Поставленна цель достигаетс октапептидом формулы 1 ъл I I -v I I- . . s.. га Sar-Ai g-aza-d. -Hva-Tyr-Val-His-Pro-3 где Sar - остаток саркозина; aza-{ -Hva aza-(i -гомо-1-валина - NH-CH-NH-CO- . t ен(сно,)о Все аминокислоты L-конфигурации. Соединение ,отличаетс от саралазина и других его структурных аналогов дополнительной модификацией в положении 3 (остаток валина в положении 3 заменен на остаток аза-cL-гомовали на), что приводит к понижению пресеорной активности без изменени сродства к рецепторам ангиотензина II. В опытах in vivo и in vitro соединение I не про вл ет прессорного эффекта , даже при наивысших примен емых концентраци х соединени I (до 500 мкг/кг). Саралазин же обладает 1 , прессорной активностью природ ного гормона. Таким образом, соединение I имеет существенно улучшенные фармакологиче кие свойства по сравнению с известным ингибитором ангиотензина II, вес ма важные дл практического применени Zj, в частности дл диагностики и терапии рениновых форм гипертониче кой болезни. СоединениеI, синтезировано конден сацией отдельных фрагментов известными методами IkJ согласно схеме. Пр межуточные соединени (2)-{6) и(10) (18) получены также известными способами Г4}, При этом примен лись бензилоксикарбонильна , нитро.метиль на , трет-бутилоксикарбонилгидразидна , гидразидна , п-нитробензильна группа. трет-Бутилоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-саркозил-М-нитроаргинил-валина (7) получают карбодиимидным методом ,,конденсиру бензилоксикарбонил-М-йироаргинин- (5) с трет-бутилоксикарбонилгидразидом валина (6) в присутствии двух моль 1-оксибензотриазола, Защиту гидразидной функции-трет-бутилоксикарбонильную группу соединени (7) -отщеп л ют трифторуксусной кислотой при комнатной температуре. Азид, получен ный по методу Рудингера из гидразида ( 8) выдерживают в растворе диметилформамида при 60®С 1 ч, 8 таких усло ви х азид полностью перегруппировы (г) ваетс в изоцианат (9), который без выделени ввод т в реакцию с аминокомпонентом (18). Защитные группы у полученного октапептида (19) удал ют каталитическим гидрогенолизом. Октапептид I очищают ионообменной хроматографией на СМ-целлюлозе в градиенте ацетата аммони . Состав и однородность полученного аналога доказаны аминокислотным и элементным анализами на хромато- и электрофореграммах имеетс одно п тно с положительной реакцией на нингидрин, реактив Сакагучи Паули,Рейндел -Хоппе,Эрлиха1 (на уреидную группу). Исследование биологических свойств соединени I. . Миотропна активность (1-саркозин, З-аза-с -гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин ) ангиотензина Ц изучалась в опытах in vitro согласно методике van Rossum 5J посредством регистрации изотонических сокращений восход щей ободочной кишки (Colon ascendens ) крыс, вл ющейс наиболее чувствительным тест-органом дл исследовани миотропной активности ангиотензина II (6) , с использованием модифицированного прибора ВИ6-5МЛ. Агонистические и антагонистические свойства изучак1т в диапазоне консвойства изучают центраций 1(ГН, врем предварительной экспозиции кишки с исследуемым соединением составл ет 3 мин. При вычислении кумул тивных кривых концентраци - эффект (КККЭ) примен ют машинную обработку экспериментальных данных (кажда точка опре дел етс как средн из 6 опытов) с определением стандартной ошибки при ,05. Дл количественной характеристики конкурентного антагонизма (1-саркозин , 3-аза- oL -гомовалин,5-валин, 8-изолейцин) ангиотензина II вычисл ют параметр рЛг. В опытах in vitro соединение I в диапазоне концентраций 10- 1СГМ не про вл ет миотропного эффекта, но в концентраци х 1 вызывает прогрессивное параллельное перемещение КККЭ ангиотензина II в сторону высших концентраций, т.е. про вл ет конкурентный антагонизм с ангиотензином II, характеризующийс величиной pA(8,60i 0,29. В концентрации исследуемое соединение вызывает понижение высоты КККЭ ангиоконцентраци х 1 П тензина М полностью ингибирует миотропный эффект ангиотензина I (фиг.1). В опытах in vivo регистрируют артериальное давление из общей сонной артерии наркотизированных уретаном белых крыс обоего пола весом 180200 г с помощью ртутного манометра на закопченной ленте кимографа. Qeщества ввод т в бедренную вену в виде инъекций в объеме 0,1 мл/200 г ве са в дозах 0,5-500 мкг/кг. При изучении антагонизма исследуемого соединени по истечении 1 ми с момента его введени крысам ввод т ангиотензин И в стандартных дозах 0,5; 2,5 и 5 мкг/кг. Вычисл ют кривые доза-эффект дл ангиотензина I1 в присутствии и в отсутствии арг тагониста. В опытах in vtvo исследуемое сое динение не обладает прессорной актив ностью, даже при наивысших примен емых концентраци х (до 500 мкг/кг), н значительно ингибирует прессорное де ствие ангиотензина II. В присутствии ( 1-саркозин,3-аза-сС-гомовалин,8-изо лейцин)ангиотензина II в дозе 5 мкг/ требуетс 10-ти кратное увеличение дозы ангиотензина II дл достижени его первоначального эффекта (фиг.2) В синтезе используют аминокислоты L-р да. Температуры плавлени соединений определ ют в открытых капил рах без исправлени . Удельные углы оптического вращени измер ют на цифровом пол риметре модели фирмы Perkln-Elmer (СИЛ). Электрофорез провод т на бумаге FN-l6(Fi1trak ГДР) в 5 и. (рН 1,9) уксусной кислоте при 18 В/см. Электрофоретическа подвижность соединений приведена по отношению к гистидину (Ец тех провод т на пластинках силикагел фирмы Merck в системах хлороформ-этанол-изопропанол-этилацетатвода Юб: : (л) н-бутанол-этанол-вода-уксусна кислота 80:10:30:5 (Б); хлороформ-метанол-уксусна кислота 80:10:5 (В); хлороформ-изопропанол-этилацетат-уксусна кислотавода 85:5.8:2:0,25 (Д) . Вещества на хромато- и электрофореграммах в зависимости от структуры соединени обнаруживает нингидрином и реактивом Паули, а также реактивами Сакагу чи, Рейндел -Хоппе и Бартона. Дл эл ментного анализа вещества высушивают в пистолете Фишера в течение ч над PU. 5 Р 60°С и остаточном давле 6 НИИ 0,1 мм рт.ст. Кислотный гидролиз пептидов провод т в 6н сол ной кислоте при 105°С в запа нных ампулах в течение 2k ч. Аминокислотный состав определ ют в автоматическом анализаторе ВС-200 фирмы Ciocal (ФРГ). Трет-бутилоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-саркозил-Н нитроаргинил-валина (7). К охлажденному до О С раствору 6,36 г (15лМмоль) бензилоксикарбонилсаркозил-М нитроагинина (5), З. г (15 ммоль) трет-бутилоксикарбонилгидразида валина (6 и ,06 г (30 ммоль) 1-оксибензотриазола в 50 мл ДНФА приливают раствор 3,2 г (16 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 10 мл ДМФА и выдерживают ч при 2°С и 5 ч при выдерживают 22 С, Дициклогексилмочевину отфильтровызают , фильтрат выливают в 500 мл смеси, содержащей насыщенный раствор NaCl и раствор КНСОз в соотношении 1:1, вещество экстрагируют смесью этилацетат-н-бутанол 1:1,промывают насыщенным раствором NaCl| 5%-ным раствором KHS04, насыщенным раствором NaCl, высушивают над MgS04, упаривают, и полученное вещество растирают с эфиром. Выход 8,8 (92); т.пл. 180-185°С, W 22,4 (С 1,ДМФА); R 0,27(В); Rj 0,78 (Г) ; R О,+7 (Д)Найдено ,о: С 51,+5; Н 6,79; N 19,б7 Cjji-fH aNgOg. Вычислено,: С 50,85; Н 6,80; N 19,76. Гидразид бензилоксикарбонилсаркозил-М нитроаргинилвалина (8). Раствор 8j7 г (13,б ммоль) трет-бутилоксикарбонилгидразида (7) в ЗС мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 20 мин при 22 С и упаривают , остаток растирают эфиром, отфильтровывают и перекристаллизовывают из этанола. Кристаллический осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и эфиром, высушивают в вакууме. Выход 6,6 г (87%); т.пл.1б8170°C; ci . 8,3 (С 1, ДМФА); Rr 0,20 (Д). С +6,87; Н 6,28; Найдено,%: N 21,81. C HjjNgOg С ii6,39; Н 6,19; Вычислено,- N 22,13. П -(итробензиловый эфир бензилоксикарбонилсаркозил-М нитроаргинил-аза- . -cL-гомовалил-тирозил-валил-гистидил-пролил-изолейцина (9) к раствсру 2,85 г (5 ммоль)(8) в 15 мл ДМФА прибавл ют мл 4,5н раствора НС1 в этилацетате. реакцион ную смесь охлаждают до -20 С, прибавл ют 0,62 мл (5,5 ммоль) трет-бутилнитрита и выдерживают 20 мин при -15С, охлаждают до -40С, при интен сивном перемешивании небольшими порци ми прибавл ют триэтиламин до рН среды 7, и упаривают реакционную смесь в вакууме (10° мм рт.ст.). Сухой остаток высушивают 3 ч в глубоком вакууме ( 10) при температуре бани 20-30 0, потом раствор ют в 30 мл сухого этилацетата и выдерживают 1 ч при (в течение Ьервых 10-15 мин выдел ютс пузырьки азота). Полученный раствор изоцианата (9) прибавл ют к раствору 2,29 г (3 ммоль) дигидробромида п-нитробензилового эфира тирозил-валйл-гистидил-пролил-йзолейцина и 0,7 мл (6 ммоль) триэтиламина в 15 мл ДМФА, выдерживают 15 ч при комнатной температуре и выливают в 200 мл насыщенного раствора NaCl. Осадок отфиль ровывают, промывают последовательно 5%-ным раствором NaHCOj,водой, раствором KHS04, водой и высушивают на воздухе. Сухое вещество кип т т с 50 мл этанола, отфильтровывают нерастворимую часть, фильтрат упариваю и полученный защищенный октапептид 8 8 очищают хроматографией на силикагеле в системе хлороформ-этанол-изопропанол-этилацетат-вода 10:6:+: 3:1. Выход 2,1 г (, счита на аминокомпонент ). Т.пл. 180-183С;{а. 21,7 (С 1,ДМФА); R 0,52(А) R. 0,81 (Б); Е|,,43(рН 1,9). Найдено,%: С 55,2; Н 6,33; N 16,91. СбоНе бО ь . Вычислено,: С 5б,20; Н 6,37; N 17.7. Саркозил-аргинил-аза- cL -гомоваил-тирозил-валил-гистидил-пролил-изоейцин 1. К раствору 1,5 г (1,17 ммоль)(t9) в 50 мл смеси метанол-уксусна кислота-вода 6:1:1 прибавл ют 1 г палладиевой черни и гидрируют 12 ч, катализатор отфильтровывают, и фильтрат упаривают. Полученный октапептид 1 очищают ионообменной хроматографией на СМ-целлюлозе. Выход 0,91 г (67%). Т.пл. 210-213С; д.,0°С (С 0,5, 1н CHjCOOH); R 0,06 (г), Rr 0,Oi(B); ,75 (рН 1,9). Найдено,: С 49,90; Н N 16,72. %%2СН СООН Вычислено,%: С 50,59; Н 7,80; N 16,86.The goal is achieved by an octapeptide of formula 1 l I I -v I I-. . s .. ha Sar-Ai g-aza-d. -Hva-Tyr-Val-His-Pro-3 where Sar is a sarcosine residue; aza- {-Hva aza- (i -homo-1-valine - NH-CH-NH-CO-. t en (clear)) All amino acids of the L-configuration. The compound differs from saralazine and its other structural analogs by additional modification in position 3 (the residue of valine in position 3 is replaced by the residue aza-cL-homulated on), which leads to a decrease in pre-receptor activity without changing affinity for angiotensin II receptors. In experiments in vivo and in vitro, compound I does not exhibit a pressor effect, even at the highest applied concentrations of compound I (up to 500 µg / kg). Saralazin also has 1, pressor activity Thus, compound I has significantly improved pharmacological properties as compared with the known angiotensin II inhibitor, which are important for the practical use of Zj, in particular for the diagnosis and therapy of renin-hypertensive disease. fragments by the known IkJ methods according to the scheme. Intermediate compounds (2) - {6) and (10) (18) are also obtained by known methods G4}, in this case benzyloxycarbonyl, nitromethyl, tert-butylox karbonilgidrazidna, hydrazide, p-nitrobenzyl group. Benzyloxycarbonyl-sarkosyl-M-nitroargin-i-valine-i-tert-Butyloxycarbonylhydrazide, i-17, i-7 is obtained by the carbodiimide method, with benzyloxycarbonyl-M-yyroarginine- (5) condensate with t-butyloxycarbonylhydrazide, (6) in the presence of 2-mol-1-y-arlynine-3-valyne, i-arlynine-3 The tert-butyloxycarbonyl group of the compound (7) is cleaved with trifluoroacetic acid at room temperature. The azide prepared by the Rudinger method from hydrazide (8) is kept in dimethylformamide solution at 60 ° C for 1 hour, 8 of these conditions, the azide is completely rearranged (g) into isocyanate (9), which, without release, is reacted with the amino component (18). The protective groups of the obtained octapeptide (19) are removed by catalytic hydrogenolysis. Octapeptide I is purified by ion exchange chromatography on CM-cellulose in an ammonium acetate gradient. The composition and homogeneity of the obtained analogue are proven by amino acid and elemental analyzes on chromatographic and electrophoregrams, there is one spot with a positive reaction to ninhydrin, Sakaguchi Pauli reagent, Reindel –Hoppe, Ehrlich1 (to the ureid group). Investigation of the biological properties of the compound I.. Myotropic activity (1-sarcosine, 3-aza-c -homovaline, 5-valine, 8-isoleucine) of angiotensin C was studied in in vitro experiments according to van Rossum 5J technique by recording isotonic contractions of the colon upstream colon (rat) the most sensitive test organ for studying the myotropic activity of angiotensin II (6), using a modified instrument VI6-5ML. The agonistic and antagonistic properties of a study in the range of conservatism study centration 1 (GN, the pre-exposure time of the intestine with the test compound is 3 minutes. When calculating the cumulative concentration-effect curves (ECCE), the computer processing of the experimental data is used (each point is defined as average of 6 experiments) with the determination of the standard error at, 05. To quantify the competitive antagonism (1-sarcosine, 3-aza-oL -homovaline, 5-valine, 8-isoleucine) angiotensin II, the pairs are calculated meter rLg In experiments in vitro, compound I in the concentration range of 10-1СГМ does not exhibit a myotropic effect, but in concentrations 1 causes a progressive parallel displacement of angiotensin II EHEC towards higher concentrations, i.e. exhibits competitive antagonism with angiotensin II, characterized by a pA value (8.60i = 0.29. In concentration, the test compound causes a decrease in the CCER height. Angioconcentration of 1 P tenzin M completely inhibits the myotropic effect of angiotensin I (Fig. 1). In in vivo experiments, arterial pressure from a common carotid artery of white rats of both sexes weighing 180200 g anesthetized with urethane was recorded using a mercury manometer on a smoked kimograph tape. The substances were injected into the femoral vein in the form of injections in a volume of 0.1 ml / 200 g of weight in doses of 0.5-500 µg / kg. In the study of the antagonism of the test compound, after 1 minute from the moment of its administration, angiotensin I was administered to rats in standard doses of 0.5; 2.5 and 5 µg / kg. Dose-response curves for angiotensin I1 are calculated in the presence and in the absence of arg tagonist. In in vtvo experiments, the studied compound does not possess pressure activity, even at the highest concentrations used (up to 500 µg / kg), and it significantly inhibits the pressure effect of angiotensin II. In the presence of (1-sarcosin, 3-aza-cC-homovaline, 8-iso-leucine) angiotensin II at a dose of 5 µg / requires a 10-fold increase in the dose of angiotensin II to achieve its original effect (Fig. 2) Lr yes. The melting points of the compounds are determined in open capillaries without correction. The specific angles of optical rotation are measured on a Perkln-Elmer digital model (SIL) digital polarimeter. Electrophoresis was carried out on FN-l6 paper (Fi1trak DDR) in 5 and. (pH 1.9) with acetic acid at 18 V / cm. The electrophoretic mobility of the compounds is given in relation to histidine (ECs are carried out on Merck silica gel plates in chloroform-ethanol-isopropanol-ethyl acetate systems Yub: (l) n-butanol-ethanol-water-acetic acid 80: 10: 30: 5 (B); chloroform-methanol-acetic acid 80: 10: 5 (B); chloroform-isopropanol-ethyl acetate-acetic acid factory 85: 5.8: 2: 0.25 (D). Substances on chromatography and electrophores, depending on the structure compounds are detected with ninhydrin and Pauli reagent, as well as with Sakagu Chi, Reindel-Hoppe and Barton reagents. The chemical analysis of the substance was dried in a Fisher pistol for hours over PU. 5 P 60 ° C and a residual pressure of 6 SRI 0.1 mm Hg Acidic hydrolysis of peptides was carried out in 6N hydrochloric acid at 105 ° C in sealed ampoules within 2k hours. The amino acid composition is determined in a BC-200 automatic analyzer from Ciocal (Germany). Tert-butyloxycarbonylhydrazide benzyloxycarbonyl-sarcosyl-N nitroarginyl-valine (7). To a cooled to О С solution of 6.36 g (15 l Mmol) benzyloxycarbonate -M nitroaginin (5), Z. g (15 mmol) tert-butyloxycarbonylhydrazide valine (6 and, 06 g ( 30 mmol) of 1-hydroxybenzotriazole in 50 ml of DNFA, a solution of 3.2 g (16 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide in 10 ml of DMF is poured and kept at 2 ° C for 5 hours and kept at 22 ° C, Dicyclohexylurea is filtered, the filtrate is poured into 500 ml of mixture, containing 1: 1 saturated NaCl solution and KNSO3 solution, the substance is extracted with a 1: 1 mixture of ethyl acetate-n-butanol, washed with saturated NaCl solution | 5% solution of KHS04, a saturated solution of NaCl, dried over MgSO4, evaporated, and the resulting substance is triturated with ether. Exit 8.8 (92); m.p. 180-185 ° C, W 22.4 (C 1, DMF); R 0.27 (B); Rj 0.78 (G); R Oh, + 7 (D) Found, about: C 51, + 5; H 6.79; N 19, B7 Cjji-fH aNgOg. Calculated: C 50.85; H 6.80; N 19.76. Benzyloxycarbonylsarcosyl-M nitroarginylvaline hydrazide (8). A solution of 8j7 g (13, b mmol) of tert-butyloxycarbonyl hydrazide (7) in CZ ml of trifluoroacetic acid, kept at 22 ° C for 20 minutes and evaporated, the residue triturated with ether, filtered and recrystallized from ethanol. The crystalline precipitate is filtered off, washed with ethyl acetate and ether, dried in vacuum. Yield 6.6 g (87%); m.p.1.18170 ° C; ci. 8.3 (C 1, DMF); Rr 0.20 (D). C + 6.87; H 6.28; Found,%: N 21.81. C HjjNgOg C ii6.39; H 6.19; Calculated - N 22,13. P - (benzyloxycarbonylsarcosyl-M nitroarginyl-aza-. -CL-homohal-tyrosyl-valyl-histidyl-prolyl-isoleucine (itrobenzyl ester) (9) add ml to a solution of 2.85 g (5 mmol) (8) in 15 ml of DMF 4.5N HCl solution in ethyl acetate. The reaction mixture is cooled to -20 ° C, 0.62 ml (5.5 mmol) of tert-butyl nitrite is added and kept at -15 ° C for 20 minutes, cooled to -40 ° C, with intensive stirring triethylamine is added in portions to pH 7, and the reaction mixture is evaporated under vacuum (10 ° mm Hg). The dry residue is dried for 3 hours in high vacuum (10) at a temperature of barrels 20-30 0, then dissolved in 30 ml of dry ethyl acetate and incubated for 1 hour at (for the first 10-15 minutes, bubbles of nitrogen were released). The resulting solution of isocyanate (9) was added to the solution 2.29 g (3 mmol) of tyrosyl-valyl-histidyl-prolyl-yzoleucine p-nitrobenzyl ester dihydrobromide and 0.7 ml (6 mmol) of triethylamine in 15 ml of DMF, kept at room temperature for 15 hours and poured into 200 ml of saturated NaCl solution. The precipitate is filtered off, washed successively with a 5% NaHCOj solution, water, KHS04 solution, water, and dried in air. The dry substance is boiled with 50 ml of ethanol, the insoluble part is filtered off, the filtrate is evaporated and the resulting protected octapeptide 8 8 is purified by chromatography on silica gel in the system chloroform-ethanol-isopropanol-ethyl acetate-water 10: 6: +: 3: 1. Yield 2.1 g (calculated on the amino component). M.p. 180-183 ° C; {a. 21.7 (C 1, DMF); R 0.52 (A) R. 0.81 (B); E | ,, 43 (pH 1.9). Found,%: C 55.2; H 6.33; N 16.91. COULD NOT BE. Calculated: C 5b, 20; H 6.37; N 17.7. Sarkosyl-arginyl-aza-cL-Homovoyl-tyrosyl-valyl-histidyl-prolyl-isoeucine 1. To a solution of 1.5 g (1.17 mmol) (t9) in 50 ml of a mixture of methanol-acetic acid-water 6: 1: 1, 1 g of palladium black is added and hydrogenated for 12 hours, the catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated. The obtained octapeptide 1 is purified by CM-cellulose ion exchange chromatography. Yield 0.91 g (67%). M.p. 210-213C; d., 0 ° C (C 0.5, 1n CHjCOOH); R 0.06 (g), Rr 0, Oi (B); 75 (pH 1.9). Found: C 49.90; H N 16.72. %% 2CH COOH Calculated,%: C 50.59; H 7.80; N 16.86.
СН(СНз)(1) .CH (CH3) (1).
Схема си«теза (1-саркозин, 3 аза-|Стомовалин,5 валин,Scheme si thesa (1-sarcosine, 3 aza- | Stomovalin, 5 valine,