SU891648A1 - Октапептид,обладающий способностью специфически ингибировать прессорный эффект и миотропное действие ангиотензина 11 - Google Patents

Description

Поставленна  цель достигаетс  октапептидом формулы 1 ъл I I -v I I- . . s.. га Sar-Ai g-aza-d. -Hva-Tyr-Val-His-Pro-3 где Sar - остаток саркозина; aza-{ -Hva aza-(i -гомо-1-валина - NH-CH-NH-CO- . t ен(сно,)о Все аминокислоты L-конфигурации. Соединение ,отличаетс  от саралазина и других его структурных аналогов дополнительной модификацией в положении 3 (остаток валина в положении 3 заменен на остаток аза-cL-гомовали на), что приводит к понижению пресеорной активности без изменени  сродства к рецепторам ангиотензина II. В опытах in vivo и in vitro соединение I не про вл ет прессорного эффекта , даже при наивысших примен емых концентраци х соединени  I (до 500 мкг/кг). Саралазин же обладает 1 , прессорной активностью природ ного гормона. Таким образом, соединение I имеет существенно улучшенные фармакологиче кие свойства по сравнению с известным ингибитором ангиотензина II, вес ма важные дл  практического применени  Zj, в частности дл  диагностики и терапии рениновых форм гипертониче кой болезни. СоединениеI, синтезировано конден сацией отдельных фрагментов известными методами IkJ согласно схеме. Пр межуточные соединени  (2)-{6) и(10) (18) получены также известными способами Г4}, При этом примен лись бензилоксикарбонильна , нитро.метиль на , трет-бутилоксикарбонилгидразидна , гидразидна , п-нитробензильна  группа. трет-Бутилоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-саркозил-М-нитроаргинил-валина (7) получают карбодиимидным методом ,,конденсиру  бензилоксикарбонил-М-йироаргинин- (5) с трет-бутилоксикарбонилгидразидом валина (6) в присутствии двух моль 1-оксибензотриазола, Защиту гидразидной функции-трет-бутилоксикарбонильную группу соединени  (7) -отщеп л ют трифторуксусной кислотой при комнатной температуре. Азид, получен ный по методу Рудингера из гидразида ( 8) выдерживают в растворе диметилформамида при 60®С 1 ч, 8 таких усло ви х азид полностью перегруппировы (г) ваетс  в изоцианат (9), который без выделени  ввод т в реакцию с аминокомпонентом (18). Защитные группы у полученного октапептида (19) удал ют каталитическим гидрогенолизом. Октапептид I очищают ионообменной хроматографией на СМ-целлюлозе в градиенте ацетата аммони . Состав и однородность полученного аналога доказаны аминокислотным и элементным анализами на хромато- и электрофореграммах имеетс  одно п тно с положительной реакцией на нингидрин, реактив Сакагучи Паули,Рейндел -Хоппе,Эрлиха1 (на уреидную группу). Исследование биологических свойств соединени  I. . Миотропна  активность (1-саркозин, З-аза-с -гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин ) ангиотензина Ц изучалась в опытах in vitro согласно методике van Rossum 5J посредством регистрации изотонических сокращений восход щей ободочной кишки (Colon ascendens ) крыс,  вл ющейс  наиболее чувствительным тест-органом дл  исследовани  миотропной активности ангиотензина II (6) , с использованием модифицированного прибора ВИ6-5МЛ. Агонистические и антагонистические свойства изучак1т в диапазоне консвойства изучают центраций 1(ГН, врем  предварительной экспозиции кишки с исследуемым соединением составл ет 3 мин. При вычислении кумул тивных кривых концентраци  - эффект (КККЭ) примен ют машинную обработку экспериментальных данных (кажда  точка опре дел етс  как средн   из 6 опытов) с определением стандартной ошибки при ,05. Дл  количественной характеристики конкурентного антагонизма (1-саркозин , 3-аза- oL -гомовалин,5-валин, 8-изолейцин) ангиотензина II вычисл ют параметр рЛг. В опытах in vitro соединение I в диапазоне концентраций 10- 1СГМ не про вл ет миотропного эффекта, но в концентраци х 1 вызывает прогрессивное параллельное перемещение КККЭ ангиотензина II в сторону высших концентраций, т.е. про вл ет конкурентный антагонизм с ангиотензином II, характеризующийс  величиной pA(8,60i 0,29. В концентрации исследуемое соединение вызывает понижение высоты КККЭ ангиоконцентраци х 1 П тензина М полностью ингибирует миотропный эффект ангиотензина I (фиг.1). В опытах in vivo регистрируют артериальное давление из общей сонной артерии наркотизированных уретаном белых крыс обоего пола весом 180200 г с помощью ртутного манометра на закопченной ленте кимографа. Qeщества ввод т в бедренную вену в виде инъекций в объеме 0,1 мл/200 г ве са в дозах 0,5-500 мкг/кг. При изучении антагонизма исследуемого соединени  по истечении 1 ми с момента его введени  крысам ввод т ангиотензин И в стандартных дозах 0,5; 2,5 и 5 мкг/кг. Вычисл ют кривые доза-эффект дл  ангиотензина I1 в присутствии и в отсутствии арг тагониста. В опытах in vtvo исследуемое сое динение не обладает прессорной актив ностью, даже при наивысших примен емых концентраци х (до 500 мкг/кг), н значительно ингибирует прессорное де ствие ангиотензина II. В присутствии ( 1-саркозин,3-аза-сС-гомовалин,8-изо лейцин)ангиотензина II в дозе 5 мкг/ требуетс  10-ти кратное увеличение дозы ангиотензина II дл  достижени  его первоначального эффекта (фиг.2) В синтезе используют аминокислоты L-р да. Температуры плавлени  соединений определ ют в открытых капил рах без исправлени . Удельные углы оптического вращени  измер ют на цифровом пол риметре модели фирмы Perkln-Elmer (СИЛ). Электрофорез провод т на бумаге FN-l6(Fi1trak ГДР) в 5 и. (рН 1,9) уксусной кислоте при 18 В/см. Электрофоретическа  подвижность соединений приведена по отношению к гистидину (Ец тех провод т на пластинках силикагел  фирмы Merck в системах хлороформ-этанол-изопропанол-этилацетатвода Юб: : (л) н-бутанол-этанол-вода-уксусна  кислота 80:10:30:5 (Б); хлороформ-метанол-уксусна  кислота 80:10:5 (В); хлороформ-изопропанол-этилацетат-уксусна  кислотавода 85:5.8:2:0,25 (Д) . Вещества на хромато- и электрофореграммах в зависимости от структуры соединени  обнаруживает нингидрином и реактивом Паули, а также реактивами Сакагу чи, Рейндел -Хоппе и Бартона. Дл  эл ментного анализа вещества высушивают в пистолете Фишера в течение ч над PU. 5 Р 60°С и остаточном давле 6 НИИ 0,1 мм рт.ст. Кислотный гидролиз пептидов провод т в 6н сол ной кислоте при 105°С в запа нных ампулах в течение 2k ч. Аминокислотный состав определ ют в автоматическом анализаторе ВС-200 фирмы Ciocal (ФРГ). Трет-бутилоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-саркозил-Н нитроаргинил-валина (7). К охлажденному до О С раствору 6,36 г (15лМмоль) бензилоксикарбонилсаркозил-М нитроагинина (5), З. г (15 ммоль) трет-бутилоксикарбонилгидразида валина (6 и ,06 г (30 ммоль) 1-оксибензотриазола в 50 мл ДНФА приливают раствор 3,2 г (16 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 10 мл ДМФА и выдерживают ч при 2°С и 5 ч при выдерживают 22 С, Дициклогексилмочевину отфильтровызают , фильтрат выливают в 500 мл смеси, содержащей насыщенный раствор NaCl и раствор КНСОз в соотношении 1:1, вещество экстрагируют смесью этилацетат-н-бутанол 1:1,промывают насыщенным раствором NaCl| 5%-ным раствором KHS04, насыщенным раствором NaCl, высушивают над MgS04, упаривают, и полученное вещество растирают с эфиром. Выход 8,8 (92); т.пл. 180-185°С, W 22,4 (С 1,ДМФА); R 0,27(В); Rj 0,78 (Г) ; R О,+7 (Д)Найдено ,о: С 51,+5; Н 6,79; N 19,б7 Cjji-fH aNgOg. Вычислено,: С 50,85; Н 6,80; N 19,76. Гидразид бензилоксикарбонилсаркозил-М нитроаргинилвалина (8). Раствор 8j7 г (13,б ммоль) трет-бутилоксикарбонилгидразида (7) в ЗС мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 20 мин при 22 С и упаривают , остаток растирают эфиром, отфильтровывают и перекристаллизовывают из этанола. Кристаллический осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и эфиром, высушивают в вакууме. Выход 6,6 г (87%); т.пл.1б8170°C; ci . 8,3 (С 1, ДМФА); Rr 0,20 (Д). С +6,87; Н 6,28; Найдено,%: N 21,81. C HjjNgOg С ii6,39; Н 6,19; Вычислено,- N 22,13. П -(итробензиловый эфир бензилоксикарбонилсаркозил-М нитроаргинил-аза- . -cL-гомовалил-тирозил-валил-гистидил-пролил-изолейцина (9) к раствсру 2,85 г (5 ммоль)(8) в 15 мл ДМФА прибавл ют мл 4,5н раствора НС1 в этилацетате. реакцион ную смесь охлаждают до -20 С, прибавл ют 0,62 мл (5,5 ммоль) трет-бутилнитрита и выдерживают 20 мин при -15С, охлаждают до -40С, при интен сивном перемешивании небольшими порци ми прибавл ют триэтиламин до рН среды 7, и упаривают реакционную смесь в вакууме (10° мм рт.ст.). Сухой остаток высушивают 3 ч в глубоком вакууме ( 10) при температуре бани 20-30 0, потом раствор ют в 30 мл сухого этилацетата и выдерживают 1 ч при (в течение Ьервых 10-15 мин выдел ютс  пузырьки азота). Полученный раствор изоцианата (9) прибавл ют к раствору 2,29 г (3 ммоль) дигидробромида п-нитробензилового эфира тирозил-валйл-гистидил-пролил-йзолейцина и 0,7 мл (6 ммоль) триэтиламина в 15 мл ДМФА, выдерживают 15 ч при комнатной температуре и выливают в 200 мл насыщенного раствора NaCl. Осадок отфиль ровывают, промывают последовательно 5%-ным раствором NaHCOj,водой, раствором KHS04, водой и высушивают на воздухе. Сухое вещество кип т т с 50 мл этанола, отфильтровывают нерастворимую часть, фильтрат упариваю и полученный защищенный октапептид 8 8 очищают хроматографией на силикагеле в системе хлороформ-этанол-изопропанол-этилацетат-вода 10:6:+: 3:1. Выход 2,1 г (, счита  на аминокомпонент ). Т.пл. 180-183С;{а. 21,7 (С 1,ДМФА); R 0,52(А) R. 0,81 (Б); Е|,,43(рН 1,9). Найдено,%: С 55,2; Н 6,33; N 16,91. СбоНе бО ь . Вычислено,: С 5б,20; Н 6,37; N 17.7. Саркозил-аргинил-аза- cL -гомоваил-тирозил-валил-гистидил-пролил-изоейцин 1. К раствору 1,5 г (1,17 ммоль)(t9) в 50 мл смеси метанол-уксусна  кислота-вода 6:1:1 прибавл ют 1 г палладиевой черни и гидрируют 12 ч, катализатор отфильтровывают, и фильтрат упаривают. Полученный октапептид 1 очищают ионообменной хроматографией на СМ-целлюлозе. Выход 0,91 г (67%). Т.пл. 210-213С; д.,0°С (С 0,5, 1н CHjCOOH); R 0,06 (г), Rr 0,Oi(B); ,75 (рН 1,9). Найдено,: С 49,90; Н N 16,72. %%2СН СООН Вычислено,%: С 50,59; Н 7,80; N 16,86.

СН(СНз)(1) .

Схема си«теза (1-саркозин, 3 аза-|Стомовалин,5 валин,

Claims (6)

1. 8-изолейцин) ангиотензина I I Формула изобретени  ОктасТептид формулы IOЭ.45 Ь 7 Sar-Arc -ci2Q-tl-Hva-Tar-Vae-His-PrQобладающий способность специфически ингибировать прессорный эффект и мио тропное действие ангиотензина II. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе 1.Laragh J. H.,Case D. В,, WallaceJ.M., Keim Н, Blocade of remin or angiotensin for understanoling of human hypertension: a coraparison of propranolol, saralasin and converting enzyme blocade. . :Proc. 1977, V. 36, N 5, p. 1781-178
2. 2.Wallace J. M., Case O.B., Laragh j. H.,Kein H.J.,f)rayer J.I.M. Sea ley J. E. I he immediate pressor responce to saralasin in man. A test of angiotens.in 11 receptor Vacancy. . Res , 1979, v.tt, N 1, p.38-kk
3. 3. Keim H. J., Drayer J. I ., Case O.B., Lopez-Ovejeroh J., V/allace J.M., Weber М.Л., Laragh J.H. A role for renin in rebound hypertension and encepholopathy after infusion of saralasin acetate(sar-ala -angiotensin t ), N.Engl. JJ1ed., 1976, v. 295, Vf 21, p. 1175-1177.
4. 4. Хими  полипептидов. Под ред. П. Кацо нниса, Пер. с англ. М.,Мир 1977.
5. 5.Van Rossum J.M. Cumulative dose-response curves. II. Technique for the, ma King of doseresponce curves in isolated organs and the evaluation in isolated organs and the evaluation of drug parameters. - Arch, int. Pharmacodyn., 1963, v. ЙЗ, № 3-, p. 299-330.
6. 6.Regoii D., Vane J.R. A sensitive method for the assay of angrotensin . - Brit J. Pharmacol., 196, V. 23, N 2, p. 351-359..

   Йммртст.

   0

   го

   10

   2,5 S,ff

   0,5

   мкг1кг Фиг.2