[go: up one dir, main page]

TR201906696T4 - Pcsk9 antagoni̇stleri̇ - Google Patents

Pcsk9 antagoni̇stleri̇ Download PDF

Info

Publication number
TR201906696T4
TR201906696T4 TR2019/06696T TR201906696T TR201906696T4 TR 201906696 T4 TR201906696 T4 TR 201906696T4 TR 2019/06696 T TR2019/06696 T TR 2019/06696T TR 201906696 T TR201906696 T TR 201906696T TR 201906696 T4 TR201906696 T4 TR 201906696T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
variable region
antibody
chain variable
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
TR2019/06696T
Other languages
English (en)
Inventor
Rue Sarah
B Cohen Steven
Li Jun
Yowe David
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43466865&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=TR201906696(T4) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of TR201906696T4 publication Critical patent/TR201906696T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Mevcut açıklama, proprotein konvertaz subtilisin/keksin tip 9a'ya ("PCSK9") karşı antikor antagonistlerini ve bu tür antikorların kullanılması yöntemlerini sağlar.

Description

TARIFNAME PCSK9 ANTAGONISTLERI ILGILI PATENT BASVURULARINA ÇAPRAZ REFERANS Mevcut bulus, 11 Aralik 2009 tarihinde basvurusu yapilan US Provizyonel Patent Basvuru No. 61/285,942'nin rüçhan hakkinin faydasini talep eder. BULUSUN SAHASI Mevcut bulus, PC8K9*a karsi antikor antagonistleri ile ilgilidir. BULUSUN ALT YAPISI Düsük yogunluklu Iipoprotein reseptörü (LDL-R), kan dolasiminda düsük yogunluluklari lipoproteinlerin (LDL) klirensi araciligiyla ateroskleroz ve hiperkolesterolemiyi önler. LDL- R, proprotein konvertaz subtilisin/keksin tip 9a ("PCSK9") tarafindan posttranslasyonel seviyede regüle edilir. Son zamanlarda PCSK9*un knockoutru farelerde rapor edilmistir. Bu fareler, plazma kolesterol seviyelerinde yaklasik %50 azalma göstermistir ve plazma kolesterolün azalmasinda statinlerin gelistirilmis duyarliligini göstermistir (Rashid S, et al (2005) Proc Natl Acad Sci 10253746379. Insan genetik verisi ayni zamanda PCSK9'un LDL homeostazindaki rolünü destekler. Son zamanlarda tahminen PCSK9 içinde "fonksiyon kaybi" mutasyonlari olan iki mutasyon tanimlanmistir. Bu mutasyonlari olan kisiler, koroner kalp hastaliginda yaklasik %50-90 azalmaya dönüsen, LDL-C'nin plazma seviyelerinde yaklasik olarak %40 azalmaya sahiptir. Birlikte ele alindiginda bu çalismalar, PCSKQ'un bir inhibitörünün LDL-C'nin plazma konsantrasyonlarinin azaltilmasina ve PCSKQ aracili diger hastalik durumlarina yönelik faydali olacagini ve örnegin, artmis etkinlige yönelik kolesterolün düsürülmesine yönelik faydali olan ikinci bir ajan ile birlikte uygulanabilecegini gösterir. Belge W02008057459, selüler LDL aliminin PCSK9 tarafindan inhibisyonunu antagonize eden, bir anti-PCSK9 antikorunu açiklar. BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Bulus, istemlerde tanimlandigi gibidir. Mevcut bulus, proprotein konvertaz subtilisin/keksin tip 9a5ya (PCSK9) (örnegin, SEO ID NO:47) baglanan ve bunun fonksiyonunu antagonize eden istemlerde tanimlandigi üzere antikorlari ve örnegin PCSK9 aracili hastalik durumlarini tedavi etmek üzere bu tür antikorlarin kullanilmasina yönelik yöntemleri saglar. Bir açida bulus, proprotein konvertaz subtilisin/keksin tip 9a9ya (PCSKQ) baglanan bir antikor saglar, burada antikor asagidakileri içerir: bir agir zincir degisken bölge ve bir hafif zincir degisken bölge, burada agir zincir degisken bölge ve hafif zincir degisken bölgenin her biri asagidaki üç tamamlayicilik belirleme bölgesini (CDRrler) içerir: CDR1, CDR2 ve CDRS; burada: i) agir zincir degisken bölgenin CDR17i, SEO ID NO:6,nin amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO ID NO:9'un amino asit dizisini içerir; iii) agir zincir degisken bölgenin CDR3'ü, SEO ID NO:13'ün amino asit dizisini içerir; iv) hafif zincir degisken bölgenin CDRiii, SEO ID NO:201nin amino asit dizisini içerir; v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO lD NO:23'ün amino asit dizisini içerir; ve vi) hafif zincir degisken bölgenin CDR3'ü, SEO ID NO:26*nin amino asit dizisini içerir, veya burada: I) agir zincir degisken bölgenin CDR1'I, SEO ID NO:7'nin amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO ID NO:10fun amino asit dizisini içerir; iii) agir zincir degisken bölgenin CDRS'ü, SEO ID NO:12 veya SEO ID NO:13"ün amino asit dizisini içerir; iv) hafif zincir degisken bölgenin CDR1*i, SEO ID NO:21*in amino asit dizisini içerir; v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2isi, SEO ID NO:24rün amino asit dizisini içerir; ve vi) hafif zincir degisken bölgenin CDR3'ü, SEO ID NO:26*nin amino asit dizisini içerir. Tarifname, antikorlari ve proprotein konvertaz subtilisin/keksin tip @3 (PCSKQ) baglanan antijen baglama moleküllerini saglar. Bazi düzenlemelerde antikor: a) PCSK9tun düsük yogunluklu Iipoprotein reseptörüne (LDLR) baglanmasini bloke etmez ve b) LDLR*nin PCSK9 aracili degradasyonunu inhibe eder. Bazi durumlarda antikor veya antijen baglama molekülü, insan PCSK9'unun kalinti pozisyonlari 680-692*de en az bir amino aside baglanir. Ornegin bazi durumlarda antikor veya antijen baglama molekülü, amino asit dizisi RSRHLAQASQELQ (SEO ID NO:49) içinde PCSK9'un bir epitopuna baglanir. Bazi durumlarda antikor veya antijen baglama molekülü, yaklasik 500 pM veya daha az bir denge ayrisma sabiti (KD) olan insan PCSKQ'una baglanir. Ornegin bazi durumlarda antikor veya antijen baglama molekülü, yaklasik 400 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 190 pM, 180 pM, 170 pM, 160 pM, 150 pM, 140 pM veya daha az denge ayrisma sabiti (KD) olan insan PCSKQ'una baglanir. Bazi durumlarda antikor veya antijen baglama molekülü, en az yaklasik 7 günlük bir in vivo yari ömre sahiptir. Bazi durumlarda antikor veya antijen baglama molekülü, en az yaklasik 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 günlük bir in vivo yari ömre sahiptir. Bazi durumlarda antikor veya antijen baglama molekülü, en az yaklasik 2 hafta, örnegin 2, 3, 4 hafta veya daha uzun süreli bir in vivo kolesterol düsürücü etkiye sahiptir. Tercihen in vivo yari ömür, bir insan öznesinde belirlenir. Tarifnamenin bazi açilarinda antikor asagidakileri içerir (a) bir Insan agir zincir V-segmenti, bir agir zincir tamamlayicilik belirleme bölgesi 3 (CDR3) ve bir agir zincir çati bölgesi 4 (FR4) içeren bir agir zincir degisken bölge ve (b) bir insan hafif zincir V segmenti, bir hafif zincir CDRS'ü ve bir hafif zincir FR4iü içeren bir hafif zincir degisken bölge, burada i) agir zincir CDRS, amino asit dizisi SYYYY(A/N)MD(A/F/SN/Y) (SEO ID NO:14) içerir; ve ii) hafif zincir CDRS degisken bölge, amino asit dizisi LQWSSDPPT (SEO ID NO:26) içerir. Bazi durumlarda antikor asagidakileri içerir (a) bir insan agir zincir V-segmenti, bir agir zincir tamamlayicilik belirleme bölgesi 3 (CDR3) ve bir agir zincir çati bölgesi 4 (FR4) içeren bir agir zincir degisken bölge ve (b) bir insan hafif zincir V segmenti, bir hafif zincir CDR37ü ve bir hafif zincir FR47ü içeren bir hafif zincir degisken bölge, burada i) agir zincir CDR3, amino asit dizisi SYYYYNMDY (SEQ ID NO:12) içerir; ve ii) hafif zincir CDRS degisken bölge, amino asit dizisi LQWSSDPPT (SEQ ID NO:26) içerir. Bazi durumlarda antikor asagidakileri içerir (a) bir insan agir zincir V-segmenti, bir agir zincir tamamlayicilik belirleme bölgesi 3 (CDRS) ve bir agir zincir çati bölgesi 4 (FR4) içeren bir agir zincir degisken bölge ve (b) bir insan hafif zincir V segmenti, bir hafif zincir CDRS'U ve bir hafif zincir FR4"u içeren bir hafif zincir degisken bölge, burada i) agir zincir CDRS, amino asit dizisi SYYYYAMDY (SEQ ID NO:13) içerir; ve ii) hafif zincir CDR3 degisken bölge, amino asit dizisi LQWSSDPPT (SEQ ID NO:26) içerir. Bazi durumlarda agir zincir CDR3, SEQ lD NO:12 ve SEO ID NO:13*ten olusan gruptan seçilen amino asit dizisini içerir; ve hafif zincir CDR3, SEQ lD NO:26'nin amino asit dizisini içerir. Bazi durumlarda agir zincir V-segmenti, SEQ ID NO:28 ile en az %85, %88, %89, %90 %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 veya %99 dizi özdesligine sahiptir ve burada hafif zincir V segmenti, SEQ ID NO:31 ile en az %85, %88, %89, %90 %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 veya %99 dizi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda agir zincir V-segmenti, SEQ ID NO:27 ile en az %85, %88, %89, %90 %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 veya %99 dizi özdesligine sahiptir ve burada hafif zincir V segmenti, SEQ ID NO:29 ve SEQ ID NO:30›dan olusan gruptan seçilen amino asit ile en az %85, %88, %89, %90 %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 veya %99 dizi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda agir zincir FR4, bir insan germ hatti FR4't`Ur. Bazi düzenlemelerde agir zincir FR4, SEQ ID NO:35rtir. Bazi durumlarda hafif zincir FR4, bir insan germ hatti FR4*tür. Bazi düzenlemelerde hafif zincir FR4, SEQ ID NO:39ydur. Tarifnamenin bazi açilarinda agir zincir V-segmenti ve hafif zincir V-segmentinin her biri bir tamamlayicilik belirleme bölgesi 1'i (CDR1) ve bir tamamlayicilik belirleme bölgesi 2'yi (CDR2) içerir; burada: i) agir zincir V-segmentinin CDR1'i, SEQ ID NO:8*in amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir V-segmentinin CDRZ'SI, SEQ ID NO:11'in amino asit dizisini içerir; iii) hafif zincir V-segmentinin CDR1'i, SEQ ID NO:22rnin amino asit dizisini içerir; ve iv) hafif zincir V-segmentinin CDR2rsi, SEQ ID NO:25'in amino asit dizisini içerir. Bazi durumlarda agir zincir V-segmenti ve hafif zincir V-segmentinin her biri bir tamamlayicilik belirleme bölgesi 1'i (CDR1) ve bir tamamlayicilik belirleme bölgesi 2'yi (CDR2) içerir; burada: i) agir zincir V-segmentinin CDR1'i, SEQ ID NO:7*nin amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir V-segmentinin CDR2'si, SEQ ID NO:10'un amino asit dizisini içerir; iii) hafif zincir V-segmentinin CDR1ri, SEQ ID NO:21'in amino asit dizisini içerir; ve iv) hafif zincir V-segmentinin CDR2'si, SEQ lD NO:24"L'in amino asit dizisini içerir. Bazi düzenlemelerde, i) agir zincir V-segmentinin CDR1*i, SEQ ID NO:7*yi içerir; ii) agir zincir V-segmentinin CDR2'si, SEQ ID NO:10'u içerir; iii) agir zincir CDR3, SEQ ID NO:12 ve SEO ID NO:13rten olusan gruptan seçilen amino asit dizisini içerir; iv) hafif zincir V-segmentinin CDR1ri, SEQ ID NO:21'I içerir; v) hafif zincir V-segmentinin CDR2si, SEQ lD NO:24'i`J içerir; ve vi) hafif zincir CDR3, SEQ ID NO:26'yi içerir. Bazi durumlarda agir zincir degisken bölge, SEQ ID NO:40'in degisken bölgesi ile en az %85, %88, %89, %90 %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 veya %99 amino asit dizisi özdesligine sahiptir ve hafif zincir degisken bölge, SEQ ID NO:41'in degisken bölgesi ile en az %90 amino asit dizisi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda antikor, SEQ lD NO:40'i içeren bir agir zinciri ve SEO lD NO:41ri içeren bir hafif zinciri içerir. Bazi durumlarda agir zincir degisken bölge, SEQ ID No:2 ve SEO ID NO:4'ten olusan gruptan seçilen degisken bölge ile en az %85, %88, %89, %90 %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 veya %99 amino asit dizisi özdesligine sahiptir ve burada hafif zincir degisken bölge, SEQ ID NO:16 ve SEO ID NO:18rden olusan gruptan seçilen degisken bölge ile en az %85, %88, %89, %90 %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 veya %99 amino asit dizisi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda agir zincir degisken bölge, SEO ID No:2 ve SEO ID NO:4:ten olusan gruptan seçilen amino asit dizisini içerir ve hafif zincir degisken bölge, SEO ID NO:16 ve SEO ID NO:18rden olusan gruptan seçilen amino asit dizisini içerir. Bazi düzenlemelerde antikor, bir IgG'dir. Bazi düzenlemelerde antikor, bir IgG1'dir. Bazi düzenlemelerde antikor, SEO ID No:3 ve SEO ID NO:5*ten olusan gruptan seçilen bir amino asit ile en az %85, %88, %89, %90 %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 veya %99 dizi özdesligini paylasan bir agir zincire sahiptir. Bazi düzenlemelerde antikor, SEO ID NO:17' ve SEO ID NO:19idan olusan gruptan seçilen bir amino asit ile en az %85, %88, %89, %90 %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98 veya %99 dizi özdesligini paylasan bir hafif zincire sahiptir. Bazi düzenlemelerde antikor, bir FAbi fragmanidir. Bazi düzenlemelerde antikor, bir tek zincirli antikordur (scFv). Bazi düzenlemelerde antikor, insan sabit bölgelerini içerir. Bazi düzenlemelerde antikor, bir insan IgG1 sabit bölgesini içerir. Bazi düzenlemelerde insan IgG1 sabit bölgesi, bir hücre veya tümleyicinin C1 bileseni üzerinde Fc reseptörü (FcR) gibi bir efektör Iigana, örnegin Fc gama R17e yönelik düsük baglama afinitesine sahip olmak üzere mutasyona ugrar. Bakiniz, örnegin, U.S. Patent No. 5,624,821. Bazi düzenlemelerde IgG1 sabit bölgesinin amino asit kalintilari L234 ve L235, Ala234 ve Ala235'e sübstitüe edilir. Agir zincir sabit bölgesinde kalintilarin numaralandirilmasi, EU indeksine (bakiniz, Kabat, et al., (1983) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," U.S. Dept. Health and Human Services) göredir. Bazi düzenlemelerde antikor, bir tasiyici proteine, örnegin albumine baglanir. Bazi düzenlemelerde antikor, PEGiIedir. Tarifname, PCSK9ia baglanan antikorlar saglar, burada antikor, bir agir zincir degisken bölge ve bir hafif zincir degisken bölge içerir, burada agir zincir degisken bölge ve hafif zincir degisken bölgenin her biri asagidaki üç tamamlayicilik belirleme bölgesini (CDR'Ier) içerir: CDR1, CDR2 ve CDR3; burada: i) agir zincir degisken bölgenin CDR1ii, SEO ID NO:8,in amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2rsi, SEO ID NO:117in amino asit dizisini içerir; iii) agir zincir degisken bölgenin CDR3'ü, SEO ID NO:14'ün amino asit dizisini içerir; iv) hafif zincir degisken bölgenin CDR1*i, SEO ID NO:22'nin amino asit dizisini içerir; v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEQ ID NO:25'in amino asit dizisini içerir; vi) hafif zincir degisken bölgenin CDRS'ü, SEO lD NO:26*nin amino asit dizisini içerir. Bazi durumlarda i) agir zincir degisken bölgenin CDR1'i, SEQ ID No:6 ve SEO ID NO:7'den olusan gruptan seçilen amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEQ ID No:9 ve SEO ID NO:10'dan olusan gruptan seçilen amino asit dizisini içerir; iii) agir zincir degisken bölgenin CDR3'ü, SEO ID NO:12 ve SEO ID NO:13'ten olusan gruptan seçilen amino asit dizisini içerir; iv) hafif zincir degisken bölgenin CDR1=i, SEQ ID NO:20 ve SEO ID NO:21'den olusan gruptan seçilen amino asit dizisini içerir; v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2*si, SEQ ID NO:23 ve SEO ID NO:24rten olusan gruptan seçilen amino asit dizisini içerir; vi) hafif zincir degisken bölgenin CDRS'U, SEQ ID NO:26*nin amino asit dizisini içerir. Ilgili bir açida bulus, PCSK9ra baglanan antikorlar saglar, burada antikor, bir agir zincir degisken bölge ve bir hafif zincir degisken bölge içerir, burada agir zincir degisken bölge ve hafif zincir degisken bölgenin her biri asagidaki 'üç tamamlayicilik belirleme bölgesini (CDR'Ier) içerir: CDR1, CDR2 ve CDR3; burada: i) agir zincir degisken bölgenin CDR1Yi, SEQ ID NO:6!nin amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2rsi, SEQ ID NO:9'un amino asit dizisini içerir; iii) agir zincir degisken bölgenin CDRS'ü, SEO ID NO:13"un amino asit dizisini içerir; iv) hafif zincir degisken bölgenin CDR1ri, SEQ ID NO:20'nin amino asit dizisini içerir; v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEQ ID NO:23'ün amino asit dizisini içerir; vi) hafif zincir degisken bölgenin CDR3'ü, SEQ ID NO:26'nin amino asit dizisini içerir. Ilgili bir açida bulus, PCSK9'a baglanan antikorlar saglar, burada antikor, bir agir zincir degisken bölge ve bir hafif zincir degisken bölge içerir, burada agir zincir degisken bölge ve hafif zincir degisken bölgenin her biri asagidaki üç tamamlayicilik belirleme bölgesini (CDRiler) içerir: CDR1, CDR2 ve CDR3; burada: i) agir zincir degisken bölgenin CDR1'I, SEO ID NO:77nin amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO ID NO:10,un amino asit dizisini içerir; iii) agir zincir degisken bölgenin CDR3'ü, SEO ID NO:12'nin amino asit dizisini içerir; iv) hafif zincir degisken bölgenin CDR1'i, SEO ID NO:21'in amino asit dizisini içerir; v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO ID NO:24'Ün amino asit dizisini içerir; vi) hafif zincir degisken bölgenin CDRS'U, SEO lD NO:26*nin amino asit dizisini içerir. Ilgili bir açida bulus, PCSK9ra baglanan antikorlar saglar, burada antikor, bir agir zincir degisken bölge ve bir hafif zincir degisken bölge içerir, burada agir zincir degisken bölge ve hafif zincir degisken bölgenin her biri asagidaki 'üç tamamlayicilik belirleme bölgesini (CDR'Ier) içerir: CDR1, CDR2 ve CDR3; burada: i) agir zincir degisken bölgenin CDR1*i, SEO ID NO:7,nin amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO ID NO:10'un amino asit dizisini içerir; iii) agir zincir degisken bölgenin CDRS'ü, SEO ID NO:13'ün amino asit dizisini içerir; iv) hafif zincir degisken bölgenin CDR1'i, SEO ID NO:21'in amino asit dizisini içerir; v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO ID NO:24r'un amino asit dizisini içerir; vi) hafif zincir degisken bölgenin CDR3'U, SEO ID NO:26*nin amino asit dizisini içerir. Diger bir açida bulus, istemlerde alintilandigi üzere bir antikor veya antijen baglama molekül'ü ve fizyolojik olarak uyumlu bir eksipiyan içeren bilesimler saglar. Bazi düzenlemelerde bilesim ayrica bir kiside düsük yogunluklu Iipoprotein kolesterol (LDL-C) seviyelerini azaltan ikinci bir ajani içerir. Bazi düzenlemelerde ikinci ajan, bir statindir. Ornegin statin, atorvastatin, serivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rosuvastatin ve simvastatinden olusan gruptan seçilebilir. Bazi düzenlemelerde ikinci ajan, fibratlar, niasin ve bunun analoglari, bir kolesterol absorpsiyon inhibitörü, bir safra asidi katkisi, bir tiroid hormonu mimetigi, bir mikrozomal trigliserit transfer proteini (MTP) inhibitörü, bir diasilgliserol asiltransferaz (DGAT) inhibitörü, bir inhibitör nükleik asit hedefleyici PCSK9 ve bir Inhibitör nükleik asit hedefleyici apoB100'den olusan gruptan seçilir. Diger bir açida bulus, buna ihtiyaci olan bir kiside LDL-Ctnin azaltilmasinin yönteminde kullanima yönelik, istemlerde anlatildigi üzere bir antikor veya antijen baglama molekülünün terapötik olarak etkili bir miktarini saglar. Bazi düzenlemelerde kisi, statin terapisine hiporesponsif veya dirençlidir. Bazi düzenlemelerde kisi, statin terapisine toleranssizdir. Bazi düzenlemelerde kisi, en az yaklasik 100 mg/dL, örnegin en az yaklasik 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 mg/dL veya daha yüksek bir referans degeri LDL-C seviyesine sahiptir. Bazi düzenlemelerde kisi, ailesel hiperkolesterolemiye sahiptir. Bazi düzenlemelerde kisi, trigliseridemiye sahiptir. Bazi düzenlemelerde kisi, bir fonksiyon kazanci PCSK9 gen mutasyonuna sahiptir. Bazi düzenlemelerde kisi, ilaç Indüklü dislipidemiye sahiptir. Bazi düzenlemelerde toplam kolesterol, LDL-C ile azaltilir. Bazi düzenlemelerde söz konusu kullanima yönelik antikor, LDL-C'nin azaltilmasinda etkili olan ikinci bir ajanin terapötik olarak etkili bir miktarinin kisiye uygulanmasina yöneliktir. Bazi düzenlemelerde ikinci ajan, bir statindir. Ornegin statin, atorvastatin, serivastatin, fluvastatin, Iovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rosuvastatin ve simvastatinden olusan gruptan seçilebilir. Bazi düzenlemelerde ikinci ajan, fibratlar, niasin ve bunun analoglari, kolesterol absorpsiyon inhibitörleri, safra asidi katkilari, bir tiroid hormonu mimetikleri, bir mikrozomal trigliserit transfer proteini (MTP) inhibitörü, bir diasilgliserol asiltransferaz (DGAT) inhibitörü, bir inhibitör nükleik asit hedefleyici PCSK9 ve bir inhibitör nükleik asit hedefleyici apoB100*den olusan gruptan seçilir. Bazi düzenlemelerde söz konusu kullanima yönelik antikor veya antijen baglama molekülü ve ikinci ajan, bir karisim olarak birlikte uygulanmaya yönelik veya ayri birlikte uygulanmaya yöneliktir. Bazi düzenlemelerde söz konusu kullanima yönelik antikor, intravenöz uygulamaya yönelik veya subkütanöz uygulamaya yöneliktir. TANIMLAR Bir "antikor", immünoglobulin ailesinin bir polipeptidine veya kovalent olmayan bir sekilde, tersine çevrilerek ve spesifik bir sekilde karsilik gelen bir antijeni baglayabilen bir immünoglobulinin fragmanlarini içeren bir polipeptide refere eder. Ornek niteligindeki bir antikor yapisal birimi, bir tetrameri içerir. Her bir tetramer, polipeptid zincirlerinin iki özdes çiftinden olusur, her bir çift, bir disülfid bagi araciligiyla baglanan bir "hafif" (yaklasik 25 kD) ve bir "agir" zincire (yaklasik 50-70 kD) sahiptir. Tanimlanan immünoglobulin genleri, K, A, oi, y, 6, a ve u sabit bölge genlerini ayrica çok sayida immünoglobulin degisken bölge genlerini içerir. Hafif zincirler, K veya A olarak siniflandirilir. Agir zincirler, karsilik olarak sirasiyla IgG, IgM, IgA, IgD ve IgE imm'unoglobulin siniflarini tanimlayan y, p, or, 6 veya 8 olarak siniflandirilir. Her bir zincirin N-terminusu, birincil olarak antijen tanimadan sorumlu olan yaklasik 100 ila 110 veya daha fazla amino asit kadar bir degisken bölgeyi tanimlar. Degisken hafif zincir (VL) ve degisken agir zincir (VH) terimleri, sirasiyla hafif ve agir zincirlerin bu bölgelerine refere eder. Bu basvuruda kullanildigi 'üzere bir "antikor", antikorun bütün varyasyonlarini ve spesifik olarak örnegin PCSK9ra yönelik belirli bir baglanmaya sahip olan fragmanlarini kapsar. Bu nedenle tam uzunlukta antikorlar, kimerik antikorlar, hümanize edilmis antikorlar, tek zincirli antikorlar (ScFv), Fab, Fab* ve ayni baglama spesifikligi olan bu fragmanlarin (örnegin, F(ab')2) multimerik versiyonlari bu kavramin kapsamindadir. "Tamamlayicilik belirleme domenleri" veya "tamamlayicilik belirleme bölgeleri" ("CDRiler"), degistirilebilir bir sekilde VL ve VH'nin çok degisken bölgelerine refere eder. CDR'ler, bu tür hedef proteine yönelik spesifiklik barindiran antikor zincirlerinin hedef protein baglama alanidir. Burada degisken domenlerin yaklasik %15-20'sini olusturan, her bir insan VL ve VH'sinde `uç CDR (N-terminusundan sirali olarak numaralandirilan CDR1-3) mevcuttur. CDR'ler yapisal olarak hedef proteininin epitopunu tamamlayicidir ve bu nedenle dogruda baglama spesifikliginden sorumludur. VL veya VHrnin kalan germeleri, sözde çati bölgeler, amino asit dizisinde daha az varyasyon gösterir (Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4. W.H. Freeman & Co., New York, 2000). CDRtIerin ve çati bölgelerinin pozisyonlari, örnegin Kabat, Chothia, international lmMunoGeneTics veri tabani (IMGT) (dünya çapinda ag üzerinde imgt.cines.fr/ adresinde) ve AbM (bakiniz, örnegin, Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 3421877-883 (1989); Chothia et al., J. Mol. Biol., 227z799-817 (1992); Al-Lazikani et al., J.MOI.Biol., 273:927-748 (1997)) olmak üzere teknikte iyi bilinen çesitli tanimlar kullanilarak belirlenir. Antijen birlestirme alanlarinin tanimlari ayni zamanda asagidakilerin içinde açiklanir: Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000); ve Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001); MacCallum et al., J. Mol. Biol., 2621732-745 (1996); ve Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol., 203z121-153 (1991); ve Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996). "Baglama spesifikligi belirleyicisi" veya "BSD" terimi degistirilebilir bir sekilde bir antikorun baglama spesifikliginin belirlenmesine yönelik gerekli olan bir tamamlayicilik belirleme bölgesinde minimum bitisik veya bitisik olmayan amino asit dizisine refere eder. Bir minimum baglama spesifikligi belirleyicisi, bir veya daha fazla CDR dizisinde bulunabilir. Bazi düzenlemelerde minimum baglama spesifikligi belirleyicileri, antikorun agir ve hafif zincirlerinin CDR3 dizilerinin bir kisminda veya tam uzunlugunda bulunur (diger bir ifadeyle, yalnizca bunlar ile belirlenir). Burada kullanildigi 'üzere bir "antikor hafif zinciri" veya bir "antikor agir zinciri", sirasiyla VL veya VHVI içeren bir polipeptide refere eder. Endojen VL, gen segmentleri V (degisken) ve J (jonksiyonel) tarafindan ve endojen VH, V, D (çesitlilik) ve J tarafindan kodlanir. VL veya VH'nin her biri, çati bölgelerinin yani sira CDR'leri içerir. Bu basvuruda antikor hafif zincirleri ve/veya antikor agir zincirleri, bazi zamanlarda genel olarak "antikor zincirleri" olarak refere edilebilir. Bu terimler, teknikte uzman kisinin kolay bir sekilde tanimlayacagi 'üzere VL veya VH'nin bazik yapisini bozmayan mutasyonlari içeren antikor Zincirlerini kapsan Antikorlar, intakt immünoglobulinler olarak veya çesitli peptidazlar ile sindirim aracilgiyla `üretilen birkaç iyi karakterize edilmis fragman olarak mevcuttur. Bu nedenle Örnegin pepsin, F(ab)'2, bir disülfid bag ile VH-CH1' baglanan bir hafif Zincir olan bir Fab* dimerini üretmek üzere mentese bölgesinde disülfid baglantilarinin altinda bir antikoru parçalar. F(ab)'2, mentese bölgesinde dis'ülfid baglantisini koparmak üzere orta siddetli kosullar altinda azaltilabilir böylece F(ab)'2 dimerini bir Fab' monomerine dönüstürür. Fab' monomeri esas olarak mentese bölgesinin parçasi ile Fab7dir. Paul, Fundamental lmmunology 3d ed. (1993). Çesitli antikor fragmanlari bir intakt antikorun sindirimi açisindan tanimlanirken teknikte uzman kisi, bu tür fragmanlarin kimyasal olarak veya rekombinant DNA metodolojisi kullanilarak de novo sentezlenebilecegini anlayacaktir. Bu nedenle burada kullanildigi 'üzere "antikor" terimi ayni zamanda tüm antikorlarin modifikasyonu ile Üretilen antikor fragmanlarini veya reklombinant DNA metolojileri (örnegin, tek zincirli Fv) kullanilarak de novo sentezlenenleri veya faj gösterim kütüphaneleri kullanilarak tanimlananlari (bakiniz, örnegin, McCafferty et al., Nature 3482552-554 (1990)) içerir. Monoklonal veya poliklonal antikorlarin hazirlanisina yönelik teknikte bilinen herhangi bir teknik kullanilabilir (bakiniz, örnegin, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985). Tek Zincirli antikorlarin üretimine yönelik teknikler (U.S. Patent No. 4,946,778), bu bulusun polipeptidlerine antikorlar üretmek üzere adapte edilebilir. Ayni zamanda transgenik fareler veya diger organizmalar, örnegin diger memeliler, hümanize edilmis antikorlari ifade etmek üzere kullanilabilir. Alternatif olarak faj gösterimi teknolojisi, spesifik olarak seçilen antijenlere baglanan antikorlari ve heteromerik Fab fragmanlarini tanimlamak üzere kullanilabilir (bakiniz, örnegin, McCafferty et al., supra; Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992)). Insan olmayan antikorlarin hümanize edilmesine veya primat haline getirilmesine yönelik yöntemler teknikte iyi bilinir. Genel olarak hümanize edilen bir antikor, buna insan olmayan bir kaynaktan eklenen bir veya daha fazla amino asit kalintisina sahiptir. Bu insan olmayan amino asit kalintilari genellikle tipik olarak bir import degisken domenden alinan import kalintilardir. Hümanize etme esas olarak Winter ve is arkadaslarinin yöntemi takip edilerek (bakiniz, örnegin Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 3322323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239z1534-1536 (1988) ve Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)), bir insan antikorunun karsilik gelen dizilerine yönelik kemirgen CDR'Ier veya CDR dizileri sübstitüe edilerek gerçeklestirilebilir. Buna göre bu tür hümanize edilmis antikorlar, kimerik antikorlardir (U.S. Patent No. 4,816,567), burada bir intakt insan degisken domeninden büyük oranda azi, insan olmayan türlerden karsilik gelen dizi ile sübstitüe edilmistir. Uygulamada hümanize edilen antikorlar tipik olarak bazi tamamlayicilik belirleme bölgesi ("CDR") kalintilari ve olasi bir sekilde bazi çati ("FR") kalintilarinin kemirgen antikorlarinda analog alanlardan kalintilar ile sübstitüe edildigi insan antikorlaridir. Bir "kimerik antikor", (a) sabit bölge veya bunun bir kisminin baskalastirildigi, yer degistirdigi veya degistirildigi böylece antikor baglama alaninin (degisken bölge) farkli veya baskalasmis bir sinifin, efektör fonksiyon ve/veya türlerin veya örnegin bir enzim, toksin, hormon, büyüme faktörü ve ilaç olmak üzere kimerik antikora yeni özellikler veren tamamen farkli bir moleküle baglandigi; veya (b) degisken bölge veya bunun bir kisminin farkli veya baskalasmis bir antijen spesifikligine sahip olan bir degisken bölge ile baskalastirildigi, yer degistirildigi veya degistirildigi bir antikor molekülüdür. Bulusun antikorlari veya antijen baglama molekülleri ayrica diger proteinlerin füzyon proteinleri ile kimyasal olarak konjuge edilen veya bunlar olarak ifade edilen bir veya daha fazla immünoglobulin zincirini içerir. Bu ayni zamanda bispesifik antikoru içerir. Bir bispesifik veya iki fonksiyonlu antikor, iki farkli agir/hafif zincir çiftine ve iki farkli baglama alanina sahip olan bir yapay hibrit antikordur. Bulusun diger antijen baglama fragmanlari veya antikor kisimlari, iki degerli scFv (diabodi), antikor molekülünün iki farkli epitopu tanidigi bispesifik scFv antikorlarini, tek baglama domenlerini (dAb5ler) ve minibodileri içerir. Burada açiklanan çesitli antikorlar veya antijen baglama fragmanlari, intakt antikorlarin enzimatik veya kimyasal modifikasyonu ile üretilebilir veya rekombinant DNA metolojileri (örnegin, tek zincirli Fv) kullanilarak de novo sentezlenebilir veya faj gösterim kütüphaneleri (bakiniz, örnegin, McCafferty et al., Nature 348:552-554, 1990) kullanilarak tanimlanabilir. Ornegin minibodiler, teknikte, örnegin Vaughan and Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-30 2001 içinde açiklanan yöntemler kullanilarak olusturulabilir. Bispesifik antikorlar, hibridomlarin füzyonu veya Fab' fragmanlarinin baglanmasini içeren çesitli yöntemler ile üretilebilir. Bakiniz, örnegin, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). Tek zincirli antikorlar, faj gösterim kütüphaneleri veya ribozom gösterim kütüphaneleri, gen karistirilmis kütüphaneler kullanilarak tanimlanabilir. Bu tür kütüphaneler, sentetik, yari sentetik veya natif ve immünokompetan kaynaklardan yapilabilir. Bir "kimerik antikor", (a) sabit bölge veya bunun bir kisminin baskalastirildigi, yer degistirdigi veya degistirildigi böylece antikor baglama alaninin (degisken bölge) farkli veya baskalasmis bir sinifin, efektör fonksiyon ve/veya türlerin veya örnegin bir enzim, toksin, hormon, büyüme faktörü, ilaç vb. olmak üzere kimerik antikora yeni özellikler veren tamamen farkli bir moleküle baglandigi; veya (b) degisken bölge veya bunun bir kisminin farkli veya baskalasmis bir antijen spesifikligine sahip olan bir degisken bölge ile baskalastirildigi, yer degistirildigi veya degistirildigi bir antikor molekülüdür. Ornegin asagidaki Orneklerde gösterildigi üzere bir fare anti-PCSK9 antikoru, bunun sabit bölgesi bir insan immünoglobulininden sabit bölge ile degistirilerek modifiye edilebilir. Bir insan sabit bölgesi ile degistirme nedeniyle kimerik antikor, orijinal fare antikoru ile karsilastirildiginda insanda düsük antijenlige sahip olurken insan PCSK9'unun tanimlanmasinda spesifikligini muhafaza edebilir. "Antikor baglama molekülü" veya "antikor olmayan Iigand" terimi, adnektinler, avimerler, tek zincirli polipeptid baglama molekülleri ve antikor benzeri baglama peptidomimetikleri dahil olmak 'uzere immünoglobulin olmayan protein omurgalarini kullanan antikor mimiklerine refere eder. "Degisken bölge" veya "V-bölgesi" terimi degistirilebilir olarak FR1-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4 içeren bir agir veya hafif zincire refere eder. Bakiniz, Sekil 1. Bir endojen degisken bölge, immünoglobulin agir zincir V-D-J genleri veya hafif zincir V-J genleri tarafindan kodlanir. Bir V-bölgesi dogal olarak meydana gelen, rekombinant veya sentetik olabilir. Burada kullanildigi üzere "degisken segment" veya "V-segmenti" terimi degistirilebilir olarak FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3 içeren degisken bölgenin bir alt dizisine refere eder. Bakiniz, Sekil 1. Bir endojen V-segmenti, bir immünoglobulin V-geni tarafindan kodlanir. Bir V-segmenti dogal olarak meydana gelen, rekombinant veya sentetik olabilir. Burada kullanildigi 'üzere **J-segmenti" terimi, bir CDR3 ve FR4=ün bir C-terminal kismini içeren kodlanmis degisken bölgenin bir alt dizisine refere eder. Bir endojen J-segmenti, bir immünoglobulin J-geni tarafindan kodlanir. Bakiniz, Sekil 1. Bir J-segmenti dogal olarak meydana gelen, rekombinant veya sentetik olabilir. Bir "hümanize edilmis" antikor, insanlarda daha az immünojenik olurken insan olmayan bir antikorun reaktivitesini muhafaza eden bir antikordur. Bu, örnegin insan olmayan CDR bölgeleri muhafaza edilerek ve antikorun geriye kalan parçalari bunlarin insan karsiliklari ile degistirilerek elde edilir. Bakiniz, örnegin, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. lmmunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239z1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994). "Karsilik gelen insan germ hatti dizisi" terimi, insan germ hatti immünoglobulin degisken bölge dizileri tarafindan kodlanan diger bilinen bütün degisken bölge amino asit dizileri ile karsilastirildiginda bir referans degisken bölge amino asit dizisi veya alt dizisi ile en yüksek belirlenmis amino asit dizisi özdesligini paylasan bir insan degisken bölge amino asit dizisi veya alt dizisini kodlayan nükleik asit dizisine refere eder. Karsilik gelen insan germ hatti dizisi ayni zamanda degerlendirilen diger bütün degisken bölge amino asit dizileri ile karsilastirildiginda bir referans degisken bölge amino asit dizisi veya alt dizisi ile en yüksek belirlenmis amino asit dizisi özdesligi olan insan degisken bölge amino asit dizisi veya alt dizisine refere eder. Karsilik gelen insan germ hatti dizisi, sadece çati bölgeleri, sadece tamamlayicilik belirleme bölgeleri, çati ve tamamlayicilik belirleme bölgeleri, bir degisken segmen (yukarida tanimlandigi üzere) veya bir degisken bölgeyi içeren diziler veya alt dizilerin diger kombinasyonlari olabilir. Dizi özdesligi, burada açiklanan yöntemler, örnegin BLAST, ALIGN veya teknikte bilinen diger hizalama algoritmasi kullanilarak iki dizinin hizalanmasi kullanilarak belirlenebilir. Karsilik gelen insan germ hatti nükleik asit veya amino asit dizisi, referans degisken bölge nükleik asit veya amino asit dizisi ile en az yaklasik %90, %92, %94, %96, %98, %99 dizi özdesligine sahip olabilir. Karsilik gelen insan germ hatti dizileri, örnegin halka açik uluslararasi lmMunoGeneTios veri tabani (IMGT) (dünya çapinda ag üzerinde imgt.cines.fr/ adresinde) ve V-base (dünya çapinda ag üzerinde vbase.mrC-cpe.cam.ac.uk adresinde) araciligiyla belirlenebilir. Bir antijen, örnegin bir protein ila bir antikor veya antikor türevli baglama ajani arasindaki etkilesimi açiklayan baglamda kullanildiginda "spesifik olarak (veya seçici olarak) baglama" ifadesi, proteinlerin bir heterojen popülasyonunda ve diger biyolojik ürünler, örnegin, bir biyolojik numune, örnegin bir kan, serum, plazma veya doku numunesinde antijenin varliginin belirleyicisi olan bir baglama reaksiyonuna refere eder. Bu nedenle gösterilen immünoanaliz kosullari altinda belirli bir baglama spesifikligi olan antikorlar veya baglama ajanlari, arka planin en az iki kati kadar bir seviyede belirli bir antijene baglanir ve numunede mevcut olan diger antijenlere büyük oranda önemli bir miktarda baglanmaz. Bu tür kosullar altinda bir antikora veya baglama ajanina spesifik baglanma, belirli bir proteine yönelik bunun spesifikligine yönelik antikor veya ajanin seçilmesini gerektirebilir. Istenildigi veya uygun oldugu üzere bu seçim, diger türlerden (örnegin, fare) veya diger PCSK alt türlerinden örnegin, PCSK9 molekülleri ile çapraz olarak reakte olan antikorlardan çikartilarak gerçeklestirilebilir. Çesitli immünoanaliz formatlari, spesifik olarak belirli bir protein ile immünoreaktif olan antikorlari seçmek üzere kullanilabilir. Ornegin kati faz ELISA immünoanalizleri rutin bir sekilde spesifik olarak bir protein ile immünoreaktif olan antikorlari seçmek üzere kullanilir (bakiniz, örnegin, spesifik immünoreaktiviteyi belirlemek üzere kullanilabilen immünoanaliz formatlari ve kosullarinin açiklamasina yönelik Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual (1998)). Tipik olarak bir spesifik veya seçici baglama reaksiyonu, arka plan üzerinde en az iki kati seviyede ve daha tipik olarak arka plan üzerinde en az 10 ila 100 katindan az seviyede bir sinyal üretecektir. "Denge ayrisma sabiti (KD, M)" terimi, birlesme hiz sabiti (ka, süre", M4) ile bölünen ayrisma hiz sabitine (kd, süre'i) refere eder. Denge ayrisma sabitleri, teknikte bilinen herhangi bir yöntem kullanilarak ölçülebilir. Mevcut bulusun antikorlari genel olarak yaklasik 10"7 veya 10'8 M'den az, örnegin yaklasik 10'9 M veya 10"10 M'den az, bazi düzenlemelerde yaklasik 10'11 M, 10"12 M veya 10'13 M'den az bir denge ayrisma sabitine sahip olacaktir. Burada kullanildigi üzere "antijen baglama bölgesi" terimi, molekül ile PCSK9 arasindaki spesifik baglanmadan sorumlu olan bu bulusun PCSK9 baglama molekülünün bir domenine refere eder. Bir antijen baglama bölgesi, en az bir antikor agir zincir degisken bölge ve en az bir antikor hafif zincir degisken bölgeyi içerir. Bu bulusun her bir PCSK9 baglama molekülünde mevcut olan bu tür en az bir antijen baglama bölgesi vardir ve antijen baglama bölgelerinin her biri, özdes veya digerlerinden farklidir. Bazi düzenlemelerde bu bulusun PCSK9 baglama molekülüni'in antijen baglama bölgelerinden en az biri, PCSK9'un bir antagonisti olarak islev görür. Burada kullanildigi 'üzere "antagonist" terimi, hedef molekülü spesifik olarak baglayabilen ve bunun aktivitesini inhibe edebilen bir ajana refere eder. Örnegin PCSK97un bir antagonisti spesifik olarak PCSKQ'a baglanir ve LDLRrnin PCSK9 aracili degradasyonunu tam olarak veya kismi olarak inhibe eder. LDLR'nin PCSK9 aracili degradasyonun inhibe edilmesi, LDLR*ye baglanan PCSK9" engelleyebilir veya engellemeyebilir. Bazi durumlarda bir PCSK9 antagonisti, bunun PCSK9*a baglanma ve PCSK9'un LDLRrye baglanmasini inhibe etme yetenegi ile tanimlanabilir. Bulusun bir antagonistine maruz kaldiginda LDLR'nin PCSK9 aracili degradasyonu, bir kontrolün varliginda veya antagonistin yoklugunda PCSK9 aracili degradasyon ile karsilastirildiginda en az yaklasik %10 az, örnegin en az yaklasik %25, %50, %75 az oldugunda veya tamemen inhibe edildiginde inhibisyon meydana gelir. Bir kontrol, sifir antikor veya antijen baglama molekülüne, spesifik olarak diger bir antijene baglanan bir antikor veya antijen baglama molekülüne veya bir antagonist olarak fonksiyon göstermeyen bir anti-PCSK9 antikoru veya antijen baglama molekülüne maruz birakilabilir. Bir "antikor antagonisti", antagonistin bir inhibe edici antikor oldugu duruma refere eder. "PCSK9" veya "proprotein konvertaz subtilisin/keksin tip Qa" terimi degistirilebilir olarak sekretuar subtilaz ailesinin proteinaz K alt ailesine ait olan dogal olarak meydana gelen bir insan proprotein konvertazina refere eder. PCSK9, endoplazmik retikulumda otokatalitik intramolek'üler prosese tabi tutulan bir çözünebilir zimojen olarak sentezlenir ve bir protein konvertazi olarak fonksiyon gösterdigi düsünülür. PCSK9, kolesterol homeostazinda bir rol oynar ve kortikal nöronlarin farklilastirilmasinda bir rol oynayabilir. Bu PCSK9 genindeki mutasyonlar, otomozal dominant ailesel hiperkolesterolami ile iliskilendirilmistir. Bakiniz, örnegin, Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1):11-26. PCSK9'un nükleik asit ve amino asit dizileri bilinir ve sirasiyla GenBank Erisim No'lari NM_174936.2 ve NP_777596.2rde yayinlanmistir. Burada kullanildigi 'üzere bir PCSK9 polipeptid, fonksiyonel olarak LDLRrye baglanir ve LDLR'nin degradasyonunu baslatir. Yapisal olarak bir PCSK9 amino asit dizisi, GenBank erisim no. NP_777596.2'nin amino asit dizisi ile en az yaklasik %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 veya %100 dizi özdesligine sahiptir. Yapisal olarak bir PCSK9 nükleik asit dizisi, GenBank erisim no. NM_174936.2=nin nükleik asit dizisi ile en az yaklasik %90, %91, %92, %93, %94, %95, %96, %97, %98, %99 veya %100 dizi özdesligine sahiptir. "PCSK9 fonksiyon kazanci mutasyonu" ifadesi, örnegin gelismis LDLR degradasyonu ve LDLR seviyelerinin azalmasi nedeniyle olan ailesel hiperkolesterolami fenotipi, hizlanmis aterosklerosis ve erken koroner kalp hastaligi ile iliskilendirilen ve/veya bunlarin nedeni olan PCSK9 genlerinde meydana gelen dogal mutasyona refere eder. PCSK9 fonksiyon kazanci mutasyonlarinin alel frekansi nadirdir. Bakiniz, Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev. (2008) 29(1):11-26. Ornek niteligindeki PCSK9 fonksiyon kazanci mutasyonlari, D129N, D374H, N4258 ve R496W içerir. Bakiniz, Fasano, et al., Atherosclerosis (2009) 203(1):166-71. PCSK9 fonksiyon kazanci mutasyonlari, örnegin Burnett and Hooper, supra; Fasano, et al, supra; Abifadel, et al., J Med Genet (2008) 45(12):780-6; Abifadel, et al., Hum Mutat (2009) 30(4):520-9; and Li, et al., Recent Pat DNA Gene Seq (2009) Nov. 1 (PMID 19601924) içinde degerlendirilir. Bulusun bir polipeptidinin "aktivitesi", bunun natif hücresi veya dokusunda bir polipeptidin yapisal, düzenleyici veya biyokimyasal fonksiyonlarina refere eder. Bir polipeptidin aktivitesinin örnekleri, dogrudan aktiviteleri ve dolayli aktiviteleri içerir. PCSK9'un örnek niteligindeki dogrudan aktiviteleri, LDLRyye baglanma ve LDLRînin PCSK9 aracili degradasyonu dahil olmak üzere polipeptid ile dogrudan etkilesimin sonucudur. PCSK9run baglaminda örnek niteligindeki dolayli aktiviteler, fenotipteki bir degisiklik veya bir hücrede, dokuda, organda veya öznede örnegin yüksek karaciger LDLR'sinin azaltilmasi, düsük plazma HDL-C, düsük plazma kolesterol, statinlere karsi yüksek duyarlilik gibi polipeptidin dogrudan aktivitesine karsi yaniti olarak gözlemlenir. Bir nükleik asit veya proteine uygulandiginda "izole edilmis" terimi, nükleik asit veya proteinin bunun dogal halde iliskilendirildigi diger selüler bilesenleri esas olarak içermedigini gösterir. Bu tercihen homojen bir haldedir. Bu kuru veya aköz bir solüsyon içinde olabilir. Saflik ve homojenlik tipik olarak poliakrilamid jel elektroforez veya yüksek performansli sivi kromatografisi gibi analitik kimya teknikleri kullanilarak belirlenir. Bir hazirlanista mevcut olan baskin tür olan bir protein büyük oranda saflastirilir. Ozellikle izole edilmis bir gen, geni yandan destekleyen ve söz konusu gen disinda bir proteini kodlayan açik okuma çerçevelerinden ayrilir. "Saflastirilmis" terimi, bir nükleik asit veya proteinin bir elektroforetik jel içinde esas olarak bir bant ortaya çikardigini gösterir. Ozellikle bu, nükleik asit veya proteinin en az %85 saf, daha fazla tercih edildigi üzere %95 saf ve en fazla tercih edildigi üzere en az %99 saf oldugu anlamina gelir. "Nükleik asit" veya "polinükleotid" terimi, deoksiribonükleik asitler (DNA) veya ribonükleik asitler (RNA) ve bunun tek veya çift sarmalli formda polimerlerine refere eder. Spesifik olarak sinirlandirilmadigi üzere terim, referans nükleik asit ile benzer baglama özelliklerine sahip olan ve dogal olarak meydana gelen nükleoitdler ile benzer bir sekilde metabolize edilen dogal nükleotidlerin bilinen analoglarini içeren nükleik asitleri kapsar. Aksi gösterilmedigi sürece belirli bir nükleik asit dizisi ayni zamanda dolayli olarak bunun korunumlu bir sekilde modifiye edilen varyantlarini (Örnegin, dejenre kodon sübstitüsyonlari), aleller, ortologlar, SNP'Ier ve tamamlayici diziler ayrica açik bir sekilde gösterilen diziyi kapsar. Spesifik olarak dejenere kodon sübstitüsyonlari, seçilen bir veya daha fazla (veya tamami) kodonlarin üçüncü pozisyonunun karistirilmis baz ve/veya deoksinosin kalintilari ile sübstitüe edildigi diziler olusturularak elde edilebilir (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 1925081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 26022605-2608 (1985); ve Rossolini et al., Mol. Cell. Probes &91-98 (1994)). "Polipeptid", "peptid" ve "protein" terimleri, degistirilebilir olarak burada amino asit kalintilarinin bir polimerine refere etmek üzere kullanilir. Terim, bir veya daha fazla amino asit kalintisinin karsilik gelen dogal olarak meydana gelen bir amino asidin yapay bir kimyasal mimetigi oldugu amino asit polimerlerine ayrica dogal olarak meydana gelen amino asit polimerlerine ve dogal olmayan sekilde meydana gelen amino asit polimerine yönelik geçerlidir. "Amino asit" terimi, dogal olarak meydana gelen ve sentetik amino asitlere ayruca dogal olarak meydana gelen amino asitler ile benzer bir sekilde fonksiyon gösteren amino asit analoglari ve amino asit mimetiklerine refere eder. Dogal olarak meydana gelen amino asitler, genetik kod tarafindan kodlananlar ayrica daha sonra modifiye edilen bu amino asitler, `örnegin hidroksiprolin, y-karboksiglutamat ve O-fosfoserindir. Amino asit analoglari, 'örnegin homoserin, norlösin, metiyonin sülfoksit, metiyonin metil sülfonyum olmak üzere dogal olarak meydana gelen bir amino asit, diger bir ifadeyle bir hidrojene, bir karboksil grubuna, bir amino grubuna ve bir R grubuna baglanan bir oi-karbon ile ayni bazik kimyasal yapiya sahip olan bilesiklere refere eder. Bu tür analoglar, modifiye edilmis R gruplarina (örnegin, norlösin) veya modifiye edilmis peptid omurgalarina sahiptir ancak dogal olarak meydana gelen bir amino asit olarak ayni bazik kimyasal yapiyi muhafaza eder. Amino asit mimetikleri, bir amino asidin genel kimyasal yapisindan farkli olan ancak dogal olarak meydana gelen bir amino asit ile benzer bir sekilde fonksiyon gösteren bir yapiya sahip olan kimyasal bilesiklere refere eder. "Korunmali olarak modifiye edilen varyantlar", amino asit ve nükleik asit diziler için geçerlidir. Belirli nükleik asit dizilerine iliskin olarak korunmali olarak modifiye edilen varyantlar, özdes veya esas olarak özdes amino asit dizilerini kodlayan veya nükleik asidin bir amino asit dizisini kodlamadigi nükleik asitlere, esas olarak özdes dizilere refere eder. Genetik kodun dejenerasyonu nedeniyle çok sayida fonksiyonel olarak özdes nükleik asit, herhangi bir verilen proteini kodlar. Ornegin kodonlar GCA, GCC, GCG ve GCU'nun tamami amino asit alanini kodlar. Bu nedenle bir alaninin bir kodon tarafindan belirlendigi her pozisyonda kodon, kodlanan polipeptidi degistirmeden açiklanan karsilik gelen kodonlardan herhangi birine degistirilebilir. Bu tür nükleik asit varyasyonlari, korunmali olarak modifiye edilen varyasyonlarin bir türü olan "sessiz varyasyonlardir". Buradaki bir polipeptidi kodlayan her nükleik asit dizisi ayni zamanda nükleik asidin mümkün olan her sessiz varyasyonunu açiklar. Teknikte uzman kisi, bir nükleik asitteki her bir kodonun (normal olarak metiyonine yönelik tek kodon olan AUG ve normal olarak triptofana yönelik tek kodon olan TGG haricinde) fonksiyonel olarak özdes bir molekül vermek üzere modifiye edilebilecegini anlayacaktir. Buna göre bir polipeptidi kodlayan bir nükleik asidin her bir sessizversiyonu, açiklanan her bir dizide açik degildir. Amino asit dizilerine iliskin olarak teknikte uzman kisi, kodlanan dizide tek bir amino asidi veya amino asitlerin küçük bir yüzdesini degistiren, ekleyen veya silen, bir nükleik asit, peptid, polipeptid veya protein dizine yönelik ayri sübstit'usyonlar, delesyonlar ve eklemelerin "korunmali olarak modifiye edilen varyant" oldugunu anlayacaktir, burada degisim, bir amino asidin kimyasal olarak benzer bir amino asit ile s'übstit'usyonuna neden olur. Fonksiyonel olarak benzer amino asitler saglayan korunumlu sübstit'üsyon tablolari teknikte iyi bilinir. Bu tür korunmali olarak modifiye edilen varyantlar, polimorfik varyantlar, türler arasi homologlar ve bulusun alellerine ek olarak bulunabilir ve bunlari kapsam disinda birakmaz. Asagidaki sekiz grubun her biri, birbirine yönellik korunumlu sübstitüsyonlar olan amino asitleri içerir: 1)Alanin (A), Glisin (G); 2) Aspartik asit (D), Glutamik asit (E); 3) Asparajin (N), Glutamin (Q); 4) Arjinin (R), Lizin (K); 5) Izolösin (I), Lösin (L), Metiyonin (M), Valin (V); 6) Fenilalanin (F), Tirosin (Y), Triptofan (W); 7) Serin (S), Treonin (T); ve 8) Sistein (C), Metiyonin (M) (bakiniz, örnegin, Creighton, Proteins (1984)). "Dizi özdesliginin yüzdesi", bir karsilastirma penceresi 'üzerinde optimal olarak hizalanan iki dizi karsilastirilarak belirlenir, burada karsilastirma penceresinde polin'ükleotid dizisinin kismi, iki dizinin optimal hizalanmasina yönelik, eklemeleri veya delesyonlari içermeyen referans dizisi (örnegin, bulusun bir polipeptidi) ile karsilastirildiginda eklemeleri veya delesyonlari (diger bir ifadeyle, bosluklar) içerebilir. Yüzde, özdes nükleik asit bazi veya amino asit kalintisinin eslestirilen pozisyonlarin sayisini vermek 'üzere her iki dizide meydana geldigi pozisyonlarin sayisi belirlenerek, eslestirilen pozisyonlarin sayisi karsilastirma penceresinde pozisyonlarin toplam sayisi ile bölünerek ve dizi özdesliginin yüzdesini vermek 'üzere sonuç 100 ile çarpilarak hesaplanir. Iki veya daha fazla nükleik asit veya polipeptid dizisinin baglaminda "özdes" veya yüzde "özdesligi terimleri, ayni diziler olan iki veya daha fazla dizi veya alt diziye refere eder. Karsilastirildiginda ve asagidaki dizi karsilastirma algoritmalarindan biri kullanilarak veya manuel hizalama ve gözle inceleme ile ölçüld't'ig'u 'üzere bir karsilastirma penceresi veya belirlenen bölge 'üzerinde maksimum uygunluga yönelik hizalandiginda iki dizinin ayni olan (diger bir ifadeyle, belirtilen bir bölge 'üzerinde veya belirtilmediginde bir referans dizisinin tüm dizisi üzerinde %70, %75, %80, %85, %90, %95, %96, %97, %98 veya %99 dizi özdesligi) amino asit kalintilari veya nükleotidlerin belirtilen bir yüzdesine sahip olmasi halinde iki dizi "büyük oranda özdes" olur. Bulus, sirasiyla burada örneklendirilen polipeptidler veya polini'ikleotidler ile büyük oranda özdes olan polipeptidleri veya polini'ikleotidleri saglar (örnegin, SEQ ID NO'Iar21-5, 15-19 ve 40- 41'den herhangi birinde örneklendirilen degisken bölgeler; SEQ ID NOilarz27-31'den herhangi birinde örneklendirilen degisken bölgeler; SEQ ID NOilar:6-14, 20-26'dan herhangi birinde örneklendirilen CDR'Ier; SEQ ID NO'lar: 32-39'dan herhangi birinde örneklendirilen FR'Ier; ve SEO ID NOlarz42-45ften herhangi birinde örneklendirilen nükleik asit dizileri). Istege bagli olarak özdeslik, uzunluk olarak en az yaklasik 15, 25 veya 50 nükleotid olan bir bölge 'üzerinde veya daha fazla tercih edildigi üzere uzunluk olarak 100 ila 500 veya 1000 veya daha nükleotid olan bir bölge üzerinde veya referans dizisinin tam uzunlugu üzerinde mevcuttur. Amino asit dizilerine iliskin olarak özdeslik veya büyük oranda özdeslik, uzunluk olarak en az 5, 10, 15 veya 20 amino asit, istege bagli olarak uzunluk olarak en az yaklasik 25, 30, 35, 40, 50, 75 veya 100 amino asit, istege bagli olarak uzunluk olarak en az yaklasik 150, 200 veya 250 amino asit olan bir bölge üzerinde veya referans dizisinin tam uzunlugu üzerinde mevcut olabilir. Daha kisa olan amino asit dizilerine, örnegin 20 veya daha az amino asit olan amino asit dizilerine iliskin olarak büyük oranda özdeslik, bir veya iki amino asit kalintisi, burada tanimlanan korunumlu sübstit'üsyonlara göre korunumlu olarak sübstit'üe edildiginde mevcuttur. Dizi karsilastirmasina yönelik tipik olarak bir dizi, test dizilerinin karsilastirildigi bir referans dizisi olarak islev görür. Bir dizi karsilastirma algoritmasi kullanilirken referans dizileri, bir bilgisayara girilir, gerekli olmasi halinde dizi koordinatlari belirlenir ve dizi algoritmasi program parametreleri belirlenir. Varsayilan program parametreleri kullanilabilir veya alternatif parametreler belirlenebilir. Dizi karsilastirma algoritmasi akabinde program parametrelerine bagli olarak referans dizisine göre test dizilerine yönelik yüzde dizi özdesliklerini hesaplar. Burada kullanildigi üzere bir "karsilastirma penceresi", 20 ila 600, genel olarak yaklasik 50 ila yaklasik 200, daha genel olarak yaklasik 100 ila yaklasik 150'den olusan gruptan seçilen bitisik pozisyonlarin sayisindan herhangi birinin bir segmentine referansi içerir, burada bir dizi, iki dizinin optimal olarak hizalanmasindan sonra ayni sayidaki ardisik pozisyonlarin bir referans dizisi ile karsilastirilabilir. Karsilastirmaya yönelik dizilerin hizalanmasina yönelik yöntemler teknikte iyi bilinir. Karsilastirmaya yönelik optimal hizalalama, Örnegin Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:4820'nin lokal homoloji algoritmasi, Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443!Un homoloji hizalama algoritmasi, Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 8522444'ün benzerlik yöntemine yönelik arastirmasi, bu algoritmalarin bilgisayar donanimli uygulamalari (Wisconsin Genetics Yazilim Paketi içindeki GAP, BESTFIT, FASTA ve TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) veya manuel hizalama ve gözle inceleme (bakiniz, örnegin, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)) ile gerçeklestirilebilmektedir. Yüzde dizi özdesliginin ve dizi benzerliginin belirlenmesine yönelik uygun olan algoritmalarin iki örnegi, BLAST ve BLAST 2.0 algoritmalaridir, bunlar sirasiyla Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 ve Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 2152403-410 içinde açiklanir. BLAST analizlerinin gerçeklestirilmesine yönelik yazilim, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi araciligiyla halka açiktir. Bu algoritma, birinci olarak yüksek skor veren dizi çiftlerinin (HSP'Ier) bir veritabani dizisinde ayni uzunluktaki bir sözcük ile hizalandigi zaman bazi pozitif degerli esik skoru (T) ile eslesen veya uyum gösteren, sorgu dizisinde bulunan W uzunlugundaki kisa sözcüklerin tanimlanmasi yoluyla tanimlanmasini içerir. T, komsu sözcük skor esigi olarak refere edilir (Altschul et al., supra). Bu ilk komsu sözcük eslesmeleri, bunlari içeren birinci daha uzun HSP'Ieri bulmaya yönelik aramalari baslatmaya yönelik baslangiç noktasi olarak islev görür. Sözcük eslesmeleri, her bir dizi boyunca her iki yönde kümülatif hizalama skorunun yükseltilebilecegi kadar genisletilir. Kümülatif skorlar, nükleotid dizilerine yönelik M (eslesen kalintilarin bir çiftine yönelik ödül skoru; her zaman 0) ve N (yanlis eslesen kalintilara yönelik ceza skoru; her zaman < 0) parametreleri kullanilarak hesaplanir. Amino asit dizilerine yönelik bir skorlama matrisi, kümülatif skoru hesaplamak üzere kullanilir. Sözcük eslesmelerinin her bir yönde uzatilmasi asagidaki durumlarda durdurulur: kümülatif hizalanma skoru elde edilen maksimum degere göre X miktari kadar düstügünde; bir veya daha fazla negaitf skoarlama kalinti hizalamasinin toplanmasi nedeniyle kümülatif skor sifira veya altina düstügünde ya da dizilerden herhangi birinin ucuna ulasildiginda. BLAST algoritma parametreleri (W, T ve X), hizalamanin duyarliligini ve hizini belirler. BLASTN programi (nükleotid dizilerine yönelik) varsayilan olarak 11 olan sözcük uzunlugu (W), 10 olan beklenti degeri (E), M=5, N=-4 ve her iki sarmalin bir karsilastirmasini kullanir. Amino asit dizilerine yönelik BLASTP programi, varsayilan olarak 3 olan sözcük uzunlugu ve 10 olan beklenti degeri (E) ve 50 olan BLOSUM62 skorlama matrisi (bakiniz Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89210915) hizalamalari (B), 10 olan beklenti degeri (E), M=5, N=-4 ve her iki sarmalin bir karsilastirmasini kullanir. BLAST algoritmasi ayni zamanda iki dizi arasindaki benzerligin istatistiksel analizini gerçeklestirir (bakiniz, örnegin, Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9025873-5787). BLAST algoritmasi ile saglanan bir benzerlik ölçütü, iki nükleotit veya amino asit dizisi arasindaki bir eslesmenin sans eseri meydana gelme olasiligininin bir göstergesini saglayan en düsük toplam olasiligidir (P(N)). Ornegin test nükleik asidinin referans nükleik asidi ile karsilastirmasinda en düsük toplam olasiligin yaklasik 0.2'den düsük, daha fazla tercih edildigi üzere yaklasik 0.01'den düsük ve en fazla tercih edildigi üzere yaklasik 0.001'den düsük olmasi halinde bir nükleik asidin bir referans dizisi ile benzer oldugu kabul edilir. Iki nükleik asit dizisi veya polipeptidin büyük oranda özdes oldugunun bir göstergesi, birinci nükleik asit tarafindan kodlanan polipeptidin asagida açiklandigi üzere ikinci nükleik asit tarafindan kodlanan polipeptide karsi yetistirilen antikorlar ile immünolojik olarak çapraz reaktif olmasidir. Bu nedenle bir polipeptid, örnegin iki polipeptidin sadece korunmali sübstit'usyonlar ile farklilik göstermesi durumunda ikinci bir polipeptid ile tipik olarak büyük oranda özdestir. Iki nükleik asit dizisinin büyük oranda özdes olmasinin diger bir göstergesi, iki molekülün veya bunlarin tamamlayicilarinin asagida açiklandigi üzere kati kosullar altinda birbirine hibritlenmesidir. Iki nükleik asit dizisinin büyük oranda özdes olmasinin diger bir göstergesi, ayni primerlerin diziyi çogaltmak üzere kullanilabilmesidir. Antijen baglama bölgelerinin bu bulusun bir PCSK9 baglama molekülünde nasil baglandiginin açiklanmasi baglaminda kullanildiginda "baglanti" terimi, bölgelerin fiziksel olarak birlestirilmesine yönelik mümkün olan tüm araçlari kapsar. Birçok antijen baglama bölgesi sik bir sekilde kimyasal baglar örnegin bir kovalent bag (örnegin, bir peptid bagi veya bir disülfid bagi) veya bir dogrudan bag (diger bir ifadeyle, iki antijen baglama bölgesi arasinda bir baglayici olmadan) veya dolayli bag (diger bir ifadeyle, iki veya daha fazla antijen baglama bölgesi arasinda en az bir baglayici molekülün yardimiyla) olabilen kovalent olmayan bir bag ile birlestirilir. u is "Ozne , hasta" ve "kisi" terimleri degistirilebilir olarak bir memeliye, örnegin bir insan veya insan olmayan bir primat memeliye refere eder. Memeli ayni zamanda bir laboratuvar memelisi, örnegin fare, siçan, tavsan, hamster olabilir. Bazi düzenlemelerde memeli birtarim hayvani (örnegin, at, koyun, bovin, domuz, devegiller) veya evcil memeli (örnegin, köpek, kedi) olabilir. "Terapötik olarak kabul edilebilir miktar" veya "terapötik olarak etkili doz" terimi, istenen sonucu (diger bir ifadeyle, HDL-disi-C plazmada, hiperkolesterolemi, ateroskleroz, koroner kalp hastaliginda bir azalma) elde etmek üzere yeterli bir miktara refere eder. Bazi düzenlemelerde terapötik olarak etkili bir miktar, istenmeyen yan etkileri indüklemez veya bunlara neden olmaz. Terapötik olarak kabul edilebilir bir miktar, birinci olarak düsük bir doz uygulanarak ve akabinde istenen etki elde edilene kadar bu doz asamali olarak arttirilarak belirlenebilir. Bulusun bir PCSK9 antagonize edici antikorunun "profilaktik olarak etkili dozaji" ve "terapötik olarak etkili dozaji", sirasiyla PCSK9'un varligi ile iliskili olan hastalik semptomlarinin (örnegin, hiperkolesterolemi) baslamasini önleyebilir veya bunun siddetinde bir azalmaya neden olabilir. Söz konusu terimler ayni zamanda sirasiyla hastalik semptomlarini içermeyen periyotlarin sikligini ve sürecini baslatabilir veya arttirabilir. "Profilaktik olarak etkili dozaj" ve "terapötik olarak etkili dozaj" ayni zamanda sirasiyla PCSK9'un aktivitesinden ortaya çikan bozukluklar ve hastaliklar nedeniyle bozulma veya yetersizligi önleyebilir veya düzeltebilir. "Birlikte uygulama" terimi, bir kisinin kaninda iki aktif ajanin es zamanli varligina refere eder. Birlikte uygulanan aktif ajanlar es zamanli olarak veya sirali olarak dagitilabilir. Burada kullanildigi üzere "esas olarak bundan olusan" ifadesi, yöntemler veya bilesimlerin hedeflenen amacina yönelik aktif olmayan herhangi bir eksipiyanin yani sira bir yöntem veya bilesimde bulunan aktif farmasötik ajanlarin cinslerine veya türlerine refere eder. Bazi düzenlemelerde "esas olarak bundan olusan" ifadesi, bulusun bir antagonist anti PCSK9 antikoru disinda bir veya daha fazla ilave aktif ajanin dahil edilmesini açik bir sekilde hariç tutar. Bazi düzenlemelerde "esas olarak bundan olusan" ifadesi, bulusun bir antagonist anti PCSK9 antikoru ve birlikte uygulanan ikinci bir ajan disinda bir veya daha fazla ilave aktif ajanin dahil edilmesini açik bir sekilde hariç tutar. "Statin" terimi, 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A (HMG-COA) redüktazinin rekabetçi inhibitörleri olan farmakolojik ajanlarin bir sinifina refere eder. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1, parent fare monoklonal antikor NVP-LFU7201nin agir (SEQ ID NO:1) ve hafif (SEQ lD NO:15) zincir amino asit dizilerini gösterir. CDR1, CDR2 ve CDR3*ün dizileri alti çizili ve koyu yazilmistir. Sekil 2, parent fare monoklonal antikor NVP-LGT209'un agir (SEQ ID No:2) ve hafif (SEQ ID NO:16) zincir amino asit dizilerini gösterir. CDR1, CDR2 ve CDR3'ün dizileri alti çizili ve koyu yazilmistir. Sekil 3, parent fare monoklonal antikor NVP-LGT210'un agir (SEQ ID No:2) ve hafif (SEO ID NO:18) zincir amino asit dizilerini gösterir. CDR1, CDR2 ve CDR3'i`Jn dizileri alti çizili ve koyu yazilmistir. Sekil 4, parent fare monoklonal antikor NVP-LGT211'in agir (SEO ID No:4) ve hafif (SEQ ID NO:16) zincir amino asit dizilerini gösterir. CDR1, CDR2 ve CDR3iün dizileri alti çizili ve koyu yazilmistir. Sekiller 5A-C, NVP-LFU720-NX-4 ile birkaç farkli insan ve fare antijeni ile karsilastirildiginda NVP-LGT209 (A), NVP-LGT210 (B) ve NVP-LGT-211 (C)'nin baglanmasini test eden ELISA analizini gösterir. Sekiller 6A-C, bir ELISA'da NVP-LGT209 (A), NVP-LGT210 (B) and NVP-LGT-211 (C)'nin insan ve sino Pcsk9'a baglanmasini gösterir. Ikincil antikor, 115000 seyreltilen keçi anti-faredir. Sadece 2., tek basina sekonder antikor kontrolüd'ür. Sekil 7, parent fare monoklonal antikor, NVP-LFU720'nin PCSK9'un C-terminusuna, kalintilar 680-6921ye (RSRHLAQASQELQ SEO ID NO:49) baglandigini gösterir. HumaneeredTM antikorlar LGT209, LGT21O ve LGT211, ayni epitop için rekabet eder. C-term mutant A685X = SEQ ID NO:56. Sekil 8, zamana bagli floresan rezonans enerji transferi (TR-FRET) biyolojik analizinde belirlendigi 'üzere parent fare antikor NVP-LFU720rnin (5P20) yetersiz bir sekilde PCSK9 ve LDL-R etkilesimini bozdugunu gösterir. Aksine 13C10, 50 nM bir IC5o ile PCSKQ-LDL- R FRET etkilesimini bozar. Bir florofor (hPCSK9-AF) ile etiketlenen insan PCSKQ'U, oda sicakliginda 30 dakika boyunca analiz tamponu (20 mM HEPES, pH 7.2, 150 mM NaCI, 1 mM CaClz, %01 v/v Tween 20 ve %0.1 w/v BSA) içinde NVP-LFU720-AX-1 veya 13C1O ile inkübe edilmistir. Bunun akabinde öropiyum-etiketli LDL-R (hLDL-R-Eu) eklenmistir ve tekrar 90 dakika boyunca oda sicakliginda inkübasyon gerçeklestirilmistir böylece nihai konsantrasyonlar, 8 nM hPcsk9-AF ve 1 nM hLDL-R-Eu olmustur. TR- FRET sinyali (330 nm eksitasyon ve 665 nm emisyon), bir plaka okuyucu (EnVision 2100, Perkin Elmer) ile ölçülmüstür ve 5P20 veya 13C1O varliginda inhibisyon %isi hesaplanmistir. ICso degerleri, Prism (GraphPad) içinde inhibisyon yüzdesi degerleri belirtilerek hesaplanmistir. Her bir veri noktasi, ortalama ± SDîyi (nokta basina n = 4 kopya) temsil eder. Veriler, en az iki bagimsiz deneyin temsilidir. Sekil 9, HumaneeredTM antikorlar LGT209, LGT21O ve LGT211iin artan LDL-R seviyelerine ve HepG2 hücreleri tarafindan LDL-alimina neden olacak sekilde fare antikoru LFU720rye esdeger oldugunu gösterir. LDL-R ölçümüne yönelik hücreler, PCSK9 baglama antikorlari ile inkübe edilmistir ve anti-LDL-R antikorlari ile etiketlenmistir. LDL alimina yönelik hücreler, PCSK9 baglama antikorlari, PCSK9 ve Dil- LDL ile inkübe edilmistir. LDL-R antikorlari ve Dil-LDL floresan, akis sitometrisi ile ölçülmüstür. Kopya ölçümlerine yönelik ortalama + SEM, her bir analize yönelik gösterilir. Sonuçlar, 3 bagimsiz deneyin temsilidir. LDL alimi analizlerine yönelik PCSK9 baglama antikorlari, %10 fetal bovin Iipoproteinden yoksun serum (Intracel) ve 200 nM insan PCSK9 (Hampton et al. PNAS (2007)104:14604-14609) içeren DMEM içinde oda sicakliginda 30 dakika boyunca inkübe edilmistir ve antikor/PCSK9/ortam solüsyonlari, 96 gözlü plakalarda hücrelere eklenmistir ve bir gece boyunca inkübe edilmistir. Sonraki gün ilave 2 saat boyunca 1,1'- dioktadesiI-3,3,3',3'-tetrametil-indokarbosiyanin perklorat-etiketli LDL (Dil-LDL, Biomedical Technologies) eklenmistir. Ortam akabinde aspire edilmistir, hücreler üç kez PBS ile yikanmistir ve hücreler, %025 tripsin-EDTA ile ayristirilmistir. Hücreler akabinde FACS tamponuna (%5 fetal bovin serum, 2mM EDTA ve %0.2 sodyum azid içeren PBS) aktarilmistir, 10 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüjlenmistir, aspire edilmistir ve %1 paraformaldehid içinde sabitlenmistir. LDL alimi, akis sitometrisi (Becton Dickinson LSR II) kullanilarak selüler Dil floresani (488 nmSde eksitasyon ve 575 nmide emisyon) ile ölçülmüstür. Yüzey LDL-R analizlerine yönelik hücreler, antikorlari içeren serum içermeyen ortam ile inkübe edilmistir, PBS ile yikanmistir ve Versine (Biowhittaker, 17- 771 E) ve FACS tamponu içinde toplanmistir. Hücreler yeni plakalara aktarilmistir, 5 dakika boyunca 1200 rpm*de santrifüjlenmistir ve normal tavsan IgG (MP biomedicals) ile bloke edilmistir. Hücreler, FACS tamponunda tavsan-anti-hLDL-R-Alexa 647 lgG (5 ug/ml) etiketli antikorlar ile etikeltlenmistir, santrifüjlenmistir, yikanmistir ve %1 paraformaldehid içinde sabitlenmistir. Yüzey LDL-Risi, akis sitometrisi (488 nm'de eksitasyon ve 633 nm'de emisyon) ile ölçülmüstür. EC50'Ier, Prism (GraphPad) kullanilarak hesaplanmistir. Sekil 10, mevcut antikorlarin kolesterol düsürme etkisini belirlemek üzere Insan PCSK9 infüzyon fare modeline yönelik çalisma tasariminin bir sematigini saglar. LGT209, LGT21O ve LGT211, murin PCSK9runa tespit edilebilir herhangi bir baglama olmadan yüksek afinite ile hPCSK9*a baglanan HumaneeredTM anti-PCSK9 antikorlaridir. LGT209, LGT210 veya LGT211iin HDL-disi kolesterolün hPCSK9 aracili yükselmesini inhibe edebilip edemedigini ve hepatik LDLRtnin PCSK9 aracili degradasyonunu önleyebilip önleyemedigini test etmek üzere antikorlarin her biri hPCSK9 (sürekli infüzyona yönelik) içeren ozmotik mini-pompa implantasyondan 3 saat önce farelere enjekte edilmistir. Plazma ve karaciger dokusu toplama, hPCSK9 enjeksiyonundan 24 saat sonra gerçeklestirilmistir. Sekil 11, antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211 ile muamelenin infüzyon fare modelinde insan PCSK95unun ("hPCSK9") akümülasyonuna neden oldugunu gösterir. Kisaca toplam hPCSK9, yakalamaya yönelik mAb 7D16 kullanilarak ELlSA ile ölçülm'usti'ir. mAb 7D16, LGT209, LGT210 ve LGT211 disinda PCSK9 'üzerinde farkli bir epitopu baglar ve toplam (serbest ve bagli) PCSK9'u ölçmek `üzere kullanilabilir. Toplam hPCSK97da gözlemlenen artis, büyük olasilikla hPCSkK9/Ab komplekslerindeki artistan kaynaklanir. Serbest antikor, yakalamaya yönelik hPCSK9 kullanilarak ELISA ile ölçülm'ust'ür. Bu analiz, "serbest" antikoru ölçmüstür ve olasi bir sekilde 1:1 AbzPCSKQ komplekslerini ölçer. C57BL/6 fareleri, tek basina araç, tek basina PCSK9, PCSK9 + 20 mg/kg LGT210, PCSK9 + 20 mg/kg NVP-LGT211 veya fare spesifik olmayan lgG karisimi (negatif kontrol) ile muamele edilmistir. Ayri veri noktalarinin grafigi çizilir ve ortalama deger, bir yatay çubuk ile ayrilir; p < 0.05 önemli olarak kabul edilmistir. Plazma lgG seviyeleri, Meso Scale Discovery (MSD) analizi ile ölçülmüstür. Serbest antikor, yakalamaya yönelik hPCSK9 kullanilarak ölçülmüst'ur. Bu analiz, "serbest" antikoru ölçm'üst'ür ve olasi bir sekilde 1:1 AbzPCSKQ komplekslerini ölçer. lgG MSD analizine yönelik MSD Standard 96 plakalari (L11XA-3) kullanilmistir. Kisaca plakalar, 4°C'de PBS (25-28 ng/göz) içinde 25 ila 28 pl yakalama antijeni, PCSK9-His, 1 pg/ml ile kaplanmistir. Kaplama solüsyonu uzaklastirilmistir ve plakalar, oda sicakliginda 1 saat boyunca çalkalanarak %5 MSD Blokör A'nin (R93AA-2) 150 pI/göz'u ile bloke edilmistir. Plakanin PBS + %005 Tween-20 300 pl ile 3 kez yikanmasindan sonra 25 pl lgG kalibratör dilL'isyonlari (10,000rden 0.0003 ng/mlrye olmak üzere MSD blokör A ile 10 seri dilüsyon), bilinmeyen plazma numunesi dil'üsyonlari (MSD blokör A ile 10,000X) veya kalite kontrol numuneleri eklenmistir ve oda sicakliginda 1 saat boyunca çalkalanarak ink'ube edilmistir. Yikama isleminden sonra 25 pl/göz 1 ug/ml tespit antikoru (%1 BSA/ PBS / %005 Tween 20 ile seyreltilen MSD keçi anti-fare SULFO-TAG etiketli tespit antikoru, R32AC-5) eklenmistir ve oda sicakliginda 1 saat boyunca çalkalanarak ink'ube edilmistir. Yikama ve 150 pI/göz 1X okuma tamponu T eklendikten sonra plaka, MSD SECTOR lmager 6000 'üzerinde okunmustur. Standart egrinin bir grafigi ve bilinmeyen numeneler, MSD veri analiz yazili kullanilarak hesaplanmistir. Plazma IgG ve hPCSK9 seviyeleri, Meso Scale Discovery (MSD) analizi ile ölçülmüst'ur. MSD hPCSK9 analizi, asagidaki istisnalar ile IgG analizi ile benzerdir. Plakalar, 25-28 pl yakalama antikoru (7D16.C3: 2.95 mg/ml) ile 1 pg/ml'de kaplanmistir. mAb 7D16, LGT209, LGT210 ve LGT211 disinda PCSK9 'üzerinde farkli bir epitopu baglar ve toplam (serbest ve bagli) PCSK9'u ölçmek Üzere kullanilabilir. Plakalarin bloke edilmesinden sonra 25 pl -hPCSK9 kalibratör diI'L'isyonlari (10,000'den 0.0003 ng/ml'ye kadar 10 nokta) ve plazma numune dili'isyonlari (MSD blokör A ile 10,000X) oda sicakliginda 1 saat boyunca çalkalanarak inkübe edilmistir akabinde primer tespit antikoru (tavsan anti- PCSK9 poliklonal antikor, Ab4, kurum içi Tavsan ID #RB11835) ile inkube edilmistir. MSD SECTOR Imager 6000 ile okunmadan önce sekonder tespit antikoru (MSD keçi anti-tavsan SULFO-TAG Etiketli tespit antikoru, R32AB-5) eklenmistir. Toplam hPCSK97da gözlemlenen artis, büyük olasilikla hPCSkK9/Ab komplekslerindeki artistan kaynaklanir. Istatistiksel analiz, GraphPad Prism 4.02 (GraphPad yazilimi, San Diego, CA) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Tek yönlü ANOVA, grup farkliliklarini analiz etmek 'üzere kullanilmistir ve genel farkliliklar bulundugunda muamele edilen gruplar arasindaki spesifik farkliliklari belirlemek üzere Newman-Keuls post hoc testi kullanilmistir. Sekil 12, antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211'in infüzyon fare modelinde akciger LDL-R'sinin hPCSK9 aracili degrasyondan korunmasina neden oldugunu gösterir. 057BL/6 fareleri, tek basina araç, tek basina PCSK9, PCSK9 + 20 mg/kg LGT210, PCSK9 + 20 mg/kg NVP-LGT211 veya fare spesifik olmayan IgG karisimi (negatif kontrol) ile muamele edilmistir. Ayri hayvanlardan karaciger numuneleri gösterilir. Plazma membran numunelerinin poliakrilamid jel elektroforezi, MOPS çalisma tamponu bir (Invitrogen NP0001) ile 20-seritli %4-12 Bis-Tris Invitrogen Midi jel (Invitrogen WG14OZBX10) kullanilarak gerçeklestirilmistir. Hazirlanan numuneeler, 10 dakika boyunca 70°C'de isitilmi stir, buz üzerine yerlestirilmistir ve akabinde bir Matrix çok kanalli pipet, bir jel üzerine her biri 10 pl olan numuneyi yüklemek üzere kullanilmistir. SeeBlue Plus2 markörleri (Invitrogen LC5925), boyut belirleme ve jel yönlendirmeye yönelik numuneler ile birlikte yüklenmistir. Jeller, yükleme boyasi jelin tabanina ulasana kadar 200V sabit voltajda çalistirilmistir. Elektroforezden sonra jeller, bir iBlot birimi (Invitrogen lBtOOiEU) kullanilarak nitroseli'iloz membranlarina (Invitrogen lBSO10-O1) aktarilmistir. Aktarma islemi, 7 dakika boyunca 20V)de gerçeklestirilmistir. Aktarma isleminden sonra membranlar, en az 30 dakika boyunca Pierce Superblock T20 (Pierce 37536) ile bloke edilmistir. Membranlar, "seaI-a-meal" paketlerine yerlestirilmistir ve akabinde sallama islemi ile 4°C=de bir gece boyunca inkübasyondan önce Superblock içinde tavsan anti-LDLR antikorunun 12500 dili'szonu eklenmistir. Membranlar, sallama islemi ile 5 dakika boyunca 5 kez TBS/%0.05 Tween içinde durulanmistir ve akabinde Superblock içinde keçi anti-tavsan HRP sekonder antikorunun 130,000 dilüsyonu, 1 saat boyunca membranlara eklenmistir. Membranlar sallama islemi ile 5 dakika boyunca 5 kez TBS/%0.05 Tween ile tekrar durulanmistir. HRP konjugati, üreticinin talimatlarina göre Pierce SuperSignal West Pico Kemilüminesan Substrat (Pierce 37079) kullanilarak tespit edilmistir. Kisaca esit parçalarda Peroksit Solüsyonu ve LuminoI/Gelistirici Solüsyon karistirilmistir ve 5 dakika boyunca membranlara (0.2mI/cm2) eklenmistir. Fazla solüsyon, blotlama ile uzaklastirilmistir ve membranlar, maruziyete yönelik Kodak BioMax MR X-isini filmine (Kodak 870 1302) maruz birakilmistir. Sekil 13A-C, antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211*in hPCSK9 infüzyon fare modelinde plazma HDL-disi kolesterolde azalmaya neden oldugunu gösterir. LGT209 antikorunun ön enjeksiyonu, HDL-disi kolesterolde hPCSK9 aracili artistan %46 koruma saglamistir. LGT210 veya LGT211 antikorunun ön enjeksiyonu, HDL-disi kolesterolde hPCSK9 aracili artistan esdeger veya daha fazla koruma saglamistir. 13C10, yüksek afinite ile hPCSK9=a baglanan dogrulanmis bir murin anti-PCSK9 antikorudur ve bu analize yönelik bir pozitif kontrol olarak kullanilmistir. CS7BL/6 fareleri, tek basina araç, tek basina PCSK9, PCSK9 + 20 mg/kg LGT209, PCSK9 + 20 mg/kg LGT210, PCSK9 + mg/kg NVP-LGT211, PCSK9 + 20 mg/kg 13010 veya fare spesifik olmayan IgG karisimi (negatif kontrol) ile muamele edilmistir. Ayri degerler, bir yatay çubuk ile sinirlandirilan ortalama deger ile gösterilir. Plazma toplam kolesterol seviyesini ölçmek üzere Olympus klinik analizör (Olympus America Inc.: Olympus AU400) kullanilmistir. Plazma numuneleri, ddH20 içinde 1:13 seyreltilmistir ve 40 pl seyreltilmis plazma numuneleri, üreticinin talimatlarina göre toplam kolesterol seviyesine yönelik ölçülmüstür. HDL ve HDL disi plazmayi ölçmek üzere Iipoprotein kolesterol fraksiyonlari, Helena Laboratories'den Spife 3000 kullanilarak elde edilmistir. Numune hazirlanisi, jel hazirlanisi, numune uygulanmasi, jel elektroforezi, boyama, yikama ve kurutma dahil olmak üzere bütün prosedürler, operatörün kilavuzunda saglanan talimatlar takip edilerek gerçeklestirilmistir. Jel akabinde Slit 5 kullanilarak Quick Scan 2000 içinde taranmistir ve Iipoprotein kolesterol fraksiyonlarinin bagil yüzdesi, Helena densitometresi kullanilarak hesaplanmistir. Son olarak HDL ve HDL-disi mutlak degerler, her bir fraksiyonun yüzdesi ve toplam kolesterol seviyelerinin çarpilmasiyla hesaplanmistir. Sekil 14, "tipik" IgG1 (PK) profili ile karsilastirildiginda antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211ie (insan IgG1-sessiz) yönelik siçan farmakokinetik (PK) profillerini gösterir. Antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211'in yari ömrü, bir tipik IgG1 yari ömrü (yaklasik 6 gün) (örnegin, bir insan öznede belirlendigi üzere) ile karsilastirildiginda önemli derecede daha uzundur (7-13 gün). Antikorlarin rodent PCSK9 ile çapraz reaktif olmadigini gösterecek sekilde hedef aracili dagilmaya (TMD) yönelik bir kanit mevcut degildir. Her bir test antikoruna yönelik 3 erkek Lewis siçan, 10 mgs/kgrde enjekte edilmistir. Süre = 0, 1, 6, 24 saat, 2, 4, 8 ve 16 günde, 250 ul kari numunesi alinmistir ve berraklastirilan plazma seyreltilmistir ve geri kazanilan toplam insan antikorunu ölçmek üzere bir yakalama ELISA (keçi anti-insan IgG) içinde degerlendirilmistir. Bir standart egri ayni zamanda her bir test antikoruna yönelik olusturulmustur. Bir siçanda tipik bir insan lgG,Sinin beklenen geri kazanimina karsi geri kazanilan lgG'nin miktari grafikle gösterilmistir. DETAYLI AÇIKLAMA Bulus, istemlerde tanimlandigi gibidir. 1. Giris Mevcut bulusun antikorlari ve antijen baglama molekülleri spesifik olarak proprotein konvertaz subtilisin/keksin tip 9aiya ("PCSK9") baglanir. Mevcut anti-PCSK9 antikorlari ve antijen baglama molekülleri, PCSK9run C-terminusuna baglanir ve PCSK95un LDL- R'ye baglanmasini engellemeden düsük yogunluklu Iipoprotein reseptörünün (LDL-R) PCSK9 aracili degradasyonunu engellemeye yönelik beklenmedik özelliklige sahiptir. Ozellikle anti-PCSK9 antikorlari ve antijen baglama molekülleri, PCSK9*un kalintilari 680-692 içinde bir epitopa, örnegin PCSK9yun C-terminal ucuna yerlestirilen Bulusun antikorlari ve antijen baglama moleküllerinin sadece dolasan PCSK9tun yani sira bir hücre üzerine bagliyken PCSK9? baglanmasi nedeniyle bunlar örnegin en az 7 gün veya daha uzun olmak üzere bir hastada karsilastirmali olarak daha uzun in vivo yari ömrüne sahiptir ve bazi düzenlemelerde uygulamadan sonra en az 2 hafta boyunca lipid düsürme etkileri saglar. Bulusun anti-PCSK9 antikorlari ve antijen baglama molekülleri, PCSK9tun antagonistleridir, diger bir ifadeyle bunlar LDL-R'nin PCSK9 aracili degradasyonunu önler, azaltir ve/veya inhibe eder, böylece düsük yogunluklu Iipoprotein kolesterolün (LDL-C) artan alimini kolaylastirir. Anti-PCSK9 antikorlari ve antijen baglama molekülleri, örnegin, dislipidemi, hiperkolesterolemi, trigliseridemi veya diger PCSK9 aracili hastalik durumlarindan muzdarip olan hastalarin tedavi edilmesinde kullanilir. 2. Gelistirilmis Genel Anti-PCSK9 Antikorlari Anti-PCSK9 antikor fragmanlari, bunlarla sinirli olmamak üzere rekombinant ifade, kimyasal sentez ve antikor tetramerlerinin enzimatik sindirimini içeren teknikte bilinen herhangi bir araç ile üretilebilir ancak tam uzunluktaki monoklonal antikor, örnegin hibridom veya rekombinant üretim ile elde edilebilir. Rekombinant ifade, teknikte bilinen herhangi bir uygun konak hücrelerden, örnegin memeli konak hücreleri, bakteriyel konak hücreler, maya konak hücreleri, böcek konak hücrelerinden, vb. olabilir. Mevcut oldugunda anti-PCSK9 antikorlarinin sabit bölgeleri, uygun oldugu sürece herhangi bir türde veya alt türde olabilir ve mevcut yöntemler tarafindan muamele edilecek öznenin türlerinden seçilebilir (örnegin, insan, insan olmayan primat veya diger memeliler, örnegin tarim memelisi (örnegin, at, koyun, bovin, domuz, devegiller), evcil memeli (örnegin, köpek, kedi) veya kemirgen (örnegin, siçan, fare, hamster, tavsan). Bazi düzenlemelerde anti-PCSK9 antikorlari hümanize edilir veya HumaneeredTM olur. Bazi düzenlemelerde sabit bölge izotopu, IgG, örnegin IgG1'dir. Bazi düzenlemelerde insan lgG1 sabit bölgesi, bir hücre veya tümleyicinin C1 bileseni üzerinde Fc reseptörü (FcR) gibi bir efektör Iigana, örnegin Fc gama R1'e yönelik düsük baglama afinitesine sahip olmak üzere mutasyona ugrar. Bakiniz, örnegin, U.S. Patent No. 5,624,821. Bu tür mutasyonlari içeren antikorlar, düsük veya sifir antikora bagli selüler sitotoksisite (ADCC) veya tamamlayiciya bagli sitotoksisiteye (CDC) aracilik eder. Bazi düzenlemelerde lgG1 sabit bölgesinin amino asit kalintilari L234 ve L235, Ala234 ve Ala235'e sübstitüe edilir. Agir zincir sabit bölgesinde kalintilarin numaralandirilmasi, EU indeksine (bakiniz, Kabat, et al., (1983) "Sequences of Proteins of Immunological Interest," U.S. Dept. Health and Human Services) göredir. Ayrica bakiniz, örnegin, Woodle, et al, Transplantation (1999) 68(5):608-616; Xu, et al., Cell lmmunol (2000) 200(1):16-26; and Hezareh, et al., J Virol 75(24):12161-8. Bulusun anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri ayni zamanda bir devegil omurgasina sahip olan tek domen antijen baglama birimlerini içerir. Devegil ailesindeki hayvanlar, develer, Iamalar ve alpakalari içerir. Devegiller, hafif zincirlerden yoksun olan fonksiyonel antikorlari üretir. Agir zincir degisken (VH) domen kendi kendine katlanir ve bagimsiz olarak bir antijen baglama birimi olarak islev görür. Bunun baglama yüzeyi, klasik antijen baglama moleküleri (Fab) veya tek zincir degisken fragmanlardaki (scFV'Ier) alti CDR ile karsilastirildiginda sadece üç CDR içerir. Devegil antikorlari, geleneksel antikorlarinki ile karsilastirildiginda baglama afinitelerini elde edebilir. Burada örneklendirilen anti-PCSK9 antikorlarinin baglama spesifiklikleri olan devegil omurgasi bazli anti-PCSK9 molekülleri, teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak üretilebilir, örnegin Dumoulin et al., Nature Struct. Biol. 11:500-515, 2002; Ghahroudi et al., FEBS Letters 414z521-526, 1997; ve Bond et al., J Mol Biol. 332:643-55, 2003. Bulusun gelistirilmis anti-PCSK9 antikorlari, bir referans antikorunun spesifikligini ve afinitesini muhafaza ederken insan germ hatti V-bölgesi dizileri ile büyük oranda amino asit dizisi özdesligine sahip olan V-bölgesi dizileri ile gelistirilen insan antikorlaridir. Bakiniz, U.S. Patent Yayin No. 2005/0255552 ve U.S. Patent Yayin No. 2006/0134098. Gelisim prosesi, bir referans antikorunun degisken bölgesinden antijen baglama spesifikligini belirlemek üzere gerekli olan minimal dizi bilgisini tanimlar ve bu bilgiyi insan antikor V-bölgelerinin bir epitopa odakli kütüphanesini olusturmak üzere insan kismi V- bölgesi gen dizisinin bir kütüphanesine iletir. Bir mikrobiyal bazli sekresyon sistemi, antikor Fabfragmanlari olarak kütüphanenin elemanlarini ifade etmek üzere kullanilabilir ve kütüphane, örnegin bir koloni kaldirma ile baglama analizi kullanilarak antijen baglama Fabrlerine yönelik taranir. Bakiniz, örnegin, U.S. Patent Yayin No. 2007/0020685. Pozitif klonlar ayrica en yüksek afinitesi olanlari tanimlamak üzere karakterize edilebilir. Ortaya çikan gelistirilmis insan Fab'leri, parent referans anti-PCSK9 antikorunun baglama spesifikligini muhafaza eder, tipik olarak parent antikor ile karsilastirildiginda antijene yönelik esdeger veya daha yüksek afiniteye sahiptir ve insan germ hatti antikor V-bölgeleri ile karsilastirildiginda yüksek bir dizi özdesligi derecesi olan V-bölgelerine sahiptir. Epitopa odakli kütüphaneyi olusturmak üzere gerekli olan minimum baglama spesifikligi belirleyicisi (BSD) tipik olarak agir zincir CDR3 ("CDRH3") içinde bir dizi ve CDRB'ün ("CDRL3") hafif zinciri içinde bir dizi ile temsil edilir. BSD, bir CDRS'ün bir kismini veya tam uzunlugunu içerebilir. BSD, bitisik veya bitisik olmayan amino asit kalintilarindan olusabilir. Bazi durumlarda epitopa odakli kütüphane, BSD'yi içeren referans antikorundan benzersiz CDR3-FR4 bölgesine bagli olan insan V-segmenti dizilerinden ve insan germ hatti J-segmenti dizilerinden (bakiniz, U.S. Patent Yayin No. 2005/0255552) olusur. Alternatif olarak insan V-segmenti kütüphaneleri, referans antikoru V-segmeninin sadece parçasinin baslangiç olarak insan dizilerinin bir kütüphanesi ile degistirildigi sirali kaset degisimi ile olusturulabilir. Kalinti referans antikoru amino asit dizileri baglaminda baglamayi destekleyen tanimlanan insan "kasetleri" akabinde tamamen insan V-segmentlerini olusturmak üzere ikinci bir kütüphane taramasinda yeniden kombine edilir (bakiniz, U.S. Patent Yayin No. 2006101134098). Her bir durumda referans antikorundan spesifiklik belirleyicilerini içeren çiftli agir ve hafif zincir CDR3 segmentleri, CDR3-FR4 segmentleri veya J-segmentleri, baglama spesifikligini sinirlandirmak üzere kullanilir böylece kütüphaneden elde edilen antijen baglayicilar, referans antikorunun epitop spesifikligini muhafaza eder. Ilave olgunlasma degisiklikleri, optimal baglama kinetikleri olan antikorlari tanimlamak amaciyla kütüphane olusumu sirasinda her bir zincirin CDR3 bölgelerine dahil edilebilir. Ortaya çikan gelistirilmis insan antikorlari, insan germ hatti kütüphanelerinden türetilen V- segmenti dizilerine sahiptir, CDRS bölgelerinden kisa BSD dizisini muhafaza eder ve insan germ hatti çatisi 4 (FR4) bölgelerine sahiptir. Buna göre bazi düzenlemelerde anti-PCSKQ antikorlari, kaynak veya referans monoklonal antikorundan türetilen agir ve hafif zincirlerin CDRS'ü içinde bir minimum baglama dizisi belirleyicisini (BSD) içerir. Agir zincir ve hafif zincir degisken bölgelerin kalan dizileri (CDR ve FR), örnegin V-segmenti ve J-segmenti, karsilik gelen insan germ hatti ve afinitesi olgunlasmis amino asit dizilerindendir. V-segmentleri, bir insan V- segmenti kütüphanesinden seçilebilir. Ayrica dizi düzenlemesi, afinite olgunlasmasi ile gerçeklestirilebilir. Diger bir düzenlemede anti-PCSK9 antikorlarinin agir ve hafif zincirleri, karsilik gelen insan germ hatti dizisinden (FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3), örnegin bir insan V-segmenti kütüphanesinden seçilen bir insan V-segmentini ve kaynak monoklonal antikorudan bir CDR3-FR4 dizisi segmentini içerir. CDR3-FR4 dizisi segmenti ayrica dizi segmentlerinin karsilik gelen insan germ hatti dizileri ile degistirilmesi ve/veya afinite olgunlasmasi ile düzenlenebilir. Ornegin kaynak monoklonal antikorun CDR3iünden BSD muhafaza edilirken FR4 ve/veya BSD'yi çevreleyen CDR3 dizisi, karsilik gelen insan germ hatti dizisi ile degistirilebilir. Bazi düzenlemelerde agir zincir V-segmentine yönelik karsilik gelen insan germ hatti dizisi, Vh1-02rdir. Bazi düzenlemelerde agir zincir J-segmentine yönelik karsilik gelen insan germ hatti dizisi, JH4'tür. Bazi düzenlemelerde agir zincir .J-segmenti, insan germ hatti JH4 kismi dizisi WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:50) içerir. Insan germ hatti `JH4iten tam uzunlukta J-segmenti, YFDYWGQGTLVTVSSidir (SEQ ID NO:51). Degisken bölge genleri, immünoglobulin degisken bölge genlerine yönelik standart terimlendirmeye göre refere edilir. Mevcut immünoglobulin gen bilgisi, dünya çapinda ag araciligiyla, örnegin ImMunoGeneTics (IMGT), V-base ve PubMed veri tabanlari üzerinden elde edilebilir. Ayrica bakiniz, Lefranc, Exp Clin lmmunogenet. 2001;18(2):100-16; Lefranc, Exp Clin lmmunogenet. 2001;18(3):161-74; Exp Clin lmmunogenet. 2001;18(4):242-54; ve Giudicelli, et al., Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1;33(Database issue):D256-61. Bazi düzenlemelerde hafif zincir V-segmentine yönelik karsilik gelen insan germ hatti dizisi, VK3 Lö'dir. Bazi düzenlemelerde hafif zincir J-segmentine yönelik karsilik gelen insan germ hatti dizisi, Jk2idir. Bazi düzenlemelerde hafif zincir J-segmenti, insan germ hatti Jk2 kismi dizisi FGQGTKLElK (SEQ lD NO:52) içerir. Insan germ hatti Jk2'den tam uzunlukta J-segmenti, YTFGQGTKLEIK'dir (SEQ ID NO:53). Bazi durumlarda agir zincir V-segmenti, amino asit dizisi QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFS(D/T)MYMSWVRQAPGQGLEWMGRID PAN(A/E/G)HTNY(A/D)(P/Q)KFQ(A/G)RVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCA R (SEO ID NO:28) ile en az %85, %89, %90, %93, %95, %96, %97, %98, %99 veya %100 dizi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda agir zincir V-segmenti, amino asit dizisi QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTMYMSWVRQAPGQGLEWMGRlDPA NEHTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCAR (SEQ ID NO:27). ile en az 85%, 89%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% dizi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda hafif zincir V-segmenti, amino asit dizisi (E/Q)lV(L/M)TQSPATLSVSPGERATLSC(R/S)AS(Q/S)SVSYMHWYQQKPGQAPRLLI Y(G/L)(T/V)F(N/R)(L/R)A(S/T)GlPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:31) ile en az 85%, 89%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% dizi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda hafif zincir V-segmenti, amino asit dizisi QIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO:29). ile en az 85%, 89%, 90%. 93%, 95%, 98%, 97%, 98%, 99% veya 100% dizi Özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda hafif zincir V-segmenti, amino asit dizisi EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATGI PDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC (SEO ID NO:30). ile en az 85%, 89%, 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% dizi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda: i) agir zincir CDR3'ü, amino asit dizisi SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (SEQ ID NO:14); içerir ve ii) hafif zincir CDR3 degisken bölge, amino asit dizisi LQWSSDPPT (SEO ID NO:26). içerir. Bazi düzenlemelerde antikor veya antijen baglama fragmani, istemlerde açiklandigi gibidir ve: i) agir zincir CDR3, SEQ ID NO:12 ve SEO ID NO:13!ten olusan gruptan seçilen amino asit dizisini içerir; ve ii) hafif zincir CDR3, SEQ ID NO:26'nin amino asit dizisini içerir. Bazi durumlarda tarifnamenin antikorlari, bir amino asit dizisini (DIT)MYMS (SEO ID No:8) içeren bir CDR1; bir amino asit dizisi RlDPAN(A/E/G)HTNY(A/D)(P/Q)KFQ(A/G) (SEQ ID NO:11); içeren bir CDR2 ve SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (SEQ ID NO:14) amino asit dizisini içeren bir CDR3 içeren bir agir zincir degisken bölgeyi içerir. Bazi durumlarda tarifnamenin antikorlari, bir amino asit dizisini (R/S)AS(Q/S)SVSYMH (SEQ ID NO:22) içeren bir CDR1; bir amino asit dizisini (G/L)(T/V)F(N/R)(L/R)A(8/T) (SEQ ID NO:25) içeren bir CDR2 ve LQWSSDPPT (SEO ID NO:26) amino asit dizisini içeren bir CDR3 içeren bir hafif zincir degisken bölgeyi içerir. Bazi düzenlemelerde agir zincir degisken bölge, SEQ ID NO:32*nin amino asit dizisini içeren bir FR1; SEQ ID NO:33'ün amino asit dizisini içeren bir FR2; SEQ ID NO:34'ün amino asit dizisini içeren bir FR3; ve SEO ID NO:35rin amino asit dizisini içeren bir FR4 içerir. Tanimlanan amino asit dizileri, bir veya daha fazla sübstitüe edilmis amino aside (örnegin, afinite olgunlasmasindan) veya bir veya iki korunmali olarak sübstitüe edilmis amino aside sahip olabilir. Bazi düzenlemelerde hafif zincir degisken bölge, SEQ ID NO:36'nin amino asit dizisini içeren bir FR1; SEO ID NO:37'nin amino asit dizisini içeren bir FR2; SEQ ID NO:38'in amino asit dizisini içeren bir FR3; ve SEO ID NO:39'un amino asit dizisini içeren bir FR4 içerir. Tanimlanan amino asit dizileri, bir veya daha fazla sübstitüe edilmis amino aside (örnegin, afinite olgunlasmasindan) veya bir veya iki korunmali olarak sübstitüe edilmis amino aside sahip olabilir. Bunlarin tam uzunlugu üzerinde mevcut bulusun anti-PCSK9 antikorlarinin degisken bölgeleri genel olarak karsilik gelen insan germ hatti degisken bölge amino asit dizisi ile en az yaklasik %85, örnegin en az yaklasik 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% olan toplam degisken bölge (örnegin, FR1-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4) amino asit dizisi özdesligine sahip olacaktir. Ornegin anti- PCSK9 antikorlarinin agir zinciri, insan germ hatti degisken bölgesi Vh1-02 ile en az yaklasik 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olabilir. Anti-PCSK9 antikorlarinin hafif zinciri, insan germ hatti degisken bölgesi VK3 L6 ile en az yaklasik 85%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olabilir. Bazi düzenlemelerde sadece çati bölgelerindeki amino asitler eklenir, silinir veya sübstitüe edilir. Bazi düzenlemelerde dizi özdesligi karsilastirmasi, CD3*ü hariç birakir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSKQ antikorlari istemlerde anlatildigi gibidir ve SEO ID NO:407m bir agir zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir agir zincir degisken bölgeyi içerir ve SEO ID NO:41'in (diger bir ifadeyle, konsensus dizileri) bir hafif zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir hafif zincir degisken bölgeyi içerir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari istemlerde anlatildigi gibidir ve SEO ID NO:1,in bir agir zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir agir zincir degisken bölgeyi içerir ve SEO ID NO:15'in (diger bir ifadeyle, fare LFU720) bir hafif zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir hafif zincir degisken bölgeyi içerir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari istemlerde anlatildigi gibidir ve SEO ID NO:2,nin bir agir zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir agir zincir degisken bölgeyi içerir ve SEO ID NO:16Snin (diger bir ifadeyle, LGT- 209) bir hafif zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir hafif zincir degisken bölgeyi içerir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari istemlerde anlatildigi gibidir ve SEO ID NO:2!nin bir agir zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir agir zincir degisken bölgeyi içerir ve SEQ ID NO:18rin (diger bir ifadeyle, LGT- 210) bir hafif zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir hafif zincir degisken bölgeyi içerir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari istemlerde anlatildigi gibidir ve SEO ID NO:4,ün bir agir zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir agir zincir degisken bölgeyi içerir ve SEO ID NO:16"nin (diger bir ifadeyle, LGT- 211) bir hafif zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir hafif zincir degisken bölgeyi içerir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari istemlerde anlatildigi gibidir ve SEO ID NO:3=ün bir agir zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir agir zincir polipeptidi içerir ve SEO ID NO:17*nin (diger bir ifadeyle, LGT-209) bir hafif zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir hafif zincir polipeptidi içerir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari istemlerde anlatildigi gibidir ve SEO ID NO:3"ün bir agir zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir agir zincir polipeptidi içerir ve SEO lD NO:19'un (diger bir ifadeyle, LGT-210) bir hafif zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir hafif zincir polipeptidi içerir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari istemlerde anlatildigi gibidir ve SEO ID NO:5,in bir agir zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir agir zincir polipeptidi içerir ve SEO ID NO:17'nin (diger bir ifadeyle, LGT-211) bir hafif zincir degisken bölgesi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% amino asit dizisi özdesligine sahip olan bir hafif zincir polipeptidi içerir. Uzunluk olarak 20 amino asitten az olan tanimlanan amino asit dizilerine yönelik istenen spesifik baglama ve/veya antagonist aktivitesi muhafaza edilirken bir veya iki korunumlu amino asit kalintisi sübstitüsyonu tolere edilebilir. Mevcut bulusun anti-PCSK9 antikorlari genel olarak yaklasik 10'8 M veya 10'9 Miden az, örnegin yaklasik 10'10 M veya 10'11 M'den az, bazi düzenlemelerde yaklasik 10'12 M veya '13 Mfden az bir denge ayrisma sabiti (KD) ile PCSK9iu baglayacaktir. Anti-PCSK9 antikorlari istege bagli olarak multimerize olabilir ve bu bulusun yöntemlerine göre kullanilabilir. Anti-PCSK9 antikorlari, tam uzunlukta bir tetramerik antikor (diger bir ifadeyle, iki hafif zincire ve iki agir zincire sahip olan), bir tek zincirli antikordur (örnegin, bir scFv) veya örnegin agir ve hafif zincir degisken bölgeleri (örnegin, Fab' veya diger benzer fragmanlar) içeren, bir veya daha fazla antijen baglama alanini olusturan ve PCSK9 baglama spesifikligi sunan antikor fragmanlarini içeren bir moleküldür. Tarifname ayrica burada açiklanan antikorlari kodlayan polinükleotidleri, örnegin burada açiklandigi üzere tamamlayicilik belirleme bölgelerini içeren agir veya hafif zincir degisken bölgeleri veya segmentleri kodlayan polinükleotidleri saglar. Bazi durumlarda agir zinciri kodlayan polinükleotid, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43 ve SEO ID NO:54*ten olusan gruptan seçilen bir polinükleotid ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% nükleik asit dizisi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda hafif zinciri kodlayan polinükleotid, SEQ ID NO:44, SEQ lD NO:45 ve SEO ID NO:55'ten olusan gruptan seçilen bir polinükleotid ile en az 85%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% nükleik asit dizisi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda agir zinciri kodlayan polinükleotid, SEQ ID NO:42'nin bir poliniLikIeotidi ile en az 85%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% nükleik asit dizisi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda hafif zinciri kodlayan polin'ukleotid, SEQ ID NO:45*in (diger bir ifadeyle, LGT-209) bir polinükleotidi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% nükleik asit dizisi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda agir zinciri kodlayan polin'ukleotid, SEQ ID NO:42'den olusan gruptan seçilen bir polinükleotid ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% nükleik asit dizisi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda hafif zinciri kodlayan polinükleotid, SEQ ID NO:44rten (diger bir ifadeyle, LGT-210) olusan gruptan seçilen bir polin'ukleotid ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% nükleik asit dizisi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda agir zinciri kodlayan polinükleotid, SEQ ID NO:43'ten olusan gruptan seçilen bir polinükleotid ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% nükleik asit dizisi 'özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda hafif zinciri kodlayan polin'ükleotid, SEQ ID NO:451ten (diger bir ifadeyle, LGT-211) olusan gruptan seçilen bir polinükleotid ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% nükleik asit dizisi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda agir zinciri kodlayan polinükleotid, SEO ID NO:54tün bir polinükleotidi ile en az 85%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% nükleik asit dizisi özdesligine sahiptir. Bazi durumlarda hafif zinciri kodlayan polin'ukleotid, SEO ID NO:55'in (diger bir ifadeyle, fare LFU720) bir polinükleotidi ile en az 85%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% veya 100% nükleik asit dizisi özdesligine sahiptir. 3. Anti-PCSK9 Antikorlarinin Tanimlanmasina Yönelik Analizler Antagonist antikorlar, anti-PCSKQ antikorlari olusturularak ve akabinde PCSK9 aracili olaylari, örnegin LDLR'ye baglanma, LDLRrnin degradasyonunu baslatmayi azaltma veya inhibe etme yetenegine yönelik her bir antikor test edilerek tanimlanabilir. Analizler, in vitro veya in vivo olarak gerçeklestirilebilir. Tercih edilen antikorlar, PCSKQ'a baglanir, PCSK9'un LDLR'ye baglanmasini önlemez ve LDLRinin PCSK9 aracili degradasyonunu azaltir veya inhibe eder. Antikorlarin veya antijen baglama moleküllerinin PCSK9? baglanmasi, sinirlama olmaksizin ELISA, Biacore ve Western Blot dahil olmak üzere teknikte bilinen herhangi bir yöntem kullanilarak belirlenebilir. LDLRrnin PCSK9 aracili degradasyonu ayni zamanda teknikte bilinen herhangi bir yöntem kullanilarak ölçülebilir. Bir düzenlemede anti-PCSK9 antikoru veya antijen baglama molekülünün LDLR degradasyonunu inhibe etme yetenegi, bir infüzyon fare modeli kullanilarak belirlenir. Anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri, bir fareye intravenöz olarak (örnegin, :Bug/saat) infüze edilir ve karaciger membran preparatlarinda LDLR'nin seviyeleri, bir kontrol antikorunun (örnegin, ilgili olmayan bir antijene baglanan) intravenöz infüzyonlarini alan bir fareden karaciger membrani preparatlarindaki LDLR seviyeleri ile karsilastirildiginda belirlenir. Antagonist anti- PCSK9 antikorlarini alan fareler, kontrol antikorunu alan fareler ile karsilastirildiginda tespit edilebilir bir sekilde daha yüksek, örnegin en az %10, %20, %50, %80, %100 daha yüksek LDLR seviyelerine sahip olacaktir. Anti-PCSK9 antagonist antikorlar ayni zamanda LCL-C, HDL-disi-C ve/veya toplam kolesterolün plazma seviyelerinin azaltilmasinda bunlarin terapötik etkinligine yönelik test edilebilir. Anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri, bir memeliye (örnegin, fare, siçan, insan olmayan primat, insan) intravenöz olarak (örnegin, 3 tig/saat) infüze edilir ve LCL-C, HDL-disi-C ve/veya toplam kolesterolün plazma seviyeleri, tedaviden önce bu memeliden veya bir kontrol antikorunun (örnegin, ilgili olmayan bir antijene baglanan) intravenöz infüzyonlarini alan bir memeliden LCL-C, HDL-disi-C ve/veya toplam kolesterolün plazma seviyeleri ile karsilastirildiginda belirlenir. Antagonist anti-PCSK9 antikorlarini alan memeli, tedaviden önce memeli veya kontrol antikorunu alan memeli ile karsilastirildiginda tespit edilebilir bir sekilde daha düsük, örnegin en az %10, %20, %50, %80, %100 daha düsük LCL-C, HDL-disi-C ve/veya toplam kolesterolün plazma seviyelerine sahip olacaktir. 4. Anti-PCSK9 Antikorlarini Içeren Bilesimler Bulus, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici ile birlikte formüle edilen mevcut anti- PCSK9 antikorlarini veya antijen baglama moleküllerini içeren farmasötik bilesimler saglar. Bilesimler ek olarak belirlenen bir bozuklugun tedavi edilmesine veya önlenmesine yönelik uygun olan diger terapötik ajanlari içerebilir. Farmasötik olarak tasiyicilar, bilesimi gelistirir veya stabilize eder veya bilesimin hazirlanisini kolaylastirir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, solventleri, dispersiyon ortamlarini, kaplamalari, antibakteriyel ve antifungal ajanlari, izotonik ve absorpsiyon geciktirme ajanlarini ve fizyolojik olarak uyumlu olan benzerlerini içerir. Mevcut bulusun bir farmasötik bilesimi, teknikte bilinen çesitli yöntemler ile uygulanabilir. Uygulama yolu ve/veya modu, istenen sonuçlara bagli olarak degisiklik gösterir. Uygulamanin intravenöz, intramüsküler, intraperitoneal veya subkütanöz olmasi veya hedef alana yakin olarak uygulanmasi tercih edilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilarin intravenöz, intramüsküler, subkütanöz, parenteral, intranazal, inhalasyonel, spinal veya epidermal uygulamaya (örnegin, enjeksiyon veya infüzyon ile) yönelik uygun olmasi gerekir. Uygulama yoluna bagli olarak aktif bilesik, diger bir ifadeyle antikor, bispesifik ve multispesifik molekül, bilesigi asitlerin etkisinden ve bilesigi etkisiz hale getirebilecek diger dogal kosullardan korumak üzere bir materyal ile kaplanabilir. Tek basina veya diger uygun bilesenler ile kombinasyon halinde antikorlar, inhalasyon araciligiyla uygulanmak üzere aerosol formülasyonlari (diger bir ifadeyle, bunlar "nebülize edilebilir") olarak yapilabilir. Aerosol formülasyonlari, dikloridflorometan, propan, nitrojen ve benzeri gibi basinçli kabul edilebilir iticilere yerlestirilebilir. Bazi düzenlemelerde bilesim, steril ve akiskandir. Uygun akiskanlik, örnegin lesitin gibi bir kaplamanin kullanilmasiyla, dispersiyon durumunda gerekli partikül boyutunun muhafaza edilmesiyle ve sürfaktanlarin kullanilmasiyla muhafaza edilebilir. Birçok durumda bilesim içinde izotonik ajanlarin, örnegin sekerler, polialkoller, örnegin manitol veya sorbitol ve sodyum kloridin bulunmasi tercih edilir. Enjekte edilebilir bilesimlerin uzun süreli absorpsiyonu, absorpsiyonu geciktiren bir ajanin, örnegin alüminyum monostearat veya jelatinin bilesime eklenmesiyle gerçeklestirilebilir. Bulusun farmasötik bilesimleri, teknikte iyi bilinen ve rutin olarak uygulanan yöntemlere göre hazirlanabilir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, bilesimi uygulamak üzere kullanilan belirli yöntemin yani sira kismi olarak uygulanan belirli bilesim ile belirlenir. Buna göre mevcut bulusun farmasötik bilesimlerinin çok çesitli uygun formülasyonlari mevcuttur. Antikorlari formüle etmeye ve uygun dozlama ve programlamayi belirlemeye yönelik uygun yöntemler, örnegin Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21St Ed., University of the Sciences in Philadelphia, Eds., Lippincott Williams & Wilkins (2005) içinde; ve Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London: Pharmaceutical Press. içinde ve Martindale, Martindale: The Extra Pharmacopoeia, 31st Edition., 1996, Amer Pharmaceutical Assn, and Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978 içinde bulunabilir. Farmasötik bilesimler tercihen GMP kosullari altinda üretilir. Tipik olarak anti-PCSK9 antikorunun terapötik olarak etkili bir dozu veya yeterli dozu, bulusun farmasötik bilesimlerinde kullanilir. Anti-PCSK9 antikorlari, teknikte uzman kisiler tarafindan bilinen geleneksel yöntemler ile farmasötik olarak kabul edilebilir dozaj formlarinda formüle edilir. Dozaj rejimleri, istenen yaniti (örnegin, bir terapötik yanit) saglamak üzere ayarlanir. Terapötik olarak veya profilaktik olarak etkili bir dozun belirlenmesinde düsük bir doz uygulanabilir ve akabinde minimal veya sifir istenmeyen yan etki ile istenen bir yanit elde edilene kadar asamali olarak arttirilir. Ornegin tek bir kapsül uygulanabilir, bölünmüs birkaç doz zamanla uygulanabilir veya doz, terapötik durumun gerekliligi ile gösterildigi üzere orantili olarak azaltilabilir veya arttirilabilir. Parenteral bilesimlerin dozajin uygulanmasi ve esitligini kolaylastirmaya yönelik dozaj birimi fomunda formüle edilmesi özellikle avantajlidir. Burada kullanildigi üzere dozaj birimi formu, tedavi edilecek öznelere yönelik bütün dozajlar olarak uygun olan fiziksel olarak ayri birimlere refere eder; her bir birim, gerekli olan farmasötik tasiyici ile iliskili olarak istenen terapötik etkiyi üretmek üzere hesaplanan aktif bilesigin önceden belirlenen bir miktarini içerir. Mevcut bulusun farmasötik bilesimlerinde aktif içerik maddelerinin asil dozaj seviyeleri, hasta için toksik olmaksizin, belirli bir hasta, bilesim ve uygulama moduna yönelik istenen terapötik yaniti elde etmek üzere etkili olan bir aktif içerik maddesinin miktarini elde etmek amaciyla degistirilebilir. Seçilen dozaj seviyesi, kullanilan mevcut bulusun belirli bilesimlerinin veya esterinin, tuzunun veya amidinin aktivitesi, kullanilan belirli bilesigin uygulama yolu, uygulama zamani, atilim hizi, tedavi süresi, kullanilan belirli bilesikler ile kombinasyon halinde kullanilan diger ilaçlar, bilesikler ve/veya materyaller, tedavi edilen hastanin yasi, cinsiyeti, kilosu, durumu, genel saglik ve önceki tibbi öyküsü ve benzer faktörler dahil olmak üzere çesitli farmakokinetik faktörlere baglidir. Bazi düzenlemelerde farmakolojik bilesimler, anti-PCSK9 antikoru veya antijen baglama molekülü ve ikinci birfarmakolojik ajanin bir karisimini içerir. Ornegin bilesimler, bulusun bir anti-PCSK9 antikorunu veya antijen baglama molekülünü ve LDL-C, HDL-disi-C ve toplam kolesterol dahil olmak üzere kolesterolü düsürmeye ve/veya HDL-C*yi yükseltmeye yönelik faydali oldugu bilinen bir ajani içerebilir. Mevcut anti-PCSK9 antagonist antikoru veya antijen baglama molekülü ile karisimlara dahil edilmeye yönelik örnek niteligindeki ikinci ajanlar, sinirlama olmaksizin bir HMG- CoA redüktaz inhibitörü (diger bir ifadeyle, bir statin), fibratlar (örnegin, klofibrat, gemfibrozil, fenofibrat, siprofibrat, bezafibrat), niasin ve bunun analoglari, kolesterol absorpsiyon inhibitörleri, safra asidi katkilari (örnegin, kolestiramin, kolestipol, kolesvelam), bir ileal safra asidi tasima (IBAT) Inhibitörü, bir tiroid hormonu mimetigi (örnegin, bilesik KBZ115), bir mikrozomal trigliserid transfer proteini (MTP) inhibitörü, bir çift peroksizom çogaltici aktiveli reseptör (PPAR) alfa ve gama agonist, bir asil CoAzdiasilgliserol asiltransferaz (DGAT) Inhibitörü, bir asil CoAzkolesterol asiltransferaz (ACAT) inhibitörü, bir Niemann Pick C1-benzeri 1 (NPC1-L1) inhibitörü (örnegin, ezetimib), ATP Baglama Kasedi (ABC) proteinleri G5 veya G8'in bir agonisti, bir kolesterol ester transfer proteini (CETP) inhibitörü, bir inhibitör nükleik asit hedefleyici PCSK9 ve bir inhibitör nükleik asit hedefleyici apoB1OO içerir. Lipid düsürücü ajanlar, teknikte bilinir ve örnegin, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th Ed., Brunton, Lazo and Parker, Eds., McGraw-Hill (2006) içinde; 2009 Physicians' Desk Reference (PDR), örnegin 63rd (2008) Eds., Thomson PDR içinde açiklanir. Mevcut bilesimlerde kullnilan ilave Iipid düsürücü ajanlar, örnegin Chang, et al., Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70; Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333- 47; Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50; Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89; Tenenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45: 1 27-53; Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):8241-8248; Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8; Oh, et al., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7; Birch, et al, J Med Chem (2009) 52(6):1558-68; ve Baxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) &308-320 içinde açiklanir ve/veya degerlendirilir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri, bir statin ile karisim olarak saglanir. Ornek niteligindeki statinler, sinirlama olmaksizin atorvastatin, serivastatin, fluvastatin, Iovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rosuvastatin ve simvastatini içerir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri, hiperkolesterolemi veya trigliseridemiyi indükleyen bir farmakolojik ajan ile karisim olarak saglanir. Ornegin ikinci farmakolojik ajan, bir proteaz inhibitörü, örnegin Sakuinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir, Atazanavir, Fosamprenavir, Tipranavir, Darunavir, abakavir-Iamivudin-zidovudin (Trizivir) olabilir. Bazi düzenlemelerde ikinci farmakolojik ajan, Takrolimustur. . Anti-PCSK9 Antikorlarinin Kullanilmasi Yöntemleri a. Anti-PCSK9 Antikorlari ile Tedaviye Tabi Olan Durumlar Bulusun anti-PCSKQ antagonist antikorlari ve antijen baglama molekülleri, PC8K9'un aktivitesi veya fazla aktivitesi aracili herhangi bir hastalik durumunun tedavi edilmesinde kullanilir. Örnegin çok sayida neden veya etiyoloji sebebiyle dislipidemi veya hiperkolesterolemiye sahip olan veya bunlari gelistirme riskinde olan kisiler, mevcut anti-PCSK9 antagonist antikorlarinin ve antijen baglama moleküllerinin uygulanmasindan faydalanabilir. Ornegin kisi, fonksiyonel bir LDL-Rinin mevcut oldugu ailesel veya genetik olarak aktarilan homozigot veya heterozigot hiperkolesterolemiye sahip olabilir. Ailesel veya genetik olarak kalitsal olan hiperkolesterolemi ile iliskilendirilen ve/veya bunun nedeni olan genetik mutasyonlar, örnegin Burnett and Hooper, Clin Biochem Rev (2008) 29(1):11-26 içinde kisaca açiklanir. Kisi ayni zamanda diger hastalik durumlarina sahip olabilir veya dislipidemi veya hiperkolesterolemi gelistirmeye katki saglayan veya gelistirme riskini arttiran davranislara sahip olabilir. Örnegin kisi obez olabilir veya diyabet veya metabolik sendromdan muzdarip olabilir. Kisi, sigara kullaniyor olabilir, hareketsiz bir yasam tarzina sahip olabilir veya kolesterol açisindan yüksek bir diyete sahip olabilir. Hedefleyici PCSK9, dislipidemi, hiperkolesterolemi ve postprandial trigliserideminin azaltilmasi, degistirilmesi, inhibisyonu veya önlenmesine yönelik faydalidir. Bakiniz, örnegin, Le May, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol (2009) 29(5):684-90; Seidah, Expert Opin Ther Targets (2009) 13(1):19-28; ve Poirier, et al., J Biol Chem (2009) PMID 19635789. Buna göre mevcut anti-PCSK9 antagonist antikorlarinin ve antijen baglama moleküllerin uygulanmasi, buna ihtiyaci olan bir kiside dislipidemi, hiperkolesterolemi ve postprandial trigliserideminin azaltilmasi, degistirilmesi, inhibe edilmesi ve önlenmesinde kullanilir. Mevcut anti-PCSKQ antagonist antikorlari ve antijen baglama molekülleri, buna ihtiyaci olan bir kiside düsük yogunluklu Iipoprotein kolesterolünün (LDL-C) azaltilmasinda veya düsürülmesinde kullanilir. Kisi, sürekli olarak yüksek LDL-C seviyelerine sahip olabilir. Bazi düzenlemelerde kisi, devamli olarak 80 mg/dL'nin üzerinde, örnegin 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 mg/dL'nin üzerinde veya daha yüksek LDL-C plazma seviyelerine sahip olabilir. Mevcut anti-PCSK9 antagonist antikorlari ve antijen baglama molekülleri ayni zamanda buna ihtiyaci olan bir kiside yüksek olmayan yogunluklu Iipoprotein kolesterolünün (HDL-disi-C) veya toplam kolesterolün azaltilmasinda veya düsürülmesinde kullanilir. Kisi, kolesterolü düsürmek üzere halihazirda diger bir farmakolojik ajani aliyor olabilir ve bu ajana karsi dirençli veya toleranssiz olabilir. Örnegin kisi halihazirda LDL-C, HDL- disi-C veya toplam kolesterolün kabul edilebilir seviyeleri düsürülmesinde bu kiside etkisiz oldugu kanitlanan bir statinin birterapötik rejimi altinda olabilir. Kisi ayni zamanda bir statinin uygulanmasina karsi toleranssiz olabilir. Mevcut anti-PCSK9 antagonist antikorlari ve antijen baglama moleküllerinin LDL-C veya HDL-disi-Cnin düsürülmesinde ve/veya HDL-Onin yükseltilmesinde faydali olan ikinci bir ajan ile kombine edilen uygulamasi, örnegin ikinci ajanin daha düsük dozlarinin uygulanmasina olanak saglayarak ikinci ajanin etkililigini ve toleransini gelistirecektir. Bazi düzenlemelerde kisi, örnegin LDLR'nin degradasyonunda anormal bir artisa neden olacak sekilde PCSK9 geninde bir kazanç fonksiyonu mutasyonuna sahiptir. Bazi düzenlemelerde kisi, dislipidemi veya hiperkolesterolemiyi indükleyen bir farmakolojik ajani alir, diger bir ifadeyle kisi, ilaç indüklü dislipidemi veya hiperkolesterolemiye sahiptir. Ornegin kisi, örnegin bir HIV enjeksiyonunun tedavisine yönelik proteaz inhibitörlerinin terapötik bir rejimini aliyor olabilir. Plazma trigliseritlerinin yüksek seviyelerine neden oldugu bilinen diger bir farmakolojik ajan, transplantasyon hastalarina uygulanan bir immünsüprese ilaç olan Takrolimustur. Siklosporinin LDL'yI önemli derecede yükselttigi gösterilmistir. Bakiniz, örnegin, Ballantyne, et al. (1996) 78(5):532-5. Ikinci jenerasyon antipsikotiklerin (örnegin, aripiprazol, klozapin, olanzapin, kuetiapin, risperidon ve ziprasidon) dislipidemi ile iliskili oldugu gösterilmistir. Bakiniz, örnegin, Henderson, J Clin Psychiatry (2008) 69(2):e04 ve Brooks, et al., Curr Psychiatry Rep (2009) 11(1):33-40. b. Anti-PCSK9 Antikorlarinin Uygulanmasi Bir doktor veya veteriner, farmasötik bilesimde kullanilan bulusun antikorlarinin dozlarini, istenen terapötik etkiyi elde etmek üzere gerekli olandan daha düsük seviyelerde baslatabilir ve istenen etki elde edilene kadar dozaji kademeli olarak arttirabilir. Genel olarak mevcut bulusun etkili dozlari, tedavi edilecek spesifik hastalik veya durum, uygulama araci, hedef alan, hastanin fizyolojik durumu, hastanin Insan veya hayvan olmasi, uygulanan diger tibbi ilaçlar ve tedavinin profilaktik veya terapötik olmasi dahil olmak üzere birçok farkli faktöre bagli olarak degisebilir. Tedavi dozlarinin güvenlik ve etkinligi optimize etmek üzere titre edilmesi gerekir. Bir antikor ile uygulamaya yönelik dozaj araliklari, konak vücut agirliginin yaklasik 0.0001 ila 100 mg/kg ve daha genel olarak 0.01 ila 5 mg/kg'si araligindadir. Ornegin dozajlar, 1 mglkg vücut agirligi veya 10 mg/kg vücut agirligi veya 1-10 mg/kg araliginda olabilir. Dozlama, günlük, haftalik, iki haftada bir, aylik veya gerekli oldugu veya istenildigi üzere daha fazla veya daha az siklikta olabilir. Ornek niteligindeki bir tedavi rejimi, haftada bir kez, iki haftada bir kez veya ayda bir kez veya 3 ila 6 ayda bir kez uygulamayi gerektirir. Bazi düzenlemelerde bulusun bir anti-PCSK9 antikorunu veya antijen baglama molekülünü kodlayan bir polinükleotid uygulanir. Ajanin bir nükleik asit oldugu düzenlemelerde tipik dozajlar, yaklasik 0.1 mg/kg vücut agirligi ve yaklasik 100 mg/kg vücut agirligi arasinda ve bu dahil olmak üzere, örnegin ,yaklasik 1 mg/kg vücut agirligi ila yaklasik 50 mg/kg vücut agirligi araliginda olabilir. Bazi düzenlemelerde yaklasik 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 veya 50 mglkg vücut agirligidir. Antikor, tek veya bölünmüs dozlar halinde uygulanabilir. Antikor genel olarak birçok olay üzerine uygulanabilir. Tek dozajlarin arasindaki araliklar, haftalik, iki haftada bir, aylik veya gerekli oldugu veya istenildigi üzere yillik olabilir. Araliklar ayni zamanda hastadaki anti-PCSK9 antikorunun kan seviyeleri ölçülerek gösterildigi üzere düzensiz olabilir. Bazi yöntemlerde dozaj, 1-1000 ug/ml bir plazma antikoru konsantrasyonunu ve bazi yöntemlerde 25-300 ug/ml elde etmek üzere ayarlanir. Alternatif olarak antikor, yavas salinimli bir formülasyon olarak uygulanabilir, bu durumda daha az siklikta uygulama gereklidir. Dozaj ve siklik, hastada antikorun yari ömrüne bagli olarak degisir. Genel olarak hümanize edilen antikorlar, kimerik antikorlar ve insan olmayan antikorlarinkinden daha uzun yari 'Ömür gösterir. Uygulamanin dozaji ve sikligi, tedavinin profilaktik veya terapötik olmasina bagli olarak degisebilir. Profilaktik uygulamalarda nispeten düsük bir dozaj, uzun bir zaman periyodu üzerinde nispeten seyrek araliklarda uygulanir. Bazi hastalar, yasamlarinin geri kalan kismi boyunca tedavi almaya devam eder. Terapötik uygulamalarda nispeten kisa araliklarda nispeten yüksek bir dozaj, hastaligin ilerleyisi azaltilana veya sonlandirilana kadar ve terapötik hasta, hastaligin semptomlarinin kismi olarak veya tam olarak iyilesmesini gösterene kadar bazi durumlarda gereklidir. Bundan sonra hastaya bir profilaktik rejim uygulanabilir. Bazi düzenlemelerde anti-PCSK9 antikoru veya antijen baglama ajani, hastadaki plazma LDL-C seviyeleri önceden belirlenen bir esik degerinin üzerine çiktiginda, örnegin en az yaklasik 80 mg/dL, örnegin, en az yaklasik 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 mg/dL veya daha yüksek oldugunda uygulanir. c. Ikinci Bir Ajan ile Birlikte Uygulama PCSK9 antikor antagonisti, LDL-C, HDL-disi-C ve toplam kolesterol dahil olmak üzere kolesterolün düsürülmesine ve/veya HDL-C'nin yükseltilmesine yönelik faydali oldugu bilinen ajanlar ile kombinasyon halinde kullanilabilir. Aktif ajanlar, anti-PCSK9 antagonist antikoru ile bir karisim içinde birlikte uygulanabilir veya her bir ajan ayri olarak uygulanabilir. Antikor ajani ve diger aktif ajan, es zamanli olarak uygulanabilir ancak bu gerekli degildir. Mevcut anti-PCSK9 antagonist antikoru veya antijen baglama molekülü ile birlikte uygulamada kullanima yönelik örnek niteligindeki ikinci ajanlar, sinirlama olmaksizin bir HMG-CoA redüktaz inhibitörü (diger bir ifadeyle, bir statin), fibratlar (örnegin, klofibrat, gemfibrozil, fenofibrat, siprofibrat, bezafibrat), niasin ve bunun analoglari, kolesterol absorpsiyon inhibitörleri, safra asidi katkilari (örnegin, kolestiramin, kolestipol, kolesvelam), bir ileal safra asidi tasima (IBAT) inhibitörü, bir tiroid hormonu mimetigi (örnegin, bilesik KBZ115), bir mikrozomal trigliserid transfer proteini (MTP) inhibitörü, bir çift peroksizom çogaltici aktiveli reseptör (PPAR) alfa ve gama agonist, bir asil CoA:diasilgliser0I asiltransferaz (DGAT) inhibitörü, bir asil CoAckolesterol asiltransferaz (ACAT) inhibitörü, bir Niemann Pick C1-benzeri 1 (NPC1-L1) inhibitörü (örnegin, ezetimib), ATP Baglama Kasedi (ABC) proteinleri G5 veya G8'in bir agonisti, bir kolesterol ester transfer proteini (CETP) inhibitörü, bir inhibitör nükleik asit hedefleyici PCSK9 ve bir inhibitör nükleik asit hedefleyici apoBi 00 içerir. Kullanilan ilave Iipid düsürücü ajanlar, örnegin Chang, et al., Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70; Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47; Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50; Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89; Tenenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45:127-53; Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-8248; Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8; Oh, et al., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7; Birch, et al. J Med Chem (2009) 52(6):1558-68; ve Baxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) &308-320 içinde açiklanir ve/veya degerlendirilir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri, bir statin ile birlikte uygulanir. Ornek niteligindeki statinler, sinirlama olmaksizin atorvastatin, serivastatin, fluvastatin, Iovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rosuvastatin ve simvastatini içerir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri, hiperkolesterolemi veya trigliseridemiyi indükleyen bir farmakolojik ajan ile birlikte uygulanir. Ornegin ikinci farmakolojik ajan, bir proteaz inhibitörü, örnegin Sakuinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir, Atazanavir, Fosamprenavir, Tipranavir, Darunavir, abakavir-Iamivudin-zidovudin (Trizivir) olabilir. Bazi düzenlemelerde ikinci farmakolojik ajan, Takrolimustur. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri, spesifik olarak PCSK9 veya apoB1007ü hedefleyen bir inhibitör nükleik asit (örnegin, bir siRNA, bir miRNA, bir antisens dizi, bir ribozim) ile birlikte uygulanir. 6. Kitler Mevcut bulusun farmasötik bilesimleri, bir kit içinde saglanabilir. Belirli düzenlemelerde mevcut bulusun bir kiti, burada açiklandigi üzere bulusun bir anti-PCSKQ antagonist antikorunu veya antijen baglama molekülünü içerir. Anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri, esit veya degisen dozajlarda saglanabilir. Bazi düzenlemelerde kitler, burada açiklandigi üzere bir veya daha fazla ikinci farmakolojik ajani içerir. Ikinci farmakolojik ajan, ayni formülasyonda veya anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama moleküllerinden ayri formülasyonlarda saglanabilir. Birinci ve ikinci ajanlarin dozajlari bagimsiz olarak esit veya degisken olabilir. Bazi düzenlemelerde kitler, PCSK9 antikor antagonistini, LDL-C, HDL-disi-C ve toplam kolesterol dahil olmak üzere kolesterolün düsürülmesine ve/veya HDL-C'nin yükseltilmesine yönelik faydali oldugu bilinen bir veya daha fazla ajani içerir. Mevcut anti-PCSK9 antagonist antikoru veya antijen baglama molekülü ile kitlere dahil edilmeye yönelik örnek niteligindeki ikinci ajanlar, sinirlama olmaksizin bir HMG-CoA redüktaz inhibitörü (diger bir ifadeyle, bir statin), fibratlar (örnegin, klofibrat, gemfibrozil, fenofibrat, siprofibrat, bezafibrat), niasin ve bunun analoglari, kolesterol absorpsiyon inhibitörleri, safra asidi katkilari (örnegin, kolestiramin, kolestipol, kolesvelam), bir ileal safra asidi tasima (IBAT) inhibitörü, birtiroid hormonu mimetigi (örnegin, bilesik K82115), bir mikrozomal trigliserid transfer proteini (MTP) inhibitörü, bir çift peroksizom çogaltici aktiveli reseptör (PPAR) alfa ve gama agonist, bir asil CoA:diasilgliserol asiltransferaz (DGAT) inhibitörü, bir asil CoA:kolesterol asiltransferaz (ACAT) inhibitörü, bir Niemann Pick C1-benzeri 1 (NPC1-L1) inhibitörü (örnegin, ezetimib), ATP Baglama Kasedi (ABC) proteinleri (35 veya G8iin bir agonisti, bir kolesterol ester transfer proteini (CETP) inhibitörü, bir inhibitör nükleik asit hedefleyici PCSK9 ve bir inhibitör nükleik asit hedefleyici apoB100 içerir. Kitlerde kullanilan ilave lipid düsürücü ajanlar, örnegin Chang, et al., Curr Opin Drug Disco Devel (2002) 5(4):562-70; Sudhop, et al., Drugs (2002) 62(16):2333-47; Bays and Stein, Expert Opin Pharmacother (2003) 4(11):1901-38; Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003) Mar(134):45-50; Tomoda and Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89; Tenenbaum, et al., Adv Cardiol (2008) 45:127-53; Tomkin, Diabetes Care (2008) 31(2):S241-S248; Lee, et al., J Microbiol Biotechnol (2008) 18(11):1785-8; Oh, et al., Arch Pharm Res (2009) 32(1): 43-7; Birch, et al, J Med Chem (2009) 52(6):1558-68; ve Baxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery (2009) &308-320 içinde açiklanir ve/veya degerlendirilir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri, bir statin ile kitlerde saglanir. Ornek niteligindeki statinler, sinirlama olmaksizin atorvastatin, serivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rosuvastatin ve simvastatini içerir. Bazi düzenlemelerde bulusun anti-PCSK9 antikorlari veya antijen baglama molekülleri, hiperkolesterolemi veya trigliseridemiyi indükleyen bir farmakolojik ajan ile kitlerde saglanir. Ornegin ikinci farmakolojik ajan, bir proteaz inhibitörü, örnegin Sakuinavir, Ritonavir, Indinavir, Nelfinavir, Amprenavir, Lopinavir, Atazanavir, Fosamprenavir, Tipranavir, Darunavir, abakavir-lamivudin-zidovudin (Trizivir) olabilir. Bazi düzenlemelerde ikinci farmakolojik ajan, Takrolimustur. 'ORNEKLER Asagidaki örnekler, istemlerde tanimlanan bulusu kisitlamayacak sekilde açiklamak üzere sunulur. 'Ornek 1: Pcsk9 antaqonisti NVPLFU720'nin Olusumu ve Tanimlanmasi Kisa Açiklama Çalismalar, Pcsk9ia karsi bir fonksiyonel antikor antagonistini olusturmak üzere gerçeklestirilmistir. Proteininin His-etiketli versiyonuna baglanabilen bir antikoru salgilayan çoklu hibridomlar tanimlanmistir. Hibridomlardan antikorlar, bu hücrelerin LDL kolesterolünü tutma yeteneklerinde bir artisa neden olacak sekilde bunlarin HepG2 hücreleri üzerinde LDL reseptörünün Pcsk9 aracili degradasyonunu inhibe etme yetenegi ile ölçüldügü üzere fonksiyonel antagonist aktivitesine yönelik degerlendirilmistir. Etkili bir fonksiyonel murin anti-insan Pcsk9 IgGl-kappa monoklonal antikor tanimlanmistir ve NVP-LFU720 (LFU720) olarak belirtilmistir. Yöntemler Antijen ve diger proteinler Insan Pcsk9 proteinini salgilayan stabil bir ifade hücre hatti, HEK293 FreestyleTM hücrelerinin (Invitrogen, Carlsbad, Ca) transfeksiyonu ile olusturulmustur. Kisaca BioCoat balonlari (Becton Dickinson) üzerinde bitisik modda FreestyleTM ortami (Invitrogen) arti %10 fetal buzagi serumu içinde kültürlenen hücreler, Lipofectamine 2000TM transfeksiyon reaktifi ve melitin sinyal dizisini içeren bir rekombinant plazmid, olgun Pcsk9 cDNA (aa 31-692) ve dizinin (E.Hampton tarafindan klonlanan, GNF, NPL 010051) C-terminusunda bir hisö (SEO ID NO:57) etiketi kullanilarak transfekte edilmistir. Transfeksiyondan 48 saat sonra pozitif transfektanlarin seçimi, kültürleme ortamina 100 ug/mL Zeocin eklenerek baslatilmistir. Dört hafta sonra Pcsk9 üreten hücrelerin dört stabil hücre havuzu meydana gelmistir. En yüksek üretici olan havuz 4, FreestyleTM ortaminda serum içermeyen süspansiyon kosullarina adapte edilmistir ve akabinde 10-20 L üretim hacmi ölçeginde WaveTM biyoreaktörler kullanilarak büyük ölçekli üretime yönelik arttirilmistir. 12 ile 30 mg/L arasinda oranlarda üretilen rekombinant proteini verecek sekilde zamanla birkaç çalisma gerçeklestirilmistir. Hücre üst fazlari toplanmistir ve çapraz akisli filtrasyon ile konsantre edilmistir. Ortaya çikan konsantre, 0.5 mL/dakikada bir 25 mL NiNTA His-Bind Superflow kolonuna (50 mM Tris/300 mM NaCI/1 mM CaCI2/2 mM ß- Merkaptoetanol ile dengelenmistir, pH 7.4) uygulanmistir. Baslangiçta pH 7.4, 50 mM Tris/3OO mM NaCI/20 mM Imidazol ile yikandiktan sonra bagli materyal, 50 mM Tris/BOO mM NaCl/250 mM Imidazol, pH 7.4 ile ayristirilmistir. Ortaya çikan eluata pH 7.3,te PBS*ye karsi diyaliz uygulanmistir. steril filtrelenmistir ve alikuot haline getirilmistir. Bir numune, oligomerizasyonun belirlenmesine yönelik analitik boyut dislama kromatografisi ile analiz edilmistir. Saflastirilan proteinden elde edilen HPLC kromatogrami, iki pik gösterir, büyük olani %851 olusturur. Tam uzunlukta proteinin HPLC-ESI MS analizi, oksitlenen bütün Sistein kalintilari ile melitin-hsPcsk9 aa31-692-Hisyten beklenen kütleye göre olan 581760 Da'nin kütlesini ortaya çikarir. Numunenin parçasi ek olarak N- glikosilatlidir. Yaklasik olarak 13 kD kütlelik kontamine edici protein, büyük bir olasilikla proteininin serbest pro-domenine benzer. Fare ve sinomolgus maymunundan Pcsk9'un karsilik gelen homologlari, Freestyle ortaminda serum içermeyen süspansiyon içinde kültürlenen HEK293 Freestyle hücreleri tekrar kullanilarak büyük ölçekli geçici ifade yaklasimlarinda üretilmistir. Rekombinant plazmidler, dogal bir lider dizi içeren fare Pcsk9 cDNA'si ve C-terminusunda bir hisö (SEQ ID NO:57) etiketi ve bir CD33 lider dizisini içeren sino Pcsk9 ve bir C-terminali hisa (SEO ID NO:57) etiketi, 123 (ug/mLzug/mL DNAzPEI) oraninda plazmid DNA'nin tasiyicisi olarak Polietilenimin kullanilarak Freestyle hücrelerinde transfekte edilmistir. Uretim çalismalari, WaveTM biyoreaktörlerinde 10 litre ölçeginde gerçeklestirilmistir; protein saflastirma ve karakterizasyonu, insan Pcsk9 proteinine yönelik yukarida açiklanan protokollere göre analog olarak yapilmistir. Fare Pcsk9 proteinine yönelik verimler, 0.7 ve 2.7 mg/L kültür araliginda olmustur, sino Pcsk9, 3.1 mg/Lide elde edilmistir. Hibridom olusumu Farelerin Immünizasyonu ve Hibridomlarin Uretimi Saflastirilan Pcsk9, Bel-2 transgenik farelerin (CSTBL/ö-Tgn (bol-2) 22 wehi susu) immünizasyonundan önce Freunds Tam Adjuvani ile 1:1 seyreltilmistir. Fareler, Birçok Alanda Tekrarli Immünizasyon (RIMMS) gerektiren bir prosedür kullanilarak immünize edilmistir. Kisaca farelere periferik lenf dügümlerinin (PLN) yakininda 8 spesifik alanda 1-3 ug antijen enjekte edilmistir. Bu prosedür, 12 günlük bir periyot üzerinde 6 kez tekrar edilmistir. Gün 12'de bir test kani toplanmistir ve serum antikor titresi, ELISA ile analiz edilmistir. Toplanan PLN, Gün 15'te yüksek titreli farelerden uzaklastirilmistir. Lenfositleri toplamak üzere PLN, düz DMEM ile iki kez yikanmistir ve akabinde .22 mikron elekten (Falcon #352350) geçirilerek ayristirilmistir. Ortaya çikan Ienfositler, füzyondan önce 2 kez daha yikanmistir. NSO/Bcl-2 miyelom hücreleri, 2.5 Ienfosit ila 1 NSO hücresi miktarinda lenfositler ile karistirilmistir. Hücre karisimi santrifüjlenmistir ve 1 mL PEG 1500 akabinde 1 dakika boyunca damlatilarak hücre pelletine eklenmistir. 30 saniye sonra 1 mL DMEM yavasça eklenmistir ve 1 dakika sonra 19 mL DMEM 5 dakika boyunca eklenmistir. Füzyonlanmis hücreler pellet haline getirilmistir, HAT ortami (DMEM + %20 FBS, Pen/Strep/Glu, 1x NEAA, 1x HAT, 0.5X HFCS) Içinde 2 X 105 hücre/mL yogunlugunda yeniden süspanse edilmistir ve bir saat boyunca 37 Oya yerlestirilmistir. Hücreler akabinde 60 pL / göz içinde 384 gözlü plakaya yerlestirilmistir. Pcsk9,a Karsi Fonksiyonel Antikorlari Salgilayan Hibridomlarin Taranmasi Füzyondan on gün sonra hibridom plakalari, Pcsk9 spesifik antikorlarinin varligina yönelik taranmistir. ELISA taramasina yönelik Maxisorp 384-gözlü plakalari (Nunc #464718), 50 uL Pcsk9 (PBS içinde 15 ng/göze seyreltilmistir) ile kaplanmistir ve 4 oC'de bir gece boyunca inkübe edilmistir. Kalan protein aspire edilmistir ve gözler, PBS içinde %1 BSA ile bloke edilmistir. Oda sicakliginda 30 dakika inkübasyondan sonra gözler, dört kez PBS + %005 Tween (PBST) ile yikanmistir. 15 uL hibridom üst fazi, ELISA plakalarina aktarilmistir. PLNinin uzaklastirilmasi sirasinda alinan 15 pL fare serumu, PBS içinde 1:1000 seyreltilmistir ve bir pozitif kontrol olarak eklenmistir. 50 uL sekonder antikor (keçi anti fare IgG - HRP (Jackson Immuno Research #115-035-071), PBS içinde 1:5000 seyreltilmistir), ELISA plakalari üzerinde bütün gözlere eklenmistir. 1 saat boyunca oda sicakliginda inkübasyondan sonra plakalar, PBST ile sekiz kez yikanmistir. pL TMB (KPL #50-76-05) eklenmistir ve oda sicakliginda 30 dakika inkübasyondan sonra; plakalar, 605 nm absorbansta okunmustur. Pozitif gözlerden hücreler, HT ortaminda (DMEM + %20 FBS, Pen/Strep/Glu, 1x NEAA, 1x HT, 0.5x HFCS) 24 gözlü plakalarda genisletilmistir. Antikor saflastirma LFU720 içeren üst faz, G proteini (Upstate # 16-266 (Billerica, MA)) kullanilarak saflastirilmistir. Ust fazin yüklenmesinden önce reçine, PBSfnin 10 kolon hacmi ile dengelenmistir. Numunenin baglanmasindan sonra kolon, PBS'nin 10 kolon hacmi ile yikanmistir ve antikor akabinde pH 2.0›da 0.1 M Glisinin 5 kolon hacmi ile ayristirilmistir. Kolon fraksiyonlari, pH 9.0'da Tris HCI=nin 1/10 hacmi ile hemen nötrlestirilmistir. Fraksiyonlarin OD280'i ölçülmüstür ve pozitif fraksiyonlar toplanmistir ve pH 7.2,de PBStye karsi bir gece boyunca diyalize tabi tutulmustur. Baglama kinetikleri ve Biacore analizi Kinetik baglama parametrelerinin belirlenmesi, optik biyosensör Biacore 851 kullanilarak yüzey plazmon rezonans ölçümleri ile yapilmistir. Bu teknoloji, bir Iigandin bir reseptöre baglanmasina (ka) ve bundan ayrismasina (kd) yönelik mikroskopik hiz sabitlerinin etiketsiz belirlenmesine olanak saglar. Bu nedenle bu özellikle antikor-antijen etkilesimlerinin karakterize edilmesine yönelik uygundur. Pcsk9yun LFU720iye (2 pg/mL) baglanma çalismalari, daha önceden bir Series 8 CM-5 Biacore sensör çipi (onayli) (Biacore #BR-1005-30) 'üzerinde hareketsiz hale getirilen bir tavsan anti-fare Fcv antikoru (Biacore #BR-1005-14) ile fare antikoru yakalanarak gerçeklestirilmistir. Fcy yakalama antikorunun kovalent baglanmasi, 'Amin Birlestirme Kiti' (Biacore #BR-1000-50) ile yapilmistir. Yakalama antikoru (tavsan-anti-fare), 10 pL/dakika akis hizinda 10 mM sodyum asetat, pH 5 içinde bir 50 pg/mL anti-Fcy antikor solüsyonu (Biacore #BR-1003-51) ile EDC aktiveli dekstran yüzeyine baglanmistir. Pcstrun 0.5 uM ila 7.8 nM (2 kati seri dilüsyon) olan konsantrasyon araligi, PBS arti 100 mM NaCI, %0.005 P20 (Biacore #BR-100064) içinde yakalanan LFU720 çipi üzerinde akitilmistir. Ortaya çikan sensörgramlar, Biacore 851 Degerlendirme Yazilimi kullanilarak analiz edilmistir. Bütün konsantrasyonlardan veriler, küresel olarak bir 1:1 Langmuir modeline uydurulmustur. TR-FRET Analizi TR-FRET analizi, 384 gözlü beyaz, derin olmayan plakalarda (Perkin Elmer, 6008280) gerçeklestirilmistir. hPcsk9-AF (10.7 nM), 15 pL analiz tamponu (20 mM HEPES, pH 7.2, 150 mM NaCI, 1 mM C8CI2, %0.1 v/v Tween 20 ve %0.1 w/v BSA) içinde oda sicakliginda 30 dakika boyunca etiketsiz hPcsk9 proteini, EGF-A peptidi veya NVP- LFU720-AX-1 antikorunun seri dilüsyonlari ile inkübe edilmistir. Bunun akabinde hPcsk9 ve NVP-LFU720-AX-1 önceden inkübe edilmis kompleksine analiz tamponu içinde 5 uL hLDL-R-Eu (4 nM) eklenmistir ve 90 dakika boyunca oda sicakliginda inkübe edilmistir. Bu etiketlenmis proteinlerin nihai konsantrasyonlari, 8 nM hPcsk9-AF ve 1 nM hLDL-R- Eu olmustur. TR-FRET sinyali, 330 nm eksitasyon ve 665 nm emisyonda EnVision 2100 çoklu etiket okuyucu (Perkin Elmer) ile ölçülmüstür. Veriler, asagidaki formül kullanilarak normal degerlere dönüstürülmüstür: [(665 nm degeri x 10,000)/(615 nm degeri)]. Inhibisyon yüzdesi, asagidaki formül ile hesaplanmistir: 100 - [(muamele edilen numunenin normallestirilen degeri/muamele edilmemis numunelerin ortalama normallestirilen degeri) x 100]. Inhibisyon yüzdesi doz yanit egrileri, Y = Alt + (Ust - AIt)/(1+1O^((LogI050- X)*Hill Egimi)) (GraphPad Prism Yazilimi) formülü ile Prism versiyon 5 kullanilarak grafik haline getirilmistir. LDL-R Dönüsüm Analizi HepG2 hücreleri tripsin haline getirilmistir ve %1 v/v kollajen ile önceden kaplanan düz tabanli 96 gözlü plakalarda (Coming, 3595) 100 i.iL kültür ortaminda göz basina 6 x 104 hücrede tohumlandirilmistir akabinde 24 saat boyunca %5 CO2'de 37'Ctde inkübe edilmistir. Genel olarak hücreler, hPcsk9 proteini, EGF-A peptidi ve/veya NVP-LFU720- AX-1 antikorunu içeren 100 uL serum içermeyen ortam ile muamale edilmistir. Muameleden sonra ortam atilmistir ve hücreler, 100 uL PBS ile yikanmistir. Hücreleri toplamak üzere 100 uL Versin (Biowhittaker, 17-771E) eklenmistir ve %5 CO2 içinde 37"C'de bir saat boyunca inkübe edilmistir akabinde 100 uL FACS tamponu eklenmistir. Hücreler, V-tabanli 96 gözlü plakalara (Coming, 3894) aktarilmistir ve hücreleri pellet haline getirmek üzere 5 dakika boyunca 1200 rpmfde santrifüjlenmistir. Hücreler üzerinde spesifik olmayan baglama alanlarini bloke etmek üzere FACS tamponu içinde 50 uL 100 ug/mL normal tavsan lgG (MP biomedicals, 55944) ve fare lgG (Sigma, I5381), her bir göze eklenmistir ve buz içinde 30 dakika boyunca inkübe edilmistir. Hücreler, 5 dakika boyunca 1200 rpm°de santrifüjlenmistir ve tampon, plakaya hafifçe vurularak uzaklastirilmistir. Hücreleri etiketlemek üzere her bir göze FACS tamponu içinde 10 uL tavsan anti-hLDL-R-Alexa 647 lgG (5 ug/mL) ve 10 uL fare anti-transferrin- R-fikoeritrin (PE) lgG (2 ug/mL) (CD71, Becton Dickinson Biosciences, 624048) etiketli antikorlar eklenmistir ve buz içinde 60 dakika inkübe edilmistir. Hücreler, 5 dakika boyunca 1200 rpm*de santrifüjlenmistir ve tampon, plakaya hafifçe vurularak uzaklastirilmistir. Bagli olmayan antikorlar, FACS tamponunu gözü basina 200 uL'si ile iki kez hücrelerin yikanmasi ile uzaklastirilmistir. Hücreler, PBS içinde %1 paraformaldehid içinde sabitlenmistir ve canli hücreler kapilanmistir (5000) ve bir BD LSR ll akis sitometresi ve FACSDIVA yazilimi (Becton Dickinson) kullanilarak analiz edilmistir. PE floresaninin medyan degeri, 488 nm eksitasyonda ve 575 nm emisyonda ölçülmüstür. Alexa 647 floresaninin medyan degeri, 488 nm eksitasyonda ve 633 nm emisyonda ölçülmüstür. Özel olarak yapilmis bir tavsan anti-hLDL-R poliklonal lgG 583, HepG2 hücreleri üzerinde yüzey hLDL-R*sinin FACS tespitine yönelik Covance (Denver, PA, ABD) tarafindan özel olarak üretilmistir. Tavsan anti-hLDL-R lgG 583, normal tavsan lgG'si ile karsilastirildiginda HepG2 hücrelerinin yüzeyi üzerinde hLDL-R'nin tespitine yönelik yaklasik olarak 7-katli pencere göstermistir. HepGZ hücrelerinin yüzeyi üzerinde LDL-R'ye yönelik anti-hLDL-R lgG 583'ün spesifikligini belirlemek üzere, bu lgG'nin baglanmasina yönelik bir rekabetçi olarak hLDL-R proteini kullanilarak bir deney gerçeklestirilmistir. HepG2 hücrelerine dogru anti-hLDL-R lgG 583'e yönelik ortalama ortam floresaninda doza bagimli bir düsüs, hLDL-R proteininin artan konsantrasyonlari ile gözlemlenmistir. Bu, anti-hLDL-R lgG 583'ün spesifik olarak HepG2 hücrelerinin yüzeyi üzerinde LDL-R5yi FACS ile ölçüldügü gibi tanidigini göstermistir. Gelecek çalismasi, HepG2 hücrelerinin yüzeyi üzerinde LDL-R'nin FACS ölçümüne yönelik dogrudan etiketli anti-hLDL-R-583-Alexa 647 lgG'yi kullanmistir. LDL-C Alimi HepGZ hücreleri tripsin haline getirilmistir ve düz tabanli 96 gözlü plakalarda (%1 v/v kollajen ile önceden kaplanan, Coming, 3595) 100 uL kültür ortaminda göz basina 6 x 104 hücrede tohumlandirilmistir akabinde 24 saat boyunca %5 CO2Yde 37°Cide inkübe edilmistir. Aksi belirtilmedigi sürece hücreler, hPcsk9 proteini, EGF-A peptidi ve/veya NVP-LFU720-AX-1 antikorunu içeren 100 uL serum içermeyen ortam ile muamele edilmistir. Muameleden sonra her bir hücre, serum içermeyen ortamda 20 uL 30 ug/mL 3,3'-dioktadesilind0karbosiyanin-etiketli düsük yogunluklu lipoprotein (Dil-LDL) (Intracell, RP-077-175) almistir ve 2 saat boyunca %5 CO2 içinde 37°Cyde inkübe edilmistir. Ortam, plakalara hafifçe vurularak uzaklastirilmistir ve hücreler, 100 pL fosfat tamponlu salin (kalsiyum veya magnezyum olmadan PBS, lnvitrogen, 14190-144) ile yikanmistir. PBS, plakalara hafifçe vurularak uzaklastirilmistir ve her bir göze 100 uL %0.25 tripsin-EDTA eklenmistir ve %5 C02 içinde 37"Cide 5 dakika boyunca inkübe edilmistir. Her bir göze yüz pL FACS tamponu (%5 FBS, 2 mM EDTA ve %02 sodyum azid içeren PBS) eklenmistir ve hücreler, 5 dakika boyunca 1200 rpmide santrifüjleme ile pellet haline getirilmistir. Ortam, plakaya hafifçe vurularak atilmistir ve hücreler, göz basina PBS içinde 50 pL %1 paraformaldehid (Electron Microscopy Sciences, 15710) eklenerek sabitlenmistir. Canli hücreler kapilanmistir ve bir BD LSR II akis sitometresi ve FACSDIVA yazilimi (Becton Dickinson) kullanilarak analiz edilmistir. Dil-LDL floresaninin medyan degeri, 488 nm eksitasyonda ve 575 nm emisyonda ölçülmüstür ve 5000 hücre analiz edilmistir. Çubuk grafikleri, Microsoft Excel 2002 (Microsoft Corporation) kullanilarak olusturulmustur. Aktivasyon yüzdesi asagidaki gibi hesaplanmistir, Aktivasyon %isi = [1 - (X + A)] x 100, burada X = numune gözünden ortam floresan okumasi ve A = sadece hPcsk9 muamelesi ile gözden ortam floresan okumasi. Aktivasyon yüzdesi, Y = Alt + (Ust-AIt)/(1+10^((LogEC50-X) x Hill Egimi)) ve GraphPad Prism 5 (GraphPad Yazilimi) denklemi kullanilarak olusturulan doz yanit egrilerinden ECso'leri belirlemek üzere muameleye karsi grafik olarak gösterilmistir. Sonuçlar Bir anti-insan Pcsk9 monoklonal antikorun olusumu B-hücreleri, Pcsk9 protein ile immünize edilen hayvanlarin primer lenf dügümlerinden toplanmistir. Hibridom, standart PEG aracili füzyon kullanilarak olusturulmustur. Ortaya çikan füzyon, ELISA tarafindan analiz edilmistir ve insan Pcsk9'una pozitif baglayicilar tanimlanmistir ve üst fazlari olusturmak üzere genisletilmistir. Sonradan fonksiyonel analizler ile siniflandirilan tanimlanmis birçok ELISA pozitif klonu mevcuttur. Oncü aday olarak tanimlanan klon, LFU720'dir. Oncü adayimiz LFU720'ye ek olarak Pcsk9 ve LDLr'nin (FRET ile ölçüldügü üzere) etkilesimini bloke etme konusunda basarisiz olan ancak Pcsk9'a baglandiginda Pcsk9'un LDLr degradasyonuna (LDLc alimi ile olcüIdügü üzere) aracilik etrne yetenegini bloke edebilen, klonlar 21D6, 5A4-C1 ve 13F1 dahil olmak üzere birçok diger klon tanimlanmistir. Klon 21D6 ayni zamanda in vivo LDLr'nin Pcsk9 degradasyonunu bloke etme yetenegi göstermistir. Spesifik olarak Pcsk9'a baglanmaya yönelik LFU720inin taranmasi LFU720 spesifikligi, ELISA içinde bir dizi diger proteine baglanmayi degerlendirerek incelenmistir. LFU720'nin diger 'üç HIS-etiketli proteine baglanmasi, Pcsk9-HlS'ye baglanma ile karsilastirilmistir. Bu, Pcsk9ia baglanmanin spesifik oldugunu ve antikorun HIS etiketine baglanmadigini göstermistir. Sinomolgus Pcsk9'a baglanmaya yönelik LFU720'nin degerlendirmesi LFU720inin Pcsk9'un sinomolgus homologuna baglanmasi belirlenmistir. Bu analize yönelik sinomolgus HIS-etiketli Pcsk9'u ifade eden hücrelerden üst fazlar, materyali saflastirmaya yönelik ihtiyaç onlenerek bir Ni yakalama plakasi ile birlikte kullanilmistir. Insan Pcsk9'u seyreltilmistir ve bunun HIS-etiketi araciligiyla yakalanmistir. LFU720, insan ve sinomolgus Pcsk9'unun her ikisine baglanabilmistir. 5P20 ayrica ELISA içinde insan LDL-R'sine veya fare Pcsk9'una baglanmamistir. LFU720inin baglanma kinetikleri Insan Pcsk9 proteinini taniyan fare antikoru LFU720, bir optik biyosensör teknigi (Biacore) kullanilarak baglanma afinitesine yönelik analiz edilmistir. LFU720*nin nanomolar-alti afinitesi (KD =200 pM) olan rekombinant insan Pcsk9'a yüksek afinite ile baglandigi bulunmustur. Pcsk9/LDL-R etkilesiminin bloke edilmesine yönelik LFU720`nin taranmasi TR-FRET analizi, anti-hPcsk9 antikoru NVP-LFU7205nin hPcsk9-AF ile hLDL-R-Eu etiketli proteinler arasindaki etkilesimi bozup bozamayacaginin belirlenmesine yönelik kullanilmistir. Etiketli olmayan hPcsk9 proteini veya EGF-A peptidi, analizin hLDL-R-Eu ve hPcsk9-AF etiketli proteinlerin etkilesimi ile olusturulan TR-FRET sinyalinin bozulmasini tespit edebildigini göstermek üzere degerlendirilmistir. Etiketli olmayan hPcsk9'un artan konsantrasyonlari, hLDL-R-Eurya baglanmaya yönelik hPcsk9-AF ile rekabet etmistir, bu TR-FRET sinyalinin bir düsüsüne neden olmustur. EGF-A peptidi, hLDL-R-Eu ile bir leo 2.5 pM'si olan hPcsk9-AF arasindaki etkilesimi bozmustur. Aksine NVP-LFU720, hPcsk9-EU ile 1000 nMiden fazla olan bir ICso'SI olan hLDL-R-AF arasindaki TR-FRET sinyalini bozmustur ve düsük antikor konsantrasyonlarinda U- seklinde bir yanit göstermistir. LDL-R,nin Pcsk9 aracili degradasyonunun inhibe edilmesine yönelik LFU720inin taranmasi LDL-R'ye Pcsk9 baglanmasinin LDL-R degradasyonuna neden oldugu gösterilmistir ve bu, HepGZ hücreleri ve rekombinant insan Pcsk9'u kullanilarak dogrulanmistir. LFU720'nin Pcsk9ta baglanma ve bu etkiyi bloke etme yetenegi belirlenmistir. NVP- LFU720, ekzojen hPcsk9 ile muamele edilen HepG2 hücrelerini inhibe etmistir ve artan hücre yüzeyi LDL-R'sine neden olmustur. Pcsk9,un inhibe edilmesine ve LDL-aliminin düzeltilmesine yönelik LFU720"nin taranmasi LDL-R'nin Pcsk9 degradasyonunun inhibisyonunun HepGZ hücrelerinin LDL-Cryi internalize etme yetenegini düzeltmesi gerekir. NVP-LFU720, ekzojen hPcsk9 ile muamale edilen HepG2 hücreleri üzerinde Pcsk9 aracili LDL-R degradasyonunu önlemistir ve 99 nM bir ECsoisi olan artan Dil-LDL alimina neden olmustur. Ornek g: PCSK9 Antagonist A_ntik0rlgri NVP-LGT209. NVP-LGT210 ve NVP- LGT211iin Olusturulmasi Giris Bu örnek, bir insan germ hatti antikoruna daha fazla dizi homolojisine sahip olmak üzere murin monoklonal PCSK9 antagonist antikoru NVP-LFU720'ye gelistirilerek insan antikorlari NVP-LGT209, NVP-LGT210 ve NVP LGT211'in olusturulmasini açiklar. NVP- LGT209, NVP-LGT210 ve NVP LGT211, parent murin antikoru NVP-LFU720ynin epitop spesifikligini, afinitesini ve sinomolgus makak PCSK9 çapraz reaktivitesini muhafaza eder. NVP-LGT209, NVP-LGT210 ve NVP LGT211, orijinal murin antikoruna göre insan germ hatti dizisine çok daha yüksek bir homolojiye sahiptir ve bu nedenle insan immün sistemi tarafindan daha iyi tolere edilmesi gerekir. Fare monoklonal antikoru LFU720'ye, bunun protein dizisini bir insan germ hatti dizisine daha yakin hale getirmek üzere ve bunun immünojenesitesini azaltmak üzere HumaneeredTM teknolojisi uygulanmistir. Humaneering TM teknolojisi, KaloBios of South San Francisco (dünya çapinda ag üzerinde kalobios.com adresinde) araciligiyla elde edilebilir. Insan HumaneeringT'V' teknolojisi, parent veya referans antikorunun spesifikligini ve afinitesini muhafaza ederken bir insan germ hatti dizisine yüksek homolojiye sahip olan V-bölgesi dizileri olan gelistirilmis insan antikorlarini olusturur (U.S. Patent Yayini 2005/0255552 ve 2006/0134098). Proses birinci olarak bir referans Fab'nin (tipik olarak agir zincir CDR3 ve hafif zincir CDRS'ü içindeki diziler) agir ve hafif zincir degisken bölgelerinde minimum antijen baglama spesifikligi belirleyicilerini (BSD'Ier) tanimlar. Bu agir ve hafif zincir BSD'Ieri, HumaneeringTM prosesi sirasinda olusturulan bütün kütüphanelerde muhafaza edilir, her bir kütüphane epitopa odaklidir ve son olarak tam olarak Humaneered TM teknolojisi ile olusturulan antikorlar, orijinal fare antikorunun epitop spesifikligini muhafaza eder. Akabinde tam zincir kütüphaneleri (burada bir tam hafif veya agir zincir degisken bölge, insan dizilerinin bir kütüphanesi ile degistirilir) ve/veya kaset kütüphaneleri (burada fare Fab'sinin agir veya hafif zincir degisken bölgesinin bir kismi, insan dizilerinin bir kütüphanesi ile degistirilir) olusturulur. Bir bakteriyel sekresyon sistemi, antikor Fab fragmanlari olarak kütüphanenin elemanlarini ifade etmek üzere kullanilir ve kütüphane, bir koloni kaldirma ile baglama analizi (CLBA) kullanarak antijeni baglayan Fabilere yönelik taranir. Pozitif klonlar ayrica en yüksek afinitesi olanlari tanimlamak üzere karakterize edilir. Kalan murin dizileri baglaminda baglamayi destekleyen tanimlanmis insan kasetleri akabinde tam olarak insan V-bölgelerini olusturmak üzere bir nihai kütüphane taramasinda kombine edilir. Ortaya çikan HumaneeredTM Fab'ler, insan kütüphanelerinden türetilen V-segmenti dizilerine sahiptir, CDR3 bölgelerinde tanimlanan kisa BSD dizilerini muhafaza eder ve insan germ hatti Çatisi 4 bölgelerine sahiptir. Bu Fabiler, agir ve hafif zincirlerin degisken bölgeleri IgG ifade vektörlerinde klonlanarak tam IgG'Iere dönüstürülür. Bu proseste olusturulan tam olarak HumaneeredT'V' teknolojisi ile olusturulan antikorlar, parent, murin antikorunun baglama spesifikligini muhafaza eder, tipik olarak parent antikora göre antijene yönelik esdeger veya daha yüksek afiniteye sahiptir ve protein seviyesinde insan germ hatti antikor genleri ile karsilastirildiginda yüksek bir dizi özdesligi derecesi olan V- bölgelerine sahiptir. Yöntemler Murin V-bölqelerinin klonlanmasi Murin monoklonal NVP-LFU720*den V-bölgesi DNAisi, standart yöntemler kullanilarak hibridom hücre hattindan izole edilen RNA'dan RT-PCR ile çogaltilmistir. Hibridom cDNAisindan agir zincir degisken bölgesinin PCR amplifikasyonuna yönelik basarili bir sekilde kullanilan primerler, VH14 (5'-CTTCCTGATGGCAGTGGTT-S'; SEQ ID NO:58) (Chardes T, et al 1999, FEBS Letters; 452(3):386-94) ve HC sabiti (5'- GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC-ß'; SEQ ID NO:59). olmustur. Hibridom CDNA'sindan hafif (kappa) zincir degisken bölgesinin PCR amplifikasyonuna yönelik basarili bir sekilde kullanilan primerler VK4/5 (5'- TCAGCTTCYTGCTAATCAGTG-S'; SEQ ID NO:60) (Chardes T, et al., 1999, supra) ve LC sabiti (5'-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3'; SEQ ID NO:61). olmustur. Çogaltilan agir ve hafif zincir degisken bölgeleri dizi haline getirilmistir. PCR akabinde V-genlerini çogaltmak üzere ve KaloBios vektörleri içinde klonlamaya yönelik kisitlama enzimlerini eklemek üzere kullanilmistir: Ncol (5') ve Nhel (13') üzerinde KB1292-His (CH1 üzerinde bir C-terminal esnek baglayiciyi ve amino asit dizisi AAGASHHHHHH'nin (SEQ ID NO:62) 6-His (SEQ ID NO:57) etiketini kodlayan KB1292,nin modifiye edilmis versiyonu) içinde Vh; Ncol (5') ve BsiWl (13') üzerinde KB1296 içinde Vk. Bu ayri agir ve hafif zincir vektörleri akabinde BssHII ve Clal ile kisitlayici kesme ve Iigasyon ile tek bir disistronik KaloBios Fab ifade vektöründe kombine edilmistir. Fab fragmanlari, bu vektörden E. Coli olarak ifade edilmistir. Bu Fab, PCSKQ antijen baglamaya yönelik test edilmistir ve referans Fab SR032 olarak refere edilir. Fab saflastirma Fab fragmanlari, KaloBios ifade vektörleri kullanilarak E. Coliiden sekresyon ile ifade edilmistir. Hücreler, ~O.6 ODGOO'e 2xYT ortaminda yetistirilmistir. Ifade, 100 uMiye IPTG eklenerek ve 33Ude 4 saat boyunca çalkalanarak in düklenmistir. Düzenlenen Fab, standart yöntemlere göre ozmotik Iiziz ve Ni-NTA kolonlari (HisTrap HP kolonlari; GE Healthcare katalog #17-5247-01) kullanilarak afinite kromatografisi ile saflastirma ile periplazmik fraksiyonlardan elde edilmistir. Fab'ler, 500 mM imidazol içeren tampon içinde ayristirilmistir ve kalsiyum ve magnezyum olmadan pH 7.4,te PBS*ye karsi tamamen diyalize tabi tutulmustur. Kütüphane olusturma Kütüphane olusturmada birinci adima yönelik epitopa odakli tam insan V-b'olgesi kütüphaneleri, KaloBios insan V-segmenti kütüphane dizilerinin PCR amplifikasyonu ile olusturulmustur. Bu tam zincir kütüphanelerinin yapilmasinda BSD ve optimize edilen referans Fab SR038rden insan germ hatti J-segmenti dizilerini içeren benzersiz CDR3- FR4 bölgeleri, PCR ile örtüsen insan V-segmenti kütüphanelerine baglanmistir. Bu tam V-bolgesi kütüphaneleri dogrudan taranmistir; ancak bunlar, Vh ve Vk orta kütüphanelerinin olusturulmasina yönelik sablonlar olarak kullanilmistir. Tam zincir kütüphanesinin olusturulmasina yönelik kullanilan KaloBios insan V-segmenti kütüphaneleri, CDR bölgelerinde orijinal murin Vh'si ve Vk'lerine en yakin olan insan germ hatti dizisine bagli olarak seçilmistir. Orijinal murin NVP-LFU720 Vh'si, bunun CDRilerinde insan germ hatti dizisi Vh1-02rye en yakin olandir böylece Vh1 alt grup elemanlarini (KB1410 ve KBl411) içeren iki KaloBios kütüphanesinin bir karisimi, tam Vh kütüphanesinin yapilmasinda kullanilmistir. Benzer bir sekilde NVP-LFU720 Vk'nin bunun CDR'Ierinde Vk3 L6 insan germ hatti dizisine en yakin olan olmasi nedeniyle Vk3 alt grup elemanlarini (KBl423 ve KB1424) içeren iki KaloBios insan V-segmenti kütüphanesinin bir karisimi, tam Vk kütüphanesinin yapilmasinda kullanilmistir. Bu tam uzunlukta Vh ve Vk kütüphaneleri akabinde parent murin V-segmentinin sadece parçasinin insan dizilerinin bir kütüphanesi ile degistirildigi kaset kütüphanelerinin yapilmasina yönelik sablonlar olarak kullanilmistir. Kasetlerin iki türü, köprü PCR ile olusturulmustur: FR1, CDR1 ve FR2rnin birinci parçasinda insan dizilerini içeren ön-uç kasetleri, Vh1 kütüphanelerinin (KBl410 ve KB'I411) karisimindan veya bir sablon olarak yukarida açiklanan Vk3 kütüphanelerinin (KBl423 ve KB1424) karisimindan çogaltilmistir. FR2, CDR2 ve FR3'ün son parçasinda insan dizilerini içeren orta kasetler, sablonlar olarak yukarida açiklanan tam insan Vh- veya Vk-bölgesi kütüphaneleri kullanilarak çogaltilmistir. Vh kasetleri, amino asit pozisyonlari 45-49'da (Kabat numaralandirmasi) FR25de ortüsen ortak dizilere sahip olmustur; Vk kasetleri, amino asit kalintilari 35-39ida (Kabat numaralandirmasi) FR2ide örtüsen ortak dizilere sahip olmustur. Bu sekilde ön uç ve orta insan kaset kütüphaneleri, insan V-agir 1 ve V-kappa 3 izotiplerine yönelik PCR tarafindan olusturulmustur. Her bir Vh kaset kütüphanesi, Ncol (5') ve Kpnl (13') üzerinde vektör K81292-His içinde klonlanmistir; her bir Vk kaset kütüphanesi, Ncol (5') ve Hindi" (3') üzerinde vektör K81296-B (FR45e eklenen bir sessiz HindIII alanina sahip olan KaloBios vektörü KB1296!nin modifiye edilmis versiyonu) içinde klonlanmistir. Ortaya çikan Vh veya Vk plazmid kütüphaneleri akabinde BssHII ve Clal ile kesme ve tam Fab*leri ifade eden disistronik vektörlerin kütüphanelerini olusturmak üzere ligasyon ile optimize edilen referans Fab SR038tden (örnegin, Vh ön uç kütüphanesi, optimize edilen referans Vk vektörü ile kombine edilmistir) tamamlayici zincir ile kombine edilmistir. Genel ELISA Rekombinant insan veya sinomolgus makak PCSK9-Hisö antijeni, bütün ELISA analizlerine yönelik kullanilmistir. Tipik olarak pH 7.4!te PBS içinde seyreltilen PCSK9- Hisö antijeni, 4`C,de bir gece boyunca inkübasyon ile 300 ng/gözde 96 gözlü bir mikrotitre plakaya baglanmistir. Plaka, 37"C'de bir saat boyunca PBS içinde %3 BSA solüsyonu ile bloke edilmistir ve akabinde PBST ile bir kez durulanmistir. Fab-içeren indüklü hücre ortami veya seyreltilmis, saflastirilmis Fab (50 uL) akabinde her bir göze eklenmistir. 37°Ode bir saatlik inkübasyondan sonra plaka, PBST ile üç kez durulanmistir. PBS (50 uL) içinde 125000 seyreltilen anti-Insan-kappa zinciri HRP konjugati (Sigma #A7164), her bir göze eklenmistir ve plaka, oda sicakliginda 45 dakika boyunca inkübe edilmistir. Plaka, PBST ile üç kez yikanmistir akabinde 100 pL SureBIue TMB substrat (KPL #52-00-03), her bir göze eklenmistir ve plaka, oda sicakliginda ~1O dakika boyunca inkübe edilmistir. Plaka, bir spektrofotometrede 650 nmrde okunmustur. Saflastirilan insan ve fare IgGileri üzerinde spesifiklik ELISAylarina yönelik 384 gözlü bir plaka, göz basina 88 ngide saflastirilmis insan veya fare antijenlerinden bir panel ile kaplanmistir ve 4"C'de bir gece boyunca inkübe edilmistir. Plaka bloke edilmistir ve yukarida açiklandigi üzere yikanmistir akabinde PBS içinde 2 pg/mLtye seyreltilen 22 uL saflastirilmis fare veya insan anti-PCSK9 antikoru her bir göze eklenmistir. Plaka, 37°C'de 1 saat boyunca inkübe edilmistir akabinde PBST ile yikanmistir. HRP'ye konjuge edilen anti-fare Fc antikoru (Jackson ImmunoResearch Labs #115-035-071) veya anti-insan kappa antikoru (Sigma #A7164), PBS (25 pL) içinde 125000 seyreltilmistir ve her bir göze eklenmistir. Plaka, oda sicakliginda 1 saat boyunca inkübe edilmistir akabinde yukarida açiklandigi gibi yikanmistir ve gelistirilmistir. Koloni kaldirma ile baglanma analizi (CLBA) Fab fragmanlarinin Humaneered TM kütüphanelerinin taranmasi esas olarak (U.S. Patent Yayinlari 2005/0255552 ve 2006/0134098) içinde açiklandigi 'üzere 6 pg/mL'de PCSK9- Hisö ile kaplanan nitroselüloz filtreleri kullanilarak gerçeklestirilmistir. Antijen kapli filtreye baglanan Fabaler, PBST içinde 1:5000 seyreltilen bir alkalin fosfataz konjugeli anti-insan kappa hafif zincir antikor (Sigma #A3813) kullanilarak tespit edilmistir ve blotlar, alkalin fosfataza (Vector Laboratories #SK-6605) yönelik DuoLux kemil'uminesan substrati ile gelistirilmistir. Biyotinlenmis rekombinant PCSK9'un olusturulmasi ve afinite ölçümleri C-terminal Avi- (alana yönlendirlen biyotinleme) ve Hisö (SEO ID NO:57) etiketleri olan PCSK9 (PCSKQ-Avi-Hisö), PCSK9'u kodlayan gen ile pRSSa/PCSKQ plazmidinde Hisö (SEQ ID NO:57) etiketi arasina bir EcoRI kisitlama alani eklenerek olusturulmustur; bir C-terminal Hisö (SEQ ID NO:57) etiketi ile PCSK9 Uniprot Erisimi Q8NBP7'nin amino asitleri 31-6921yi ifade eder. Avi etiketini (amino asit dizisi: GGGLNDIFEAQKIEWHE; SEQ lD NO:63) kodlayan ve EcoRI çikintilari ile yandan desteklenen oligonükleotidler, T4 polin'ükleotid kinazi (Introvogen) ile fosforlanmistir, tavlanmistir ve akabinde yeni eklenen EcoRl alani kullanilarak pRSSa/PCSK9 içinde baglanmistir. Avi etiketini içeren klonlar, dizi analizi ile dogrulanmistir. PCSK9-Avi-Hi56'nin ifadesi, 293 Freestyle Ifade Sisteminde (Invitrogen) gerçeklestirilmistir ve salgilanan rekombinant proteini, Ni-NTA reçinesi (QIAGEN) kullanilarak saflastirilmistir. Saflastirmanin akabinde PCSKS-Avi- HisG proteini, 10 mM Tris pH 8.0, 50 mM NaCI'ya karsi diyalize tabi tutulmustur. Protein, 'üreticinin protokolüne göre biyotin-protein Iigazi (Avidite) ile in vitro olarak biyotinlenmistir. Tamamlanmasi üzerine reaksiyon, pH 7.2,de PBS'ye karsi diyalize tabi tutulmustur ve biyotinleme, HRP-konjugeli streptavidin ile problanarak Western blot ile dogrulanmistir. IgG'Ier ve Fab fragmanlarinin baglanma kinetikleri, bir Solüsyon Denge Titrasyonu ("SET") analizi kullanilarak analiz edilmistir. Kisaca hPCSKQ'nin seri dilüsyonlari, 60 pM IgG veya Fab'ye eklenmistir ve bir gece boyunca inki'ibe edilmistir. 96 gözlü Standart Baglayici mikrotitre plaka (Meso Scale Discovery), 1 ug/ml hPCSK9 ile kaplanmistir ve bir gece boyunca Ink'übe edilmistir, PBS/%0.05 (w/v) Tween 20 ile yikanmistir, PES/%5 (w/v) BSA ile bloke edilmistir ve tekrar yikanmistir. Antikor-antijen preparati, PCSK9 ile kapli Standart Baglayici plakaya eklenmistir ve oda sicakliginda 30 dakika boyunca inkübe edilmistir. Uç ilave yikama adimindan sonra Sulfo-Tag-etiketli keçi-anti-insan- tespit antikoru (R32AJ-5, Meso Scale Discovery) eklenmistir ve oda sicakliginda bir saat boyunca ink'L'ibe edilmistir. Plaka 'üç kez yikandiktan sonra Okuma Tamponu (Meso Scale Discovery) eklenmistir ve elektrokemilüminesans (ECL) sinyalleri, bir Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery) ile ölçülmüstür. ECL verileri, Piehler, et al., (1997) J Immunol Methods 201z189-206 içinde açiklanan antikorlara yönelik uygulanabilen uydurma modeli kullanilarak excel eklentisi XLfit 4.3.2 (ID Business Solutions) ile islenmistir. Her birine yönelik hesaplanan 150-190 pM KD degerleri olan, solüsyon içinde insan PCSK9'u ile antikorlar LGT209, LGT21O ve LGT211 arasinda yüksek afiniteli baglanma gözlemlenmistir. Antikor üretimi ve saflastirma Tam olarak HumaneeredTM teknolojisi ile olusturulan NVP-LGT209, NVP-LGT21O ve NVP-LGT211 antikorlari (sessiz IgG1 kappa), üreticinin protokolüne göre 293fectin transfeksiyon reaktifi (Invitrogen #51-0031) kullanilarak asagidaki gibi 293 Freestyle hücrelerinde vektörlerin es transfeksiyonu ile üretilmistir. LGT-209 - pJG04 (Vh) +pJG1O (Vk) LGT-210 - pJG04 (Vh) + pJGO1 (Vk) LGT-211 - pSR74 (Vh) + pJG10 (Vk) Antikor, bir 5-mL HiTrap Protein A HP kolonu (GE Healthcare #17-0403-03) kullanilarak 293 Freestyle hücre üst fazlarindan saflastirilmistir. Antikor, IgG Elüsyon Tamponu (Pierce #21004) kullanilarak ayristirilmistir ve tampon, diyaliz ile PBS içinde degistirilmistir. Protein A afinite kromatografisi, bir AKTAFPLC sivi kromatografisi sistemi (GE Healthcare) üzerinde gerçeklestirilmistir. Epitop rekabet analizi PCSKQ üzerinde epitop baglanmasina yönelik orijinal fare antikoru NVP-LFU720 ile bunun HumaneeredTM türevi NVP-LGT209 arasindaki rekabet, ForteBio Octet QK sistemi ve biyotinlenmis PCSKQ-Avi-Hisö ile kaplanan Streptavidin Yüksek Baglayici Biyosensörler kullanilarak analiz edilmistir. Uç farkli antikor akabinde doyana kadar ayri PCSK9 kapli sensorlere baglanmistir: fare LFU720'si, tam olarak insan LGT209'u veya kontrol faresi antikoru 7D16 (LFU720rninkinden ayri bir epitopa sahip oldugu bilinen). Akabinde bütün sensörler, birinci antikorun LFU720 baglamasini bloke edip edemeyecegini belirlemek üzere LFU720 fare antikorunu içeren gözlere batirilmistir. Sonuçlar Murin ve referans V-bolqesi amino asit dizileri NVP-LFU720yyi ifade eden hibridom hücrelerinden RT-PCR ürünleri dizi haline getirilmistir ve bu dizi, bir ThermoElectron LTQ-Orbitrap Kütle Spektrometresi kullanilarak protein seviyesinde büyük oranda (%95 veya daha fazla) dogrulanmistir. LFU720,nin agir ve hafif zincir degisken bölgeleri akabinde referans Fab SR032'yi olusturmak amaciyla KaIoBios vektörlerinde klonlanmistir. NVP-LFU720 Vk içinde birinci amino asidin referans Fab SR032rnin olusturulmasina yönelik KaIoBios vektörlerinde klonlamaya olanak saglamak üzere bir glutaminden (O) bir glutamik aside (E) degistirilmesi gerekir; bu nedenle SR032 Vk, birinci Vk pozisyonunda glutamik aside sahiptir. Fab SR032, insan sabit bölgeleri ile kaynastirilan NVP-LFU720iden intakt murin V-bölgelerine sahiptir ve E. Coli'den'den saflastirilmistir. PCSK9-His6 antijen baglamanin bir dilüsyon ELISA testinde klonlanan SR032 referans Fab, Fab konsantrasyonuna bagli olan baglama egrileri üretmistir. Referans Fab'a (SR032) ek olarak optimize edilen bir referans Fab, SR038 olusturulmustur. SR032 içinde birkaç çati amino asit kalintisi, SR038'de insan germ hattina degistirilmistir. Referans ve optimize edilen referans Fab afinitesi analizi FR1 ve FR3'te optimize edilen referans Fab SR038 içine eklenen insan germ hatti kalintilari, insan V-segmenti repertuarini çogaltmak üzere kullanilan PCR primerleri tarafindan belirtilenlerdir ve bu nedenle Humaneered TM V-bölgesi kütüphanelerinin bütün elemanlarinda mevcuttur. Optimize edilen referans Fab, insan germ hattina herhangi bir degisikligin Fab baglama özelliklerini degistirip degistirmedigini degerlendirmek üzere olusturulur. Saflastirilan Fabrler kullanilarak dilüsyon ELISA araciligiyla rekombinant PCSK9 antijenine yönelik SR032 ve SR038'in afinitelerinin özdes oldugu belirlenmistir, bu SR038 içindeki amino asit degisikliklerinin tolere edildigini gösterir. Kütüphane olusturma ve tam olarak HumaneeredTM teknoloiisi ile olusturulan Fab'lerin &imi Vh1 veya Vk3 ile kisitlanan agir ve hafif zincir ön uç ve orta kaset kütüphanelerinin alt grubu olusturulmustur ve CLBA ile taranmistir. Vh'ye yönelik PCSK9 antijenine baglanmayi destekleyen ön uç kasetleri, koloni kaldirma ile baglama analizi ile tanimlanmistir ancak Vh orta kasetleri tanimlanmamistir. Vk'ye yönelik ön uç ve orta kasetler, koloni kaldirma ile tanimlanmistir ve ayrica bazi tam Vk klonlari tanimlanmistir (tam Zincirli Vk klonlari ile Vk ön uç kütüphanesinin kontaminasyonu nedeniyle). Her bir kütüphaneden birçok baglayici, bir ELISA analizinde Fab içeren hücre üst fazlarini yeniden onaylamistir ve her bir kütüphaneden birkaç Fab, periplazmik fraksiyonlardan saflastirilmistir ve Forte analizi ile afiniteye göre siralanmistir. PCSK9 baglanmasini destekleyen herhangi bir V-agir orta kasedinin tanimlanmamasi nedeniylei agir zincir CDR2 veya FR3'ünde bütün pozisyonlarda parental murin kalintisini veya en yakin insan germ hatti kalintisini kodlayan iki mutajenik kütüphane olusturulmustur. Bu nedenle gelistirilmis bir insan orta kaset kütüphanesi olusturulmustur, taranmistir ve antijen baglama klonlari tanimlanmistir. Ayri klonlar baglaminda baglamayi destekleyen Vh orta kisminda insan germ hattina yönelik degisiklikler akabinde bir nihai orta kaset olusturmak 'üzere kombine edilmistir ve optimize edilen referans Fab'nin yani sira optimize edilen referans Fab baglaminda bu kasedi içeren bir Fab'nin afinitesinin baglandigi Forte analizi tarafindan dogrulanmistir. Olusturulan kütüphanelerden PCSK9 antijenlerine baglanmayi destekleyen ön uç ve orta insan kasetleri, CLBA tarafindan agir ve hafif zincirlere yönelik basarili bir sekilde tanimlanmistir. Bu baglayicilarin tamami ELISA tarafindan dogrulanmistir akabinde Fab*ler saflastirilmistir ve ForteBio Octet sistemi kullanilarak siralanmistir. Agir ve hafif zincirlere yönelik `üst düzeyli kasetler, köprü PCR araciligiyla bir nihai kütüphanede kombine edilmistir ve PCSKQta baglanmayi destekleyen tam olarak HumaneeredTM teknolojisi ile olusturulan Fab*|er, CLBA tarafindan bu kütüphaneden seçilmistir. Bununla paralel olarak siralamada üstte olan kasetler veya zincirlerin tamami (en iyi Vh ön ucu, gelistirilmis Vh orta kismi ve en iyi tam hafif zincir), yüksek afiniteli baglamayi destekleyeoegi tahmin edilen tek bir Fab SR066 olusturmak üzere birlikte kombine edilmistir. Parent fare mAb NVP-LFU720 ve HumaneeredTM Abs NVP-LGT209, NVP-LGT210 ve NVP-LGT211ie yönelik agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin diziler, sirasiyla Sekiller 1-4=te gösterilir. ForteBio Octet analizi kullanilarak PCSK9 antiienine yönelik tam olarak HumaneeredTM teknoloiisi ile olusturulan Fab'lerin afinitesinin test edilmesi Humaneered TM SR066 Fab ve nihai kombinasyonel kütüphaneden çikarilan 'uç Fab (#1- 2, #3-2 ve #4-2) ifade edilmistir ve saflastirilmistir. Bu dört insan Fabtsinin baglama kinetikleri akabinde ForteBio Octet sistemi (Tablo 1tde kisaca açiklanan sayisal veriler) kullanilarak optimize edilen referans Fab SR038iin kinetikleri ile karsilastirilmistir. Tablo 1 PCSK9'a y'önelik tam olarak HumaneeredTM teknolojisi ile olusturulan Fab"lerin afinitesi Fab ka kd Ko SR038 1,39E3 5,12E-4 3,69E-7 SR066 3,25E3 1,08E-3 3,33E-7 #1-2 6,91E3 2,16E-3 3,13E-7 #3-2 5,92E3 1,46E-3 2,47E-7 *** Güvenilir kinetik verilerini olusturmak üzere #4-2 Fab'nin yeterli baglanmasi tespit edilmemistir. Bu Fab'lere yönelik protein konsantrasyonunun belirlenmesi zordur; böylece off-orani (kd) verileri, on-orani (ka) ve KD verilerinden çok daha güvenilirdir (sadece off-oranlari, konsantrasyondan bagimsizdir). Test edilen dört HumaneeredTM Fab5in tamaminin optimize edilen Fabininkine göre 3- ila 4-kati "daha kötü" (diger bir ifadeyle. daha hizli) olan off-oranlarina sahip oldugu görülmüstür. Afinitedeki bu düsüs, olasi bir sekilde orijinal agir zincir ön uc kaset kütüphanesinden seçilen Fab baglayicilarinin tamaminin optimize edilen referans Fab'a (veriler gösterilmez) göre "kötü" off-oranlarina sahip oldugunun görülmesi nedeniyle bu klonlardaki agir zincir ön uçlarindan kaynaklanmistir. Agir zincir ön ucunun CDR1 içermesi nedeniyle Vh `On uç kasetlerinde bu CDRSde yapilan degisiklikler, nihai HumaneeredTM Fab'lerin azalan afinitesine yönelik olasi bir nedendir. Tam olarak HumaneeredT'V' teknoljisi ile olusturulan Fab'ler arasindan SR066, en iyi off- oranina (Tablo 1) sahip olmustur ve agir zincir CDR1iinde SR066 ile referans (fare) dizisi arasinda üç farklilik mevcuttur. CDRH1'de yapilan degisikliklerin bütün HumaneeredT'V' teknoljisi ile olusturulan Fab'lerde görülen afinitedeki azalmadan sorumlu oldugu fikrini test etmek amaciyla orijinal murin kalintilarini eslestirmek 'üzere SROSG'nin CDRH1'inde bir seferde iki kalinti es zamanli olarak geri degistirilmistir ve Forte kinetik analizine yönelik degistirilen bu Fab'ler ifade edilmistir ve saflastirilmistir. CDRH1 (SR079) içindeki iki es zamanli degisiklik ile bir Fab (Tablo 2), SR066'nin baglanma kinetiklerini önemli derecede gelistirmistir (sayisal veriler Tablo 3'te kisaca açiklanir). Aslinda SR079 Fab'in optimize edilen referans (fare) Fab SR038 ile esdeger olan bir off-oranina sahip oldugu görülmüstür. Tablo 2 CDRH1 varyant Fab SR079**un CDRH1 dizisi SR066 (humaneered) TYYMN SEQ ID NO:64 SR038 (fare) DMYMS SEQ ID NO:65 SR079 (humaneered) TMYMS SEQ ID NO:66 *Insan (SR066 türevli) veya degismez kalintilar koyu yazilir; murin kalintilari normal fonttadir. Tablo 3 PCSK9'a yonelik SR079 Fab'inin afinitesi Fab ka kd KD SR038 2,69E3 3,68E-4 1,37E-7 SR079 6,01 E3 3,26E-4 5,42E-8 HumaneeredTM Fab'lei' SR066, #1-2, #3-2 ve #4-2, orijinal fare antikorundan gelen CDRH2 içinde bir "Asn-Gly" ("NG") amino asit dizisini içermistir. Bu dizinin potansiyel olarak üretime yönelik istenmeyen bir özellik olan deamidasyona maruz kaldigi bilinir. Bu nedenle ayni zamanda HumaneeredTM SR066 Fab'nin afinitesini gelistirmek üzere çaba gösterilmesi nedeniyle iki mutajenik kütüphane, SR066 baglaminda olusturulmustur, burada "N" veya "",G orijinal amino asit haricinde mümkün olan her amino asit ile sübstitüe edilmistir (örnegin, "N uzaklastirma kütüphanesinde" "",N "N" haricinde her amino asit ile sübstitüe edilmistir). Bu kütüphaneden Fab içeren hücre üst fazlari akabinde "NG" dizisine sahip olmayan ancak baglamanin SR066 seviyesini (optimize edilen referans Fab SR038'inkinden az olan) muhafaza eden klonlari tanimlamak üzere ELISA tarafindan taranmistir. "N uzaklastirma kütüphanesi", SR066 ile ayni ölçüde baglanan herhangi bir Fab'yi vermemistir ancak "G uzaklastirma kütüphanesi", "G" pozisyonunda birkaç farkli sübstitüsyona sahip olan yeterli baglama seviyeleri olan Fab'leri vermistir. Bunlar arasindan "NG" ila "NE", "NA" ve "NM" degisikliklerine sahip olan Fab'ler, saflastirma ve Forte kinetik analizine yönelik seçilmistir ve parent Fab SROBö'ninki ile benzer kinetiklere sahip oldugu bulunmustur. Afiniteyi gelistirmek üzere 7472 insan IqG'sinin gelistirilmesi Vk gelistirme Tam olarak insan lgG'si olusturmak amaciyla CDRH2'ye kadar SR079iun Vh dizisi (gelismis afiniteye sahip olan SR066'nin modifiye edilmis versiyonu) çogaltilmistir ve köprü PCR tarafindan FR47ün çogu araciligiyla CDRH2'den bir "G uzaklastirma kütüphanesi" klonunun (CDRH2ide "NE" içeren) dizisine baglanmistir. Bu Vh dizisi, pSRO74 olusturmak üzere Nrul (5') ve Kpnl (13') üzerinde pRSSa-hlgG1 LALA + Kpnl (Vh'nin amino asit dizisini etkilemeksizin FR4 içinde bir Kpnl alani eklemek üzere modifiye edilen sessiz IgG1 klonlama vektörü) içinde klonlanmistir. SR066idan Vk (FR1*den kismen FR4›e kadar) çogaltilmistir ve p8R072 olusturmak üzere Agel ve BsiWI üzerinde pRSSa-hkappa içinde klonlanmistir. Bu vektörler, dizi olusturularak dogrulanmistir ve 293 Freestyle hücrelerinde birlikte transfekte edilmistir. Bu IgG ("7472" olarak refere edilen), antikor içeren hücre ortamdan saflastirilmistir. Sasirtici bir sekilde antikor 7472, Biacore analizi (gösterilmez) tarafindan parental fare antikoru LFU720Sden 'önemli derecede daha yavas bir on-oranina sahiptir. Her bir insan zinciri tamamlayici parental fare zinciri ile degistirilerek bu on-orani kusurunun insan hafif zinciri ile ilgili bir sorundan kaynaklandigi belirlenmistir. Afiniteyi kurtarmak üzere pSR072 insan hafif zincirine degisiklikler yapilmistir (Tablo 4): hafif zincirin birinci dört kalintisi, fare dizisine geri dönüstürülmüstür ve CDR1'in ikinci yarisindaki kalintilar, fareye geri dönüstürülmüstür. Bu hafif zincir, pJG1O ve pJG01*i olusturmak üzere yukarida açiklandigi üzere pRSSa-hkappa içinde klonlanmistir ve tam bir IgG, pSRO74 (Hc vektörü) ve pJG10 (LC vektbrü) veya pJGO1'in (LC vektörü) birlikte transfeksiyonu ile olusturulmustur. Bu degisiklikler birlikte Biacore ile belirlendigi üzere HumaineeredTM antikorlarin afinitesini kismi olarak kurtarmistir. Tablo 4 lgG 7472 hafif zincire yapilan degisiklikler LC N terminusu (SEQ ID NO:) LC CDR1 (SEQ ID NO:) 7472 EIVM (6_7) 7472 RASQSVSSSHVA @g LFU720 QIVL (Q) LFU720 SASSSVS--YMH (E) pJGlO QIVL @i pJG10 RASQSVS--YMH (H) Tablo 4, insan antikoru 7472, parental fare antikoru LFU7207nin hafif zincirlerinin kisimlarinin ve pJGlO ile kodlanan hafif zincirinin hizalanmalarini gösterir. Bu kisim, pJG01 ile kodlanan hafif zincir ile özdestir. Hafif zincir vektörleri, nihai HumaneeredTM antikorlar NVP-LGT209, NVP-LGT210 ve NVP-LGT-211'nin ifaesine yönelik kullanilmistir. CDRH3'ün Afinite Olgunlasmasi Hafif zincir degisiklikleri ile paralel olarak bir Fab kütüphanesi, pSRO74 agir zincirin CDR3'ünün afinitesini olgunlastirmak üzere olusturulmustur. Bu kütüphanede CDR3 kalintilari, orijinal kalinti hariç olmak üzere diger her amino asit ile ayri olarak sübstitüe edilmistir. Bu kütüphane, CLBA tarafindan taranmistir, baglayicilar ELISA tarafindan dogrulanmistir ve ortaya çikan Fab*ler saflastirilmistir ve bunlarin parental insan Fab'sine göre gelismis baglama kinetiklerine sahip olup olmadigini belirlemek üzere biyo-katman interferometre ile test edilmistir. Afiniteyi önemli derecede gelistirmeyen bir CDRHS sübstitüsyonu tanimlanmistir: bir A ile N degisikligi (Tablo 5). Bu degisiklik akabinde pSRO74 agir zincir IgG ifade plazmidi baglaminda yapilmistir; bu yeni yapi, pJG04 olarak adlandirilmistir. Nihai HumaneeredTM antikor NVP-LGT209 (LGT209), pJGO4 (Hc) ve pJG10'un birlikte transfeksiyonu akabinde saflastirma ile olusturulmustur. Nihai HumaneeredTM antikor NVP-LGT21O (LGT210), pJGO4 (HC) ve pJGO15un birlikte transfeksiyonu akabinde saflastirma ile olusturulmustur. Bu degisiklik, antikor NVP-LGT211ie (LGT211) eklenmemistir. Tablo 5 lgG 7472 agir zincir CDR3'i'me yapilan degisiklikler CDRH3 dizisi SEO ID NO: 7472 CARSYYYYAMDY 7_2 LFU720 CARSYYYYAMDY 7_2 pJGO4 CARSYYYYNMDY E Tablo 5, insan antikoru 7472, parental fare antikoru LFU720'nin agir zincir CDRSS'un'un ve pJGO4 tarafindan kodlanan agir zincirin (nihai Humaneered TM antikorlar NVP-LGT209 ve NVP-LGT210run ifadesine yönelik kullanilan agir zincir vektörü) hizalanmalarini gösterir. A ila N sübstitüsyonunun alti çizgilidir. Solüsvon Denqe Titrasvonu (SET) sistemi kullanilarak NVP-LGT209, NVP-LGT21O ve NVP-LGT211'in baglanma kinetiklerinin analizi SET analizi kullanilarak NVP-LGT209, NVP-LGT210 ve NVP-LGT211 antikorlarinin insan PCSK95una baglanma afinitelerinin Tablo 6*da gösterildigi 'üzere 150-190 pM arasinda oldugu belirlenmistir. Bu, solüsyon içinde antikorlar ile PCSK9 arasinda yüksek afinite etkilesimi önerir. Tablo 6 Antikor KD [pM] LGT209 190 ± 50 LGT210 150 ± 50 LGT211 190 ± 50 ELISA tarafindan NVP-LGT2091un antiien spesifikliginin analizi Parental fare antikoru LFU720'nin antijen spesifikliginin nihai HumaneeredT'V' IgG'Ier, LGT209, LGT210 ve LGT211 içinde muhafaza edilip edilmedigini test etmek amaciyla insan ve fare antijenlerinin (ayrica insan PCSK9ru) bir paneline karsi antikorlarin baglanmasi, bir ELISA analizinde test edilmistir. Bu analizin sonuçlari (Sekiller 5A-C), murin antikoru LFU720 ile benzer sekilde LGT209, LGT210 ve LGT211'in PCSKQ'a yönelik yüksek spesifikligi muhafaza ettigini gösterir. ELISArda insan ve sinomolqus makak Pcsk9 proteinine antikor baglanmasi LGT209, LGT210 ve LGT211, insan ve sinomolgus makak (sino) Pcsk95una spesifik baglanmaya yönelik degerlendirilmistir. Bu ELISA analizi, parental fare antikoru LFU720 gibi HumaneeredTM antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211'in benzer bir sekilde insan ve sino Pcsk9runa baglanabildigini (Sekiller 6A-C) gösterir. Biyo-katman interferometre temelli epitop rekabet analizi Parent murin antikoru NVP-LFU720'nin epitop spesifikliginin nihai HumaneeredTM antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211'de muhafaza edilip edilmedigini test etmek amaciyla ForteBio Octet sistemi kullanilarak bir rekabet analizi gelistirilmistir. HumaneeredTM antikorlarinin orijinal murin antikorunun epitop spesifikligini muhafaza ettigini gösterecek sekilde HumaneeredTM antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211, parental fare antikoru NVP-LFU720'nin baglanmasini bloke eder. Antikorlarin yüklenme sirasi degistirildiginde, diger bir ifadeyle birinci olarak NVP-LFU720 akabinde HumaneeredTM antikoru baglandiginda benzer sonuçlar elde edilmistir. Humaneered TM antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211*in amino asit dizisi ve insan qerm hatti dizisi ile özdeslik yüzdesi Nihai HumaneeredTM IgG LGT209, LGT210 ve LGT211rin degisken bölge amino asit dizileri, sirasiyla Sekiller 2-4'te gösterilir; CDR'ler alti çizgili ve koyu yazilmistir. Nükleotid dizileri, dizi listesinde mevcuttur. Antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211'e yönelik insan germ hatti dizileri ile özdeslik yüzdesi, tek bir insan germ hatti dizisine (sirasiyla Vh1 1-02 ve Vk3 A27; Tablo 7) karsi Vh ve Vk amino asit dizileri hizalanarak belirlenmistir. CDRH3 ve CDRL3'teki kalintilar, her bir zincire yönelik hesaplamadan çikartilmistir. Tablo 7 Antikorlar LGT209, LGT210 ve LGT211'in insan germ hatti dizileri ile özdeslik yüzdesi Vh1 1-02tye karsi Vh Vk3 A27'ye karsi Vk 89% 91% Humaneered antikorlarin fonksiyonel karakterizasyonuna iliskin ek bilgi, Sekiller 8-14'ün sekil açiklamalarinda ele alinir. Ornek 3: PCSK9 An_tagonist Antikorlari NVP-@09. NVP-@10 ve NVP- LGT211,in Mutasyon Analizi PCSK9 Antagonist Antikorlari NVP-LGT209, NVP-LGT210 ve NVP LGT211'in varyantlari, PCSK9,a baglanma yeteneklerine yönelik degerlendirilmistir. Sonuçlar asagida kisaca açiklanir: Agir zincir CDR1'i, TMYMS'ye (SEO ID NO:66) iliskin olarak sadece orijinal fare kalintilarini (koyu yazilmis) içeren klonlar, fare Abisinin (biyokatman interferometre analizi ile belirlendigi üzere) baglanma kinetiklerini muhafaza eder. Bu nedenle agir zincir CDR1'inde bu kalintilar baglamada bir rol oynar. Agir zincir CDR2'si, RIDPANgHTNYAQKFQG'ye (SEO ID NO:74) iliskin olarak koyu yazilmis kalintilar, orijinal (fare) kalintiyi veya her bir pozisyonda (ELISA tarafindan taranan) en yakin insan germ hatti dizisinde karsilik gelen kalintiyi kodlayan bir kütüphaneden çikarilan antikor baglayicilarinda degistirilmememistir. Bu nedenle koyu yazilmis kalintilar, baglamada bir rol oynar. Korunumlu sübstitüsyonlar, alti çizgili Glu kalintisi ile gösterilen pozisyonda tolere edilir, 'Örnegin bu pozisyon, ELISA tarafindan belirlendigi ve biyokatman interferometre ile dogrulandigi `üzere A, E veya D olabilir. Agir zincir CDR3'ü, SYYYY(AIN)MDrye (SEO ID NO:75) iliskin olarak koyu yazilmis kalintilar, her bir pozisyonda bütün amino asit olasiliklarini (orijinal aa haricinde) kodlayan bir afinite olgunlasmasi kütüphanesinden çikarilan kolonlarda degistirilmememistir. Bu nedenle koyu yazilmis kalintilar, baglamada bir rol oynar. Korunumlu sübstitüsyonlar, alti çizgili Ala veya Asn kalintisi ile gösterilen pozisyonda tolere edilir, örnegin bu pozisyon, Biacore ile belirlendigi üzere A, N veya O olabilir. Korunumlu sübstitüsyonlar, alti çizgili Tyr kalintisi ile gösterilen pozisyonda tolere edilir, örnegin bu pozisyon, Biacore tarafindan belirlendigi üzere A, F, S, V veya Y olabilir. Hafif zincir FR1'i, (g/Q)IV(M/L)TOSPATLSVSPGERATLSC'ye (SEO ID NO:76) iliskin olarak korunumlu sübstitüsyonlar, Biacore ile belirlendigi 'üzere alti çizgili pozisyonlar 1 ve Me tolere edilir. Ornegin pozisyon 1'de amino asit, A, D, E, N veya Q olabilir. Pozisyon 4ite amino asit, V, l, L veya M olabilir. OIVL (SEO ID NO:69) (fare parent LFU720, LGT209 ve LGT211 Vkide oldugu gibi) olarak pozisyonlar 1-4, Biacore ile belirlendigi 'üzere EIVM (SEO ID NO:67) (LGT21O Vk'de oldugu gibi) olarak pozisyonlar 1-4 'üzerinde baglanmayi gelistirmistir. Hafif zincir CDR1=i, RASOSVSYMH'ye (SEO ID NO:71) iliskin olarak LC CDR1iin bu kisminda 2 ekstra amino asidi olan bir insan klonunun afinite açisindan riske atilmasi nedeniyle koyu yazilmis kalintilarin boslugu baglamaya yönelik sonuçlara sahip olmustur. Bu nedenle koyu yazilmis kalintilar, baglamada bir rol oynar. Hafif zincir CDRS'U, LOWSSDPPT'ye (SEO ID NO:26) iliskin olarak bu pozisyonlarda insan germ hattina yönelik degisiklikler, ELISA ile belirlendigi üzere tolere edilmez. Bu nedenle koyu yazilmis kalintilar, baglamada bir rol oynar. TR TR TR TR

Claims (18)

ISTEMLER
1. Proprotein konvertaz su btilisin/keksin tip 9'a (PCSK9) baglanan bir antikor olup, özelligi antikorun asagidakileri içermesidir: bir agir zincir degisken bölge ve bir hafif zincir degisken bölge, burada agir zincir degisken bölge ve hafif zincir degisken bölgenin her biri asagidaki 'üç tamamlayicilik belirleme bölgesini (CDR'Ier) içerir: CDR1, CDR2 ve CDR3; burada: i) agir zincir degisken bölgenin CDR1ri, SEQ ID NO:6inin amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEQ ID NO:9'un amino asit dizisini iii) agir zincir degisken bölgenin CDRS'U, SEQ ID NO:13*'ûn amino asit dizisini iv) hafif zincir degisken bölgenin CDR1ii, SEQ ID NO:2OJnin amino asit dizisini v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEQ lD NO:23'ün amino asit dizisini vi) hafif zincir degisken bölgenin CDR35`ü, SEQ ID NO:26'nin amino asit dizisini veya burada: I) agir zincir degisken bölgenin CDR1ri, SEQ ID NO:7'nIn amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2rsi, SEQ ID NO:10fun amino asit dizisini iii) agir zincir degisken bölgenin CDRS'U, SEQ ID NO:12 veya SEQ ID NO:13"ün amino asit dizisini içerir; iv) hafif zincir degisken bölgenin CDRl'i, SEQ ID NO:21'in amino asit dizisini v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEQ lD NO:24rL`in amino asit dizisini vi) hafif zincir degisken bölgenin CDRSSÜ, SEQ ID NO:26'nin amino asit dizisini
2. istem 1'in antikorudur, burada: i) agir zincir degisken bölgenin CDR1'i, SEQ ID NO:6'nin amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEQ ID NO:9,un amino asit dizisini iii) agir zincir degisken bölgenin CDRSSÜ, SEO ID NO:13*ün amino asit dizisini iv) hafif zincir degisken bölgenin CDR1'i, SEO ID NO:20rnin amino asit dizisini v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO ID NO:23'ün amino asit dizisini vi) hafif zincir degisken bölgenin CDR31'ü, SEO ID NO:26'nin amino asit dizisini
3. istem 1'in antikorudur, burada: i) agir zincir degisken bölgenin CDR1Yi, SEO ID NO:7'nin amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2rsi, SEO ID NO:10fun amino asit dizisini iii) agir zincir degisken bölgenin CDRS'ü, SEO ID NO:12'nin amino asit dizisini iv) hafif zincir degisken bölgenin CDR1'i, SEO ID NO:21fin amino asit dizisini v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO ID NO:24'ün amino asit dizisini vi) hafif zincir degisken bölgenin CDRS'ü, SEO lD NO:26'nin amino asit dizisini
4. istem 1'in antikorudur, burada: i) agir zincir degisken bölgenin CDR17i, SEO ID NO:7'nin amino asit dizisini içerir; ii) agir zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO ID NO:10'un amino asit dizisini iii) agir zincir degisken bölgenin CDR3>ü, SEO lD NO:13*ün amino asit dizisini iv) hafif zincir degisken bölgenin CDR1ri, SEO ID NO:217in amino asit dizisini v) hafif zincir degisken bölgenin CDR2'si, SEO ID NO:24r'ün amino asit dizisini vi) hafif zincir degisken bölgenin CDR3*'ü, SEO ID NO:26'nin amino asit dizisini
5. Istem irin antikoru olup, özelligi antikorun SEO ID NO:1'in bir agir zincir degisken bölgesini ve SEO ID NO:15'in bir hafif zincir degisken bölgesini içermesidir.
6. Istem 1rin antikoru olup, özelligi antikorun SEQ ID NO:2'nin bir agir zincir degisken bölgesini ve SEO ID NO:16*nin bir hafif zincir degisken bölgesini içermesidir.
7. Istem 1rin antikoru olup, özelligi antikorun SEQ ID NO:2'nin bir agir zincir degisken bölgesini ve SEO ID NO:18iin bir hafif zincir degisken bölgesini içermesidir.
8. Istem 1'in antikoru olup, özelligi antikorun SEQ ID NO:4r'un bir agir zincir degisken bölgesini ve SEO ID NO:16'nin bir hafif zincir degisken bölgesini içermesidir.
9. Istem 1'in antikoru olup, özelligi antikorun SEQ ID NO:3r'un bir agir zincir degisken bölgesini ve SEO ID NO:17'nin bir hafif zincir degisken bölgesini içermesidir.
10. Istem 1iin antikoru olup, özelligi antikorun SEQ ID NO:3'ün bir agir zincir degisken bölgesini ve SEO ID NO:19'un bir hafif zincir degisken bölgesini içermesidir.
11. Istem 1'in antikoru olup, özelligi antikorun SEO ID NO:5'in bir agir zincir degisken bölgesini ve SEO ID NO:17'nin bir hafif zincir degisken bölgesini içermesidir.
12. Istemler 1 ila 11'den herhangi birine göre antikor olup, özelligi antikorun bir FAb' fragmani olmasi veya antikorun bir lgG olmasi veya antikorun tek zincirli bir antikor olmasi veya antikorun insan sabit bölgelerini içermesi veya antikorun bir tasiyici proteine baglanmasi veya antikorun PEGiIe olmasi veya antikorun hümanize edilmesidir.
13. Istem 1'in bir antikorunu ve fizyolojik olarak uyumlu bir eksipiyani içeren bir bilesimdir.
14. Istem 13)'un bilesimi olup, özelligi bilesimin ayrica bir kiside düsük yogunluklu
15. Istem 1=in antikorunun terapötik olarak etkili bir miktari olup, özelligi buna ihtiyaci olan bir kiside LDL-C'nin düsürülmesine yönelik bir yöntemde kullanima yönelik olmasidir.
16. istem 15Se göre kullanima yönelik antikor olup, özelligi kisinin statin terapisine hiporesponsif veya dirençli olmasi veya kisinin statin terapisine toleranssiz olmasi veya kisinin en az yaklasik 100 mg/dL bir referans LDL-C seviyesine sahip olmasi veya kisinin ailesel hiperkolesterolemiye sahip olmasi veya toplam kolesterolün LDL-C ile düsürülmesi veya kisinin trigliseridemiye sahip olmasi veya kisinin fonksiyon kazanci PCSK9 gen mutasyonuna sahip olmasi veya kisinin ilaç indüklü dislipidemiye sahip olmasidir.
17. istem 16'ya göre kullanima yönelik antikor olup, 'özelligi söz konusu antikorun LDL-Onin düsürülmesinde etkili olan ikinci bir ajanin terap'otik olarak etkili bir miktarinin kisiye uygulanmasina yönelik olmasidir.
18. istem 16*ya göre kullanima yönelik antikor veya istem 14,e göre bilesim olup, özelligi ikinci ajanin bir statin olmasidir, tercihen burada statin, atorvastatin, serivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rosuvastatin ve simvastatinden olusan gruptan seçilir veya burada ikinci ajan, fibratlar, niasin ve bunun analoglari, kolesterol absorpsiyon inhibitörleri, safra asidi katkilari, tiroid hormonu mimetikleri, bir mikrozomal trigliserit transfer proteini (MTP) inhibitörü, bir diasilgliserol asiltransferaz (DGAT) inhibitörü, bir inhibitör nükleik asit hedefleyici PCSK9 ve bir Inhibitör nükleik asit hedefleyici apoB100'den olusan gruptan seçilir.
TR2019/06696T 2009-12-11 2010-12-10 Pcsk9 antagoni̇stleri̇ TR201906696T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US28594209P 2009-12-11 2009-12-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201906696T4 true TR201906696T4 (tr) 2019-05-21

Family

ID=43466865

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/06696T TR201906696T4 (tr) 2009-12-11 2010-12-10 Pcsk9 antagoni̇stleri̇

Country Status (32)

Country Link
US (1) US8710192B2 (tr)
EP (1) EP2510013B1 (tr)
JP (2) JP5981347B2 (tr)
KR (1) KR101915496B1 (tr)
CN (1) CN102652139B (tr)
AR (1) AR079336A1 (tr)
AU (1) AU2010327924B2 (tr)
BR (1) BR112012013782A8 (tr)
CA (1) CA2781050C (tr)
CL (1) CL2012001529A1 (tr)
CO (1) CO6571886A2 (tr)
CR (1) CR20120371A (tr)
CU (1) CU24058B1 (tr)
EA (1) EA032084B1 (tr)
EC (1) ECSP12012034A (tr)
ES (1) ES2726040T3 (tr)
GT (1) GT201200189A (tr)
HN (1) HN2012001223A (tr)
IL (1) IL220091A0 (tr)
IN (1) IN2012DN05237A (tr)
MA (1) MA33903B1 (tr)
MX (1) MX2012006648A (tr)
NZ (2) NZ625433A (tr)
PE (1) PE20121361A1 (tr)
PH (1) PH12012501148A1 (tr)
PL (1) PL2510013T3 (tr)
PT (1) PT2510013T (tr)
TN (1) TN2012000243A1 (tr)
TR (1) TR201906696T4 (tr)
TW (1) TWI523662B (tr)
UY (1) UY33102A (tr)
WO (1) WO2011072263A1 (tr)

Families Citing this family (138)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JOP20080381B1 (ar) * 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).
US20130064834A1 (en) 2008-12-15 2013-03-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia using antibodies to pcsk9
BR112013018877A2 (pt) 2011-01-28 2016-10-04 Sanofi Sa composições farmacêuticas que compreendem anticorpos humanos para pcsk9
WO2012131504A1 (en) * 2011-03-02 2012-10-04 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
AR088782A1 (es) * 2011-04-29 2014-07-10 Sanofi Sa Sistemas de ensayo y metodos para identificar y caracterizar farmacos hipolipemiantes
WO2012168491A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
WO2012170607A2 (en) * 2011-06-10 2012-12-13 Novartis Ag Use of pcsk9 antagonists
CN104093423A (zh) * 2011-07-14 2014-10-08 辉瑞公司 使用抗pcsk9抗体的治疗
AR087305A1 (es) 2011-07-28 2014-03-12 Regeneron Pharma Formulaciones estabilizadas que contienen anticuerpos anti-pcsk9, metodo de preparacion y kit
AU2012308797B2 (en) 2011-09-16 2017-06-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lipoprotein(a) levels by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PSCK9)
AR087715A1 (es) 2011-09-16 2014-04-09 Lilly Co Eli Anticuerpos anti pcsk9 y usos de los mismos
CN104220460A (zh) 2011-12-08 2014-12-17 安姆根有限公司 激动人lcat抗原结合蛋白和它们在疗法中的用途
CA2859226C (en) * 2011-12-20 2020-07-21 Adaerata, Limited Partnership Single domain antibodies as inhibitors of pcsk9
US9255154B2 (en) * 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
CN104364266A (zh) * 2012-06-15 2015-02-18 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗-pcsk9抗体,制剂,剂量给药,和使用方法
CN104540852B (zh) 2012-08-13 2018-10-02 瑞泽恩制药公司 具有pH-依赖性结合特性的抗-PCSK9抗体
EP2703009A1 (en) * 2012-08-31 2014-03-05 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
EP2706070A1 (en) * 2012-09-06 2014-03-12 Sanofi Combination treatments involving antibodies to human PCSK9
EP2922590B1 (en) 2012-11-21 2020-02-05 Amgen Inc. Drug delivery device
US10287317B2 (en) * 2013-02-15 2019-05-14 Srx Cardio, Llc Proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9) allosteric binding ligands to modulate serum low density lipoprotein (LDL) levels
BR112015022042B1 (pt) 2013-03-15 2023-01-10 Amgen Inc Injetor para injetar um produto terapêutico
CA2904661C (en) 2013-03-15 2022-03-15 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
CA2904725C (en) 2013-03-15 2022-04-12 Amgen Inc. Drug cassette, autoinjector, and autoinjector system
CA2897825C (en) 2013-03-22 2022-05-24 Scott R. Gibson Injector and method of assembly
TWI682780B (zh) * 2013-05-30 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 醫藥組成物用於製造治療與ｐｃｓｋ９功能獲得性突變有關之體染色體顯性高膽固醇血症的藥物之用途
US10111953B2 (en) 2013-05-30 2018-10-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing remnant cholesterol and other lipoprotein fractions by administering an inhibitor of proprotein convertase subtilisin kexin-9 (PCSK9)
TW202021614A (zh) 2013-06-07 2020-06-16 法商賽諾菲生物技術公司 藉由投與ｐｃｓｋ９抑制劑抑制動脈粥狀硬化的方法
EP2862877A1 (en) 2013-10-18 2015-04-22 Sanofi Methods for inhibiting atherosclerosis by administering an inhibitor of PCSK9
US20150004174A1 (en) * 2013-06-28 2015-01-01 Amgen Inc. Methods for treating homozygous familial hypercholesterolemia
CA2920894C (en) 2013-10-24 2023-03-14 Amgen Inc. Injector and method of assembly
MX2016005315A (es) 2013-10-24 2016-08-11 Amgen Inc Sistema de administracion de farmacos con control sensible a la temperatura.
AU2014348765A1 (en) 2013-11-12 2016-06-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Dosing regimens for use with PCSK9 inhibitors
US9914769B2 (en) 2014-07-15 2018-03-13 Kymab Limited Precision medicine for cholesterol treatment
US8945560B1 (en) 2014-07-15 2015-02-03 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US9067998B1 (en) 2014-07-15 2015-06-30 Kymab Limited Targeting PD-1 variants for treatment of cancer
US9017678B1 (en) 2014-07-15 2015-04-28 Kymab Limited Method of treating rheumatoid arthritis using antibody to IL6R
US8986694B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Targeting human nav1.7 variants for treatment of pain
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
FR3014695A1 (tr) * 2013-12-17 2015-06-19 Kymab Ltd
US9034332B1 (en) 2014-07-15 2015-05-19 Kymab Limited Precision medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8992927B1 (en) 2014-07-15 2015-03-31 Kymab Limited Targeting human NAV1.7 variants for treatment of pain
US9045548B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision Medicine by targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9051378B1 (en) 2014-07-15 2015-06-09 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9023359B1 (en) 2014-07-15 2015-05-05 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US9045545B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision medicine by targeting PD-L1 variants for treatment of cancer
DE202014010499U1 (de) 2013-12-17 2015-10-20 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
US8883157B1 (en) 2013-12-17 2014-11-11 Kymab Limited Targeting rare human PCSK9 variants for cholesterol treatment
US10994112B2 (en) 2014-02-05 2021-05-04 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
CA2945026C (en) 2014-05-07 2023-10-10 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
IL297356A (en) 2014-06-03 2022-12-01 Amgen Inc Controllable drug delivery system and method of use
EP4328245A3 (en) 2014-07-15 2024-06-05 Kymab Ltd. Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
US9150660B1 (en) 2014-07-15 2015-10-06 Kymab Limited Precision Medicine by targeting human NAV1.8 variants for treatment of pain
US9139648B1 (en) 2014-07-15 2015-09-22 Kymab Limited Precision medicine by targeting human NAV1.9 variants for treatment of pain
DE202015009002U1 (de) 2014-07-15 2016-08-18 Kymab Limited Targeting von humaner PCSK9 zur Cholesterinbehandlung
EP3332790A1 (en) 2014-07-15 2018-06-13 Kymab Limited Antibodies for use in treating conditions related to specific pcsk9 variants in specific patients populations
JP2017528427A (ja) 2014-07-16 2017-09-28 サノフィ・バイオテクノロジー ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ｈｅＦＨ）を有する患者を処置するための方法
WO2016023916A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
WO2016046684A1 (en) * 2014-09-23 2016-03-31 Pfizer Inc. Treatment with anti-pcsk9 antibodies
WO2016061220A2 (en) 2014-10-14 2016-04-21 Amgen Inc. Drug injection device with visual and audio indicators
WO2016071701A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Kymab Limited Treatment of disease using ligand binding to targets of interest
US10799630B2 (en) 2014-12-19 2020-10-13 Amgen Inc. Drug delivery device with proximity sensor
JP2017538512A (ja) 2014-12-19 2017-12-28 アムジエン・インコーポレーテツド ライブボタンまたはユーザインタフェースフィールドを含む薬物送達装置
WO2016133947A1 (en) 2015-02-17 2016-08-25 Amgen Inc. Drug delivery device with vacuum assisted securement and/or feedback
EP3261690B1 (en) 2015-02-27 2021-12-15 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a tunable threshold of resistance to needle guard movement
WO2016150444A1 (en) * 2015-03-20 2016-09-29 Aarhus Universitet Inhibitors of pcsk9 for treatment of lipoprotein metabolism disorders
CN106084058B (zh) * 2015-07-15 2019-08-27 北京天广实生物技术股份有限公司 抗人pcsk9单克隆抗体
CA2995645A1 (en) 2015-08-18 2017-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-pcsk9 inhibitory antibodies for treating patients with hyperlipidemia undergoing lipoprotein apheresis
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
ES2755717T3 (es) 2015-12-09 2020-04-23 Amgen Inc Autoinyector con tapa de señalización
WO2017114230A1 (zh) 2015-12-31 2017-07-06 江苏恒瑞医药股份有限公司 Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
HK1243439A1 (zh) 2016-01-05 2018-07-13 江苏恒瑞医药股份有限公司 Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
WO2017120178A1 (en) 2016-01-06 2017-07-13 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
US11200298B2 (en) 2016-03-15 2021-12-14 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
CN105801701B (zh) * 2016-03-31 2019-03-29 河北仁博科技有限公司 一种pcsk9抗体的重链和轻链可变区及其应用
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
MX2018013616A (es) 2016-05-13 2019-02-21 Amgen Inc Montaje de cubierta protectora de vial.
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
US11541176B2 (en) 2016-06-03 2023-01-03 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
JP7261379B2 (ja) 2016-06-20 2023-04-20 カイマブ・リミテッド 抗ｐｄ－ｌ１抗体
US11285266B2 (en) 2016-07-01 2022-03-29 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
WO2018034784A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
WO2018083248A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
JOP20190112A1 (ar) 2016-11-14 2019-05-14 Amgen Inc علاجات مدمجة لتصلب الشرايين، شاملة مرض قلبي وعائي تصلبي
MX2019008432A (es) 2017-01-17 2019-11-18 Amgen Inc Dispositivos de inyeccion y metodos relacionados de uso y ensamblaje.
US11752258B2 (en) 2017-02-17 2023-09-12 Amgen Inc. Drug delivery device with sterile fluid flowpath and related method of assembly
MX2019009755A (es) 2017-02-17 2019-10-07 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de suministro de farmacos.
JP2020508803A (ja) 2017-03-06 2020-03-26 アムジエン・インコーポレーテツド 作動防止特徴部を備える薬物送達デバイス
US11571511B2 (en) 2017-03-07 2023-02-07 Amgen Inc. Insertion mechanism and method of inserting a needle of a drug delivery device
MX2019010671A (es) 2017-03-09 2019-10-21 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de administracion de farmacos.
JP7118993B2 (ja) 2017-03-28 2022-08-16 アムジエン・インコーポレーテツド プランジャーロッド・シリンジアセンブリシステム及び方法
CA3058567A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Cadila Healthcare Limited Novel peptide based pcsk9 vaccine
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
EP3634546A1 (en) 2017-06-08 2020-04-15 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
AU2018288604B2 (en) 2017-06-22 2023-12-21 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
MX2019015479A (es) 2017-06-23 2020-02-20 Amgen Inc Dispositivo electronico de administracion de farmacos con tapa accionada por un conjunto de conmutador.
JP7408398B2 (ja) 2017-07-14 2024-01-05 アムジエン・インコーポレーテツド 二重ねじりばねシステムを有する針挿入後退システム
EP3655063A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
MA49676A (fr) 2017-07-25 2020-06-03 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament doté d'un système d'accès à un récipient et procédé d'assemblage associé
MA49677A (fr) 2017-07-25 2021-04-21 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament avec module d'engrenage et procédé d'assemblage associé
US12318593B2 (en) 2017-08-09 2025-06-03 Amgen Inc. Hydraulic-pneumatic pressurized chamber drug delivery system
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
MA50614A (fr) 2017-10-06 2020-08-12 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament comprenant un ensemble de verrouillage et procédé d'assemblage associé
EP3694578A1 (en) 2017-10-09 2020-08-19 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
IL273582B2 (en) 2017-11-03 2024-12-01 Amgen Inc Systems and approaches for sterilizing a drug delivery device
EP3707075A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
MA50553A (fr) 2017-11-06 2020-09-16 Amgen Inc Dispositif d'administration de médicament avec détection de positionnement et de débit
EP3706826A1 (en) 2017-11-10 2020-09-16 Amgen Inc. Plungers for drug delivery devices
CA3079540A1 (en) 2017-11-16 2019-05-23 Amgen Inc. Door latch mechanism for drug delivery device
IL273636B1 (en) 2017-11-16 2025-06-01 Amgen Inc Automatic injector with delay and end point sensing
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
EP3826699A1 (en) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023220A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with tacky skin attachment portion and related method of preparation
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US12109389B2 (en) 2018-07-31 2024-10-08 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
AU2019347710B2 (en) 2018-09-24 2025-05-08 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
AU2019350660B2 (en) 2018-09-28 2024-09-26 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
WO2020072698A1 (en) * 2018-10-02 2020-04-09 Exosome Therapeutics, Inc. Compositions and methods for producing exosome loaded therapeutics for treating cardiovascular disease
US12156991B2 (en) 2018-10-02 2024-12-03 Amgen Inc. Injection systems for drug delivery with internal force transmission
WO2020072846A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
EP3866890A1 (en) 2018-10-15 2021-08-25 Amgen Inc. Drug delivery device having damping mechanism
AU2019359801B2 (en) 2018-10-15 2025-01-02 Amgen Inc. Platform assembly process for drug delivery device
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
AU2019370159B2 (en) 2018-11-01 2025-05-29 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
MA54048A (fr) 2018-11-01 2022-02-09 Amgen Inc Dispositifs d'administration de médicament avec rétraction partielle de l'organe d'administration de médicament
SG11202107614PA (en) 2019-01-18 2021-08-30 Astrazeneca Ab Pcsk9 inhibitors and methods of use thereof
EP3958934B1 (en) 2019-04-24 2025-04-09 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
CA3139943A1 (en) 2019-05-17 2020-11-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genome-based methods for reducing cardiovascular risk
MX2022002149A (es) 2019-08-23 2022-03-17 Amgen Inc Dispositivo de suministro de farmacos con componentes de acoplamiento de capuchon de aguja configurable y metodos relacionados.
MX2023013640A (es) 2021-05-21 2023-11-30 Amgen Inc Metodo de optimizacion de una receta de llenado para un contenedor de medicamento.

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5612114B2 (tr) * 1974-06-07 1981-03-18
AU548996B2 (en) 1980-02-04 1986-01-09 Merck & Co., Inc. Tetrahydro-2h-pyran-2-one derivatives
US4444784A (en) * 1980-08-05 1984-04-24 Merck & Co., Inc. Antihypercholesterolemic compounds
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
NO177005C (no) * 1988-01-20 1995-07-05 Bayer Ag Analogifremgangsmåte for fremstilling av substituerte pyridiner, samt mellomprodukter til bruk ved fremstillingen
FI94339C (fi) * 1989-07-21 1995-08-25 Warner Lambert Co Menetelmä farmaseuttisesti käyttökelpoisen /R-(R*,R*)/-2-(4-fluorifenyyli)- , -dihydroksi-5-(1-metyylietyyli)-3-fenyyli-4-/(fenyyliamino)karbonyyli/-1H-pyrroli-1-heptaanihapon ja sen farmaseuttisesti hyväksyttävien suolojen valmistamiseksi
US5177080A (en) * 1990-12-14 1993-01-05 Bayer Aktiengesellschaft Substituted pyridyl-dihydroxy-heptenoic acid and its salts
JP2648897B2 (ja) * 1991-07-01 1997-09-03 塩野義製薬株式会社 ピリミジン誘導体
US20110230392A1 (en) * 1999-10-22 2011-09-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel narc sc1, narc 10a, narc 1, narc 12, narc 13, narc17, narc 25, narc 3, narc 4, narc 7, narc 8, narc 11, narc 14a, narc 15, narc 16, narc 19, narc 20, narc 26, narc 27, narc 28, narc 30, narc 5, narc 6, narc 9, narc 10c, narc 8b, narc 9, narc2a, narc 16b, narc 1c, narc 1a, and narc 25 molecules and uses therefor
CA2399727A1 (en) 2000-02-07 2001-08-09 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Narc-1, subtilase-like homologs
WO2005069970A2 (en) 2004-01-20 2005-08-04 Kalobios, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
ES2744149T3 (es) * 2004-11-16 2020-02-21 Humanigen Inc Intercambio de casetes de la región variable de la inmunoglobulina
US8211648B2 (en) 2005-07-22 2012-07-03 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Secretion of antibodies without signal peptides from bacteria
ES2366973T3 (es) * 2006-05-05 2011-10-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimiento para modular la expresión génica.
EP2584047B1 (en) * 2006-05-11 2014-11-19 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the PCSK9 gene
US20100040611A1 (en) 2006-11-07 2010-02-18 Sparrow Carl P Antagonists of pcsk9
EP2083860A4 (en) 2006-11-07 2010-05-26 Merck Sharp & Dohme PCSK9 ANTAGONISTS
US20100136028A1 (en) * 2006-11-07 2010-06-03 Sparrow Carl P Antagonists of pcsk9
JOP20080381B1 (ar) * 2007-08-23 2023-03-28 Amgen Inc بروتينات مرتبطة بمولدات مضادات تتفاعل مع بروبروتين كونفيرتاز سيتيليزين ككسين من النوع 9 (pcsk9)
AR070315A1 (es) * 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Anticuerpos 1b20 antagonistas de pcsk9
AR070316A1 (es) * 2008-02-07 2010-03-31 Merck & Co Inc Antagonistas de pcsk9 (proproteina subtilisina-kexina tipo 9)
US20120103537A1 (en) 2008-07-25 2012-05-03 Henk Dogger Head rail for a blind
TWI516501B (zh) * 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
US8748115B2 (en) * 2008-12-12 2014-06-10 Merck Sharp & Dohme Corp. PCSK9 immunoassay
JO3672B1 (ar) 2008-12-15 2020-08-27 Regeneron Pharma أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9).

Also Published As

Publication number Publication date
EP2510013B1 (en) 2019-02-13
CA2781050A1 (en) 2011-06-16
CL2012001529A1 (es) 2012-08-03
TW201136605A (en) 2011-11-01
MX2012006648A (es) 2013-05-30
IN2012DN05237A (tr) 2015-10-23
PH12012501148A1 (en) 2017-02-03
GT201200189A (es) 2014-06-06
CU24058B1 (es) 2014-12-26
ES2726040T3 (es) 2019-10-01
AU2010327924A1 (en) 2012-07-05
AR079336A1 (es) 2012-01-18
MA33903B1 (fr) 2013-01-02
EA201200861A1 (ru) 2013-01-30
US8710192B2 (en) 2014-04-29
TN2012000243A1 (en) 2013-12-12
EP2510013A1 (en) 2012-10-17
CU20120095A7 (es) 2013-02-26
TWI523662B (zh) 2016-03-01
BR112012013782A8 (pt) 2017-12-26
US20110142849A1 (en) 2011-06-16
ECSP12012034A (es) 2012-08-31
HN2012001223A (es) 2015-08-24
PE20121361A1 (es) 2012-10-13
EA032084B1 (ru) 2019-04-30
CR20120371A (es) 2016-07-20
KR101915496B1 (ko) 2018-11-08
UY33102A (es) 2011-07-29
IL220091A0 (en) 2012-09-24
PL2510013T3 (pl) 2019-08-30
CO6571886A2 (es) 2012-11-30
WO2011072263A1 (en) 2011-06-16
NZ625433A (en) 2015-12-24
NZ601084A (en) 2014-06-27
JP6297088B2 (ja) 2018-03-20
CA2781050C (en) 2019-06-11
CN102652139B (zh) 2014-11-05
KR20120098873A (ko) 2012-09-05
BR112012013782A2 (pt) 2017-01-10
CN102652139A (zh) 2012-08-29
JP5981347B2 (ja) 2016-08-31
AU2010327924B2 (en) 2014-09-04
JP2016179979A (ja) 2016-10-13
JP2013513620A (ja) 2013-04-22
PT2510013T (pt) 2019-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2010327924B2 (en) PCSK9 antagonists
US20130315927A1 (en) Pcsk9 antagonists
WO2012170607A2 (en) Use of pcsk9 antagonists
AU2011208719C1 (en) Anticoagulant antidotes
AU2011208719B2 (en) Anticoagulant antidotes
WO2012168491A1 (en) Pharmaceutical formulations of pcsk9 antagonists
US20240374671A1 (en) Activin Type 2 Receptor Binding Proteins and Methods of Making Them
AU2018279705A1 (en) Anti-ROBO2 antibodies, compositions, methods and uses thereof
KR20220050182A (ko) 항-cd22 항체 및 그의 용도
CA3214281A1 (en) Antibodies specific to sialic acid-binding ig-like lectin 15 and uses thereof
EP4153313A1 (en) Anti-sars-cov-2 antibodies and uses thereof