[go: up one dir, main page]

TW201437367A - 可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌 - Google Patents

可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌 Download PDF

Info

Publication number
TW201437367A
TW201437367A TW102111616A TW102111616A TW201437367A TW 201437367 A TW201437367 A TW 201437367A TW 102111616 A TW102111616 A TW 102111616A TW 102111616 A TW102111616 A TW 102111616A TW 201437367 A TW201437367 A TW 201437367A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
lactic acid
gene
carbon
lactate dehydrogenase
biologically pure
Prior art date
Application number
TW102111616A
Other languages
English (en)
Inventor
li-ting Lu
Der-Ren Hwang
Original Assignee
Far Eastern New Century Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Far Eastern New Century Corp filed Critical Far Eastern New Century Corp
Priority to TW102111616A priority Critical patent/TW201437367A/zh
Priority to CN201310288914.8A priority patent/CN104073448A/zh
Priority to US14/108,825 priority patent/US9382557B2/en
Publication of TW201437367A publication Critical patent/TW201437367A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
    • C12N1/185—Saccharomyces isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/85—Saccharomyces
    • C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明提供一種釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)之生物純培養物，其培養物具有可高量生產乳酸之特徵性質。本發明亦提供一種包含製備該生物純培養物之方法，及一種用於產生乳酸之方法。

Description

可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌
本發明係關於乳酸之生產技術，詳言之，係關於用於高量生產乳酸之釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)及方法。
傳統乳酸生產係使用乳酸菌(Lactobacillus spp.)發酵而得，但乳酸菌之培養須使用複合式培養基，該複合式培養基之成本高，除了增加發酵過程之成本外，亦增加自發酵液中分離純化乳酸之成本。然而，若欲應用以乳酸為單體所聚合成之聚乳酸於日用塑膠中，生產乳酸之成本必須降低，因此，許多研究開始嘗試改良菌種，例如使用釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)進行微生物發酵以生成乳酸。釀酒酵母菌之原生菌株無法進行乳酸發酵，因此在1994年Dequin等人透過基因工程，於釀酒酵母菌之細胞內表現外源乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)，使釀酒酵母菌可利用葡萄糖發酵生產乳酸(Biotechnology(New York)，Feb.1994，12：p.173-177)，此為利用酵母菌生產乳酸之第一篇報導文獻。
可做為發酵碳源之生質原料來源相當廣泛，包含糖質(sugar)、澱粉(starch)及木質纖維素(lignocellulose)，其中利用糖質或澱粉原料做為發酵碳源以生產乳酸、有機酸或酒精等生質能源與材料之技術已十分成熟，然而，因糧食供給壓力與穀物成本上漲，利用糖質或澱粉原 料生產生質能源或材料並不經濟且不符期待，因此產業界積極投入發展以木質纖維素做為碳源而生產生質材料或能源。
五碳醣是半纖維素之主要組成之一，在植物纖維中含量可達到30%，因此，有效利用木醣並轉化為目標產物是使用木質纖維素為碳源的重要關鍵。以纖維素酒精工業發展為例，酒精工業上最廣為應用的原生釀酒酵母無法代謝五碳醣，因此從80年代開始科學家便利用基因工程技術或是馴化菌株方法改善酵母菌或細菌來發酵木醣等五碳醣生產酒精，其中以Nancy Ho等人最早揭露製備釀酒酵母菌之方法(美國實用專利第5789210號)，解決了培養成本以及使用混合碳源的問題，Nancy Ho等人利用基因轉殖技術，使酵母菌帶有並表現木醣還原酶(xylose reductase，XR)、木醣醇脫氫酶(xylose dehydrogenase，XDH)以及木酮醣激酶(xylulokinase，XKS)基因，此種重組酵母菌株可將木醣發酵為酒精。
於2001及2002年，Nature Works LLC(美國實用專利第7109010及7141410號)分別揭露使用基因轉殖技術，讓原生菌株可代謝木醣之酵母菌Kluyveromyces以及Candida sonorensis表現外源乳酸脫氫酶，使其可將木醣發酵生成乳酸，但其產率低，約僅有5%至34%。至2004年Cargill Inc(美國實用專利第7943366號)揭露藉由剔除Kluyveromyces marxianus及Candida sonorensis原本之五碳醣代謝基因木醣還原酶(xylose reductase，XR)及木醣醇脫氫酶(xylose dehydrogenase，XDH)，轉而表現木酮醣激酶(xylulokinase，XKS)以及外源木醣異構酶(xylose isomerase，XI)，以提升該酵母菌利用木醣發酵生成乳酸的能力，產率可達79%。此技術雖然提升乳酸之產率，但Kluyveromyces marxianus及Candida sonorensis並非一般常用之發酵菌種。
於2006年，Takahashi等人將Saccharomyces cerevisiae之原生PDC1以及PDC5基因置換成LDH，讓酵母菌株可代謝葡萄醣生成乳 酸，其產率雖可達81.5%，但此種菌株生長慢，且發酵速率慢，需時200小時才可達到最高產率(Biosci Biotechnol Biochem.2006 May；70(5)：1148-53)，並不符合快速生產之要求。綜上，習知技術利用菌種改良所開發出之乳酸生產技術，其產率或生產過程雖已有提升，惟用於量產時，可使用之碳源仍受限，故開發出一種可以產生更高乳酸產量的菌株，以及可以產生更高乳酸產量之低成本生產方式仍有其需求。
本發明提供一可高量生產乳酸之酵母菌，由於釀酒酵母菌具有培養容易且發酵能力強等許多優勢，本發明利用基因改質方式，使釀酒酵母菌可利用木醣發酵生成乳酸，且提高產率至約80%。
本發明為提供一種微生物菌株之生物純培養物，其中該微生物菌株係源自釀酒酵母菌FENC-05並包含至少一套數之外源乳酸脫氫酶基因；及該微生物菌株利用碳源生產乳酸之產率為大於約75%，其中該碳源包含五碳糖及六碳糖；及該釀酒酵母菌FENC-05係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920077。
本發明亦提供一種製備根據前述之生物純培養物之方法，其包含將該外源乳酸脫氫酶基因轉型入釀酒酵母菌FENC-05，並篩選利用碳源生產乳酸之產率大於約75%之微生物菌株，其中該碳源包含五碳糖及六碳糖。
本發明再提供一種生產乳酸之方法，其特徵在於一培養基中培養根據前述之微生物菌株之生物純培養物，並自該生物純培養物獲得乳酸，其中該培養基包含碳源，且該碳源包含五碳糖及六碳糖。
於以下部分中詳細描述本發明。可在以下[實施方式]及申請專利範圍中容易地發現本發明之其他特徵、目的及優點。
圖1顯示pFENC-01之質體圖譜。
圖2顯示pFENC-L01之質體圖譜。
圖3顯示pFENC-Cre之質體圖譜。
圖4顯示pFENC-L02之質體圖譜。
圖5顯示FENC-Sc 5dPL-4LK之乳酸脫氫酶蛋白質之蛋白質電泳圖及西方墨點法結果圖。
參考以下對本發明之各態樣、實例、及伴隨相關描述之化學圖式及表格的詳細描述，可更容易地瞭解本發明。在揭示及描述本發明之純培養物、組合物及/或方法之前，應瞭解，除非由申請專利範圍另外特別地指出，否則本發明不受限於特定製備方法或生產方法的特定模式，此係由於熟習相關技術之通常知識者非常清楚此等事情是可以加以變化的。亦應瞭解，本文所用之術語僅用於描述特定態樣之目的而不意欲用於限制性本發明之範疇。
除非另外指出，否則如本發明所用之以下術語應解釋為具有以下含義。
如本文所用之術語「乳酸」係指2-羥基丙酸，其係為多種生物化學過程中重要之化合物。乳酸為含有羥基之羧酸，其分子式為C3H6O3。乳酸有兩種旋光異構體，一個為L-(+)-乳酸或(S)-乳酸，另一個為D-(-)-乳酸或(R)-乳酸。於本發明之較佳具體例中，乳酸係指L-(+)-乳酸或(S)-乳酸。
本發明所言之「純培養物」乙詞係指只有一種微生物的培養物，如果某一培養物是由單一微生物細胞繁殖產生的，就稱之為該微生物之純培養物。
範圍在本文中通常表述為「約」一個特定值及/或至「約」另一個特定值。當表述此類範圍時，一態樣為包括一個特定值及/或至另 一個特定值之範圍。類似地，當值藉由使用字「約」表述為近似值時，應瞭解特定值可形成另一態樣。另外應瞭解，每一範圍之各端點皆有顯著性，一端點與另一端點既有相關性，亦彼此獨立。
「視情況」或「視情況地」意謂隨後所述之事件或狀況可能發生或可能不發生，且該描述包括該事件或狀況發生之情況及其未發生之情況。舉例而言，「視情況包含試劑」意謂該試劑可能存在或可能不存在。
根據本發明中乳酸之產率測定可為一般之測定方法，具體言之，可利用高效率液相層析儀(HPLC)定量。於下文中所言之乳酸產量係將醱酵後所得的樣品，經離心過濾，所得之濾液再經HPLC定量所得之數值。HPLC進行分析之條件為：管柱為Transgenomics 87H column，管柱溫度設定為65℃，移動相則為5mM H2SO4，流速為0.6 mL/min。
必須指出，除非上下文另外清楚規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一」及「該」包括複數個所指標的物。因此，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。
本發明提供一種微生物菌株之生物純培養物，其中該微生物菌株係源自釀酒酵母菌FENC-05並包含至少一套數之外源乳酸脫氫酶基因；及該微生物菌株利用碳源生產乳酸之產率為大於約75%，較佳係為約75%至約80%；及該釀酒酵母菌FENC-05係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920077。
本發明所言之「外源」乙詞係指來源並非釀酒酵母菌野生種，亦即自然界不存在於釀酒酵母菌中。
本發明所言之「乳酸脫氫酶基因」乙詞係指其編碼之產物為具有乳酸脫氫酶活性，其中乳酸脫氫酶具有催化丙酮酸與乳酸間之轉換 能力，或具催化還原型菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸與其氧化型之間之轉換能力。因乳酸具有L-(+)-乳酸以及D-(-)-乳酸兩種旋光異構體，L-(+)-乳酸由L-乳酸脫氫酶生成，D-(-)-乳酸由D-乳酸脫氫酶生成，較佳地，該乳酸脫氫酶係為L-乳酸脫氫酶基因編碼。
根據本發明之外源乳酸脫氫酶基因可為已經解碼或未經解碼之完整基因或其功能性片段。於本發明之一較佳具體實施例中，該外源乳酸脫氫酶基因係為源自牛。
由於每個物種進行胺基酸序列轉譯時，都有其慣用之核酸密碼子(codon)，因此，如欲於細胞內表現外源基因時，若直接使用原始物種基因序列，會因為密碼子無法被宿主細胞辨識而無法轉錄、轉譯成蛋白質，因此於本發明之一較佳具體實施例中，該外源乳酸脫氫酶係以小牛(bovine)之乳酸脫氫酶基因編碼為模板，經過人工最適化處理，比對物種慣用密碼子資料庫(http：//www.kazusa.or.jp/codon/)，將來自牛之乳酸脫氫酶基因編碼修改成易於酵母菌細胞辨識的人造序列(artificial sequence)，並示於SEQ ID NO.11，使此段基因編碼可以在酵母菌細胞內表現有酵素功能的乳酸脫氫酶蛋白質。
根據本發明之該外源乳酸脫氫酶基因可由釀酒酵母菌固有之啟動子啟動，或為外源啟動子所啟動。較佳地，該外源乳酸脫氫酶係由釀酒酵母菌固有之啟動子啟動；由於該外源乳酸脫氫酶係與碳源之利用相關，故更佳地，該外源乳酸脫氫酶係由與碳源利用相關之釀酒酵母菌固有之啟動子啟動；尤佳地，該外源乳酸脫氫酶係經丙酮酸脫羧酶1啟動子所調控。
於本發明之較佳具體實施例中，該外源乳酸脫氫酶基因係取代釀酒酵母菌中原生之丙酮酸脫羧酶1結構基因，並由完整之丙酮酸脫羧酶1啟動子所調控。
於本發明之一較佳具體實施例中，該微生物菌株係為釀酒酵母 菌，另包含至少一套數之五碳醣代謝基因。較佳地，該五碳醣代謝基因係選自由木醣還原酶、木醣醇脫氫酶、木酮醣激酶及木醣異構酶所組成之群。
於本發明之一較佳具體實施例中，該生物純培養物包含釀酒酵母菌FENC-Sc 5dPL-4LK，其寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920083。
FENC-Sc 5dPL-4LK菌株相較於母株FENC-05，其使用包含五碳糖及六碳糖之碳源發酵時，酒精轉換率只剩下10%，而乳酸產率可達到80%。
本發明亦提供一種製備根據前述之生物純培養物之方法，其包含將該外源乳酸脫氫酶基因轉型入釀酒酵母菌FENC-05，並篩選利用碳源生產乳酸之產率大於約75%之微生物菌株，其中該碳源包含五碳糖及六碳糖。
於本發明之一較佳具體實施例中，該方法包含剔除釀酒酵母菌之丙酮酸脫羧酶1，並使該外源乳酸脫氫酶基因係經丙酮酸脫羧酶1啟動子所調控。
根據本發明之方法，篩選生產乳酸之產率大於約75%之微生物菌株之方法，可直接測定乳酸之產率或篩選外源乳酸脫氫酶基因套數較多之微生物菌株，較佳係篩選外源乳酸脫氫酶基因套數較多之微生物菌株，於本發明之一較佳具體實施例中，可利用含碳酸鈣之培養基進行篩選。因乳酸脫氫酶基因套數較多之微生物菌株可產生較多乳酸，且乳酸會與碳酸鈣反應，形成溶解度較碳酸鈣高的乳酸鈣，故在可產生乳酸之微生物菌落周圍，原本呈現白色的含碳酸鈣培養基會變成透明，形成一透明圈。因此，藉由挑選透明圈較大之微生物菌株，可得到乳酸產率較高的微生物菌株。另一方面，其中該篩選方法可為同時轉殖一報導基因，並藉由測定該報導基因之表現而測定。於本發明之 一較佳具體例中，該報導基因係為一抗藥性基因。
於本發明之具體實施例中，剔除釀酒酵母菌株FENC-05之原生丙酮酸脫羧酶1，並同時以外源乳酸脫氫酶基因取代原本丙酮酸脫羧酶基因的位置，使得乳酸脫氫酶表現受到原本丙酮酸脫羧酶1啟動子的調控，得到重組酵母菌株FENC-5dPLK。接著以Cre/loxp系統，移除菌株之抗藥性基因，得到FENC-5dPL使得菌株可以再次進行外源乳酸脫氫酶轉殖，讓外源乳酸脫氫酶伴隨抗藥性基因以隨機的方式，插入酵母菌基因體中，接著以含有高抗生素濃度之培養基篩選出抗藥性較高的菌株，以挑選出含有較多乳酸脫氫酶套數之酵母菌株，即為FENC-Sc 5dPL-4LK。
本發明再提供一種生產乳酸之方法，其特徵在於一培養基中培養根據前述之微生物菌株之生物純培養物，並自該生物純培養物獲得乳酸，其中該培養基包含碳源，且該碳源包含五碳糖及六碳糖。
於本發明之較佳具體例中，該六碳糖係選自由葡萄糖、果糖(Fructose)、半乳糖(Galactose)及甘露糖(Mannose)所組成之群。
另一方面，於本發明之較佳具體例中，該五碳糖係選自由木糖及阿拉伯糖所組成之群。
根據本發明之方法可以本發明所屬技術領域中具通常知識者熟知的方式進行醱酵。培養較佳為批次培養或饋料批次培養。其具體培養基之調配及培養條件之決定為本發明所屬技術領域中具通常知識者基於本發明說明書之揭示而可決定者。
根據本發明，乳酸係存在於微生物中或培養基中。本發明之方法進一步包含自液體培養基中回收乳酸之步驟。可以一般本發明所屬技術領域中具通常知識者熟知的方式進行回收。
以下之非限制性之實例有助於本發明所屬技術領域中具通常知識者實施本發明。該等實例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬 技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。
實例 木醣代謝相關基因選殖及重組質體建構
本實例中木醣代謝相關基因選殖工作係利用聚合酶連鎖反應(Polymerase chain reaction，PCR)進行。首先以SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4之引子組合，並以釀酒酵母菌BCRC 22743所提取之基因庫為模板，選殖出pGK啟動子及pGK終結子；以SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8之引子組合，從Pichia stipitis細胞中，選殖出木醣還原酶(XR)、木醣酶脫氫酶(XDH)基因；以SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10引子組合，並以釀酒酵母菌BCRC 22743所提取之基因庫為模板，以PCR選殖木酮醣激酶(XKS)基因，將以上核酸片段以適當之限制酶切位共同構築至pAUR101質體中，即完成木醣相關基因重組載體之建構，所得之質體為pFENC-01(如圖1所示)。
建構可將PDC1基因置換成乳酸脫氫酶基因(LDH)之質體pFENC-L01
將Takahashi等人的方式稍做修改，建立基因轉殖載體，將LDH基因表現卡匣插入酵母菌染色體上PDC1的位置(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，Apr.2005，p.1964-1970)，做法如下：
乳酸脫氫酶LDH全基因合成
以小牛(bovine)的LDH基因編碼為模板，經過人工最適化處理，比對物種慣用密碼子資料庫(http：//www.kazusa.or.jp/codon/)，將來自牛的LDH基因編碼修改成易於酵母菌細胞辨識的人造序列SEQ ID NO.11，使此段基因編碼可以在酵母菌細胞內表現有酵素功能的LDH蛋白質。
依照SEQ ID-11之序列以PCR進行乳酸脫氫酶的全基因合成。
建構基因置換質體pFENC-L01
分別以SEQ ID NO.12/SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14/SEQ ID NO.15以及SEQ ID NO.16/SEQ ID NO.17為引子組合，釀酒酵母菌BCRC 22743所提取之基因庫為模板，進行PCR選殖部分PDC1啟動子片段(400 bp)、PDC1終結子片段以及ENO1終結子；以SEQ ID NO.18/SEQ ID NO.19為引子組合，pFa-KanMX6質體為模板，進行PCR選殖抗G418基因表現卡匣，並使其帶有loxp序列。將上述核酸片段與LDH基因片段以及載體pBluescript II KS(-)以適當限制酶切位進行接合，得到基因置換質體pFENC-L01(如圖2所示)。
建構Cre/loxp基因移除系統的重組酶表現質體pFENC-Cre
將Hegemann等人的方式稍做修改，建立酵母菌基因移除系統(Nucleic Acids Research，1996，Vol.24，No.13 2519-2524)，做法如下：
重組酶Cre全基因合成
以噬菌體P1(Enterobacteria phage P1，NCBI Reference Sequence：YP _006472.1)之Cre基因編碼為模板，經過人工最適化處理，比對物種慣用密碼子資料庫(http：//www.kazusa.or.jp/codon/)，將來自噬菌體P1的Cre基因編碼修改成易於酵母菌細胞辨識的人造序列SEQ ID NO.20，使此段基因編碼可以在酵母菌細胞內表現有酵素功能的Cre蛋白質。依照SEQ ID NO.20之序列以PCR進行Cre之全基因合成。
建構重組酶Cre誘導表現質體pFENC-Cre
以SEQ ID NO.21/SEQ ID NO.22為引子組合，pFa-KanMX6質體為模板，進行PCR選殖抗G418基因表現卡匣；以SEQ ID NO.23/SEQ ID NO.24為引子組合，pFa6a-Hyg質體為模版，進行PCR選殖抗 Hygromycine基因表現卡匣；以SEQ ID NO.25/SEQ ID NO.26為引子組合，pYD1(Invitrogen)質體為模板，進行PCR選殖GAL1啟動子片段；分別以SEQ ID NO.16/SEQ ID NO.17為引子組合，釀酒酵母菌BCRC 22743所提取之基因庫為模板，進行PCR選殖ENO1終結子；以SEQ ID NO.27/SEQ ID NO.28為引子組合，pSos ColI(AgilentTeclmologies)質體為模板，進行PCR選殖2u ori片段。將上述核酸片段與Cre基因片段及載體pUC19以適當限制酶切位進行接合，得到重組酶Cre誘導表現質體pFENC-Cre(如圖3所示)。
建構乳酸脫氫酶基因LDH表現質體pFENC-L02
分別以SEQ ID NO.29/SEQ ID NO.30以及SEQ ID NO.31/SEQ ID NO.32為引子組合，釀酒酵母菌BCRC22743所提取之基因庫為模板，進行PCR選殖出酵母菌逆轉座子(retrotransposon)Delta序列基因片段；以SEQ ID NO.33/SEQ ID NO.13為引子組合，釀酒酵母菌BCRC22743所提取之基因庫為模板，進行PCR選殖完整PDC1啟動子(900 bp)；以SEQ ID NO.34/SEQ ID NO.35為引子組合，質體pFENC-L01為模板，進行PCR選殖抗G418基因表現卡匣；以限制酵素AvrII/BamHI對質體pFENC-L01進行酶切反應，得到LDH-ENO1終結子；將上述核酸片段與載體pUC19以適當限制酶切位進行接合，得到質體pFENC-L02(如圖4所示)。
建構可同時代謝葡萄醣以及木醣的酵母菌株FENC-05
將pFENC-01質體以化學法轉殖至工業用酵母菌株(釀酒酵母菌BCRC 22743)中(Tranformation of yeast by the LiAC/SS carrier DNA/PEG method.Methods in Enzymology，2002，350，p.87-96.)，以含0.5 μg/L Aureobasidin A之YPD固態培養基(1%酵母萃取物，2%蛋白腖，2%葡萄糖，2%瓊脂)篩選轉型株，置於30℃培養，從轉型株中 挑出代謝五碳醣能力較佳的酵母菌株FENC-05，FENC-05係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920077。
剔除FENC-05的原生PDC1基因，並同時在該基因座位置放入LDH基因，建立菌株FENC-5dPL
以電穿孔方式將質體pFENC-L01酶切片段送入酵母菌FENC-05的細胞中
以限制酵素BssHII對質體pFENC-L01進行酶切反應，將所得帶有LDH基因編碼的核酸片段，以電穿孔方式(1.5kV，200 ohm，25uF，2mm cuvette)送入酵母菌細胞內，並且以含300μg/mL G418的YPD固態培養基篩選對G418具有抗性的轉殖株。
以碳酸鈣培養基篩選出PDC1基因被置換成LDH基因之轉殖株
將對G418具有抗性的轉殖株轉移到含0.5%碳酸鈣的YPD固態培養基進行培養，由於BssHII酶切pFENC-L01片段上只帶有部分PDC1啟動子(400 bp)，並不足以驅使LDH表現，因此，唯有完成以LDH基因取代原生PDC1序列之轉殖株，其LDH基因才能受到完整原生PDC1啟動子序列調控而表現，產生乳酸，並在碳酸鈣培養基上產生透明圈(clear zone)。將會產生透明圈的菌株5dP5LK-10進行產孢培養(sporulation)；先在YPK培養基(20 g/L蛋白腖，10 g/L酵母萃取物，10g/L KAc)中培養16小時，再將菌體移至SPM培養基(10 g/L KAc，1 g/L酵母萃取物，0.5 g/L葡萄糖，0.05 g/L腺苷，0.05 g/L尿苷，0.1g/L色胺酸，0.1 g/L亮胺酸，0.1 g/L組胺酸)，30℃培養5-7天進行產孢；將SPM菌液塗在YPD固態培養基上以挑選出單一菌落，將單一菌落轉移至含有0.5%碳酸鈣的YPD固態培養基進行培養，挑選出透明圈有變大的菌株，表示其基因體上的兩套PDC1基因皆已置換成LDH基因，該菌株為5dP5LK-10S8。
以Cre/loxP系統移除5dP5LK-10S8菌株的抗藥性基因，建立菌株 FENC-5dPL
以電穿孔方式將質體pFENC-Cre轉殖入5dP5LK-10S8中，以含有300μg/mL Hygromycin的YPD固態培養基篩選轉殖成功的菌株，以2%SG固態培養基(20 g/L半乳糖，6.7 g/L YNB，20 g/L瓊脂)培養轉殖株，誘導Cre表現，進行抗G418抗藥性基因移除。將從2%SG培養基中長出的菌落分別移至含有300 μg/mL G418或是300 μg/mL Hygromycin的YPD固態培養基，確認其無法生長，表示已完成抗藥性基因移除以及pFENC-Cre丟失；得到菌株FENC-5dPL。
建構高LDH表現量的菌株FENC-Sc 5dPL-4LK
以電穿孔方式將質體pFENC-L02酶切片段送入酵母菌FENC-5dPL細胞中
以限制酵素XhoI對質體pFENC-L02進行酶切反應，將所得帶有LDH基因編碼的核酸片段，以電穿孔方式(1.5kV，200 ohm，25 uF，2mm cuvette)轉殖入FENC-5dPL細胞內，並且以含4000μg/mL G418的YPD固態培養基篩選對高濃度G418具有抗性的轉殖株。
以碳酸鈣培養基篩選出可能具有高LDH表現以及高乳酸產率特性的轉殖株
將對高濃度G418具有抗性的轉殖株移至碳酸鈣培養基進行培養，挑選出透明圈比FENC-5dPL大的轉殖株FENC-Sc 5dPL-4LK。
功效驗證： FENC-5dPL發酵測試：
1.前培養1：挑選單一菌落，以2 mL YPD(10 g/L酵母萃取物；20g/L蛋白腖，20 g/L葡萄糖)進行培養7小時，30℃，200rpm。
2.前培養2：將前培養1菌液倒入100 mL YPD60(10 g/L酵母萃取物；20g/L蛋白腖，60 g/L葡萄糖)中，培養24小時， 30℃，200rpm。
3.菌體製備：將前培養2之菌液以8000 rpm離心，去掉培養基，以二次水清洗兩次，再以5 mL二次水懸浮菌體，測定OD600。
4.發酵：發酵液體積100 mL(60 g/L葡萄糖、35 g/L木醣、1 g/L尿素)；FENC-5dPL組別另外加入3%碳酸鈣。取適量菌體懸浮液，以OD 12接種至發酵液中。以水封管封口，30℃，200 rpm培養72小時。
5.發酵液成分分析：
(1)依時間點取1mL發酵液，以13,200 rpm離心，取上清液以0.22 μm/PVDF無菌丟棄式過濾器過濾後，以二次水稀釋五倍。
(2)HPLC分析：Transgenomics 87H column 65℃，5mM H2SO4，0.6 mL/min。
(3)產率(yield)計算：(產物濃度/起始總醣量)x100%，其結果示於表1及表2。
FENC-Sc 5dPL-4LK乳酸脫氫酶蛋白質表現量確認
菌體製備：
挑選單一菌落以3 mL YPD，30℃，200rpm隔夜培養，取1 mL OD1之菌液以13,200rpm於4℃離心1分鐘以去除上清液，接著以100 μL 2x蛋白質樣本緩衝液懸浮菌體，再於95℃加熱20分鐘以製備樣本。
蛋白質表現量分析：
將15 μL樣本以8%SDS-PAGE分析，共兩組。
總蛋白質：將跑完電泳之SDS-PAGE以水清洗後，以InstantBlue染色，比較各樣本之總蛋白質萃取量。
LDH蛋白質：將跑完電泳之SDS-PAGE進行PVDF轉印(15V，100mA，60 min)，轉印完之PVDF膜以5%脫脂奶粉(1xPBS)於室溫浸漬一小時，再與LDH一次抗體(sc-33781，Santa Cruz)溶液(1：500於0.25%脫脂奶粉)於4℃浸漬隔夜。以1xPBS清洗三次後，加入2次抗體(1：2500；4142521f，NICHIREI BIOSCIENCES)於室溫浸漬一小時；以1xPBS清洗三次後，加入1 mL NBT/BCIP呈色。其結果示於圖5。
FENC-Sc 5dPL-4LK發酵測試
1.前培養1：挑選單一菌落，以2 mL YPD進行培養7小時，30℃，200rpm。
2.前培養2：將前培養1菌液倒入100 mL YPD60中，培養24小時，30℃，200rpm。
3.菌體製備：將前培養2之菌液以8000 rpm離心，去掉培養 基，以二次水清洗兩次，再以5 mL二次水懸浮菌體，測定OD600。
4.發酵：發酵液體積100 mL(60 g/L葡萄糖、35 g/L木醣、1 g/L尿素、5%碳酸鈣)。取適量菌體懸浮液，以OD 12接種至發酵液中。以水封管封口，30℃，200 rpm培養72小時。
5.發酵液成分分析：
(1)依時間點取1mL發酵液，以13,200 rpm離心，取上清液以0.22 μm/PVDF無菌丟棄式過濾器過濾後，以二次水稀釋五倍。
(2)HPLC分析：Transgenomics 87H column 65℃，5mM H2SO4，0.6 mL/min。
(3)產率(yield)計算：(產物濃度/起始總醣量)x100%，其結果示於表3及表4。
上述實施例僅為說明本發明之原理及其功效，而非限制本發明。習於此技術之人士對上述實施例所做之修改及變化仍不違背本發明之精神。本發明之權利範圍應如後述之申請專利範圍所列。
<110> 遠東新世紀股份有限公司
<120> 可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌
<130> 無
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 1
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 2
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 3
<210> 4
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 4
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 5
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 6
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 7
<210> 8
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 8
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 9
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 10
<210> 11
<211> 1013
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Lactate dehydrogenase
<400> 11
<210> 12
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 12
<210> 13
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 13
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 14
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 15
<210> 16
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 16
<210> 17
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 17
<210> 18
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 18
<210> 19
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 19
<210> 20
<211> 1058
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Cre recombinase
<400> 20
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 21
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 22
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 23
<210> 24
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 24
<210> 25
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 25
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 26
<210> 27
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 27
<210> 28
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 28
<210> 29
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 29
<210> 30
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 30
<210> 31
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 31
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 32
<210> 33
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 33
<210> 34
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 34
<210> 35
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 35

Claims (12)

  1. 一種微生物菌株之生物純培養物，其中該微生物菌株係源自釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)FENC-05並包含至少一套數之外源乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)基因；及該微生物菌株利用碳源生產乳酸之產率為大於約75%，其中該碳源包含五碳糖及六碳糖；及該釀酒酵母菌FENC-05係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920077。
  2. 根據請求項1之生物純培養物，其中該外源乳酸脫氫酶基因係具有SEQ ID NO.11所示之序列。
  3. 根據請求項1之生物純培養物，其中該外源乳酸脫氫酶基因係經丙酮酸脫羧酶1(pyruvate decarboxylase 1，PDC 1)啟動子所調控。
  4. 根據請求項1之生物純培養物，其中該微生物菌株另包含至少一套數之五碳醣代謝基因。
  5. 根據請求項4之生物培養物，其中該五碳醣代謝基因係選自由木醣還原酶、木醣醇脫氫酶、木酮醣激酶及木醣異構酶所組成之群。
  6. 根據請求項1之生物純培養物，其中該微生物菌株係為FENC-Sc 5dPL-4LK，其係寄存於中華民國台灣新竹食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 920083。
  7. 一種製備根據請求項1至6任何一項之生物純培養物之方法，其包含將該外源乳酸脫氫酶基因轉型入釀酒酵母菌FENC-05，並篩選利用碳源生產乳酸之產率大於約75%之微生物菌株，其中該碳源包含五碳糖及六碳糖。
  8. 根據請求項7之方法，其包含剔除釀酒酵母菌之丙酮酸脫羧酶1，並使該外源乳酸脫氫酶基因係經丙酮酸脫羧酶1啟動子所調控。
  9. 一種生產乳酸之方法，其特徵在於一培養基中培養根據請求項1至6任何一項之微生物菌株之生物純培養物，並自該生物純培養物獲得乳酸，其中該培養基包含碳源，且該碳源包含五碳糖及六碳糖。
  10. 根據請求項9之方法，其中該六碳糖係選自由葡萄糖、果糖(Fructose)、半乳糖(Galactose)及甘露糖(Mannose)所組成之群。
  11. 根據請求項9之方法，其中該五碳糖係選自由木糖及阿拉伯糖所組成之群。
  12. 如請求項9之方法，其進一步包含自該培養基中回收乳酸之步驟。
TW102111616A 2013-03-29 2013-03-29 可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌 TW201437367A (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW102111616A TW201437367A (zh) 2013-03-29 2013-03-29 可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌
CN201310288914.8A CN104073448A (zh) 2013-03-29 2013-07-10 可利用五碳糖及六碳糖生产乳酸的酵母菌
US14/108,825 US9382557B2 (en) 2013-03-29 2013-12-17 Yeast strain for lactic acid production by using pentose and hexose

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW102111616A TW201437367A (zh) 2013-03-29 2013-03-29 可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201437367A true TW201437367A (zh) 2014-10-01

Family

ID=51595055

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102111616A TW201437367A (zh) 2013-03-29 2013-03-29 可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9382557B2 (zh)
CN (1) CN104073448A (zh)
TW (1) TW201437367A (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160012561A (ko) * 2014-07-24 2016-02-03 삼성전자주식회사 Erg5의 활성이 증가되도록 유전적으로 조작된, 내산성을 갖는 효모 세포 및 그를 이용하여 락테이트를 생산하는 방법
TWI526536B (zh) * 2014-12-22 2016-03-21 遠東新世紀股份有限公司 重組型酵母菌細胞及其製備方法與用途
CN108486176B (zh) * 2018-05-18 2021-08-03 天津科技大学 一种产乳酸乙酯的酿酒酵母及其构建方法与应用
TWI719317B (zh) * 2018-06-13 2021-02-21 遠東新世紀股份有限公司 用於生產乳酸的方法
CN110734937A (zh) * 2018-07-20 2020-01-31 远东新世纪股份有限公司 用于生产乳酸的方法
CN114540429A (zh) * 2022-01-26 2022-05-27 四川大学 基于浓酸低温水解及酸循环的秸秆化学品生产方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5789210A (en) 1993-11-08 1998-08-04 Purdue Research Foundation Recombinant yeasts for effective fermentation of glucose and xylose
CN100347308C (zh) * 1999-05-21 2007-11-07 卡吉尔道有限责任公司 合成有机产物的方法和材料
CN1249239C (zh) 2000-11-22 2006-04-05 加吉尔·道聚合物公司 合成有机产物的方法和材料
US7141410B2 (en) 2000-11-22 2006-11-28 Natureworks Llc Methods and materials for the production of organic products in cells of Candida species
DK2345662T3 (en) 2003-05-02 2016-08-15 Cargill Inc Genetically modified yeast species and fermentation processes using genetically modified yeast
CN101463328B (zh) * 2007-12-19 2011-06-29 中国科学院微生物研究所 一株利用木糖发酵产乙醇的代谢工程酵母菌
CN101886048B (zh) 2010-07-21 2012-05-30 江南大学 一种产乳酸工程菌及其构建方法和应用
CN102212489A (zh) * 2011-04-13 2011-10-12 江南大学 一种高产乳酸的酿酒酵母工程菌的构建及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20140342415A1 (en) 2014-11-20
CN104073448A (zh) 2014-10-01
US9382557B2 (en) 2016-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11174489B2 (en) Fermentative glycerol-free ethanol production
JP5321320B2 (ja) 発酵能力が向上された酵母及びその利用
JP2022025108A (ja) Ｆｄｃａの真菌による生産
KR102281701B1 (ko) 아세토인을 제조하는 방법
TW201437367A (zh) 可利用五碳糖及六碳糖生產乳酸之酵母菌
Álvarez-Cao et al. Bioconversion of beet molasses to alpha-galactosidase and ethanol
US20080254524A1 (en) Increased Ethanol Production from Xylose
CN113755354B (zh) 利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途
CN110651034A (zh) 用于制备fdca的fdca-脱羧单加氧酶-缺陷的宿主细胞
CN113881584A (zh) 一株经航天育种技术选育的酿酒酵母及其突变位点应用
MX2010014529A (es) Microorganismo que expresa aldosa-1-epimerasa.
TWI450963B (zh) 具高木醣消耗率之分離酵母菌株及使用該菌株製造酒精之方法
US5786186A (en) DNA encoding enzymes of the glycolytic pathway for use in alcohol producing yeast
WO2012133275A1 (ja) Kluyveromyces属の変異体酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
EP4506462A1 (en) Method for preparing glycine, acetyl coenzyme a, and acetyl coenzyme a derivative by using threonine
JP6343754B2 (ja) 耐酸耐塩性付与方法と耐酸耐塩性酵母を用いた有用物質生産
KR101551533B1 (ko) 2,3-부탄디올의 생성능이 증강된 재조합 미생물 및 이를 이용한 2,3-부탄디올의 생산 방법
CN115873881A (zh) 一种产1,3-丁二醇的基因工程菌及其应用
CN107267476A (zh) 一种乳酸脱氢酶及其在制备乳酸中应用
CN104831574A (zh) 一种用酿酒酵母工程菌降解植物的木质素的方法
Deng et al. Driving carbon flux through exogenous butyryl-CoA: acetate CoA-transferase to produce butyric acid at high titer in Thermobifida fusca
CN114806987B (zh) 一种改造的大肠杆菌工程菌及其生产柠苹酸的方法
JP2015000007A (ja) 組換え酵母、及びそれを用いたエタノールの製造方法
JP7452900B2 (ja) 乳酸耐性の向上を有する酵母およびその使用
Lertwattanasakul et al. as a Platform in Synthetic Biology