TW200300451A - Method of cell taking on surface of article with three-dimensional structure - Google Patents

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200300451 A 7 __B7_ 五、發明説明（1 ) 發明之技術領域 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明係關於一種使來自活體細胞在立體構造物表面 上移植存活之方法。更詳細而言，本發明係關於移植於活 體內、或安裝於活體外而使用的人造器官或人造組織等立 體構造物表面上，移植存活來自活體細胞之方法，及藉由 該方法所製造出之立體構造物。 先即技術 牙周病中，以牙周組織周圍被口腔內微生物感染而引 起的慢性發炎爲最多。結果會導致牙槽骨的吸收、牙肉的 萎縮致使牙齒脫落。又，牙周病患因於咬嚼食物時引起牙 周組織的疼痛，故大部分導致不得不拔牙的情況。過去， 取代脫落或拔牙的牙齒時，進行他人或自身天然芽、人造 牙、牙科移植等的移植治療。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 然而，天然牙的牙根與人造牙或牙科移植（人造牙根）有 著相當大的差異。天然牙的牙根有牙根膜包覆，通常不會 被支持牙齒的牙槽骨吸收。相對於此，移植除去牙根膜的 天然牙的情況（Lang，H·，et al.，Formation of differentialted tissues in vivo by periodontal cell population cultured in vitro. ; J. Dent. Res., 74, pp.1 2 1 9-25, 1995 )、移植無牙根 膜的牙科移植的情況（江藤隆德、移植與天然牙齒的支持 機構與感覺之差異，末次恆夫•松本直之監修；牙科移植 初版，先端醫療技術硏究所，東京、PP. 11 3-119，2000 )， 長時間下或引起支撐該牙的牙槽骨的吸收，而有不耐用之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -5- 200300451 A7 B7 五、發明説明（2 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 問題。因此，移植齒的牙根膜是否能健全保存狀態下進行 移植，成爲齒移植法的關鍵點（月星光博、自身牙宜執法 的實際，末次恆夫•松本直之監修；牙科移植初版、先端 醫療技術硏究所、東足PP.247-251，2000)。 該牙根膜組織的形成維持受到牙根膜細胞的影響（藤 田恆太郎、牙組織學 1版、牙醫藥初版、東京、PP.159-1 9 8 1 )、被口內細菌污染的天然牙，以一般的殺菌處理即 可殺死牙根膜細胞的死亡。因此，天然牙的牙根部，或原 先即無牙根膜的人造牙之牙根部或牙科用牙科移植上，重 新附著上牙根膜細胞，繼續使其生存，僅形成與天然牙根 膜組織極類似的擬牙根膜組織，即可長時間使用。 作爲過去的附著牙根膜細胞之方法，一般期待單單將 大量的牙根膜細胞的懸浮液中放入牙或牙科移植進行培養 ，即可期待細胞的移植存活。然而，天然牙的牙根部若詳 細觀察其有著複雜的彎曲面構造，故靜置天然牙的牙根部 ，牙根膜細胞懸浮於一般培養液中，既使由上注入，會使 細胞附著的僅爲極少面積，大部分的細胞會由曲面滑落。 牙科移植亦相同。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 因此，嘗試以如牙或牙科移植的立體構造物之三次元 曲面上，可廣泛且有效率地移植生存牙根膜細胞，進而形 成擬牙根膜組織作爲目的。例如，已知有Choi氏們的報告 (Choi, B. Η., Periodontal ligament formation around titanium implants using cultured periodontal ligament cells; A pilot study. Oral Maxillofac Implants, 15, pp. 193- 196, 2000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） -6- 200300451 A7 B7 五、發明説明（3 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ) '及木下氏們的報告（木下韌彥、福岡真一、日高丈博 ;對牙科移植的牙根膜之再生、末次恆夫·松本直之之間 修；牙科移植初版、先端醫療技術硏究所、東京、PP.305-311、2000 )、及淸水們的方法（特開平6-738 1 )。

Choi氏們取出狗經拔牙後殘留於牙根部份之牙根膜， 係切割之膜片段直接放置於移植表面上，培養至由此遊走 的牙根膜細胞廣泛被覆移植表面爲止而形成擬牙根膜組織 後，該牙根膜組織在移植自身（來自該經拔牙的狗）狗上 ，3個月後觀察移植表面與其周圍形成牙根膜組織與水泥質 。然而，該技術於最初必須採取充分量之牙根膜，牙根膜 未被來自口腔內微生物污染時必須未殺死細胞下進行殺菌 ，由設置爲不均勻牙根膜片段所遊走之牙根膜細胞能充分 被覆牙科移植表面必須培養4〜5星期，需要過長時間等爲 其缺點。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 又，木下等人將牙根膜細胞以三次培養於膠原膠內， 其中放入膠原固定化牙科移植，於牙科移植表面上播種牙 根膜細胞。但該技術中，細胞因重力而無法沈下而保持於 膠原膠內，可抑制根部依賴性之牙根膜細胞附著於牙科移 植表面上，某程度離開牙科移植表面之牙根膜細胞無法生 存附著於牙科移植表面上，其細胞播種效率較低。 又，淸水氏們開發出將牙根膜細胞三次培養於膠原膠 內，且將此塞入糜狀膠原海綿中進行培養之疊層培養薄片 ，纏繞於牙科移植面之方法。然而’該方法有著捲入海綿 而固定（依情況需繼續培養）之技術上繁雜之操作。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 200300451 A7 B7 五、發明説明（4 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 因此’上述皆有著問題點，並無到達確立可將牙根膜 細胞移植存活於具有如牙齒或牙科移植等複雜形狀的立體 構造之表面上的優良技術。又，與牙根部相同，其他活體 內埋植用·安裝於活體外用之人造組織•人造臟器，其細 胞亦幾乎無法單純地如沈澱附著地具有廣平面構造者。即 ’無具有複雜形狀的立體構造物表面上細胞能能良好地生 存附者之技術的問題點，不僅於牙科材料上，於人造物與 來自活體的細胞所構成之雜交型人造組織或人造臟器之製 造領域下亦存在。 發明的說明 因此，本發明的課題爲提供，例如於具有活體內臟器 或組織等複雜形狀的立體構造物表面上，來自活體的細胞 可廣泛且更有效率地移植存活之方法。 本發明另一課題爲提供，該表面上移植存活來自活體 的細胞之立體構造物。 本發明者欲解決上述課題努力結果發現， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (1 )既使具有複雜的形狀之牙根部，依該牙根部的形 狀製作出鑄型，該鑄型內部放入少量的培養牙根膜細胞之 懸浮液後，與牙根部嵌合後進行恆溫培養，可使牙根部上 移植存活細胞； (2)鑄型係由對細胞毒性少，且無細胞粘著性之材料 所成，或鑄型僅以該材料做表面處理，牙根部可有效率地 移植存活牙根膜細胞； -8- 本紙張尺度適用中周國家標準（CNS ) A4規格〈210 X 297公釐） 200300451 A7 B7 五、發明説明（5 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) (3 )於鑄型內表面及/或牙根部表面上，設有細溝及/ 或細孔，使鑄型上再次合上鑄型時，牙根膜細胞懸浮液無 法簡單地排除，可滯留於細溝及/或細孔中，使細胞更能有 效率地移植存活於牙根部； (4 )經上述（1 )的恆溫培養後，由鑄型剝離牙根部 ，僅將牙根部浸漬於培養液中再次培養，移植存活的牙根 膜細胞會繼續生存於牙根部表面上，經伸展而形成擬牙根 組織；本發明即基於此見解而完成者。 即，本發明爲提供一種使來自活體細胞在立體構造物 表面上移植存活之方法，其特徵爲含有以下之步驟： (c) 製作配合立體構造物的表面形狀之鑄型的步驟 (d) 該鑄型中放入細胞懸浮液後，將該立體構造物嵌合 於該鑄型中進行恆溫培養的步驟。 本發明亦提供該表面上移植存活來自活體細胞之立體 構造物。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明的較佳型態爲，經拔牙的人類牙之牙根部上可 廣泛地移植存活牙根膜細胞，又同樣地，人造牙或牙科移 植上已可有效率地移植存活牙根膜細胞。又，欲使經移植 存活的牙根膜細胞能繼續存活下去，可形成擬牙根組織。 因此，可預防支持移植牙•牙科移植之牙槽骨之吸收，可 再生可長時間使用之牙齒。即，可治療不得不拔牙的牙周 病患等牙科病患。 同樣地，本發明的較佳型態，即，既使具有複雜的生 理埋植用人造組織•人造臟器表面上細胞可有效率地移植 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X：297公釐） -9- 200300451 A7 B7 五、發明説明（6 ) 存活。又，欲繼續生存經移植存活的細胞，亦可製造出具 有類似活體內組織之組織之雜交型人造組織•人造臟器。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明的實施方法 本發明的立體構造物表面上之細胞移植存活方法，基 本上含有以下步驟。 (1)鑄型的製作 本步驟中，配合立體構造物的形狀製作鑄型。 所謂本發明的「立體構造物」，可舉出具有複雜形狀 的三次元構造物，具體而言爲人造臟器或人造組織等，代 表性爲牙科移植。 第一型態爲，鑄型本身爲對細胞毒性較少，且以具有 細胞難以移植存活之性質的材料所成。該鑄型經由例如， 對細胞毒性較少，具有細胞難以移植存活之性質的材料溶 液添加於立體構造物周圍，經冷卻固定而製作者。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 作爲「對細胞毒性較少，具有細胞難以移植存活之性 質的材料」，例如可使用固化前具有流動性，但可經斯業 者利用適當處理方式固化後，發揮該性質之材料爲佳。該 種類雖無特別限定，但舉出瓊脂糖或洋菜作爲代表。又， 僅爲固化前的流動性高之液狀材料，對於更複雜形狀的立 體構造物而言亦適用。 上述材料的濃度依種類而相異，雖無特別限定，但可 例如可舉出瓊脂糖4%水溶液。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -10- 200300451 A7 _ B7 五、發明説明（7 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 又，作爲其他型態，鑄型由前述材料進行表面處理亦 可。此時’形成鑄型的材料種類雖無特別限制，例如可使 用如聚乙烯經加熱狀態之溶液，僅冷卻即可固化之塑料作 爲iff型的形成部材料使用。例如立體構造物周圍以聚乙矯 熔融液經冷卻固化後，該固化之鑄型表面（與立體構造物 的接觸面）以對細胞毒性少，且具有細胞難以移植存活的 性質之材料進行塗布。作爲該材料，可舉出聚（2_羥基甲 基丙烯酸乙酯）、聚乙二醇、瓊脂糖等。 又’纟尋型表面以該材料進行塗布時，塗布厚度以每分 子的厚度爲0.1mm程度及可。使用於塗布之塗布液濃度， 作爲塗布劑例如使用瓊脂糖時爲0.3重量％程度。 如上述型態之外，與立體構造物的接觸面使細胞難以 移植存活，且對細胞毒性較少之表面即可，可使用任意表 面加工。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 且，一般爲使用目的立體構造物而形成鑄型，但僅可 事先設計立體構造物的鑄型形狀時，亦可使用具有細胞難 以移植存活的性質之塑料塊後金屬塊製造出立體構造物的 鑄型，又，該鑄型表面可以如前述具有細胞難以移植存活 的性質之材料進行塗布。其亦對細胞毒性少，且細胞難以 移植存活之表面即可，可使用任意表面加工法。 對於本發明而言，如上述所製作的鑄型表面上欲滯留 細胞懸浮液，於該表面上可設置細溝及/或細孔。細溝及/或 細孔，可利用牙科用探針及與其類似之針，刺傷該鑄型表 面等，斯業者所利用的方法或其他任意方法皆可，並無特 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -11 - 200300451 A7 _ B7 五、發明説明（8 ) 別限定。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 所謂細溝及/或細孔，至少爲可放入細胞的尺寸，且僅 爲不會使鑄型構造變形之範圍即可，例如直徑•深度皆爲 1 mm程度爲佳，但無須特別限定。又，其數目亦可適宜地 選擇，但以該鑄型的型態不會大幅度破壞範圍內，儘可會g 多數爲佳。 如此於鑄型表面設置細溝及/或細孔，可將流入鑄型內 的細胞懸浮液流入這些細溝及/或細孔中，當立體構造物嵌 合於該鑄型時，因立體構造物與該鑄型無法全面地密合， 故可防止細胞懸浮液會由壓出的鑄型中漏出。其結果細胞 可於立體構造物表面上快速地移植存活。 上述的細溝及/或細孔亦可設置於立體構造物表面。因 立體構造物表面設有細溝及/或細孔，故細胞會由這些細溝 及/或細孔中進入，對立體構造物表面的細胞移植存活較容 易進行。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 此時，可直接使用如市販的牙科移植上，具有與細溝 及/或細孔相當的螺紋或孔者亦可。將設置有細溝及/或細孔 的立體構造物表面，更以具有與細胞較易粘著的性質之材 料’例如以膠原、纖維結合蛋白、層黏蛋白等的細胞粘著 因子進行塗布，可強化細胞的粘著性。此時的塗布所使用 的材料與方法，僅爲斯業者可利用者即可。 上述細溝及/或細孔若必要，可設於鑄型、立體構造物 t任一邊、或雙方。若設於鑄型與立體構造物的雙方表面 ’細胞可由這些細溝及/或細孔進入，對應細溝及/或細孔的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -12- 200300451 A7 B7 五、發明説明（9 ) 容積可暫時性地保持於此，於該鑄型表面上並不會生存而 於立體構造物上則形成較易移植存活之狀態。 (2 )欲細胞移植存活之培養 (1 )所製作的鑄型，使用立體構造物與該立體構造物 成一體化的形式製作時，一旦將鑄型由立體構造物脫離， 又鑄型可獨立設計，與立體構造物爲分離形式下另外製作 時，可直接供給於下述步驟中。 所得之鑄型內放入另外調製出的來自活體之細胞懸浮 液，該立體構造物與該鑄型嵌合進行恆溫培養。經由該操 作，細胞不會於細胞較難移植存活之鑄型表面存活，係於 細胞較易移植存活之立體構造物表面上移植存活。該方法 不需要如前述木下氏們的方法，細胞封閉於膠原膠內使其 不會因重力而沈下，或如淸水氏們將重疊培養薄片捲牙科 移植面上之繁雜方法，可將懸浮於培養液的細胞直接移植 存活於立體構造物上。因此，所需要的細胞數比無須鑄型 時少即可。且，細胞數雖無須限定，僅可預測於後述的後 續培養後，斯業者所知之幅度可覆蓋立體構造物程度之數 目即可。 所謂本發明的「細胞可移植存活」，係指細胞可維持 於存活狀態爲目的，於立體構造物表面上進行附著•固定 。細胞於立體構造物表面上，並非僅由懸浮狀態至單純疏 散的方式附著，係爲經伸展的細胞秘密地廣泛地存在成爲 該細胞組織而言。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -13- 200300451 A 7 B7 五、發明説明（1〇) 於此所使用的來自活體的細胞，以適用於該細胞可移 植存活之立體構造物的用途之細胞爲佳。例如人類牙根膜 細胞移植生存於人類天然牙中，使用於移植治療時，以治 療對象之患者本人的人類牙根膜細胞爲最佳。 所謂本發明的來自活體之細胞而言，可使用來自包含 人類之各種動物之細胞，來自這種組織的細胞，例如可舉 出牙根膜細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、滑膜細胞、纖維芽 細胞、血管內皮細胞、角膜細胞、片細胞、口腔黏膜細胞 、咽頭上皮細胞、喉頭上皮細胞、食道上皮細胞、支氣管 上皮細胞、肺胞上皮細胞、來自肝的細胞、膽管細胞、膽 囊細胞、來自腎的細胞、移動上皮細胞、及腸管黏膜細胞 等。 與此所使用的細胞懸浮液之調製方法，僅可生存維持 該細胞的方法即可並無特別限制，斯業者可利用的方法即 可。又，該立體構造物嵌合於該鑄型後所進行的恆溫培養 條件雖無特別限定，但例如於37 °C下進行1日培養爲佳。且 恆溫培養條件亦無受到上述條件之限定，僅爲細胞可移植 存活於立體構造物表面之條件即可，任意條件皆可使用。 又，所謂恆溫培養亦含有單單放置。 作爲細胞之培養液，使用斯業者可利用的培養液即可 。例如以牙根膜細胞的情況，添加培養液RHAM α (-）於 補給品之培養液 RHAM a ( Kawai，K. et al.，Additive effects of antitumor drugs and lymphokine-activated killer cell cytotoxic activity in tumor cell killing determined by lactate- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -14- 200300451 A7 B7 五、發明説明（11) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) dehydrogenase-release assay; Cancer. Immunol. Immunother, 35，pp. 225-229，1 992 )，更添加牛胚胎血淸成 10% (v/v) 者爲最佳。然而，人類牙根膜細胞可維持生存之培養液即 可並無特別限定，任意培養液皆可使用。又，培養期間爲 適宜即可，以2〜4週的時間爲佳，但此依據斯業者可利用 的方法之時間亦可。大部分的實施例中，經3星期後牙根膜 細胞會於牙根部、雖未完全但已充分地擴張，如上述使用 狗牙齒之 Choi氏們的報告（Choi，B. H·，Periodontal ligament formation around titanium impant s using cultured periodontal ligamne t cells; A pilot study. Oral Maxillofac Implants，15，pp. 1 93- 196，2000 )中記載可縮短爲小於5〜6 星期的時間。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 依據上述的方法使細胞移植存活之立體構造物，例如 牙齒或牙科移植，由鑄型脫離，浸漬於可生存或增殖該細 胞或之培養液中，於立體構造物表面上培養該細胞，形成 該細胞所生成之組織。實施該立體構造物表面上之後續培 養爲佳，但必須對應所使用的姻胞性質與使用目的而設定 適當之條件。例如於牙根部移植存活之牙根膜細胞，係爲 經由該後續培養而伸展至牙根部表面，有時增殖，於培養 液中形成擬牙根膜組織。 實施例 以下爲依據實施例對本發明做更具體的說明，但本發 明並非被這些所限定。且，第1圖表示本發明的細胞移植存 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -15- 200300451 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（12) 活法之槪要流程圖。 (實施例1 ) (1 )牙根膜細胞的調製 由必須做隱藏智齒或位置異常牙矯正治療之牙科病串 的同蒽下拔牙，使用臨床尙無發炎症狀之牙齒。首先，將 拔出之牙齒以滅菌生理食鹽水將血液洗淨除去，使用滅菌 夾、牙科用渦輪機之滅菌棒將拔牙之牙頸部剩下之牙肉· 牙石除去。將此直接冷卻於4 °C下放入輸送用培養基（表1 )〇 表1· 輸送用培養基 RHAM α (-)(市販的動物細胞用基本培養基RMI 1 640、 HMA-F12、MEM α之3 : 1 : 1的混合培養液） 添加物 慶大黴素 1 0 // g / m 1 鏈黴素 100/zg/ml 卡那黴素 60 // g/ml 製作洗淨液（表2)，橫排5枚放有5ml的洗淨液之直徑 6cm的培養皿，由左端的培養皿至右端的培養皿，用鑷子將 齒一邊搖動一邊依序地移動而充分地洗淨。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 200300451 A7 B7 五、發明説明（13) 表2. 洗淨液 無菌生理磷酸緩衝液（PBS(-)) 添加物 青黴素 200IU/ml 大黴素 10// g/ml 鏈黴素 100// g/ml 卡那黴素 60// g/ml 兩性黴素 2.5 β g/ml (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 培養用的6溝培養皿中的1個溝中，放入含有( v/v )的牛胚胎血淸之培養液RH AM a 10ml，將經洗淨的牙齒靜 靜地放入沈下，直接培養，第二天添加1 〇ml的培養液再將 牙齒移至旁邊的溝中。同樣地，最初的3〜4天每天交換培 養液，其後換一半培養液。該培養步驟中，若運氣好無細 菌感染，除去牙後附著於溝培養表面之牙根膜細胞於溝內 增殖，若達到全面覆蓋，依常法以胰蛋白酶處理再以3 5mm 培養皿進行傳代培養。由細胞增殖後之1〜3枚之培養皿中 ，依常法懸浮於1〜2ml的培養液中製作成細胞懸浮液。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2 )拔後牙齒的殺菌 於l5ml容積的試驗管中，放入l〇ml的輸送用培養基， 每根牙齒各別保存。以洗淨液與前項相同方式進行洗淨， 與前項相同方式進行培養。該培養步驟下表現細菌感染時 ，直接將牙齒移至輸送用培養基中，且添加高濃度慶大黴 素水溶液（20mg/ml )，使慶大黴素最終濃度爲1〇〇 μ g/ml 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Μ規格（210X297公釐） -17- 200300451 A 7 B7 五、發明説明（14) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，經一夜上培養後殺菌。此後的洗淨、培養步驟中若未見 到有細菌感染，可再增加慶大黴素的量，重複上述步驟， 確認無細菌感染下，使用於以下步驟上。作爲比較對照組 ，拔牙後放入7〇 %酒精液中保存之牙齒，PBS (-）下洗淨 ，進行120°C下20分鐘之殺菌釜滅菌後再使用。 (3 )對牙根膜細胞的牙齒附著及培養 3g的瓊脂糖加入75ml的水，電磁爐下加溫溶解。將該 溶解的4 %瓊脂糖溶液，放入培養用24溝培養皿之溝中，放 置至膠狀爲止。該瓊脂糖內經殺菌，植入以PB S (-）洗 淨之牙齒，放置到瓊脂糖固化爲止，製成牙型鑄型。其次 ，取出牙齒，表面用滅菌鑷子刮乾淨，浸漬於纖維結合蛋 白溶液（溶解10 // g/ml之PBS( —)者）中於常溫下1〜2 天。前述的牙型鑄型內表面，以鑷子或探針做溝，加入適 量的牙根膜細胞懸浮液於牙型鑄型中，植入經纖維結合蛋 白處理的牙齒，注入培養液至牙冠部面爲止，經1天培養。 該牙齒移至其他空的溝中，加入培養液中經2〜4週培養。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (4 )鹼性磷酸酶染色 經由上述處理，僅可使牙根膜細胞於培養牙表面上生 存即可，其具有鹼性磷酸酶活性，染色牙表面上觀察到濃 藍紫色的偶氮色素之沈澱物。鹼性磷酸酶染色由下述步驟 進行。首先，經培養的牙齒浸漬於99.5%的乙醇中，固定細 胞，以純水洗淨5〜6次。將此浸漬於鹼性磷酸酶反應液（ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） — -18- 200300451 A7 _ B7 五、發明説明（15) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 表3 )中，室溫下反應約3 0分鐘，以自來水充分洗淨後，以 1%甲基籃核染色液（蘇木精、kernehiterot)染色10分鐘， 以自來水及純水洗淨，再乾燥。 表3 鹼性磷酸酶反應液 萘酚AS-BI(AS-MX)磷酸（二鈉鹽） (Sigma、目錄號碼 N2125) 5mg 2-胺基-2-甲基-1，3-丙二醇緩衝液（0.05M，pH9.8) l〇ml Fast blue RR 鹽（Sigma 目錄號碼 F0500) 5 mg (5 )結果 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經牙根膜細胞調製未有細菌感染的拔牙，直接於培養 器內放置溝內放有牙齒的培養皿經數日後，確認培養皿的 溝表面上有細菌增殖。已知培養牙根膜細胞，與以骨芽細 胞爲主的其他牙周組織之細胞於型態特徵上有著相異性（ 窪田正宏，有關牙根膜細胞及骨芽細胞於低氧狀態下的增 殖與功能之硏究、腔疾病雜誌56 : pp.473 -483，1 989 )。於 此培養出的增殖旺盛之細胞，經光學顯微鏡觀察下爲縱軸 長的紡錘體之均勻擬線維芽細胞細胞，經增殖後排列呈一 定方向之性質亦爲線維細胞的特徵。又’該細胞經鹼性磷 酸酶染色後顯示具有鹼性磷酸酶活性。由上述該2點可鑑定 爲牙根膜細胞。傳代培養該牙根膜細胞後，以約1 : 2至1 : 3分裂進行至5〜1 〇代以上。可進彳了該傳代培養的牙根膜細 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -19- 200300451 A7 B7 五、發明説明（16) 胞，因可依常法冰凍保存•融解再培養，故可使用於經殺 園處理的牙國上之再附著貫驗。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 上述（2)中於含有高濃度慶大黴素的輸送用培養基中 經殺菌處理的牙齒上，移植生存另外培養調製之牙根膜細 胞，經後續培養後之鹼性磷酸酶染色，觀察到存在於牙根 部表面上（第2圖A)。由具有一面的濃濃擴散之染色區做 判斷，並非牙根膜細胞由懸浮狀態至單純疏散地附著，係 爲經伸展的細胞秘密廣泛地存在，此推測形成擬牙根膜組 織。 作爲對照組經70 %乙醇保存•殺菌釜殺菌處理的牙齒 中，完全無觀察到與濃藍紫色一樣的偶氮色素之沈澱物， 表示並沒有牙根膜細胞移植生存（第2圖B )。推測因經7 0 %乙醇保存•殺菌釜殺菌處理，故牙齒表面的細胞粘著因 子產生改性，使牙根膜細胞無法移植存活。 產業上可利用性 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明提供’具有牙齒、牙科移植、人造骨、人造血 管的複雜形狀之立體構造物表面上，來自活體的細胞可廣 泛且效率地移植存活之方法。經由該方法可製造出的將來 自活體細胞移植存活之立體構造物，可使用於埋植於活體 內、或裝置於活體外的作爲人造臟器、人造組織之具有較 高活體適應性、達到高醫療效果。 圖面簡單說明 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇χ；297公釐） -20- 200300451 A7 B7 五、發明説明（17) 第1圖表示牙根部的鑄型形成法、牙根膜細胞粘著法· 培養法之流程圖。 第2圖表示人類牙根部表面的牙根膜細胞之後續培養結 果的照片。 A. 以含有高濃度的慶大黴素之輸送用培養基進行殺菌 處理之人類牙齒。經後續培養後之鹼性磷酸酶染色，會見 到如濃藍紫色的偶氮色素沈澱物。顯示牙根部表面上牙根 膜細胞非常廣泛地移植存活著。 B. 作爲對照組，經70%酒精保存•高壓釜殺菌處理的 人類牙齒。完全無觀察到如濃藍紫色之偶氮色素的沈澱物 ，表示無牙根膜細胞移植存活。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -21 -

Claims (1)

1. 200300451 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍1 ~ 1. 一種方法，其爲使來自活體細胞在立體構造物表面上 移植存活之方法，其特徵爲含有以下之步驟： (a) 製作配合立體構造物的表面形狀之鑄型的步驟 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (b) 該鑄型中放入細胞懸浮液後，將該立體構造物嵌合 於該鑄型中進行恆溫培養的步驟。 2·如申請專利範圍第1項之方法，其中該鑄型爲，細胞 毒性較少，且由具有細胞難以移植存活的性質之材料所成 ，或以該材料進行表面處理者。 3·如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該鑄型表 面及/或該立體構造物表面上，設有可滯留細胞懸浮液之細 溝及/或細孔。 4. 如申請專利範圍第1項至第3項中任一項之方法，其中 該材料爲瓊脂糖、聚（2-羥甲基丙烯酸乙酯）、或聚乙二 醇。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5. 如申請專利範圍第1項至第4項中任一項之方法，其 中該來自活體的細胞爲選自牙根膜細胞、骨芽細胞、軟骨 細胞、滑膜細胞、纖維芽細胞、血管內皮細胞、角膜細胞 、片細胞、口腔黏膜細胞、咽頭上皮細胞、喉頭上皮細胞 、食道上皮細胞、支氣管上皮細胞、肺胞上皮細胞、來自 肝的細胞、膽管細胞、膽囊細胞、來自腎的細胞、移動上 皮細胞、及腸管黏膜細胞所成群。 6. 如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法，其 中該立體構造物爲選自牙齒、牙科移植、骨、人造關節、 固定用具、人造韌帶、人造硬膜、人造血管、人造角膜、 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 22- 200300451 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍2 隱形眼鏡、人造喉頭、人造咽頭、人造食道、人造氣管、 人造肺、人造胸壁、人造乳房、人造心臟、人造瓣膜、人 造心膜、人造橫隔膜、人造肝臟、人造膽管、人造腎臟、 人造膀胱、人造尿道、人造胰臟、人造腹壁、人造陰莖、 及人造睪九所成群。 7.—種立體構造物，其特徵爲如申請專利範圍第1項至 第6項中任一項之方法所製造出者，其表面上可移植存活 來自活體的細胞。 裝 訂 "線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -23-