CN111925992B

CN111925992B - 分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗、应用

Info

Publication number: CN111925992B
Application number: CN202011013978.3A
Authority: CN
Inventors: 庄光磊; 臧荣余; 狄文
Original assignee: Suzhou Renduan Bio Medicine Technology Co ltd
Current assignee: Suzhou Renduan Bio Medicine Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2040-09-24
Also published as: CN111925992A

Abstract

本发明提供了分泌抗Wnt‑7a单克隆抗体杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株为1B8A2和/或4G6F3。本发明还提供了上述的分泌抗Wnt‑7a单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，单克隆抗体的抗原表位处于Wnt‑7a蛋白的C端或Wnt‑7a蛋白的M段，处于Wnt‑7a蛋白的C端的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；处于Wnt‑7a蛋白的M段的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。本发明特异性强且灵敏度高，可通过配对检测体液、组织中Wnt‑7a蛋白含量，应用于检测Wnt‑7a蛋白过量表达或诊断以Wnt‑7a蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

Description

分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗、应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株。

背景技术

Wnt蛋白家族由19个分泌糖蛋白组成，主要通过与 Frizzled(Fzd)受体结合参与细胞的增殖、分化及肿瘤生长等多种生物学过程。其中，Wnt-7a （即Wnt7a）属于 Wnt 家族中的经典 Wnt 信号分子,通过经典的 Wnt / β-catenin 信号过程参与多种恶性肿瘤的发生发展。Wnt-7a的分子量为39kDa，含有349个氨基酸，在分泌之前剪切为含有318个氨基酸、分子量为48KD的成熟蛋白。在氨基酸水平上，人Wnt-7a蛋白和小鼠的Wnt-7a蛋白具有98%的相似性。Wnt-7a通常在肺、睾丸、淋巴结和脑中表达，通过Wnt/β-catenin信号通路参与调控细胞的生命活动。

Wnt信号通路对多种正常组织和癌组织的细胞增殖和分化起着重要的调控作用。Wnt信号分子是癌症诊断、治疗和预防以及再生医学、组织工程的有效靶点。己公布的数据显示Wnt-7a在不同类型的恶性肿瘤中表现出不同的表达模式。在浆液性卵巢癌中，CTNNB 1未突变情况下，Wnt-7a通过CTNNB1(13-catenin)／TCF信号通路促进卵巢癌进展；在膀胱癌中，Wnt-7a的过表达促进了肿瘤的转移，并且高表达Wnt-7a蛋白的膀胱癌患者的总生存期较短；在乳腺癌中，Wnt-7a作为一种关键的肿瘤细胞分泌因子，通过诱导成纤维细胞活化而促进肿瘤细胞在体内转移，导致患者预后差。相反，在宫颈癌中，Wnt-7a可以抑制癌细胞的增殖和迁移。在小鼠中，Wnt-7a通过失活S期激酶相关蛋白(一种重要的细胞衰老的替代调节因子)诱导细胞衰老，从而抑制肺癌的发生；在白血病中，Wnt-7a也被鉴定为肿瘤抑制基因。因此Wnt-7a对于卵巢癌的预示具有重要的意义，而市场上现有的检测试剂盒，体系中多采用多克隆抗体，抗体特异性差，不能区分Wnt-7a高度同源家族蛋白，由于其抗体本身效价或特异性的原因，也使得其对Wnt-7a检测的临床效用受到局限，降低了样本检测的特异性，同时也对灵敏度产生一定的影响。因此急需获得特异性识别Wnt-7a蛋白单克隆抗体，满足临床样本检测要求，提高检测的灵敏度和特异性。

现有的检测试剂盒体系中多采用多克隆抗体；抗体特异性差，不能区分Wnt-7a高度同源家族蛋白，由于其抗体本身效价或特异性的原因，也使得其对Wnt-7a检测的临床效用受到局限，降低了样本检测的特异性，同时也对灵敏度产生一定的影响。本发明通过双抗体夹心的原理，利用高亲和力高特异性配对单克隆抗体制备检测试剂盒，采用全自动化学发光仪检测样品浓度。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株；本发明的目的之二在于提供分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体；本发明的目的之三在于提供含有所述单克隆抗体的试剂盒；本发明的目的之四在于提供所述单克隆抗体在制备检测Wnt-7a蛋白试剂中的应用。本发明技术方案的其中一方面，提供了分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株，杂交瘤细胞株为1B8A2和/或4G6F3，保藏于中国典型培养物保藏中心，（保藏中心地址为：中国.武汉.武汉大学，电话：027-68752319），1B8A2保藏编号为CCTCC NO:C202095, 4G6F3保藏编号为CCTCC NO:C202096。

本发明技术方案的其中一方面，提供了上述的分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，单克隆抗体的抗原表位处于Wnt-7a蛋白的C端或Wnt-7a蛋白的M段，处于Wnt-7a蛋白的C端的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；处于Wnt-7a蛋白的M段的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明技术方案的其中一方面，提供了Wnt-7a蛋白检测试剂盒，Wnt-7a蛋白检测试剂盒包含上述单克隆抗体包被的固相载体。在一些实施方式中固相载体可以是磁微粒。

本发明技术方案的其中一方面，提供了Wnt-7a蛋白检测试剂盒，Wnt-7a蛋白检测试剂盒还包含校准品Wnt-7a蛋白、碱性磷酸酶标记的检测抗体和化学发光底物。

本发明技术方案的其中一方面，提供了Wnt-7a蛋白检测试剂盒，化学发光底物为AMPPD，上述单克隆抗体包被的固相载体中的抗体为杂交瘤细胞株1B8A2分泌的单克隆抗体，检测抗体为杂交瘤细胞株4G6F3分泌的单克隆抗体。

本发明技术方案的其中一方面，提供了上述单克隆抗体的应用，单克隆抗体用于制备检测Wnt-7a蛋白过量表达或诊断以Wnt-7a蛋白异常表达的试剂中。

本发明技术方案的其中一方面，提供了上述单克隆抗体的应用，上述试剂用于制备Wnt-7a蛋白检测试剂盒。

本发明技术方案的其中一方面，提供了分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，使用引物为：Wnt-7a-F：5’-TACACGTGCAAGTGA-3’(SEQ ID NO.1)；Wnt-7a-R：5’-CGCTTTCCGGTTCAT-3’)(SEQ ID NO.2)。

本发明提供的两种单克隆抗体可用于样品中Wnt-7a蛋白的检测，且特异性强、灵敏度高；两种单克隆抗体特异识别Wnt-7a的不同区段，特异性更好。可通过配对检测体液、组织中人Wnt-7a含量，应用于检测Wnt-7a蛋白过量表达或诊断以Wnt-7a蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

本发明的有益效果在于：本发明通过获得分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株，获得针对Wnt-7a不同抗原表位的单克隆抗体2种，特异性强且灵敏度高，可通过配对检测体液、组织中Wnt-7a蛋白含量，应用于检测Wnt-7a蛋白过量表达或诊断以Wnt-7a蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

附图说明

图1为重组Wnt-7a蛋白SDS-PAGE电泳图；

图2为1B8A2、3G5G2和4G6F3抗体SDS-PAGE电泳图；

图3为Wnt-7a截断蛋白免疫印迹WB检测结果；

图4为试剂条示意图；

图5为ROC曲线图。

具体实施方式

下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J .萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、Wnt-7a的重组蛋白表达和纯化

从卵巢癌组织提取RNA后经随机引物RT-PCR得到的cDNA为模板，设计引物进行Wnt-7a基因的克隆，引物具体为：Wnt-7a-F：5’-TACACGTGCAAGTGA-3’(SEQ ID NO.1)；Wnt-7a-R：5’-CGCTTTCCGGTTCAT-3’)(SEQ ID NO.2)。扩增的Wnt-7a基因插入到含有6×His标签的pcDNA3.1载体上，得Wnt-7a-pcDNA3.1。然后将Wnt-7a-pcDNA3.1转化至DH5α，挑取阳性克隆并大量培养后，用高纯度质粒提取试剂盒提取重组质粒Wnt-7a-pcDNA3.1。重组质粒转入293T细胞中，并同时转染pcDNA3.1空载体作为阴性对照，分别在含10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO₂条件下培养72h，收集上清，利用0.22μm滤膜过滤上清液。

将所得500mL滤液进行非变性条件下的Ni-NTA亲和层析，平衡缓冲液为50mM PBS、10mM咪唑、150mM NaCl，pH7.6。上样完毕后，清洗10mL；用50mM PBS、250mM咪唑、150mMNaCl，pH7.6洗脱，收集洗脱液。利用15kD超滤管浓缩蛋白溶液，将蛋白保存于pH 7.4 50mMPBS缓冲液中，-80℃保存。纯化的蛋白进行SDS-PAGE电泳纯度鉴定，分子量大小在39kD左右，灰度分析表明蛋白纯度达到95％以上，见图1。

实施例2、Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备

小鼠免疫：用Wnt-7a蛋白免疫3批BALB/c小鼠，每次3只。每只小鼠每次免疫50μg抗原。首次免疫Wnt-7a抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，随后Wnt-7a与弗氏不完全佐剂1:1混合，每隔两周免疫一次，共免疫3次，第三次免疫十天后断尾采血，检测血清效价。

杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:100000后用Wnt-7a抗原(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在50mL离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1mL预热50％PEG-1450作用。

1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清DMEM培养基15mL，37℃水浴5min，然后补加无血清DMEM培养基至40mL，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40mL预热的HAT 培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μL，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞3株，分别为1B8A2、3G5G2和4G6F3。

实施例3、Wnt-7a单克隆抗体制备、纯化、效价检测及特异性分析

单抗腹水制备：将筛选的3种杂交瘤细胞株分别在培养基中培养至90％密度，收集细胞，将细胞稀释至3×10⁶个/mL。10-12周BALB/c小鼠适应性饲养一周后，腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5mL/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的杂交瘤细胞，约(1-2)×10⁶/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，合并收集腹水上清。

抗体纯化：收集小鼠腹水，用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mM PBS溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1mL/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mM PBS，pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH 9.0 Tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mM PBS溶液透析3次。将透析后的抗体进行10％SDS-PAGE电泳，结果显示，3种抗体在55kD与20kD处有条带，灰度分析纯度均大于90％，1B8A2、3G5G2和4G6F3抗体SDS-PAGE见图2所示。

单克隆抗体效价检测：以1μg/ml的重组Wnt-7a蛋白的碳酸盐缓冲液(pH9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体 (1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000)，加入羊抗鼠IgG-AP(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(S/N>2.1)，1B8A2、4G6F3和3G5G2单克隆抗体效价均为1:128000。

单克隆抗体特异性分析：分别以1μg/ml的Wnt-7a、Wnt7b和Wnt8a蛋白的CBS缓冲液100μl体积4℃过夜包被微孔板，将各个抗体倍比稀释(500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml和0ng/ml)后加入到微孔反应板，然后加入羊抗鼠 IgG-AP(50ng/ml)，结果如表1所示。结果确定1B8A2特异性识别Wnt-7a蛋白，4G6F3和3G5G2与Wnt7b和Wnt8a蛋白均可反应，故1B8A2可作为试剂盒的捕获抗体用于特异性识别Wnt-7a。

表1.单克隆抗体特异性分析

实施例4、Wnt-7a单克隆抗体配对验证

以3μg/ml 1B8A2抗体包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(10-1600pg/mL)的Wnt-7a校准品，37℃孵育60min，洗涤后分别加入100μL浓度为100ng/ml的AP标记的4G6F3抗体和3G5G2抗体，并于37℃孵育60min，洗涤后加入AMPPD化学发光底物于仪器测定其化学发光值，结果如表2所示。从结果上看，1B8A2与4G6F3配对更佳，灵敏度和发光值更高。

表2 .Wnt-7a单克隆抗体配对结果

校准品（pg/ml）	4G6F3	3G5G2
			0	10	18
50	246.18	615.90
			100	490.53	293.75
200	989.17	516.82
			400	1981.15	474.35
800	4012.79	1148.72
			1600	8317.98	2871.92

实施例5、Wnt-7a单克隆抗体表位鉴定

重组截断Wnt-7a蛋白构建表达：根据Wnt-7a蛋白序列，设计了N、M、C端的序列以及Wnt-7a全长蛋白(记为Wnt-7a-F)，连接表达载体pET30a，并转入表达菌株BL21(DE3)中。在LB培养基中，IPTG 0.1mmol/L 25℃条件下过夜诱导Wnt-7a截断重组蛋白可溶性表达。原核重组表达经6×His标签亲和纯化，纯化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳，纯度均在90％以上。

Wnt-7a-N片段(32-58) (SEQ ID NO.3)：LGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDA；

Wnt-7a-M片段(59-125) (SEQ ID NO.4):

IIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQ；

Wnt-7a-C片段(308-349) (SEQ NO.5)：

CCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK；

Wnt-7a- F片段 (32-349) (SEQ ID NO.6)：

LGASIICNKIPGLAPRQRAICQSRPDAIIVIGEGSQMGLDECQFQFRNGRWNCSALGERTVFGKELKVGSREAAFTYAIIAAGVAHAITAACTQGNLSDCGCDKEKQGQYHRDEGWKWGGCSADIRYGIGFAKVFVDAREIKQNARTLMNLHNNEAGRKILEENMKLECKCHGVSGSCTTKTCWTTLPQFRELGYVLKDKYNEAVHVEPVRASRNKRPTFLKIKKPLSYRKPMDTDLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACNKTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK。

蛋白免疫印迹法WB确认抗体识别表位：重组蛋白Wnt-7a-N/M/C、Wnt-7a全长4种蛋白取5μg 上样，进行15％SDS-PAGE电泳。电泳完成后，150V恒压条件下，蛋白转0.45pgmPVDF。转膜完成后利用含5％BSA的PBST溶液37℃封闭两小时。分别用5μg/mL的抗体(1B8A2/4G6F3)溶液37℃孵育1小时。孵育完成后，加入50ng/ml的兔抗鼠IgG-HRP孵育1小时。清洗完成后，加入DAB显色液进行显色。Wnt-7a全长蛋白作为阳性对照，Wnt-7a-N/M/C片段位置棕色沉淀物质，则表明抗体识别该目的片段。结果显示，1B8A2抗体识别Wnt-7a蛋白的C段，4G6F3抗体识别Wnt-7a蛋白M段，见图3。

实施例6、Wnt-7a检测试剂盒

本实施例提供一种化学发光免疫检测试剂条，试剂条分别设有一个样本孔4和一个检测孔3，从样本孔4依次设有九个试剂孔2、两个反应孔1，如图4。由于所述试剂条除了样本孔中样本为外源添加外，试剂孔中的试剂为预先封装进试剂条，采用铝塑复合材料进行封膜，这些试剂含有包被捕获抗体1B8A2的磁珠保存液、清洗液、AP标记4G6F3检测抗体保存液、底物等试剂。

（一）样本-磁珠孵育

将50μL血浆样本加入试剂条的样本孔4中，将试剂条加入到配套的分析仪器中，仪器中的移液模块将50μL样本转移至反应孔1中，随后将试剂孔2中的100μL含包被捕获抗体1B8A2的磁珠保存液转移至样本所在反应孔1，仪器的温育结构维持反应孔1恒温状态，为37度，30min。

（二）磁珠转移清洗

上一步温育结束，仪器的磁分离模块将反应孔1中的磁微粒吸附富集，随后移液模块将不含磁微粒的废液吸去。然后，移液模块将试剂孔2中的清洗液加入反应孔1中，同时，磁分离模块关闭，移液模块对反应孔1进行吹打混合，静止30秒，磁分离模块启动，将磁微粒吸附，移液模块将清洗液吸去，完成一次清洗。以上清洗步骤进行三次。

（三）检测抗体结合

当清洗完成后，仪器模块将试剂孔2中的200μL AP标记4G6F3抗体转移至反应孔1中，吹打，将磁微粒和抗体混合，仪器的温育结构维持反应孔1恒温状态，为37度，30min。

（四）磁珠转移清洗

（五）信号检测

当上一步清洗完成后，移液模块将反应底物从试剂孔2中转移至反应孔1中，随后，吹打混匀，将混合液吸取转移至检测孔3中，仪器的信号测定模块对检测孔3的信号进行信号采集分析，获得对应的浓度值。

（六）Wnt-7a检测试剂盒用于卵巢癌诊断

从医院收集100例卵巢癌患者术前血清；同时从收集100例健康人员血清。使用Wnt-7a检测试剂盒检测卵巢癌、正常人血清中Wnt-7a浓度。ROC曲线统计结果如图5显示，曲线下面积为0.914,以627ng/mL作为检测参考值，Wnt-7a检测试剂盒特异性为96％，灵敏度为91％。

综上所述，本发明提供的2种单克隆抗体均可用于样品中Wnt-7a蛋白的检测，且特异性强、灵敏度高。2种单克隆抗体特异识别Wnt-7a的不同区段，可通过配对检测体液、组织中人Wnt-7a含量，应用于检测Wnt-7a蛋白过量表达或诊断以Wnt-7a蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。

上述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。

序列表

<110> 苏州仁端生物医药科技有限公司

<120> 分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其单抗、应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tacacgtgca agtga 15

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

cgctttccgg ttcat 15

<210> 3

<211> 27

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 3

Leu Gly Ala Ser Ile Ile Cys Asn Lys Ile Pro Gly Leu Ala Pro Arg

1 5 10 15

Gln Arg Ala Ile Cys Gln Ser Arg Pro Asp Ala

20 25

<210> 4

<211> 67

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Ile Ile Val Ile Gly Glu Gly Ser Gln Met Gly Leu Asp Glu Cys Gln

1 5 10 15

Phe Gln Phe Arg Asn Gly Arg Trp Asn Cys Ser Ala Leu Gly Glu Arg

20 25 30

Thr Val Phe Gly Lys Glu Leu Lys Val Gly Ser Arg Glu Ala Ala Phe

35 40 45

Thr Tyr Ala Ile Ile Ala Ala Gly Val Ala His Ala Ile Thr Ala Ala

50 55 60

Cys Thr Gln

65

<210> 5

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 5

Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asn Thr His Gln Tyr Ala Arg Val Trp Gln

1 5 10 15

Cys Asn Cys Lys Phe His Trp Cys Cys Tyr Val Lys Cys Asn Thr Cys

20 25 30

Ser Glu Arg Thr Glu Met Tyr Thr Cys Lys

35 40

<210> 6

<211> 318

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Leu Gly Ala Ser Ile Ile Cys Asn Lys Ile Pro Gly Leu Ala Pro Arg

1 5 10 15

Gln Arg Ala Ile Cys Gln Ser Arg Pro Asp Ala Ile Ile Val Ile Gly

20 25 30

Glu Gly Ser Gln Met Gly Leu Asp Glu Cys Gln Phe Gln Phe Arg Asn

35 40 45

Gly Arg Trp Asn Cys Ser Ala Leu Gly Glu Arg Thr Val Phe Gly Lys

50 55 60

Glu Leu Lys Val Gly Ser Arg Glu Ala Ala Phe Thr Tyr Ala Ile Ile

65 70 75 80

Ala Ala Gly Val Ala His Ala Ile Thr Ala Ala Cys Thr Gln Gly Asn

85 90 95

Leu Ser Asp Cys Gly Cys Asp Lys Glu Lys Gln Gly Gln Tyr His Arg

100 105 110

Asp Glu Gly Trp Lys Trp Gly Gly Cys Ser Ala Asp Ile Arg Tyr Gly

115 120 125

Ile Gly Phe Ala Lys Val Phe Val Asp Ala Arg Glu Ile Lys Gln Asn

130 135 140

Ala Arg Thr Leu Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Lys Ile

145 150 155 160

Leu Glu Glu Asn Met Lys Leu Glu Cys Lys Cys His Gly Val Ser Gly

165 170 175

Ser Cys Thr Thr Lys Thr Cys Trp Thr Thr Leu Pro Gln Phe Arg Glu

180 185 190

Leu Gly Tyr Val Leu Lys Asp Lys Tyr Asn Glu Ala Val His Val Glu

195 200 205

Pro Val Arg Ala Ser Arg Asn Lys Arg Pro Thr Phe Leu Lys Ile Lys

210 215 220

Lys Pro Leu Ser Tyr Arg Lys Pro Met Asp Thr Asp Leu Val Tyr Ile

225 230 235 240

Glu Lys Ser Pro Asn Tyr Cys Glu Glu Asp Pro Val Thr Gly Ser Val

245 250 255

Gly Thr Gln Gly Arg Ala Cys Asn Lys Thr Ala Pro Gln Ala Ser Gly

260 265 270

Cys Asp Leu Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Asn Thr His Gln Tyr Ala

275 280 285

Arg Val Trp Gln Cys Asn Cys Lys Phe His Trp Cys Cys Tyr Val Lys

290 295 300

Cys Asn Thr Cys Ser Glu Arg Thr Glu Met Tyr Thr Cys Lys

305 310 315

Claims

1.分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株为两种杂交瘤细胞株，所述两种杂交瘤细胞株为1B8A2和4G6F3，保藏于中国典型培养物保藏中心，所述1B8A2保藏编号为CCTCC NO:C202095,所述4G6F3保藏编号为CCTCC NO:C202096。

2.权利要求1所述的分泌抗Wnt-7a单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的抗原表位处于Wnt-7a蛋白的C端和Wnt-7a蛋白的M段，处于Wnt-7a蛋白的C端的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；处于Wnt-7a蛋白的M段的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。

3.Wnt-7a蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述Wnt-7a检测试剂盒包含权利要求2所述的单克隆抗体包被的固相载体。

4.根据权利要求3所述的Wnt-7a蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体为磁微粒。

5.根据权利要求4所述的Wnt-7a蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述Wnt-7a蛋白检测试剂盒还包含校准品Wnt-7a蛋白、碱性磷酸酶标记的检测抗体、洗涤液和化学发光底物。

6.根据权利要求3所述的Wnt-7a蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为AMPPD，所述单克隆抗体包被的固相载体中的抗体为杂交瘤细胞株1B8A2分泌的单克隆抗体，所述检测抗体为杂交瘤细胞株4G6F3分泌的单克隆抗体。

7.权利要求2所述的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述单克隆抗体用于制备检测Wnt-7a蛋白过量表达或诊断以Wnt-7a蛋白异常表达的试剂中。

8.根据权利要求7所述的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述试剂用于制备Wnt-7a蛋白检测试剂盒。