TW201138823A

TW201138823A - Anti-LRP6 antibodies

Info

Publication number: TW201138823A
Application number: TW100109985A
Authority: TW
Inventors: Eric Bourhis; Tim Christopher Cao; Rick Carano; Andrea Cochran; Mike Costa; Almeida Venita De; James Ernst; Yan Gong; Rami Hannoush; Paul Polakis; Bonnee Rubinfeld; Mark Solloway; Yan Wu
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2010-03-24
Filing date: 2011-03-23
Publication date: 2011-11-16
Also published as: SG184033A1; AU2011232514A1; BR112012022044A2; MX2012010853A; CN102906117B; CA2791991A1; KR101899835B1; US20140363439A1; US8846041B2; US9556267B2; WO2011119661A1; JP6093692B2; RU2587625C2; HK1178175A1; RU2012145086A; EP2550295A1; JP2013529060A; KR20130012256A; AR080795A1; NZ602040A

Description

201138823 六、發明說明：【發明所屬之技術領威】本發明係關於抗LRP6抗體及其使用方法。【先前技術】類似於多數其他成形素（m〇rph〇gen)及生長因子信號傳導路徑，在發育及組織内穩態期間藉由使用19種不同配位體、10種受體及多種輔助受體（coreceptor)(包括LRP5/6、鲁 Rorl/2及Ryk)多次採用哺乳動物Wnt信號傳導（van Amer〇ngen and Nusse，2009)。此外’結合 Wnt(老如 SFRP1/2/3/4/5 及 WIFI)或LRP5/6(包括DKK1/2/4及SOST)之不同分泌括抗劑調節配位體與受體之間的相互作用。此等膜及胞外蛋白質及其多種同功異型物在表現及組合蛋白質相互作用層面上提供差異性調控。多數Wnt同功異型物看似能夠結合輔助受體LRP5/6 ’且LRP5/6接合（engagement)限定典型或β -索烴素依賴性Wnt信號傳導。Wnt使LRP5/6及FZD雜二聚而 φ 介導LRP5/0胞内域之磷酸化及Axin結合（Tamai等人， 2000 ; Semenov等人，2001 ; Tamai等人，2004)。DVL藉由直接結合Axin及FZD而形成複合物，且DVL寡聚可能使細胞質膜面上螯合GSK3之此等蛋白質複合物增加且抑制其磷酸化及β-索烴素失穩（Mi等人，2006 ; Bilic等人， 2007 ; Schwarz-Romond等人，2007 ; Cselenyi等人，2008 ; Piao等人，2008 ; Zeng等人，2008 ; Wu等人，2009) 〇呈現可觀的一級序列分異度且介導哺乳動物典型Wnt信號傳導之大量配位體同功異型物與高度同源輔助受體對形 154875.doc 201138823 成對比。LRP6及LRP5胞外域主要由四個同源區組成，亦即自N末端至C末端的E1至E4，該等區各含有YWTD型β螺旋槳結構（propeller)及EGF樣結構域peon等人，2001)。 LRP0及LRP5中類似位置之各重複序列高度保守，而相同蛋白質内的不同重複序列顯著較為分異。有趣地是， 8〇11沌丨3等人.（2010)證明\^1^913只在活體外結合於£1-£2區内，而Wnt3a僅結合於含有E3-E4之片段，此表明各重複序列或兩個相鄰重複序列之組合結合於Wnt同功異型物之不同子集。此分佈可能提供Wnt蛋白質之多樣性，且可能亦允許LRP5/6拮抗劑配位體對其的差異性調控。在胞外區分別含有EGF樣及Ig結構域之重複序列的Notch及VEGF受體中，多種配位體同功異型物之結合侷限於一或兩個重複序列之相同區，但其他重複序列之存在可能增強結合。 (Rebay 等人，1991 ; Davis-Smyth 等人，1996 ; Cunningham 等人，1997)。對於受體酪胺酸激酶，配位體誘導之二聚引發對激酶活性及信號傳導之刺激。雖然配位體誘導之受體-輔助受體雜二聚為典型Wnt信號傳導所必需，但LRP5/6或FZD均二聚不存在明確確定的作用。迫使不同重組LRP6蛋白質二聚可能激活或抑制Wnt信號傳導。結合於受體FZD及輔助受體LRP5/6兩者之Wnt同功異型物引發β-索烴素依賴性Wnt信號傳導，此又在細胞質膜面上裝配多聚體複合物而募集及滅活激酶GSK3。Wnt同功異型物與受體之間機械上不同的相互作用是否可能且如何調 154875.doc 201138823 節此過程仍待確定》【發明内容】 I.定義用於達成本文目的之「接受體人類構架」為包含源自如下文所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架的輕鏈可變域（VL)構架或重鏈可變域（VH)構架之胺基酸序列的構架。「源自」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受 φ 體人類構架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化數目為1〇或1〇以下、9或9以下、8或8以下' 7或7以下、6或6以下、5或5以下、4或4以下、3或3以下、或2或2以下》在一些實施例中，VL接受體人類構架的序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列相同。「親和力」係指某一分子（例如抗體）之單一結合位點與其結合搭配物（例如抗原）之間的非共價相互作用之總和的參強度。如本文所用，除非另外指出，否則「結合親和力」係指反映結合對成員（例如抗體與抗原）之間1:丨相互作用的固有結合親和力。分子X對其搭配物γ的親和力—般可由解離常數（Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法（包括本文所述之方法）量測《下文描述用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例。「親和力成熟」抗體係指相較於親本抗體在一或多個高變區（HVR)中具有一或多個變化之抗體，該等變化導致該抗體對抗原之親和力有改良。 154875.doc 201138823 術語「抗LRP6抗體」及「結合於LRP6之抗體」係指能夠以足夠親和力結合LRP6以致抗體適用作把向LRP6之診斷劑及/或治療劑的抗體。在一實施例中，例如由放射免疫檢測法（RIA)所量測，抗LRP6抗體與不相關非LRP6蛋白質之結合程度小於該抗體與LRP6之結合的約1 〇%。在某些實施例中，結合於LRP6之抗體的解離常數（Kd)為£1 μΜ、 <100 ηΜ ' <10 ηΜ ' <1 ηΜ ' <0.1 ηΜ ' <0.01 ηΜ^<〇.〇〇ΐ ηΜ(例如10·8 Μ或10_8 Μ以下，例如10_8 Μ至ΙΟ」3 Μ，例如 ΙΟ·9 Μ至ΙΟ·13 Μ)。在某些實施例中，抗LRP6抗體結合於 LRP6之抗原決定基，其在不同物種之LRP6之間為保守的。本文之術語「抗體」依最廣泛含義使用且涵蓋多種抗體結構’包括（但不限於）單株抗體、多株抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）及展現所要抗原結合活性之抗體片段。「抗體片段」係指除完整抗體外的分子，其包含結合完整抗體所結合之抗原的一部分完整抗體。抗體片段之實例包括（但不限於）Fv、Fab、Fab，、Fab，-SH、F(ab，）2 ;雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子（例如scFv);及由抗體片段形成之多特異性抗體。與參考抗體「結合於相同抗原決定基之抗體」係指在競爭檢測法中阻斷參考抗體與其抗原結合達到50%或50%以上之抗體，且相反而言’在競爭檢測法中參考抗體阻斷該抗體與其抗原結合達到5 0%或5 0%以上。本文提供例示性 154875.doc • 6 · 201138823 競夢檢測法。術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物之通常以無節制的細胞生長/增殖為特徵的生理學病況。癌症之實例包括（但不限於）癌瘤、淋巴瘤（例如霍奇金氏及非霍奇金氏淋巴瘤（Hodgkin’s and non-H〇dgkin'S lymphoma))、胚細胞瘤、肉瘤及白血病。該等癌症之更特定的實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺之腺癌、肺之鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞瘤、胃腸癌、胰臟癌、神經膠質瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、曱狀腺癌、肝癌、白血病及其他淋巴組織增生性病症，以及各種類型之頭頸部癌。「化學治療劑」係指適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括烧基化劑，諸如塞替派（thiotepa)及環磷醯胺（cyclosphosphamide ; CYTOXAN®);烷基磺酸鹽，諸如白消安（busulfan)、英丙舒凡（improsulfan)及η底泊舒凡 (piposulfan);氮丙〇定類（aziridines)，諸如苯佐多巴 (benzodopa)、卡波酿（carboquone)、米特多巴（meturedopa) 及尤利多巴（uredopa);乙烯亞胺類及曱基三聚氰胺類，包括六曱密胺（altretamine)、三伸乙基三聚氰胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫基磷醯胺及三羥曱基三聚氰胺；乙醯精寧（acetogenin)(尤其布拉他辛（bullatacin)及布拉他辛酮 (bullatacinone)) ; δ-9·四氫大麻酚（屈大麻酚（dronabinol)， MARINOL®) •’ β-拉帕酮（beta-lapachone);拉帕醇 154875.doc 201138823 (lapachol);秋水仙驗（colchicine);樺木酸（betulinic acid);喜樹鹼（camptothecin)(包括合成類似物拓朴替康 (topotecan ； HYCAMTIN®) 、 CPT-11(伊立替康 (irinotecan ; CAMPTOSAR®))、乙酿基喜樹驗、東霞菪素 (scopolectin)及9-胺基喜樹驗）；苔蘚蟲素（bryostatin);卡利他丁（callystatin) ； CC-1065(包括其阿多來新

(adozelesin)、卡折來新（carzelesin)及比折來新（bizelesin) 合成類似物）；鬼臼毒素（podophyllotoxin);足葉草酸 (podophyllinic acid);替尼泊苷（teniposide);自念珠藻環肽（cryptophycin)(尤其自念珠藻環肽1及自念珠藻環肽8); 海兔毒素（dolastatin);多卡米辛（duocarmycin)(包括合成類似物 KW-2189 及 CB1-TM1);艾榴素（eleutherobin);水鬼薦驗（pancratistatin);沙考的汀（sarcodictyin);海綿他；丁 (spongistatin);氣芬類（nitrogen mustards)，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥（chlornaphazine)、氣礙醢胺、雌莫司汀 (estramustine)、異環填醯胺、氮芥（mechlorethamine)、氮芥氧化物鹽酸鹽、美法命（melphalan)、新恩比興 (novembichin)、苯芬膽甾醇（phenesterine)、潑尼莫司灯 (prednimustine)、曲洛構胺（trofosfamide)、尿嘴。定氮齐 (uracil mustard);亞石肖基脲，諸如卡莫司汀（carmustine)、氣脲黴素（chlorozotocin)、福莫司汀（fotemustine)、洛莫司 /'T (lomustine)、尼莫司汀（nimustine)及雷莫司汀 (ranimnustine);抗生素，諸如稀二炔抗生素（例如卡奇黴素（calicheamicin)，尤其卡奇徽素γΠ及卡奇黴素ωΐΐ，參 154875.doc 201138823

看例如Nicolaou等人，C/iew /«//·五ί/·五《§7.，33: 183-186 (1994)) ; CDP323(— 種口服α-4整合素抑制劑）；達内黴素（dynemicin)，包括達内黴素A;埃斯培拉黴素 (esperamicin);以及新制癌菌素（neocarzinostatin)發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團）、阿克拉黴素 (aclacinomysin)、放線菌素（actinomycin)、安麯黴素 (authramycin)、氮絲胺酸（azaserine)、博來黴素（bleomycin) 、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛（carabicin)、洋紅黴素（carminomycin)、嗜癌黴素（carzinophilin)、色黴素 (chromomycin)、放線菌素 D(dactinomycin)、道諾黴素 (daunorubicin) ' 地托比星（detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓（doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、 N-嗎啉基-小紅莓、氰基-(N-嗎啉基）-小紅莓、2-(N-吡咯啉基）-小紅莓、鹽酸小紅莓脂質體注射液（DOXIL®)、脂質體小紅莓TLC D-99(MYOCET®)、聚乙二醇化脂質體小紅莓 (CAELYX®)及脫氧小紅每（deoxydoxorubicin))、表柔比星 (epirubicin)、依索比星（esorubicin)、黃膽素（idarubicin)、麻西羅黴素（marcellomycin)、絲裂黴素（mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴紛酸（mycophenolic acid)、諾拉黴素 (nogalamycin)、橄欖黴素（olivomycin)、培洛黴素（peplomycin) 、泊非黴素（porfiromycin)、嘌呤黴素（puromycin)、三鐵阿黴素（quelamycin)、羅多比星（rodorubicin)、鏈黑黴素 (streptonigrin)、鍵佐星（streptozocin)、殺結核菌素（tubercidin) 、烏苯美司（ubenimex)、淨司他丁（zinostatin)、佐柔比星 <：ί 154875.doc 201138823

(zorubicin);抗代謝物，諸如甲胺°祟呤、吉西他濱 (gemcitabine ; GEMZAR®)、喃氟咬（tegafur ; UFTORAL®) 、卡培他濱（capecitabine ; XELODA®)、埃坡黴素 (epothilone)及5-氟尿嘧啶（5-FU);葉酸類似物，諸如迪諾特寧（denopterin)、曱胺。棠吟、蝶羅吟（pteropterin)、三甲曲沙（trimetrexate) ; °票°令類似物，諸如II達拉濱 (fludarabine)、6-疏基 D票吟、嗟 11米嗓吟（thiamiprine)、硫鳥〇票吟（thioguanine) ； °密°定類似物，諸如安西他濱 (ancitabine)、阿紮胞苦（azacitidine)、6-氮雜尿苦、卡莫敗 (carmofur)、阿糖胞苷（cytarabine)、雙脫氧尿苷、脫氧氟尿苷、依諾他濱（enocitabine)、敗展苷（floxuridine);雄激素，諸如卡普睪酮（calusterone)、丙酸屈他雄酮 (dromostanolone propionate)、環硫雄醇（epitiostanol)、美雄院（mepitiostane)、睪内酯（testolactone);抗腎上腺類，諸如胺魯米特（aminoglutethimide)、米托坦（mitotane)、曲洛司坦（trilostane);葉酸補充劑，諸如夫羅林酸（frolinic acid);醋葡醛内酯（aceglatone);醛磷醯胺醣苷；胺基乙醯丙酸；恩尿，咬（eniluracil);安B丫咬（amsacrine);貝司他布（bestrabucil);比生群（bisantrene);埃達曲卡（edatraxate); 得弗伐胺（defofamine);秋水仙胺（demecolcine);地σ丫酉昆 (diaziquone);艾弗尼辛（elfornithine);依利醋錄（elliptinium acetate);埃坡黴素；依託格魯（etoglucid);硕酸鎵；經基脲；香益多醣（lentinan);羅尼代寧（lonidainine);美登素類（maytansinoids)，諸如美登素（maytansine)及美登木素 154875.doc -10- 201138823

(ansamitocin);米托胍膝（mitoguazone);米托蒽西昆 (mitoxantrone);莫比旦莫（mopidanmol);硝爾靈（nitraerine); 喷司他丁（pentostatin);蛋胺氮芥（phenamet) ; 0比柔比星 (pirarubicin);洛索蒽酿（losoxantrone) ; 2-乙基醯耕；丙卡巴肼（procarbazine) ; PSK® 多醋複合物（JHS Natural Products，Eugene, OR);雷佐生（razoxane);根瘤菌素 (rhizoxin);西佐喃（sizofiran);鍺螺胺（spirogermanium); 細交鏈抱菌酮酸(^1111&2〇114&〇丨(1);三亞胺酿；2,2'，2'-三氣三乙胺；單端孢黴烯族毒素（trichothecene)(尤其T-2毒素、韋拉庫林A(verracurin Α)、桿抱菌素A(roridin Α)及安奎定 (anguidine));烏拉坦（urethan);長春地辛（vindesine) (ELDISINE®、FILDESIN®);達卡巴嗪（dacarbazine);甘露莫司、;丁（mannomustine);二溴甘露醇（mitobronitol);二溴衛矛醇（mitolactol) ; °底泊漠烧（pipobroman);伽托辛 (gacytosine);阿拉伯糖普（arabinoside; 「Ara-C」）；塞替派；紫杉烧（taxoid)，例如太平洋紫杉醇（paclitaxel ; TAXOL®)、經白蛋白工程改造之太平洋紫杉醇之奈米粒子調配物（ABRAXANETM)及多西他賽（docetaxel ; TAXOTERE®);苯丁酸氮芥（chloranbucil); 6-硫鳥嘌呤； Μ基嘌吟；甲胺嗓呤；始試劑，諸如順鉑（cisplatin)、奥沙利链（oxaliplatin)(例如 ELOXATIN®)及卡始（carboplatin); 防止微管蛋白聚合形成微管的長春花屬（vinca)，包括長春鹼（VELBAN®)、長春新鹼（ONCOVIN®)、長春地辛 (ELDISINE®、FILDESIN®)及長春瑞賓（vinorelbine ; 154875.doc 201138823 NAVELBINE®);依託泊苷（etoposide)(VP-16);異環填醯胺；米托蒽酿；甲醢四氫葉酸（leucovorin);諾凡特龍 (novantrone);依達曲沙（edatrexate);道諾黴素；胺基喋吟；伊班膦酸鹽（ibandronate);拓撲異構酶抑制劑RFS 2000 ;二氟曱基烏胺酸（DMFO);類視黃素，諸如視黃酸，包括貝瑟羅汀（bexarotene ; TARGRETIN®);雙膦酸鹽，諸如氣屈膦酸鹽（clodronate)(例如BONEFOS®或 OSTAC®)、依替膦酸鹽（etidronate ; DIDROCAL®) ' NE-5 8095、n坐來膦酸（zoledronic acid)/°坐來膦酸鹽（zoledronate ; ZOMETA®)、阿侖膦酸鹽（alendronate ; FOSAMAX®)、帕来膦酸鹽(pamidronate ; AREDIA®)、替魯膦酸鹽(tiludronate ; SKELID®)或利塞膦酸鹽（risedronate ; ACTONEL®);曲沙他濱（troxacitabine)(l，3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物）；反義寡核苷酸，尤其能抑制異常細胞增殖中所涉及之信號傳導路徑中之基因表現的反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Raf、 H-Ras及表皮生長因子受體（EGF-R);疫苗，諸如 THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN® 疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；拓撲異構酶1 抑制劑（例如 LURTOTECAN®) ; rmRH(例如 ABARELIX®); BAY439006(索拉非尼（sorafenib); Bayer); SU-1 1248(舒尼替尼（sunitinib)，SUTENT®，Pfizer);略立福新（perifosine)、 COX-2抑制劑（例如塞來昔布（celecoxib)或依託昔布 (etoricoxib))、蛋白體抑制劑（例如PS341);棚替佐米 (bortezomib ; VELCADE®) ; CCI-779 ;替 °比法尼（tipifarnib ; 154875.doc 12 201138823 R1 1577);奥拉非尼（orafenib)、ABT510 ; Bcl-2抑制劑，諸如奥利默森鈉（oblimersen sodium; GENASENSE®);匹克生瓊（pixantrone) ; EGFR抑制劑（參看下文定義）；路胺酸激酶抑制劑（參看下文定義）；絲胺酸-蘇胺酸激酶抑制劑，諸如雷帕黴素（rapamycin)(西羅莫司（sirolimus)， RAPAMUNE®);法尼基轉移酶（farnesyltransferase)抑制劑，諸如洛那法尼（lonafarnib ; SCH 6636 ， SARAS ARTM);及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及兩種或兩種以上上述者之組合，諸如 CHOP，其為環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼龍 (prednisolone)之組合療法的縮寫；及FOLFOX，其為奥沙利鉑（ELOXATINtm)與5-FU及曱醯四氫葉酸組合之治療方案的縮寫。如本文所定義之化學治療劑包括能調控、減輕、阻斷或抑制會促進癌瘤生長之激素作用的「抗激素劑」或「内分泌治療劑」。其可為激素本身，包括（但不限於）：具有混合促效/拮抗特徵之抗雌激素，包括他莫昔芬（tamoxifen ; NOLVADEX®)、4-羥基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene ; FARESTON®)、艾多昔芬(idoxifene)、曲洛昔芬(dr〇l〇xifene)、雷洛昔芬（raloxifene ; EVISTA®)、曲沃昔芬（tri〇xifene)、雷洛昔芬（keoxifene)及選擇性雌激素受體調節劑（SErm)，諸如SERM3 ;不具有促效特性之純抗雌激素，諸如乾維司群（fulvestrant ; FASLODEX®)及EM800(該等藥劑可阻斷雌激素受體（ER)二聚化、抑制DNA結合、增加er轉換 154875.doc •13· 201138823 (turnover)且/或抑制ER含量）；芳香酶抑制劑，包括類固醇芳香酶抑制劑（諸如福美司坦（formestane)及依西美坦 (exemestane ; AROMASIN®))及非類固醇芳香酶抑制劑（諸如阿那曲0坐（anastrazole ; ARIMIDEX®)、來曲。坐（letrozole ; FEMARA®)及胺魯米特），及其他芳香酶抑制劑，包括伏氯0坐（vorozole ; RIVISOR®)、乙酸曱地孕酮（megestrol acetate ; MEGASE®)、法屈唾（fadrozole)及 4(5)-咪°坐；黃體激素釋放激素促效劑，包括亮丙立德（leuprolide ; LUPRON® 及 ELIGARD®)、戈舍瑞林（goserelin)、布舍瑞林（buserelin)及曲特瑞林（tripterelin);性類固醇，包括孕激素（諸如乙酸甲地孕酮及乙酸甲羥孕酮）、雌激素（諸如己稀雌盼（diethylstilbestrol)及普雷馬林（premarin))及雄激素/ 類視黃素（諸如敗經甲基睪酮（fluoxymesterone)、所有反式視黃酸及芬維A胺（fenretinide));奥那司S同（onapristone); 抗孕酮；雌激素受體下調劑（ERD);抗雄激素，諸如氟他胺（flutamide)、尼魯胺（nilutamide)及比卡魯胺（bicalutamide); 及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及兩種或兩種以上上述者之組合。術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自一特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自另一來源或物種之抗體。抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。存在5個主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及 IgM，且其中若干可進一步分為子類（同型），例如IgG!、 154875.doc • 14· 201138823

IgG2、IgG3、IgG4、IgA!及IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。如本文所用之術語「細胞毒性劑」係指能抑制或阻止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括（但不限於）放射性同位素（例如At2"、I131、I125、Υ90、 Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及 Lu之放射性同位素），化學治療劑或藥物（例如甲胺。票吟、阿德力黴素 φ (adriamicin)、長春花屬生物鹼（長春新鹼、長春鹼、依託治苷）、小紅莓、美法侖、絲裂黴素C、苯丁酸氮芥、道諾黴素或其他嵌入劑）；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核分解轉’抗生素；毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；及下文揭示之多種抗腫瘤劑或抗癌劑。「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區的彼等生物活性’其隨抗體同型而變化。抗體效應功能之實例包括：籲 C1q結合及補體依賴性細胞毒性（CDC) ; Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性（ADCC);吞噬作用；細胞表面受體（例如B細胞受體）之下調；及B細胞活化。某一藥劑（例如醫藥調配物）之「有效量」係指在必需劑量下及時段内可有效實現所要治療或預防結果的量。本文之術語「Fe區」係用於定義免疫球蛋白重鏈之含有至少一部分怪定區的C末端區。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區°在—實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226 或ΡΓ〇230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離 154875.doc 201138823 胺酸（Lys44 7)可能存在或不存在。除非本文中另外說明，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基編號係根據eu編號系統（亦稱為EU指數）進行，如Kabat等人，0/ ProiezW o//mmw«o/og!ca/ 第 5版.Public Health

Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 中所述。「構架」或「FR」係指除高變區（HVr)殘基之外的可變域殘基。可變域之FR—般由四個FR結構域組成：FR1、 FR2、FR3及FR4。因此，HVR及FR序列一般依以下順序出現於 VH(或 VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4 〇術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換地用於指結構實質上類似於天然抗體結構或重鏈含有如本文所定義之Fc區的抗體。術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及r宿主細胞培養物」了互換使用且係指已引入有外源核酸的細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」’其包括初級轉型細胞及不管繼代次數而源自其的子代°子代之核酸含量與母細胞可能不完全相同，而是可含有突變。本文包括針對原始轉型細胞所篩選或選擇具有相同功能或生物活性之突變子代。「人類抗體」為所具胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體的胺基酸序列的抗體^人類抗體之此 154875.doc 201138823 定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。「人類共同構架」為代表人類免疫球蛋白VL或VH構架序列之選擇中最常出現之胺基酸殘基的構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之子群。一般而言’序列子群為如Kabat等人，iSegweTices ο/' Proteins of Immunological Interest,第 5 版，NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991),第 1-3卷中之子 φ 群。在一實施例中，對於VL，子群為如Kabat等人，同上文中之子群κ I。在一實施例中，對於VH，子群為如Kabat 等人’同上文中之子群III。「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個及通常兩個可變域之實質上全部’其中所有或實質上所有HVR(例如CDR)對應於非人類抗體之彼等HVR且所有或實質上所有FR對應於人類抗 • 體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含至少一部分源自人類抗體之抗體恒·定區。抗體（例如非人類抗體）之「人類化形式」係指已被人類化之抗體。如本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上高變及/或形成結構上綠定之環（「高變環」）的各區。一般而言，天然四鏈抗體包含6個HVR ;三個在 VH 中（HI、H2、H3)且三個在 VL 中（LI、L2、L3)。HVR- 般包含來自高變環及/或來自「互補決定區J(CDR)之胺基酸殘基’互補決定區具有最高序列可變性及/或與抗原識 154875.doc •17· 201138823 別有關。例示性高變環出現於胺基酸殘基26-32(Ll)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(Η1)、53-55(H2)及 96-1 01 (H3) 處。（Chothia及 Lesk，·/. Mo/. 5b/. 196:901-917 (1987)。）例示性 CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、 CDR-H2及CDR-H3)出現於LI之胺基酸殘基24-34、L2之 50-56、L3 之 89-97、HI 之 31-35B、H2 之 50-65 及 H3 之 95-102 處。（Kabat 等人，分wewces of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD (1991)。）除 VH 中之CDR1外，CDR—般包含來自高變環之胺基酸殘基。 CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為與抗原接觸之殘基。SDR含於稱為簡化-CDR或a-CDR之CDR區中。例示性a-CDR(a-CDR-Ll、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現於LI之胺基酸殘基 31-34、L2之 50-55、L3 之 89-96、HI 之 31-35B、H2之 50-58 及 H3 之 95-.102處。（參看 Almagro 及 Fransson，Frowi.价仍以· 13:1619-1633 (2008)。）除非另外指出，否則在本文中可變域中之HVR殘基及其他殘基（例如FR殘基）係根據Kabat等人，同上文來編號。「免疫結合物」為結合於一或多個異源分子（包括（但不限於）細胞毒性劑）之抗體。「個體」為哺乳動物。哺乳動物包括（但不限於）家養動物（例如牛、綿羊、貓、犬及馬）、靈長類動物（例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴）、兔及齧齒動物（例如小鼠及 154875.doc •18· 201138823 大鼠）。在某些實施例中，個體為人類。經分離」抗體為已與其天然環境之組分分離的抗體。在一些實施例中，抗體經純化至大於95%或99%的純度，例如由電泳（例如SDS-PAGE、等電聚焦（IEF)、毛細電泳法）或層析（例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於評估抗體純度之方法的綜述，參看例如Flatman等人，·/· Chromatogr. B 848:79-87 (2007) 〇

「經分離」核酸係指已與其天然環境之組分分離的核酸分子。經分離核酸包括含於通常含有該核酸分子之細胞中的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置的染色體位置處。「編碼抗LRP6抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈（或其片段）之一或多個核酸分子，包括單個載體或各別載體中之該（等）核酸分子，及存在於宿主細胞之一或多個位置處的該（等）核酸分子。如本文所用之術語「單株抗體」係指獲自實質上同源之抗體群體之抗體，亦即構成該群體之個別抗體為相㈣及/ 或結合相同抗原決定基，但可能之變異抗體除外，例如含有天然存在之突變或在製造單株抗體製劑期間產生之突變，該等變異體-般以少量存在。與通常包括針對不同決 =子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑不同，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上〇. 〜平決定子。因此’修飾語「單株表示獲自實質上俨的心抗體群體之抗體的特徵，且不應解釋為需要藉由任何料方法來產生抗 154875.doc -19- 201138823 體。舉例而s ’欲根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製備’包括（但不限於）融合瘤法、重組dna法、噬菌體呈現法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物之方法’該等方法及用於製備單株抗體之其他例示性方法在本文中有描述。「裸抗體」係指未與異源部分（例如細胞毒性部分）或放射性標記結合的抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。「天然抗體」係指具有不同結構的天然存在之免疫球蛋白为子。舉例而言’天然IgG抗體為約l50,0〇〇道爾頓 (dalton)且由經二硫鍵鍵結之兩個相同輕鏈及兩個相同重鏈構成的雜四聚醣蛋白。自N末端至c末端，各重鏈具有可變區（VH)(亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變域），繼之以三個恆定域（CHI、CH2及CH3卜類似地，自N末端至c 末端，各輕鏈具有可變區（VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變域），繼之以恆定輕鏈（CL)結構域。抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為稱為κ&λ的兩種類型之 — 〇術語「藥品說明書」係用於指治療產品商業包裝中通常包括之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或關於使用該治療產品之注意事項的資訊β 關於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比（％)」係定義為在比對序列且在需要時引入間隙以實現最大序列一致性百分比後，且在不將任何保守取代視為序列一致性 154875.doc -20- 201138823 之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列之胺基酸殘基一致之胺基酸殘基百分比。出於測定胺基酸序列一致性百分比的目的，比對可以屬於此項技術技能範圍内之多種方式實現，例如使用可公開獲得之電腦軟體，諸如 BLAST、BLAST-2、ALIGN或 Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較序列的整個長度上實現最大比對所需的任何演算法。然而，為本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性百分比值。ALIGN-2序列比較電腦程式係由Genentech, Inc.創造，且原始程式碼已與使用者文件一起在 U.S. Copyright Office, Washington D.C·，20559存檔，在美國版權局其以美國版權登記號第TXU510087號登記。ALIGN-2程式可公開經由 Genentech，Inc.，South San Francisco，California得到，或可由原始程式碼編譯。 ALIGN-2程式應經編譯以在UNIX操作系統（包括數位UNIX V4.0D)上使用。所有序列比較參數係藉由ALIGN-2程式設定且並不變化。在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形中，如下計算既定胺基酸序列A與既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性百分比（其或者可表述為既定胺基酸序列A與既定胺基酸序列B具有或包含某一胺基酸序列一致性百分比）： 10〇x(X/Y) 其中X為藉由序列比對程式ALIGN-2對Α與Β進行比對時評為一致匹配的胺基酸殘基數目，且其中Y為B之胺基酸殘 154875.doc 21 201138823 基的總數。應瞭解，當胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A與B之胺基酸序列一致性百分比將不等於B與A之胺基酸序列-致性百分比。除非另外明確說明’否則本文中使用之所有胺基酸序列一致性百分比值均使用ALIGN-2電腦程式如前一段中所述來獲得。術語「醫藥調酉己物」係、指一種呈可允許所含活性成分之生物活性有效之形式且不含對將投與調配物之個體具有不可接受之毒性之其他組分的製劑。「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外且對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括 (但不限於）緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。除非另外指出，否則如本文所用之術語「LRp6」係指來自任何脊椎動物來源之任何天然LRp6，該來源包括哺乳動物，諸如靈長類動物（例如人類）及齧齒動物（例如小鼠及大鼠）。該術語涵蓋「全長」、未加工之LRp6以及由細胞中加工產生之任何形式的LRP6。該術語亦涵蓋LRp6的天然存在之變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。例示性人類LRP6之胺基酸序列顯示於SEq ID N〇: 29中。亦參看 NCBI寄存編號 AAI43726, Strausberg，R. L.等人， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 : 16899-16903 (2002)； He，X等人，Devel〇pment，131:1663 1677 (2〇〇4); Chen， M.等人，J. Biol. Chem·，284:35040-35048 (2009)。如本文所用，「治療」係指力圖改變所治療個體之天然病程的臨床干預，且其可為了預防目的進行或在臨床病理 154875.doc •22· 201138823 學過程期間進行。所要治出現或復發、緩解症狀、減於）防止疾病 …，進展速率、改善或減輕疾 r用：延遲#或改善預後。在—些實施例中，本發明抗體用於延遲疾病出現或減緩疾病進展。術語「可變區」3戈「可變域」係指抗體與抗原結合時所涉及之抗體重鏈或輕鏈的結構域。天然抗體之重鍵及輕键之可變域（分別為VH及VL)-般具有類似結構，各結構域包含四_守構架區_及三個高變區（hvr)。（參看例如 Kmdt等人尺“紗抽ww„〇/〇烈第6版，w h

C〇.，第91頁（2〇07))。單個VH或％結構域可能足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用來自結合特定抗原之抗體的 VH或VL結構域來分離結合該抗原之抗體，以分別篩選互補VH或VL結構域的集合庫。參看例如卩加匕比⑽等人，乂 150:880-887 (1993) ; Clarkson 等人， 352:624-628 (1991) » 如本文所用之術語「載體」係指能夠傳送其所連接之另一核酸的核酸分子。該術語包括呈自身複製核酸結構的載體以及併入至已引入該載體之宿主細胞基因組中之載體。某些載體能夠引導與其以操作方式連接之核酸的表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。 II.組合物及方法本發明提供意外地能夠抑制一些Wnt同功異型物之信號傳導且增強其他同功異型物之信號傳導的抗LRP6抗體。 154875.doc •23· 201138823 如實例中所述，兩種抗LRP6抗體之進一步特徵在於對大多數Wnt顯示互逆活性，其中一種抗體具有拮抗作用但另一種卻具有增強作用。此兩種抗體結合於LRP6之不同區 (如同不同Wnt同功異型物之作法）且由阻斷Wnt結合性來抑制信號傳導。基於與本發明抗LRP6抗體之功能性相互作用，所測試之14種Wnt同功異型物可分為三類：Wnt3及Wnt3a受抗 LRP6抗體YW211.31抑制但被抗LRP6抗體YW210.09增強； Wnt 1、2、2B、6、8A、9A、9B 及 10B 被抗 LRP6 抗體 YW211.31增強但被抗LRP6抗體YW210.09拮抗；且Wnt 4、7A、7B及10A被抗LRP6抗體YW211.31增強但不受抗 LRP6抗體YW210.09抑制（圖3C)。此等分類顯然不對應於所提議之Wnt基因系統發育（phylogeny)，但Wnt3/3a子族在進化上最分異（Cho等人，2010)。可使用抑制不同類別之 Wnt同功異型物的抗LRP6抗體之組合為治療與Wnt信號傳導有關之疾病提供有效治療。抗體介導之LRP6二聚僅當Wnt同功異型物亦能夠結合複合物（大概募集FZD)時可增強信號傳導。不同腫瘤細胞株中之内源自分泌Wnt信號傳導可被LRP6抗體拮抗或提高。此輔助受體-配位體相互作用之複雜性可能允許有差異地調控Wnt同功異型物之信號傳導，且可與抗體一起用於有差異地控制特定組織或疾病狀態中之Wnt信號傳導。在一些實施例中，抗LRP6抗體可抑制一些細胞類型之自分泌或内源Wnt信號傳導，且增強其他細胞類型之自分 154875.doc -24- 201138823 泌信號傳導。在一些實施例中，抗LRP6抗體介導LRP6之二聚且在同時結合於LRp6之Wnt同功異型物存在下提高或增強信號傳導。在一些實施例申，抗LrP6抗體藉由抑制 Wnt拮抗劑（諸如DKK同功異型物及s〇ST)之結合增強Wnt 信號傳導。抗LRP6抗體可用於選擇性調節由Wnt同功異型物誘導之信號傳導活化或抑制的過程。該等過程包括例如細胞增 • 殖、細胞命運特化及不同癌症類型中之幹細胞自更新，及發月過私。抗LRP6適用於例如治療Wnt介導之病症，諸如癌症及骨或骨路系統病症以及血管病症。可使用抗LRp6 抗體治療之癌症的實例包括小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肝細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌（包括腎細胞癌）、肝癌、前列腺癌。可使用抗LRP6抗體治療之骨骼或骨病症之實例包括骨礦 • f疏鬆症、骨關節炎、骨折及骨損害。可使用抗LRP6抗體治療之血管病症之實例包括視網膜血管病，諸如諾里病 (Nome disease)、骨礦質疏鬆症·假神經膠質瘤症候群 (OPPG)、豕族性滲出性玻璃體視網膜病變（fevr) '早產兒視網膜病變（講）、糖尿病性視網膜病變、年齡相關之黃斑變性、早產兒視網膜病變、科茨病（c〇ats,心咖）及科茨樣反應，及視網膜動脈或靜脈阻塞，及讀相關病況’諸如心肌梗塞及缺血性心臟病。相應地，本發明之一態樣提供一種結合於LRp6之抗 154875.doc •25· 201138823 體，其中該抗體抑制由一種Wnt同功異型物誘導之信號傳導且增強由另一 Wnt同功異型物誘導之信號傳導。在一實施例中，抗體抑制Wnt3及/或Wnt3a之信號傳導。在一實施例中，抗體增強 Wnt 1、2、2b、4、6、7a、7b ' 8a、9a、 9b、10a及/或10b之信號傳導。在一實施例中，抗體抑制 Wnt3及/或Wnt3a之信號傳導且增強Wnt 1、2、2b、4、6、 7a、7b、8a、9a、9b、10a及/或10b之信號傳導。在一實施例中’抗體抑制Wnt3及/或Wnt3a之信號傳導且增強Wnt 1、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、10a及 l〇b之信號傳導。在一實施例中，抗LRP6抗體結合於LRP6之E3-E4區 (第一及第二β-螺旋槳結構）。在另一實施例中，抗體抑制Wnt 1、2、2b、6、8a、 9a、9b及/或1 Ob之信號傳導。在一實施例中，抗體增強 Wnt3及/或Wnt3a之信號傳導。在一實施例中，抗體抑制 Wnt 1、2、2b、6、8a、9a、9b及/或10b之信號傳導且增強 Wnt3及/或Wnt3a之信號傳導。在一實施例中，抗體抑制 Wnt 1、2、2b、6、8a、9a、9b及/或1 Ob之信號傳導且增強 Wnt3及/或Wnt3a之信號傳導。在一實施例中，抗LRP6抗體結合於LRP6之E1-E2區（第三及第四β-螺旋槳結構）。在一實施例中，抗LRP6抗體為能夠結合LRP6之兩個或兩個以上不同區或抗原決定基之多特異性抗體。在一實施例中，多特異性抗體為能夠特異性結合於LRP6之兩個不同區的雙特異性抗體。在一實施例中，雙特異性抗體結合於LRP6之ΕΙ-Ε2區且結合於LRP6之Ε3-Ε4區。在一實施例 -26- 154875.doc 201138823 中，多特異性抗體抑制由選自由Wnt3&Wnt3a組成之群的 Wnt同功異型物誘導之信號傳導且抑制由選自由界加工、 2、2b、6、8a、9a、9b及l〇b組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導《在一實施例中，多特異性抗體抑制由選自由Wnt3及Wnt3 a組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導且抑制由選自由Wnt 1、2、2b、6、8a、9a、9b及l〇b組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導，且進一步抑制由i«自由Wnt 4、7a' 7b及10a組成之群的wnt同功異型物誘導之信號傳導。在一實施例中，多特異性抗體抑制由 Wntl與Wnt3a之組合誘導之Wnt信號傳導。在一實施例中’多特異性抗體抑制自分泌Wnt信號傳導。在某些實施例中’多特異性抗體為抑制由選自由Wnt3及 Wnt3a組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導且抑制由選自由Wnt 1、2、2b、6、8a、9a、9b及10b組成之群的 Wnt同功異型物誘導之信號傳導的雙特異性抗體。在某些實施例中’多特異性抗體為抑制由選自由Wnt3及Wnt3a組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導且抑制由選自由 Wnt 1、2、2b、6、8a、9a、9b 及 l〇b組成之群的 Wnt 同功異型物誘導之信號傳導，且進一步抑制由選自由Wnt 4、 7a、7b及10a組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導的雙特異性抗體。在某些實施例中，多特異性抗體為抑制由 Wntl與Wnt3a之組合誘導之信號傳導的雙特異性抗體。在一實施例中，多特異性抗體為對由Wntl與Wnt3a之組合誘導之信號傳導的抑制比具有與雙特異性抗體相同特異性之 154875.doc -27· 201138823 單特異性抗體之組合更有效的雙特異性抗體。在某些實施例中，多特異性抗體為對自分泌Wnt信號傳導的抑制比具有與雙特異性抗體相同特異性之單特異性抗體之組合更有效的雙特異性抗體。在某些實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體抑制Wnt信號傳導達到至少約10%、20°/。、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%或90%以上。可使用此項技術中已知且如本文所述之檢測法測定對Wnt信號傳導之抑制。舉例而言，可使用Wnt報導體檢測法（諸如實例中所述之Wnt螢光素酶報導體檢測法）測定對Wnt信號傳導之抑制。亦可藉由如實例中所述監測Wnt靶基因（諸如APCDD1、 AXIN2、GAD1、LEFTY2及 SAX1)之表現，測定對 Wnt信號傳導之抑制^ 在某些實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體抑制 Wnt靶基因（諸如 APCDD1、AXIN2、GAD1、LEFTY2 及SAX1)之表現達到至少約10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80°/〇、90%。在一實施例中，使用基因表現檢測法（諸如PCR，包括qPCR)測定Wnt靶基因之表現。本發明之另一態樣提供結合於LRP6且與本文所述之任一抗LRP6抗體競爭結合之抗體。本發明之另一態樣提供與本文所述之任一抗LRP6抗體結合於LRP6上之相同抗原決定基的抗體。 154875.doc -28- 201138823 Α·例示性抗LRP6抗體本發明之一態樣提供抗LRP6抗體，其為單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在一實施例中，使用噬菌體集合庫產生抗LRP6抗體。在一實施例中，抗LRP6抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab，、scFv、雙功能抗體或 F(ab’）2片段。在另一實施例中，抗體為全長抗體，例如完整IgGl抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。 φ 在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有表2之胺基酸序列的重鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有表2之胺基酸序列的輕鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有表2之胺基酸序列的重鏈序列及輕鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1的重鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 2的輕鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1的重鏈序列 # 及具有胺基酸序列SEQ ID NO·· 2的輕鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 3的重鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4的輕鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 3的重鏈序列及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 4的輕鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID ΝΟ·_ 5的重鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 6的輕鏈序列。在一實施例中， 154875.doc -29- 201138823 抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5的重鏈序列及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 6的輕鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 7的重鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 8的輕鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 7的重鏈序列及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 8的輕鏈序列。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自表3之胺基酸序列的重鏈可變域（VH)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自表3之胺基酸序列的輕鏈可變域（VL)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自表3之胺基酸序列的VH及VL。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 1之重鏈的重鏈可變域（VH)。在一實施例中，抗 LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 2之輕鏈序列的輕鏈可變域（VL)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 1之重鏈的VH及來自胺基酸序列 SEQ ID NO: 2之輕鏈序列的VL。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9的重鏈可變域（VH)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 10的輕鏈可變域（VL)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9的VH及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 10的VL。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 3之重鏈的重鏈可變域（VH)。在一實施例中，抗 154875.doc -30- 201138823 LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 3之輕鏈序列的輕鏈可變域（VL)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 3之重鏈的VH及來自胺基酸序列 SEQ ID NO: 4之輕鏈序列的VL。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 11的重鏈可變域（VH)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 12的輕鏈可變域 (VL)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 11的VH及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 12的 VL。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 5之重鏈的重鏈可變域（VH)。在一實施例中，抗 LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 6之輕鏈序列的輕鏈可變域（VL)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 5之重鏈的VH及來自胺基酸序列 SEQ ID NO: 6之輕鏈序列的VL。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 13的重鏈可變域（VH)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 14的輕鏈可變域 (VL)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 13的VH及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 14的 VL。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 7之重鏈的重鏈可變域（VH)。在一實施例中，抗 154875.doc -31 - 201138823 LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 8之輕鏈序列的輕鏈可變域（VL)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 7之重鏈的VH及來自胺基酸序列 SEQ ID NO: 8之輕鏈序列的VL。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 15的重鏈可變域（VH)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 16的輕鏈可變域 (VL)。在一實施例中，抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 15的VH及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 16的 VL。本發明之另一態樣提供一種多特異性抗LRP6抗體。在一實施例中，多特異性抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 7 中之至少一者的重鏈。在一實施例中，多特異性抗體包含具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 7中之至少兩者的重鏈。在一實施例中，多特異性抗體為包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 7 中之至少一者之重鏈的雙特異性抗體。在一實施例中，雙特異性抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1的重鏈及具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 7的重鏈。在一實施例中，雙特異性抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 3的重鏈及具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 7的重鏈。在一實施例中，雙特異性抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5的重鏈及具有胺基酸序列 154875.doc •32- 201138823 SEQ ID NO: 7的重鏈。在一實施例中，多特異性抗LRP6抗體包含來自胺基酸序列 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO·· 3、SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 7中之至少一者之重鏈的VH。在一實施例中，多特異性抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO·· 5或SEQ ID NO·· 7中之至少兩者之重鏈的 VH。在一實施例中，多特異性抗體為包含來自胺基酸序 φ 列 SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 7之重鏈的VH的雙特異性抗體。在一實施例中，雙特異性抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 1之重鏈的VH 且包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 7之重鏈的VH。在一實施例中，雙特異性抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 3之重鏈的VH且包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 7之重鏈的VH。在一實施例中，雙特異性抗體包含來自胺基酸序列SEQ ID NO: 5之重鏈的VH且包含來自胺基酸序列SEQ # ID NO: 7之重鏈的VH。在一實施例中，多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 15中之至少一者的VH。在一實施例中，多特異性抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 15 中之至少兩者的 VH。在一實施例中，多特異性抗體為包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO· 13 或 SEQ ID NCh 15之VH的雙特異性抗體。在一實施例中，雙特異性抗體 154875.doc •33· 201138823 包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9的VH及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 1 5的VH。在一實施例中，雙特異性抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 11的VH及具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 15的VH。在一實施例中，雙特異性抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 5的VH及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 15 的 VH。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR : (a)來自表4之 HVR-H1胺基酸序列的HVR-H1 ; (b)來自表4之HVR-H2胺基酸序列的HVR-H2 ; (c)來自表4之HVR-H3胺基酸序列的 HVR-H3 ; (d)來自表4之HVR-L 1胺基酸序列的HVR-L 1 ; (e) 來自表4之HVR-L1胺基酸序列的HVR-L2 〇 HVR-L2 ;及 (f) 來自表4之HVR-L3胺基酸序列的HVR-L3 HVR-L1。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR : (a) SEQ ID NO: 1 之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 1 之重鏈的11¥11-H2 ; (c) SEQ ID NO: 1之重鏈的 HVR-H3 ; (d) SEQ ID NO: 2 之輕鏈的 HVR-L1 ; (e) SEQ ID NO: 2 之輕鏈的 HVR-L2 ; 及（f)SEQ ID NO: 2之輕鏈的 HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 1 之重鏈的HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 1 之重鏈的HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H3。在一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H3。在另一實施例中， 154875.doc • 34· 201138823 抗體包含SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H3及SEQ ID NO: 2 之重鏈的HVR-L3。在另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 1 之重鏈的 HVR-H3、SEQ ID NO: 2 之輕鏈的 HVR-L3 及SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H2。在另一實施例中，抗體包含（a) SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H2 ;及（c) SEQ ID NO: 1之重鏈的 HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 19之 HVR-H3。在一實施例中，抗體包含具有胺基酸序歹ij SEQ ID NO: 19之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 19的HVR-H3及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 27的HVR-L3。在另一實施例中，抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 19之HVR-H3、具有胺基酸序列SEQ ID NO: 27之HVR-L3、及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 18之 HVR-H2。在另一實施例中，抗體包含（a)具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 17 之 HVR-H1 ; (b)具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ;及（c)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 19之 HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列：（a) SEQ ID NO: 2 之輕鏈的 HVR-L1 ; (b) SEQ ID NO: 2之輕鏈的 HVR-L2 ; 154875.doc •35- 201138823 及（c) SEQ ID NO: 2之輕鏈的HVR-L3。在一實施例中，抗體包含（a) SEQ ID NO: 2之輕鏈的 HVR-L1 ; (b) SEQ ID NO: 2之輕鏈的HVR-L2 ;及（c) SEQ ID NO: 2之輕鏈的 HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含（a)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列的VH結構域： (i)SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H1，（ii)SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H2，及（iii)SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H3 ;及 (b)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列的VL結構域：（i)SEQ ID NO: 2之輕鏈的1^¥11-Ll，（ii)SEQ ID NO: 2之輕鏈的 HVR-L2，及（c) SEQ ID NO: 2之輕鏈的HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含（a)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR的VH結構域：（i)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-H1，（ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2，及（iii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 19之HVR-H3 ;及（b)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR的VL結構域：（i)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之HVR-L1，（ii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26之HVR-L2，及（c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 27之HVR-L3。

在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：（a) SEQ ID NO: 1 之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 1 之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H3 ; (d) SEQ ID 154875.doc -36- 201138823 NO: 2 之輕鏈的 HVR-Ll ; (e) SEQ ID NO: 2 之輕鏈的 HVR-L2 ;及（f)SEQ ID NO: 2之輕鏈的 HVR-L3。在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 1 8 之 HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 19之HVR-H3 ; (d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之 HVR-L1 ; (e)包含胺基酸序歹 iJSEQ ID NO: 26 之 HVR-L2 ; 及（f)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 27之HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR ·· (a) SEQ ID NO: 3 之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 3 之重鏈的11¥11-H2 ; (c) SEQ ID NO: 3之重鏈的 HVR-H3 ; (d) SEQ ID NO: 4之輕鏈的 HVR-L1 ; (e) SEQ ID NO: 4之輕鏈的 HVR-L2 ; 及（f)SEQ ID NO: 4之輕鏈的 HVR-L3。

在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 3 之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 3 之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 3之重鏈的HVR-H3。在一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 3之重鏈的HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 3之重鏈的HVR-H3及SEQ ID NO: 4 之重鏈的HVR-L3。在另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 3 之重鏈的 HVR-H3、SEQ ID NO: 4 之輕鏈的 HVR-L3 及SEQ ID NO: 3之重鏈的HVR-H2。在另一實施例中，抗體包含（a) SEQ ID NO: 3之重鏈的HVR-H1 ; (b) SEQ ID 154875.doc ·37· 201138823 NO: 3之重鏈的HVR-H2 ;及（c) SEQ ID NO: 3之重鏈的 HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序歹iJSEQ ID NO: 17之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 21之 HVR-H3。在一實施例中，抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 21之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 21之重鏈的HVR-H3及包含胺基酸序列SEQ ID NO: 28 之HVR-L3。在另一實施例中，抗體包含具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 21 之 HVR-H3、具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 28之HVR-L3、及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2。在另一實施例中，抗體包含（a)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 17 之 HVR-H1 ; (b)具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 18 之HVR-H2 ;及（c)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 21之HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列：（a) SEQ ID NO: 4 之輕鏈的 HVR-L1 ; (b) SEQ ID NO: 4 之輕鏈的 HVR-L2 ; 及（c) SEQ ID NO: 4之輕鏈的HVR-L3。在一實施例中，抗體包含（a) SEQ ID NO: 4之輕鏈的 HVR-L1 ; (b) SEQ ID NO: 4之輕鏈的HVR-L2 ;及（c) SEQ ID NO: 4之輕鏈的 HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一 154875.doc -38- 201138823 個、至少兩個或所有三個VL HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之HVR-L1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 26之HVR-L2 ;及（c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 28之 HVR-L3。在一實施例中，抗體包含（a)具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 25 之 HVR-L1 ; (b)具有胺基酸序列 SEQ ID NO·· 26之HVR-L2 ;及（c)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 28之 HVR-L3。 φ 在一實施例中，抗LRP6抗體包含（a)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列的VH結構域： (i)SEQ ID NO: 3 之重鏈的 HVR-H1，（ii)SEQ ID NO: 3 之重鏈的 HVR-H2，及（iii)SEQ ID NO: 3之重鏈的HVR-H3 ;及 (b)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列的VL結構域：（i)SEQ ID NO: 4之輕鏈的11¥11-Ll，（ii)SEQ ID NO: 4之輕鏈的 HVR-L2，及（c) SEQ ID NO: 4之輕鏈的HVR-L3。 # 在一實施例中，抗LRP6抗體包含（a)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR的VH結構域：（i)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-H1，（ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2，及（iii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO·· 21之HVR-H3 ;及（b)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR的VL結構域：（i)包含胺基酸序列SEQ ID NO·· 25之HVR-L1，（ii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26之HVR-L2，及（c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 28之HVR-L3。 154875.doc -39· 201138823 在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：（a) SEQ ID NO: 3之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 3之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 3之重鏈的 HVR-H3 ; (d) SEQ ID NO: 4 之輕鏈的 HVR-L1 ; (e) SEQ ID NO: 4 之輕鏈的 HVR-L2 ;及（f)SEQ ID NO: 4之輕鏈的 HVR-L3。在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 18之 HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 21之HVR-H3 ; (d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之 HVR-L1 ; (e)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26 之 HVR-L2 ; 及（f)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 28之HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR : (a) SEQ ID NO: 5 之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 5 之重鏈的11¥11-H2 ; (c) SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H3 ; (d) SEQ ID NO: 6 之輕鏈的 HVR-L1 ; (e) SEQ ID NO: 6 之輕鏈的 HVR-L2 ; 及（f)SEQ ID NO: 6之輕鏈的 HVR-L3。

在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 5 之重鏈的HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H3。在一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H3及SEQ ID NO: 6 之重鏈的HVR-L3。在另一實施例中，抗體包含SEQ ID 154875.doc ·40· 201138823 NO: 5 之重鏈的 HVR-H3、SEQ ID NO: 6 之輕鏈的 HVR-L3 及SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H2。在另一實施例中，抗體包含（a) SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H2 ;及（c) SEQ ID NO: 5之重鏈的 HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 20之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 19之 HVR-H3。在一實施例中，抗體包含具有胺基酸序歹，J SEQ ID NO: 19之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 19的HVR-H3及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 27的HVR-L3。在另一實施例中，抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 19之HVR-H3、具有胺基酸序列SEQ ID NO: 27之HVR-L3、及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 18之 HVR-H2。在另一實施例中，抗體包含（a)具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 20之 HVR-H1 ; (b)具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ;及（c)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 19之 HVR-H3。

在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列：（a) SEQ ID NO: 6 之輕鏈的 HVR-L1 ; (b) SEQ ID NO: 6之輕鏈的 HVR-L2 ; 及（c) SEQ ID NO: 6之輕鏈的HVR-L3。在一實施例中，抗體包含（a) SEQ ID NO: 6 之輕鏈的 HVR-L1 ; (b) SEQ ID 154875.doc -41- 201138823 NO: 6之輕鏈的HVR-L2 ;及（c) SEQ ID NO: 6之輕鏈的 HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含（a)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列的VH結構域： (i)SEQ ID NO: 5 之重鏈的 HVR-H1，（ii)SEQ ID NO: 5 之重鏈的 HVR-H2，及（iii)SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H3 ;及 (b)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列的VL結構域：（i)SEQ ID NO: 6之輕鏈的^1¥11-Ll，（ii)SEQ ID NO: 6之輕鏈的 HVR-L2，及（c) SEQ ID NO: 6之輕鏈的HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含（a)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR的VH結構域：（i)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 20之HVR-H1，（ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2，及（iii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 1 9之HVR-H3 ;及（b)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR的VL結構域：（i)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之HVR-L1，（ii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26之HVR-L2，及（c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 27之HVR-L3。在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：（a) SEQ ID NO: 5之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 5之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 5之重鏈的 HVR-H3 ; (d) SEQ ID NO: 6 之輕鏈的 HVR-L1 ; (e) SEQ ID NO: 6 之輕鏈的 HVR-L2 ;及（f)SEQ ID NO: 6之輕鏈的 HVR-L3。 154875.doc -42- 201138823 在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 20之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 18 之 HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 19之HVR-H3 ; (d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之 HVR-L1 ; (e)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26 之 HVR-L2 ; 及（f)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 27之HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個HVR : (a) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 7之重鏈的11¥11-H2 ; (c) SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H3 ; (d) SEQ ID NO: 8 之輕鏈的 HVR-L1 ; (e) SEQ ID NO: 8 之輕鏈的 HVR-L2 ; 及（f)SEQ ID NO: 8之輕鏈的 HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 7 之重鏈的HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H3。在一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H3及SEQ ID NO: 8 之重鏈的HVR-L3。在另一實施例中，抗體包含SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H3、SEQ ID NO: 8之輕鏈的 HVR-L3 及SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H2。在另一實施例中，抗體包含（a) SEQ ID NO: 7 之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H2 ;及（c) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H3。 154875.doc 43- 201138823 在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 24之 HVR-H3。在一實施例中，抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 24之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 24的HVR-H3及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 27的HVR-L3。在另一實施例中，抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 24之HVR-H3、具有胺基酸序列SEQ ID NO: 27之HVR-L3、及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 23之 HVR-H2。在另一實施例中，抗體包含（a)具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 22之 HVR-H1 ; (b)具有胺基酸序列 SEQ ID NO: 23之HVR-H2 〇 ;及（c)具有胺基酸序列SEQ ID NO: 24 之 HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列：（a) SEQ ID NO: 8 之輕鏈的 HVR-L1 ; (b) SEQ ID NO: 8 之輕鏈的 HVR-L2 ; 及（c) SEQ ID NO: 8之輕鏈的HVR-L3。在一實施例中，抗體包含（a) SEQ ID NO: 8之輕鏈的 HVR-L1 ; (b) SEQ ID NO: 8之輕鏈的HVR-L2 ;及（c) SEQ ID NO: 8之輕鏈的 HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含（a)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列的VH結構域： (i)SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H1，（ii)SEQ ID NO: 7之重 154875.doc -44- 201138823 ο 鍵的HVR-H2 ’ 及（iii)SEQ ID NO: 7之重键的HVR-H3 ;及 (b)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列的VL結構域：（i)SEQ ID NO: 8之輕鏈的1^11-Ll，（ii)SEQ ID NO: 8之輕鏈的 HVR-L2，及（c) SEQ ID NO: 8之輕鏈的HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體包含（a)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR的VH結構域：（i)包 φ 含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1，（ii)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23之HVR-H2，及（iii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 24之HVR-H3 ;及（b)包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR的VL結構域：（i)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之HVR-L1，（ii)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26之HVR-L2，及（c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 27之HVR-L3。在另一實施例中，本發明提供包含以下之抗體：（a) # SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H3 ; (d) SEQ ID NO: 8之輕鏈的 HVR-L1 ; (e) SEQ ID NO: 8之輕鏈的 HVR-L2 ;及（f)SEQ ID NO: 8之輕鏈的 HVR-L3。在另一實施例中，本發明提供包含以下之抗體：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 23 之 HVR-H2; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 24之HVR-H3 ; (d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之 HVR-L1 ; (e)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26 之 HVR-L2 ; 154875.doc • 45- 201138823 及（f)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 27之HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 1之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 1之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 1之重鏈的 HVR-H3，且包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個 VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 19之HVR-H3，且包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23 之 HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 24 之 HVR-H3。

在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含來自以下的所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 1 之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 1 之重鏈的11¥11-H2 ; (c) SEQ ID NO: 1之重鏈的HVR-H3，且包含來自以下的所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID 154875.doc -46- 201138823 NO: 7之重鏈的HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含來自以下的所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 19 之HVR-H3，且包含來自以下的所有三個VH HVR序歹，J : (a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 24之HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 3之重鏈的HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 3之重鏈的HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 3之重鏈的 HVR-H3，且包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個 VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H3。

在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 21之HVR-H3，且包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ 154875.doc -47· 201138823 ID NO: 23 之 HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 24 之 HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含來自以下的所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 3之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 3之重鏈的1^¥11-H2 ; (c) SEQ ID NO: 3之重鏈的HVR-H3，且包含來自以下的所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 7之重鍵的HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含來自以下的所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18 之 HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 21 之HVR-H3，且包含來自以下的所有三個VH HVR序列： (a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 24之HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 5之重鍵的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 5之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 5之重鏈的 HVR-H3，且包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個 VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 7之重鏈的 HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 7之 154875.doc • 48· 201138823 重鍵的HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 20之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 19之HVR-H3，且包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基 φ 酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO·· 23 之 HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO·· 24 之 HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含來自以下的所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO: 5之重鏈的11¥11-H2 ; (c) SEQ ID NO: 5之重鏈的HVR-H3，且包含來自以下的所有三個VH HVR序列：（a) SEQ ID NO: 7之重鏈的 # HVR-H1 ; (b) SEQ ID NO·· 7之重鏈的 HVR-H2 ; (c) SEQ ID NO: 7之重鏈的HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體為多特異性抗LRP6抗體，其包含來自以下的所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 20之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18 之 HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO·· 19 之HVR-H3，且包含來自以下的所有三個VH HVR序列： (a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 154875.doc • 49- 201138823 SEQ ID NO: 24之HVR-H3。在多特異性抗LRP6抗體之任一上述實施例中，抗體另外包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列：（a) SEQ ID NO: 2之輕鏈的 HVR-L1 ; (b) SEQ ID NO: 2 之輕鏈的 HVR-L2 ;及（c) SEQ ID NO: 2 或 SEQ ID NO: 4之輕鏈的HVR-L3。在一實施例中，抗體包含（a) SEQ ID NO: 2之輕鏈的 HVR-L1 ; (b) SEQ ID NO: 2之輕鏈的 HVR-L2 ;及（c) SEQ ID NO: 2之輕鏈的 HVR-L3。在一實施例中，抗體包含（a) SEQ ID NO: 2之輕鏈的HVR-L1 ; (b) SEQ ID NO: 2 之輕鏈的 HVR-L2 ;及（c) SEQ ID NO: 4 之輕鏈的 HVR-L3。在多特異性抗LRP6抗體之任一上述實施例中，抗體另外包含選自以下的至少一個、至少兩個或所有三個VL HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之HVR-L1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 26之HVR-L2 ;及（c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 27 或 SEQ ID NO: 28 之 HVR-L3。在一實施例中，抗體包含（a)包含胺基酸SEQ ID NO: 25之 HVR-L1 ; (b)包含胺基酸 SEQ ID NO: 26 之 HVR-L2 ;及（c) 包含胺基酸SEQ ID NO: 27之HVR-L3。在一實施例中，抗體包含（a)包含胺基酸SEQ ID NO: 25之HVR-L1 ; (b)包含胺基酸SEQ ID NO: 26之HVR-L2 ;及（c)包含胺基酸SEQ ID NO: 28之HVR-L3。在一實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列N Xi X2 K (SEQ ID NO: 41)之HVR- 154875.doc -50- 201138823 H3。在一實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列N X! X2 KN (SEQ ID NO: 42)之HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列N XJK (SEQ ID NO: 43)之HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列NXJK (SEQ ID NO: 44)之HVR-H3 » 在一實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列NX!VKN (SEQ ID NO: 45)之HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列NX丨IKN (SEQ ID NO: 46)之HVR-H3。在上述實施例中，X!為胺基酸且X2為I或V;或又1為入、8、尸、 T、Y或L且X2為I或V;或X丨為A、S、F、T、Y或L且X2為 I;或X丨為A、S、F、T、Y或L且X2為V。在一實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列NAVK (SEQ ID NO: 47)之HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列NAIK (SEQ ID NO: 48)之HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列 NAVKN (SEQ ID NO: 49)之 HVR-H3。在一實施例中，抗LRP6抗體或多特異性抗LRP6抗體包含具有胺基酸序列 NAIKN (SEQ ID NO: 50)之HVR-H3。在任一上述實施例中，抗LRP6抗體經人類化。在一實施例中，抗LRP6抗體包含如任一上述實施例之HVR，且另外包含接受體人類構架，例如人類免疫球蛋白構架或人 154875.doc •51· 201138823 類共同構架。

在另一態樣中’抗LRP6抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 7之

重键的 VH具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95〇/o、 96%、97%、98°/。、99%或100%序列一致性的重键可變域 (VH)序列。在另一態樣中’抗LRP6抗體包含與胺基酸序歹|J SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 15具有至少 90%、91%、92%、93%、94¼、95¼、 96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重键可變域 (VH)序列。在某些實施例中，具有至少90°/。、91 %、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%一致性的 VH序列相對於參考序列含有取代（例如保守取代）、插入或缺失，但包含彼序列之抗LRP6抗體保留與LRP6結合之能力。在某些實施例中’ SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、

SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 7 或 SEQ ID NO: 9、SEQ ID

NO: 11、SEQ ID NO: 13或 SEQ ID NO: 15之 VH中已取代、插入及/或缺失總共1至10個胺基酸。L

在另一態樣中’抗LRP6抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID N〇: 5 或 SEQ ID NO: 7具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96¼、97%、 98%、99%或100%序列一致性的重鏈序列。在某些實施例中，具有至少 90〇/〇、910/〇、92%、93%、94〇/〇、95〇/〇、 96%、97%、98%或99%—致性的重鏈序列相對於參考序列含有取代（例如保守取代）、插入或缺失，但包含彼序列之 154875.doc • 52- 201138823 抗LRP6抗體保留與LRP6結合之能力。在某些實施例中， SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 7中已取代、插入及/或缺失總共1至1 0個胺基酸。在某些實施例中，取代、插入或缺失出現於HVR之外的區（亦即FR中）。視情況而言，抗LRP6抗體包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO·· 5 或 SEQ ID NO·· 7 之重鏈及/或重鏈的VH，包括彼序列之轉譯後修飾。

在另一態樣中，提供抗LRP6抗體，其中該抗體包含與胺基酸序列 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6 或SEQ ID NO: 8之輕鏈的VL具有至少90%、91%、92%、 93%、94% ' 95%、96%、97%、98%、99% 或 100%序歹'j 一致性的輕鏈可變域（VL)。在另一態樣中，提供抗LRP6抗體，其中該抗體包含與胺基酸序列SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12 ' SEQ ID NO: 14 或 SEQ ID NO: 16 具有至少 90% ' 91%、92%、93%、94%、95%、96% ' 97%、98% ' 99%或100%序列一致性的輕鏈可變域（VL)。在某些實施例中，具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99% —致性的VL序列相對於參考序列含有取代（例如保守取代）、插入或缺失，但包含彼序列之抗LRP6抗體保留與LRP6結合之能力。在某些實施例中， SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6或 SEQ ID NO: 8 或 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14 或SEQ ID NO: 16之VL中已取代、插入及/或缺失總共1至 10個胺基酸。 154B75.doc -53- 201138823 在另一態樣中，提供抗LRP6抗體，其中該抗體包含與胺基酸序列 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6 或 SEQ ID NO: 8具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或 100%序列一致性的輕鏈。在某些實施例中，具有至少90%、91%、92°/〇、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%—致性的輕鏈序列相對於參考序列含有取代（例如保守取代）、插入或缺失，但包含彼序列之抗LRP6抗體保留與LRP6結合之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6或SEQ ID NO: 8中已取代、插入及/或缺失總共1至10個胺基酸。在某些實施例中，取代、插入或缺失出現於HVR之外的區（亦即FR中）。視情況而言，抗LRP6抗體包含SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 6 或 SEQ ID NO: 8之輕鏈及/或VL序列，包括彼序列之轉譯後修飾。在另一態樣中，提供抗LRP6抗體，其中該抗體包含如上文提供之任一實施例中之VH及如上文提供之任一實施例中之VL。在另一態樣中，本發明提供與本文提供之抗LRP6抗體結合於同一抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與選自包含以下之抗LRP6抗體的抗LRP6抗體結合於同一抗原決定基之抗體：序列SEQ ID NO: 9之VH及序列SEQIDNO:10之VL、或序列SEQIDNO:11之VH及序列SEQIDNO:12之VL、或序列SEQIDNO:13之VH及序列 154875.doc -54- 201138823 SEQ ID NO:14 之 VL、或序列 SEQ ID NO: 15 之 VH 及序列 SEQ ID NO: 16之VL。在某些實施例中，提供結合於LRP6 片段内之抗原決定基的抗體。在一實施例中，抗LRP6抗體結合於LRP6之E3-E4區的至少一部分。在一實施例中，抗LRP6抗體結合於LRP6之E1-E2區的至少一部分。

在一實施例中，抗LRP6抗體結合於包括LRP6之胺基酸 R28 ' E51 、 D52 、 V70 、 S71 、 E73 、 L95 、 S96 、 D98 、 E115、R141及N185的構形抗原決定基。因此，在一實施例中，抗LRP6抗體與LRP6之Ε1 β螺旋槳結構的胺基酸殘基R28 、 Ε51 、 D52 、 V70 、 S71 、 Ε73 、 L95 、 S96 、 D98 、 Ε115、R141及Ν185中之至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個、至少十個、至少十一個或全部相互作用。在另一實施例中，抗LRP6抗體另外與LRP6殘基R29、 W188、Κ202、Ρ225、Η226、S243 及 F266相互作用。在另一態樣中，任一上述實施例之抗LRP6抗體可單獨或組合併入下文第1 - 7部分所述之任何特徵： 1.抗體親和力在某些實施例中，本文提供之抗體的解離常數（Kd)為$1 μΜ ' <100 ηΜ ' <10 ηΜ ' <1 ηΜ ' <0.1 ηΜ ' <0.01 ηΜ或 <0.001 ηΜ(例如 ΙΟ·8 Μ或 ΙΟ·8 Μ以下，例如 1 Ο·8 Μ至 1 Ο·13 Μ，例如 ΙΟ·9 Μ至 10·13 Μ)。在一實施例中，藉由使用如以下檢測法中所述的所關注抗體之Fab型式及其抗原進行的放射性標記之抗原結合檢 154875.doc -55- 201138823 測法（RIA)量測Kd。藉由在未標記抗原之滴定系列存在下以最小濃度之（1251)標記之抗原平衡Fab，接著以抗Fab抗體塗覆之板捕捉結合之抗原來量測Fab針對抗原之溶液結合親和力（參看例如Chen等人，乂从〇/.价〇/.293:865-881(1999))。為了形成檢測條件，以含5 gg/ml捕捉抗Fab 抗體（Cappel Labs)之50 mM碳酸納（pH 9.6)塗覆 MICROTITER®多孔板（Thermo Scientific)隔夜，且隨後在室溫（約23°C )下以含2 w/v%牛血清白蛋白之PBS阻斷2至5 籲小時。在無吸附劑之板（Nunc #269620)中，將100 pM或26 pM [1251]-抗原與所關注Fab之連續稀釋液混合（例如與 Presta等人，Caweriie·?. 57:4593-4599 (1997)中之抗 VEGF 抗體、Fab-12之評定一致）。接著培育所關注Fab隔夜；然而，可長時間（例如約65小時）繼續培育以確保達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉板以供在室溫下培育（例如1小時）。接著移除溶液且板以含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-2〇®)之PBS洗滌8次。當板乾燥時，每孔添加15〇 μΐ閃爍籲體（MICROSCINT-20tm; Packard)，且在 TOPCOUNTtm gamma計數器（Packard)上對板計數10分鐘。選擇產生小於或等於20%最大結合之各Fab濃度用於競爭性結合檢測法。根據另一實施例，在25°C下使用表面電漿子共振檢測法使用 BIACORE®-2000 或 BIACORE®-3000(BIAcore， Inc., Piscataway, NJ)以約10個反應單位（RU)之固定抗原CM5晶片量測Kd »簡言之，根據供應商說明以iV-乙基-ΛΓ-(3-二曱 154875.doc -56- 201138823 基胺基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（edc)及羥基丁二醯亞胺（NHS)活化羧曱基化聚葡萄糖生物感測器晶片（CM5, BIACORE，Inc.)。抗原以1〇 mM乙酸鈉，pH 4.8稀釋至5 pg/ml(約0.2 μΜ)’隨後在5 μ1/πιίη之流動速率下注射以實現偶聯蛋白之約10個反應單位（RU)。注射抗原後，注射1 Μ乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25 °C 下’在約25 μΐ/min之流動速率下，將Fab之兩倍連續稀釋液（0.78 nM 至 500 ιιΜ)與 0.05%聚山梨醇酯 20(TWEEN-20tm) 界面活性劑（PBST)—起注射至PBS中。使用簡易一對一朗谬爾結合模型（simple one-to-one Langmuir binding model ’ BIACORE ® Evaluation軟體第3.2版）藉由同時擬合締合及解離感測器圖譜計算締合速率（kon)及解離速率 (koff)。根據比率計算平衡解離常數（Kd)。參看例如 Chen等人，·/· Μο/· 293:865-881 (1999)。若藉由上文之表面電漿子共振檢測法測得締合速率超過106 M·1 s·1，則可藉由使用在25°C之含20 ηΜ抗-抗原抗體（Fab形式）之 PBS，pH 7.2中量測螢光發射強度（激發=295 nm ;發射 =3 40 nm，16 nm帶通）之增加或降低的螢光淬滅技術，在如光譜儀（諸如具有攪拌式光析管之間歇流體光譜儀（stop-flow equipped spectrophometer，Aviv. Instruments)或 8000 系列 SLM-AMINCO TM光譜儀（ThermoSpectronic))中所量測增加濃度之抗原存在下測定締合速率。 2.抗體片段在某些實施例中，本文提供之抗體為抗體片段。抗體片 154875.doc •57· 201138823 段包括（但不限於）Fab、Fab1、Fab’-SH、F(ab')2、Fv及 scFv 片段，及下文所述之其他片段。某些抗體片段之評論參看 Hudson等人，TVai. Med. 9:129-134 (2003)。scFv片段之評論參看例如 Pluckthiin，The Pharmacology of Monoclonal dwiAoAes，第 113 卷，Rosenburg 及 Moore 編，（8卩141^61*-Verlag, New York),第 269-315 頁（1994);亦參看 WO 93/16185 ;及美國專利第5,571，894號及第5,587,458號。包含救助受體結合抗原決定基殘基且活體内半衰期增加之 Fab及F(ab')2片段的論述參看美國專利第5,869,046號。雙功能抗體為具有可為二價或雙特異性之兩個抗原結合位點之抗體片段。參看例如EP 404,097 ; WO 1993/01161 ; Hudson等人，TVai. Met/· 9:129-134 (2003);及 Hollinger等人，Proc. 90: 6444-6448 (1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，iVai. Med 9:129-134 (2003)中。單結構域抗體為包含抗體之所有或部分重鏈可變域或所有或部分輕鏈可變域之抗體片段。在某些實施例中，單結構域抗體為人類單結構域抗體（Domantis，Inc.，Waltham, ΜΑ;參看例如美國專利第6,248,516 81號）。抗體片段可藉由多種技術製備，包括（但不限於）如本文所述之完整抗體之蛋白水解消化以及藉由重組宿主細胞 (例如大腸桿菌或噬菌體）產生。 3.嵌合及人類化抗體在某些實施例中，本文提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌 154875.doc -58 - 201138823 合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等 k，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8 1:685 1-6855 (1 984)中。在一實例中，嵌合抗體包含非人類可變區（例如源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類（諸如猴）之可變區）及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別切換」抗體’其中類別或子類已自親本抗體發生變化。嵌合抗體包括其抗原結合片段。在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，非人類抗體經人類化以降低對人類之免疫原性，同時保持對親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含HVR(例如CDR)(或其部分）源自非人類抗體且fr(或其部分）源自人類抗體序列之一或多個可變域。人類化抗體視情況亦將包含人類怪定區的至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體（例如產生HVR殘基之抗體）之相應殘基取代，例如以恢復或提尚抗體特異性或親和力。人類化抗體及其製備方法評論於例如Almagro及

Fransson’Frowi. 5沁13:1619-1633 (2008)中，且進一步描述於例如 Riechmann等人，iVaiwre 332:323-329 (1988); Queen等人，Proc. «SW. 86:10029-10033 (1989);美國專利第5,821，337號、第7,527,791號、第 6,982,321 號及第 7,087,409 號；Kashmiri 等人， 36:25-34 (2005)(描述 SDR(a-CDR)移植）；Padlan，Μο/· Jmmwm?/. 28:489-498 (1991)(描述「表面重修」）；Dall'Acqua 154875.doc -59- 201138823 等人，Mei/zoA 36:43-60 (2005)(描述「FR 改組」）；及 Osbourn等人，Mei/zo心 36:61-68 (2005)及 Klimka等人，价· 乂 83:252-260 (2000)(描述「導向選擇」，近似於 FR改組）中。可用於人類化之人類構架區包括（但不限於）：使用「最佳擬合」法選擇之構架區（參看例如Sims等人，Τ'. 151:2296 (1993));源自輕鏈或重鏈可變區之特定子組之人類抗體之共同序列的構架區（參看例如Carter等人，iVoc· iVai/. Jcai >Scz·· tASd，89:4285 (1992);及 Presta 等人，·/. //nmwwo/·，151:2623 (1993));人類成熟（體細胞突變）構架區或人類生殖系構架區（參看例如Almagro及

Fransson，Frowi. 13:1619-1633 (2008));及源自篩選FR集合庫之構架區（參看例如Baca等人，乂价〇/ c/jem. 272:10678-10684 (1997)及 Rosok 等人，乂价〇/· C/zem. 271:2261 1-22618 (1996)) 〇 4·人類抗體在某些實施例中’本文提供之抗體為人類抗體。可使用此項技術中已知之多種技術產生人類抗體。人類抗體一般描述於 van Dijk及 van de Winkel，Cwrr. _P/zarmaco/· 5: 368-74 (2001)以及Lonberg，Cwrr. /mwwwo/· 20:450-459 (2008)中》可藉由向已經修飾以回應於抗原攻毒產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物投與免疫原來製備人類抗體。該等動物通常含有所有或部分人類免疫 154875.doc •60· 201138823 球蛋白基因座，該等基因座置換内源免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在該等轉瘦基因小鼠中’内源免疫球蛋白基因座一般經滅活。自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的評論參看Lonberg， Biotech. 23:1117_1125 (2005)。亦參看例如描述 XENOMOUSEtm技術的美國專利第6,075，181號及第 6，150,584號；描述HuMab®技術之美國專利第5,770,429

號；描述K-M MOUSE®技術之美國專利第7,〇41，870號；及描述VelociMouse®技術之美國專利申請公開案第 2007/0061900號）。來自由該等動物產生之完整抗體的人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合進一步修飾。亦可藉由基於融合瘤之方法製備人類抗體。已描述用於產生人類单株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞株。（參看例如 Kozbor */. , 133: 3001 (1984) ; Brodeur 等人 ’ Mcmoc/owa/ 办 /Vot/Mciz.OA? 第 51-63 頁（Marcel Dekker， Inc.，New York，1987);及 Boerner等人，*/· /mmwwo/.，147·· 86 (1991)。）經人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於 Li等人，iVoc. iVa". Jcai 5W. tASJ，103:3557-3562 (2006)中。其他方法包括例如美國專利第7,189,826號（描述自融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體）

MiawWxwe，26(4):265-268 (2006)(描述人類-人類融合瘤）中所述之彼等。人類融合瘤技術（Trioma技術）亦描述於 Vollmers 及 Brandlein， Histology and Histopathology, 154875.doc -61- 201138823 20(3):927-937 (2005)以及 Vollmers 及 Brandlein，Mei/ζσί/ί and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)中。亦可藉由分離選自源自人類之噬菌體呈現集合庫的Fv純系可變域序列產生人類抗體。該等可變域序列接著可與所要人類恆定域組合。下文描述自抗體集合庫選擇人類抗體之技術。 5.源自集合庫之抗體可藉由篩選組合集合庫中具有所要活性之抗體來分離本發明抗體。舉例而言，此項技術中已知多種用於產生噬菌體呈現集合庫及篩選該等集合庫中具有所要結合特徵之抗體的方法。該等方法於例如Hoogenboom等人，

Mo/ecw/ar 178:1-37 (O'Brien等人編，Human Press,

Totowa，NJ, 2001)中評論，且另外於例如McCafferty等 A > Nature 348:552-554 ； Clackson^ A » Nature 352: 624-628 (1991) ; Marks 等人，*/. Mo/· 222: 581-597 (1992) ; Marks及 Bradbury, Mcj/ecw/ar 248:161-175 (Lo 編，Human Press, Totowa，NJ，2003); Sidhu等人，Mo/·价〇/. 338(2): 299-310 (2004) ; Lee等人，《/· Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004) ； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)；及Lee等人，J. Jwwwwo/· Mei/zoc/·? 284(1-2): 1 19-132(2004) 中描述。在某些噬菌體呈現法中，VH及VL基因之譜系藉由聚合 154875.doc -62- 201138823 酶鏈反應（PCR)單獨選殖且在噬菌體集合庫中隨機重組，其接著可如 Winter等人，J鳳 12: 433-455 (1994)中所述篩選抗原結合噬菌體。噬菌體通常以單鏈 Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自經免疫來源之集合庫無需建構融合瘤即可提供對免疫原親和力高之抗體。或者，天然譜系可經選殖（例如自人類）以向多種非自體抗原及亦自體抗原提供單個來源，如Griffiths等人，乂 12: 725-734 (1993)所述。最後，如Hoogenboom 及Winter，·/· Μο/. 227: 381-388 (1992)所述，亦可藉由自幹細胞選殖未重排之V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引子以編碼高度可變CDR3區且完成活體外重排來以合成方法製造天然集合庫。描述人類抗體噬菌體集合庫之專利公開案包括例如美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第 2005/0079574 號、第 2005/0119455 號、第 2005/0266000號、第 2007/0117126號、第 2007/0160598號、第 2007/0237764號、第 2007/0292936號及第 2009/0002360 號。自人類抗體集合庫分離之抗體或抗體片段在本文視為人類抗體或人類抗體片段。 6.多特異性抗體在某些實施例中，本文提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中’一個結合特異性針對LRP6且另一結合特異性這對任何其他抗原。在 154875.doc •63· 201138823 某些實施例中’雙特異性抗體結合於LRp6之兩個不同抗原m雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現LRP6之細胞。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段形式。用於製造多特異性抗體之技術包括（但不限於）重組共表現具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈_輕鏈對（參看 Milstein^Cuello, Nature 305: 537 (1983) ； WO 93/08829 ；及 Traunecker等人，五从的乂 ι〇: 3655 (199i));及「杵_ 白」工程改造（參看例如美國專利第5,731，168號）》多特異性抗體亦可藉由以下製造：用於製備抗體Fc雜二聚分子之工程改造靜電牵引作用（WO 2009/089004A1);交聯兩個或兩個以上抗體或片段（參看例如美國專利第4,676,980號；及 Brennan等人，229: 81 (1985));使用白胺酸拉鏈製造雙特異性抗體（參看例如Kostelny等人，乂 /mmMwo/·， 148(5):1547-1553 (1992));使用用於製造雙特異性抗體片段之「雙功能抗體」技術（參看例如Hollinger 等人’/Voc. //a". dcW. Sc/· 90:6444-6448 (1993));及使用單鏈

Fv(sFv)二聚體(參看例如 Gruber 等人，·/. Immunol., 152:5368 (1994));及例如 Tutt等人，//wmwwo/. 147: 60 (1991)中所述製備三特異性抗體。本文亦包括具有三個或三個以上功能性抗原結合位點之工程改造抗體，包括「章魚抗體」（參看例如US 2006/0025576A1) » 本文之抗體或片段亦包括包含結合於LRP6以及另一不 I54875.doc -64- 201138823 同抗原之抗原結合位點的「雙重作用FAb」或「DAF」（參看例如 US 2008/0069820)。 7.抗體變異體在某些實施例中’涵蓋本文提供之抗體的胺基酸序列變異體。舉例而言’可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物特性。可藉由向編碼抗體之核苷酸序列中引入適當修飾或藉由肽合成製備抗體之胺基酸序列變異體。該等修飾包括例如缺失及/或插入及/或取代抗體之胺基酸序列中的殘棊。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，只要最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合。 a)取代、插入及缺失變異體在某些貫施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於取代型突變誘發之所關注位點包括hvr及 FR。保守取代顯示於標題為「保守取代」之表丨中。更多實質改變提供於標題為r例示性取代」之表i中且如下文關於胺基酸侧鏈類別進一步描述。可向所關注抗體中引入胺基酸取代，且篩選具有所要活性之產物，例如保留/改良之抗原結合、降低之免疫原性或改良之ADCC或CDC。表1

154875.doc •65- 201138823 初始殘基例示性取代較佳取代 Cys(C) Ser ； Ala Ser Gln(Q) Asn ; Glu Asn Glu(E) Asp ； Gin Asp Gly(G) Ala Ala His(H) Asn ; Gin ; Lys ; Arg Arg He⑴ Leu ; Val ; Met ; Ala ; Phe ;正白胺酸 Leu Leu(L) 正白胺酸；lie ; Val ; Met ; Ala ; Phe lie Lys(K) Arg ; Gin ; Asn Arg Met(M) Leu ; Phe ; lie Leu Phe(F) Trp ; Leu ; Val ; lie ; Ala ; Tyr Tyr Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Val ； Ser Ser Trp(W) Tyr ; Phe Tyr Tyr(Y) Trp ； Phe ； Thr ； Ser Phe Val(V) lie ; Leu ; Met ; Phe ; Ala ;正白胺酸 Leu 胺基酸可根據常見側鏈特性分組： (1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ; (2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; _ (3) 酸性：Asp、Glu ; (4) 鹼性：His、Lys、Arg ; (5) 影響側鏈定向之殘基：Gly、Pro ; (6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。非保守取代將需要將此等類別中之一者的成員換成另一類別。一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體（例如人類化抗體或人類抗體）之一或多個高變區殘基。一般而言，選 154875.doc -66- 201138823 擇用於進-步研究之所得變異體的某些生物特性將相對於親本抗體具有修飾（例如改良）（例如增加之親和力、降低之免疫原性）及/或將實質上保留親本抗體之某些生物特性。例示性取代變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術（諸如本文所述之技術）便利地產生。簡言之，一或多個HVR殘基突變且變異體抗體呈

現於噬菌體上且針對特定生物活性（例如結合親和力）進行篩選。可在HVR中進行改變（例如取代），例如以提高抗體親和力叮在HVR熱點」（亦即體細胞成熟過程中經歷高頻率突變之密碼子編碼的殘基）（參看例如Chowdhury， Μο/ϋ 207:179-196 (2008))及 /或 SDR(a-CDR) 中進行突變，測試所得變異體VH或VL之結合親和力。藉由自一級集合庫建構及再選擇進行親和力成熟已描述於例如 Hoogenboom等人，Mei/zoA ζ·« Μσ/ecw/ar 178:1- 37 (Ο Brien^ 人編，Human Press, Totowa，NJ，（2001) _。在一些親和力成熟之實施例中，藉由多種方法（例如易錯 PCR、鍵改組或寡核苷酸定點突變誘發）中之任一種向選擇用於成熟之可變基因中引入多樣性。接著形成二級集合庫。接著篩選集合庫以識別任何具有所要親和力之抗體變異體。另一引入多樣性之方法涉及HVR定點法，其中將若干HVR殘基（例如一次4-6個殘基）隨機化。可例如使用丙胺酸筛選突變誘發或建模特異性識別抗原結合中涉及之Hvr 殘基。尤其通常靶向CDR-H3及CDR-L3。 154875.doc •67· 201138823 在某些實施例中，—或多個HVR可出現取代、插入或缺失’只要該等改變不會實質上降低抗體結合抗原之能力。舉例而言’可在HVR中進行不會實質上降低結合親和力之保守改變（例如如本文提供之保守取代）。該等改變可在 HVR「熱點」或SDR外。在上文提供之變異體、11及乂]^序列之某些實施例中，各HVR未經改變或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。適用於識別經乾向以進行突變誘發之抗體的殘基或區之方法稱為丙胺酸篩選突變誘發」，如Cunningham及

Wells (1989) 244:1081-1085所述。在此方法中，識别殘基或目彳示殘基之群（例如帶電殘基，諸如arg、asp、 his、lys及glu)，且置換為中性或帶負電胺基酸（例如丙胺酸或聚丙胺酸）以判斷抗體與抗原的相互作用是否受影響。可在對初始取代顯示功能敏感性的胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構識別抗體與抗原之間的接觸點。該等接觸殘基及相鄰殘基可作為取代之候選物靶向或消除。已篩選變異體以判斷其是否含有所要特性》胺基酸序列插入物包括長度為一個殘基至含有一百個或更多殘基之多肽之胺基末端及/或羧基未端融合體，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列内插入物。末端插入之實例包括具有N末端曱硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N末端或C末端與酶（例如對於 ADEPT而言）或增加抗體之血清半衰期之多肽的融合體。 154875.doc •68· 201138823 b)糖基化變異體在某些實施例中，本文提供之抗體經改變以增加或降低抗體糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列使得形成或移除一或多個糖基化位點，便利地實現抗體糖基化位點的添加或缺失。若抗體包含Fc區，則可改變與其連接之碳水化合物。哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含一般經N鍵聯連接至 Fc區之CH2結構域的Asn297的分支、雙觸角寡醣。參看例如 Wright等人，77B：T£C7/ 15:26-32 (1997)。寡醣可包括多種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺（GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接於雙觸角寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以形成具有特定改良特性之抗體變異體。在一實施例中，提供具有碳水化合物結構之抗體變異體，其中該碳水化合物結構缺乏（直接或間接）連接於Fc區的海藻糖。舉例而言，該抗體中海藻糖之量可為1%至 80%、1% 至 65%、5% 至 65% 或 20% 至 40%。例如 WO 2008/077546中所述，藉由相對於如MALDI-TOF質譜法所量測之連接於Asn 297的所有甘油結構（例如複合、雜合及高甘露糖結構）的總和計算Asn297處糖鏈内海藻糖之平均量來測定海藻糖之量。Asn297係指位於Fc區中約位置 297(Fc區殘基之Eu編號）處之天冬醯胺殘基；然而，由於抗體中之微小序列變化，因此Asn297亦可位於位置297之 154875.doc -69- 201138823 上游或下游約± 3個胺基酸處，亦即位置294至300處。該海藻糖化變異體可具有改良之ADCC功能。參看例如美國專利公開案第 US 2003/0157108 號（Presta，L.) ; US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.，Ltd)。關於「去海藻糖化」或「海藻糖缺乏」抗體變異體之公開案實例包括：US 2003/0157108 ; WO 2000/61739 ; WO 2001/29246 ; US 2003/0115614 ； US 2002/0164328 ； US 2004/0093621 ； US 2004/0132140 ； US 2004/0110704 ； US 2004/0110282 ； US 2004/0109865 ； WO 2003/085119 ; WO 2003/084570 ； WO 2005/035586 ； WO 2005/035778 ； WO 2005/053742 ； WO 2002/031 140 ; Okazaki等人，*/·Μο/·5ζ·ο/·336:1239-1249 (2004) ; Yamane-Ohnuki 等人，«尽· 87: 614 (2004)。能夠產生去海藻糖化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質海藻糖化之Lecl3 CHO細胞（Ripka等人， Jrd 249:533-545 (1986);美國專利申請案第 US 2003/0157108 Α1 號，Presta，L ;及 WO 2004/056312 Al，Adams等人，尤其實例11);及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、尸LTS、基因剔除CHO細胞（參看例如Yamane-Ohnuki等人’Biotech. 87: 614 (2004) ; Kanda，Y.等人，叹.，94(4):680-688 (2006);及 WO 2003/085107)。抗體變異體另外具有等分寡醣，例如連接於抗體Fc區之被GlcNAc等分之雙觸角寡醣。該等抗體變異體可具有降低之海藻糖化及/或提高之ADCC功能。該等抗體變異體之 154875.doc -70- 201138823 實例描述於例如WO 2003/01 1878(Jean-Mairet等人）；美國專利第 6,602,684 號（Umana 等人）；及 US 2005/0123546 (Umana等人）中。亦提供寡醣中至少一個半乳糖殘基連接於Fc區的抗體變異體》該抗體變異體可具有改良之CDC功能。該抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人）；WO 1998/58964(Raju，S.);及 WO 1999/22764(Raju， S.)中。 c)Fc區變異體在某些實施例中，可向本文提供之抗體Fc區中引入一或多個胺基酸修飾，藉此產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾（例如取代）的人類Fc區序列（例如人類IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區）。在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些但非所有效應功能之抗體變異體，該等效應功能使該抗體成為活體内抗體半衰期重要而某些效應功能（諸如補體及ADCC)不必要或有害之應用的所要候選物。可進行活體外及/或活體内細胞毒性檢測法以確認CDC及/或ADCC活性之降低/耗盡。舉例而言，可進行Fc受體（FcR)結合檢測法以確保抗體缺乏 FcyR結合（因此可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn結合能力。NK細胞為用於介導ADCC之初級細胞，其僅表規 FcyRIII，而單核細胞表現FcyRI、FcyRII及FcyRIII。造如細胞上之FcR表現概述於Ravetch及Kinet，^eV' /mwwwo/. 9:457-492 (1991)第 464頁的表3 中。評定所關 4 分子之ADCC活性之活體外檢測法之非限制性實例描述於 154875.doc -71· 201138823 美國專利第5,500,362號（參看例如Hellstrom，I.等人，Proc. Nat'l Acad. Sci. 83:7059-7063 (1986)及 Hellstrom，I等尺，Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337( $- ^ Bruggemann, M. ^ A } J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987))中。或者，可採用非放射性檢測法 (參看例如用於流動式細胞測量術之ACTI™非放射性細胞毒性檢測法（CellTechnology，Inc. Mountain View，CA)及 CytoTox 96®非放射性細胞毒性檢測法（Promega，Madison， WI)。適用於該等檢測法之效應細胞包括周邊血液單核細胞（PBMC)及自然殺手（NK)細胞。或者或另外，可例如在諸如 Clynes等人，Proc. TVai’/ Jcad· *SW. 95:652-656 (1998)中揭示之動物模型中活體内評定所關注分子之 ADCC活性。亦可進行Clq結合檢測法以確認抗體不能結合Clq且因此缺乏CDC活性。參看例如WO 2006/029879及 WO 2005/100402 中之 Clq 及 C3c 結合 ELISA。可進行 CDC 檢測法來評定補體活化，（參看例如Gazzano-Santoro等人’ Tmmwwo/. 202:163 (1996) ; Cragg，M.S.等人’

Blood 101:1045-1052 (2003);以及 Cragg，M.S.及 M.J.

Glennie，103:2738-2743 (2004))。亦可使用此項技術中已知之方法進行FcRn結合及活體内清除率/半衰期測定 (參看例如 Petkova，S.B.等人，/«ί7· /mwwwo/· 18(12):1759-1769 (2006))。效應功能降低之抗體包括取代Fc區殘基238、265、 269、270、297、327及329中一或多者之彼等（美國專利第 154875.doc -72· 201138823 6,737,056號）。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、 269、270、297及327中兩者或兩者以上處具有取代之以突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂「DANA」 Fc突變體（美國專利第7,332,581號）。描述了與FcR之結合提高或減少的某些抗體變異體。（參看例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312 ;及 Shields等人，/· 5io/· C/zem. 9(2): 6591-6604 (2001)。）在某些實施例中’抗體變異體包含具有一或多個改良 ADCC之胺基酸取代的Fc區，例如在Fc區之位置298、333 及/或334(殘基之EU編號）處取代。在一些實施例中，在Fc區中作出導致經改變（亦即提高或減少）Clq結合及/或補體依賴性細胞毒性（CDC)的改變，例如美國專利第6，194,551號、WO 99/51642及1如3〇笆丨6等人，X/mmwwo/. 164: 4178-4184 (2000)中所述。半衰期增加及與新生兒Fc受體（FcRn)結合改良之抗體描述於US2005/0014934Al(Hinton等人）中，其中FcRn負責將母源 IgG 轉移至胎兒（Guyer 等人，·/· Immunol. 117:587 (1976)及 Kim等人，乂 /wmwwo/. 24:249 (1994))。彼等抗體包含具有一或多個取代之Fc區，該等取代改良Fc區與FcRn 之結合。該等Fc變異體包括在Fc區殘基：238、256、 265 、 272 、 286 、 303 、 305 ' 307 、 311 、 312 、 317 、 340 、 356 、 360 、 362 、 376 、 378 、 380 、 382 、 413 、 424或434中一或多者處具有取代，例如取代Fc區殘基434之變異體（美國專利第7,371，826號）。 154875.doc -73- 201138823 亦參看 Duncan 及 Winter，322:738-40 (1988);美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及關注Fc 區變異體之其他實例的WO 94/29351。句半胱胺酸工程改造抗體變異體在某些實施例中’可能需要形成半胱胺酸工程改造抗體，例如「thioMAb」’其中一或多個抗體殘基經半胱胺酸殘基取代。在某些實施例中，經取代殘基存在於抗體之可達位點處。藉由以半胱胺酸取代彼等殘基，藉此將反應性硫醇基置於抗體之可達位點處，且可用於結合抗體與其他部分（諸如藥物部分或連接子-藥物部分）以形成如本文進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，任何一或多個以下殘基可經半胱胺酸取代：輕鏈之V2〇5(Kabat編號）；重鏈之A118(EU編號）；及重鏈Fc區之S400(EU編號）。可例如美國專利第7,521，541號中所述產生半胱胺酸工程改造之抗體。 e)抗體衍生物在某些實施例中，本文提供之抗體可經進一步修飾以含有此項技術中已知且容易獲得的其他非蛋白質部分。適於衍生抗體之部分包括（但不限於）水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括（但不限於）聚乙二醇（pEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧曱基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚]，3_二氧戊環、聚三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸（均聚物或無規共聚物）及聚葡萄糖或聚（N·乙烯吡咯咬酮）聚乙二醇、丙二 154875.doc •74- 201138823 醇均聚物、聚氧化雨，成/与 μ化丙烯/氧化乙烯共聚物醇（例如甘油）、帑Γ，膝t Ώ 乳乙婦多71：烯醇及其混合物。因為聚乙二於水中之穩定性，所以其在製造時具有優勢。聚 · 有任何分子量，且 ’。物可具的數目可心 t或未刀支。與抗體連接之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，相同或不同分子。-般而言，用於衍生作用之聚合：及/或類型可基於包括(但不限於)待改良抗體之特定特性或

功能’抗體衍生物是否將用於既定條件下之療法等考慮來確定。在另一實施例中，提供抗體與可藉由暴露於輻射來選擇性加熱的非蛋白質部分之結合物。在一實施例中非蛋白質部分為碳奈米管（Kam等人，y& 102: 1 1600-1 1605 (2005))。此輻射可具有任何波長，且包括（但不限於）不損害普通細胞，但能將非蛋白質部分加熱至可殺死接近抗體-非蛋白質部分之細胞之溫度的波長。 B·重組方法及組合物可使用例如美國專利第4,8 16,567號中所述之重組方法及組合物製造抗體。在一實施例中，提供編碼本文所述之抗 LRP6抗體的經分離核酸。該核酸可編碼抗體之包含vl之胺基酸序列及/或包含VH的胺基酸序列（例如抗體之輕鏈及/ 或重鏈）。在另一實施例中，提供一或多個包含該核酸之載體（例如表現載體）。在另一實施例中，提供包含該核酸之宿主細胞。在一所述實施例中，宿主細胞包含（例如已經以下轉型）：（1)包含編碼包含抗體之VL的胺基酸序列及 154875,doc •75· 201138823 包含抗體之VH的胺基酸序列之核酸的載體，或（2)包含編碼包含抗體之VL的胺基酸序列之核酸的第一載體及包含編碼包含抗體之VH的胺基酸序列之核酸的第二載體。在一實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞或淋巴樣細胞（例如γ〇、NS0、Sp20細胞）。在一實施例中，提供製備抗LRP6抗體之方法，其中該方法包含在適於表現抗體之條件下培養如上文提供之包含編碼抗體之核酸的宿主細胞，且視情況自宿主細胞（或宿主細胞培養基）回收抗體。為了重組產生抗LRP6抗體，分離編碼抗體之核酸（例如如上文所述）且插入至一或多個載體中以供在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。該核酸容易使用習知程序（例如藉由使用能夠特異性結合於編碼抗體重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針）分離及定序》適於選殖或表現編碼抗體之載體之宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，尤其當不需要糖基化及 Fc效應功能時’可在細菌中產生抗體。抗體片段及多肽於細菌中之表現參看例如美國專利第5,648,237號、第 5,789，199说及第 5,840,523 號。（亦參看 ci^arlton，Meiftoc/s k Mo/ec—r 价o/ogy，茗卷（B.K.C. Lo 編，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，第 245-254 頁，描述抗體片段於大腸桿菌中之表現。）在表現後’抗體可在可溶部分中自細菌細胞糊狀物分離且可經進一步純化。除了原核生物外’真核微生物（諸如絲狀真菌或酵母）為 154875.doc •76- 201138823 適用於編碼抗體之載體的選殖或表現宿主，包括糖基化路徑經「人類化」導致產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌株。參看Gerngross，iVai. 22:1409-1414 (2004)及Li等人，价oiec/z. 24:210-215 (2006)。適用於表現糖基化抗體之宿主細胞亦源自多細胞生物體 (無脊椎動物及脊椎動物）。無脊椎動物細胞之實例包括植 φ 物及昆蟲細胞。已識別出可與昆蟲細胞結合使用且尤其用於轉染草地黏蟲（印Wopiera /rwgipert/a)細胞之眾多桿狀病毒病毒株。植物細胞培養物可以用作宿主。參看例如美國專利第 5,959,177 號、第 6,040,498 號、第 6,420,548 號、% 7,125,978 號及第6,41 7,429號（描述用於在轉殖基因植物中製造抗體之 PLANTIBODIEStm 技術）。脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，可使用適於在 # 懸浮液中生長之哺乳動物細胞株。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40(COS-7)轉型之猴腎CV1細胞株；人類胎腎細胞株（例如Graham等人，J. KzW. 36:59 (1977)中所述之293或293細胞）；幼倉鼠腎細胞（BHK);小鼠賽特利細胞（mouse sertoli cell)(例如 Mather, _βζ·ο/· Reprod. 23:243-251 (1980)中所述之ΤΜ4細胞）；猴腎細胞 (CV1);非洲綠猴腎細胞（VERO-76);人類子宮頸癌細胞 (HELA)；犬腎細胞（MDCK ;布法羅大鼠肝細胞（buffalo rat liver cell)(BRL 3A);人類肺細胞（W138);人類肝細胞 154875.doc -77- 201138823 (Hep G2);小鼠乳房腫瘤（ΜΜΤ 060562) ; TRI細胞，例如 Mather等人，Μ；Γ· Jcai 5W. 383:44-68 (1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢（CHO)細胞，包括DHFR· CHO細胞 (Urlaub等人，/Voc. iVcz". 5W· 77:4216 (1980)); 及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NSO及Sp2/0。適於抗體製造之特定哺乳動物宿主細胞株之評論參看例如Yazaki及Wu， Methods in Molecular Biology,黑卷（B.K.C. Lo,編， Humana Press, Totowa, NJ),第 255-268 頁（2003)。 C.檢測法本文提供之抗LRP6抗體可藉由此項技術中已知之多種檢測法針對物理/化學特性及/或生物活性進行識別、篩選或表徵。 1.結合檢測法及其他檢測法在一態樣中，例如藉由已知方法（諸如ELISA、西方墨點等）測試本發明抗體之抗原結合活性。在另一態樣中，可使用競爭檢測法識別與本發明之抗 LRP6抗體競爭結合LRP6的抗體。在某些實施例中，該競爭抗體結合於與本發明抗LRP6抗體所結合相同之抗原決定基（例如線性或構形抗原決定基）。用於定位結合抗體之抗原決定基之詳細例示性方法提供於Morris (1996) 「Epitope Mapping Protocols,」Methods in Molecular 第 66卷（Humana Press，Totowa, NJ)中。在例示性競爭檢測法中，在包含結合於LRP6之第一經 154875.doc -78 · 201138823 標記抗體及測試與第一抗體競爭結合LRP6之能力的第二未經標記抗體的溶液中培育經固定LRP6。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一經標記抗體但不包含第二未經標記抗體之溶液中培育經固定LRP6。在允許第一抗體與LRP6結合之條件下培育後，移除過量之未結合抗體，且量測與經固定LRP6締合之標記的量。若測試樣品中經固定LRP6締合之標記的量相對於對照樣品實質上降低，則表明第二抗體與第一抗體競爭結合 LRP6。參看 Harlow 及 Lane (1988) J Zaftoraior少

Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) 〇 2.活性檢測法在一態樣中，提供識別其具有生物活性之抗LRP6抗體的檢測法。生物活性可包括例如抑制或增強Wnt同功異型物介導之信號傳導、調節骨量/内容物、抑制細胞增殖、提高細胞增殖。亦提供具有該活體内及/或活體外生物活性之抗體。在某些實施例中，測試本發明抗體之該生物活性。實例中提供用於測試生物活性之特定檢測法。 D.免疫結合物本發明亦提供包含本文之抗LRP6抗體與一或多種細胞毒性劑（諸如化學治療劑或藥物）、生長抑制劑、毒素（例如蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素、或其片段）、或放射性同位素結合之免疫結合物。 154875.doc -79- 201138823 在一實施例中，免疫結合物為抗體與一或多種藥物結合之抗體-藥物結合物（ADC)，包括（但不限於）類美登素（參看美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1);奥芮他汀（auristatin)，諸如單甲基奥芮他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參看美國專利第 5,635,483號及第5,780,588號、及第7,498,298號）；海兔毒素（dolastatin);卡奇黴素（calicheamicin)或其衍生物（參看美國專利第 5,712,374 號、第 5,714,586 號、第 5,739，116 號、第 5,767,285 號、第 5,770,701 號、第 5,770,710 號、第 5,773,001 號及第 5,877,296 號；Hinman 等人，及et 53:3336-3342 (1993) ； ALodef A » Cancer Res. 58:2925-2928 (1998));蒽環黴素（anthracycline)，諸如道諾黴素或小紅葛（參看Kratz等人，Cwrrewi C/aewi. 13:477-523 (2006);專 k，Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006) ; Torgov 721 (2005) ; Nagy 等人，/Voc. iVa". iScz·· C/5^4 97:829-834 (2000) ； Dubowchik 等人，Bioorg. & Med. Chem, Letters 12:1529-1532 (2002) ; King 等人，·/· Mei C/zem. 45:4336-4343 (2002);及美國專利第 6,630,579號）；曱胺喋呤；長春地辛；紫杉烷，諸如多西他赛、太平洋紫杉醇、拉羅他赛（larotaxel)、特昔他赛（tesetaxel)及歐塔他赛（ortataxel);新月毒素（trichothecene);及CC1065。在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之抗體與酶活性毒素或其片段之結合，包括（但不限於）白喉A鏈、 154875.doc -80 - 201138823 白喉毒素之未結合活性片段、外毒素A鏈（來自綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A 鏈、莫迪素 A鏈（modeccin A chain)、α-帚麴菌素（alpha-sarcin)、光桐（Aleurites fordii)蛋白、康乃馨（dianthin)蛋白、洋商陸（Phytolaca americana)蛋白（PAPI、PAPII 及 PAP_S)、古瓜抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、石驗草 (sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹素、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素（enoniycin)及黴菌毒素 (tricothecene)。在另一實施例中，免疫結合物包含如本文所述之抗體與放射性原子結合形成放射結合物。多種放射性同位素可用於製造放射結合物。實例包括At211、I131、I125、γ90、 Re186、Re〗88、Smi53、Bim、p32、pb21jLu之放射性同位素。當放射結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍研究之放射性原子，例如tc99m或1123 ;或用於核磁共振（NMR)成像（亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記物，諸如蛾_ 123(又一次）、碘-131、銦-111、氟_19、碳_13、氮·15、氧-17、亂、猛或鐵。可使用多種雙功能蛋白偶聯劑製備抗體與細胞毒性劑之結合物’該等蛋白偶聯劑諸如N_丁二醯亞胺基_3·(2•吼咬基二硫基）丙酸酯（SPDP)、丁二醯亞胺基_4-(Ν-順丁烯二醯亞胺基甲基）環己烷-1-甲酸酯（SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷 (IT)、醢亞胺酯之雙功能衍生物（諸如二亞胺代己二酸二甲醋鹽酸鹽）、活性酯（諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯）、链類 154875.doc •81 201138823 (諸如戊二搭）、雙-疊氮基化合物（諸如雙_(對疊氮基苯曱酿基）己二胺）、雙-重氮鹽衍生物（諸如雙·（對重氮鹽苯曱醯基）·乙二胺）、二異氰酸酯（諸如甲苯2,6_二異氰酸酯）及雙活性氟化合物（諸如1，5_二氟-2,4-二硝基苯）。舉例而言，可如Vitetta等人，《Science 238:1098 (1987)中所述製備蓖麻毒素免疫毒素。碳-14標記之卜異硫氰基苯甲基_3_曱基二伸乙基三胺五乙酸（MX-DTPA)為用於結合放射性核苷酸與抗體之例示性螯合劑。參看wo 94/1 1026。連接子可為促進在細胞中釋放細胞毒性藥物之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二曱基連接子或含二硫化物之連接子（Chari 等人，C：⑽52:127-131 (1992);美國專利第 5,208,020號）。本文之免疫結合物或ADC明確涵蓋（但不限於）使用交聯劑製備之結合物，交聯劑包括（但不限於）BMPS、EMCS、 GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、ΜΡΒΗ、SBAP、SIA、 SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-G^lBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB、以及SVSB( 丁二醯亞胺基-(4-乙烯基颯）苯甲酸酯），其在市場上有售（例如來自Pierce Biotechnology, Inc.，Rockford，IL.，U.S.Α) 〇 E.用於診斷及偵測之方法及組合物在某些實施例中，本文提供之任一抗LRP6抗體均適用於偵測生物樣品中LRP6之存在。如本文所用之術語「偵 154875.doc •82· 201138823 測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織。在一實施例中，提供用於診斷或债測法中之抗LRP6抗體。在另一態樣中’提供偵測生物樣品中LRP6之存在的方法。在某些實施例中’該方法包含使生物樣品與如本文所述之抗LRP6抗體在允許抗LRP6抗體與LRP6結合的條件下接觸，且偵測抗LRP6抗體與LRP6之間是否形成複合物。該方法可為活體外或活體内方法。在一實施例中，使用抗LRP6抗體選擇符合使用LRP6抗體之療法（例如其中 LRP6為用於選擇患者之生物標記）條件的個體。可使用本發明抗體診斷之例示性病症包括癌症及骨路系統病症。在某些實施例中’提供經標記抗LRP6抗體。標記包括 (但不限於）直接偵測之標記或部分（諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記' 化學發光標記及放射性標記）；以及例如藉由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分，諸如酶或配位體。例示性標記包括（但不限於）放射性同位素 32P、“C、〗-[、3H及mI;螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素（fluorescein)及其衍生物；若丹明（rh〇damine)及其衍生物；丹磺醯基（dansyl);繳酮（uinbelliferone);營光素酶’例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶（美國專利第 4,737,456號）；營光素（luciferin) ; 2,3_二氫酞嗪二明；辣根過氧化酶（HRP);鹼性磷酸酶；卜半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氡化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧 154875.doc •83· 201138823 化酶及葡萄糖冬峨酸脫氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃以氧化酶，與用過氧化氯氧化染料前驅物之酶（諸如 HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶）偶聯；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記物；噬菌體標記物；穩定自由基及其類似物0 F.醫藥調配物藉由混合具有所要純度之如本文所述之抗LRp6抗體與一或多種可選醫藥學上可接受之載劑似⑽5W㈣打第16版，〇s〇1，a編（198〇))製備凍乾調配物或水溶液形式之該抗體之醫藥調配物。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無 f，且包括（但不限於）：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑（諸如氣化十八基二曱基苯曱基銨；氯化六羥季銨；氣化本甲k録’专索氣錄（benzeth〇niurn chloride);齡，丁醇或苯曱酚；對羥基苯曱酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸曱醋或對羥基苯甲酸丙酯；間苯二酚；環己醇；3 _戊醇；及間曱紛）；低分子量（小於約10個殘基）之多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯°比咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬酿胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物’包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如 EDTA ;糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子’諸如鈉；金屬錯合物（例如Zn_蛋白質錯合 154875.doc •84- 201138823 物）；護/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇（PEG) »本文例示性醫藥學上可接受之載劑另外包括間質藥物分散劑’ 諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白（sHASEGP) ’例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®， Baxter International，Inc.)。某些例示性 sHASEGP及使用方法（包括rHuPH20)描述於美國專利公開案第2005/0260186 號及第2006/0104968號中。在一態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡糖胺聚糖酶（諸如軟骨素酶）合併。例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6，171，586號及第WO 2006/044908號中所述之彼等，後一調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。本文之調配物亦可含有所治療特定適應症必需的一種以上活性成分，較佳具有不會彼此不利影響之互補活性的彼等。該活性成分適當地以對預期目的有效之量存在於組合中〇可例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合將活性成份嵌埋於所製備之微囊中，例如分別嵌埋於膠狀藥物傳遞系統（例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米囊劑）中或於巨乳液中的羥甲基纖維素或明膠微囊及聚-(甲基丙浠酸曱醋）微囊。該等技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences 第 16版，Osol，Α·等人（1980)。可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半透性基質，該等基質呈成 154875.doc •85· 201138823 型物品形式，例如薄膜或微膠囊。用於活體内投與之調配物一般無菌。容易例如藉由經無菌過濾膜過濾實現滅菌。 G.治療方法及組合物本文提供之任一抗LRP6抗體均可用於治療方法中。在一態樣中，提供用作藥物之抗LRP6抗體。在其他態樣中，提供用於治療Wnt介導之病症（諸如癌症或骨骼或骨病症）的抗LRP6抗體。在某些實施例中，提供用於治療法中之抗LRP6抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療罹患癌症或骨骼或骨病症之個體的方法中之抗lRP6抗體，該方法包含向個體投與有效量之抗LRP6抗體。在一所述實施例中’該方法另外包含向該個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如下文所述。在其他實施例中，本發明提供用於抑制由第一 Wnt同功異型物誘導之信號傳導及增強由第二Wnt同功異型物誘導之信號傳導的抗[尺“抗體。在某些實施例中，本發明提供用於抑制第一 Wnt同功異型物誘導之信號傳導且增強第二Wnt同功異型物誘導之信號傳導之方法的抗LRP6抗體，該方法包含向個體投與有效量之抗LRP6抗體來抑制第一 Wnt同功異型物誘導之信號傳導且增強第二Wnt同功異型物誘導之信號傳導。任一上述實施例之「個體」較佳為人類。在另一態樣中’本發明提供抗LRp6抗體之用途，其用於製造或製備藥物。在—實施例t，$藥物用於治療_ 介導之病症（諸如癌症或骨骼或骨病症）。在另一實施例 154875.doc • 86 - 201138823 中，該藥物用於治療Wnt介導等 < 病症（诸如癌症或骨絡或骨病症）的方法中，該方法 3勹患有Wnt介導之病症之個體投與有效量之藥物。A _從，+、& i 、所述實施例中，該方法另外包含向該個體投輿_右#吾> 、 v 一種額外治療劑，例如下文所述。任-上述實施狀「個體」可為人類。在另1、樣中，本發明提供治療Wnt介導之病症（諸如癌症或d或骨病症）时法。在—實施财，該方法包含向患有該Wnt介導之病症之個體投與有效量之抗LRP6抗體在戶斤述實施例中，該方法另外包含向該個體投與有效里之至少一種額外治療劑，例如下文所述。任一上述實施例之「個體」可為人類。在貫施例中，Wnt介導之病症為癌症，諸如非小細胞肺癌、礼癌、胰臟癌、卵巢癌、腎癌或前列腺癌。在另一實施例中，Wnt介導之病症為骨骼或骨病症，諸如骨礦質疏鬆症、骨關節炎、骨折或骨損害。

一個實施例提供治療罹患癌症之個體的方法，其包含向個體投與有效量之結合於LRp6且抑制由選自由Wnt3及 Wnt3a組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導的抗體’及結合於LRP6且抑制由選自由wnt 1、2、2b、6、 8a、9a、9b及10b組成之群的wnt同功異型物誘導之信號傳導的抗體。另一實施例提供治療罹患癌症之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之結合於LRP6且抑制Wnt3及

Wnt3a誘導之信號傳導的抗體，及結合於LRP6且抑制Wnt 1、2、2b、6、8a、9a、9b及10b誘導之信號傳導的抗體。 154875.doc -87- 201138823 另一貫施例提供一種治療罹患癌症之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之結合於LRP6且抑制Wnt3及Wnt3a誘導之k號傳導的抗體’及結合於LRP6且抑制Wnt 1、2、 2b、4、6、7汪、7b、8a、9a、9b及10b誘導之信號傳導的抗體。在另一態樣中’本發明提供一種增強個體中由Wnt同功異型物誘導之Wnt信號傳導的方法，該方法包含向該個體投與有效量之增強Wnt同功異型物誘導之信號傳導的抗 LRP6抗體及增強Wnt同功異型物誘導之貿扒信號傳導的 Wnt同功異型物。在另一態樣中，本發明提供包含本文提供之任一抗 LRP6抗體的醫藥調配物，例如用於任一上述治療法中。在一實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任一抗LRp6 抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任一抗LRP6抗體及至少一種額外治療劑’例如下文所述。 j發明抗體可單獨或與其他試劑組合用於療法中。舉例 °本發明抗體可與至少一種額外治療劑共投與。在某些實_中’額外治療劑為化學治療劑。在另―、實施例中，藥劑為有效治療癌症或治療骨路或骨病症之抗體。上文所述之該等組合療法涵蓋組合投與(其中相同或不同調配物中包括兩種或兩種以上治療劑）及單獨投與，在該情形中’本發明抗體可在投與額外治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後投與。本發明抗體亦可與放射療法組合使用。 154875.doc -88 - 201138823 本發明抗體（及任何額外治療劑）可葬由盘u μ 精由任何適合方式投與，包括非經腸、肺内及鼻内投與，且鴻要局部治療，則病灶内投與。非經腸輸注包括肌肉内、靜脈内、動脈内、腹膜内或皮下投與。部分視投與是暫時或長期投斑而定，給藥可藉由任何適合途徑，例如注射，諸如靜脈内或皮下注射。本文涵蓋包括(但不限於)經多個時間點單次或多次投與、團式投與及脈衝輸注之多種給藥時程。

本發明抗體將以與良好醫療實踐一致的方式調配、給藥及投與。本文考慮之因素包括所治療之特定病況、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症過程、藥劑傳遞部位、投與方法、投與時程、及醫師已知之其他因素。抗體並非必需但視情況與一或多種目前用於預防或治療所論述病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量視調配物中存在之抗體的量、病症或治療之類型、及上文所述之其他因素而定。此等一般以與本文所述相同之劑量及投與途徑、或約丨至99%本文所述之劑量、或經驗上/臨床上判斷適當的任何劑量及任何途徑使用。為了預防或治療疾病，本發明抗體之適當劑量（當單獨或與一或多種其他治療劑組合使用時）將視待治療疾病之類型、抗體類型、疾病嚴重程度及過程、抗體為預防還是治療目的投與、先前療法、患者病歷及對抗體之反應、及主治醫師之判斷而定。抗體適合一次或經一系列治療向患者投與。視疾病類型及嚴重程度而定，約1 pg/kg至15 mg/kg(例如〇.lmg/kg_10mg/kg)抗體可為藉由一或多個各別 154875.doc -89· 201138823 投與或藉*連續輸注向患者投與之初始候選劑[視上文提及之因素而定，-典型每日劑量可為約i ^g/kg至1〇〇 mg/kg或H)0 mg/kg以上之範圍。為了經數天或更長時間重複投與’視病況而定，治療-般將㈣直至出現疾病症狀的所要抑制。一種例示性抗體劑量將為約〇〇5 mg/kg至約 10 mg/kg範圍。因此，可向患者投與約〇5 mg/kg、2〇 mg/kg、4.0 mg/kg或10 mg/kgt)3一或多個劑量（或其任何組合）。該等劑量可間歇投與，例如每週或每三週（例如使得患者接收約2至約20次，或例如約6次抗體劑量卜可投與較高起始劑量’隨後一或多次較低劑量。此療法之過程容易藉由習知技術及檢測法監測。應瞭解，任何上述調配或治療方法可使用代替抗抗體或除抗LRP6抗體之外的本發明之免疫結合物來進行。 H·製品在本發明之另一態樣中，提供一種含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。該製品包含一容器及一在該容器上或與該容器相聯之標籤或藥品說明書。適合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、^溶液袋等。嗜等容器可由諸如玻璃或塑膠之多種材料形成。容器容納單獨組合物或與可有效於治療、預防及/或診斷病況之另一組合物組合之組合物，且可具有一無菌進入孔（例如，容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈輸液袋或小瓶）。組合物中之至少一種活性成分為本發明抗體。標籤 154875.doc 201138823 或樂品說明書⑸組合物適用於治療所選病況。此外品可包含⑷内含組合物之第一容器，#中該組合

發明抗體Kb)内含組合物之第二容器，纟中該級合物包含另-種細胞毒性劑或治療劑。本發明之此實施例中的製品可進-步包含指示組合物可用於治療特定病況之藥品說明書。或者或另外，製品可進—步包含第二（或第三）容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如抑菌性注射用水(B刪)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液_㈣，s solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者觀點出發所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。應瞭解，任何上述製品可包括代替抗LRp6抗體或除抗 LRP6抗體之外的本發明之免疫結合物。【實施方式】 III·實例以下為本發明之方法與組合物的實例。應瞭解，考慮到上文提供之一般說明，可實踐多種其他實施例。實例1 實驗程序細胞培養及細胞檢測法使細胞株EKVX及μ 14在補充有10%胎牛血清及2 mM麩醯胺酸之RPMI-1640培養基中生長；使JHH-1細胞在具有相同補充物之威廉斯培養基E(Williams· Medium E)中生長。所有其他細胞株獲自美國菌種保存中心（American 154875.doc -91- 201138823

Type Culture Collection，ATCC)且如所推薦加以保存。根據製造商建議，在24孔板中以FuGENE 6轉染試劑 (Roche)轉染細胞。在螢光素酶報導體檢測法中，轉染表現質體 DNA 之混合物：7.5 ng TOPglow(Upstate)或 TOPbrite (Zhang等人，2009)螢火蟲螢光素酶Wnt報導體、0.5 ng pRL-SV40 Renilla登光素酶（Promega)及 1 ng LEF1。在轉染後24小時開始以抗體處理細胞16-20小時。自在開始抗體處理後1小時開始，向細胞中添加Wnt3a蛋白質（根據X純 · 化，或購自R&D Systems)。將細胞收集於150 μΐ溶解緩衝液（DeAlmeida等人，2007)中，且使用Dual-Glo螢光素酶系統（Promega)及 Envision Multilabel 讀取器（PerkinElmer)檢測 30-50 μΐ細胞溶解產物之發光。將螢火蟲螢光素酶含量針對轉染效率校正為Renilla螢光素酶含量，且另外根據未經 Wnt3a刺激之細胞中的含量校正相對螢光素酶單位 (RLU)。選擇穩定整合有TOPbrite報導體之HEK293及Hs578T細 · 胞株中具有濕黴素抗性之細胞株。基於穩定整合之SV40驅動之Renilla榮光素_ (對於HEK293細胞）或MultiTox-Fluor 細胞活力檢測法（Promega)(對於Hs578T細胞）根據細胞數校正Wnt螢光素酶報導體之表現。藉由在pRK5表現載體中於全長FZD4、FZD5或LRP6上游選殖全長Wntl或Wnt3a來構成wnt嵌合構築體。在Wnt與 FZD或LRP6序列之間插入24個胺基酸之連接子（GGGSGGGT)3 (Cong等人，2004)。 154875.doc •92· 201138823 在大腸桿菌中，藉由使用「样-臼（knobs-into-holes)」工程改造技術共表現YW2 11.3 1.62重鏈及輕鏈與截短之Fc結構域來產生單臂YW211.31抗體變異體（Ridgway，J.B.B.等人，«尽 9:617-621 (1996))。在抗體交聯中，使Fc特異性山羊抗人類IgG抗體或F(a1V)2片段（Sigma· Aldrich)與單臂YW211.31抗體一起培育1小時，隨後將混合物添加至細胞中。在西方分析中，將1.2><106個1^〖293細胞接種至10(；111盤上，且3天後以10 pg/ml抗體，或以X pg/ml DKK1(R&D Systems)或 Fzd8CRD-Fc(DeAlmeida 等人，2007)蛋白質處理1小時，隨後添加0·2 pg/ml Wnt3a蛋白質後再維持1小時。以冷PBS洗滌細胞2次，且在冰上在0.5 ml溶解緩衝液中溶解。使20 pg蛋白質在變性SDS-聚丙烯醯胺凝膠Ου%)上電泳解析，轉移至硝基纖維素膜，且以針對磷酸基-及總 LRP6(Cell Signaling Technology)、β-索烴素（BD Transduction Laboratories)、β-肌動蛋白及GAPDH之抗體探測。使用紅外線標記之二級抗體（Rockland Immunochemicals) 及 Odyssey imager(LI-COR)檢測蛋白質。在定量即時PCR(qPCR)表現分析中，使用RNeasy套組 (QIAGEN)自細胞分離RNA，且用TaqMari單步RT-PCR主混合試劑套組（Applied Biosystems)在7900 HT快速即時PCR 系統（Applied Biosystems)上進行反應。使用AACt法計算相對RNA含量，且根據相同樣品内之人類GAPDH或小鼠 Rpll9 RNA含量校正，且另外根據來自未添加（NA)Wnt3a、 154875.doc •93· 201138823 抗體或其他蛋白質之細胞的樣品校正。前置引子、反置引子及探針序列之引子及探針組以5’至3·列出，分別為 SP5 ： AATGCTGCTGAACTGAATAGAAA (SEQ ID NO: 32)、AACCGGTCCTAGCGAAAA (SEQ ID NO: 33)、 CCGAGC ACTGTTTCAAATCTCCCA (SEQ ID NO: 34)； ZNRF3 ： TGAGAGTGTGACATTGTTGGAA (SEQ ID NO: 35) 、GTAAAATCTGTGTGCAATTATCATGT (SEQ ID NO: 36) 、 AATCATTGAAAATGACTAACACAAGACCCTGTAAAT (SEQ ID NO: 37)；小鼠 Mmp7 : TGAGGACGCAGGAGTGAA (SEQ ID NO: 38)、CCCAGAGAGTGGCCAAAT (SEQ ID NO: 39)、CCTG TTTGCTGCCACCCATGA (SEQ ID NO: 40)。先前描述了用於人類APCDD1、AXIN2、GAD1、LEFTY2及 SAX1以及小鼠Rpll9及Axin2之引子及探針（DeAlmeida等人，（2007) ; Liu等人，（2010))。 GAPDH引子及探針購自Applied Biosystems。對於報導體基因及qPCR檢測法，所有圖均表示3或4次重複實驗之平均值及標準差。 LRP6抗體篩選及親和力成熟將編碼 E1-E2 (SEQ ID NO: 29 之胺基酸 A19-R644)及 E3_ E4 (SEQ ID NO:29 之胺基酸 V629-G1244)區域之人類 LRP6 cDNA片段單獨選殖至含有HSV信號序列及人類IgG Fc區 (作為蛋白質標籤）（SEQ ID NO: 30(El-E2-fc) ; SEQ ID NO: 31(E3-E4-fc))的哺乳動物表現載體中。使LRP6.E1-E2-Fc 154875.doc -94- 201138823 及LRP6.E3-E4-FC蛋白質藉由短暫轉染表現於CHO細胞中，且藉由蛋白質A/G親和力層析法加以純化。LRP6.E1-E2-Fc及LRP6.E3-E4-FC蛋白質亦個別地用於篩選人類合成 Fab噬菌體呈現集合庫。在用固定LRP6蛋白質選擇後，分離噬菌體純系且藉由噬菌體ELIS A確認與LRP6-FC融合蛋白片段結合，而不是與Fc蛋白質結合。接著重新格式化噬菌體Fab純系以表現為人類IgGl單株抗體。轉染24個針對 LRP6.E1-E2-FC之獨特抗體重鍵純系及22個針對LRP6.E3-E4-Fc之純系，且與常見赫赛丁（Herceptin)源性人類κ輕鏈一起短暫表現於HEK293細胞中，且藉由親和力層析法純化IgG蛋白質。藉由短暫轉染於CHO細胞中來產生隨後的大規模抗體製劑。使用加His標籤之LRP6.E3-E4蛋白質使YW211.31抗體親和力成熟。在各別集合庫中利用軟隨機選擇之殘基靶向 CDR環之三種不同組合（H1/L3、H2/L3及H3/L3)以進行隨機化。此外，靶向L1/L2/L3 CDR組合以進行硬隨機化。在第一輪選擇中，以經固定LRP6.E3-4-His蛋白質選擇來自隨機化集合庫之噬菌體，隨後進行5輪溶液-噬菌體分選，其中LRP6.E3-4-His之濃度自300 nM逐漸降至0.5 nM，且添加100倍過量之LRP6.E3-4-FC蛋白質以較快解離速率耗盡抗體。純化11個噬菌體純系，且如藉由噬菌體競爭 ELISA所測定，均顯示對LRP3.E3-E4之親和力有改良。此等純系之序列在CDR-H1、CDR-H3及CDR-L3中展現1至6 個胺基酸變化。使用BIAcore儀器藉由表面電漿子共振分 154875.doc •95- 201138823 析評定經純化抗體之解離速率常數。生物膜層干涉法LRP6蛋白質結合檢測法生物膜層干涉法如先前所述進行（Bourhis等人，2010)。簡言之，使用AviTag系統（GeneCopoeia)自感染桿狀病毒之昆蟲細胞純化出經生物素標記之加His標籤之LRP6蛋白質。在裝載有20 gg/ml LRP6蛋白質之Octet RED系統 (ForteBio)上使用抗生蛋白鏈菌素高結合FA生物感測器量測結合動力學。無載劑之經純化人類Wnt3a及小鼠Wnt9b 獲自R&D Systems，且經純化DKK1蛋白質如先前所述產生 (Bourhis等人，2010)。腫瘤及骨研究使來自MMTV-Wntl轉殖基因小鼠之腫瘤在C57BL/6小鼠之乳腺脂肪墊中繼代，機械及酶促地解離，再懸浮於基質膠（Matrigel)及漢克氏平衡鹽溶液（Hank's Balanced Salt Solution，HBSS)中，且注射至無胸腺NCr裸小鼠（Taconic) 之乳腺脂肪墊中。在腫瘤體積達到250-800 mm3後開始處理。對於各處理組，每兩天向10隻小鼠腹膜内（IP)投與30 mg/kg抗體或蛋白質。使用測徑規量測法分析腫瘤體積。如先前所述進行Ntera-2異種移植腫瘤生長及活體内研究 (DeAlmeida # 乂，2007)。簡言之，向NU/NU無胸腺裸小鼠（Charles River)每隻小鼠皮下注射ι〇,〇〇〇,〇〇〇個Ntera-2細胞（於含50%基質膠之HBSS中），在平均腫瘤體積達到535-595 mm3後分成每組4或5隻動物之組，且以1〇〇 mg/kg抗體或30 mg/kg Fzd8CRD-Fc蛋白質之單次ip劑量注射》在處 154875.doc -96- 201138823 理後1 6小時收集腫瘤及血清樣品。使用TissueLyser系統 (QIAGEN)使腫瘤均質化，且使用RNeasy套組（QIAGEN)提取 RNA。採集顱蓋且如Mohammad等人，2008所述加以培養。簡言之，自2日齡小鼠仔解剖顱蓋，切成兩半，且與硬膜、脈管及頭皮分離。將顱蓋在組織培養板中在補充有0.1%牛血清白蛋白及各為1〇〇1^1111之青黴素（卩611丨(^11丨11)及鏈徽素 (streptomycin)之BGJb培養基中培養1天，隨後以10 pg/ml 抗體或蛋白質處理7天。使骨在含5°/。C02、37°C之含濕氣氛圍下培養。用 μ(：Τ 40(SCANCO Medical, Basserdorf， Switzerland)x射線微CT系統使小鼠顱蓋成像。使用以下參數獲得微CT資料：X射線管能量位準=45 kV，電流=177 μΑ，積分時間=300 ms，2000個投影。在6 μιη各向同性解析度下獲得軸像。使用羥磷灰石（ΗΑ)幻像進行校準。以 Analyze(AnalyzeDirect Inc., Lenexa, KS，USA)分析微 CT掃描。形成各樣品橫斷面之最大強度投影及三維表面透視圖。使用Trace工具手工繪製頂骨邊界以對頂骨區域劃分區段。在此區域内，計算樣品體積及平均骨礦質密度 (BMD)。對該區域應用0.3 gm-HA/cm3之臨限值以計算該區域内僅鈣化組織之平均BMD。亦使用該臨限值，藉由以鈣化體元數除以頂骨區之總體元數來計算頂骨區鈣化體積百分比。分析各樣品之以下參數：頂骨區體積、頂骨區鈣化體元之BMD及頂骨區鈣化百分比。若杜奈特測試 (Dunnett's test)顯示p值小於0.05，則認為各組之間的差異 154875.doc -97- 201138823 顯著。根據基因泰克機構動物管理及使用委員會準則 (Genentech Institutional Animal Care and Use Committee guidelines)進行所有使用小鼠之實驗。實例2 分離Wnt拮抗劑及增強型LRP6單株抗體為了研發候選治療性分子以控制Wnt信號傳導，產生能抑制或增強由Wnt3a蛋白質誘導之信號傳導的抗體。使用重組 LRP6.E1-E2-FC (SEQ ID NO: 30)及 LRP6.E3-E4-Fc (SEQ ID NO: 31)蛋白質篩選人類合成Fab噬菌體呈現集合庫，且藉由ELISA確認經分離噬菌體純系與LRP6之結合。分離出24個針對LRP6.E1-E2之獨特抗體重鏈純系及22個針對LRP6.E3-E4之純系，重新格式化且表現為人類IgGl抗體。有6種LRP6.E3-E4抗體以濃度依賴性方式抑制HEK293 細胞中由0.1 mg/ml經純化Wnt3a誘導之Wnt螢光素酶報導體活性（圖1A，此圖及所有其他圖之誤差杠（有註釋者除外）代表至少3個重複樣品的標準差）。此等抗體命名為 YW21 1.03 、 YW211.08 、 YW211.il 、 YW211.12 、 YW211.31及YW211.33。LRP6.E1-E2抗體均未展現此抑制。識別LRP6.E3-E4結構域之YW211.31抗體能最有效地抑制經Wnt3a刺激之HEK293細胞的信號傳導，IC5G為約1 pg/ml(或6 nM)。與經純化Fzd8CRD及DKK1蛋白質類似， YW211.3 1抗體抑制Wnt3a誘導之LRP6磷酸化及β-索烴素蛋白質穩定作用，而不影響LRP6蛋白質含量（圖1Β，其顯示 154875.doc -98- 201138823 關於未經刺激抑或由Wnt3a誘導且用所指LRP6抗體或經純化蛋白質處理之HEK293細胞的西方分析結果）（所示β-肌動蛋白及GAPDH蛋白質含量作為樣品内參照）。RNAi實驗證明僅由β-索烴素多株抗體識別之較低分子量條帶表示β_索烴素蛋白質。YW211.31抗體亦可拮抗小鼠Lrp6功能，因為其部分抑制小鼠NIH/3T3細胞中Wnt3a誘導之報導體活性及小鼠L細胞中的β-索烴素蛋白質穩定作用。藉由表面電漿子共振（SPR)量測得知，YW2 11.3 1抗體具有約2 ηΜ之結合親和力’且藉由Scatchard分析量測得知，具有0.6 nM之結合親和力。為了改良YW211.31抗體之親和力及潛在效能，使用加His標籤之LRP6 E3-E4蛋白質及 CDR組合集合庫使純系親和力成熟，其中乾向所選之cdr 殘基以供隨機化。使藉由噬菌體競爭ELISA得知顯示最大改良親和力之4個噬菌體純系（YW211.31.il、YW211.31.11， 35、YW211.31.57及YW211.31.62)重新格式化且表現為全長人類IgG。所有四個親和力成熟的IgG之解離速率常數均有降低，從而使兩個最佳抗體YW211.31.57及YW211.31.62 之親和力有改良，KD值分別為0.27及0.17 nM。YW211.31.57 及YW211.31.62亦顯示抑制Wnt3a刺激之HEK293細胞中之 k就傳導的效能有改良’ IC50值為約0.1 pg/ml(〇.6 nM)。篩選中分離之抗體在無外源Wnt3 a蛋白質刺激存在下均不激活HEK293細胞中之信號傳導，然而LRP6 E1-E2中有5 個及E3-E4抗體中有兩個使Wnt3a誘導之信號傳導增強至少 2倍。在小鼠NIH/3T3細胞中，YW210.09(—種Ε1·Ε2抗體） 154875.doc -99- 201138823 亦使Wnt3a誘導之信號傳導增強至少1.5倍，此表明其亦識別小鼠LRP6。在HEK293細胞中，Wnt3a誘導之信號傳導被YW210.09抗體增強之量值與Wnt3a濃度成比例（圖1C)。 YW210.09抗體與人類LRP6 E1-E2蛋白質相互作用之KD藉由SPR分析量測得知為5 nm。ELISA測試顯示所有拮抗劑及增強型抗體僅特異性結合用於其分離之LRP6蛋白質片段，且均不識別E1-E2及E3-E4兩者。FACS分析顯示可溶性LRP6 E1-E4蛋白質有效且完全地阻斷YW211.31.57& YW210.09與HEK293細胞的結合，表明此等抗體不會識別其他細胞表面蛋白質。實例3 LRP6單株抗體對自分泌Wnt信號傳導之影響使用多種腫瘤細胞株測定LRP6抗體拮抗或增強内源或自分泌Wnt信號傳導之能力（Bafico等人，2004 ; DeAlmeida 等人，2007 ; Akiri等人，2009)。在畸胎上皮癌細胞株PA-1及NTERA-2中，YW2 1 1.3 1抗體抑制由自分泌Wnt信號傳導誘導之報導體活性的效能類似於關於外源Wnt3a所觀測到之效能（圖2A顯示對在經螢光素酶報導體轉染及用LRP6 抗體（個別或組合）或Fzd8CRD-Fc蛋白質（陽性對照）處理之 PA-1畸胎上皮癌細胞中的自分泌Wnt信號傳導之濃度依賴性抑制及增強作用）。在PA1細胞中，表現内源Wnt靶基因亦觀測到YW211.31 抗體對Wnt信號傳導之抑制（圖2B)。圖2B顯示關於在用或未用 0.3 mg/ml Wnt3a蛋白質處理且用 10 mg/ml YW211.31 154875.doc -100- 201138823 抗體、作為陰性對照之抗gD單株抗體或作為陽性對照樣品之Fzd8CRD-Fc蛋白質處理的PA-1細胞中Wnt誘導型基因 SAX1及GAD1以及Wnt抑制型基因LEFTY2的qPCR表現分析之結果，且另外根據來自未添加（NA)Wnt3a之細胞的樣品加以校正。抗體部分抑制由外源Wnt3a蛋白質誘導抑或由内源性自分泌Wnt信號傳導維持之SAX1、GAD1及APCDD1的表現。相反地，YW211.31抗體減輕Wnt3a蛋白質或自分泌 Wnt信號傳導對LEFTY2表現的抑制。與YW211.31形成對比，報導體基因檢測法顯示，YW210.09抗體增強PA-1及 NTERA-2細胞株中之Wnt3a誘導及自分泌Wnt信號傳導（圖 2A)。儘管YW2 11.3 1.57抗體對Wnt信號傳導之抑制在較大抗體濃度下逐漸增加，但在一些細胞類型（諸如PA-1細胞）中YW2 10.09及其他抗體之增強作用在高抗體濃度下可能降低。此可表明增強作用需要報導體LRP6二聚，因為高抗體濃度將會促進單價相互作用且因此限制LRP6分子交聯。類似於單獨YW211.31.57之作用，以YW211.31.57與丫\¥210.09抗體之組合處理？人-1或1^丁£11人-2細胞會拮抗 Wnt3a誘導及自分泌Wnt信號傳導兩者。為了識別展現自分泌Wnt信號傳導之其他細胞株，在 Wnt螢光素酶報導體基因檢測法中測試Fzd8CRD-Fc蛋白質對相對高量地表現Axin2 mRNA或磷酸基-LRP5/6之細胞株中之Wnt信號傳導的抑制作用。9種細胞株展現自分泌Wnt 信號傳導受Fzd8CRD-Fc蛋白質抑制，包括NSCLC細胞 154875.doc -101 - 201138823 NCI-H23及NCI-H2030以及軟組織肉瘤細胞SW872及ΗΤ-1080，該等細胞先前已報導過基於使用其他Wnt拮抗劑之檢測法具有内源Wnt信號傳導（Guo等人，2008 ; Akiri等人，2009 ; Nguyen等人，2009)。圖3顯示藉由單因子變異數分析（ANOVA)分析之資料的彙總（其中p值<0.01)。使用 10 mg/ml 抗體（但分別以 1 mg/ml YW211.31.57 或 YW210.09 抗體處理的NCI-H3 58及HT-1080細胞除外）進行檢測法以提高增強作用。所有9種細胞株中之Wnt信號傳導均被外源Wnt3a蛋白質進一步誘導，且YW211.31.57抗體抑制對Wnt3a之此反應 (圖3、4A、4D及4F)。令人驚奇的是，YW211.31.57抗體增強所有9種此等細胞株中之自分泌Wnt信號傳導，而 YW210.09增強5種細胞株中之自分泌Wnt信號傳導且抑制3 種細胞株（圖3、4A-4C、4E及4F)。不僅使用螢光素酶報導體觀測到YW211.31.57抗體對自分泌及Wnt3a誘導之信號傳導的此互逆活性，而且在所測試之6種細胞株中的内源 Wnt靶基因（諸如Axin2)之表現亦觀測到此活性（圖4A、4B 及4C) »在EKVX及乳癌Hs578T細胞株中，藉由證明 YW211.31抗體增加Wnt信號傳導之作用被Fzd8CRD-Fc蛋白質阻斷來確認此增加依賴於自分泌Wnt(圖4G)。亦對篩選中識別之Wnt3a誘導之信號傳導的其他5種抗體拮抗劑觀測到EKVX及Hs578T細胞中之自分泌Wnt信號傳導有增強。在圖 4A 中，AXIN2 mRNA 於 HT-1080、EKVX、NCI- 154875.doc •102· 201138823 H358及Hs578T中之qPCR表現分析表明YW2U·31 制由Wnt3a mg/ml)抗體增強自分泌（NA)Wnt信號傳導及抑、从

Vri25 誘導之信號傳導（0.2 mg/ml)，而Fzd8CRI>Fcy 抗自分泌（NA)及Wn3a誘導之信號傳導兩老晌中之表現中，Wnt誘導型基因於NCI-H23(B)及M14(C)挪犯 cr/ml)抗體核被YW211.31.57增強且被YW210.09抗體（30 理抗。所示 Wnt3a(0.2 mg/ml)及 Fzd8CRD-Fc(3〇 mg/ ) • 分別作為增強及抑制自分泌Wnt信號傳導的陽性對照 ,,¢+ 03 (3〇 CD4-Fc蛋白質（B)或抗g〇抗體（C)用作陰性W…、 mg/ml)。對於 M14 細胞（C)，AXIN2 及 SP5 表現比 APCDD1 及ZNRF3表現更有效地經…加“蛋白質或YW211.3 1.57抗體增強。圖4口及4E顯示在穩定整合有Wnt螢光素酶報導體之

Hs578T細胞中，YW211.31.57抗體顯示對Wnt3a創激之信號傳導的濃度依賴性抑制作用（D)及對自分泌Wnt信號傳導的增強作用（E)，而Fzd8CRD-Fc蛋白質在有或無（NA)〇.l φ mg/ml Wnt3a刺激下抑制信號傳導且YW210.09抗體增強信號傳導。RNAi實驗表明Hs578T細胞中至少41%的Wnt3a誘導之信號傳導依賴於LRP5表現’且預測此信號傳導受 Fzd8CRD-Fc蛋白質而非YW211.31.57抗體抑制。在此實驗中，SV40驅動之螢光素酶未經轉染以供校正’且相反地’ 獨立地確認抗體及蛋白質處理對此細胞株之活力不具顯者影響。圖4F及4G顯示經Wnt螢光素酶報導體轉染之EKVX 細胞亦展現YW211.3 1.57抗體增強自分泌Wnt信號傳導及結抗Wnt3 a誘導之信號傳導。抗體介導之自分泌Wnt信號 154875.doc .103- 201138823 傳導的增強受5 mg/ml Fzd8CRD-Fc蛋白質抑制。實例4 LRP0抗趙對不同Wnt同功異型物之互逆活性 YW211.31抗體抑制所有細胞株中由外源％加3&蛋白質誘導之信號傳導，但可以細胞株依賴性方式抑制或增強自分泌Wnt信號傳導，此表明驅動自分泌信號之特異性Wnt同功異型物限定抗體活性。因此’測定抗體針對由Wnt3a& 其他Wnt同功異型物之外源表現誘導的信號傳導之活性。 YW211.31.57抗體以類似於抑制由Wnt3a蛋白質處理誘導之信號傳導的效能抑制由HEK293或Hs578T細胞中Wnt3a 之轉染誘導的Wntjs號傳導。令人驚奇的是，兩細胞株中由Wntl表現誘導之信號傳導被YW211.31.57抗體增強。如所預期，Fzd8CRD-Fc蛋白質抑制Wntl及Wnt3a信號傳導兩者。亦對篩選中識別之其他Wnt3a拮抗劑抗體觀測到Wntl 信號傳導增強。YW210.09抗體針對Wnt3a及Wntl誘導之信號傳導亦展現相反活性，其與YW2 11.3 1.57活性互逆，亦即增強Wnt3a信號傳導且抑制Wntl信號傳導。如可由Wnt 靶基因Axin2及Mmp7之表現降低至與Fzd8CRD-Fc蛋白質處理類似之程度觀測出，YW210.09抗體亦抑制來自 MMTV-Wntl小鼠腫瘤之生長在培養物中之腫瘤細胞中的 Wntl信號傳導。在MMTV-Wntl細胞中，YW211.31.57抗體未能增強Wntl信號傳導，可能是因為此等細胞中之 Wntl信號傳導已最大。已證明丫1\^211.31.57及丫贾210.09抗體對由双1^33及\^1^1 154875.doc -104- 201138823 引發之Wnt信號傳導具有互逆活性，亦對19種Wnt基因中在HEK293細胞中誘生超過2倍之螢光素酶報導體的另外11 種進行此分析。圖5提供資料彙總，使用10 gg/ml抗體、1〇 pg/ml Fzd8CRD進行檢測法。僅Wnt3a及Wnt3活性受 YW211.31.57抗體抑制，且皆被YW210.09增強。除Wntl之外的7種Wnt同功異型物被YW211.31.57增強且受YW210.09 抑制。第三類Wnt同功異型物（Wnt7a、7b及10a)展現不受任一抗體抑制且至少被YW211.3 1.57增強的信號傳導活性。在經不同Wnt同功異型物轉染之Hs578T細胞中，抗體展現多數此等相同活性。詳言之，丫貿211.31.57抑制^¥价3 及Wnt3a且增強所有11種誘生至少2倍的螢光素酶報導體之其他Wnt同功異型物。YW210.09亦增強Hs578T細胞中之 Wnt3及Wnt3a，而且抑制7種Wnt同功異型物中在HEK293 細胞中被拮抗且能夠在Hs578T細胞中被測試的5種。此類中之其他兩種Wnt同功異型物Wnt8a及Wnt9b在Hs578T細胞中不受YW210.09抗體影響。因為RNAi實驗表明Hs578T而非HEK293細胞中之Wnt3a信號傳導由LRP6及LRP5兩者轉導，所以Wnt 8a及Wnt9b可能在Hs578T細胞中主要經由 LRP5傳送信號》如在HEK293細胞中，第三類Wnt同功異型物在Hs587T細胞中不受任一抗體抑制，且可將不會在 HEK293細胞中誘導信號傳導的Wnt4添加至此類中。此類中僅Wnt7b活性表現不同，不同之處在於YW210.09抗體增強其在Hs578T而非HEK293細胞中的信號傳導。與 YW211.3 1.5 7及YW210.09抗體之Wnt同功異型物特異性活 154875.doc •105- 201138823 性相反，Fzd8CRD-Fc蛋白質可有效抑制所有Wnt之活性， HEK293細胞中之Wnt6及Wnt9b除外。在Hs578T細胞中， YW211.31.57及YW210.09抗體皆增強自分泌Wnt信號傳導，由Wnt4、Wnt7a及Wnt7b之表現誘導之信號傳導亦被增強。因此，此三種Wnt同功異型物為Hs578T細胞中之自分泌信號傳導驅動者的候選物。針對Wnt7b而非其他Wnt同功異型物之多種siRNA抑制 Hs578T細胞中之自分泌信號傳導，從而識別介導信號傳導之特異性Wnt蛋白質。因為PA-1細胞中之自分泌Wnt信號傳導受YW211.31.57抗體抑制且被YW210.09增強，所以 Wnt3或Wnt3a可能活化此等細胞中之内源信號傳導。實際上，針對Wnt3而非Wnt3a之siRNA抑制PA-1細胞中之自分泌Wnt信號傳導。在1<^1-1123 NSCLC細胞及M14黑素瘤細胞中’自分泌Wnt信號傳導被YW211.3 1抗體增強且被 YW210.09拮抗與Wnt2 RNAi抑制NCI-H23細胞中之内源信號傳導及M14細胞中之内源Wntl表現一致。使用多種 siRNA確認自分泌Wnt信號傳導需要NCI-H23細胞中之胃1^2表現及厘14細胞中之\¥1^1。因為自實例2之篩選分離的在受Wnt3a刺激之HEK293細胞中拮抗信號傳導的所有抗體亦抑制所測試之所有其他細胞株中之Wnt3 a刺激，且亦抑制畸胎上皮癌細胞株中之自分泌Wnt信號傳導’所以意外的是此等抗體在所測試之其他9種細胞株中增強自分泌Wnt信號傳導。此外， YW210.09抗體增強所有所測試細胞株中之Wnt3a信號傳導 154875.doc •106- 201138823 且加強7種細胞株中之自分泌Wnt信號傳導，但其抑制3種其他細胞株中之内源信號傳導。此等研究顯示不同Wnt同功異型物（在相同細胞株中表現）決定LRP6抗體之活性，且 Wnt3a拮抗劑及增強型抗體亦對多數其他Wnt蛋白質具有互逆作用。研究亦顯示向相同細胞株引入不同Wnt同功異型物決定LRP6抗體之活性，且Wnt3a拮抗劑及增強型抗體亦對多數其他Wnt蛋白質具有互逆作用。所測試之14種 Wnt同功異型物基於其與兩種LRP6抗體之功能性相互作用可分成三類：Wnt3及Wnt3a受YW211.31抑制且被 YW210.09增強；Wnt 1、2、2b、6、8a、9a、9b及 1 Ob被丫\^211.31增強且被丫\¥210.09拮抗；且\^1^4、7&、71?及 10a被YW211.31增強且不受YW210.09抑制（圖5)。此等分類不明顯對應於所提議之Wnt基因系統發育，但Wnt3/3a子族在進化上最分異（Cho等人，2010)。實例5

Wnt同功異型物限定LRP6抗體之不同活性不同Wnt同功異型物可優先結合内源表現於多個細胞株中之不同FZD同功異型物，且可以設想能解釋LRP6抗體之差異性活性。為了檢驗此可能性，建構共價連接不同Wnt-FZD對之嵌合蛋白質以測試特異性Wnt或FZD同功異型物是否決定LRP6抗體之活性。假定無内源Wnt表現存在下，與FZD4或FZD5融合之Wnt3a或Wnt 1有效活化HEK293細胞中之Wnt信號傳導，而過表現FZD4或FZD5不會誘導Wnt信號傳導。YW211.31.57抗體抑制與FZD4或FZD5融合之 154875.doc -107- 201138823

Wnt3a的信號傳導活性，且增強與FZD4或FZD5融合之 Wntl的活性（圖6提供資料彙總，使用10 pg/ml抗體、10 pg/ml Fzd8CRD進行檢測法）。YW210.09抗體顯示針對 Wntl嵌合體之互逆活性，抑制兩者。因此，抗體活性與 Wnt同功異型物而非FZD同功異型物有關。Fzd8CRD-Fc蛋白質對四種Wnt-FZD嵌合體中任一者誘導之信號傳導無影響，此與嵌合體獨立於Wnt之FZD結合位點起作用一致。使Wntl或Wnt3a與LRP6融合之嵌合體的表現對Wnt信號傳導之誘導比LRP6過表現有效得多。YW211.31.57& YW210.09抗體不能抑制此誘導，此符合抗體之抑制功能依賴於阻斷Wnt與LRP6結合的假設（圖6)。此研究確認Wnt而非FZD之同功異型物決定抗體之活性。Wnt同功異型物與LRP6而非FZD之嵌合蛋白融合物對 LRP0抗體之抑制不敏感，此表明拮抗作用可由阻斷配位體-輔助受體相互作用所介導。此係藉由活體外結合研究來確認：Wnt3a及YW210.09抗體兩者競爭性結合於LRP6之 E3-E4區内且Wnt9b及YW211.31抗體競爭結合於E1-E2區内。兩個LRP6抗體之抗原決定基各自界定不同類別的Wnt 同功異型物之結合位點，一個在E1-E2内且一個在E3-E4結構域内。預測既不受任一抗體抑制又不受其組合抑制的同功異型物具有至少第三Wnt結合位點，且四個重複結構域中每一者看起來可能結合Wnt同功異型物之不同子集。此模組化組織可能允許不同Wnt及其結合位點有結構離散度以分別適應Wnt結合及輔助受體結合拮抗劑（諸如SFRP及 154875.doc -108 * 201138823 DKK蛋白質同功異型物）的差異性調控β 實例6 抗體介導之Wnt信號傳導的增強涉及LRP6二聚 YW2 11.3 1抗體對自分泌Wnt信號傳導的增強作用需要親合力效應，大概由LRP6二聚來達成。在EKVX及Hs578T細胞中，在抑制此等細胞株中Wnt3 a誘導之信號傳導的漢度下，YW211.3 1之單價Fab片段及重組單臂YW211.3 1抗體展現不增強自分泌Wnt信號傳導❶相反，YW211.3 1 Fab片段及單臂mAb以與完整IgG抗體類似之效能抑制pa_丨畸胎上皮癌細胞株中之自分泌Wnt及Wnt3a誘導之信號傳導。為了測試單臂YW211.3 1抗體交聯是否會恢復全IgG分子之 Wnt增強功能’利用展現自分泌Wnt及Wnt2誘導之信號傳導被YW211.31.57抗體增強的HT-1080軟組織肉瘤細胞株’以及因Fc交聯增強之Apomab抗體誘導之細胞〉周亡 (Adams等人’ 2008)。單臂YW211.31抗體對自分泌Wnt信號傳導或由Wnt2轉染誘導之信號傳導無影響。在與增強 Apomab介導之細胞凋亡的抗Fc抗體交聯的條件下，測得單臂抗體之交聯部分復原關於YW211.3 1.57全抗體觀測到的對自分泌Wnt及Wnt2信號傳導兩者之增強作用。抗體介導之Wnt增強作用需要輔助受體二聚，因為單臂及Fab抗體型式除非交聯否則不能加強Wnt信號傳導。此外’本文呈現之基於細胞之生物化學資料表明Wnt與交聯 LRP6之結合亦為增強信號傳導所必需，此大概反映了需要在Wnt介導下使FZD募集至複合物中。一小部分過表現 154875.doc -109- 201138823 之LRP6可在細胞表面上作為均二聚體而被識別，且二聚需要胞外域，然而未明確此是否會促成由LRP6過表現誘導之與Writ無關的β-索烴素信號傳導（Liu等人，2003)。缺失LRP6胞外域亦以與Wnt無關之方式活化信號傳導，且藉由不同方法迫使此重組蛋白質發生胞外二聚會提高或抑制此活性（Liu等人，2003 ; Cong等人，2004)。Wnt在質膜處誘導LRP6聚集及構酸化’此皆需要胞内DVL蛋白質之均寡聚（homo-oligomerization)功能（Bilic等人，2007)。此等大聚集物亦含有Axin及GSK3，且可能抑制β_索烴素降解。實例7 在抗體介導下藉由抑制Wnt拮抗劑之結合增強Wnt信號傳導抑制胞外LRP6拮抗劑（諸如DKK1同功異型物及SOST)之活性亦可增強Wnt信號傳導（Niida等人，2004)。外源DKK1 蛋白質抑制HEK293細胞中Wntl誘導之信號傳導，且 YW2 11.3 1.57抗體可阻斷此拮抗作用且甚至在足夠高的濃度下在DKK1蛋白質存在下增強信號傳導（圖4G) ^相反， YW2 11.3 1單臂抗體在此等相同濃度下僅極弱地抑制wntl 信號傳導之DKK1拮抗作用。YW211.31.57全抗體在所測試之所有DKK1濃度下有效拮抗DKK1活性，而單臂抗體甚至在低DKK1濃度下亦具有最小作用或無作用。關於全 YW2 11.31抗體而非單臂YW211.31抗體觀測到之外源DKK1 活性的有效拮抗作用可能促成對全抗體特異之Wnt增強活性。或者，因為在此檢測法中DKK1蛋白質不能完全抑制 Wntl誘導之信號傳導，所以完整YW211.31抗體亦可能僅 154875.doc 201138823 經由LRP6二聚增強剩餘信號。因為DKK1與LRP6之相互作用的抗體抑制並非必然賦予 Wnt增強活性，且DKK1拮抗作用看似需要LRP6二聚，所以DKK1活性之抑制可能主要由與輔助受體結合之Wnt對剩餘信號傳導的增強作用所介導。實例8

Wnt信號傳導拮抗作用在LRP6抗體組合中佔優勢 φ 上述檢測法表明Wnt3a及Wnt3結合於LRP6之E1-E2區内且其結合受YW211.31.57抗體抑制。預測Wntl類中之Wnt 同功異型物結合E3-E4區，且此結合被YW210.09抗體阻斷。不受任一種理論約束，當Wnt同功異型物與抗體皆能結合同一 LRP6分子時可出現Wnt信號傳導之增強，此大概需要由Wnt募集FZD及由抗體使LRP6二聚。此模型預測兩種抗體之組合將會抑制任一類之Wnt同功異型物誘導之信號傳導，因為儘管仍將可能發生LRP6二聚，但一種或其 • 他抗體將會阻斷Wnt結合。如所預測，用YW211.3 1.57及 YW210.09抗體同時處理HEK293細胞會抑制由表現Wnt3a 或Wntl引發之信號傳導（圖7及8A)。在穩定整合有Wnt螢光素酶報導體之HEK293細胞中進行圖8A中所示之檢測法，其中該報導體已經Wnt3a、Wntl或Wnt3a與Wntl兩者之表現構築體轉染。所有抗體及蛋白質各按10 pg/ml使用。將此分析擴展至Wntl類之三種其他Wnt同功異型物，且發現YW211.3 1.57與YW210.09抗體之組合以與單獨 YW210.09類似之程度抑制Wnt信號傳導（圖7)。當同時表現 154875.doc -111 - 201138823

Wnt3a及Wntl兩者時，任一抗體均不拮抗Wnt信號傳導，但兩種抗體之組合不抑制信號傳導（圖8 A)。此結果之一種可能解釋為各抗體抑制僅一種Wnt同功異型物之結合，且兩種抗體皆能同時結合LRP6分子以阻斷兩個Wnt結合位點。不被YW2 11.3 1.5 7或YW2 10.09抗體拮抗的第三類之四種 Wnt同功異型物可能結合於LRP6上未被任一抗體阻斷之位點，或其可能具有結合於由抗體界定之任一 Wnt結合位點的能力。對於此等Wnt同功異型物中的每一者，兩種抗體之組合亦不會抑制其信號傳導，而是增強或不影響其活性，表明此等Wnt同功異型物可結合不同於YW211.31.57 及YW210.09抗原決定基之位點（圖7)。所觀測到的丫賈211.31.57及丫贾210.09抗體組合對由外源 Wnt同功異型物誘導之Wnt信號傳導的活性亦延伸至内源性自分泌Wnt信號傳導。在畸胎上皮癌細胞株PA-1及 Ntera-2中（其中YW211.31.57抗體抑制自分泌Wnt信號傳導且YW210.09增強自分泌Wnt信號傳導），抗體組合抑制信號傳導（圖2A)。在Hs578T及EKVX細胞中，若兩種抗體皆增強自分泌Wnt信號傳導，則抗體組合亦增強自分泌Wnt 信號傳導（圖8B及8C)。實例9 LRP6抗體有差異地抑制Wnt與多個位點結合 1^6抗體之互逆活性表明丫\¥211.31.57及¥〜210.09與 LRP0上之獨特Wnt同功異型物結合位點相互作用，且Wnt 154875.doc •112· 201138823 結合被拮抗劑抗體競爭但被增強型抗體允許。量測經純化 Wnt蛋白質與經純化、經固定之LRP6胞外域蛋白質片段之結合的生物膜層干涉法檢測法（參看實例1)證明Wnt3a結合於YW211.31.57抗體之抗原決定基所位於的LRP6之E3-E4 區，且Wnt9b(關於抗體相互作用與Wntl屬同一類別）僅結合於YW210.09抗體亦結合之E1-E2區（Bourhis等人. (2010))。YW211.31.57 抗體而非 YW210.09 抑制 Wnt3a 與 LRP6.E1-E4蛋白質片段之結合（圖9A)。相反，YW210.09 而非 YW211.31.57 抑制 Wnt9b 與 LRP6.E1-E4 結合（圖 9B)。在此等檢測法中，允許抗體與LRP6蛋白質之結合達到平衡，且顯示Wnt蛋白質結合之締合及解離相在干涉圖案中有隨後的波長移位。在抗體介導下對Wnt結合的抑制亦可使用較小Wnt結合片段（對於Wnt3a為E3-E4且對於Wnt9b為E1-E2)偵測（圖9C 及9D)。單臂YW211.31抗體亦可抑制Wnt3a與E3-E4片段結合。此外，YW211.31.57及YW210.09在無競爭下且當依任一順序添加時可依序結合於LRP6.E3-E4蛋白質（圖9E)。僅 Wnt3a與 YW211.31.57抗體之間以及僅 Wnt9b與 YW210.09 之間在LRP6蛋白質上之不同位點處的結合競爭與各抗體針對特異性Wnt同功異型物之信號傳導的抑制活性有關。生物膜層干涉法檢測先前顯示經純化DKK1蛋白質可結合LRP6之E3-E4及E1-E2片段兩者，且此結合可抑制Wnt3a 及Wnt9b與此等各別蛋白質區的結合。（Bourhis等人. (2010))。此檢測法用於顯示YW211.3 1.57及YW21 0.09抗體 154875.doc • 113 - 201138823 可各自抑制DKK1與LRP6.E1-E4蛋白質結合。YW211 31 57 抗體亦抑制DKK1與LRP6.E3-E4蛋白質結合，且YW21〇〇9 抗體阻斷DKK1與LRP6.E1-E2片段結合。單臂YW2U 3ι抗體完全保留此抑制活性，即使其不能增強Wnt信號傳導亦不能顯著拮抗外源DKK1對細胞中之Wnt信號傳導的活性亦如此《此結果表明DKK1拮抗作用可能不會顯著促成在抗體介導下對Wnt信號傳導的增強作用。實例10 LRP6抗體對Wnt驅動之腫瘤及骨形成具有活性為了開始研究LRP6抗體之抗腫瘤治療功效，處理琛价配位體驅動之腫瘤的兩個模型。MMTV-Wntl轉殖基因乳房腫瘤同種異體移植依賴於Wnt 1表現且Ntera_2人類畸胎上皮癌異種移植由未知Wnt同功異型物之自分泌Wnt信號傳導驅動（DeAlmeida等人’ 2007)。使用自MMTV-Wntl轉殖基因小鼠乳房腫瘤分離之細胞在無胸腺裸小鼠中形成腫瘤’該等小鼠每兩天以抗體處理一次。類似於Fzd8CRD_ Fc蛋白質’關於YW210.09抗體觀測到快速及持續的腫瘤消退（圖10A)。相較於對照緩衝液（PBS)或抗gD抗體處理， YW211.3 1.57抗體在此等條件下不會改變腫瘤生長。每兩天向小鼠投與30 mg/kg抗體或蛋白質（箭頭）（圖1〇A)。此等結果與上文關於組織培養物中處理之MMTV-Wntl腫瘤細胞之Wnt靶基因表現所述的抗體作用一致。

Ntera-2畸胎上皮癌細胞亦用於在無胸腺裸小鼠中形成異種移植腫瘤，該等小鼠用抗體或Fzd8CRD-Fc蛋白質處 154875.doc •114· 201138823 理。自用抗體 YW211.31.57、單臂 YW211.31或YW211.31.57 與YW210.09之組合處理之腫瘤提取的RNA顯示Wnt靶基因 SP5之表現降至來自注射緩衝液之對照小鼠的腫瘤程度的 41-57%，而Fzd8CRD-Fc蛋白質處理使SP5表現降至8.0%。根據相同腫瘤内之GAPDH mRNA含量校正SP5 mRNA含量，且另外根據經PBS處理之腫瘤作校正。相較於PBS對照組，除YW210.09之外的所有處理展現p值<0.005(藉由 ANOVA得知）。（圖 10B)。Fzd8CRD-Fc 使 Axin2表現降至僅 56.2%，且對於任何抗體處理均未偵測到Axin2表現有顯著變化。YW210.09抗體處理未顯著影響SP5或Axin2表現。關於在HEK293細胞中抑制或增強Wnt3a誘導之信號傳導而檢測的血清樣品確認所注射之抗體及蛋白質在16小時暴露期間保留至少一些活體内活性。因為活化或增強Wnt信號傳導可藉由加強成骨細胞分化及功能，且間接地藉由抑制姓骨細胞分化來提高骨量 (Glass等人，2005)，所以測試LRP6抗體針對器官型培養物中之小鼠顱蓋骨的活性。使微擷取顱蓋外植體與抗體或 RANK-Fc—起培養，接著藉由微電腦斷層攝影術分析頂骨體積及密度。使用對照樣品直方圖分析，確定鈣化（骨）及未鈣化（軟骨）組織之X射線衰減範圍。YW210.09抗體處理使鈣化頂骨之平均骨礦質密度（BMD)顯著提高7.4%，與關於RANK-Fc處理抑制蝕骨細胞分化所觀測到的6.8%之提高類似（圖10C ; Hsu等人，1999)。YW211.31.62抗體處理不會顯著改變鈣化頂骨BMD。所有處理均為10 pg/ml抗體或 154875.doc •115- 201138823 蛋白質持續7天。在圖10C中，資料點表示來自各處理組4 隻小鼠的8個半片顱蓋；平均值及平均值標準誤差分別顯不為水平線及垂直線。僅YW210.09及RANK-Fc處理與未處理樣品顯著不同，杜奈特測試顯示P值分別小於〇〇丨及 0.0 5 (藉由t測試得知，皆< 〇. 〇 5)。抗體或RANK-Fc處理未顯著改變總頂骨區（鈣化及未鈣化）之體積及此區域中鈣化骨之比例，表明YW21 〇.〇9抗體可增強礦化而不使細胞增殖總體發生變化。實例11 LRP6雙特異性抗體充當Pan_Wnt抑制劑使用杵·臼工程改造（Atwell等人，1997)，用YW211.3 1.62 及YW210.09重鏈雜二聚體建構雙特異性IgG雜交物。在大腸桿菌或HEK293細胞中產生之此LRP6雙特異性抗體拮抗 HEK293細胞（圖11A)及腫瘤細胞株PA-1、M14及CAL-51(圖11C)中Wnt3a誘導（0.1 pg/ml)之信號傳導。值得注意的是’雙特異性抗體至少與YW211.31—樣有效地抑制且不保留YW21 0.09之Wnt3a增強活性。雙特異性抗體亦抑制所測試之所有三種腫瘤細胞株中的自分泌Wnt信號傳導（圖 1 1B)，保留YW211.31抗體在PA-1細胞中及YW210.09在 Μ14細胞中之抑制活性。有趣的是，即使YW211.3 1增強 CAL-51乳癌細胞中之自分泌Wnt信號傳導且YW210.09對其無影響，雙特異性抗體亦抑制信號傳導。對於 YW211.31與YW210.09抗體之組合未觀測到此新穎的拮抗活性。在上述檢測法中’穩定整合有Wnt榮光素酶報導體 154875.doc -116- 201138823 之PA-1及M14細胞以及經報導體轉染之CAL-5 1細胞在有 (11C)或無（llB)O.l pg/ml Wnt3a刺激下用所指對照緩衝液 (PBS)、抗體、抗體組合或Fzd8CRD-Fc蛋白質（各1〇 μδ/ηι1) 處理。當針對ΗΕΚ293細胞中由轉染13種Wnt同功異型物誘導之信號傳導進行測試時，雙特異性抗體有效抑制由 YW211.31或YW210.09阻斷之所有Wnt(圖12)。表12中概示之檢測法測定抗體或蛋白質（10 Pg/rnl)對穩定整合有Wnt榮光素酶報導體之HEK293或Hs578T細胞株中由轉染评加同功異型物之表現構築體誘導之信號傳導的影響。將報導體活性根據細胞數目作校正且另外根據用相同表現構築體轉染但未經抗體或蛋白質處理之細胞中的程度作校正。抗§1) 用作對照組。當倍數變化值在對於對照抗gD抗體處理所觀測到的範圍之外時亦認為其相關：在HEK293細胞中抑制小於0_80且增強大於1.30，且在Hs578T細胞中抑制小於 0.65且增強大於1.30。類似於YW211.31與YW210.09抗體之組合，且不像任何單獨抗體，雙特異性抗體阻斷由Wnt 1與Wnt3 a之組合誘導之信號傳導（圖12)。出乎意料的是，雙特異性抗體亦減低不受單獨或組合之均二聚抗體抑制的三種Wnt之信號傳導。亦在Hs578T細胞中觀測到雙特異性抗體之此等拮抗活性’但對Wnt7a誘導之信號傳導缺乏影響可能除外。檢驗雙特異性抗體抑制在Wnt3a誘導下穩定化β_索煙素蛋白質之能力。以5 pg/ml濃度之YW211.31、YW210.09或 154875.do. •117· 201138823 雙特異性抗體、或對照Fzd8CRD-Fc蛋白質或抗gD處理經或未經Wnt3a轉染之HEK293細胞18小時，且藉由西方墨點分析測定β-索烴素蛋白質含量及磷酸化LRP5/6含量（圖 13Α)。在ΗΕΚ293細胞中，類似於YW211.31且不同於提高 β-索烴素程度之YW210.09，雙特異性抗體抑制在Wnt3a誘導下穩定化β-索烴素蛋白質（圖13 A)。雙特異性抗體及 YW211.31而非YW2 10.09抗體阻斷高分子量種類之磷酸化 LRP5/6的Wnt3a誘導。令人驚奇的是，儘管YW211.31及 YW210.09不影響總LRP6蛋白質之穩態含量，但雙特異性抗體在有或無Wnt3a誘導下增加LRP6蛋白質。在無Wnt刺激存在下，此穩定之LRP6可具有略微增加之Serl490磷酸化，但雙特異性抗體在無Wnt存在下不會影響HEK293細胞中之Wnt報導體活性。亦測定雙特異性抗體抑制活體内Wnt信號傳導之能力》向具有M14黑素瘤異種移植腫瘤之SCID-6g小鼠注射30 mg/kg LRP6雙特異性抗體、Fzd8CRD蛋白質（陽性對照）或抗gD抗體（陰性對照）。在處理16小時後，提取RNA且藉由 qPCR檢驗Wnt靶基因之表現。根據相同腫瘤内之GAPDH mRNA含量校正mRNA含量，且另外根據抗gD處理之腫瘤作校正。相較於抗gD對照組，所有雙特異性抗體及 Fzd8CRD處理展現p值<0.001(藉由ANOVA得知）。如圖13B 所示，LRP6雙特異性抗體抑制長成異種移植腫瘤之M14黑素瘤細胞中之Wnt信號傳導。自用抗體處理之腫瘤提取的 RNA顯示Wnt靶基因AXIN2及APCDD1之表現分別降至用 154875.doc • 118· 201138823 對照抗gD抗體處理之腫瘤t之程度的46_5 7%及35-38%。此等降低之表現程度類似於關於注射Fzd8CRD蛋白質所觀測到的程度，且表明雙特異性在活體内穩定且具有活性。實例12 LRP6 E1-YW210.09 Fab複合物之結構藉由分子置換法測定LRP6之第一 β螺旋槳結構及EGF結構域（亦稱為Ε1)與YW21 0.09 Fab之複合物的晶體結構，且 • 以分別為0.175及0.220之R及Rfree改進至1.9 A解析度。不對稱結晶單元由一個LRP6 E1結構域及一個YW210.09 Fab 構成。可解釋的電子密度允許追蹤El結構域之殘基Ala 20 至Lys 324’以及分別屬於Fab輕鍵及重鍵之殘基Asp 1至 Glu 213 及 Glu 1 至 Lys 214，但 Fab 重鏈殘基 Ser 127 至 Thr 131除外（全部使用Kabat編號）。使LRP6 E1結構域裝配在包含β螺旋槳結構模組及表皮生長因子（EGF)樣模組之模組架構中。β螺旋槳結構由由輻射 ® 狀排列之4股逆平行β片形成的6個葉片結構組成，其中]^末端邊緣朝向中心通道且YWTD基元位於各葉片結構之第二股中。儘官序列一致性僅為36%，但LRP6 Ε1 β螺旋槳結構接近類似於LDLr(Jeon，η.等人，2〇〇1)，當疊置於245 Ca 原子上時rrnsd為0.83 A。多數保守殘基集中於形成p片之 YWTD核心基元周目，此為p螺旋槳結構完整性所必需，而表面殘基極其多樣，促成此等受體之功能多樣性。 LRP6使用其EGF樣結構域鎖住螺㈣結構之第—及第六葉片，·u•維持其機械強度。EGF樣m請殘基的連接 154875.doc •119· 201138823 子自β螺旋槳結構之c末端伸出，且向後摺疊至p螺旋槳結構底側，對接至第三與第四葉片結構之間的表面。如由 1226人2之大總内埋表面積及〇 74之形狀互補性所指示， EGF與β螺旋槳結構之間的相互作用為廣泛的。EGF模組之第一 β股中的三個殘基Leu 296、Leu 298及Met 299構成包納於β螺旋槳結構之互補腔内的疏水性核心，經由一些直接相互作用或水介導之極性相互作用被包圍。LDLR結構中亦觀測到此等特徵（jeon，H等人，2〇〇1 ; Rudenk〇，G等人，2002)。 YW210.09 Fab識別β螺旋槳結構頂部中心之區域，此為經常發現與蛋白質.蛋白質相互作用有關的區域（Springer， T. A.，1998)。互補位（paratope)由來自5個CDR之殘基構成’包括三個重鏈CDR(H1、H2、H3)及兩個輕鍵CDR(L1 及L3)。抗體與β螺旋槳結構結合内埋1691入2之總面積，形狀互補性分數為0.7 6。β螺旋槳結構頂部表面上之酸性路徑大約佔據總面積的1 /3，但僅與YW210抗原決定基重疊。相反’重鏈與輕鏈識別個別區域^由重鏈CDR形成之直接接觸表示80%内埋面積，單獨之CDR Η3佔50%以上。此區段由17個殘基構成，該等殘基中，殘基His 98至Lys 100c與β螺旋槳結構形成直接接觸。重要的是，抗體之Asn 100與LRP6之Asn 185產生一對氫鍵，形成「交握型」相互作用（圖16)。此外，Val 100b及Lys 100c主鏈異常構形使與 LRP6之Arg 28相互作用的羰基置於後部，且使經由兩個水分子（Watl及Wat2)與酸性路徑相互作用之兩個NH基團置 154875.doc •120· 201138823 於前部（圖14)。Lys 100c側鏈亦藉由與LRP6之Val 7〇及Ser 96主鏈羰基氫鍵結合而中和酸性路徑。LRP6之Arg 141錨定於中部且與橋接水Wat2、LRP6之Asn 185及YW210.09之 Ala 100a相互作用。Arg 141看似將兩個氫鍵網狀結構整合在一起。此外，Val 100b側鏈對接至β螺旋槳結構之中心通道的疏水性腔中。因此，YW210.09 Η3序列NAVK展現與LRP6之β螺旋槳結構Ε1的特別結合模式。其他CDR與β 螺旋槳結構頂部參數之殘基相互作用》與Η3與LRP6結合有關之其他殘基包括Ε51、D52、V70、S71、Ε73、L95、 S96、D98及Ε115。Η1及Η2接觸第五及第六葉片結構，而 L1及L3接觸第六、第一及第二葉片結構（圖15)。與 YW210.09與LRP6結合有關之其他LRP6殘基包括R29、 W188、Κ202、Ρ225、Η226、S243 及 F266 ° 晶體堆疊相互作用不與YW210.09接觸LRP6抗原決定基的區域直接相關，表明晶體結構應反映兩個分子如何在溶液中相互作用。獨特CDR Η3 NAVKN (SEQ ID NO: 49)基元與 LRP6 Ε1 β螺旋槳結構之間的相互作用與所報導的介於Laminin與 Nidogen之間的相互作用高度類似（Takagi，J.等人， 2003)。在兩種情形中，經由上文所述之Asn交握及分支鏈疏水性殘基進入由β螺旋槳結構中心通道之頂部形成的疏水性腔中來形成顯著接觸，其中兩個螺旋槳結構中之疏水性腔皆由Phe擋板結構封閉。人類Dkkl呈現除了 lie 42之外與YW210.09之CDR H3環中發現之基元相同的基元（胺基酸 40至44 : NAIKN (SEQ ID NO: 50))。此基元在物種及除 154875.doc • 121 - 201138823

Dkk3之外的家族成員之間嚴格保守，表明Dkk生物學中此基元之特定功能。在Dkkl之N末端上發現保守基元，此為先前未考慮（Brott, Β· K.及Sokol，S. Y.，2002)且經預測無序之區域。此外，此特定基元在經由與LRP5/6相互作用調控Wnt信號傳導的兩個其他蛋白質中亦保守，該兩個其他蛋白質亦即 Sclerostin(Semenov，Μ.等人 ’ 2005)及 Wise (Itasaki，Ν·等人，2003)。此兩個蛋白質與半胱胺酸結蛋白屬於同一超家族（McDonald，N. Q.及Hendrickson, W. Α·， 1993)且在其第2環中展現識別之基元，亦稱為此保守摺疊之「後部」（Lintern，K. B.等人，2009 ; Veverka，V.等人， 2009)。實例13 例示性抗LRP6抗體序列表中提供某些抗LRP6抗體之胺基酸序列。表2-4提供該等序列之說明。表2 重鍵及輕键 SEQID 說明 SEQIDNO: 1 YW211.31 重鏈 SEQ ID NO: 2 YW211.31 輕鏈 SEQID NO: 3 YW211.31.57 重鏈 SEQ ID NO: 4 YW211.31.57 輕鏈 SEQ ID NO: 5 YW211.31.62 重鏈 SEQ ID NO: 6 YW211.31.62 輕鏈 SEQ ID NO: 7 YW210.09 重鏈 SEQ ID NO: 8 YW210.09 輕鏈 154875.doc -122- 201138823 表3 重鏈及輕鍵可變區 SEQID 說明 SEQ ID NO: 9 YW211.31重鏈可變區 SEQID NO: 10 YW211.31 ； YW211.03 ； YW211.08 ； YW211.il ； YW211.12 ; YW211.33 ; YW211.31.35輕鏈可變區 SEQ ID NO: 11 YW211.31.57重鏈可變區 SEQ ID NO: 12 YW211.31.57 ; YW211.31.il ; YW211.31.35輕鏈可變區 SEQ ID NO: 13 YW211.31.62重鏈可變區 SEQ ID NO: 14 YW211.31.62輕鏈可變區 SEQ ID NO: 15 YW210.09重鏈可變區 SEQ ID NO: 16 YW210.09輕鏈可變區 SEQ ID NO: 51 YW211.03重鏈可變區 SEQ ID NO: 52 YW211.08重鏈可變區 SEQ ID NO: 53 YW211.il重鏈可變區 SEQ ID NO: 54 YW211.12重鏈可變區 SEQ ID NO: 55 YW211.33重鏈可變區 SEQ ID NO: 56 YW211.31.il重鏈可變區 SEQ ID NO: 57 YW211.31.35重鏈可變區 SEQ ID NO: 58 YW211.31.il輕鏈可變區

表4

重鏈及輕鏈HVR SEQID NO: 17 YW211.31 HVR-H1 ； YW211.31.57 HVR-H1 SEQ ID NO: 18 YW211.31HVR-H2 ； YW211.31.57 HVR-H2; YW211.31.62 HVR-H2 SEQ ID NO: 19 YW211.31HVR-H3 ； YW211.31.62 HVR-H3 SEQ ID NO: 20 YW211.31.62HVR-H1 SEQ ID NO: 21 YW211.31.57HVR-H3 154875.doc -123 - 201138823 SE〇 ID NO: 22 YW210.09 HVR-H1 SEQ ID NO: 23 YW210.09 HVR-H2 SEQ ID NO: 24 YW210.09 HVR-H3 SEQ ID NO: 25 YW211.31HVR-L1 ； YW211.31.57 HVR-L1; YW211.31.62 HVR-L1 ； YW210.09 HVR-L1 SEQ ID NO: 26 YW211.31 HVR-L2 ； YW211.31.57 HVR-L2; YW211.31.62 HVR-L2 ； YW210.09 HVR-L2 SEQ ID NO: 27 YW211.31 HVR-L3 ； YW211.31.62 HVR-L3 ； YW210.09 HVR-L3 SEQ ID NO: 28 YW211.31.57 HVR-L3 儘管上文已為了理解清晰性目的而以圖表及實例之方式相當詳細地描述了本發明，但該等描述及實例不應理解為限制本發明範疇。本文中引用之所有專利及科學文獻的揭示内容明確以引用的方式全部併入本文中。參考文獻

Adams C, Totpal K, Lawrence D, Marsters S, Pitti R, Yee S, Ross S, Deforge L, Koeppen H, Sagolla M, Compaan D, Lowman H, Hymowitz S, Ashkenazi A. Structural and functional analysis of the interaction between the agonistic monoclonal antibody Apomab and the proapoptotic receptor DR5. Cell Death Differ. 2008年4月；15(4):751-61. 2008年 1 月25曰電子出版物。

Akiri G, Cherian MM, Vijayakumar S, Liu G, Bafico A, Aaronson SA. Wnt pathway aberrations including autocrine Wnt activation occur at high frequency in human non-small-cell lung carcinoma. Oncogene. 2009 年 5 月 28 曰；28(21): 2163-72. 2009年4月20日電子出版物。 154875.doc -124- 201138823

Bafico A, Liu G, Goldin L, Harris V, Aaronson SA. An autocrine mechanism for constitutive Wnt pathway activation in human cancer cells. Cancer Cell· 2004年 11 月；6(5):497-506。

Bilic J, Huang YL, Davidson G, Zimmermann T, Cruciat CM, Bienz M, Niehrs C. Wnt induces LRP6 signalosomes and promotes dishevelled-dependent LRP6 phosphorylation. Science. 2007年 6 月 15 日；316(5831):1619-22。

Binnerts ME, Tomasevic N, Bright JM, Leung J, Ahn VE, Kim KA, Zhan X, Liu S, Yonkovich S, Williams J, Zhou M, Gros D, Dixon M, Korver W, Weis WI, Abo A. The first propeller domain of LRP6 regulates sensitivity to DKK1. Mol Biol Cell. 2009年 8 月；20(15):3552-60. 2009年 5 月 28 曰電子出版物。

Bourhis E, Tam C, Franke Y, Bazan JF, Ernst J, Hwang J, Costa M, Cochran AG, Hannoush RN. Reconstitution of a Frizzled8-Wnt3a-LRP6 Signaling Complex Reveals Multiple Wnt and Dkkl Binding Sites on LRP6. J Biol Chem. 2010年 3月19日；285(12):9172-9. 2010年1月21日電子出版物。 Brott，B. K.及 Sokol，S. Y. (2002) Mol Cell Biol 22, 6100-6110 。

Cho SJ, Valles Y, Giani VC Jr, Seaver EC, Weisblat DA. Evolutionary dynamics of the Wnt gene family: a lophotrochozoan perspective· Mol Biol Evol. 2010年 2 月 22 日。[電子出版物 h 154875.doc •125· 201138823 先於印刷版]

Cong F, Schweizer L, Varmus H. Wnt signals across the plasma membrane to activate the beta-catenin pathway by forming oligomers containing its receptors, Frizzled and LRP. Development. 2004年 10月；131(20):5103-15。

Cselenyi CS, Jernigan KK, Tahinci E, Thorne CA, Lee LA, Lee E. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of beta-catenin. Proc Natl Acad Sci USA. 2008年6月10日；105(23):8032-7. 2008年5月28日電子出版物。

Cunningham SA, Stephan CC, Arrate MP, Ayer KG, Brock TA. Identification of the extracellular domains of Flt-1 that mediate ligand interactions. Biochem Biophys Res Commun. 1997年 2 月 24 曰；231(3):596-9。

Davis-Smyth T, Chen Η, Park J, Presta LG, Ferrara N. The second immunoglobulin-like domain of the VEGF tyrosine kinase receptor Flt-1 determines ligand binding and may initiate a signal transduction cascade. EMBO J. 1996年 9 月 16 日；15(18):4919-27。

DeAlmeida VI, Miao L, Ernst JA, Koeppen H, Polakis P, Rubinfeld B. The soluble wnt receptor Frizzled8CRD-hFc inhibits the growth of teratocarcinomas in vivo. Cancer Res. 2007年 6月 1 曰；67(1 1):5371-9。 154875.doc -126- 201138823

Glass DA 2nd, Bialek P, Ahn JD, Starbuck M, Patel MS, Clevers H, Taketo MM, Long F, McMahon AP, Lang RA, Karsenty G. Canonical Wnt signaling in differentiated osteoblasts controls osteoclast differentiation. Dev Cell. 2005年 5 月；8(5):751-64 °

Guo Y, Xie J, Rubin E, Tang YX, Lin F, Zi X, Hoang BH. Frzb, a secreted Wnt antagonist, decreases growth and invasiveness of fibrosarcoma cells associated with inhibition of Met signaling. Cancer Res. 2008年 5 月 1 日；68(9):3350-60 °

Hsu H, Lacey DL, Dunstan CR, Solovyev I, Colombero A, Timms E, Tan HL, Elliott G, Kelley MJ, Sarosi I, Wang L, Xia XZ, Elliott R, Chiu L, Black T, Scully S, Capparelli C, Morony S, Shimamoto G, Bass MB, Boyle WJ. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 年 3 月 30 曰；96(7):3540-5。

Itasaki, N., Jones, C. M., Mercurio, S., Rowe, A., Domingos, P. M., Smith, J. C.及 Krumlauf，R. (2003) Development 130, 4295-4305 0

Jeon H, Meng W, Takagi J, Eck MJ, Springer TA, Blacklow SC. Implications for familial hypercholesterolemia from the structure of the LDL receptor YWTD-EGF domain 154875.doc -127- 201138823 pair. Nat Struct Biol. 2001 年 6月；8(6):499-504。

Lintern，K. B·，Guidato，S.，Rowe，A.，Saldanha，J. W.及 Itasaki，N. (2009) J Biol Chem 284, 23159-23168。

Liu G, Bafico A, Harris VK, Aaronson SA. A novel mechanism for Wnt activation of canonical signaling through the LRP6 receptor. Mol Cell Biol.(2003) 16:5825-35 o

Liu BY，Soloviev I，Chang P，Lee J，Huang X等人，

(2010) Stromal cell-derived factor-l/CXCL12 contributes to MMTV-Wntl tumor growth involving Grl + CDllb+ cells. PLoS One (2010) 5 (1):1-13; e8611。

McDonald, N. Q.及 Hendrickson, W. A. (1993) Cell 73, 421-424 °

Mi K, Dolan PJ, Johnson GV. The low density lipoprotein receptor-related protein 6 interacts with glycogen synthase kinase 3 and attenuates activity. J Biol Chem. 2006年 2 月 24

曰；281(8):4787-94. 2005年12月19日電子出版物。

Mohammad KS, Chirgwin JM, Guise ΤΑ. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods Mol Biol. 2008;455:37-50。

Niida A, Hiroko T, Kasai M, Furukawa Y, Nakamura Y, Suzuki Y, Sugano S, Akiyama T. DKK1, a negative regulator of Wnt signaling, is a target of the beta-catenin/TCF pathway. Oncogene. 2004年11月 4 曰；23(52):8520-6 °

Nguyen DX, Chiang AC, Zhang XH, Kim JY, Kris MG, 154875.doc -128- 201138823

Ladanyi M, Gerald WL, Massague J. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 2009年 7月 10 日；138(1):51-62. 2009年 7月 2曰電子出版物。

Piao S, Lee SH, Kim H, Yum S, Stamos JL, Xu Y, Lee SJ, Lee J, Oh S, Han JK, Park BJ, Weis WI, Ha NC. Direct inhibition of GSK3beta by the phosphorylated cytoplasmic domain of LRP6 in Wnt/beta-catenin signaling. PLoS One. 2008;3(12):e4046. 2008年 12月 24 曰電子出版物。

Quarto N, Wan DC, Kwan MD, Panetta NJ, Li S, Longaker MT. Origin Matters: Differences in Embryonic Tissue Origin and Wnt Signaling Determine the Osteogenic Potential and Healing Capacity of Frontal and Parietal Calvarial Bones. J Bone Miner Res. 2009年 11 月 23 日。[電子出版物先於印刷版]

Rebay I, Fleming RJ, Fehon RG, Cherbas L, Cherbas P, Artavanis-Tsakonas S. Specific EGF repeats of Notch mediate interactions with Delta and Serrate: implications for Notch as a multifunctional receptor. Cell. 1991年 11月 15 曰；67(4):687-99 °

Rudenko, G., Henry, L., Henderson, K., Ichtchenko, K., Brown, M. S·，Goldstein，J. L.及 Deisenhofer，J· (2002) Science 298, 2353-2358 °

Schwarz-Romond T, Metcalfe C, Bienz M. Dynamic 154875.doc -129- 201138823 recruitment of axin by Dishevelled protein assemblies. J Cell Sci. 2007年 7月 15 日；120(Pt 14):2402-12。

Semenov MV, Tamai K, Brott BK, Kiihl M, Sokol S, He X. Head inducer Dickkopf-1 is a ligand for Wnt coreceptor LRP6. Curr Biol. 2001 年 6 月 26 日；11(12):951-61。

Semenov, Μ.，Tamai，K.及 He，Χ· (2005) J Biol Chem 280, 26770-26775 0

Springer, T. A. (1998) J Mol Biol 283, 837-862。

Takagi，J.，Yang, Y.，Liu，J. H.，Wang，J. H.及 Springer, I\ A. (2003) Nature 424, 969-974。

Tamai K, Semenov M, Kato Y, Spokony R, Liu C, Katsuyama Y, Hess F, Saint-Jeannet JP, He X. LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction. Nature. 2000年 9月 28 曰；407(6803):530-5 °

Tamai K，Zeng X，Liu C，Zhang X，Harada Y，Chang Z， He X. A mechanism for Wnt coreceptor activation. Mol Cell. 2004年 1 月 16 日；13(1):149-56。 van Amerongen R, Nusse R. Towards an integrated view of Wnt signaling in development. Development. 2009年 10 月；136(19):3205-14 〇 Veverka，V.，Henry，A. J.，Slocombe， P. M., Ventom, A., Mulloy, B., Muskett, F. W., Muzylak, M·，Greenslade, K.，Moore, A., Zhang, L., Gong, J., Qian, X·，Paszty, C·, Taylor, R. J.，Robinson，Μ. K.及 Carr, M. D· (2009) J Biol Chem 284, 10890-10900。 154875.doc •130- 201138823

Veverka, V., Henry, A. J., Slocombe, P. M., Ventom, A., Mulloy, B., Muskett, F. W., Muzylak, M., Greenslade, K., Moore, A., Zhang, L., Gong, J” Qian, X., Paszty, C., Taylor, R. J., Robinson, Μ. K. A Carr, M. D. (2009) J Biol Chem 284, 10890-10900。

Wu G, Huang H, Garcia Abreu J, He X. Inhibition of GSK3 phosphorylation of beta-catenin via phosphorylated PPPSPXS motifs of Wnt coreceptor LRP6。PLoS One. 2009;4(3):64926.2009年3月18日電子出版物。

Yasui N, Mihara E, Nampo M, Tamura-Kawakami K, Unno H，Matsumoto K, Takagi J. Detection of endogenous LRP6 expressed on human cells by monoclonal antibodies specific for the native conformation. J Immunol Methods. (2010) 1 月 31 日；352(1-2):153-60. 2009 年 11 月 26 日電子出版物。

Ye, X.等人，The Norrin/Frz4 signaling pathway in retinal vascular development and disease. (2010) Trends Mo/ Med. 16, 417-425 °

Zhang Y, Appleton BA, Wiesmann C, Lau T, Costa M, Hannoush RN，Sidhu SS. Inhibition of Wnt signaling by Dishevelled PDZ peptides. Nat Chem Biol· 2009 年 4 月； 5(4):217-9. 2009年3月1日電子出版物。

Zeng X, Huang H, Tamai K, Zhang X, Harada Y, Yokota C, Almeida K, Wang J, Doble B, Woodgett J, Wynshaw- 154875.doc -131 - 201138823

Boris A, Hsieh JC, He X. Initiation of Wnt signaling: control of Wnt coreceptor Lrp6 phosphorylation/activation via frizzled, dishevelled and axin functions. Development. 2008年1月；135(2):367-75. 2007年12月12日電子出版物》

Zhou H, Mak W, Kalak R, Street J, Fong-Yee C, Zheng Y, Dunstan CR, Seibel MJ. Glucocorticoid-dependent Wnt signaling by mature osteoblasts is a key regulator of cranial skeletal development in mice. Development. 2009 年 2 月； 136(3):427-36.

Zoltewicz JS, Ashique AM, Choe Y, Lee G, Taylor S, Phamluong K, Solloway M, Peterson AS. Wnt signaling is regulated by endoplasmic reticulum retention. PLoS One. 2009年 7月 10 日；4(7):e6191。【圖式簡單說明】圖1A為顯示針對LRP6.E3-E4蛋白質之抗體對在HEK293 細胞中由0.1 mg/ml經純化Wnt3a誘導之Wnt勞光素酶報導體活性之抑制作用的圖。圖1B為關於未經刺激抑或由Wnt3a誘導且用所指LRP6抗體或經純化蛋白質處理之HEK293細胞的西方墨點分析結果。圖1C為顯示YW210.09抗體以與HEK293細胞中之Wnt3a 濃度成比例的方式增強Wnt報導體基因活性的圖。圖2A為顯示對在經螢光素酶報導體轉染及用LRP6抗體 (個別或組合）或Fzd8CRD-Fc蛋白質處理之PA-1畸胎上皮癌 154875.doc -132- 201138823 細胞中的自分泌Wnt信號傳導之濃度依賴性抑制及增強作用的圖。圖2B為顯示關於在用或未用0.3 mg/ml Wnt 3a蛋白質處理且用10 mg/ml YW211.31抗體、抗gD單株抗體（陰性對照）或Fzd8CRD-Fc蛋白質（陽性對照）處理的PA-1細胞中Wnt 誘導型基因SAX1及GAD1以及Wnt抑制型基因LEFTY2的 qPCR表現分析之結果的圖。根據來自未添加（NA)Wnt3a之細胞的樣品权正數據。圖3為顯示LRP6抗體及Fzd8CRD-Fc蛋白質對細胞株中之自分泌信號傳導之影響的彙總表。圖4A為展示關於AXIN2 mRNA於在有及無（NA)0.2 pg/ml Wnt3a 下經 25 pg/ml YW211.31.57 抗體或 Fzd8CRD-Fc 蛋白質處理之四種細胞株中的qPCR表現分析結果之圖。圖4B為展示Wnt誘導型基因於NCI-H23細胞中之表現被 YW211.3 1·57增強及被YW210.09抗體（3 0μg/ml)拮抗的圖。CD4-Fc蛋白質（30 pg/ml)用作陰性對照。圖4C為展示Wnt誘導型基因於M14細胞中之表現被丫買211.31.57增強及被丫\¥210.09抗體（30 pg/ml)拮抗的圖。圖4D為顯示YW211.3 1.57抗體在穩定整合有Wnt螢光素酶報導體之Hs578T細胞中對Wnt3a刺激之信號傳導的濃度依賴性抑制作用的圖。圖4E為顯示YW211.31.57抗體在穩定整合有Wnt螢光素酶報導體之Hs578T細胞中對自分泌Wnt信號傳導的濃度依 154875.doc -133- 201138823 賴性增強作用的圖。圖4F為顯示經Wnt螢光素酶報導體轉染之EKVX細胞展現YW211.31.57抗體增強自分泌Wnt信號傳導（NA)及拮抗 Wnt3a誘導之信號傳導的圖。圖4G為顯示抗體介導之自分泌Wnt信號傳導的增強受5 pg/ml Fzd8CRD-Fc蛋白質抑制的圖。圖5為關於10 mg/ml LRP6抗體或Fzd8CRD-Fc蛋白質對穩定整合有Wnt螢光素酶報導體之HEK293或Hs578T細胞株中由轉染Wnt同功異型物之表現構築體誘導之信號傳導的影響的彙總表。將Wnt螢光素酶報導體之表現根據細胞數目作校正，且另外根據轉染相同表現構築體但未經蛋白質處理之細胞中的程度作校正。圖6為關於10 mg/ml LRP6抗體或Fzd8CRD-Fc蛋白質對穩定整合有Wnt螢光素酶報導體之HEK293細胞株中的信號傳導之影響的彙總表。藉由轉染由Wnt同功異型物與fzd 同功異型物或LRP6融合組成的嵌合蛋白質之表現構築體誘導該信號傳導。將Wnt螢光素酶報導體之表現根據細胞數目作杈正，且另外根據轉染相同表現構築體但未經蛋白質處理之細胞中的程度作校正。圖7為關於1G mg/ml LRp6抗體或抗體組合對穩定整合有 Wnt勞光素酶報導體之細胞株中由轉染同功異型物之表現構築體誘導之信號傳導的影響的囊總表。將㈣勞光素酶報導體之表現根據細胞數目作校正，且另外根據轉染相同表現構築體但未經蛋白質處理之細胞中的程度作校 154875.doc •134· 201138823 正。圖8 A為顯示YW211.31.5 7與YW2 10.09抗體之組合抑制穩定整合有Wnt螢光素酶報導體之HEK293細胞中之信號傳導的圖，其中該等細胞已經轉染以表現Wnt3a、Wntl或 Wnt3a與Wntl兩者。對Wnt信號傳導之抑制而言，所示抗 gD抗體及Fzd8CRD-Fc蛋白質分別作為陰性及陽性對照物。圖8B為顯示YW2 11.3 1.57與YW210.09抗體之組合增強 Hs578T細胞中之自分泌Wnt信號傳導的圖。圖8C為顯示YW211.31.57與YW210.09抗體之組合增強 EKVX細胞中之自分泌Wnt信號傳導的圖。圖9A及9B為使用固定於抗生蛋白鏈菌素生物感測器上之經生物素標記之LRP6 E1-E4蛋白質的生物膜層干涉法檢測結果，其表明YW211.31.57抗體抑制Wnt3a及Wnt9b與 LRP6結合且YW210.09抗體僅抑制Wnt9b結合。圖9C為使用較小之非重疊LRP6片段之生物膜層干涉法檢測結果，其顯示Wnt3a結合於E3-E4區，且此相互作用被完整抑或單臂YW211.31抗體阻斷。圖9D為使用較小之非重疊LRP6片段之生物膜層干涉法檢測結果，其顯示YW210.09抗體結合LRP6 E1-E2蛋白質片段且與Wnt9b結合競爭。圖9£為顯示丫^¥211.31.57及丫^¥210.09抗體當以任一順序依序添加時可一起結合於固定LRP6.E1-E4蛋白質，從而確認各別抗原決定基的生物膜層干涉法檢測結果。 154875.doc -135- 201138823 圖10A為顯示類似於關於Fzd8CRD-Fc蛋白質觀測到的結果’當用YW210.09抗體處理小鼠時MMTV-Wntl同種異體腫瘤生長消退的圖。圖10B為顯示在用完整或單臂Yw2ii.31抗體處理之小鼠中藉由qPCR分析得知Ntera-2異種移植腫瘤展現SP5 mRNA 表現降低但YW210.09抗體並非如此的圖。圖10C為顯示類似於raNK-Fc蛋白質處理，用YW210.09 抗體處理所培養之小鼠顱蓋外植體會顯著增加鈣化頂骨之骨礦質密度（BMD)但YW211.31.62抗體並非如此的圖。圖11A為顯示大腸桿菌或HEK293細胞中所產生之雙特異性抗LRP6抗體類似地在由〇.1 yg/ml經純化Wnt3a誘導之 HEK293細胞中以濃度依賴性方式抑制Wnt螢光素酶報導體活性的圖。1(：5()值分別為〇.〇32及〇.〇14 4§/1111。圖11B為顯示用所指對照緩衝液（pBS)、抗體、抗體組合或Fzd8CRD-Fc蛋白質（各1〇叫/〇11)處理對穩定整合有Wnt 螢光素酶報導體之PA-1及Μ14細胞以及經報導體轉染之 CAL-51細胞中的自分泌Wint信號傳導之影響的圖，其中該等細胞均在有（C)或無（3)0」μ§/πιι Wnt3a刺激下用所指對照緩衝液（PBS)、抗體、抗體組合或Fzd8CRD_Fc蛋白質 (各 10 pg/ml)處理。圖1 ic為顯示用所指對照緩衝液（pBS)、抗體、抗體組合或Fzd8CRD-Fc蛋白質（各1〇 μ§/ιη1)處理對在〇」μ§/ιη1

Wnt3a刺激下穩定整合有Wnt螢光素酶報導體之pA1&Mi4 細胞以及經報導體轉染之cal_51細胞的影響的圖。 154875.doc •136· 201138823 圖12為關於抗體或Fzd8CRD蛋白質（10 pg/ml)對穩定整合有Wnt螢光素酶報導體之HEK293或Hs578T細胞株中由轉染Wnt同功異型物之表現構築體誘導之信號傳導的影響的彙總表。圖13A為關於經或未經Wnt3a轉染及用所指抗體或 Fzd8CRD-Fc蛋白質（5 pg/ml)處理18小時之HEK293細胞的西方分析結果。所示β-肌動蛋白或GAPDH蛋白質含量分別作為上部及下部凝膠之樣品内參照。圖13Β為顯示在以30 mg/kg LRP6雙特異性抗體或 Fzd8CRD蛋白質處理16小時之SCID-0g小鼠中藉由qPCR分析得知M14異種移植腫瘤展現AXIN2及APCDD1 mRNA表現降低但對照抗gD抗體並非如此的圖。圖14為CDR H3與LRP6溝槽結構（groove)之殘基之相互作用的詳細視圖，其顯示由NAVK基元形成之相互作用的重要網狀結構。圖15為由CDR HI、H2、LI、L2及L3形成之相互作用的詳情。圖16為顯示Kabat CDR之例示性抗LRP6抗體之重鏈可變區（VH)。圖17為顯示Kabat CDR之例示性抗LRP6抗體之輕鏈可變區（VL)。 154875.doc -137- 201138823 序列表 <11〇>美商建南德克公司 <120> 抗-0«>6抗體 <130> P4430R1 <140〉 100109985 <141> 2011-03-23 <150> 61/317,137; 61/394,836 <151> 2010-03-24; 2010-10-20

<160〉 58 <170> Patentln version 3.5 <210〉 1 <211〉 456 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400〉 1

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Glu lie Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

S 154875-序列表.doc 201138823

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro lie Arg Leu His Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He 195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240 2·

154875·序列表.doc 201138823

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asa Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340 345 350

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 355 360 365

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415 154875-序列表.doc 201138823

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210〉 2 <211> 214 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 <400> 2

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 •4 154875·序列表.doc 201138823

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 3 〈211〉 456 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成多肽 <400> 3 154875-序列表.doc 201138823

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Glu He Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro He Arg Leu Tyr Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175 154875-序列表.doc 201138823

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340 345 350 154875-序列表.doc 201138823

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 355 360 365

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 <210> 4 <211〉 214 <212〉 PRT <213〉人工序列〈220> 〈223>合成多肽 <400> 4

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 154875·序列表.doc 201138823

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Leu Pro Thr

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 -9- 154875-序列表.doc 201138823

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 5 <211> 456 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400〉 5

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Tyr 20 25 30

Tyr lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Glu lie Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro lie Arg Leu His Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110 10· 154875-序列表doc 201138823

Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He 195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285 -11 - 154875-序列表.doc 201138823

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335

Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340 345 350

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 355 360 365

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380

Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 12- 154875-序列表 _doc 201138823 <210〉 6 <211〉 214 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多狀 <400> 6

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 -13- 154875-序列表.doc 201138823

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 195 200

Val Thr Lys Ser 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 7 <211〉 456 <212> PRT 〈213>人工序列<220> 〈223〉合成多肽 <400> 7 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 1 5 10

Gin Pro Gly Gly 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Ser 20 25 30

Tyr lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 154875_ 序列表.doc 14· 201138823

Gly Trp lie Thr Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Ser Gly His Val Asn Ala Val Lys Asn Tyr Gly Tyr Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie 195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 210 215 220 •15· 154875-序列表 _doe 201138823

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin 290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin 305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 325 330 335

Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro 340 345 · 350

Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 355 360 365

Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380

Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400 16-

154875·序列表.doc 201138823

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe 420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys 435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455

<210〉 8 <211〉 214 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 <400> 8

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 17- 154875-序列表.doc 201138823

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110

Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140

Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210〉 9 <211〉 118 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 18-

154875-序列表.doc 201138823 <223〉合成多肽 <400〉 9

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

Ala Glu lie Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro lie Arg Leu His Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115 <210〉 10 <211〉 108 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 19· 154875-序列表.doc 201138823 <400〉 10

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210〉 11 〈211〉 118 <212〉 PRT 〈213>人工序列 <220> <223〉合成多肽 <400〉 11

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 -20-

154875-序列表.doc 201138823

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Tyr lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Glu lie Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro lie Arg Leu Tyr Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115 <210> 12 <211〉 108 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400> 12

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30 -21 154875·序列表.doc 201138823

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Leu Pro Thr 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 13 <211〉 118 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成多肽 <400> 13

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Tyr 20 25 30

Tyr lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 •22- 154875-序列表.doc 201138823

Ala Glu lie Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro lie Arg Leu His Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115 <210〉 14 <211〉 108 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220>

<223〉.合成多肽 <400〉 14

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 •23· 154875·序列表 _doc 201138823

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 15 <211〉 118 <212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 <400> 15

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Ser 20 25 30

Tyr He His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Trp lie Thr Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 24- 154875-序列表.doc 201138823

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Ser Gly His Val Asn Ala Val Lys Asn Tyr Gly Tyr Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115

<210〉 16 〈211〉 108 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400〉 16

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 • 25 154875·序列表doc 201138823

Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 17 <211> 5 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400> 17

Ser Tyr Tyr lie Ser 1 5 <210〉 18 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400〉 18

Glu lie Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210〉 19 <211〉 14 <212〉 PRT 〈213> 人工序列 <220> -26- 154875·序列表.doc 201138823 <223〉合成多肽 <400〉 19

Arg Ala Arg Pro Pro lie Arg Leu His Pro Arg Gly Ser Val 1 5 10 <210〉 20 <211> 5 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉

<223〉合成多肽 <400> 20

Tyr Tyr Tyr He Ser 1 5 <210〉 21 <211> 14 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉〈223〉合成多肽 <400〉 21

Arg Ala Arg Pro Pro lie Arg Leu Tyr Pro Arg Gly Ser Val 1 5 10 <210〉 22 <211〉 5 <212> PRT <213> 人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 -27- 154875-序列表.doc 201138823 <400〉 22

Asn Ser Tyr He His 1 5 <210〉 23 <211> 17 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 <400〉 23

Trp lie Thr Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly <210〉 24 〈211〉 14 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400〉 24

Gly Ser Gly His Val Asn Ala Val Lys Asn Tyr Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 25 <211> 11 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 ·28·

154875-序列表.doc 201138823 <223〉合成多肽 <400〉 25

Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala Val Ala 1 5 10 <210〉 26 <211> 7 <212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 • <223> 合成多肽 <400> 26

Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5 <210〉 27 . <211> 9 <212〉 PRT <213> 人工序列 <220> <223〉 φ 合成多肽 <400〉 27

Gin Gin Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5 <210〉 28 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉〈223> 合成多狀 29· 154875-序列表.doc 201138823 <400> 28

Gin Gin Ser Tyr Thr Leu Pro Thr Thr 1 5 <210〉 29 <211〉 1613 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 29

Met Gly Ala Val Leu Arg Ser Leu Leu Ala Cys Ser Phe Cys Val Leu 15 10 15

Leu Arg Ala Ala Pro Leu Leu Leu Tyr Ala Asn Arg Arg Asp Leu Arg 20 25 30

Leu Val Asp Ala Thr Asn Gly Lys Glu Asn Ala Thr lie Val Val Gly 35 40 45

Gly Leu Glu Asp Ala Ala Ala Val Asp Phe Val Phe Ser His Gly Leu 50 55 60 lie Tyr Trp Ser Asp Val Ser Glu Glu Ala lie Lys Arg Thr Glu Phe 65 70 75 80

Asn Lys Thr Glu Ser Val Gin Asn Val Val Val Ser Gly Leu Leu Ser 85 90 95

Pro Asp Gly Leu Ala Cys Asp Trp Leu Gly Glu Lys Leu Tyr Trp Thr 100 105 110

Asp Ser Glu Thr Asn Arg lie Glu Val Ser Asn Leu Asp Gly Ser Leu 115 120 125 -30· 154875·序列表.doc 201138823

Arg Lys Val Leu Phe Trp Gin Glu Leu Asp Gin Pro Arg Ala lie Ala 130 135 140

Leu Asp Pro Ser Ser Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Val 145 150 155 160

Pro Lys lie Glu Arg Ala Gly Met Asp Gly Ser Ser Arg Phe He He 165 170 175

He Asn Ser Glu He Tyr Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu Asp Tyr Glu 180 185 190

Glu Gin Lys Leu Tyr Trp Ala Asp Ala Lys Leu Asn Phe He His Lys 195 200 205

Ser Asn Leu Asp Gly Thr Asn Arg Gin Ala Val Val Lys Gly Ser Leu 210 215 220

Pro His Pro Phe Ala Leu Thr Leu Phe Glu Asp lie Leu Tyr Trp Thr 225 230 235 240

Asp Trp Ser Thr His Ser lie Leu Ala Cys Asn Lys Tyr Thr Gly Glu 245 250 255

Gly Leu Arg Glu lie His Ser Asp He Phe Ser Pro Met Asp He His 260 265 270

Ala Phe Ser Gin Gin Arg Gin Pro Asn Ala Thr Asn Pro Cys Gly He 275 280 285

Asp Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Met Ser Pro Val Lys Pro 290 295 300 •31 · 154875-序列表.d〇c 201138823

Phe Tyr Gin Cys Ala Cys Pro Thr Gly Val Lys Leu Leu Glu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Thr Cys Lys Asp Gly Ala Thr Glu Leu Leu Leu Leu Ala Arg Arg 325 330 335

Thr Asp Leu Arg Arg He Ser Leu Asp Thr Pro Asp Phe Thr Asp lie 340 345 350

Val Leu Gin Leu Glu Asp lie Arg His Ala lie Ala lie Asp Tyr Asp 355 360 365

Pro Val Glu Gly Tyr He Tyr Trp Thr Asp Asp Glu Val Arg Ala He 370 375 380

Arg Arg Ser Phe lie Asp Gly Ser Gly Ser Gin Phe Val Val Thr Ala 385 390 395 400

Gin He Ala His Pro Asp Gly lie Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn 405 410 415

Leu Tyr Trp Thr Asp Thr Gly Thr Asp Arg He Glu Val Thr Arg Leu 420 425 430

Asn Gly Thr Met Arg Lys He Leu lie Ser Glu Asp Leu Glu Glu Pro 435 440 445

Arg Ala lie Val Leu Asp Pro Met Val Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp 450 455 460

Trp Gly Glu lie Pro Lys He Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Ser Asp 465 470 475 480 32-

154875-序列表.doc 201138823

Arg Val Val Leu Val Asn Thr Ser Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Ala 485 490 495

Leu Asp Tyr Asp Glu Gly Lys lie Tyr Trp Gly Asp Ala Lys Thr Asp 500 505 510

Lys lie Glu Val Met Asn Thr Asp Gly Thr Gly Arg Arg Val Leu Val 515 520 525

Glu Asp Lys lie Pro His lie Phe Gly Phe Thr Leu Leu Gly Asp Tyr 530 535 540

Val Tyr Trp Thr Asp Trp Gin Arg Arg Ser lie Glu Arg Val His Lys 545 550 555 560

Arg Ser Ala Glu Arg Glu Val lie lie Asp Gin Leu Pro Asp Leu Met 565 570 575

Gly Leu Lys Ala Thr Asn Val His Arg Val lie Gly Ser Asn Pro Cys 580 585 590

Ala Glu Glu Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Tyr Arg Pro Gin 595 600 605

Gly Leu Arg Cys Ala Cys Pro He Gly Phe Glu Leu lie Ser Asp Met 610 615 620

Lys Thr Cys lie Val Pro Glu Ala Phe Leu Leu Phe Ser Arg Arg Ala 625 630 635 640

Asp lie Arg Arg He Ser Leu Glu Thr Asn Asn Asn Asn Val Ala lie 645 650 655 •33 154875·序列表.<j〇c 201138823

Pro Leu Thr Gly Val Lys Glu Ala Ser Ala Leu Asp Phe Asp Val Thr 660 665 670

Asp Asn Arg lie Tyr Trp Thr Asp lie Ser Leu Lys Thr lie Ser Arg 675 680 685

Ala Phe Met Asn Gly Ser Ala Leu Glu His Val Val Glu Phe Gly Leu 690 695 700

Asp Tyr Pro Glu Gly Met Ala Val Asp Trp Leu Gly Lys Asn Leu Tyr 705 710 715 720

Trp Ala Asp Thr Gly Thr Asn Arg lie Glu Val Ser Lys Leu Asp Gly 725 730 735

Gin His Arg Gin Val Leu Val Trp Lys Asp Leu Asp Ser Pro Arg Ala 740 745 750

Leu Ala Leu Asp Pro Ala Glu Gly Phe Met Tyr Trp Thr Glu Trp Gly 755 760 765

Gly Lys Pro Lys lie Asp Arg Ala Ala Met Asp Gly Ser Glu Arg Thr 770 775 780

Thr Leu Val Pro Asn Val Gly Arg Ala Asn Gly Leu Thr lie Asp Tyr 785 790 795 800

Ala Lys Arg Arg Leu Tyr Trp Thr Asp Leu Asp Thr Asn Leu He Glu 805 810 815

Ser Ser Asn Met Leu Gly Leu Asn Arg Glu Val lie Ala Asp Asp Leu 820 825 830 -34

154875-序列表.doc 201138823

Pro His Pro Phe Gly Leu Thr Gin Tyr Gin Asp Tyr lie Tyr Trp Thr 835 840 845

Asp Trp Ser Arg Arg Ser He Glu Arg Ala Asn Lys Thr Ser Gly Gin 850 855 860

Asn Arg Thr lie lie Gin Gly His Leu Asp Tyr Val Met Asp lie Leu 865 870 875 880

Val Phe His Ser Ser Arg Gin Ser Gly Trp Asn Glu Cys Ala Ser Ser 885 890 895

Asn Gly His Cys Ser His Leu Cys Leu Ala Val Pro Val Gly Gly Phe 900 905 910

Val Cys Gly Cys Pro Ala His Tyr Ser Leu Asn Ala Asp Asn Arg Thr 915 920 925

Cys Ser Ala Pro Thr Thr Phe Leu Leu Phe Ser Gin Lys Ser Ala lie 930 935 940

Asn Arg Met Val lie Asp Glu Gin Gin Ser Pro Asp lie lie Leu Pro 945 950 955 960 lie His Ser Leu Arg Asn Val Arg Ala lie Asp Tyr Asp Pro Leu Asp 965 970 975

Lys Gin Leu Tyr Trp lie Asp Ser Arg Gin Asn Met lie Arg Lys Ala 980 985 990

Gin Glu Asp Gly Ser Gin Gly Phe Thr Val Val Val Ser Ser Val Pro 995 1000 1005 -35- 154875-序列表.doc 201138823

Ser Gin Asn Leu Glu lie Gin Pro Tyr Asp Leu Ser lie Asp lie 1010 1015 1020

Tyr Ser Arg Tyr He Tyr Trp Thr Cys Glu Ala Thr Asn Val He 1025 1030 1035

Asn Val Thr Arg Leu Asp Gly Arg Ser Val Gly Val Val Leu Lys 1040 1045 1050

Gly Glu Gin Asp Arg Pro Arg Ala lie Val Val Asn Pro Glu Lys 1055 1060 1065

Gly Tyr Met Tyr Phe Thr Asn Leu Gin Glu Arg Ser Pro Lys lie 1070 1075 1080

Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Thr Glu Arg Glu Val Leu Phe Phe 1085 1090 1095

Ser Gly Leu Ser Lys Pro lie Ala Leu Ala Leu Asp Ser Arg Leu 1100 1105 1110

Gly Lys Leu Phe Trp Ala Asp Ser Asp Leu Arg Arg lie Glu Ser 1115 1120 1125

Ser Asp Leu Ser Gly Ala Asn Arg lie Val Leu Glu Asp Ser Asn 1130 1135 1140 lie Leu Gin Pro Val Gly Leu Thr Val Phe Glu Asn Trp Leu Tyr 1145 1150 1155

Trp He Asp Lys Gin Gin Gin Met lie Glu Lys lie Asp Met Thr 1160 1165 1170 •36· 154875-序列表 doc 201138823

Gly Arg Glu Gly Arg Thr Lys Val Gin Ala Arg lie 1175 1180 1185

Ala Gin Leu

Ser Asp He His Ala Val Lys Glu Leu Asn Leu Gin 1190 1195 1200

Glu Tyr Arg

Gin His Pro Cys Ala Gin Asp Asn Gly Gly Cys Ser 1205 1210 1215

His lie Cys

Leu Val Lys Gly Asp Gly Thr Thr Arg Cys Ser Cys 1220 1225 1230

Pro Met His

Leu Val Leu Leu Gin Asp Glu Leu Ser Cys Gly Glu 1235 . 1240 1245

Pro Pro Thr

Cys Ser Pro Gin Gin Phe Thr Cys Phe Thr Gly Glu 1250 1255 1260 lie Asp Cys lie Pro Val Ala Trp Arg Cys Asp Gly Phe Thr Glu 1265 1270 1275

Cys Glu Asp

His Ser Asp Glu Leu Asn Cys Pro Val Cys Ser Glu 1280 1285 1290

Ser Gin Phe

Gin Cys Ala Ser Gly Gin Cys He Asp Gly Ala Leu 1295 1300 1305

Arg Cys Asn

Gly Asp Ala Asn Cys Gin Asp Lys Ser Asp Glu Lys 1310 1315 1320

Asn Cys Glu

Val Leu Cys Leu lie Asp Gin Phe Arg Cys Ala Asn 1325 1330 1335

Gly Gin Cys 154875-序列表.doc •37- 201138823 lie Gly Lys His Lys Lys Cys Asp His Asn Val Asp 1340 1345 1350

Cys Ser Asp

Lys Ser Asp Glu Leu Asp Cys Tyr Pro Thr Glu Glu 1355 1360 1365

Pro Ala Pro

Gin Ala Thr Asn Thr Val Gly Ser Val lie Gly Val 1370 1375 1380

He Val Thr

He Phe Val Ser Gly Thr Val Tyr Phe He Cys Gin 1385 1390 1395

Arg Met Leu

Cys Pro Arg Met Lys Gly Asp Gly Glu Thr Met Thr 1400 1405 1410

Asn Asp Tyr

Val Val His Gly Pro Ala Ser Val Pro Leu Gly Tyr 1415 1420 1425

Val Pro His

Pro Ser Ser Leu Ser Gly Ser Leu Pro Gly Met Ser 1430 1435 1440

Arg Gly Lys

Ser Met lie Ser Ser Leu Ser He Met Gly Gly Ser 1445 1450 1455

Ser Gly Pro

Pro Tyr Asp Arg Ala His Val Thr Gly Ala Ser Ser 1460 1465 1470

Ser Ser Ser

Ser Ser Thr Lys Gly Thr Tyr Phe Pro Ala lie Leu 1475 1480 1485

Asn Pro Pro

Pro Ser Pro Ala Thr Glu Arg Ser His Tyr Thr Met 1490 1495 1500

Glu Phe Gly 154875·序列表.doc •38- 201138823

Tyr Ser Ser Asn Ser Pro Ser Thr His Arg Ser Tyr Ser Tyr Arg 1505 1510 1515

Pro Tyr Ser Tyr Arg His Phe Ala Pro Pro Thr Thr Pro Cys Ser 1520 1525 1530

Thr Asp Val Cys Asp Ser Asp Tyr Ala Pro Ser Arg Arg Met Thr 1535 1540 1545

Ser Val Ala Thr Ala Lys Gly Tyr Thr Ser Asp Leu Asn Tyr Asp 1550 1555 1560

Ser Glu Pro Val Pro Pro Pro Pro Thr Pro Arg Ser Gin Tyr Leu 1565 1570 1575

Ser Ala Glu Glu Asn Tyr Glu Ser Cys Pro Pro Ser Pro Tyr Thr 1580 1585 1590

Glu Arg Ser Tyr Ser His His Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Ser Pro 1595 1600 1605

Cys Thr Asp Ser Ser 1610 〈210〉 30 <211> 890 <212> PRT <213〉人工序列〈220> <223>合成多肽 <400> 30

Met Gly Gly Thr Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val He Leu Phe Val Val 39- 154875·序列表.doc 201138823 10 15 lie Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Gly Ser Ala Ala Pro Leu 20 25 30

Leu Leu Tyr Ala Asn Arg Arg Asp Leu Arg Leu Val Asp Ala Thr Asn 35 40 45

Gly Lys Glu Asn Ala Thr He Val Val Gly Gly Leu Glu Asp Ala Ala 50 55 60

Ala Val Asp Phe Val Phe Ser His Gly Leu lie Tyr Trp Ser Asp Val 65 70 75 80

Ser Glu Glu Ala lie Lys Arg Thr Glu Phe Asn Lys Thr Glu Ser Val 85 90 95

Gin Asn Val Val Val Ser Gly Leu Leu Ser Pro Asp Gly Leu Ala Cys 100 105 110

Asp Trp Leu Gly Glu Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Glu Thr Asn Arg 115 120 125 lie Glu Val Ser Asn Leu Asp Gly Ser Leu Arg Lys Val Leu Phe Trp 130 135 140

Gin Glu Leu Asp Gin Pro Arg Ala He Ala Leu Asp Pro Ser Ser Gly 145 150 155 160

Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Val Pro Lys lie Glu Arg Ala 165 170 175

Gly Met Asp Gly Ser Ser Arg Phe lie lie lie Asn Ser Glu He Tyr •40·

154875·序列表.doc 201138823 180 185 190

Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu Asp Tyr Glu Glu Gin Lys Leu Tyr Trp 195 200 205

Ala Asp Ala Lys Leu Asn Phe lie His Lys Ser Asn Leu Asp Gly Thr 210 215 220

Asn Arg Gin Ala Val Val Lys Gly Ser Leu Pro His Pro Phe Ala Leu 225 230 235 240

Thr Leu Phe Glu Asp He Leu Tyr Trp Thr Asp Trp Ser Thr His Ser 245 250 255 lie Leu Ala Cys Asn Lys Tyr Thr Gly Glu Gly Leu Arg Glu lie His 260 265 270

Ser Asp He Phe Ser Pro Met Asp He His Ala Phe Ser Gin Gin Arg 275 280 285

Gin Pro Asn Ala Thr Asn Pro Cys Gly He Asp Asn Gly Gly Cys Ser 290 295 300

His Leu Cys Leu Met Ser Pro Val Lys Pro Phe Tyr Gin Cys Ala Cys 305 310 315 320

Pro Thr Gly Val Lys Leu Leu Glu Asn Gly Lys Thr Cys Lys Asp Gly 325 330 335

Ala Thr Glu Leu Leu Leu Leu Ala Arg Arg Thr Asp Leu Arg Arg lie 340 345 350

Ser Leu Asp Thr Pro Asp Phe Thr Asp lie Val Leu Gin Leu Glu Asp • 41 · 154875·序列表.doc 201138823 355 360 365 lie Arg His Ala lie Ala lie Asp Tyr Asp Pro Val Glu Gly Tyr lie 370 375 380

Tyr Trp Thr Asp Asp Glu Val Arg Ala He Arg Arg Ser Phe lie Asp 385 390 395 400

Gly Ser Gly Ser Gin Phe Val Val Thr Ala Gin lie Ala His Pro Asp 405 410 415

Gly lie Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn Leu Tyr Trp Thr Asp Thr 420 425 430

Gly Thr Asp Arg lie Glu Val Thr Arg Leu Asn Gly Thr Met Arg Lys 435 440 445 lie Leu lie Ser Glu Asp Leu Glu Glu Pro Arg Ala lie Val Leu Asp 450 455 460

Pro Met Val Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu lie Pro Lys 465 470 475 480

lie Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Ser Asp Arg Val Val Leu Val Asn 485 490 495

Thr Ser Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Ala Leu Asp Tyr Asp Glu Gly 500 505 510

Lys lie Tyr Trp Gly Asp Ala Lys Thr Asp Lys He Glu Val Met Asn 515 520 525

Thr Asp Gly Thr Gly Arg Arg Val Leu Val Glu Asp Lys He Pro His • 42- 154875-序列表.doc 201138823 530 535 540 lie Phe Gly Phe Thr Leu Leu Gly Asp Tyr Val Tyr Trp Thr Asp Trp 545 550 555 560

Gin Arg Arg Ser lie Glu Arg Val His Lys Arg Ser Ala Glu Arg Glu 565 570 575

Val lie lie Asp Gin Leu Pro Asp Leu Met Gly Leu Lys Ala Thr Asn 580 585 590

Val His Arg Val lie Gly Ser Asn Pro Cys Ala Glu Glu Asn Gly Gly 595 600 605

Cys Ser His Leu Cys Leu Tyr Arg Pro Gin Gly Leu Arg Cys Ala Cys 610 615 620

Pro lie Gly Phe Glu Leu lie Ser Asp Met Lys Thr Cys lie Val Pro 625 630 635 640

Glu Ala Phe Leu Leu Phe Ser Arg Arg Ala Asp lie Arg Arg Leu Glu 645 650 655

Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 660 665 670

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 675 680 685

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 690 695 700

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp •43- 154875-序列表.doc 201138823 705 710 715 720

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 725 730 735

Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 740 745 750

His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 755 760 765

Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 770 775 780

Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 785 790 795 800

Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 805 810 815

Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 820 825 830

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 835 840 845

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 850 855 860

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 865 870 875 880

Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys • 44-

154875-序列表.doc 201138823 885 890 <210> 31 <211〉 882 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223>合成多肽 <400〉 31

Met Gly Gly Thr Ala Ala Arg Leu Gly Ala Val He Leu Phe Val Val

lie Val Gly Leu His Gly Val Arg Gly Lys Gly Ser Val Pro Glu Ala 20 25 30

Phe Leu Leu Phe Ser Arg Arg Ala Asp lie Arg Arg lie Ser Leu Glu 35 40 45

Thr Asn Asn Asn Asn Val Ala He Pro Leu Thr Gly Val Lys Glu Ala 50 55 60

Ser Ala Leu Asp Phe Asp Val Thr Asp Asn Arg lie Tyr Trp Thr Asp 65 70 75 80

He Ser Leu Lys Thr He Ser Arg Ala Phe Met Asn Gly Ser Ala Leu 85 90 95

Glu His Val Val Glu Phe Gly Leu Asp Tyr Pro Glu Gly Met Ala Val 100 105 HO

Asp Trp Leu Gly Lys Asn Leu Tyr Trp Ala Asp Thr Gly Thr Asn Arg 115 120 125 154875-序列表.doc •45-

S 201138823 lie Glu Val Ser Lys Leu Asp Gly Gin His Arg Gin Val Leu Val Trp 130 135 140

Lys Asp Leu Asp Ser Pro Arg Ala Leu Ala Leu Asp Pro Ala Glu Gly 145 150 155 160

Phe Met Tyr Trp Thr Glu Trp Gly Gly Lys Pro Lys lie Asp Arg Ala 165 170 175

Ala Met Asp Gly Ser Glu Arg Thr Thr Leu Val Pro Asn Val Gly Arg 180 185 190

Ala Asn Gly Leu Thr He Asp Tyr Ala Lys Arg Arg Leu Tyr Trp Thr 195 200 205

Asp Leu Asp Thr Asn Leu lie Glu Ser Ser Asn Met Leu Gly Leu Asn 210 215 220

Arg Glu Val He Ala Asp Asp Leu Pro His Pro Phe Gly Leu Thr Gin 225 230 235 240

Tyr Gin Asp Tyr lie Tyr Trp Thr Asp Trp Ser Arg Arg Ser He Glu 245 250 255

Arg Ala Asn Lys Thr Ser Gly Gin Asn Arg Thr He He Gin Gly His 260 265 270

Leu Asp Tyr Val Met Asp lie Leu Val Phe His Ser Ser Arg Gin Ser 275 280 285

Gly Trp Asn Glu Cys Ala Ser Ser Asn Gly His Cys Ser His Leu Cys 290 295 300 46·

154875·序列表.d〇c 201138823

Leu Ala Val Pro Val Gly Gly Phe Val Cys Gly Cys Pro Ala His Tyr 305 310 315 320

Ser Leu Asn Ala Asp Asn Arg Thr Cys Ser Ala Pro Thr Thr Phe Leu 325 330 335

Leu Phe Ser Gin Lys Ser Ala He Asn Arg Met Val lie Asp Glu Gin 340 345 350

Gin Ser Pro Asp lie He Leu Pro He His Ser Leu Arg Asn Val Arg 355 360 365

Ala lie Asp Tyr Asp Pro Leu Asp Lys Gin Leu Tyr Trp He Asp Ser 370 375 380

Arg Gin Asn Met lie Arg Lys Ala Gin Glu Asp Gly Ser Gin Gly Phe 385 390 395 400

Thr Val Val Val Ser Ser Val Pro Ser Gin Asn Leu Glu lie Gin Pro 405 410 415

Tyr Asp Leu Ser lie Asp lie Tyr Ser Arg Tyr lie Tyr Trp Thr Cys 420 425 430

Glu Ala Thr Asn Val He Asn Val Thr Arg Leu Asp Gly Arg Ser Val 435 440 445

Gly Val Val Leu Lys Gly Glu Gin Asp Arg Pro Arg Ala lie Val Val 450 455 460

Asn Pro Glu Lys Gly Tyr Met Tyr Phe Thr Asn Leu Gin Glu Arg Ser 465 470 475 480 47- 154875·序列表.doc 201138823

Pro Lys He Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Thr Glu Arg Glu Val Leu 485 490 495

Phe Phe Ser Gly Leu Ser Lys Pro He Ala Leu Ala Leu Asp Ser Arg 500 505 510

Leu Gly Lys Leu Phe Trp Ala Asp Ser Asp Leu Arg Arg lie Glu Ser 515 520 525

Ser Asp Leu Ser Gly Ala Asn Arg He Val Leu Glu Asp Ser Asn He 530 535 540

Leu Gin Pro Val Gly Leu Thr Val Phe Glu Asn Trp Leu Tyr Trp lie 545 550 555 560

Asp Lys Gin Gin Gin Met lie Glu Lys He Asp Met Thr Gly Arg Glu 565 570 575

Gly Arg Thr Lys Val Gin Ala Arg He Ala Gin Leu Ser Asp He His 580 585 590

Ala Val Lys Glu Leu Asn Leu Gin Glu Tyr Arg Gin His Pro Cys Ala 595 600 605

Gin Asp Asn Gly Gly Cys Ser His lie Cys Leu Val Lys Gly Asp Gly 610 615 620

Thr Thr Arg Cys Ser Cys Pro Met His Leu Val Leu Leu Gin Asp Glu 625 630 635 640

Leu Ser Cys Gly Thr Gly Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Asp 645 650 655 • 48 154875-序列表.doc 201138823

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 660 665 670

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie 675 680 685

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 690 695 700

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 705 710 715 720

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 725 730 735

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 740 745 750

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 755 760 765

Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 770 775 780

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 785 790 795 800

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp 805 810 815

Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 820 825 830 •49 154875-序列表.doc 201138823

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 835 840 845

Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 850 855 860

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 865 870 875 880

Gly Lys <210〉 32 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成序列 <400> 32 aatgctgctg aactgaatag aaa 23 <210〉 33 <211〉 18 <212> DNA 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉合成寡核苷酸 <400> 33 aaccggtcct agcgaaaa 18 <210> 34

<211〉 24 <212〉 DNA 50- 154875-序列表.doc 201138823 <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成寡核苷酸 <400〉 34 ccgagcactg tttcaaatct ccca <210〉 35 <211〉 22 <212〉 DNA 〈213> 人工序列

<220〉 <223〉合成寡核苷酸 <400〉 35 tgagagtgtg acattgttgg aa <210> 36 <211〉 26 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成寡核苷酸 <400> 36 gtaaaatctg tgtgcaatta tcatgt <210> 37 <211〉 36 <212〉 DNA 〈213>人工序列 <220> <223〉合成寡核苷酸 <400> 37 aatcattgaa aatgactaac acaagaccct gtaaat •51 - 154875-序列表.doc 201138823 <210〉 38 <211> 18 <212> DNA 〈213> 人工序列 <220〉 <223〉合成寡核苷酸 <400> 38 tgaggacgca ggagtgaa <210〉 39 <211〉 18 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成寡核苷酸 <400> 39 cccagagagt ggccaaat <210〉 40 <211〉 21 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220> <223〉合成寡核苷酸 <400> 40 cctgtttgct gccacccatg a <210〉 41 <211〉 4 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 154875-序列表.doc 201138823 <220> <221〉 MISC_FEATURE 〈222〉 ⑵..⑵ <223〉 X為任何胺基酸 <220〉 <221〉 MISC_FEATURE <222〉 (3).. (3) <223〉 X為I或V <400> 41 Asn Xaa Xaa Lys 1

<210> 42 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽

<220〉 <221〉 MISC_FEATURE <222〉 ⑵··⑵ <223〉 X為任何胺基酸 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉 ⑶·.⑶ <223〉 X為I或V <400〉 42

Asn Xaa Xaa Lys Asn 1 5 <210〉 43 154875-序列表.doc -53· 201138823 <211> 4 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 <220〉 <221> MISC_FEATURE <222〉（2)·. (2) <223〉X為任何胺基酸 <400〉 43

Asn Xaa Val Lys 1 <210> 44 〈211〉 4 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <220>

<221> MISC.FEATURE <222> (2).. (2) <223〉X為任何胺基酸 <400> 44

Asn Xaa lie Lys 1 <210> 45 <211〉 5 <212> PRT <213〉人工序列 •54 154875-序列表.doc 201138823 <220> <223〉合成多肽〈220〉〈221〉 MISC_FEATURE <222〉 ⑵..⑵ <223〉 X為任何胺基酸 <400〉 45

Asn Xaa Val Lys Asn 1 5

<210〉 46 <211〉 5 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽

<220> <221〉 MISC—FEATURE <222〉 ⑵..⑵ <223> X為任何胺基酸 <400〉 46 Asn Xaa lie Lys Asn 1 5 <210〉 47 <211〉 4 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 <400〉 47 154875·序列表.doc -55- 201138823

Asn Ala Val Lys 1 <210〉 48 <211> 4 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400〉 48

Asn Ala lie Lys 1 <210> 49 <211〉 5 <212〉 PRT 〈213> 人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400〉 49

Asn Ala Val Lys Asn <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> 人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400〉 50

Asn Ala lie Lys Asn -56·

154875-序列表.doc 201138823 1 5 <210> 51 <211〉 115 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 <400> 51

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Trp lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Thr lie Ser Pro Ala Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80

Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Thr Asp Trp Arg Phe His His Ala Gly Glu Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin 115 -57- 154875·序列表.doc 201138823 <210〉 52 <211〉 115 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> 〈223>合成多肽 <400〉 52

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Trp lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Gly lie Ser Pro Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Trp Ser Tyr lie Ser Arg Tyr Phe Ser Ser Val Met Asp Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin 115 〈210〉 53 58- 154875-序列表.doc 201138823 <211> 113 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400〉 53

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30

Asp lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Ser He Tyr Pro Ala Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Ser Pro Gly Trp Ala Leu Arg Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin

<210〉 54 <211〉 110 <212〉 PRT 59- 154875·序列表.doc 201138823 <213〉人工序列 <220〉 <223〉合成多肽 <400〉 54

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Asn 20 25 30

Asp lie His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Arg He Tyr Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Lys Glu Val Thr Tyr His Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110 <210> 55 <211〉 115 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉〈223>合成多肽 <400〉 55 •60- 154875·序列表.doc 201138823

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser 20 25 30

Ser lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Val lie Ser Pro Ser Ser Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Trp Pro Ala Gly Ala Phe Leu Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin 115 〈210〉 56 <211〉 118 〈212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 <400〉 56

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly -61 - 154875-序列表.doc 201138823 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Phe Tyr 20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Glu lie Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro lie Arg Leu His Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115

〈210〉 57 <211〉 118 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 <400> 57

Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 •62- 154875·序列表.doc 201138823

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Phe Tyr 20 25 30

Tyr lie Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Glu He Ser Pro Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Leu Arg Ala Arg Pro Pro lie Arg Leu His Pro Arg Gly Ser Val 100 105 110

Met Asp Tyr Trp Gly Gin 115 <210〉 58 <211〉 108 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220> <223〉合成多肽 <400> 58

Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ser Thr Ala 63- 154875-序列表.doc 201138823 20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Thr Ala lie Pro 85 90 95

Thr Thr Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 64· 154875-序列表.doc

Claims

201138823 七、申請專利範圍： 1 · 一種結合於LRP6之經分離抗體，其中該抗體抑制由第— Wnt同功異型物誘導之信號傳導且增強由第二Wnt同功異型物誘導之信號傳導。 2. 如請求項1之抗體’其中該第一Wnt同功異型物係選自由 Wnt3及Wnt3a組成之群。 3. 如請求項1之抗體，其中該第二冒加同功異型物係選自由 Wnt 1、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、10a及 l〇b 組成之群。 4. 如凊求項丨之抗體，其中該第—Wnt同功異型物係選自由 Wnt3及Wnt3a組成之群且該第二wnt同功異型物係選自由 Wnt 1、2、2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、10a及 l〇b組成之群。 5. 如凊求項1之抗體，其中該第一 Wnt同功異型物係選自由 Wnt 1、2、2b、6、8a、9a、9b及 10b組成之群。 6. 如凊求項1之抗體，其中該第二Wnt同功異型物係選自由 Wnt3及Wnt3a組成之群。 7. 如凊求項丨之抗體，其中該第一 wnt同功異型物係選自由 Wnt 1 2、2b、6、8a、9a、9b及10b組成之群，且該第一 Wnt同功異型物係選自由评加3及％加3&組成之群。 8. 如明求項丨至4中任一項之抗體，其中抗體結合於 E3-E4區。 9. 如π求項1或5至7中任一項之抗體，其中抗體結合於 LRP6 之 Ε1-Ε2 區。 154875.doc 201138823 10. —種經分離抗體’其結合於LRP6之兩個不同區β 11 ·如請求項1 〇之抗體’其中該抗體結合於LRpg之ε 1-Ε2區及 LRP6之Ε3-Ε4 區。 12. 如請求項1〇或11之抗體，其中該抗體抑制由WnU與 Wnt3a之組合誘導之Wnt信號傳導。 13. 如請求項1〇、11或12之抗體，其中該抗體抑制自分泌 Wnt信號傳導。 14. 一種抗體，其與如請求項丨至13中任一項之抗體競爭結合0 15. —種免疫結合物，其包含如請求項丨至13中任一項之抗體及細胞毒性劑。 16. —種醫藥調配物，其包含如請求項丨至15中任一項之抗體及醫樂學上可接受之载劑。 17. 如請求項1至14中任一項之抗體，其係用作藥物。 18. 如請求項丨至14中任一項之抗體，其係用於治療癌症或骨骼病症。 19. 如請求項1至14中任一項之抗體，其係用於抑制由第一 Wnt同功異型物誘導之信號傳導及增強由第二貿加同功異型物誘導之信號傳導。 20· -種如請求項任—項之抗體之用途，其係用於製造藥物。 21. 如請求項20之用途，其中該藥物治療癌症或骨骼病症。 22. 如請求項20之用途’其中該藥物係用於抑制由第一胸同功異型物誘導之信號傳導及增強由第二編同功異型 154875.doc -2 · 201138823 物誘導之信號傳導。 2 3 · —種治療患有癌症之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之如清求項1至14中任一項之抗體。 24.如請求項23之方法，其中該癌症係選自由非小細胞肺癌、乳癌、騰臟癌、卵巢癌、腎癌及前列腺癌組成之群。 25· —種治療患有癌症之個體的方法，其包含向該個體投與 ^ 有效量之以下物質： a) 經分離抗體，其結合於LRP6且抑制由選自由Wnt3 及Wnt3a組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導，及 b) 經分離抗體，其結合於LRP6且抑制由選自由Wnt 1、2、2b、6、8a、9丑、9b及10b組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導。 26. —種治療患有癌症之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之以下物質： • a)經分離抗體，其結合於LRP6且抑制由Wnt3及Wnt3a 誘導之信號傳導，及 b)經分離抗體，其結合於LRP6且抑制由Wnt 1、2、 2b、6、8a、9a、9b及10b誘導之信號傳導。 27. —種治療患有癌症之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之以下物質： a) 經分離抗體，其結合於LRP6且抑制由Wnt3及Wnt3a 誘導之信號傳導，及 b) 經分離抗體，其結合於LRP6且抑制由Wnt 1、2、 154875.doc 201138823 2b、4、6、7a、7b、8a、9a、9b、10a及 l〇b誘導之信號傳導。 2 8. —種治療患有骨骼病症之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項1至14中任一項之抗體。 29. 如請求項28之方法，其中該骨骼病症係選自由骨礦質疏鬆症、骨關節炎、骨折及骨損害組成之群。 30. —種增強個體中由Wnt同功異型物誘導之Wnt信號傳導的方法，其包含向該個體投與有效量之如請求項1至14中任一項之抗體及該Wnt同功異型物，以增強由該Wnt同功異型物誘導之Wnt信號傳導。 3 1 · —種結合於LRP6之經分離抗體，其中該抗體包含選自由 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13及 SEQ ID NO: 15組成之群的VH。 32. —種結合於LRP6之經分離抗體，其中該抗體包含選自由 SEQ ID NO: 10及 SEQ ID NO: 12組成之群的 VL。 33. —種結合於LRP6之經分離抗體，其中該抗體包含選自由來自 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13及 SEQ ID NO: 15之重鏈的VH組成之群的VH，及選自由來自SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 12之輕鏈的VL組成之群的VL。 34. —種結合於LRP6之經分離抗體，其中該抗體包含所具胺基酸序列與 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO·· 11、SEQ ID NO: 13及SEQ ID NO: 15之胺基酸序列具有至少90%同源性的重鏈。 154875.doc 201138823 35. —種結合於LRP6之經分離抗體，其中該抗體包含所具胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12組成之群的胺基酸序列具有至少90%同源性的輕鏈。 36. —種結合於LRP6之經分離抗體，其中該抗體包含所具胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15組成之群的胺基酸序列具有至少90%同源性的重鏈及所具胺基酸序列與選自由SEq ID NO: 10、SEQ ID NO: 12組成之群的胺基酸序列具有至少90%同源性的輕鏈。 3 7. —種結合於LRP6之兩個不同區的經分離雙特異性抗體，其中該抗體包含所具胺基酸序列選自由SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NOM1、SEQ ID NO: 13 及 SEQ ID NO: 15 組成之群的重鏈e 3 8.如請求項37之雙特異性抗體，其中該抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 9之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 15之重鏈。 39. 如請求項37之雙特異性抗體，其中該抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 11之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 15之重鏈。 40. 如請求項37之雙特異性抗體，其中該抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 13之重鏈及具有胺基酸序列SEQ ID NO: 15之重鏈。 41. 如請求項37至40中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體進一步包含具有選自由SEQ ID NO: 10及SEQ ID NO: 12 154875.doc 201138823 組成之群的胺基酸序列之輕鏈。 42. —種結合於LRP6之兩個不同區的經分離雙特異性抗體，其中5亥抗體包含所具胺基酸序列與選自由沾卩id NO: 9、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 13 或 SEQ ID NO: 15 組成之群的胺基酸序列具有至少9〇%同源性的重鏈。 43. 如請求項42之雙特異性抗體，其中該抗體包含所具胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO: 9具有至少90%同源性的重鏈及所具胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO: 1 5具有至少90%同源性的重鏈。 44·如請求項42之雙特異性抗體，其中該抗體包含所具胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO: 11具有至少90%同源性的重鏈及所具胺基酸序列與胺基酸序列SEq ID N〇: 15具有至少90%同源性的重鏈。 45·如請求項42之雙特異性抗體，其中該抗體包含所具胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO: 13具有至少90%同源性的重鍵及所具胺基酸序列與胺基酸序列SEQ ID NO: 1 5具有至少90%同源性的重鏈。 46·如請求項42至45中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體進一步包含所具胺基酸序列與選自由SEQ ID NO: 10及 SEQ ID NO: 12組成之群的胺基酸序列具有至少9〇%同源性的輕鏈。 47.—種結合於lrp6之兩個不同區的經分離雙特異性抗體，其中該抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有二個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之 154875.doc -6- 201138823 HVR-Hl ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ;及（c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 19之HVR-H3，且包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-HI ; (e)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23之HVR-H2 ;及（f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 24之HVR-H3。 48· —種結合於LRP6之兩個不同區的經分離雙特異性抗體，其中該抗體包含所有三個來自以下之VH HVR序列：（a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-Hl ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 19之HVR-H3 ;及所有三個來自以下之VH HVR序列：（d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-Hl ; (e)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23之HVR-H2 ;及（f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 24之HVR-H3。 49. 一種結合於LRP6之兩個不同區的經分離雙特異性抗體，其中該抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之 HVR-Hl ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 21之HVR-H3，且包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR 序列：（d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-Hl ; (e) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23之HVR-H2 ;及（f)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 24之HVR-H3。 50. —種結合於LRP6之兩個不同區的經分離雙特異性抗體， 154875.doc 201138823 其中該抗體包含所有三個來自以下之VH HVR序列：（a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 17之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)HVR-H3 vSEQ ID NO: 21 ;及所有三個來自以下之VH HVR序列：（d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (e)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23之HVR-H2 ;及（f)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 24之HVR-H3。 5 1. —種結合於LRP6之兩個不同區的經分離雙特異性抗體，其中該抗體包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 20之 HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 18 iHVR-H2 ; (c)HVR-H3 SEQ ID NO: 19，且包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個VH HVR序列：（d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (e)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 23之HVR-H2 ;及（f)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 24之HVR-H3。 52. —種結合於LRP6之兩個不同區的經分離雙特異性抗體，其中該抗體包含所有三個來自以下之VH HVR序列：（a) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 20之HVR-H1 ; (b)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 18之HVR-H2 ; (c)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 19之HVR-H3 ;及所有三個來自以下之VH HVR序列：（d)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 22之HVR-H1 ; (e)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 23之HVR-H2 ;及（f) 包含胺基酸序列SEQ ID NO: 24之HVR-H3。 154875.doc -8- 201138823 53. 如請求項47至52中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體進一步包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個 VL HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之 HVR-L1 ; (b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26 iHVR-L2 ; (c)HVR-L3 SEQ ID NO: 27。 54. 如請求項47至52中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體進一步包含選自以下之所有三個VL HVR序列：（a)包含 φ 胺基酸序列SEQ ID NO: 25之HVR-L1 ; (b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26之 HVR-L2 ; (c)HVR-L3 SEQ ID NO: 27 〇 5 5.如請求項47至52中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體進一步包含選自以下之至少一個、至少兩個或所有三個 VL HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之 HVR-L1 ; (b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26 2HVR-L2 ; (c)HVR-L3 SEQ ID NO: 28。 • 56.如請求項47至52中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體進一步包含選自以下之所有三個VL HVR序列：（a)包含胺基酸序列SEQ ID NO: 25之HVR-L1 ; (b)包含胺基酸序列 SEQ ID NO: 26之 HVR-L2 ; (c)HVR-L3 SEQ ID NO: 28 ° 57. —種結合於LRP6之兩個不同區的經分離雙特異性抗體，其中該抗體包含具有胺基酸序列SEQ ID NO: 15之第一 VH 及選自由包含 SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 11 及 SEQ ID NO: 13之胺基酸序列的VH組成之群的第二VH。 154875.doc 201138823 58_如請求項57之雙特異性抗體，其進一步包含具有SEQ ID NO: 10或SEQ ID NO: 12之胺基酸序列的VL。 59.如請求項57之雙特異性抗體，其中第一 VH包含胺基酸序列SEQ ID NO: 15且第二VH包含胺基酸序列SEQ ID NO: 9 ’且VL包含胺基酸序列SEQ ID NO: 10。 60·如請求項37至59中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體抑制由選自由Wnt3及Wnt3a組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導且抑制由選自由Wnt 1、2、2b、6、8a、 9a、9b及1 〇b組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導。 61. 如請求項37至59中任一項之雙特異性抗體，其中該抗體抑制自分泌Wnt信號傳導。 62. —種經分離雙特異性抗體，其結合於LRP6且抑制由選自由Wnt3及Wnt3a組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導且抑制由選自由Wnt 1、2、2b、6、8a、9a、9b及 l〇b組成之群的Wnt同功異型物誘導之信號傳導。 63·如請求項62之雙特異性抗體，其中該抗體抑制由選自由 Wnt 4、7a、7b及10a組成之群的Wnt同功異型物绣導之信號傳導。 154875.doc •10·