TW200835792A - Process for the biological production of n-butanol with high yield - Google Patents

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200835792 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係包括藉由代謝性工程微生物將可發酵的碳 源生物轉化高產率正丁醇的方法。 【先前技術】 本發明之背景 正丁醇為具有中度揮發性且微溶混於水（大約7-8%) 之無色，中性液體，但可與所有的一般溶劑例如，甘 油’酮類，醇，醛類，醚類，及芳族與脂族烴類自由地 溶混。正丁醇係用於i)製造其他化學品，Η)作為溶劑及 iii)作為調配的產物例如化桩品中之組成份。正丁醇作 為原料主要係用在丙嫦酸酯/曱基丙烯酸酯，乙二醇 _，正丁基醋酸酯，胺基樹脂及正丁胺之合成中。目 前，全世界每年消耗之丁醇超過九百萬噸。 最近已顯示正丁醇由於較低的揮發壓，較高的能含 里（接近石油者）及於水存在時較低的分離敏感性，而成 為比乙醇為佳之生物燃料。此外，正丁醇比乙醇，可以 車^同的濃度拌合使用於標準車輛引擎中且不需要汽車製 化者為了符合環保法規而在效益上妥協；其亦適合於管 、表運送且因此其具有快速導入汽油中之潛能且避免需要 ’、他大規核的支援次結構(infrastructures)。 正丁醇可藉由溶制產生之（s〇lvent〇genic)梭菌之碳 水化合物發酵作用而製成丙酮/正丁醇/乙醇(ABE)混合 5 200835792 物ABE發酵作用係二相的。於第一個酸產生 (ac^dogemc)相中，高成長速率伴隨著醋酸及丁酸生成。 於第j溶難生相中，生長速率降低且_(僅)係 共伴著第一個相中所產生之有機酸的消耗時生成。整個 發酵過程中皆生成二氧化碳及氫。 顯示於圖1中者，正丁醇之生物製造需要形成丁醯 基-CoA作為中間體，其可依生理條件，藉由經adhEi 及adhEf、編碼之二種不同的雙_官能性盤_醇脫氮酶而降 低。丁&^_CoA亦可藉由分別經ptb及触基因所編 碼之磷-轉化丁醯酶及丁酸酯激酶而轉化為丁酸。丙酮 係由乙醯-乙醯基_CoA (丁醯基-C〇A製造中之中間體)藉 由刀別、、二ctfAB及adc基因所編碼之乙酿醋酸醋脫氫酶 而製造。氫係藉由鐵來製造，惟僅氫酶被hydA基因編 碼。當培養係在-氧化碳存在下進行時，氫酶抑制劑， 正丁醇，乙醇及乳酸酯為主要的發酵產物。乳酸酯係從 丙酮酸酯藉由Idh基因編碼之乳酸酯脫氫酶生成。 具有不活性buk基因之醋酪酸梭菌菌株（用不可複 製的質體藉單一交換而獲得）業已說明於論文（葛林等， 1996)中。將具有〇·8 kb内buk斷片之不可複製的載體 PJC4BK整合為染色體buk基因，其導致内因性基因不 活化。該所獲得之菌株因質體之名稱而稱為，，突變種 PJC4BK”。如該論文中所說明者，由於藉由質體切除進 行此類型基因去活化作用而逆轉成野生型之不穩定性， 因此，此基因整合並未完全削弱酵素活性亦不會形成丁 6 200835792 ，酯。因而此突變菌株被使用於許多研究中（葛林及柏 示特，1998 ;迪塞及哈里斯，1999 ;哈里斯等，

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20 傳統上，由於連續培養所產生之梭_不穩定，市隹 發_麗純錢灯騎。許乡產生^ 的發酵方法業已說明。這些方法以比例6 ·· 3: i產生正 丁醇，_及乙醇。可發酵的碳源產生29_34%之溶劑 (於正丁醇時僅18-25%)業已報導於文獻中。由於所產生 之正丁醇的毒性，-般的極限為16_24克/升總溶劑濃度 及10 14克/升正丁醇濃度。然而，這些溶劑之低滴定度 對於該方法似乎不再是經濟關，因為最近已顯示出溶 劑可於發酵期間使用"低成本”的氣提技術來回收。 本發明所要解決的問題是獲得不具丁酸酯激酶活性 之穩定的突變菌株，其可被培養達數代而無任何反轉成 野生型基因型的可能性。該菌株可由便宜的碳基質，例 如，葡萄糖或其他糖類，藉由基因穩定的梭菌培養株用 於生物製造高產率正丁醇。於工業級可實施之正丁醇的 製備方法中，由於去活化之生物化學步驟的總數及代謝 規則的複雜度’促使必須使用經代謝性工程處理的全細 胞催化劑。 7 200835792 【發明内容】 μ 決了所說明的問題且本發明係提供藉 、= 培養株用於將可發酵的碳源生物轉化 為以正丁為主要產物的方法。葡萄_用作為模式

10 15 基質且重組體醋_梭8係用作為模式寄主。於本發明 之方面中不犯將丁醯基-CoA代謝成丁酸酯之穩定 重組體醋梭g係藉著將編碼了 _旨激酶(buk)之基因 去除而構築。於本發明之另_方面中，不能產生丙銅之 重組體醋⑽梭g係藉著將編碼CgA_轉化酶(etfAB)之 基因去除而構築。於本發明之其他方面中，不能產生乳 酸酉曰之重組體菌株係藉著將編碼乳酸酯脫氫酶(ldh)之基 因去除而構築。再者，不能產生醋酸酯之重組體醋酪酸 梭菌係藉著將編碼磷轉化乙醯酶及/或醋酸酯激酶(pta及 ack)之基因去除而構築。於本發明之最終方面中，氫製 造之通量係降低且然後所降低之等效通量係藉由削弱編 瑪鼠酶(hydA)之基因再指向正丁醇之製造。 本發明通常可應龍包括可容易地轉化為乙酿基· CoA之任何碳基質。 因此，本發明之目的係提供用於製造正丁醇之重組 體微生物’其包括：⑷至少將涉及丁縣·Cga轉化為 丁酸醋之二種基因之-去除且(b)至少將編碼Cqa_轉化 酶活性之二種基因之一去除。重組體微生物可任音包括 〇選自包括下列之内因性基因的不活化突變株：（:)編碼 8 20 200835792 具有乳酸酯脫氫酶活性之多胜肽的基因（b)編碼具有磷-轉化乙醯酶或醋酸酯激酶活性之多胜肽的基因及ii)將編 碼具有氫酶活性之多胜肽的基因削弱。 5

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20 於另一個具體例中，本發明係提供用於由重組體微 生物製造高產率正丁醇的穩定方法，其包括：（a)將本發 明之重組體微生物與至少一個選自包括單醣類，寡醣 類，多醣類，及單一碳基質之石炭源接觸而產生正丁醇； 任意（b)於製造中經由氣提法之步驟回收正丁醇且（c)藉 蒸餾法從冷凝物中將正丁醇予以純化。 里之詳細說明 本文中所使用之下列名詞可用於詮釋申請專利範圍 及說明書。 ’’微生物一岡係指所有種類之單細胞微生物，包括 原核微生物如細菌，及真核微生物如酵母。 ’適當的培養介質"用詞係指最適於所使用之微生物 的培養介質如同此方面技藝之人士所熟知者。 石反基質或石炭源”一詞係指任何能夠被微生物所代 謝的碳源、’巧’該基f中含有至少—個碳原子。特別 的”可為葡萄糖’蔗糖，單一或募醣類，殿粉或其衍 生物，甘油，及其等之混合物。 削弱聽^低的基目魏 基因產物之活性。熟知此方面技藝 果的方法，且例如： 9 200835792 ’或該經 -將突變導人基因巾’降低此基因之表現程度 編碼之蛋白質的活性度。 •基因之天然促進子㈣度低的促進子替代，導致較低 的表現。 一 •使用該相關訊息RNA或蛋白質不穩定的元素。 -如果不需要表現，將基因去除。 去除的基因一詞係指該基因之編碼序列的實質部

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份被移除。健者’至少5G%之編碼序顺移除，、且更 佳為至少80%。 於本發明之說明書中，酵素係以其等特定之活性來 確認。因此該定義係包括所有亦存在於其他生物中，更 特別為於其他微生物中，具有經定義之特定活性的多胜 肽。具有類似活性之酵素經常可藉由其等歸屬於特定家 族如PFAM或COG所定義者而被確認。 PFAM(排比及隱藏的馬可夫模式之蛋白質家族資料 庫；Mi£://www.san狀r.ac.uk/Softw抑e/Pbm/)代表大量 收集之蛋白質序列排比。各個PFAM儘可能地顯示多重 排比，觀看蛋白質區域，評估於生物中之分佈，獲准進 入其他資料庫，及顯示已知的蛋白質結構。 COGs (蛋白夤之同源群組（orthologous group)叢 集；http://wwv^ncbi.nlm.nih.g〇v/COGA 係從 43 個代表 30個主要種系發生系之完整定序的染色體組中藉著比 較蛋白質序列而獲得。各個COG係從至少三個系中界 疋’其同意先ji’j保存之區域的鑑定。 20 200835792

鑑定同質性序列及其等百分比同質性的方法係精於 此方面技藝之人士所熟知者，且特別包含BLAST程 式，其可從ΜίριΖ/^ν^ικ^.ηΙηχ.ηϋυον/ΒΚΑ^ΙΤ/ 網站使 用該網站中所指明之預設參數來操作。然後將所得到的 序列（例如，組合），利用程式例如，CLUSTALW

(http;//www,ebi.__ac.uk/clustalwA 或 MULTALIN (http>//prodes>touiouse. inra· fr/multalin/cgi-bin/multalin.pl)使用 那些網站上所指明之預設參數來操作。 那些精於此方面技藝者使用基因庫（GenBank)中所 給定之已知基因的參考時能夠測定在其他生物，細菌菌 株，酵母，真菌，哺乳類，植物等中之相等基因。該例 行工作可使用一致序列（consensus sequence)，其係藉由 其他彳政生物所衍生的基因來進行序列排比而有利地完 成，且設計簡併探針(degenerate probe)而選殖另一個生 物中之相關基因。此等分子生物學的例行方法係精於此 方面技藝者所熟知，且係說明於例如，山布魯克等 (1989分子職··實驗室手札第2版，冷春港實驗室， 冷春港，紐約）中。 本發明係提供用於發酵批次或連續製造正丁醇的方 法，其係藉著將微生物於包含碳源之適當培養介質中培 育’且同時從培養中回收正丁醇，其中，微生物中至少 有一種涉及丁酸酯形成之基因被去除。 &本發明之特定具體例係提供其中微生物係經改質而 不旎將丁醯基_(：〇八轉化為丁酸酯的方法，其係由於至 11 200835792 少有一種編碼磷-轉化丁醯酶(ptb)或丁酸酯激酶(buk)之 基因被去除。於梭菌中基因之去除可使用最近於專利申 請案PCT/EP2006/066997中所說明的方法來完成，其容 許i)將要去除的基因用紅彳致素抗藥性基因替代且⑴ 用重組酶移除紅黴素抗藥性基因。 於本發明之另一個具體例中，微生物不能產生丙酮 係由於至少有一種涉及丙酮形成之基因被削弱或去除。 較佳者’此基因係編碼酵素c〇A，化酶(ctfAB)或乙醯 酉曰酉文酉曰脫幾^酶^如）。此荨基因中之一者之去除，可使用 最近於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明的方法 來完成。 於本發明之其他具體例中，本發明之方法中所用的 微生物不能產生乳酸酯。特別的，其可能係由於將編碼 乳酸酯脫氫酶之基因Idh去除。idh之去除可使用最近 於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明的方法來完 成。 於另一個具體例中’微生物係經如此方式改質而不 能產生醋酸酯。此結果可藉著將至少一個涉及醋酸酯形 成者予以去除而達成。較佳者，該基因係選自包括編碼 磷_轉化乙醯酶(pta)或醋酸酯激酶(ack)之基因者。將此 等基因中之一個去除可使用最近於專利申請案 PCT/EP2006/066997中所說明的方法來完成。 本發明之具體例亦提供具有降低氫之製造通量且然 後將降低之等效通量再指向正丁醇製造之微生物 ;且可 12 200835792 藉由削弱編碼氫酶(hydA)(其係一種酶，提供貯存區 (sink)以降低等效量之氫產製型式）的基因來達成。削弱 hydA時，可藉著將天然的啟動子用強度較低的啟動子 來替代’或藉由可使相關的訊息RNA或蛋白質不穩定 之元素來達成。如果需要，亦可藉著將相關DNA序列 去除而達到將基因完全削弱。

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較佳為，所使用的微生物係選自包括丁酸梭菌，拜 葉林克氏梭菌（C· beijerinkckii)，糖過丁丙酮梭菌（c· saccharoperbutylacet〇nicum)或糖丁 酸梭菌（c sacchar〇_ butylicum)者。 於本發明之另一個具體例中，培養係連續且穩定 的0 於另個具體例中，根據本發明的方法包括下列的 步驟： ⑻將微生，與至少_個選自包括葡萄糖，木糖，阿拉 伯糖’蔗糖，單_類，寡醣類，多醣類，纖維素， 糖’騎或其衍生物者及甘油之碳源接觸藉以 產生正丁醇。 ⑻於發酵作財藉氣提法爾正丁醇且 ⑷籍蒸顧法從冷凝物中將正丁醇單離出來。 物的：此Ξ面技藝者能夠定義根據本發明之微生 ^ 2〇〇C^ 55〇CfBl ^ ^

之溫度發酵。 更彳枝㈣係於約35°C 20 200835792 ，酵作用—般係在含有適於所採用細菌的已知 組成物之無機培養介質的發酵器中進行，其包括至小: 種J單的碳源，且如果需要’製造該代謝物所需‘辅- 基貝。 本發明亦關於如前文所說明的微生物。較佳者，此 微生物係選自包括祕酸梭菌，拜葉林克氏梭菌，糖^ 丁丙酮梭菌或糖丁酸梭菌者。

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【實施方式】 實例1 不能產生丁酸酯之菌株的構築··醋酪酸梭菌 Acacl515AuppAbuk 為了去除buk基因，係使用克勞斯及索凱爾（2〇〇6) 於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明之同質性重 組體方式。該方式容許紅徽素抗藥性g挿入，同時去除 大部份有關的基因。pCons::upp中之buk去除匣係構築 如下。 14 200835792 表1 :引子序列 名稱 引子序列 Bukl SEQIDN° 1 aaaaggatcctagtaaaagggagtgtacgaccagtg Buk2 SEQIDN° 2 ggggtcgcgaaaaaaggggggattattagtaatctatacatgttaac attcctccac Buk3 SEQIDN° 3 cccccttttttcgcgaccccacttcttgcacttgcagaaggtggac Buk4 SEQIDN0 4 aaaaggatcctctaaattctgcaatatatgccccccc BukO SEQIDN° 5 ataacaggatatatgctctctgacgcgg Buk5 SEQ IDN° 6 gatcatcactcattttaaacatggggcc

圍繞buk之二個DNA斷片係經具有來自醋酪酸梭 5 菌總DNA之Pwo聚合酶作為模板及二個特定寡聚核苷

酸對予以PCR放大。以BUK 1-BUK 2及BUK 3-BUK 4 _ 引子對，分別得到二個DNA斷片。引子BUK 1及BUK

4二者係導引BamHI位置，而引子BUK 2及BUK 3具 有互補區其導引Nml位置。將DNA斷片BUK 1-BUK 2 10 及BUK 3-BUK 4係在以引子BUK 1及BUK 4之PCR 融合實驗中連接，且將所產生的斷片於pCR4-TOPO-Blunt中選殖以產生pT〇p〇:buk。於pTOPO: buk獨特之 StuI位置上，將兩邊皆具有FRT序列之抗生素抗藥性 MLS基因從puC18-FRT-MLS2之StuI斷片中導引出 15 200835792 來。於產生之質體BamHI消化後將所得到之BUK去除 匣選殖至pCons::upp中於BamHI上以產生卩^£?厶611尺:: upp質體。 pREPABUK::upp質體係藉由電穿孔醋酪酸梭菌 MGCAcacl5Aupp菌株而使用於轉化。於陪替氏培養皿

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上選出對抗紅黴素(40微克/毫升）之選殖後，將一菌落 培育於具有40微克/毫升紅黴素之液態合成介質中達24 小時且將100微升未稀釋之培養物平板塗抹至具有40 微克/毫升紅黴素及400//M 5-FU之RCA上。將對抗紅 黴素及5-FU二者之菌落影印接種至具有4〇微克/毫升 紅黴素之RCA上及具有50微克/亳升曱磺氯黴素之 RCA上，以選出其中5_FU抗藥性亦伴隨著甲磺氯徽素 敏感性之祕。對紅黴素抗藥及對甲料黴素敏感之菌 落的基因㈣藉自PCR分析(具有5丨子BUK()&BUK5 位於buk去除£外面）來檢查。將已喪失卿馳也尋 之Acacl5AuppAbuk:: mlsR菌株單離出來。 _el5AUPPAbuk::mlsR菌株係用來自啤酒酵母編碼 F1P重組酶表額pl基因之pCLFU載料轉化。於 t 養Γ上轉化且選出對抗甲石黃氯徽素(5〇微克/毫 升）之廷瘦後’將一個菌落於且右50外± — «产* 音夕人具有錢/毫升甲磺氯黴 = 培育且將適當的稀釋液平板塗抹至 八有50 4克/毫升甲磺氯徽素之RCa 素抗藥菌落以影印接種至 ，將曱 上及具有5G微克/亳升曱魏黴素之RCA上。具 20 200835792 有紅黴素敏感性及甲磺氯黴素抗藥性之菌落的基因型係 • 藉由具有引子BUK 0及BUK 5之PCR分析來檢查。進 . 行具有紅黴素敏感性及曱磺氯黴素抗藥性之

Acacl5AuppAbuk菌株之二個連續24小時培育以便去除 5 pCLFl.l。將已去除 pCLFl.l 之Acacl5AuppAbuk 菌株根 據其對紅黴素及曱磺氯黴素二者之敏感性予以單離。 實例2 _ 不能產生丁酸酯及丙酮之菌株的構築：醋絡酸梭菌

10 AcaclSISAuppAbukActfAB 為了去除ctfAB基因，係使用克勞斯及索凱爾 (2006)於專利申請案pCT/Ep2〇〇6/〇66997中所說明之同 質性重組體方式。該方式容許紅黴素抗藥性匣挿入，同 時去除大部份有關的基因。pCons::upp中ctfAB去除昆 15 係構築如下。 17 200835792 表2 ·引子序列 名稱 引子序列 Ctf 1 sEQIDN〇 7 aaaaggatcccagacactataatagctttaggtggtacccc Ctf 2 SEQ ID N。8 ggggaggcctaaaaagggggattataaaaagtagttgaaatatgaagg tttaaggttg Ctf 3 SEQIDN。9 ccccctttttaggcctccccatatccaatgaacttagacccatggctg Ctf 4 —----— seqidn° 10 ——-_ aaaaggatccgtgttataatgtaaatataaataaataggactagaggcg Ctf 〇 SEQIDN0 11 taccaccttctttcacgcttggctgcgg Ctf 5 SEQIDN0 12 tatttaaagaggcattatcaccagagcg 圍繞ctfAB之二個DNA斷片係經具有來自醋酪酸 梭菌總DNA之Pwo聚合酶作為模板及二個特定寡聚梭 答酸對予以PCR放大。以CTF 1-CTF 2及CTF 3-CTF 4 引子對，分別得到二種DNA斷片。引子CTF 1及CTF 4二者係導引BamHI位置，而引子CTF 2及CTF 3具 有互補區其導引StuI位置。將DNA斷片CTF 1-CTF 2 及CTF 3-CTF 4係在以引子CTF 1及CTF 4之PCR融 合實驗中連接，且將所產生的斷片於pCR4-TOPO-Blunt 中選殖以產生pTOPO: CTF。於pTOPO: CTF獨特之 StuI位置上，將兩邊皆具有FRT序列之抗生素抗藥性 MLS基因從puci8-FRT-MLS2之StuI斷片中導引出 來。於產生之質體BamHI消化後將所得到之UPP去除 18 200835792 匣選殖至pCons::upp中於BamHl位置上以產生 pREPACTF::upp 質體。 ， PREPACTFzupp質體係藉由電穿孔醋酪酸梭菌 MGCAcacl5AuppAbuk菌株而使用於轉化。於陪替氏培 5 養皿上選出對抗紅黴素(40微克/毫升）之選殖後，將一 菌落培育於具有40微克/毫升紅黴素之液態合成介質中 達24小時且將1〇〇微升未稀釋之培養物平板塗抹至具 有40微克/毫升紅黴素及400Mm 5-FU之RCA上。將 瞻 對抗紅黴素及5-FU二者之菌落以影印接種至具有4〇微 10 克/毫升紅彳放素之RCA上及具有50微克/毫升曱磺氯徽 素之RCA上，以選出其中5-FU抗藥性亦伴隨著甲磺氯 黴素敏感性之菌落。對紅黴素抗藥及對甲磺氯黴素敏感 之囷洛的基因型係藉由PCR分析（具有引子CTF 0及 CTF 5位於ctfAB去除匿外面）來檢查。將已喪失 15 PREPACTF::upp 之Acacl5AuPP △bukActfAB::mlsR 菌株單 離出來。 ⑩ 菌株係用來自啤酒酵 母編碼Flp重組酶表現Flpl基因之pCLFi 1載體予以 轉化。於陪替氏培養皿上轉化且選出對抗曱磺氯黴素 2〇 (50微克/毫升)之選殖後，將一菌落於具有50微克/毫升 曱石頁氯彳放素之合成液體介質上培育且將適當的稀釋液平 板塗抹至具有微克/毫升甲磺氯黴素之RCA上。將 曱石黃氯黴素抗樂菌洛以影印接種至具有微克/毫升紅

黴素之RCA上及具有50微克/毫升甲磺氯黴素之RCA 19 200835792 上。具有紅黴素敏感性及甲磺氯黴素抗藥性之菌落的& β 因型係藉由具有引子CTF 0及CTF 5之PCR分析來二 - 查。進行具有紅黴素敏感性及曱磺氯黴素抗藥性之

Acacl5AuppAbukActfAB菌株之二個連續24小時培育以 5 便去除 pCLFl.l 。將已去除 pCLFl.l 之

Acac 15AuppAbukActfAB菌株根據其對紅黴素及甲错氯 黴素二者之敏感性予以單離。 _ 實例3 1〇 不能產生丁酸酯，丙酮及乳酸酯之菌株的構築：醋路 酸梭菌 Acacl515AuppAbukActfABAldh 為了去除ldh基因，係使用克勞斯及索凱爾（2006) 於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明之同質性重 組體方式。該方式容許紅黴素抗藥性匣挿入，同時去除 15 大部份有關的基因。pCons::upp中ldh去除匣係構築如 下。 20 200835792 表3 :引子序列

名稱 引子序列 Ldh 1 SEQIDN。13 AAAAGGATCCGCTTTAAAATTTGGAAAGAGGA ’ AGTTGTG Ldh 2 SEQIDN0 14 GGGGAGGCCTAAAAAGGGGGTTAGAAATCTTT AAAAATTTCTCTATAGAGCCCATC Ldh 3 SEQIDN。15 CCCCCTTTTTAGGCCTCCCCGGTAAAAGACCTA AACTCCAAGGGTGGAGGCTAGGTC Ldh 4 SEQIDN0 16 AAAAGGATCCCCCATTGTGGAGAATATTCCAA AGAAGAAAATAATTGC Ldh 0 SEQIDN。17 CAGAAGGCAAGAATGTATTAAGCGGAAATGC ’ Ldh 5 SEQIDN0 18 CTTCCCATTATAGCTCTTATTCACATTAAGC 圍繞ldh (CAC267)之二個DNA斷片係經具有來自 5 醋酿酸梭菌總DNA之Pwo聚合酶作為模板及二個特定 寡聚核苷酸對予以PCR放大。以LDH 1-LDH 2及LDH 3-LDH 4引子對，分別獲得1135 bp及1177 bp DNA斷 _ 片。引子LDH 1及LDH 4二者係導引BamHI位置，而 引子LDH 2及LDH 3具有互補區其導引StuI位置。將 10 DNA斷片LDH 1-LDH 2及LDH 3-LDH 4係在以引子對 LDH 1及LDH 4之PCR融合實驗中連接，且將所產生 的斷片於 pCR4-TOPO-Blunt 中選歹直以產生 pTOPO丄DH。於pTOPO.LDH獨特之StuI位置上，將 兩邊皆具有FRT序列之抗生素抗藥性MLS基因從 pUC18-FRT-MLS2之1372 bp StuI斷片中導引出來。於 21 15 200835792 產生之質體BamHI消化後將所得到之UPP去除匣選殖 至 pCons::upp中於 Bamffl位置上以產生 pREPALDH::upp 質體。 pREPALDH::upp質體係藉由電穿孔醋酪酸梭菌 MGC Acacl5AuppAbukActfAB菌株而使用於轉化。於陪 替氏培養孤上選出對抗紅黴素（40微克/毫升）之選殖 後，將一菌落培育於具有40微克/毫升紅黴素之液態合 成介質中達24小時且將1〇〇微升未稀釋之培養物平板 塗抹至具有40微克/毫升紅黴素及4〇〇 μ M 5-FU之 RCA上。將對抗紅黴素及5-FU二者之菌落以影印接種 至具有40微克/毫升紅黴素之rcA上及具有50微克/毫 升曱磺氯黴素之RCA上，以選出其中5-FU抗藥性亦伴 隨著曱磺氯黴素敏感性之菌落。對紅黴素抗藥及對甲磺 氯黴素敏感之菌落的基因型係藉由PCR分析（具有引子 LDH 0及LDH 5位於Idh去除匣外面）來檢查。將已喪 失 pREPALDH::upp 之△cacbAuppAbuk ActfABAldh::mlsR 菌株 單離出來。

Acacl5AuppAbukActfABAldh::mlsR 菌株係用來自啤 酒酵母編碼Flp重組酶表現Flpl基因之pCLF11載體 予以轉化。於陪替氏培養孤上轉化且選出對抗曱磺氯黴 素(50微克/毫升)之選殖後，將一菌落培育於具有5〇微 克/¾升甲磺氯黴素之合成液體介質上且將適當的稀釋 液平板塗抹至具有50微克/毫升甲磺氯黴素之rCa 上。將曱磺氯黴素抗藥菌落以影印接種至具有4〇微克/ 22 200835792 毫升紅黴素之RCA上及具有50微克/毫升甲磺氯徽素 & 之RCA上。具有紅黴素敏感性及曱磺氯黴素抗藥性之

- 菌落的基因型係藉由具有引子LDH 0及LDH 5之PCR 分析來檢查。進行具有紅黴素敏感性及甲續氣黴素抗$ 5 性之Acacl5AuppAbukActfABAldh 菌株之二個連繽 24 ^ 時培育以便去除pCLFl.l。將已去除PCLFU之 Acac 15AuppAbukActfABAldli菌株根據其對紅黴素及甲 石夤氯黴素二者之敏感性予以單離。 10 實例4 不能產生丁酸酯，丙酮，乳酸酯及醋酸酯之菌株的構築： 酷絡酸梭菌 Acac1515AuppAbukActfABAldMpta-ack 為了去除pta及ack基因，係使用克勞斯及索凱爾 (2006)於專利申請案pCT/EP2〇〇6/〇66997中所說明之同 15 質性重組體方式。該方式容許紅黴素抗藥性匣挿入，同 日守去除大部份有關的基因。pCons::upp中pta-ack去除 參 S係構築如下。 23 200835792 表4 :引子序列 名稱 引子序列 PA 1 SEQIDN。19 aaaaggatcctattataacagtcaaacccaataaaatactggg PA 2 SEQIDN0 20 ggggaggcctaaaaagggggttaatccatttgtattttctcccttcataatg PA 3 SEQ IE) N。21 cc ccccctttttaggcctcccctttattttgcatgcttatataataaattatggct gcg PA 4 SEQIDN。22 aaaaggatccgcttttccttcttttacaagatttaaagcc PA 0 SEQIDN。23 cacttttatttatcaagctgtaggcc PA 5 seqii>n。24 tataccttttgaacctaggaaaggc

圍繞pta-ack之二個DNA斷片係經具有來自醋酪酸 5 梭菌總DNA之Pwo聚合酶作為模板及二個特定寡聚核 苷酸對予以PCR放大。以PA 1-PA 2及PA 3-PA 4引子 對，分別獲得二個DNA斷片。引子PA 1及PA 4二者 _ 係導引BamHI位置，而引子PA 2及PA 3具有互補區 其導引StuI位置。將DNA斷片PA 1_PA 2及PA 3-PA 1〇 4係在以引子pa 1及PA4之PCR融合實驗中連接，且 將所產生的斷片於pCR4-T0P0-Bhmt中選殖以產生 ρΤΌΡΌ:ΡΑ。於ρΤΌΡΌ:ΡΑ獨特之StuI位置上，將兩邊 皆具有FRT序列之抗生素抗藥性MLS基因從pUC18-FRT-MLS2之StuI斷片中導引出來。於產生之質體 15 BamHI消化後將所得到之UPP去除匣選殖至 200835792 pCons“upp中於BamHI位置上以產生pREpAPA::upp質 ^ 體。 、 e PREPAPA::UPP質體係藉由電穿孔醋酪酸梭菌 MGCAcacl5AuppAbukActfABAldh 菌株而使用於轉化。 5 於陪替氏培養皿上選出對抗紅黴素(40微克/毫升）之選 殖後，將一囷洛培月於具有40微克/毫升紅徽素之液態 合成介質中達24小時且將1〇〇微升未稀釋之培養物平 板塗抹至具有40微克/毫升紅黴素及400# M 5-FU之 瞻 RCA上。將對抗紅黴素及5-FU二者之菌落以影印接種 10 至具有40微克/毫升紅黴素之RCA上及具有50微克/毫 升曱磺氯黴素之RCA上，以選出其中5-FU抗藥性亦伴 隨著甲石黃氯彳啟素敏感性之菌落。對紅黴素抗藥及對曱磺 氯黴素敏感之菌落的基因型係藉由PCR分析（具有引子 ΡΑ 0及ΡΑ 5位於pta-ack去除匣外面）來檢查。將已喪 15 失 PREPAPA: :upp 之 Acac 15 AuppAbukActfABAldhApta- ack::mlsR菌株單離出來。 _ Acacl5AuppAbukActfABAldhApta-ack::mlsR 菌株係 用來自啤酒酵母編碼Flp重組酶表現Fipl基因之 pCLFl.l載體予以轉化。於陪替氏培養皿上轉化且選出 2〇 對抗甲石黃氯彳致素(50微克/¾升）之選瘇後，將一菌落终 育於具有50微克/亳升甲續氯黴素之合成液體介質上且 將適當的稀釋液平板塗抹至具有5〇微克/毫升曱磺氯黴 素之RCA上。將曱石黃氯黴素抗藥菌落以影印接種至具 有40微克/愛升紅黴素之RCA上及具有50微克/毫升甲 25 200835792 石黃氯黴素之RCA上。具有紅黴素敏感性及曱磺氯黴素 • 抗藥性之菌落的基因型係藉由具有引子PA 0及PA 5之 PCR分析來檢查。進行具有紅黴素敏感性及甲磺氯黴素 抗藥性之△caclSAuppAbukActfAB Aldh Apta-ack 菌株之 5 二個連續24小時培育以便去除pCLFl.l。將已去除 pCLFl.l 之Acaci5AuppAbukActfAB AldhApta-ack 菌株根 據其對紅黴素及甲磺氯黴素二者之敏感性予以單離。 • 實例5 10 具有較低氳製造之菌株的構築：醋路酸梭菌

Acacl515AuppAbukActfABAldhAhydA 為了去除hydA基因，係使用克勞斯及索凱爾（2〇〇6) 於專利申請案PCT/EP2006/066997中所說明之同質性重 組體方式。該方式容許紅黴素抗藥性匣挿入，同時去除 15 大部份有關的基因。Pcons::upp中hydA去除昆係構^ 如下。 v 26 200835792 表5 :引子序列

名稱 引子序列 Hydl SEQIDN° 25 AAAAGGATCCGCCTCTTCTGTATTATGCAAGGA AAGCAGCTGC Hyd2 SEQIDN° 26 GGGGAGGCCTAAAAAGGGGGTATATAAAATAA ATGTGCCTTAACATC TAAGTTGAGGCC Hyd3 SEQIDN° 27 CCCCCTTTTTAGGCCTCCCCGTTTATCCTCCCA AAATGTAAAATATAA TTAAAATATATTAATAAACTTCGATTAATAAAC TTCG Hyd4 SEQIDN° 28 AAAAGGATCCCCTTTTAGCGTATAAAGTTTTAT ATAGCTATTG HydO SEQIDN° 29 CATGTTCTATTGTTACTATGGAAGAGGTAGTAG Hyd5 SEQIDN° 30 GCAGTTATTATAAATGCTGCTACTAGAGC 圍繞hydA (CAC028)之二個DNA斷片係經具有來 5 自醋赂酸梭菌總DNA之Pwo聚合酶作為模板及二個特 ® 定寡聚核苷酸對予以PCR放大。以HYD 1-HYD 2及 HYD 3-HYD 4引子對，分別獲得1269 bp及1317 bp DNA斷片。引子HYD 1及HYD 4二者係導引Bamm 位置，而引子HYD 2及HYD 3具有互補區其導引stul 10 位置。將 DNA 斷片 HYD 1-HYD 2 及 HYD 3-HYD 4 係 在以引子HYD 1及HYD4之PCR融合實驗中連接，且 將所產生的斷片於pCR4-TOPO-Blunt中選殖以產生 pTOPO: HYD。於pTOPO:HYD獨特之StuI位置上，將 200835792 兩邊皆具有FRT序列之抗生素抗藥性]^1^基因從 pUC18-FR1T-MLS2之1372 bp StuI斷片中導引出來。於 產生之質體BamHI消化後將所得到之UPP去除匣選殖 至 pCons::upp 中於 BamHI 位置上以產生 pREPAHYD::upp 質體。 pREPAHYD::upp質體係藉由電穿孔醋酪酸梭菌 MGCAcacl5AuppAbukActfABAldh 菌株而使用於轉化。 於陪替氏培養里上選出對抗紅黴素(4〇微克/毫升）之選 殖後，將一菌落培育於具有40微克/毫升紅黴素之液態 合成介質中達24小時且將1〇〇微升未稀釋之培養物平 板塗抹至具有40微克/毫升紅黴素及4〇〇//M 5-FU之 RCA上。將對抗紅黴素及5-FU二者之菌落以影印接種 至具有40微克/毫升紅黴素之rCA上及具有5〇微克/毫 升甲磺氯黴素之RCA上，以選出其中5_FU抗藥性亦伴 隨著曱磺氯黴素敏感性之菌落。對紅黴素抗藥及對曱磺 氣Μ素敏感之菌落的基因型係藉由PCR分析（具有引子 HYD 0及HYD 5位於hydA去除匣外面）來檢查。將已 喪失 pREPAHYD::—之 Acacl5AuppAbukAct仪BAldh

AhydA::mlsR菌株單離出來。 △cacl5AuppAbukActfABAldMhydAzmlsR 菌株係用 來自啤酒酵母編碼Flp重組酶表現pipl基因之pCLFl」 載體予以轉化。於陪替氏培養孤上轉化且選出對抗甲石黃 氯黴素(50微克/毫升）之選殖後，將一菌落培育於具有 50微克/¾升曱磺氣黴素之合成液體介質上且將適當的 28 200835792 稀釋液平板塗抹至具有50微克/毫升曱磺氯黴素之RCA 上。將曱磺氯黴素抗藥菌落以影印接種至具有40微克/ • 毫升紅黴素之RCA上及具有50微克/毫升甲磺氯黴素

之RCA上。具有紅黴素敏感性及甲績氯黴素抗藥性之 5 菌落的基因型係藉由具有引子HYD 0及HYD 5之PCR 分析來檢查。進行具有紅黴素敏感性及甲磺氯黴素抗藥 性之Acac 15AuppAbuk ActfABAldhAhydA 菌株之二個連 續24小時培育以便去除pCLFl.l。將已去除pCLFl.l 釀之Acacl5 AuppAbukActfAB AldhAhydA 菌株根據其對紅 10 黴素及甲磺氯黴素二者之敏感性予以單離。 實例6 產生正丁醇之菌株的批次發酵 首先菌株係在添加有2.5克/升醋酸錢之厭氧性燒瓶 15 培養中，於索尼等（索尼等，丨987，微生物生物技術應 用27 : 1-5)所說明之合成介質中分析。將於35。(：過夜培 ⑩ 養用於接種30毫升培養至〇·〇5之OD6〇〇。將培養於35 °C培育達3天後，藉由HPLC使用分離用之BioradHPX 97H管柱及偵測用之折射計來分析葡萄糖，有機酸及溶 20 劑。 隨即將具有正確表現型之菌株，於3〇〇毫升發酵器 (DASGIP)中，於製造條件下使用厭氧批次實驗步驟進行 試驗。 為了此目的，於發酵器中填充250毫升合成介質， 29 200835792 用氮喷撒達分鐘且將25毫升預培養接種至介於〇 〇5 及0.1間（OD600毫微米）之光密度。 培養之溫度維持恒定於35°C且使用nh4OH溶液將 pH調整至怪為5.5。於發酵中之振盪速率維持在 300rpm 〇 實例7 產生正丁醇之菌株的連績性發酵 將產生正丁醇最好的菌株於化學恆定培養中，於索 尼等（索尼等’ 1987 ’微生物生物技術應用，27 : U)所 說明之合成介質中進行分析。將於35它過夜培養接種

至使用厭乳化學怪疋貫驗步驟之3〇〇毫升發酵哭 (DASGIP)中。 W 為了此目的，於發酵器中填充250毫升合成介質， 用氮喷撒達30分鐘且將25毫升預培養接種至介於〇 〇5 及〇·1間（OD600毫微米）之光密度。於re，pH 5 5 (使 用NH4〇H溶液予以調整)及30〇rpm振盪速率下批次培 養12小時後，將發酵器用不含氧之合成介質以〇〇5 時-1之稀釋速率予以連續填充，同時藉由依序將發酵'的 介質移除而使體積維持恆定。於使用前述說明之 流程進行產物分析後接著測定培養之穩定性。 30 200835792 參考文獻

代謝性通量分析係說明酸-形成作用途徑於藉由醋酿 酸梭囷調節溶劑製造中之重要性。 代謝工程 1999，1 : 206-13。 ΆΜ EM，斑尼待

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醋酪酸梭菌丁酸酯激酶不活性突變之重組體菌 15 特性：需要溶劑產生（s〇lvent〇genesis)及丁醇抑制、 新現象模式？ 1乍用之 20 生物技術生物工程2000，； 67 : l-u。 皇立B. K.，索凱爾p.，古爲g. 連續的丙嗣丁醇發酵作用：維生素於醋酪酸梭 謝活性上之影響。 微生物生物技術應用1987，27 : lj。 31 200835792 【圖式簡單說明】 併入且構成本說明書之一部份的附帶圖 了本發明且與朗書-起用於轉本發明之原理、。》5兄明 圖1描述由碳水化合物發展丁醇製造之、、二 的基因工程。 σ 心代謝

ίο 1 :丙酮酸酯-電子傳遞蛋白（ferredoxin)氧化還原酶；2 : 硫解酶(thiolase) ; 3 :羥基丁醯基_c〇A脫氫酶；4 : 巴豆酶(Crotonase) ; 5 : 丁醯基_€οΑ脫氫酶；6 :乳酸酯 脫氫酶；7 :磷-轉化乙醯酶；8 :醋酸酯激酶；9 :乙縮 醛脫氫酶；10 ··乙醇脫氫酶；n : c〇A轉化酶（乙酸乙 醯基-CoA ··醋酸酯/丁酸酯：c〇A轉化酶）；12 :乙醯醋 酸酯脫羧酶；13 :磷-轉化丁醯酶；14 : 丁酸酯激酶； 15 : 丁醛-丁醇脫氫酶；16 :氫酶。 ’

32

Claims (1)

1. 200835792 十、申請專利範圍： ♦ 1· 一種用於製造正丁醇的方法，其係藉著將微生物於 包含碳源之適當培養介質中培育且從培養介質中回 收正丁醇，其中，微生物中至少有一種涉及丁酸酯 5 形成之基因被去除。 2.如申請專利範圍第1項之方法，其中，被去除的基 因為至少一種下列的基因： ⑩編碼鱗-轉化丁醯酶之ptb ⑩ •編碼丁酸酯激酶之buk。 1〇 3. 如申請專利範圍第1或2項之方法，其中，微生物 中至少一種涉及丙酮形成之基因被削弱。 4·如申請專利範圍第3項之方法，其中，至少一種下 列的基因被去除： 籲編碼CoA-轉化酶之ctfAB 15 _編碼乙醯-醋酸酯脫叛酶之adc。 5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法，其 ⑩ 中，微生物係經改質而不能產生乳酸酯。 6· 如申請專利範圍第5項之方法，其中，Idh基因被 去除。 20 7·如申請專利範圍第1至6項中任一項之方法，其 中，微生物係經改質而不能產生醋酸酯。。 8.如申請專利範圍第7項之方法，其中至少一種涉及 醋酸酯形成之基因被去除。 如申請專利範圍第10項之方法，其中，被去除的 33 9. 200835792 基因係選自下列者： *編碼石粦-轉化丁醯酶之pta Λ *編碼醋酸酯激酶之ack。 10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項之方法，其 5 中，氫通量係降低且減低的動力係再指向丁醇之製 造。 11. 如申請專利範圍第10項之方法，其中，hydA基因 被削弱。 * 12.如申請專利範圍第1至11項中任一項之方法，其 10 中，微生物係選自包括醋酪酸梭菌，拜葉林克氏梭 菌（C· beijerinckii)，糖過丁丙酮梭菌（C· saccharoperbutyl-acetonicum)或糖丁 酸梭菌（C· saccharobutylicum)者0 13.如申請專利範圍第1至14項中任一項之方法，其 15 中，培養係連續且穩定的。 14·如申請專利範圍第13項之方法，其包括下列的步 ⑩ 驟： a) 產生正丁醇之微生物的發酵作用 b) 於發酵作用期間藉由氣提法將正丁醇排出 20 c) 藉蒸餾法從冷凝物中將正丁醇單離出來。 15. —種如申請專利範圍第1至12項中任一項所定義 之微生物。 34 200835792 丁醇ST25順序清單 <110> METABOLIC EXPLORER 用於生物製造高產率正丁醇之方法 、·- , / " <130> 350341/D24755 * <160> 30 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213>人工 <220> <223> buk 1 <400> 1 aaaaggatcc tagta-aaagg gagtgtacga ccagtg 36

   <210> <211> <212> <213〉 2 57 DNA 人工 <220> <223> buk 2 <400> 2 57 ggggtcgcga aaaaaggggg gattattagt aatctataca tgttaacatt cctccac <210> 3 <211> 46 <212〉 DNA •人工 ， <220> <223> buk 3 <400> 3 cccccttttt tcgcgacccc acttcttgca cttgcagaag gtggac 46 <210> 4 <211> 37 •<212> DNA <21.3>人工 <220> <223> buk 4 <400〉 4 # aaaaggatcc tctaaattct gcaatatatg ccccccc 37 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> buk 0 <400> 5 ataacaggat atatgctctc tgacgcgg 28 <210> 6 <211> 28 第1頁 200835792 <212> <213> DNA 丁醇ST25順序清單 人工 <220> - <223> buk 5 <400> 6 gatcatcact cattttaaac atggggcc 28 <210> 7 <211> <212> <213> 41 DNA 人工 <220> <223> Ctf 1 <400> 7 aaaaggatcc cagacactat aatagcttta ggtggtaccc c 41 <210> 8 <211> <212> <213〉 58 DNA 人工 W <220> <223> <400〉 Ctf 2 8 ggggaggcct aaaaaggggg attataaaaa gtagttgaaa tatgaaggtt taaggttg 58 <210> 9 <211> <212> <213〉 48 DNA 人工 <220> <223> <400> Ctf 3 9 cccccttttt aggccicccc atatccaatg aacttagacc catggctg 48 <210> 10 <211> <212〉 <213> 49 DNA 人工 <220> 響 <223〉 Ctf 4 <400> 10 aaaaggatcc gtgttataat gtaaatataa ataaatagga ctagaggcg 49 <210〉 11 <211〉 <212> <213> 28 DNA 人工 <220> <223> Ctf 0 <400〉 11 taccaccttc tttcacgctt ggctgcgg 28 <210> 12 <211〉 <212> <213> 28 DMA 人工 第2頁 28 200835792 <220> <223> Ctf 5 丁醇ST25順序清單 <400> 12 tatttaaaga ggcattatca ccagagcg <210> 13 <211> 39 <212〉 DNA <213> 人工 <220> <223> Ldh 1 <400〉 13 aaaaggatcc gctttaaaat ttggaaagag gaagttgtg <210> 14 <211> 56 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> Ldh 2 <400〉 14 ggggaggcct aaaaaggggg ttagaaatct ttaaaaattt ctctatagag <210〉 15 <211> 57 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> Ldh 3 <400〉 15 cccccttttt aggcctcccc ggtaaaagac ctaaactcca agggtggagg <210〉 16 <211> 48 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> Ldh 4 <400> 16 aaaaggatcc cccattgtgg agaatattcc aaagaagaaa ataattgc 39 56 57 48 A工 17S 人 0>1>2>3> <21<21<21<21 <220> <223> Ldh 0 <400〉 17 cagaaggcaa gaatgtatta agcggaaatg c 31 〇〇 1)NA^ f—· CO CZj > > > > 0 12 3 <21<21<21<21 <220> <223> Ldh 5 第3頁 31 200835792 <400> 18 cttcccatta tagctcttat tcacattaag c 丁醇ST25順序清單 A工‘1943DN人 0>1>2>3> <21<21<21<21 <220> <223> PA 1 <400> 19 aaaaggaicc tattataaca gtcaaaccca ataaaatact ggg 43 2054DN人 0>1>2>3> <21<21<21<21 <220> <223> PA 2 <400> 20 ggggaggcct aaaaaggggg ttaatccatt tgtattttct cccttcataa tgcc 54 <210> 21 <211> 57 <0^ 1A 人工 <220> <223> PA 3 <400〉 21 cccccttttt aggcctcccc tttattttgc atgcttatat aataaattat ggctgcg 57 <210> 22 <211> 40 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> PA 4 <400> 22 aaaaggatcc gcttttcctt cttttacaag atttaaagcc 40 A工 36)n^ 2 2 D ^ >>>> 012 3 2 2 2 2 <<<< <220> <223> PA 0 <400> 23 cacttttatt tatcaagctg taggcc A ^ 2425DN人 0>1>2>3> <21<21<21<21 <220> <223> PA 5 <400> 24 tatacctttt gaacctagga aaggc 第4頁 26 200835792 丁醇ST25順序清單 lgc ah d c 5 3 N ^ y 5C 2 4 D 人 H 2 t )7777)77)>g 0123 03 oa 1 1 I n 2 2 3 222^ 22 4 a <<< V V V < a gcaa ggaaagcagc tgc 43 <210> 26 <211> 59 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> Hyd 2 <400〉 26 ggggaggcct 32 <210> 27 <211> 85 <212〉 DNA <213> 人工 <220> <223> Hyd 3 <400〉 27 59 cccccttttt aggcctcccc gtttatcctc ccaaaatgta aaatataatt aaaatatatt aataaacttc gattaataaa cttcg 60 85 <210〉 28 <211> 43 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> Hyd 4 <400〉 28 aaaaggatcc ccttttagcg tataaagttt tatatagcta ttg 43 <210> <211> <212> <213> 29 33 DNA 人工 <220> <223> Hyd 0 <400> 29 33 catgttctat tgttactatg gaagaggtag tag <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213>人工 <220> <223> Hyd 5 <400> 30 gcagttatta taaatgctgc tactagagc 第5頁. 29