鏈可變區中之任一者的三個CDR，及表1A或1B中所示之輕鏈可變區中之任一者的三個CDR。
表2A及2B提供本文所提供之抗升糖素受體之拮抗劑抗體之CDR序列的實例。
在一些實施例中，抗體包含來自表2B之三個輕鏈CDR及三個重鏈CDR。來自表2B中所示之變異體的共同序列如下：輕鏈可變區CDR1：X1ASQNX2RX3AX4X5，其中X1為K或R，X2為V或I，X3為T或S，X4為V或L，且X5為V或N(SEQ ID NO：90)。輕鏈可變區CDR2：LAX1NRHX2，其中X1為S或T，且X2為S或G(SEQ ID NO：91)。輕鏈可變區CDR3：X1QHWX2YPFX3，其中X1為L或Q，X2為T或S，且X3為T或S(SEQ ID NO：92)。重鏈可變區CDR2：WINX1EX2DEX3X4YAX5X6FX7G，其中X1為T或S，X2為T或S，X3為T或S，X4為S或T，X5為D或Q，X6為D或N，且X7為K或Q(SEQ ID NO： 93)。重鏈可變區CDR3：SRGWX1YGPPDX2，其中X1為T或S，且X2為Y或V(SEQ ID NO：94)。
在一些實施例中，抗體包含抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb5之全長重鏈(具有或不具有C端離胺酸)及/或全長輕鏈。mAb5全長重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：87)展示如下： (SEQ ID NO：87)
不具有C端離胺酸之mAb5全長重鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：88)展示如下： (SEQ ID NO：88)
mAb5全長輕鏈之胺基酸序列(SEQ ID NO：89)展示如下： (SEQ ID NO：89)
本發明亦提供產生、選擇及製造抗升糖素受體之拮抗劑抗體之方法。本發明之抗體可藉由此項技術中已知之程序製得。在一些實施例中，可使用此項技術中已知之任何方法以重組方式製得抗體並使其表現。
在一些實施例中，抗體可藉由噬菌體呈現技術製備及選擇。參見例如美國專利第5,565,332號、第5,580,717號、第5,733,743號及第6,265,150號；及Winter等人，Annu.Rev.Immunol.12：433-455,1994。或者，噬菌體呈現技術(McCafferty等人，Nature 348：552-553,1990)可用於由來自未免疫供體之免疫球蛋白可變(V)域基因譜系活體外產生人類抗體及抗體片段。根據此技術，使抗體V域基因同框選殖至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)之主要或次要鞘蛋白基因中，且以功能性抗體片段之形式呈現於噬菌體粒子之表面上。由於絲狀粒子含有噬菌體基因組之單股DNA複本，故基於抗體之功能特性的選擇亦得以選擇編碼展現彼等特性之抗體的基因。因此，噬菌體模擬B細胞之一些特性。噬菌體呈現可以多種格局進行；關於評述，參見例如Johnson,Kevin S.及Chiswell,David J.,Current Opinion in Structural Biology 3：564-571,1993。V基因區段之若干來源可用於噬菌體呈現。Clackson等人，Nature 352：624-628,1991自來源於免疫小鼠之脾的V基因之小型隨機組合文庫中分離一系列多樣性抗噁唑酮抗體。可構築來自人類供體之V基因譜系，且可基本上遵循Mark等人，J.Mol.Biol.222：581-597,1991或Griffith等人，EMBO J.12：725-734,1993所述之技術來分離針對一系列多樣性抗原(包括自體抗原)之抗體。在天然免疫反應中，抗體基因以高速率積累突變(體細胞超突變)。所引入之一些變化將賦予較高親和力，且呈現高親和力表面免疫球蛋白之B細胞在後續抗原攻擊期間優先複製及分化。此天然過程可藉由採用稱為「鏈改組」之技術來仿效。(Marks等人，Bio/Technol.10：779-783,1992)。在此方法中，藉由噬菌體呈現獲得之「初級」人類抗體之親和力可藉由用獲自未免疫供體之V域基因之天然存在之變異體(譜系)的譜系依序置換重鏈及輕鏈V區基因來改良。此技術可產生具有在pM-nM範圍內之親和力的抗體及抗體片段。用於製造極大噬菌體抗體譜系(亦稱為「全母體文 庫(mother-of-all library)」)之策略已由Waterhouse等人，Nucl.Acids Res.21：2265-2266,1993描述。基因改組亦可用於自嚙齒動物抗體得到人類抗體，其中該人類抗體具有與初始嚙齒動物抗體類似之親和力及特異性。根據此方法，亦稱作「抗原決定基刻印」，用人類V域基因之譜系置換藉由噬菌體呈現技術獲得之嚙齒動物抗體之重鏈或輕鏈V域基因，從而產生嚙齒動物-人類嵌合體。對抗原之選擇得以分離能夠恢復功能性抗原結合位點之人類可變區，亦即，抗原決定基支配(刻印)搭配物之選擇。當重複該過程以置換剩餘嚙齒動物V域時，獲得人類抗體(參見PCT公開案第WO 93/06213號)。與藉由CDR移植對嚙齒動物抗體進行傳統人類化不同，此技術提供完全人類抗體，其不具有嚙齒動物起源之構架或CDR殘基。
在一些實施例中，抗體可使用融合瘤技術製得。預期包括人類之任何哺乳動物個體或來自其之抗體產生細胞可經操作以充當產生哺乳動物(包括人類)融合瘤細胞株之基礎。如本文進一步描述，使宿主動物免疫之途徑及時程一般與用於抗體刺激及產生之經確立及習知之技術保持一致。通常用一定量之免疫原(包括如本文所述者)對宿主動物進行腹膜內、肌肉內、經口、皮下、蹠內及/或皮內接種。
可使用Kohler,B.及Milstein,C.,1975,Nature 256：495-497之一般體細胞雜交技術或如Buck,D.W.等人，In Vitro,18：377-381,1982所修改，自淋巴細胞及永生化骨髓瘤細胞製備融合瘤。可用之骨髓瘤細胞株，包括(但不限於)X63-Ag8.653及來自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA之骨髓瘤細胞株，可用於雜交中。一般而言，該技術涉及使用諸如聚乙二醇之融合劑或藉由熟習此項技術者熟知之電方式使骨髓瘤細胞與淋巴樣細胞融合。在融合之後，將細胞自融合培養基中分離且在諸如次黃嘌呤-胺基喋呤-胸苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine；HAT)培養基之選擇性生長培養 基中生長，以消除未雜交之親本細胞。補充有血清或未補充血清之本文所述之任何培養基可用於培養分泌單株抗體之融合瘤。作為細胞融合技術之另一替代方案，可使用EBV永生化B細胞產生本發明之升糖素受體單株抗體。必要時，使融合瘤或其他永生化B細胞擴展並進行次選殖，且藉由習知免疫分析程序(例如放射性免疫分析、酶免疫分析或螢光免疫分析)分析上清液之抗免疫原活性。
可用作抗體來源之融合瘤涵蓋產生對升糖素受體具特異性之單株抗體之親本融合瘤的所有衍生物、子代細胞，或其一部分。
可使用已知程序使產生該等抗體之融合瘤在活體外或活體內生長。必要時，可藉由諸如硫酸銨沈澱、凝膠電泳、透析、層析及超濾之習知免疫球蛋白純化程序，自培養基或體液中分離單株抗體。可例如藉由使製劑在由附著至固相之免疫原製成之吸附劑之上流動且自免疫原溶離出或釋放出所要抗體來移除不當活性(若存在)。使用雙功能劑或衍生劑，例如順丁烯二醯亞胺基苄醯基磺基丁二醯亞胺酯(經半胱胺酸殘基結合)、N-羥基丁二醯亞胺(經離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl2或R1N=C=NR(其中R及R1為不同烷基)，以含有結合至在待免疫之物種中具免疫原性之蛋白質的目標胺基酸序列之升糖素受體多肽或片段對宿主動物進行免疫，該蛋白質為例如匙孔螺血氰蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，可得到抗體(例如單株抗體)之群體。
必要時，可對相關之抗升糖素受體之拮抗劑抗體(單株或多株)進行定序，且可接著將聚核苷酸序列選殖至載體中以供表現或繁殖。可將編碼相關抗體之序列維持於宿主細胞中之載體中，且可接著擴展及冷凍宿主細胞以供日後使用。在細胞培養物中產生重組單株抗體可經由以此項技術中已知之方式選殖來自B細胞之抗體基因而進行。參見例如Tiller等人，2008,J.Immunol.Methods 329,112；美國專利第 7,314,622號。
在一些實施例中，聚核苷酸序列可用於基因操作以使抗體「人類化」或改良抗體之親和力或其他特徵。抗體亦可經定製以供例如在犬、貓、靈長類動物、馬及牛中使用。
在一些實施例中，完全人類抗體可藉由使用已經工程改造以表現特異性人類免疫球蛋白之市售小鼠獲得。經設計以產生更合需要(例如完全人類抗體)或更穩固之免疫反應的轉殖基因動物亦可用於產生人類化或人類抗體。該技術之實例為來自Abgenix,Inc.(Fremont,CA)之XenomouseTM及來自Medarex,Inc.(Princeton,NJ)之HuMAb-Mouse®及TC MouseTM。
抗體可藉由首先自宿主動物中分離抗體及抗體產生細胞，獲得基因序列，及使用該基因序列在宿主細胞(例如CHO細胞)中重組表現該抗體而以重組方式製得。另一種可採用之方法為在植物(例如菸草)或轉殖基因牛乳中表現抗體序列。已揭示在植物或牛乳中重組表現抗體之方法。參見例如Peeters等人Vaccine 19：2756,2001；Lonberg,N.及D.Huszar Int.Rev.Immunol 13：65,1995；及Pollock等人，J Immunol Methods 231：147,1999。製造抗體衍生物(例如域抗體、單鏈抗體等)之方法在此項技術中為已知的。
亦可採用免疫分析及流動式細胞測量術分選技術(諸如螢光活化細胞分選(FACS))分離對升糖素受體具特異性之抗體。
編碼單株抗體之DNA易於使用習知程序(例如藉由使用能夠特異性地結合至編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)來分離及定序。融合瘤細胞充當該DNA之較佳來源。一旦分離，即可將DNA置於表現載體(諸如PCT公開案第WO 87/04462中所揭示之表現載體)中，接著將其轉染至不會以其他方式產生免疫球蛋白之宿主細胞(諸如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或骨髓瘤 細胞)中，以達成在重組宿主細胞中合成單株抗體。參見例如PCT公開案第WO 87/04462號。DNA亦可例如藉由用人類重鏈及輕鏈恆定域之編碼序列替代同源鼠類序列(Morrison等人，Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851,1984)，或藉由使非免疫球蛋白多肽之編碼序列之全部或一部分共價連接至免疫球蛋白編碼序列來修飾。以彼方式，製備具有本文中之升糖素受體單株抗體之結合特異性的「嵌合」或「雜交」抗體。
抗體片段可藉由抗體之蛋白水解或其他降解，藉由如上文所述之重組方法(亦即單一或融合多肽)，或藉由化學合成來產生。抗體之多肽，尤其至多約50個胺基酸之較短多肽宜藉由化學合成而製得。化學合成之方法在此項技術中為已知的且可購得。舉例而言，可藉由採用固相法之自動化多肽合成器來產生抗體。亦參見美國專利第5,807,715號、第4,816,567號及第6,331,415號。
在一些實施例中，聚核苷酸包含編碼抗體mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、LM1、LM2、LM3、LM4、LM6、LM7、LM8、LM9、LM11、HM4、HM6、HM7、HM8、HM11或HM12之重鏈及/或輕鏈可變區的序列。可將編碼相關抗體之序列維持於宿主細胞中之載體中，且可接著擴展及冷凍宿主細胞以供日後使用。載體(包括表現載體)及宿主細胞進一步描述於本文中。
本發明包括親和力成熟之實施例。舉例而言，親和力成熟之抗體可藉由此項技術中已知之程序產生(Marks等人，1992,Bio/Technology,10：779-783；Barbas等人，1994,Proc Nat.Acad.Sci,USA 91：3809-3813；Schier等人，1995,Gene,169：147-155；Yelton等人，1995,J.Immunol.,155：1994-2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.,154(7)：3310-9；Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.,226：889-896；及PCT公開案第WO2004/058184號)。
以下方法可用於調整抗體之親和力及用於表徵CDR。一種表徵抗體之CDR及/或改變(諸如改良)多肽(諸如抗體)之結合親和力的方式稱為「文庫掃描突變誘發」。一般而言，文庫掃描突變誘發如下工作。使用技術公認之方法，用兩個或兩個以上(諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)胺基酸置換CDR中之一或多個胺基酸位置。此產生純系之小文庫(在一些實施例中，對於每個經分析之胺基酸位置產生一個文庫)，各自具有兩個或兩個以上成員之複雜性(若在每個位置處取代兩個或兩個以上胺基酸)。一般而言，該文庫亦包括包含原生(未經取代)胺基酸之純系。將來自各文庫之少量純系(例如約20-80個純系(視文庫之複雜性而定))針對對標靶多肽(或其他結合標靶)之結合親和力進行篩選，且鑑別具有增加、相同、減少之結合或無結合之候選物。測定結合親和力之方法在此項技術中為熟知的。結合親和力可使用例如BiacoreTM表面電漿子共振分析(其偵測約2倍或2倍以上之結合親和力差異)、Kinexa®生物感測器、閃爍近接分析、ELISA、ORIGEN®免疫分析、螢光淬滅、螢光轉移及/或酵母呈現來測定。結合親和力亦可使用適合之生物分析來篩選。當初始抗體已以相對較高親和力結合時，例如約10nM或10nM以下之KD，BiacoreTM尤其適用。
在一些實施例中，使用技術公認之突變誘發方法(其中一些描述於本文中)，用所有20種天然胺基酸置換CDR中之每個胺基酸位置(在一些實施例中，一次一種)。此產生純系之小文庫(在一些實施例中，對於每個經分析之胺基酸位置產生一個文庫)，各自具有20個成員之複雜性(若所有20種胺基酸在每個位置處取代)。
在一些實施例中，待篩選之文庫包含在兩個或兩個以上位置處之取代，其可在同一CDR中或在兩個或兩個以上CDR中。因此，文庫可包含在一個CDR中之兩個或兩個以上位置處之取代。文庫可包含在 兩個或兩個以上CDR中之兩個或兩個以上位置處之取代。文庫可包含在3、4、5個或5個以上位置處之取代，該等位置見於兩個、三個、四個、五個或六個CDR中。該取代使用低冗餘密碼子來製備。參見例如Balint等人，1993,Gene 137(1)：109-18之表2。
CDR可為重鏈可變區(VH)CDR3及/或輕鏈可變區(VL)CDR3。CDR可為VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及/或VL CDR3中之一或多者。CDR可為Kabat CDR、Chothia CDR、延伸CDR、AbM CDR、接觸CDR或構形CDR。
可對具有改良之結合的候選物進行定序，藉此鑑別得到改良之親和力(亦稱為「改良」之取代)的CDR取代突變體。亦可對結合之候選物進行定序，藉此鑑別保持結合之CDR取代。
可進行多輪篩選。舉例而言，具有改良之結合的候選物(各自包含在一或多個CDR之一或多個位置處之胺基酸取代)亦適用於設計在各改良之CDR位置(亦即，CDR中之胺基酸位置，在該位置處取代突變體顯示改良之結合)含有至少原始及經取代之胺基酸的第二文庫。此文庫之製備及篩選或選擇進一步論述於下文中。
文庫掃描突變誘發亦提供一種用於表徵CDR之方式，至於具有改良之結合、相同結合、減少之結合或無結合之純系的頻率亦提供與各胺基酸位置對抗體-抗原複合物之穩定性的重要性有關之資訊。舉例而言，若CDR之位置在變為所有20種胺基酸時保持結合，則將彼位置鑑別為不太可能為抗原結合所需之位置。相反地，若CDR之位置在僅較小百分比之取代中保持結合，則將彼位置鑑別為對CDR功能而言較重要之位置。因此，文庫掃描突變誘發方法產生關於CDR中可變為許多不同胺基酸(包括所有20種胺基酸)之位置及CDR中不可變為或僅可變為少數胺基酸之位置的資訊。
可在第二文庫中組合具有改良之親和力的候選物，該第二文庫 包括改良之胺基酸、在彼位置處之原始胺基酸，且視所要文庫或使用所要篩選或選擇方法所允許之文庫的複雜性而定，其可進一步包括在彼位置處之其他取代。另外，必要時，可將相鄰胺基酸位置隨機化為至少兩個或兩個以上胺基酸。相鄰胺基酸之隨機化可允許突變型CDR中之額外構形靈活性，繼而可允許或促進引入較大數目之改良突變。文庫亦可包含在第一輪篩選中不顯示改良之親和力之位置處的取代。
使用此項技術中已知之任何方法針對具有改良及/或改變之結合親和力的文庫成員來篩選或選擇第二文庫，包括使用KinexaTM生物感測器分析進行篩選，及使用此項技術中已知用於選擇之任何方法進行選擇，包括噬菌體呈現、酵母呈現及核糖體呈現。
為表現本發明之抗升糖素受體之抗體，可首先使用上文所述之任何方法獲得編碼VH及VL區之DNA片段。亦可使用熟習此項技術者已知之標準方法將各種修飾，例如突變、缺失及/或添加引入DNA序列中。舉例而言，可使用諸如PCR介導之突變誘發的標準方法進行突變誘發，其中將經突變之核苷酸引入PCR引子中，以使得PCR產物含有所要突變或定點突變誘發。
本發明涵蓋對表1中所示之可變區及表2A或2B中所示之CDR的修飾。舉例而言，本發明包括包含不會顯著影響其特性之功能等效可變區及CDR之抗體，以及具有增強或增加之活性及/或親和力之變異體。舉例而言，胺基酸序列可經突變以獲得對升糖素受體具有所要結合親和力之抗體。多肽修飾為此項技術中之常規實踐且無需在本文中詳細描述。經修飾多肽之實例包括具有胺基酸殘基之保守取代、胺基酸之一或多個缺失或添加的多肽，該等取代、缺失或添加不會顯著不利地改變功能活性，或使多肽對其配位體或化學類似物之使用的親和力成熟(增強)。
胺基酸序列插入物包括長度在一個殘基至含有一百個或多於一 百個殘基之多肽範圍內的胺基端及/或羧基端融合體，以及具有單一或多個胺基酸殘基之序列內插入物。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體或融合至抗原決定基標籤之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括與增加抗體於血液循環中之半衰期的酶或多肽之抗體之N端或C端之融合體。
取代變異體具有在已移除之抗體分子中之至少一個胺基酸殘基及在其位置處插入之不同殘基。取代突變誘發最相關之位點包括高變區，但亦涵蓋構架變化。保守取代展示於表3中之標題「保守取代」下。若該等取代引起生物活性變化，則可引入更多實質性變化，表3中命名為「例示性取代」或如下文關於胺基酸種類進一步描述，且篩選產物。
對抗體之生物特性的實質性修飾係藉由選擇取代來實現，該等取代在其維持以下之作用方面顯著不同：(a)取代區域中多肽骨架之結構，例如β片或螺旋構形；(b)分子在目標位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈體積。可基於共同側鏈特性將天然存在之殘基分組：(1)非極性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)極性、不帶電荷：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性(帶負電荷)：Asp、Glu；(4)鹼性(帶正電荷)：Lys、Arg；(5)影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；及(6)芳族：Trp、Tyr、Phe、His。
藉由將此等種類之一之成員交換為另一種類之成員來進行非保守取代。
舉例而言，可進行之一種類型之取代為將抗體中可具化學反應性之一或多個半胱胺酸變為另一殘基，諸如(但不限於)丙胺酸或絲胺酸。舉例而言，可存在非典型半胱胺酸之取代。取代可在可變域之CDR或構架區中或抗體之恆定區中進行。在一些實施例中，半胱胺酸為典型半胱胺酸。亦可取代任何不涉及維持抗體之適當構形的半胱胺酸殘基，一般用絲胺酸取代，以改良分子之氧化穩定性且防止異常交聯。相反地，可將半胱胺酸鍵添加至抗體中以改良其穩定性，尤其在抗體為諸如Fv片段之抗體片段時。
抗體亦可例如在重鏈及/或輕鏈之可變域中經修飾，例如，以改變抗體之結合特性。可變區中之變化可改變結合親和力及/或特異 性。在一些實施例中，在CDR域內進行不多於一至五個保守胺基酸取代。在其他實施例中，在CDR域內進行不多於一至三個保守胺基酸取代。舉例而言，可在一或多個CDR區中進行突變以增加或減小抗體對升糖素受體之KD，增加或減小koff，或改變抗體之結合親和力。定點突變誘發之技術在此項技術中為熟知的。參見例如Sambrook等人及Ausubel等人，同上。
亦可在構架區或恆定區中進行修飾或突變以增加抗升糖素受體之抗體的半衰期。參見例如PCT公開案第WO 00/09560號。亦可在構架區或恆定區中進行突變以改變抗體之免疫原性，提供共價或非共價結合至另一分子之位點，或改變諸如補體固定、FcR結合及抗體依賴性細胞介導之細胞毒性的特性。在一些實施例中，在構架區或恆定區內進行不多於一至五個保守胺基酸取代。在其他實施例中，在構架區或恆定區內進行不多於一至三個保守胺基酸取代。根據本發明，單一抗體可在可變域之CDR或構架區中之任何一或多者中或在恆定區中具有突變。
修飾亦包括糖基化及非糖基化多肽以及具有其他轉譯後修飾之多肽，該等轉譯後修飾為諸如使用不同糖之糖基化、乙醯化及磷酸化。抗體在其恆定區中之保守位置處經糖基化(Jefferis及Lund,1997,Chem.Immunol.65：111-128；Wright及Morrison,1997,TibTECH 15：26-32)。免疫球蛋白之寡醣側鏈影響蛋白質之功能(Boyd等人，1996,Mol.Immunol.32：1311-1318；Wittwe及Howard,1990,Biochem.29：4175-4180)及醣蛋白部分之間的分子內相互作用，此可影響醣蛋白之構形及所呈現之三維表面(Jefferis及Lund，同上；Wyss及Wagner,1996,Current Opin.Biotech.7：409-416)。寡醣亦可用以使既定醣蛋白基於特異性識別結構靶向某些分子。亦已報導抗體之糖基化影響抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。詳言之，已報導藉由CHO細胞使用四環素 調控之β(1,4)-N-乙醯葡糖胺轉移酶III(GnTIII)表現、對分GlcNAc之糖基轉移酶催化形成而產生之抗體具有改良之ADCC活性(Umana等人，1999,Nature Biotech.17：176-180)。
抗體之糖基化通常為N-連接或O-連接。N-連接係指碳水化合物部分連接至天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸、天冬醯胺-X-蘇胺酸及天冬醯胺-X-半胱胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為用於碳水化合物部分酶促連接至天冬醯胺側鏈之識別序列。因此，多肽中此等三肽序列中之任一者的存在產生潛在糖基化位點。O-連接糖基化係指糖類N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖或木糖之一連接至羥基胺基酸，最常見的為絲胺酸或蘇胺酸，不過亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
向抗體中添加糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列，以使其含有上述三肽序列中之一或多者來實現(針對N-連接糖基化位點)。該改變亦可藉由向原始抗體之序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基進行取代來實現(針對O-連接糖基化位點)。
亦可在不改變根本核苷酸序列之情況下改變抗體之糖基化型式。糖基化主要視用於表現抗體之宿主細胞而定。由於用於表現作為潛在治療劑之重組醣蛋白(例如抗體)之細胞類型極少為原生細胞，故可預期抗體之糖基化型式的變化(參見例如Hse等人，1997,J.Biol.Chem.272：9062-9070)。
除宿主細胞之選擇以外，在重組產生抗體期間影響糖基化之因素包括生長模式、培養基調配物、培養物密度、氧合作用、pH值、純化方案及其類似因素。已提議多種方法來改變在特定宿主生物體中達成之糖基化型式，包括引入或過度表現寡醣產生中所涉及之某些酶(美國專利第5,047,335號、第5,510,261號及第5,278,299號)。糖基化或 某些類型之糖基化可以酶促方式自醣蛋白移除，例如使用內切糖苷酶H(Endo H)、N-糖苷酶F、內切糖苷酶F1、內切糖苷酶F2、內切糖苷酶F3。另外，可將重組宿主細胞遺傳工程改造成在處理某些類型之多醣中有缺陷。此等及類似技術在此項技術中為熟知的。
其他修飾方法包括使用此項技術中已知之偶合技術，包括(但不限於)酶促方式、氧化取代及螯合。修飾可用於例如連接標記以供免疫分析。經修飾之多肽係使用此項技術中確立之程序製得，且可使用此項技術中已知之標準分析來篩選，其中一些分析描述於下文及實例中。
在一些實施例中，抗體包含經修飾之恆定區，其對人類Fcγ受體具有增加或降低之結合親和力；為免疫惰性或部分惰性的，例如不會觸發補體介導之溶解，不會刺激抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)，或不會活化微神經膠質細胞；或在以下任何一或多者中具有降低之活性(與未經修飾之抗體相比)：觸發補體介導之溶解，刺激ADCC，或活化微神經膠質細胞。恆定區之不同修飾可用於達成效應功能之最佳水準及/或組合。參見例如Morgan等人，Immunology 86：319-324,1995；Lund等人，J.Immunology 157：4963-9 157：4963-4969,1996；Idusogie等人，J.Immunology 164：4178-4184,2000；Tao等人，J.Immunology 143：2595-2601,1989；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59-76,1998。在一些實施例中，如Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624；PCT申請案第PCT/GB99/01441號；及/或UK專利申請案第9809951.8號中所述對恆定區進行修飾。
在一些實施例中，可對抗體恆定區進行修飾以避免與Fcγ受體以及補體系統及免疫系統相互作用。製備該等抗體之技術描述於WO 99/58572中。舉例而言，若抗體用於人類臨床試驗及治療中，可將恆定區工程改造成更類似於人類恆定區以避免免疫反應。參見例如美國 專利第5,997,867號及第5,866,692號。
在一些實施例中，Fc可為人類IgG2或人類IgG4。Fc可為含有突變A330P331至S330S331(IgG2△a)之人類IgG2，其中胺基酸殘基係參考野生型IgG2序列進行編號。Eur.J.Immunol.,1999,29：2613-2624。在一些實施例中，抗體包含IgG4之恆定區，其包含以下突變(Armour等人，2003,Molecular Immunology 40 585-593)：E233F234L235至P233V234A235(IgG4△c)，其中編號係參考野生型IgG4。在另一實例中，Fc為人類IgG4 E233F234L235至P233V234A235，其具有缺失G236(IgG4△b)。在另一實施例中，Fc為任何人類IgG4 Fc(IgG4、IgG4△b或IgG4△c)，其含有鉸鏈穩定突變S228至P228(Aalberse等人，2002,Immunology 105,9-19)。
在其他實施例中，恆定區係針對N-連接糖基化來進行去糖基化。在一些實施例中，恆定區係針對N-連接糖基化藉由使寡醣連接殘基及/或作為恆定區中N-糖基化識別序列之一部分的側接殘基突變來進行去糖基化。舉例而言，N-糖基化位點N297可突變為例如A、Q、K或H。參見Tao等人，J.Immunology 143：2595-2601,1989；及Jefferis等人，Immunological Reviews 163：59-76,1998。在一些實施例中，恆定區係針對N-連接糖基化來進行去糖基化。恆定區可針對N-連接糖基化以酶促方式(諸如由酶PNGase移除碳水化合物)或藉由表現於糖基化缺乏宿主細胞中來進行去糖基化。
其他抗體修飾包括已如PCT公開案第WO 99/58572號中所述而修飾之抗體。除針對標靶分子之結合域以外，此等抗體亦包含具有實質上與人類免疫球蛋白重鏈之恆定區之全部或一部分同源之胺基酸序列的效應域。此等抗體能夠結合標靶分子，而不會觸發顯著補體依賴性溶解或細胞介導之標靶破壞。在一些實施例中，效應域能夠特異性地結合FcRn及/或FcγRIIb。此等效應域通常係基於來源於兩個或兩個以 上人類免疫球蛋白重鏈CH2域之嵌合域。以此方式修飾之抗體尤其適合用於慢性抗體療法中以避免習知抗體療法之發炎反應及其他不良反應。
在一些實施例中，抗體包含經修飾之恆定區，與未經修飾之抗體相比，其對FcRn具有增加之結合親和力及/或具有增加之血清半衰期。
在稱為「生殖系化(germlining)」之過程中，VH及VL序列中之某些胺基酸可經突變以匹配生殖系VH及VL序列中天然所見之胺基酸。詳言之，VH及VL序列中之構架區之胺基酸序列可經突變以匹配生殖系序列，從而當投與抗體時降低免疫原性之風險。人類VH及VL基因之生殖系DNA序列在此項技術中為已知的(參見例如「Vbase」人類生殖系序列資料庫；亦參見Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號；Tomlinson等人，1992,J.Mol.Biol.227：776-798；及Cox等人，1994,Eur.J.Immunol.24：827-836)。
可進行之另一種類型之胺基酸取代為移除抗體中之潛在蛋白水解位點。該等位點可存在於可變域之CDR或構架區中或抗體之恆定區中。半胱胺酸殘基之取代及蛋白水解位點之移除可降低抗體產物異質性之風險且因此增加其同質性。另一種類型之胺基酸取代為消除形成潛在去醯胺化位點之天冬醯胺-甘胺酸對，此係藉由改變該等殘基中之一或兩者來達成。在另一實例中，可使本發明之抗升糖素受體之抗體之重鏈的C端離胺酸裂解。在本發明之多個實施例中，抗升糖素受體之抗體之重鏈及輕鏈可視情況包括信號序列。
一旦獲得編碼本發明之VH及VL區段之DNA片段，即可藉由標準重組DNA技術進一步操作此等DNA片段，例如以使可變區基因轉變 成全長抗體鏈基因、轉變成Fab片段基因或轉變成scFv基因。在此等操作中，使編碼VL或VH之DNA片段操作性地連接至編碼另一蛋白質之另一DNA片段，諸如抗體恆定區或可撓性連接子。如此上下文中所用之術語「操作性地連接」欲意謂使兩個DNA片段連接以使得由該兩個DNA片段編碼之胺基酸序列保持同框。
可藉由使編碼VH之DNA操作性地連接至編碼重鏈恆定區(CH1、CH2及CH3)之另一DNA分子而使編碼VH區之經分離DNA轉變成全長重鏈基因。人類重鏈恆定區基因之序列在此項技術中為已知的(參見例如Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號)，且可藉由標準PCR擴增獲得涵蓋此等區之DNA片段。重鏈恆定區可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恆定區，但最佳為IgG1或IgG2恆定區。IgG恆定區序列可為已知存在於不同個體之間的各種對偶基因或異型中之任一者，諸如Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)及Gm(17)。此等異型表示IgG1恆定區中天然存在之胺基酸取代。對於Fab片段重鏈基因，可使編碼VH之DNA操作性地連接至僅編碼重鏈CH1恆定區之另一DNA分子。CH1重鏈恆定區可來源於重鏈基因中之任一者。
可藉由使編碼VL之DNA操作性地連接至編碼輕鏈恆定區CL之另一DNA分子而使編碼VL區之經分離DNA轉變成全長輕鏈基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因之序列在此項技術中為已知的(參見例如Kabat,E.A.等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版物第91-3242號)，且可藉由標準PCR擴增獲得涵蓋此等區之DNA片段。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。κ恆定區可為已知存在於不同個體之間的各種對偶基因中之任一者，諸如Inv(1)、 Inv(2)及Inv(3)。λ恆定區可來源於三個λ基因中之任一者。
為產生scFv基因，使編碼VH及VL之DNA片段操作性地連接至編碼可撓性連接子之另一片段，以使得VH及VL序列可表現為連續單鏈蛋白質，其中VL及VH區係由可撓性連接子連接(參見例如Bird等人，1988,Science 242：423-426；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等人，1990,Nature 348：552-554)。連接肽之一個實例為(GGGGS)3(SEQ ID NO：18)，其在一個可變區之羧基端與另一可變區之胺基端之間橋連約3.5nm。已設計及使用其他序列之連接子(Bird等人，1988，同上)。繼而可對連接子進行修飾以用於其他功能，諸如藥物附著或附著至固體支撐物。若僅使用單一VH及VL，則單鏈抗體可為單價；若使用兩個VH及VL，則其可為二價；或若使用兩個以上VH及VL，則其可為多價。可產生雙特異性或多價抗體，其特異性地結合至升糖素受體及另一分子。可以重組方式或以合成方式產生單鏈變異體。對於以合成方式產生scFv，可使用自動化合成器。對於以重組方式產生scFv，可將含有編碼scFv之聚核苷酸的適合質體引入適合宿主細胞中，該宿主細胞為真核細胞，諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞，或原核細胞，諸如大腸桿菌。可藉由諸如聚核苷酸接合之常規操作製得編碼相關scFv之聚核苷酸。可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術分離所得scFv。
亦涵蓋其他形式之單鏈抗體，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL表現於單一多肽鏈上，但使用過短而無法在同一鏈上之兩個域之間配對的連接子，藉此迫使該等域與另一鏈之互補域配對且產生兩個抗原結合位點(參見例如Holliger,P.等人，1993,Proc.Natl.Acad Sci.USA 90：6444-6448；Poljak,R.J.等人，1994,Structure 2：1121-1123)。
包含兩個共價連接之抗體的異結合抗體亦處於本發明之範疇 內。該等抗體已用於使免疫系統細胞靶向不當細胞(美國專利第4,676,980號)，且用於治療HIV感染(PCT公開案第WO 91/00360號及第WO 92/200373號；EP 03089)。異結合抗體可使用任何適宜之交聯方法製得。適合之交聯劑及技術在此項技術中為熟知的，且描述於美國專利第4,676,980號中。
亦可使用合成蛋白質化學之已知方法(包括涉及交聯劑之方法)在活體外製備嵌合或雜交抗體。舉例而言，可使用二硫基交換反應或藉由形成硫醚鍵來構築免疫毒素。用於達成此目的之適合試劑之實例包括亞胺基硫醇酯及甲基-4-巰基丁醯亞胺酯。
本發明亦涵蓋包含來自本文所揭示之抗體之一或多個片段或區的融合蛋白質。在一些實施例中，可製得融合抗體，其包含連接至另一多肽之本發明之抗升糖素受體之抗體的全部或一部分。在另一實施例中，僅抗升糖素受體之抗體之可變域連接至多肽。在另一實施例中，抗升糖素受體之抗體之VH域連接至第一多肽，而抗升糖素受體之抗體之VL域連接至第二多肽，該第二多肽以一定方式與第一多肽締合以使得VH及VL域可彼此相互作用以形成抗原結合位點。在另一較佳實施例中，VH域與VL域由連接子隔離以使得VH及VL域可彼此相互作用。VH-連接子-VL抗體接著連接至相關多肽。另外，可產生融合抗體，其中兩個(或兩個以上)單鏈抗體連接至彼此。若吾人欲在單一多肽鏈上產生二價或多價抗體，或吾人欲產生雙特異性抗體，則此為適用的。
在一些實施例中，提供融合多肽，其包含SEQ ID NO：2、4、6、8、10或42所示之可變輕鏈區之至少10個鄰接胺基酸及/或SEQ ID NO：3、5、7、9、11或43所示之可變重鏈區之至少10個胺基酸。在其他實施例中，提供融合多肽，其包含可變輕鏈區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個鄰接胺基酸；及/或可變 重鏈區之至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個鄰接胺基酸。在另一實施例中，融合多肽包含如選自SEQ ID NO：2與3、4與5、6與7、8與9、10與11及42與43之序列對中之任一者所示的輕鏈可變區及/或重鏈可變區。在另一實施例中，融合多肽包含一或多個CDR。在其他實施例中，融合多肽包含VH CDR3及/或VL CDR3。就本發明而言，融合蛋白質含有一或多個抗體及其在原生分子中不連接之另一胺基酸序列，例如異源序列或來自另一區之同源序列。例示性異源序列包括(但不限於)「標籤」，諸如FLAG標籤或6His標籤。標籤在此項技術中為熟知的。
可藉由此項技術中已知之方法，例如以合成方式或以重組方式產生融合多肽。通常，本發明之融合蛋白質係藉由使用本文所述之重組方法製備及表現編碼其之聚核苷酸來製得，不過其亦可藉由此項技術中已知之其他方式製備，包括例如化學合成。
在其他實施例中，可使用編碼抗升糖素受體之抗體的核酸分子來製備其他經修飾之抗體。舉例而言，可使用標準分子生物學技術，遵循本說明書之教示來製備「κ體」(Ill等人，1997,Protein Eng.10：949-57)、「微型抗體」(Martin等人，1994,EMBO J.13：5303-9)、「雙功能抗體」(Holliger等人，同上)或「兩面蛋白(Janusin)」(Traunecker等人，1991,EMBO J.10：3655-3659及Traunecker等人，1992,Int.J.Cancer(增刊)7：51-52)。
舉例而言，可使用本文所揭示之抗體來製備雙特異性抗體，其為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株抗體。製造雙特異性抗體之方法在此項技術中為已知的(參見例如Suresh等人，1986,Methods in Enzymology 121：210)。舉例而言，可藉由融合瘤融合或Fab'片段連接來產生雙特異性抗體或抗原結合片段。參見例如Songsivilai及Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人， 1992,J.Immunol.148：1547-1553。傳統上，雙特異性抗體之重組產生係基於兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共表現，其中兩個重鏈具有不同特異性(Millstein及Cuello,1983,Nature 305,537-539)。另外，雙特異性抗體可以「雙功能抗體」或「兩面蛋白」之形式形成。在一些實施例中，雙特異性抗體結合至升糖素受體之兩個不同抗原決定基。在一些實施例中，使用來自本文所提供之抗升糖素受體之抗體之可變域或CDR區中之一或多者來製備上文所述之經修飾抗體。
根據一種用以製造雙特異性抗體之方法，使具有所要結合特異性(抗體-抗原組合位點)之抗體可變域融合至免疫球蛋白恆定區序列。融合較佳係與包含鉸鏈、CH2及CH3區之至少一部分的免疫球蛋白重鏈恆定區融合。較佳使含有輕鏈結合所必需之位點的第一重鏈恆定區(CH1)存在於融合體中之至少一者中。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體及必要時免疫球蛋白輕鏈之DNA插入各別表現載體中，且共轉染至適合之宿主生物體中。當在構築中所用之三個多肽鏈之不等比率提供最佳產率時，此提供在實施例中調整三個多肽片段之相互比例的較大靈活性。然而，當等比率之至少兩個多肽鏈之表現得到高產率或當比率並非特別重要時，可能將兩個或全部三個多肽鏈之編碼序列插入一個表現載體中。
在一種方法中，雙特異性抗體之一個臂由具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈構成，且另一個臂由雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)構成。僅在一半雙特異性分子中具有免疫球蛋白輕鏈之不對稱結構有助於將所要雙特異性化合物與不當之免疫球蛋白鏈組合分離。此方法描述於PCT公開案第WO 94/04690號中。
本發明亦提供包含結合(例如連接)至有助於偶合至固體支撐物(諸如生物素或抗生物素蛋白)之試劑之抗體的組合物。為簡單起見，將一般參考抗體，其條件為此等方法適用於本文所述之升糖素受體結 合及/或拮抗劑實施例中之任一者。結合一般係指連接如本文所述之此等組分。該連接(其一般至少出於投藥而將此等組分固定於緊密締合中)可依許多方式達成。舉例而言，當各自具有能夠與另一者反應之取代基時，在試劑與抗體之間的直接反應為可能的。舉例而言，諸如胺基或硫氫基之親核基團一方面可能夠與諸如酐或酸鹵化物之含羰基基團反應，或另一方面可能夠與含有良好脫離基(例如鹵基)之烷基反應。
抗體可結合至許多不同載劑。載劑可為活性及/或惰性的。熟知載劑之實例包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、耐綸(nylon)、澱粉酶、玻璃、天然纖維素及經改質之纖維素、聚丙烯醯胺、瓊脂糖及磁鐵礦。就本發明而言，載劑之性質可為可溶或不可溶的。熟習此項技術者將知曉抗體之其他適合載劑，或將能夠使用常規實驗確定該等載劑。在一些實施例中，載劑包含靶向肺、心或心瓣膜之部分。
本發明之抗體或多肽可連接至標記劑，諸如螢光分子、放射性分子或此項技術中已知之任何其他標記。標記在此項技術中為已知的，其一般提供(直接或間接)信號。
聚核苷酸、載體及宿主細胞
本發明亦提供聚核苷酸，其編碼任何抗體，包括本文所述之抗體片段及經修飾之抗體，諸如具有削弱之效應功能的抗體。在另一態樣中，本發明提供一種製造本文所述之聚核苷酸中之任一者之方法。可藉由此項技術中已知之程序製造及表現聚核苷酸。因此，本發明提供聚核苷酸或組合物，包括醫藥組合物，其包含編碼以下任一者之聚核苷酸：抗體mAb1、mAb2、mAb3、mAb4、mAb5、mAb6、LM1、LM2、LM3、LM4、LM6、LM7、LM8、LM9、LM11、HM4、HM6、HM7、HM8、HM11及HM12，或其具有拮抗升糖素受體之能力的任何片段或部分。
本發明亦涵蓋與任何該等序列互補之聚核苷酸。聚核苷酸可為單股(編碼或反義)或雙股，且可為DNA(基因組DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。RNA分子包括含有內含子且以一對一之方式對應於DNA分子之HnRNA分子，及不含內含子之mRNA分子。其他編碼或非編碼序列可能(但不必需)存在於本發明之聚核苷酸內，且聚核苷酸可能(但不必需)連接至其他分子及/或支撐材料。
聚核苷酸可包含原生序列(亦即編碼抗體或其片段之內源序列)或可包含此種序列之變異體。聚核苷酸變異體含有一或多個取代、添加、缺失及/或插入，使得經編碼多肽之免疫反應性相對於原生免疫反應性分子並未減小。一般可如本文所述來評估對經編碼多肽之免疫反應性的影響。變異體與編碼原生抗體或其片段之聚核苷酸序列展現較佳至少約70%一致性、更佳至少約80%一致性、甚至更佳至少約90%一致性且最佳至少約95%一致性。
當如下文所述比對最大對應性時，若兩個聚核苷酸或多肽序列中之核苷酸或胺基酸之序列相同，則稱該兩個序列為「一致」的。兩個序列之間的比較通常係藉由在比較窗口上比較該等序列來進行以鑑別及比較具有序列相似性之局部區。如本文所用之「比較窗口」係指至少約20個鄰接位置之區段(通常30個至約75個或40個至約50個)，其中在最佳比對一個序列與具有相同數目之鄰接位置的參考序列之後，可比較該兩個序列。
可使用生物資訊學軟體(DNASTAR®,Inc.,Madison,WI)之Lasergene®套件中之MegAlign®程式，使用預設參數來進行序列之最佳比對以供比較。此程式體現以下參考文獻中所述之若干比對方案：Dayhoff,M.O.,1978,A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships.Dayhoff,M.O.(編)Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,Washington DC第5卷，增刊3，第345-358頁；Hein J.,1990,Unified Approach to Alignment and Phylogenes第626-645頁Methods in Enzymology第183卷，Academic Press,Inc.,San Diego,CA；Higgins,D.G.及Sharp,P.M.,1989,CABIOS 5：151-153；Myers,E.W.及Muller W.,1988,CABIOS 4：11-17；Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11：105；Santou,N.,Nes,M.,1987,Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath,P.H.A.及Sokal,R.R.,1973,Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy,Freeman Press,San Francisco,CA；Wilbur,W.J.及Lipman,D.J.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
較佳地，「序列一致性百分比」係藉由在至少20個位置之比較窗口上比較兩個經最佳比對之序列來確定，其中在比較窗口中之聚核苷酸或多肽序列之部分與參考序列(其不包含添加或缺失)相比可包含20%或少於20%、通常5%至15%或10%至12%之添加或缺失(亦即空隙)用於兩個序列之最佳比對。百分比係由以下方式計算：確定兩個序列中相同核酸鹼基或胺基酸殘基出現之位置的數目以得到匹配位置之數目，用匹配位置之數目除以參考序列(亦即窗口尺寸)中之位置之總數，且用結果乘以100以得到序列一致性百分比。
變異體亦可或替代地實質上與原生基因或其一部分或補體同源。該等聚核苷酸變異體能夠在適度嚴格條件下與編碼原生抗體(或互補序列)之天然存在之DNA序列雜交。
適合之「適度嚴格條件」包括在5X SSC、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)之溶液中預洗滌；在50℃-65℃下於5X SSC中雜交隔夜；繼而在65℃下用含有0.1% SDS之2X、0.5X及0.2X SSC中之每一者洗滌兩次，持續20分鐘。
如本文所用之「高度嚴格條件」或「高嚴格度條件」為以下條 件：(1)採用低離子強度及高溫用於洗滌，例如在50℃下0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交期間採用變性劑，諸如甲醯胺，例如在42℃下50%(v/v)甲醯胺與0.1%牛血清白蛋白/0.1% Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯啶酮/50mM磷酸鈉緩衝液(pH 6.5)與750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉；或(3)在42℃下採用50%甲醯胺、5x SSC(0.75M NaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH 6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5x鄧哈特氏溶液(Denhardt's solution)、經音波處理之鮭魚精DNA(50μg/ml)、0.1% SDS及10%硫酸葡聚糖，且在42℃下於0.2x SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)洗滌及在55℃下於50%甲醯胺中洗滌，繼之以由在55℃下含有EDTA之0.1x SSC組成之高嚴格度洗滌。熟習此項技術者應認識到如何調整為適應諸如探針長度及其類似物之因素所必需之溫度、離子強度等。
一般技術者應瞭解，由於遺傳密碼之簡併，故存在許多編碼如本文所述之多肽的核苷酸序列。此等聚核苷酸中之一些對任何原生基因之核苷酸序列具有最小同源性。儘管如此，本發明特定涵蓋由於密碼子使用之差異而不同的聚核苷酸。此外，包含本文所提供之聚核苷酸序列之基因的對偶基因處於本發明之範疇內。對偶基因為由於諸如核苷酸缺失、添加及/或取代之一或多個突變而改變之內源基因。所得mRNA及蛋白質可能(但不必需)具有經改變之結構或功能。對偶基因可使用標準技術(諸如雜交、擴增及/或資料庫序列比較)來鑑別。
可使用化學合成、重組方法或PCR獲得本發明之聚核苷酸。化學聚核苷酸合成之方法在此項技術中為熟知的且無需在本文中詳細描述。熟習此項技術者可使用本文所提供之序列及商業DNA合成器以產生所要DNA序列。
對於使用重組方法製備聚核苷酸，如本文進一步論述，可將包含所要序列之聚核苷酸插入適合載體中，且繼而可將載體引入適合宿 主細胞中以供複製及擴增。可藉由此項技術中已知之任何方式將聚核苷酸插入宿主細胞中。藉由直接吸收、內飲作用、轉染、F-配合或電穿孔引入外源聚核苷酸而使細胞轉化。一旦引入，即可將外源聚核苷酸以非整合載體(諸如質體)之形式維持於細胞內或整合至宿主細胞基因組中。可藉由此項技術中熟知之方法將如此擴增之聚核苷酸自宿主細胞中分離。參見例如Sambrook等人，1989。
或者，PCR可複製DNA序列。PCR技術在此項技術中為熟知的且描述於美國專利第4,683,195號、第4,800,159號、第4,754,065號及第4,683,202號以及PCR：The Polymerase Chain Reaction,Mullis等人編，Birkauswer Press,Boston,1994中。
可藉由使用在適當載體中之經分離DNA且將其插入適合宿主細胞中來獲得RNA。當細胞複製及DNA轉錄成RNA時，可接著使用熟習此項技術者熟知之方法分離出RNA，例如，如Sambrook等人，1989,同上所闡述。
適合之選殖載體可根據標準技術來構築，或可選自此項技術中可用之許多選殖載體。儘管所選擇之選殖載體可根據欲使用之宿主細胞而變化，但適用之選殖載體一般具有自我複製之能力、具有針對特定限制性核酸內切酶之單一標靶，及/或可帶有可用於篩選含有載體之選殖體純系之標記基因。適合之實例包括質體及細菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp 19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNA，及穿梭載體，諸如pSA3及pAT28。此等及許多其他選殖載體可獲自商業供應商，諸如BioRad、Strategene及Invitrogen。
本發明進一步提供表現載體。表現載體一般為含有本發明之聚核苷酸之可複製聚核苷酸構築體。此意指表現載體必須以游離基因體或染色體DNA完整地一部分的方式在宿主細胞中複製。適合之表現載 體包括(但不限於)質體、病毒載體(包括腺病毒、腺相關病毒、反轉錄病毒)、黏質體，及PCT公開案第WO 87/04462號中所揭示之表現載體。載體組分一般可包括(但不限於)以下一或多者：信號序列；複製起點；一或多個標記物基因；適合之轉錄控制元件(諸如啟動子、強化子及終止子)。對於表現(亦即轉譯)，通常亦需要一或多個轉譯控制元件，諸如核糖體結合位點、轉譯起始位點及終止密碼子。
可藉由許多適當方式中之任一者，包括電穿孔；採用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質之轉染；微彈轟擊；脂質體轉染；及感染(例如，其中載體為諸如牛痘病毒之感染劑)，將含有相關聚核苷酸之載體引入宿主細胞中。引入載體或聚核苷酸之選擇常常視宿主細胞之特徵而定。
本發明亦提供包含本文所述之聚核苷酸中之任一者的宿主細胞。可使用任何能夠過度表現異源DNA之宿主細胞來達成分離編碼相關抗體、多肽或蛋白質之基因的目的。哺乳動物宿主細胞之非限制性實例包括(但不限於)COS、HeLa及CHO細胞。亦參見PCT公開案第WO 87/04462號。適合之非哺乳動物宿主細胞包括原核生物(諸如大腸桿菌或枯草桿菌(B.subtillis))及酵母(諸如釀酒酵母(S.cerevisae)、裂殖酵母(S.pombe)或乳酸克魯維酵母(K.lactis))。宿主細胞較佳以比宿主細胞中相關之相應內源抗體或蛋白質(若存在)之水準高約5倍、更佳高10倍、甚至更佳高20倍之水準來表現cDNA。針對與升糖素受體或升糖素受體域之特異性結合篩選宿主細胞係藉由免疫分析或FACS來實現。可鑑別過度表現相關抗體或蛋白質之細胞。
表現載體可用於引導抗升糖素受體之拮抗劑抗體的表現。熟習此項技術者熟悉表現載體之投與以獲得活體內外源蛋白質之表現。參見例如美國專利第6,436,908號、第6,413,942號及第6,376,471號。表現載體之投與包括局部或全身投與，包括注射、經口投與、粒子槍或 經導管投與，及局部投與。在另一實施例中，將表現載體直接投與交感神經幹或神經節，或投與冠狀動脈、心房、心室或心包中。
亦可使用含有表現載體或次基因組聚核苷酸之治療性組合物的靶向傳遞。受體介導之DNA傳遞技術描述於例如Findeis等人，Trends Biotechnol.,1993,11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct Gene Transfer,J.A.Wolff編，1994；Wu等人，J.Biol.Chem.,1988,263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.,1994,269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.,1991,266：338中。在基因治療方案中，對於局部投藥，以約100ng至約200mg DNA之範圍投與含有聚核苷酸之治療性組合物。在基因治療方案期間亦可使用約500ng至約50mg、約1μg至約2mg、約5μg至約500μg及約20μg至約100μg DNA之濃度範圍。可使用基因傳遞運載體來傳遞治療性聚核苷酸及多肽。基因傳遞運載體可具有病毒或非病毒起源(一般參見Jolly,Cancer Gene Therapy,1994,1：51；Kimura,Human Gene Therapy,1994,5：845；Connelly,Human Gene Therapy,1995,1：185；及Kaplitt,Nature Genetics,1994,6：148)。可使用內源哺乳動物或異源啟動子來誘導該等編碼序列之表現。編碼序列之表現可為組成性的或經調控。
用於傳遞所要聚核苷酸及在所要細胞中表現之基於病毒之載體在此項技術中為熟知的。例示性的基於病毒之運載體包括(但不限於)重組反轉錄病毒(參見例如PCT公開案第WO 90/07936號、第WO 94/03622號、第WO 93/25698號、第WO 93/25234號、第WO 93/11230號、第WO 93/10218號、第WO 91/02805號；美國專利第5,219,740號及第4,777,127號；GB專利第2,200,651號；及EP專利第0 345 242號)、基於α病毒之載體(例如辛得比病毒載體(Sindbis virus vector)、勝利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、羅氏 河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)及委內瑞拉馬腦脊髓炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))，及腺相關病毒(AAV)載體(參見例如PCT公開案第WO 94/12649號、第WO 93/03769號、第WO 93/19191號、第WO 94/28938號、第WO 95/11984號及第WO 95/00655號)。亦可採用如Curiel,Hum.Gene Ther.,1992,3：147中所述之連接至經殺滅之腺病毒的DNA之投藥。
亦可採用非病毒傳遞運載體及方法，包括(但不限於)連接或未連接至單獨經殺滅之腺病毒的聚陽離子性縮合DNA(參見例如Curiel,Hum.GeneTher.,1992,3：147)；經配位體連接之DNA(參見例如Wu,J.Biol.Chem.,1989,264：16985)；真核細胞傳遞運載體細胞(參見例如美國專利第5,814,482號；PCT公開案第WO 95/07994號、第WO 96/17072號、第WO 95/30763號及第WO 97/42338號)；及與細胞膜之核電荷中和或融合。亦可採用裸DNA。例示性裸DNA引入方法描述於PCT公開案第WO 90/11092號及美國專利第5,580,859號中。可充當基因傳遞運載體之脂質體描述於美國專利第5,422,120號；PCT公開案第WO 95/13796號、第WO 94/23697號、第WO 91/14445號；及EP 0524968中。其他方法描述於Philip,Mol.Cell Biol.,1994,14：2411及Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,91：1581中。
組合物
本發明亦提供醫藥組合物，其包含有效量之本文所述之抗升糖素受體之抗體。該等組合物以及如何調配之實例亦描述於本文中。在一些實施例中，組合物包含一或多種升糖素受體抗體。在其他實施例中，抗升糖素受體之抗體識別升糖素受體。在其他實施例中，抗升糖素受體之抗體為人類抗體。在其他實施例中，抗升糖素受體之抗體為人類化抗體。在一些實施例中，抗升糖素受體之抗體包含能夠觸發所 要免疫反應，諸如抗體介導之溶解或ADCC的恆定區。在其他實施例中，抗升糖素受體之抗體包含不會觸發不當或不合需要之免疫反應，諸如抗體介導之溶解或ADCC的恆定區。在其他實施例中，抗升糖素受體之抗體包含抗體之一或多個CDR(諸如一個、兩個、三個、四個、五個或在一些實施例中全部六個CDR)。
應瞭解，組合物可包含一種以上抗升糖素受體之抗體(例如識別升糖素受體之不同抗原決定基之升糖素受體抗體的混合物)。其他例示性組合物包含一種以上識別相同抗原決定基之抗升糖素受體之抗體，或不同種類之結合至升糖素受體之不同抗原決定基的抗升糖素受體之抗體。在一些實施例中，組合物包含識別升糖素受體之不同變異體之抗升糖素受體之抗體的混合物。
本發明中所用之組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(Remington：The Science and practice of Pharmacy第20版，2000,Lippincott Williams and Wilkins,K.E.Hoover編)，呈凍乾調配物或水溶液之形式。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在劑量及濃度下對接受者無毒，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苄基銨；氯化六羥季銨；氯苄烷銨、苄索氯銨；苯酚、丁醇或苄醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬複合物(例如Zn-蛋白質複合物)；及/或非離子性 界面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。醫藥學上可接受之賦形劑進一步描述於本文中。
抗升糖素受體之抗體及其組合物亦可與用以增強及/或補充藥劑有效性之其他藥劑聯合使用。
本發明亦提供組合物，包括醫藥組合物，其包含本發明之聚核苷酸中之任一者。在一些實施例中，組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼如本文所述之抗體的聚核苷酸。在另一實施例中，組合物包含表現載體，該表現載體包含編碼本文所述之抗體中之任一者的聚核苷酸。
套組
本發明亦提供套組，其包含本文所述之抗體中之任一者或所有抗體。本發明之套組包括一或多個包含本文所述之抗升糖素受體之拮抗劑抗體的容器及根據本文所述之本發明方法中之任一者使用之說明書。一般而言，此等說明書包含投與抗升糖素受體之拮抗劑抗體用於上述治療性治療的描述。在一些實施例中，提供用於產生單次劑量投藥單位之套組。在某些實施例中，套組可含有具有經乾燥蛋白質之第一容器與具有水性調配物之第二容器。在某些實施例中，包括含有單腔室及多腔室預填充注射器(例如液體注射器及溶解注射器(lyosyringe))之套組。
在一些實施例中，抗體為人類抗體。在一些實施例中，抗體為人類化抗體。在有些實施例中，抗體為單株抗體。與使用抗升糖素受體之抗體有關之說明書一般包括關於用於預期治療之劑量、給藥時程及投藥途徑之資訊。容器可為單位劑量、散裝包裝(例如多劑量包裝)或子單位劑量。本發明之套組中所提供之說明書通常為書寫於標籤或藥品說明書(例如套組中所包括之紙單)上之說明書，但機器可讀說明書(例如磁性或光學儲存碟片上所載之說明書)亦為可接受的。
本發明之套組處於適合之包裝中。適合之包裝包括(但不限於)小瓶、瓶、罐、可撓性包裝(例如密封聚酯薄膜(Mylar)或塑膠袋)及其類似物。亦涵蓋與特定裝置組合使用之包裝，該裝置為諸如吸入器、經鼻投藥裝置(例如霧化器)或輸注裝置，諸如微型泵。套組可具有無菌進入孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之瓶塞的小瓶)。容器亦可具有無菌進入孔(例如容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之瓶塞的小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為抗升糖素受體之抗體。容器可進一步包含第二醫藥活性劑。
套組可視情況提供諸如緩衝液之其他組分及說明性資訊。通常，套組包含容器及在該容器上或與該容器相關聯之標籤或藥品說明書。
提供以下實例僅用於說明之目的且不欲以任何方式限制本發明之範疇。實際上，根據上文描述，除本文中所示及所述之內容以外的本發明之各種修改將為熟習此項技術者顯而易知且處於隨附申請專利範圍之範疇內。
實例 實例1：測定抗體動力學及結合親和力
此實例說明測定抗體動力學及抗升糖素受體之抗體對人類及食蟹獼猴(cyno)升糖素受體之結合親和力。
藉由用400mM EDC與100mM NHS之1：1(v/v)混合物以10μL/min之流動速率活化Biacore CM4感測器晶片之所有流槽，持續7分鐘來製備抗人Fc感測器晶片。將山羊抗人Fc抗體(Southern Biotech)於10mM乙酸鈉(pH 5.0)中稀釋至50μg/mL，且以20μL/min注射於所有流槽上，持續7分鐘。用含100mM乙二胺之150mM硼酸鹽緩衝液(pH 8.5)以10μL/min阻斷所有流槽，持續7分鐘。用於此固定程序之操作緩衝液為10mM HEPES、150mM NaCl、0.05%(v/v)TWEEN® 20， pH 7.4。
在25℃及37℃下使用10mM HEPES、150mM NaCl、0.05%(v/v)TWEEN® 20(pH 7.4)、1mg/mL BSA之操作緩衝液進行以下動力學實驗。
所有實驗均在BiacoreTM T200表面電漿子共振生物感測器(GE Lifesciences,Piscataway NJ)上進行。將人類及食蟹獼猴(cyno)升糖素受體胞外域人類Fc融合蛋白質以10μL/min之流動速率捕捉至2μg/mL之下游流槽(分別為流槽2、3)上，持續3分鐘。流槽1用作空白參考表面。在捕捉升糖素受體Fc融合蛋白質之後，將分析物(緩衝液或mAb5 Fab)以30μL/min注射於所有流槽上，持續兩分鐘。測試多個mAb5 Fab分析物濃度。mAb5 Fab分析物濃度為0.16、0.8、4、20及100nM。在注射分析物之後，監測解離10分鐘(對於20nM及100nM mAb5 Fab分析物樣品)或30秒(對於0.16、0.8及4nM mAb5 Fab分析物樣品)。對於緩衝液分析物週期，監測解離30秒及10分鐘。在分析物結合及解離之後，使用75mM磷酸之四次1分鐘注射使所有流槽再生。在曲線擬合之前對感測器圖譜資料進行雙重參考(雙重參考如Myszka,D.G.,1999,J.Mol.Recognit.,12：279-284中所述)。使用BiacoreTM T200評估軟體將經雙重參考之感測器圖譜與簡單的1：1朗繆爾與質量輸送結合模型(Langmuir with mass transport binding model)進行全局擬合。結合至人類及食蟹獼猴升糖素受體之抗升糖素受體之拮抗劑抗體的結合親和力資料展示於下表4中。
*解離速率過低而無法在既定實驗條件下測定精確kd值；因此，報導關於kd、t1/2及KD之界限。
實例2：基於細胞之功能分析
此實例說明抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb5對表現人類升糖素受體之細胞中之升糖素信號傳導的影響。
對於此研究，使用LANCE® cAMP套組(目錄號AD0262E,PerkinElmerInc.)，在經人類升糖素受體穩定轉染之CHO細胞株中量測cAMP信號傳導。將細胞添加至96孔盤中，且與經連續稀釋之mAb5一起培育。接著在室溫(RT)下用200pM升糖素(目錄號22456,AnaSpec,Inc.)刺激細胞30分鐘。接著添加偵測抗體，且在室溫下培育10分鐘。接著用所供應之偵測緩衝液使細胞溶解，且在室溫下於黑暗中培育3小時。接著在VICTOR3TM盤讀取器(PerkinElmer,Inc)上讀取該盤。結果展示於圖1中。由於此分析之讀出結果係基於經標記之外源cAMP(在665nm下量測)與未經標記之內源產生之cAMP之間的競爭，故較高信號指示由細胞產生較少cAMP。mAb5以劑量依賴性方式抑制cAMP產生(圖1)。
此等結果證實，在升糖素刺激之後抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb5抑制升糖素受體介導之cAMP增加。
實例3：在食蟹獼猴中之活體內功效
此實例說明在食蟹獼猴中之升糖素攻擊之後抗升糖素受體之拮抗劑抗體對血漿葡萄糖含量的影響。
將升糖素之靜脈內大丸劑投與動物由於肝中之升糖素信號傳導而使得血漿葡萄糖升高。為判定抗升糖素受體之拮抗劑抗體是否抑制此血漿葡萄糖升高，在給與抗升糖素受體之拮抗劑抗體或PBS之未處理之雌性食蟹獼猴中進行升糖素攻擊。在猴中在兩個各別時機進行升糖素攻擊：在猴接受3mg/kg單次靜脈內劑量之mAb5或等效體積之 PBS(基線)之前五天進行一次升糖素攻擊，且在猴接受mAb5劑量或PBS之後一小時進行第二次升糖素攻擊。
對於每次升糖素攻擊，在時間0時投與20μg/kg升糖素之靜脈內大丸劑(GlucaGen® Hypokits®)。在以下時間點自所有動物獲取血液樣品：攻擊前，及攻擊後5、15、30、45、60及120分鐘。使用臨床化學分析儀分析血漿樣品之血漿葡萄糖濃度。平均絕對葡萄糖值(mg/dL)+/- SEM及AUC(反映血漿葡萄糖隨時間漂移之曲線下面積)展示於表5中。
在升糖素攻擊前一小時經3mg/kg mAb5處理之動物的平均血漿葡萄糖濃度在攻擊前為78.83 +/- 5.44，在攻擊後五分鐘為92.00 +/- 4.88mg/dL，在攻擊後十五分鐘為81.33 +/- 5.54mg/dL，在攻擊後三十分鐘為69.00 +/- 4.66mg/dL，在攻擊後四十五分鐘為63.83 +/- 2.36mg/dL，及在攻擊後六十分鐘為63.17 +/- 3.15mg/dL(表5)。相比之下，在升糖素攻擊一小時投與PBS之動物的平均血漿葡萄糖濃度在攻擊前為84.5 +/- 4.36，在攻擊後五分鐘為109.0 +/- 6.98mg/dL，在攻擊後十五分鐘為118.5 +/- 9.79mg/dL，在攻擊後三十分鐘為107.17 +/- 12.30mg/dL，在攻擊後四十五分鐘為98.33 +/- 12.08mg/dL，及在攻擊後六十分鐘為92.67 +/- 12.64mg/dL(表5)。因此，在升糖素攻擊後，經抗升糖素受體之拮抗劑抗體Mab 5處理之動物中之血漿葡萄糖含量與PBS對照相比實質上較低。
此等結果證實，在升糖素攻擊之後抗升糖素受體之拮抗劑抗體有效阻斷葡萄糖漂移。
實例4：處理後之肝功能分析
此實例說明用高劑量之mAb5升糖素受體阻斷mAb長期處理的影響。
人類中之先前臨床資料已證實，用升糖素受體小分子拮抗劑處理4週可使得某些肝功能測試(LFT)，特定而言丙胺酸胺基轉移酶(ALT)及天冬胺酸胺基轉移酶(AST)(LY及MK)升高。參見例如Engel,S.等人，2011,「Efficacy and tolerability of MK0893,a glucagon receptor antagonist,in patients with type 2 diabetes」,ADA Symposium。為解決在升糖素受體用單株抗體而非小分子阻斷之情況下在長期處理後該等變化是否將顯而易見，進行一項研究以評估在食蟹獼猴中每週靜脈內大丸劑劑量之mAb5經4週對此等LFT參數的影響。
如上述實例3中所示，在食蟹獼猴中升糖素攻擊之後單次劑量之3mg/kg mAb5有效抑制葡萄糖漂移。對於肝功能研究，選擇100mg/kg之劑量以確保在所有時間完全阻斷。三隻瘦型未處理之雌猴在第1天、第8天、第15天及第22天接受100mg/kg mAb5。作為對照，三隻瘦型未處理之雌猴在第1天、第8天、第15天及第22天接受PBS對照之靜脈內大丸劑。在第7天、第14天、第21天及第29天自兩個組之所有動物收集空腹血清樣品，且與基線，亦即研究開始前(第-6天)自相同動物獲取之處理前樣品相比較。除ALT及AST以外，使用臨床化學 分析儀，亦量測鹼性磷酸酶(ALP)及γ-麩胺醯基轉移酶(GGT)。ALT、AST、ALP及GGT測試結果展示於圖2及3中，且概述於下表6中。
表6展示在基線處(第-6天)及在研究結束時(第29天)此等參數之平均(+/-SEM)值。如表6中所見，在經mAb5處理之動物中量測之任何LFT參數與PBS對照動物及基線組動物相比無顯著變化(最後一行)。
此等結果證實，用高劑量之mAb5升糖素受體阻斷抗體長期處理對肝功能無害。
實例5：處理後之循環脂質含量分析
此實例說明用高劑量之mAb5升糖素受體阻斷mAb長期處理不會引起食蟹獼猴中之血漿脂質變化。
人類中之先前臨床資料已證實，用升糖素受體小分子拮抗劑處理4週與LDL-膽固醇含量(MK)之劑量依賴性10-17%升高相關聯。參見例如Ruddy,M.等人，2011,「Inhibition of glucagon-induced hyperglycemia predicts glucose-lowering efficacy of the glucagon receptor antagonist,MK0893,in patients with type 2 diabetes mellitus(T2DM)」,ADA Symposium。為解決在升糖素受體用單株抗體而非小分子阻斷之情況下在長期處理後該等變化是否將顯而易見，進行一項研究以評估在食蟹獼猴中每週靜脈內大丸劑劑量之mAb5之後經4週對LDL-C及其他循環脂質(總膽固醇、HDL-C及三酸甘油酯)的影響。
三隻瘦型未處理之雌猴在第1天、第8天、第15天及第22天接受100mg/kg mAb5。對於對照，三隻瘦型未處理之雌猴在相同時間點接 受PBS對照之靜脈內大丸劑。在第7天、第14天、第21天及第29天自兩個組之所有動物收集空腹血清樣品，且與基線，亦即研究開始前自相同動物獲取之處理前樣品(第-6天)相比較，且使用臨床化學分析儀量測脂質。得自此研究之資料概述於表7中且展示於圖4及5中。
表7展示在基線處(第-6天)及在研究結束時(第29天)此等參數之平均(+/-SEM)值。圖4及5展示在第-6天、第7天、第14天、第21天及第29天對照及經mAb5處理之動物中之血漿脂質含量。在經mAb5處理之動物中量測之任何循環脂質參數與PBS對照動物及基線組動物相比未觀測到變化。
此等結果證實，用高劑量之mAb5抗升糖素受體之拮抗劑抗體長期處理與LDL-膽固醇升高不相關。
實例6：在2型糖尿病之小鼠模型中之活體內功效
此實例說明在2型糖尿病之小鼠模型中用抗升糖素受體之拮抗劑抗體處理。
在禁食小鼠中投與葡萄糖之腹膜內大丸劑(葡萄糖攻擊)使得血漿葡萄糖顯著升高，繼之以清除期。空腹血漿葡萄糖含量(亦即在即將攻擊之前)與處理經投與之葡萄糖負荷的能力在餵食高脂肪膳食之DIO(膳食誘發之肥胖)小鼠中均下降。用抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3預處理此等動物係如下進行：自6週齡開始，向C57Bl/6J小鼠(每組n=5)餵食高脂肪膳食(「HFD」，40kcal%脂肪)。自12週齡，向小鼠 繼續餵食HFD，且一組每週接受一次腹膜內注射3mg/kg mAb3，而第二組接受類似體積之PBS媒劑。處理3週後及在18小時隔夜禁食後，將葡萄糖之腹膜內大丸劑(2g/kg)投與所有動物(時間=0)。在以下時間點自所有動物獲取血液樣品：攻擊前，及攻擊後15、30、45、60、90及120分鐘。使用手持式One Touch®葡萄糖計分析全血樣品之血漿葡萄糖濃度。平均絕對葡萄糖值(mg/dL)+/- SEM及AUC(反映血漿葡萄糖隨時間漂移之曲線下面積)展示於表8中。
經抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3處理之動物的空腹血糖含量為128.80 +/- 12.92mg/dL，顯著低於給與PBS之對照動物中之空腹血糖含量156.80 +/- 11.41mg/dL(表8，第2行)。此外，經mAb3處理之動物在葡萄糖攻擊後之血糖含量與給與PBS之動物相比較低(表8，第3-9行)。此等結果證實，在2型糖尿病之小鼠模型中抗升糖素受體之拮抗劑抗體降低空腹血糖及在葡萄糖攻擊後引起之血漿葡萄糖漂移。
實例7：組合處理
此實例說明在小鼠中用抗升糖素受體之拮抗劑抗體與mTOR抑制劑組合處理。
先前已證實，阻斷嚙齒動物中之升糖素信號傳導促使胰臟α(亦即升糖素產生)細胞之數目及/或尺寸由此增加。參見例如Gelling等人，2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(3)：1438-1443(無GCGR小鼠)；Sloop等人，2004,J.Clin.Invest.113(11)：1571-1581(反義寡核苷酸)。 在小鼠中投與抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3(每週一次，腹膜內)已類似地顯示每個胰島之α細胞之面積增加，反映α細胞數目增加以及平均α細胞尺寸增加。
進行本研究以評估mTOR抑制劑雷帕黴素與mAb3聯合處理之作用。在此研究中，雄性14週齡C57Bl/6J小鼠(每組n=10)每週接受一次腹膜內注射3mg/kg mAb3，或每日接受腹膜內給與10mg/kg雷帕黴素(於含5%乙醇、5.2% Tween-80、5.2% PEG400之水中調配)與每週一次3mg/kg劑量之mAb3的組合。第三組接受媒劑作為對照。在處理三週後，將動物處死且收集其胰臟，固定於10%中性緩衝福馬林(neutral buffered formalin)中24小時，接著遵循標準程序在石蠟中處理並包埋。切出4μm切片，安放於plus載片上且在37℃下乾燥隔夜。藉由免疫組織化學，使用依序雙標記方案，在Leica BondTM自動化免疫染色儀(Leica Microsystems,IL)上偵測胰臟中之升糖素(為鑑別胰島α細胞)及胰島素(為鑑別胰島β細胞)。用Cyto-Q Background Buster(Innovex Biosciences,CA)阻斷內源蛋白質。使用熱誘導之抗原決定基修復(HIER)緩衝液(pH 6.0)(Leica Microsystems,IL)針對抗升糖素免疫組織化學進行抗原修復20分鐘。使用生物素標記之山羊抗天竺鼠IgG(Dako,CA)以BondTM Intense R Detection(Leica Microsystems)偵測抗胰島素(Dako,CA)，且使用BondTM Polymer Refine Red套組(Leica Microsystems,IL)偵測抗升糖素(Abcam,MA)。用蘇木精(Leica Microsystems,IL)對組織進行對比染色，脫水且安放於二甲苯中，隨後進行顯微鏡評估。使用配備有多光譜相機之Perkin Elmer Vectra自動化成像系統在低倍(4X)及高倍(20X)下使含有針對抗升糖素(矢量紅(vector red))及抗胰島素(DAB)染色之胰臟IHC之切片的載片成像。使用Perkin Elmer®之InForm®影像分析軟體來分析低倍與高倍影像。使用高倍多光譜影像進行個別胰島之詳細分析。以自動化方式擷取胰臟 切片內各胰島之影像，且在光譜分解之後用Perkin Elmer®之InForm®軟體進行分析。創建演算法以分別使用抗升糖素或抗胰島素染色定量及表徵α或β細胞之區域，同時排除組織之所有不相關區域。使用蘇木精對比染色亦測定各區域內之核數目，且將其用於計算相對於各胰島之區域(α/β)的平均細胞數目及平均細胞尺寸。
研究資料概述於下表9中。該表中提供：α細胞數目(定量為% α細胞數目/胰島+/- SEM)、α細胞所佔據之總面積(定量為% α細胞面積/胰島+/- SEM)，及平均α細胞尺寸(量測為像素)。
與僅投與媒劑之小鼠相比，在經mAb3處理之小鼠中觀測到α細胞數目及α細胞尺寸增加(表9)。當mAb3與雷帕黴素處理共同投與時，不存在α細胞數目及尺寸增加之此等量測結果(表9)。此等資料證實，mTOR信號傳導可在介導α細胞增生中起作用。此等資料亦證實，與mTOR抑制劑聯合處理減少藉由阻斷升糖素受體活性所致之肥大及增生。
實例8：肝功能分析
此實例說明用抗升糖素受體之拮抗劑抗體處理四週對肝功能的影響。
先前已顯示，用升糖素受體小分子拮抗劑處理4週可使得某些肝功能測試(LFT)，特定而言丙胺酸胺基轉移酶(ALT)及天冬胺酸胺基轉移酶(AST)(LY及MK)升高。參見例如Engel,S.等人，2011,「Efficacy and tolerability of MK0893,a glucagon receptor antagonist,in patients with type 2 diabetes」,ADA Symposium。為解決在升糖素受體用單株抗體而非小分子阻斷之情況下在長期處理後該等變化是否將顯而易見，進行一項研究以評估在野生型小鼠及餵食高脂肪膳食(HFD)之DIO(膳食誘發之肥胖)小鼠中每週腹膜內劑量之抗升糖素受體之拮抗劑抗體經4週對此等LFT參數的影響。
在該研究中，以每週為基礎，向野生型小鼠及HFD-DIO小鼠腹膜內投與10mg/kg劑量之抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3或PBS媒劑(對照)。已顯示，所使用之10mg/kg劑量歷時至少七天之持續時間(亦即給藥時間間隔)發揮最大葡萄糖降低作用，表明在此研究中完全阻斷升糖素受體。在mAb3處理4週之後，收集空腹血清樣品，且量測以下肝酶之含量：ALT、AST及ALP。結果(每組之平均值及標準誤差(n=10/組/小鼠模型))概述於下表10中。
與在PBS媒劑對照動物中量測之LFT參數相比，在經mAb3處理之動物中量測之任何LFT參數(亦即ALT、ALP及AST含量)無顯著變化(表10)。
此等結果證實，用抗升糖素受體之拮抗劑抗體處理四週對肝功能無害。
實例9：肝功能分析
此實例說明用抗升糖素受體之拮抗劑抗體處理43週對肝功能的 影響。
在此研究中，使野生型C57Bl/6雄性小鼠暴露於抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3之長期處理，自9週齡開始且持續43週，直至52週齡(n=9)。每週腹膜內投與3mg/kg劑量之mAb3。將PBS媒劑投與對照動物組(n=6)。在研究終止時，收集空腹血清樣品，且量測以下肝酶之含量：ALT、AST及ALP。結果(每組之平均值及標準誤差)概述於表11中。
與經相同持續時間給與PBS之對照小鼠中量測之LFT參數相比，在經mAb3處理之小鼠中量測之任何LFT參數(亦即ALT、ALP及AST含量)無顯著變化(表11)。因此，用mAb3升糖素受體阻斷抗體處理約11個月之持續時間(其代表此動物之總壽命的大部分)與對肝功能之此等酶標記物的任何有害影響不相關。
此等結果證實，用抗升糖素受體之拮抗劑抗體長期處理對肝功能無害。
實例10：肝功能分析
此實例說明用抗升糖素受體之拮抗劑抗體長期處理的影響。
進行一項研究以解決用抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb5長期處理13週對肝功能的影響。在該研究中，經13週向雄性及雌性食蟹獼猴皮下(SC)或靜脈內(IV)投與mAb5。
在食蟹獼猴中之升糖素攻擊之後單次劑量之3mg/kg mAb5有效抑制葡萄糖漂移(參見上述實例3)。選擇用於此長期研究之劑量為10、50及200mg/kg，各劑量將預期產生升糖素信號之完全阻斷。
瘦型未處理猴之四個組(每個性別，每組n=3)每週接受靜脈內或皮下注射10mg/kg mAb5，持續總共13週。每個性別之五隻瘦型未處理猴之另外六個組各接受每週靜脈內注射50mg/kg mAb5或每週靜脈內或皮下注射200mg/kg mAb5，持續總共13週。作為對照，每個性別之五隻瘦型未處理猴藉由靜脈內或皮下注射途徑每週接受媒劑注射，持續13週。
在第29天、第57天及第93天自所有動物收集空腹血清樣品，且與兩個基線，亦即在研究開始前(亦即第-43天及第-8天)自相同動物獲取之處理前樣品相比較。除ALT及AST以外，使用臨床化學分析儀，亦量測鹼性磷酸酶(ALP)及γ-麩胺醯基轉移酶(GGT)。ALT、AST、ALP及GGT測試結果(平均值+/- SEM)概述於下表12中。
表12展示在基線處(第-43天及第-8天)及在整個給藥時程中之每月 時間間隔處(第29天、第57天及第93天)之ALT、AST、ALP及GGT含量的平均(+/-SEM)值。與經媒劑處理之對照動物及每組自身之基線值相比，在經任何劑量/給藥途徑之mAb5處理之動物中量測之任何LFT參數無顯著變化(表12)。
此等結果證實，用高劑量之mAb5升糖素受體阻斷抗體長期處理對肝功能無害。
實例11：循環脂質含量分析
此實例說明用mAb5升糖素受體拮抗劑抗體慢性長期處理之影響。
為評估用單株抗體阻斷升糖素受體之影響，向雄性及雌性食蟹獼猴投與每週劑量之mAb5，持續13週，且評估對循環脂質(總膽固醇、LDL-C、HDL-C及三酸甘油酯)之影響。
瘦型未處理猴之四個組(每組包含每個性別之三隻動物)每週接受靜脈內或皮下注射10mg/kg mAb5，持續總共13週。每個性別之五隻瘦型未處理猴之另外六個組各接受每週靜脈內注射50mg/kg mAb5或每週靜脈內或皮下注射200mg/kg mAb5，持續總共13週。作為對照，每個性別之五隻瘦型未處理猴每週接受媒劑注射(藉由靜脈內與皮下途徑)，持續13週。
在第29天、第57天及第93天自所有動物收集(約每月一次)空腹血清樣品，且與兩個基線，亦即在研究開始前(第-43天及第-8天)自相同動物獲取之處理前樣品相比較。除ALT及AST以外，使用臨床化學分析儀，亦量測鹼性磷酸酶(ALP)及γ-麩胺醯基轉移酶(GGT)。得自此研究之資料(平均值+/- SEM)概述於表13中。
表13展示在基線處(第-43天及第-8天)及在整個給藥時程中之每月時間間隔處(第29天、第57天及第93天)此等參數之平均(+/-SEM)值。與經媒劑處理之對照動物及每組自身之基線值相比，在經任何劑量/給藥途徑之mAb5處理之動物中量測之任何循環脂質參數無顯著變化(表13)。
此等結果證實，用高劑量之mAb5升糖素受體阻斷抗體長期處理不會導致LDL-C或三酸甘油酯有害升高。
實例12：逆轉α細胞增生
此實例說明在經高劑量之抗升糖素受體之拮抗劑抗體處理之個體中逆轉伴有或不伴有肥大之胰臟α細胞增生。
已顯示，阻斷小鼠及/或大鼠中之升糖素信號傳導導致循環升糖素含量補償性升高(高升糖素血症)及胰臟α細胞數目及/或細胞尺寸增加(參見例如Gelling等人，2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(3)：1438-1443(無GCGR小鼠)；Sloop等人，2004,J.Clin.Invest. 113(11)：1571-1581(反義寡核苷酸)；Gu等人，2009,J.Pharmacol.Exp.Ther.331(3)：871-881(單株抗體))。如上述實例3中所示，在食蟹獼猴中之升糖素攻擊之後單次劑量之3mg/kg mAb5有效抑制葡萄糖漂移，因此，選擇用於此長期研究之劑量(10、50及200mg/kg)將預期產生升糖素信號之完全阻斷。
在此研究中，瘦型未處理猴之四個組(每組包含每個性別之三隻動物)每週接受靜脈內或皮下注射10mg/kg mAb5，持續總共13週。每個性別之五隻瘦型未處理猴之另外六個組各接受每週靜脈內注射50mg/kg mAb5或每週靜脈內或皮下注射200mg/kg mAb5，持續總共13週。作為對照，每個性別之五隻瘦型未處理猴每週接受媒劑注射(藉由靜脈內與皮下途徑)，持續13週。
在給藥時段結束時，自每組三隻動物收集胰臟，切片且使用標準H&E及抗升糖素/抗胰島素IHC技術進行染色。檢查胰臟且針對胰島α細胞增生及肥大進行評定。接著來自所選組(對照；50mg/kg IV；200mg/kg IV；200mg/kg SC)之每個性別之兩隻動物經歷24週之恢復期(亦即，在停止mAb5給藥之後)，以使得抗體含量降至有效閾值以下(「抗體洗出」)。在此抗體洗出時段結束時，類似地分析來自此等動物之胰臟的增生及肥大。得自此研究之資料概述於表14中。
在13週時間點在一些動物中存在明顯α細胞增生及/或肥大(表 13，前八行)。然而，在24週抗體洗出時段結束時，來自任何給藥組之任何動物中α細胞增生或肥大均不明顯(表13，最後四行)。因此，儘管用高劑量之mAb5慢性長期處理可導致伴有或不伴有肥大之胰臟α細胞增生，但此等特徵在抗體洗出後完全可逆轉。
此等結果證實，一旦治療性抗體之含量降至最小有效閾值以下且解除對升糖素信號傳導之阻斷，在食蟹獼猴中mAb5處理之後胰島α細胞之變化完全可逆轉。
實例13：逆轉肝細胞肝糖沈積
此實例說明在經高劑量之抗升糖素受體之拮抗劑抗體處理之個體中逆轉肝細胞肝糖沈積。
在食蟹獼猴中之升糖素攻擊之後單次劑量之3mg/kg mAb5有效抑制葡萄糖漂移(參見上述實例3)。選擇用於此長期研究之劑量(10、50及200mg/kg)將預期產生升糖素信號之完全阻斷。瘦型未處理猴之四個組(每組包含每個性別之三隻動物)每週接受靜脈內或皮下注射10mg/kg mAb5，持續總共13週。每個性別之五隻瘦型未處理猴之另外六個組各接受每週靜脈內注射50mg/kg mAb5或每週靜脈內或皮下注射200mg/kg mAb5，持續總共13週。作為對照，每個性別之五隻瘦型未處理猴每週接受媒劑注射(藉由靜脈內與皮下途徑)，持續13週。
在給藥時段結束時，自每組三隻動物收集肝臟，固定，切片且使用標準H&E及PAS染色技術進行染色。檢查肝臟且針對增加之肝細胞肝糖沈積進行評定。接著來自所選組(對照；50mg/kg IV；200mg/kg IV；200mg/kg SC)之每個性別之兩隻動物在停止mAb5給藥之後經歷24週之恢復期，以使得抗體含量降至有效閾值以下(「抗體洗出」)。在此時段結束時，類似地分析來自此等動物之胰臟。得自此研究之資料概述於表15中。
表15
在13週mAb5處理之後在一些動物中觀測到增加之肝細胞肝糖(表15)。舉例而言，給與10mg/kg SC mAb5之2隻雄性、給與50mg/kg IV mAb5之1隻雌性、給與200mg/kg IV mAb之3隻雄性及2隻雌性及給與200mg/kg SC mAb5之2隻雄性評定為對增加之肝細胞肝糖呈陽性(表15，前七行)。然而，在mAb5洗出時間之後，在來自任何給藥組之任何動物中未觀測到明顯增加之肝細胞肝糖(表15，最後四行)。因此，儘管用高劑量之mAb5慢性長期處理可導致肝細胞肝糖沈積之變化，但該等變化在抗體洗出後完全可逆轉。
此等結果證實，一旦治療性抗體之含量降至最小有效閾值以下且解除對升糖素信號傳導之阻斷，在食蟹獼猴中抗升糖素受體之拮抗劑抗體處理之後肝細胞中肝糖積聚之變化完全可逆轉。
實例14：在2型糖尿病之小鼠模型中之活體內功效
此實例說明在2型糖尿病之小鼠模型中用抗升糖素受體之拮抗劑抗體處理。
缺乏瘦素(leptin)之雄性ob/ob小鼠展現出明顯攝食過量，從而導致高血糖症、高胰島素血症及肥胖症。在此研究中，向雄性ob/ob小鼠按以下劑量投與單次劑量之mAb3：10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg或0.3mg/kg(對於各給藥組，n=5)。向對照動物投與PBS替代mAb3。在以下時間點自所有動物(處於飽餐狀態)獲取血液樣品：給藥前，及給藥後第1天、第2天、第5天、第6天、第7天、第9天、第12天、第13天及第20天。使用手持式One Touch®葡萄糖計分析全血樣品之葡萄糖濃度。平均絕對葡萄糖值+/- SEM展示於表16中。
如表16中所示，投與抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3之單次腹膜內注射使得此等小鼠之餐後血糖含量與其處理前基線或媒劑處理組相比產生顯著而持久之降低。作用持續時間顯示劑量反應，其中10mg/kg劑量具有最長作用持續時間，且1mg/kg劑量具有最短作用持續時間(表16)。經10、3或1mg/kg抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3處理之動物在mAb3給藥後一天及兩天具有顯著改良之餐後葡萄糖含量(表16，第2列及第3列)。
單次劑量之10或3mg/kg mAb3在葡萄糖降低方面產生相當的最大作用。舉例而言，在用10mg/kg mAb3處理後6天，小鼠具有75.60±7.71mg/dL之餐後血糖含量，且在用3mg/kg mAb3處理後2天，小鼠具有79.20±3.62mg/dL之餐後血糖含量。比較而言，給與PBS替代mAb3之對照動物具有高得多的餐後血糖含量：在給藥後第2天261.80±28.13mg/dL，及在給藥後第6天241.20±43.40mg/dL。1mg/kg劑量產生較小作用：在用1mg/kg mAb3處理後2天，小鼠具有124.00±8.79mg/dL之餐後血糖含量。在0.3mg/kg劑量下未觀測到可量測之作用。
經1mg/kg mAb3處理之動物中之葡萄糖含量至第5天已返回至給藥前水準。然而，經3或10mg/kg mAb3處理之動物分別至給藥後第7天及第12天仍保持改良之餐後葡萄糖含量(表16，第4列、第6列及第8列)。
此等結果證實，抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3有效降低2型糖尿病之小鼠模型中之餐後血糖含量。
實例15：在2型糖尿病之小鼠模型中之活體內功效
此實例說明在2型糖尿病之小鼠模型中用抗升糖素受體之拮抗劑抗體處理。
HFD-DIO及ob/ob小鼠為一些(若非所有)要素之2型糖尿病的公認模型。此兩種模型表現明顯肥胖症。向三個月大的兩種模型類型之雄性小鼠投與抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3或PBS(n=10/組/小鼠模型)。經4週藉由每週腹膜內注射投與10mg/kg之mAb3；將PBS以類似方式投與對照動物。在處理第1週、第2週及第3週結束時量測各小鼠之體重。在各時間點，各個別小鼠之重量表示為其給藥前初始重量之百分比。確定各組之平均重量±SEM。結果概述於表17中。
與經PBS處理之小鼠相比，經10mg/kg抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3處理之HFD-DIO與ob/ob小鼠經四週研究持續時間均具有顯著較小之體重增加(表17)。舉例而言，在HFD-DIO小鼠中，與平均體重為基線之119.42±1.41%的給與PBS之動物相比，經mAb3處理之動物 的平均體重為基線之114.99±1.23%。總而言之，與經PBS處理之小鼠相比，用mAb3處理顯著減少HFD-DIO小鼠與ob/ob小鼠之體重增加。
此等結果證實，抗升糖素受體之拮抗劑抗體可減少2型糖尿病之兩種不同小鼠模型之體重增加。
實例16：組合處理
此實例說明在小鼠中用抗升糖素受體之拮抗劑抗體與mTOR抑制劑組合處理。
先前已證實，阻斷嚙齒動物中之升糖素信號傳導促使胰臟α(亦即升糖素產生)細胞之數目及/或尺寸由此增加。參見例如Gelling等人，2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(3)：1438-1443(無GCGR小鼠)；Sloop等人，2004,J.Clin.Invest.113(11)：1571-1581(反義寡核苷酸)；Gu等人，2009,J.Pharmacol.Exp.Ther.331(3)：871-881(單株抗體)。在小鼠中投與抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3(每週一次，腹膜內)已類似地顯示每個胰島之α細胞之數目及總面積增加，反映α細胞數目增加以及平均α細胞尺寸增加。
在此研究中，雄性12週齡HFD-DIO小鼠(每組n=5)每週接受一次腹膜內注射3mg/kg mAb3，或每日接受腹膜內給與10mg/kg雷帕黴素(於含5%乙醇、5.2% Tween-80、5.2% PEG400之水中調配)與每週一次3mg/kg劑量之抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb3的組合。第三組接受PBS作為對照。
如先前所述，在處理三週後，將動物處死且收集其胰臟，固定，切片且針對升糖素(為鑑別胰島α細胞)及胰島素(為鑑別胰島β細胞)進行染色。創建演算法以分別使用抗升糖素或抗胰島素染色定量及表徵α或β細胞之區域，同時排除組織之所有不相關區域。使用蘇木精對比染色亦測定各區域內之核數目，且將其用於計算相對於各胰島 之區域(α/β)的平均細胞數目及平均細胞尺寸。
研究資料概述於下表18中。表18提供(a)α細胞數目，定量為% α細胞數目/胰島+/- SEM；(b)α細胞所佔據之總面積，定量為% α細胞面積/胰島+/- SEM；及(c)平均α細胞尺寸，量測為像素。
與僅投與媒劑之小鼠相比，在經mAb3處理之HFD-DIO小鼠中觀測到增加之α細胞數目(α細胞增生)及α細胞尺寸(α細胞肥大)(表18)。然而，當mAb3與雷帕黴素處理共同投與時，在HFD-DIO小鼠中不存在α細胞數目及尺寸增加之此等量測結果(表18，最後一列)。
此等資料證實，mTOR信號傳導可在介導α細胞增生中起作用。此等資料亦證實，與mTOR抑制劑聯合處理減少藉由阻斷升糖素受體活性引發之肥大及增生。
實例17：在食蟹獼猴中之活體內功效
此實例說明在食蟹獼猴中之升糖素攻擊之後抗升糖素受體之拮抗劑抗體對血漿葡萄糖含量的影響。
將升糖素之靜脈內大丸劑投與動物由於肝中之升糖素信號傳導而使得血漿葡萄糖升高(升糖素攻擊)。為確定有效阻斷活體內急性升糖素信號傳導之mAb5劑量，在進行升糖素攻擊之前1小時給與1、3或30mg/kg抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb5的瘦型未處理之雌性食蟹獼猴中進行升糖素攻擊範例。對於各組動物，在兩個各別時機進行升糖素攻擊：在猴接受mAb5之前五天進行第一次攻擊以建立與給藥後反應進行比較的各動物之給藥前基線，且在猴接受mAb5劑量之後一 小時進行第二次攻擊。
對於每次升糖素攻擊，在時間0時投與20μg/kg升糖素之靜脈內大丸劑(GlucaGen® Hypokits®)。在以下時間點自所有動物獲取血液樣品：即將攻擊前，及攻擊後5、15、30、45、60及120分鐘。使用臨床化學分析儀分析血漿樣品之血漿葡萄糖濃度。結果(平均葡萄糖含量變化+/- SEM，mg/dL)概述於表19中。由於動物之間初始血糖含量之可變性，故資料展示為絕對葡萄糖值自攻擊前值之變化。
在各組中，第-5天，在無預先mAb5處理之情況下的升糖素攻擊使得血漿葡萄糖含量增加，反映由於升糖素刺激而使肝增加葡萄糖產生及輸出之生理反應(基線)(表19，標記為「基線處之GC」之列)。葡萄糖含量在升糖素攻擊後15分鐘達到峰值且一般在攻擊後60-120分鐘之間返回至攻擊前含量或甚至更低含量。
在升糖素攻擊前一小時用mAb5處理相對於基線反應顯著抑制葡 萄糖對升糖素攻擊之反應(表19，標記為「mAb5後1小時之GC」之列)。在此等組中之峰值葡萄糖漂移最小且在一些狀況下為負，一般在較早時間點觀測到，且較快返回至正常含量或甚至低於攻擊前含量。舉例而言，在GC後15分鐘(葡萄糖含量在基線攻擊期間達到峰值之時間)，經30mg/kg mAb5處理之動物之血糖含量比攻擊前低16.67±14.17mg/dL。然而，在無mAb5處理之情況下在GC後15分鐘，此等相同動物之血糖含量比攻擊前高45.67±6.84mg/dL。在GC後15分鐘，經3mg/kg mAb5處理之動物之血糖含量比攻擊前高16.25±22.45mg/dL。相比之下，在無mAb5處理之情況下在GC後15分鐘，此等相同動物之血糖含量比攻擊前高56.75±26.52mg/dL。在GC後15分鐘，經1mg/kg mAb5處理之動物之血糖含量比攻擊前高1.00±14.73mg/dL。相比之下，在無mAb5處理之情況下在GC後15分鐘，此等相同動物之血糖含量比攻擊前高52.00±14.19mg/dL。30、3或1mg/kg mAb5之劑量在此範例中顯示類似功效，而無劑量反應。
此等結果證實，mAb5在阻斷活體內升糖素信號傳導方面有效，且在升糖素攻擊之後抗升糖素受體之拮抗劑抗體有效阻斷葡萄糖漂移。
實例18：在食蟹獼猴中之活體內功效
此實例說明在食蟹獼猴中之升糖素攻擊之後抗升糖素受體之拮抗劑抗體對血漿葡萄糖含量的影響。
將升糖素之靜脈內大丸劑投與動物由於肝中之升糖素信號傳導而使得血漿葡萄糖升高(升糖素攻擊)。為確定可有效阻斷活體內急性升糖素信號傳導之其他mAb5劑量，在進行升糖素攻擊之前1小時給與1.78、0.24或0.026mg/kg抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb5的瘦型未處理之雌性食蟹獼猴中進行升糖素攻擊範例。另一組動物僅接受PBS媒劑(n=4/組)。對於各組動物，在三個各別時機進行升糖素攻擊：在猴 接受mAb5之前三天進行第一次攻擊以建立各動物之給藥前基線且確保所有動物對升糖素有反應；在猴接受mAb5劑量之後一小時進行第二次攻擊；及在猴接受mAb5劑量之後一週進行第三次攻擊。
對於每次升糖素攻擊，在時間0時投與20μg/kg升糖素之靜脈內大丸劑(GlucaGen® Hypokits®)。在以下時間點自所有動物獲取血液樣品：攻擊前，及攻擊後5、15、30、45、60及120分鐘。使用臨床化學分析儀分析血漿樣品之血漿葡萄糖濃度。第二次及第三次攻擊之結果(平均葡萄糖含量變化+/- SEM，mg/dL)概述於表20中。由於動物之間初始血糖含量之可變性，故資料展示為在彼天獲取之絕對葡萄糖值自攻擊前值之變化。
可將經mAb5處理之動物中升糖素攻擊(GC)後之血糖含量變化與在同一天接受GC的經PBS預處理之動物中之血糖含量變化相比較(表20)。一般在5分鐘時間點觀測到峰值葡萄糖含量。在GC期間，在0.026及0.24mg/kg之mAb5劑量後一小時，僅觀察到葡萄糖反應之極小(若有)降低。舉例而言，在用0.026及0.24mg/kg mAb5處理後1小時受攻擊之動物中，在峰值葡萄糖含量下分別觀測到血糖含量增加30.25±6.65mg/dL及44.25±6.21mg/dL，與給與PBS替代mAb5之動物中增加34.75±5.57mg/dL作比較(表20)。0.026及0.24mg/kg mAb5給藥組中之反應至第8天類似於對照動物。
然而，在1.78mg/kg mAb5處理組中，在給藥後一小時觀測到升糖素反應之適度抑制。在經1.78mg/kg mAb5處理之動物中，血漿葡萄糖含量低於其他組，在5分鐘時達到峰值(22.25±1.49mg/dL)，且至攻擊後30-45分鐘恢復至基線或基線以下(表20)。甚至當在投與mAb5後七天進行重複升糖素攻擊時仍觀測到此升糖素反應抑制(表20)。1.78mg/kg mAb5之顯著處理效果在相對於媒劑處理組中之血漿葡萄糖含量(85.50±8.17mg/dL)降低攻擊前(亦即空腹)血漿葡萄糖含量(60.0±3.79mg/dL)方面亦顯而易見。
此等結果證實，在升糖素攻擊之後抗升糖素受體之拮抗劑抗體有效阻斷葡萄糖漂移。
實例19：抗原決定基定位
抗升糖素受體之拮抗劑抗體mAb5之晶體結構及mAb5：升糖素受體複合物之晶體結構用於表徵人類升糖素受體上由mAb5識別之抗原決定基。藉由計算mAb5：升糖素受體晶體結構與單獨升糖素受體結構之間的可達表面積差異來鑑別與結合有關之升糖素受體殘基。在與mAb5抗體形成複合物後顯示出內埋表面積之升糖素受體殘基作為抗原決定基之一部分包括在內。蛋白質之溶劑可達表面定義為當探針球 (表示1.4A半徑之溶劑分子)在蛋白質之凡得瓦爾表面(Van der Waals surface)上滾動時該探針球之中心位置。如程式MODELLER(A.Sali及T.L.Blundell.J.Mol.Biol.234,779-815,1993)中所實施，藉由在繞各原子延伸之球上產生表面點(在自原子中心等於原子與探針半徑之和的距離處)且去除位於與鄰近原子相關聯之等效球內之表面點來計算溶劑可達表面積。基於晶體結構分析，升糖素受體上由mAb5識別之結構抗原決定基涉及在人類升糖素受體(SEQ ID NO：1)之位置31、33-38、40-42、44-45、48、62及64處之胺基酸殘基。
支配大蛋白質-蛋白質界面之結合能的殘基身分已稱為「功能性抗原決定基」(Cunningham,B.C.及Wells,J.A.,1993,J.Mol.Biol.,234,554-563)。相互作用之親和力(及由此生物特異性)因此由配位體與受體之功能性抗原決定基之結構互補性來定義。詳細突變誘發研究已顯示，構成細胞激素及受體之功能性抗原決定基的最重要殘基為涉及非極性側鏈(諸如色胺酸)、非極性側鏈之脂族組分或多肽骨架之疏水性接觸。非極性「核心」係由對結合能具有較小重要性之極性殘基之鹵基圍繞。動力學研究指示，功能性抗原決定基之主要作用在於藉由降低複合物之解離速率來穩定蛋白質-蛋白質相互作用。已表明，細胞激素與受體之間的初始接觸係由產生許多不穩定接觸之蛋白質表面的隨機擴散或「滾動」來支配。當受體與配位體之功能性抗原決定基嚙合時，接著使複合物穩定(參見例如Bravo及Heath,2000,EMBO J.19：2399-2411)。
酵母呈現用於確定升糖素受體上由mAb5識別之功能性抗原決定基中所涉及之胺基酸殘基。使升糖素受體胞外域(GCGR-ECD)之單點突變體之文庫呈現於酵母細胞上。接著將表現GCGR-ECD之酵母細胞(「原始文庫」)與經螢光標記之mAb5或經螢光標記之非mAb5抗升糖素受體之抗體彙集庫一起培育。野生型升糖素受體用作陽性對照。藉 由FACS分離呈現相對於野生型GCGR-ECD具有降低之抗體結合的GCGR-ECD突變體之酵母細胞。對此細胞群體(「富集文庫」)進行深度定序且分析資料已確定各突變體之富集度。富集度定義為與原始文庫中之出現率相比較在富集文庫(在FACS分離之後)中特定突變體之出現率，例如富集度4.0意謂突變體在富集文庫中存在之頻率為其在原始文庫中出現之頻率的四倍。較大富集度對應於具有較低結合親和力之GCGR-ECD突變體。進行三輪淘選，在三個不同輪次之間具有一致性。表21概述酵母呈現分析之結果。
在任何輪次中富集度大於3之突變位置視為升糖素受體上由mAb5識別之功能性抗原決定基的一部分。基於酵母呈現分析，升糖素受體上由mAb5識別之功能性抗原決定基涉及SEQ ID NO：1之位置33、36、38、41、44、45及60處之胺基酸殘基(表21，粗體位置)。位置60 為在結構抗原決定基中亦未發現之唯一富集殘基；其亦在非mAb5抗體彙集庫中富集，指示在此位置處之殘基干擾蛋白質摺疊。
進行分析以確定突變體文庫中及結構抗原決定基中哪些位置未富集。在結構抗原決定基中之十五個位置當中，十一個位置亦存在於突變體文庫中。在此十一個位置當中，六個位置富集。功能性抗原決定基中之五個未富集位置為31、34、42、48及64。所有未富集位置均位於結構抗原決定基之周邊。
儘管所揭示之教示內容已參考各種應用、方法、套組及組合物加以描述，但應瞭解，可在不脫離本文中之教示內容及本發明下文所主張之內容的情況下作出各種變化及修改。提供前述實例以更好地說明所揭示之教示內容且不欲限制本文所呈現之教示內容的範疇。儘管本發明教示內容已根據此等例示性實施例加以描述，但熟習此項技術者將易於瞭解，在無過度實驗之情況下可能對此等例示性實施例進行眾多變更及修改。所有該等變更及修改均在本發明教示內容之範疇內。
本文所引用之所有參考文獻，包括專利、專利申請案、論文、教科書及其類似文獻，以及其中所引用之參考文獻，均以全文引用的方式、以其前所未有之程度併入本文中。在所併入之文獻及類似材料中之一或多者不同於本申請案或與本申請案相悖之情況下(包括(但不限於)所定義之術語、術語用法、所述技術或其類似者)，以本申請案為準。
上述描述及實例詳述本發明之某些特定實施例且描述本發明者所預期之最佳模式。然而，應瞭解，無論上述內容以多麼詳細之文字出現，本發明可以許多方式實施，且本發明應根據隨附申請專利範圍及其任何等效物來解釋。
<110> 美商雷那特神經科學股份有限公司 美商輝瑞大藥廠
<120> 抗升糖素受體之抗體及其使用方法
<130> PC33992A
<150> 61/820,604
<151> 2013-05-07
<150> _
<151> 2014-04-17
<160> 94
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 477
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
<210> 2
<211> 107
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<400> 61
<210> 62
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗體序列
<400> 62
<210> 63
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗體序列
<400> 63
<210> 64
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗體序列
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<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗體序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗體序列
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 人類化抗體序列
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<223> 人類化抗體序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 人類化抗體序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 人類化抗體序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 人類化抗體序列
<220>
<221> VARIANT
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為K或R
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<212> PRT
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<220>
<223> 人類化抗體序列
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<221> VARIANT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗體序列
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<221> VARIANT
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<223> Xaa可為L或Q
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類化抗體序列
<220>
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<220>
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<221> VARIANT
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<223> Xaa可為K或Q
<400> 93
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 人類化抗體序列
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<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為T或S
<220>
<221> VARIANT
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可為Y或V
<400> 94

Claims (34)

  1. 一種經分離之拮抗劑抗體，其特異性地結合至升糖素受體且包含：重鏈可變區(VH)，該重鏈可變區包含具有選自由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：11組成之群之胺基酸序列的VH之VH互補決定區1(CDR1)、VH CDR2及VH CDR3；及輕鏈可變區(VL)，該輕鏈可變區包含具有選自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8及SEQ ID NO：10組成之群之胺基酸序列的VL之VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。
  2. 如請求項1之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：24、16或25之胺基酸序列之VH CDR1、包含SEQ ID NO：18或26之胺基酸序列之VH CDR2、包含SEQ ID NO：41所示之胺基酸序列之VH CDR3、包含SEQ ID NO：40所示之胺基酸序列之VL CDR1、包含SEQ ID NO：13所示之胺基酸序列之VL CDR2，及包含SEQ ID NO：14所示之胺基酸序列之VL CDR3。
  3. 如請求項1或2之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：3、5、7、9或11所示之胺基酸序列之VH或其變異體，該變異體在非處於CDR內之殘基中具有一個或數個保守胺基酸取代。
  4. 如請求項1或2之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示之胺基酸序列之VL或其變異體，該變異體在非處於CDR內之胺基酸中具有一個或數個胺基酸取代。
  5. 如請求項1之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：11所示之胺基酸序列之VH及包含SEQ ID NO：10所示之胺基酸序列之VL。
  6. 如請求項5之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含有包含SEQ ID NO：87或88所示之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：89所示之胺基酸序列之輕鏈。
  7. 如請求項1、2、5或6中任一項之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體進一步包含免疫學惰性恆定區。
  8. 如請求項7之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體具有選自由IgG2、IgG2△a、IgG4、IgG4△b、IgG4△c、IgG4S228P、IgG4△b S228P及IgG4△c S228P組成之群的同型。
  9. 如請求項7之經分離之拮抗劑抗體，其中該恆定區為去糖基化Fc。
  10. 如請求項1之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體之各CDR係根據CDR之Kabat定義、Chothia定義、Kabat定義與Chothia定義之組合、AbM定義或接觸定義加以定義。
  11. 一種經分離之拮抗劑抗體，其特異性地結合至升糖素受體且結合至與由如請求項1之抗體識別之升糖素受體上之抗原決定基相同或重疊之抗原決定基。
  12. 如請求項11之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體識別人類升糖素受體上包含SEQ ID NO：1所示之升糖素受體胺基酸序列之胺基酸殘基31、33-38、40-42、44-45、48、62及64的抗原決定基。
  13. 如請求項11之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體識別人類升糖素受體上包含SEQ ID NO：1所示之升糖素受體胺基酸序列之胺基酸殘基33、36、38、41、44及45的功能性抗原決定基。
  14. 如請求項11之經分離之拮抗劑抗體，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之VH CDR1、包含SEQ ID NO：93之胺基酸序列之VH CDR2、包含SEQ ID NO：94所示之胺基酸序列之VH CDR3、包含SEQ ID NO：90所示之胺基酸序列之VL CDR1、包含SEQ ID NO：91所示之胺基酸序列之VL CDR2，及包含SEQ ID NO：92所示之胺基酸序列之VL CDR3。
  15. 一種經分離之細胞株，其產生如請求項1至14中任一項之抗體。
  16. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至14中任一項之抗體。
  17. 一種重組表現載體，其包含如請求項16之核酸。
  18. 一種宿主細胞，其包含如請求項17之表現載體。
  19. 一種融合瘤，其能夠產生如請求項1至14中任一項之抗體。
  20. 一種產生抗升糖素受體之拮抗劑抗體之方法，該方法包含：在產生如請求項1至14中任一項之抗體的條件下，培養可重組性產生該抗體之細胞株；及回收該抗體。
  21. 一種產生抗升糖素受體之拮抗劑抗體之方法，該方法包含：在產生包含有包含SEQ ID NO：87或88所示之胺基酸序列之重鏈及包含SEQ ID NO：89所示之胺基酸序列之輕鏈之抗體的條件下，培養包含編碼該抗體之核酸的細胞株；及回收該抗體。
  22. 如請求項21之方法，其中該重鏈及該輕鏈係在各別載體上編碼。
  23. 如請求項21之方法，其中該重鏈及該輕鏈係在同一載體上編碼。
  24. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  25. 一種用於治療與異常血糖含量相關之病狀之套組，其包含如請求項24之醫藥組合物。
  26. 一種如請求項1至14中任一項之拮抗劑抗體之用途，其係用於製 造用以在個體中降低血糖、改良葡萄糖耐受性及/或治療或預防由升糖素受體介導之病狀的藥劑。
  27. 如請求項26之用途，其中該病狀係選自由1型糖尿病、2型糖尿病、高血糖症、高胰島素血症、空腹葡萄糖異常、葡萄糖耐受性異常、血脂異常及代謝症候群組成之群。
  28. 如請求項26或27之用途，其中該藥劑係與第二治療劑一起投與。
  29. 如請求項28之用途，其中該第二治療劑係選自由胰島素、mTor抑制劑、雙胍、磺醯基脲、PPARγ促效劑、α葡糖苷酶抑制劑、EXENATIDE®、SYMLIN®、升糖素拮抗劑及第二升糖素受體拮抗劑組成之群。
  30. 如請求項29之用途，其中該雙胍為二甲雙胍(metformin)。
  31. 如請求項29之用途，其中該mT0r抑制劑係選自由雷帕黴素(rapamycin)、西羅莫司(sirolimus)、替西羅莫司(temsirolimus)、依維莫司(everolimus)、地磷莫司(ridaforolimus)及ATP競爭性mTOR激酶抑制劑(TKI)組成之群。
  32. 如請求項31之用途，其中該TKI係選自由Torin1、Torin 2、PP242、PP30、KU0063794、WAY-600、WYE-687、WYE-354、OSI-027、AZD-8055、KU-BMCL-200908069-1、Wyeth-BMCL-200908069-2、XL-388、INK-128及AZD-2014組成之群。
  33. 一種如請求項1至14中任一項之抗體之用途，其係用於製造用以治療或預防人類之1型或2型糖尿病或用以達成人類之體重減輕的藥劑。
  34. 如請求項1、2、5、6及10至14中任一項之抗體，其係用於治療由升糖素受體介導之病狀。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018502084A (ja) * 2014-12-23 2018-01-25 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ベータ細胞への変換と組み合わせられたアルファ細胞の再生
JP6861641B2 (ja) * 2015-04-02 2021-04-21 アールイーエムディー バイオセラピューティクス，インコーポレイテッドＲＥＭＤ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ グルカゴン受容体アンタゴニスト抗体を用いた肥満症および非アルコール性脂肪性肝疾患または非アルコール性脂肪性肝炎を治療するための方法
WO2017055966A1 (en) 2015-10-01 2017-04-06 Pfizer Inc. Low viscosity antibody compositions
WO2017062693A1 (en) * 2015-10-07 2017-04-13 Remd Biotherapeutics, Inc. Methods for treating rare genetic disorders using glucagon receptor antagonistic antibodies
WO2017120261A1 (en) * 2016-01-04 2017-07-13 Remd Biotherapeutics, Inc. Methods of treating type 2 diabetes mellitus using glucagon receptor antagonistic antibodies
CN109642908B (zh) * 2016-06-27 2022-08-16 哈佛学院院长及董事 可用于治疗代谢病症的化合物
WO2018005445A1 (en) 2016-06-27 2018-01-04 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diabetes
CN118236497A (zh) 2016-08-30 2024-06-25 瑞泽恩制药公司 通过干扰胰高血糖素受体的信号传导治疗重度胰岛素抵抗的方法
US20190248888A1 (en) * 2016-10-20 2019-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of lowering blood glucose levels
EP3573651A4 (en) 2017-01-27 2020-10-14 NGM Biopharmaceuticals, Inc. GLUCAGON RECEPTOR BINDING PROTEINS AND METHODS OF USE
CN110357959B (zh) 2018-04-10 2023-02-28 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
WO2020023847A1 (en) 2018-07-27 2020-01-30 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Use of glucagon receptor antagonists with immunotherapeutic agent
JP2022516439A (ja) 2018-12-21 2022-02-28 ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド 二特異性タンパク質
CN110898225A (zh) * 2019-12-23 2020-03-24 黑龙江中医药大学 mTOR/S6K1及MAPK信号通路抑制在胰岛素抵抗改善中的应用
CN113045657B (zh) * 2019-12-26 2022-06-07 杭州济元基因科技有限公司 一种人源化抗人bcma单克隆抗体及其car-t细胞

Family Cites Families (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US5422120A (en) 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
EP0454781B1 (en) 1989-01-23 1998-12-16 Chiron Corporation Recombinant cells for therapies of infection and hyperproliferative disorders and preparation thereof
US6673776B1 (en) 1989-03-21 2004-01-06 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate, mammal, fish, bird or human
JP3250802B2 (ja) 1989-03-21 2002-01-28 バイカル・インコーポレイテッド 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
AU641673B2 (en) 1989-06-29 1993-09-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
EP1001032A3 (en) 1989-08-18 2005-02-23 Chiron Corporation Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
NZ237464A (en) 1990-03-21 1995-02-24 Depotech Corp Liposomes with at least two separate chambers encapsulating two separate biologically active substances
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5278299A (en) 1991-03-18 1994-01-11 Scripps Clinic And Research Foundation Method and composition for synthesizing sialylated glycosyl compounds
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
GB9115364D0 (en) 1991-07-16 1991-08-28 Wellcome Found Antibody
ES2197145T3 (es) 1991-08-20 2004-01-01 The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Deptm. Of Health And Human Services Transferencia de genes mediada por adenovirus al gastrointestinal.
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
AU3144193A (en) 1991-11-21 1993-06-15 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Controlling degradation of glycoprotein oligosaccharides by extracellular glycosisases
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1993025234A1 (en) 1992-06-08 1993-12-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for targeting specific tissue
WO1993025698A1 (en) 1992-06-10 1993-12-23 The United States Government As Represented By The Vector particles resistant to inactivation by human serum
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
ATE149570T1 (de) 1992-08-17 1997-03-15 Genentech Inc Bispezifische immunoadhesine
PL178685B1 (pl) 1992-08-28 2000-06-30 Zymogenetics Inc Cząsteczka DNA kodująca receptor glukagonu lub peptyd receptora glukagonu, konstrukty DNA, komórka gospodarza zawierająca konstrukty DNA, peptyd receptora glukagonu i sposoby wytwarzania receptora glukagonu lub peptydu receptora glukagonu
CA2592997A1 (en) 1992-12-03 1994-06-09 Genzyme Corporation Pseudo-adenovirus vectors
US5981568A (en) 1993-01-28 1999-11-09 Neorx Corporation Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells
ES2188612T3 (es) 1993-04-22 2003-07-01 Skyepharma Inc Liposomas multivesiculares de ciclodextrina para encapsular compuestos farmacologicos y metodos para su uso.
WO1995000655A1 (en) 1993-06-24 1995-01-05 Mc Master University Adenovirus vectors for gene therapy
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
ATE215989T1 (de) 1993-09-15 2002-04-15 Chiron Corp Rekombinanter alphavirus vektor
EP2113569A1 (en) 1993-10-25 2009-11-04 CANJI, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
NZ276305A (en) 1993-11-16 1997-10-24 Depotech Corp Controlled release vesicle compositions
US6436908B1 (en) 1995-05-30 2002-08-20 Duke University Use of exogenous β-adrenergic receptor and β-adrenergic receptor kinase gene constructs to enhance myocardial function
DE69535669T2 (de) 1994-05-09 2008-12-04 Oxford Biomedica (Uk) Ltd. Retrovirale vektoren mit verminderter rekombinationsrate
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
US6265150B1 (en) 1995-06-07 2001-07-24 Becton Dickinson & Company Phage antibodies
DE69739286D1 (de) 1996-05-06 2009-04-16 Oxford Biomedica Ltd Rekombinationsunfähige retrovirale vektoren
WO1999018792A1 (en) 1997-10-10 1999-04-22 Johns Hopkins University Gene delivery compositions and methods
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
AU770555B2 (en) 1998-08-17 2004-02-26 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1158997A2 (en) 1999-03-09 2001-12-05 University Of Southern California Method of promoting myocyte proliferation and myocardial tissue repair
EP1575517B1 (en) 2002-12-24 2012-04-11 Rinat Neuroscience Corp. Anti-ngf antibodies and methods using same
AU2006236508B2 (en) 2005-04-15 2012-02-02 Precision Biologics, Inc. Recombinant monoclonal antibodies and corresponding antigens for colon and pancreatic cancers
CL2007002668A1 (es) 2006-09-20 2008-05-09 Amgen Inc Proteina de union a antigeno que se une al receptor de glucagon humano; acido nucleico que la codifica; metodo de produccion; composicion farmaceutica que la comprende; y su uso para tratar o prevenir la diabetes tipo 2.
CL2009000586A1 (es) * 2008-03-27 2010-06-04 Lilly Co Eli Fragmento fab o anticuerpo monoclonal humanizado que lo comprende que se une a receptor de glucagon humano/glucr, de rata, de raton, y mono cinomolgus; vector que comprende polinuccleotido codificante; celula huesped que lo comprende; composicion farmaceutica; uso para tratar diabetes tipo 1 o 2, o para la perdida de peso
EP2475683A4 (en) 2009-09-08 2013-04-24 Neopharm Co Ltd GLUCAGONIC RECEPTOR ANTIBODY YOUR USE
JO3756B1 (ar) 2010-11-23 2021-01-31 Regeneron Pharma اجسام مضادة بشرية لمستقبلات الجلوكاجون

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