SU738517A3 - Способ получени антибиотика - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Изобретение относитс  к области микробиологии к касаетс  получени  а тибиотиков, обладающих ингибирукщим действием. Предложенный антибиотик новый и способ его получени  в научно-технической и патентной литературе не опи сан. Целью изобретени   вл етс  получе ние антибиотика общейформулы 5-CH2-CH,-NH-CO-CH Да ОI где R, - водород, металл, алкил или трифенилметил. Достигаетс  это тем, что штамм Streptomyces А 271 выращивают в аэроб ных услови х в питательной среде, со держащей источники углерода и азота и минеральные соли, при.рН 4,0-9,0 и 20-40 С с последующим выделением целе вого продукта в виде кислоты или в ви де сложного эфира, или соли. Штамм Streptomyces выделен из почвенного образца, собранного недалеко от храма Eiheiji в районе Voshida пре фектуры Fukui в Японии, обозначенный номером А 271. Культура депонирована в Fermentation Research 3nstitute, Agency o JndustriaE Science and Techno ogie, где онахранитс  под HOiepOM PERM - P .№ 3984. Образец организма Streptomyces A 271 депонирован также институтом АТСС под № 31358. Морфологические признаки. Развет-г . вленность полученного мицели  проста , верхн   часть его образует крюки,петли или неполные спирали. Эти формы наблюдаютс  при культивировании на среде из овс ной муки и глицерин-аспарагиновой агаровой среде, в то врем  как пр мые или.же изогнутые формы обычно образуютс  на среде из дрожжевого и солодового экстрактов, Форма овальна  или цилиндрическа / причем эти споры образуют цепь, состо щую более чем из 10 (обычно 10-50) спор. Размер 0,8-1,0 х 1; 0-1,8 мк, поверхность гладка , не наблюдаетс  ни жгутиков, ни спорангиев. На воздушном мицелии образуютс  гифы. Культуральные признаки штаг.ма Streptomyces А 271 приведены в табл 1,

Цвет воздушного

Рост

Среда мицели 

Снетло-оранжево- Сильный -желтЕлй

Бледно-оранжевоТо же -желтый до светло-оранжево-желтотого

Бледно-оранжевоа-желтый до светло-оранжево-желтого

- -

Бледно-оранжево-желтый до светло-оранжево-желтого

.Бледно-оранжево-желтый до светло-оранжево-желтого почти не определенный

Бледно-оранжевОт желтый до светлооранжево-желтого та

Бледно-ора нжевый

й до светло-оранжево- хсел того Физиологические характеристики. Растет и развиваетс  при 10-40-с, оптимальной  вл етс  20-30°С. Желатину разжижает при 20°С; крахмал гидролизует , молоко пептонизирует, но не коагулирует. Образует меланоидные пигменты на пирозиновом агаре, на пептоновом дрож жевом железистом агаре и в бульоне из триптоно-дрожжевого экстракта. Хо рошо усваивает арабинозу, ксилозу, глюкозу, рамнозу, плохо усваивает сахарозу. Совсем не усваивает фруктозу , инозитол, раффинозу, маннитол. Новый антибиотик получают путем инокулировани  спор мицели  штамма . Streptomyces А 271 в аэробной питательной среде. В качестве питательной среды используют источники углерода , азота, неорганические соли. В качестве источников углерода берут глюкозу, глицерин, мальтозу, сахарозу , мелассу, декстрин, крахмал, ма л Н|Ые или жировые источники углерода такие как масло земл ных орехов. При нес бходимости добавл ют источники азота, пептон, м сной экстракт, муку из соевых бобов, масло из сем н хлоп чатника, сушеные дрожжи, жидкость от замочки кукурузы, дрожжевой экстракт , казеин от сн того молока, нитрат натри , нитрат аммони , сульфат аммони , неорганические соли; дикаТабл-ица 1

Цвет мицели Растворимый -субстрата пигмент

Светло-желтый светло-оранжевожелтый

Светло-желтый

Светло-желтый до слегка желто-розового

Светло-оранжево-желтый до светло-желтого

Светло-оранжево-желтый до коричневато-желтого бледно-желтый

Светло-оранжево-желтый до бледно-коричневого

Светло-желтый лийфосфат, хлористый натрий, карбонат кальци , сульфат магни , а также следы металлов, например кобальта, марганца. Дл  предупреждени  вспенивани  во врем  ферментации добавл ют, ajiивспениватели , силиконовое и растительное масло..Среду можно стерилизовать перед культивированием, рН довод т до 4-9, предпочтительно 6-8 до или после стерилизации. Культивирование провод т в аэробных услови х. Используют методы встр хивани  в колбах или выращивание ведут в погруженном состо нии. Температура ферментации колеблетс  от 20 до 40С, предпочтительно от 25 до . рН культурального бульона во врем  ферментации довод т до 4-9, предпочтительно 6-8. Ферментацию ведут до тех пор, пока не сконцентрируетс  достаточное количество антибиотика. Обычно ферментаци  длитс  от 30 до 90 ч, хот  этот период колеблетс  в зависимости от состава среды, температуры ферментации , штамма. Количество скопившегос  антибиотика в Ферментационном бульне определ ют биоиспытательным методом и биоавтографией.

Скопившийс  антибиотик растворим в воде и находитс  в основном вне мицели , поэтому мицелий удал ют после ферментации известными способами, фильтрацией центрифугированием, экстракцией с последующим выделением аи- 5 тибиотика из фильтрата.

Дл  регенерации и.выделени  антибиотика примен ют экстрагирование при низком рн с применением растворител , этилацетата, Н-бутанола или с обрат- Q ной экстракцией из сло  растворител  в водный слой при более высоком рН, экстракции при нейтральном рН с применением растворителей; хлористого метилена, хлороформа или в присутст- ,ВИИ липофильной четвертичной аммониевой соли, как бензалконийхлорид тетра-н-бутил-аммонийгидросульфат с обратной экстракцией из сло  растворител , содержащего йодистый натрий, йодистый калий.20

Адсорбцию ведут на активированном угле или высокопористых стиролдивинилбензольных смолах, как амберлит и

элюирование - водным метанолом, водным ацетоном, гель-фильтрацию - с применением сефадекса, хроматографию- на колонне или тонкослойную хроматографию с применением целлюлозы, силикагел , глинозема, а осаждение путем добавлени  растворител  - ацетона. 30

Антибиотик обладает широким спектром антибиотического действи , оказыва  сильное действие протиб различных . бактерий, например грам-положительных , таких как StaphyEococcus, DipEo-35coccus . Streptococcus, Sarcina, Ba- ciEPus, и грАм-отрицательных, относ щихс  к родам ACcaCigenes, Comamonas, Escherichia, KEebsieEBa, Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Serratia. 4Q Антибиотик обладает свойством повышать антибиотическое действие других антибиотиков, таких как пенициллинн ,, и цефалоспорины, а также Citrobacter, frendii, Proteus vu garis, Entero- 5 bacter aerogenes, Serratia marcescens.

При введении мышам, зараженным патогенными грам-положительными бактери-  ми, антибиотик оказывает значительное терапевтическое действие.сп

При введении мьоиам внутрибрюшинным путем в количестве 500 мг/кг антибиотик не оказывает смертельного действи  у подопытных животных.

Так как антибиотик более устойчив В виде соли, чем в виде свободной кислоты , то в фармацевтических цел х его используют предпочтительно в вие соли.

В качестве солей антибиотика ис

пользуют соли щелочных металлов (нат- 6 ри , кали , лити ), щелочноземельных

(кальци  и магни ), а также соли других металлов - алюмини , соль аммони , первичные, вторичные или третич;-ные амины (моноэтиламин, диметиламин, 65

триметиламин, моноэтаноламин, диэтаноламин ), соли с органическими основани ми , как бензатин, прокаин.

Пригодными сол ми дл  фармацевтических целей  вл ютс  соли щелочных металлов, натри , кали .

Антибиотик представл ет собой одноосновную кислоту, содержащую карбоксильную группу в молекуле. Поэтому из антибиотика можно получить различные сложные эфиры с различными спиртами, меркаптанами .или их производными; поступают при этом аналогично способу примен емому дл  известных антибиотиков на основе клавулановой кислоты или тиенамицина.

По изобретению соответствующим сложным эфиром антибиотика  вл етс  сложный эфир общей структурной формулы

S - СН J- СН J-NH -СО-СНз

CHj-CHj.

(II

-N

COOR

1

где R, низка  алкильна  группа . или трифенильна  группа.

В приведенной структурной формуле (II) низша  алкильна  группа обозна .чает группу с разветвленной или неразветвленной цепью, в частности алкильную группу с числом атомов С менее б, а именно группу с числом атомов С от 1 до 4. К ней относ тс   метил , этил, н-пропил, изопропил, и-бутил , изо-бутил, н-пентил, изо-пен тил , н-гексил и др.

Согласно изобретению сложные эфиры приведенной структурной формулы (II) могзт быть получены взаимодействием антибиотика структурной формулы (1)-или его солей с соединени ми общей структурной формулы

(III)

КУ

где R имеет -то же значение, что и выше , а Y - атом или группа, которые . можно расщепить.

Что касаетс  атомов или групп, выражаемых символом Y в формуле (III), то примениь ыми  вл ютс  любой вид атомов или групп, которые поддаютс  расщеплению при контактировании с карбоксильной группой антибиотика,, например атомы галоидов, хлор, бром или йод, сульфонилоксигруппы, карбонилоксигруппы реакционноспособного характера , как -O-CO-CF,j и т. п. Предпочтительными вл ютс  атомы галоида.

.Примерами соединени  приведенной структурной формулы (III)  вл ютс : метиловый спирт, йодистый метил, диметилсульфат , метилмерка:птан, этанол, бромистый этил,.йодистый этил, этилмеркаптан , н-пропилхлорид,. н-пропилйодид , пропиловый спирт,изо-пропиловый спирт,изо-пропилбромид, -бутиловый спирт , н -бутилбромид-, н -бутилйодид , и-пентиловый спирт, н-пентил-1 хлорид, Н-пен1албромид, н-пентилйодид , Н гексиловый спирт, н-гексилбромид , Н-гексилйодид, тритиловый спирт, тритилмеркаптан, тритилхлорид, тритилбромид и т. п. Одним из примеров низших диаэоалканов , пригодных дл  получени  сложных эфиров антибиотика  вл етс  диазометан . Взаимодействие антибиотика с соединени ми общей структурной формулы (III) или с низшими диазоалкв-намн мО лгет быть осуществлено известными способами , примен емыми при этерификации в сложный эфир. Так, например , взаимодействие антибиотика с соединеПИЯМИ общей структурной формулы (III или с низшими диаэоалканами предпочтительно осуществл ют в инертной жидкой среде, хот  его можно вести и без нее. В качестве такой среды можно примен ть углеводороды, как бензол , толуол, Н-гексан, циклогексан и галогензамещенные углеводороды, как хлороформ, хлористый метилен или дру гие амидыр как диметилформамид, гексаметилфосфортриамид или другие ,,диметилсульфоксид , эфиры, как диэтиловый , диизопропиловый, ди-и-бутиловый тетрагидрофуран, диоксан или другие. сложные эфиры, как этилацетат, Н -бут ацетат или другие, кетоны, как ацетон метилэтилкето.н или т. п. Эти раствор 1е.ли использовать в отдельност или в виде смесей двух или нескольки из них. Температура реакции может колебать с  в пределах диапазона в зависимости от рода соединений общей структурной формулы (III), вида низшего диазоалкана рода жидкой среды или используемых продуктов . Температуру реакции можно выбирать в диапазоне, в котором антибиотик не разлагаетс , заметно, од нако, , предпочтительно примен ют температуру пор дка ниже 60°С, предпочтительно , 0-40С, более предпочтител но, мелщу 5°С и комнатной температурой . При осуществлении этой реакции можно добавл ть стимулирующий реак , цию реагент, как триметиламин, триэтиламин , пиридин, дициклогексилкарбодиимид , или др. В этих услови х ре акци  может быть завершена за 1-24 ч обычно 3-12 ч. Согласно предпочтительному Всфиан ту изобретени  антибиотик, примен вMbij дл  взаимодействи  с реакционноспособным производным структурной фо мулы III, где R - трифенилметил,. не об зательно должен представл ть собой выделенный очищенный продукт. Дл реакции может найти применение . кул тивированный продукт или профильтрованный бульон после удалени  мицели  из культивированного продукта и сырой препарат антибиотика, частично очищенный регенерацией и вьаделением частично очищенным препаратам относ тс , например, концентрированный злюат из активированного угл , которым обрабатывают профильтрованный бульон; концентрированный элюат из стиролдивинилбензольной смолы, как Diaion НР-20, которым обработан профилированный бульон, обессолен- ный концентрат с активированным углем элюата, полученного ступенчатой концентрацией хлористого натри  в фосфатном буфере из ионообменной смолы, например QAE-Sephadex, на котором адсорбирован концентрированный элюат из Diaion НР-20, концентрированный метиленхлоридный экстракт в присутствии бензалконийхлорида, концентрированный экстракт с хлороформом в присутствии сго 7П-соединений; концентрированный бутаноловый экстракт при низком рН (3,5) и низкой температуре. Полученный таким образом антибиотик-тритиловый сложный эфир выдел ют- из реакционной смеси и очищают р дом известных способов. По окончании реакции реакционную смесь вначале выливают в водную среду дл  удалени  водных примесей, как побочные продукты и т. д. Предпочтительно в качестве водной средыпримен ют нейтраль ный буфер, чтобы значение рН приближалось к нейтральному. Антибиотик тритиловый сложный эфир, экстрагируют малопол рным органическим растворителем , в основном, не смешивающимс  с водой, как этилацетат, бензол, хлороформ и т. п. в течение ступени экстрагировани  в цел х его улучшени  можно добавл ть соль: хлористый натрий, сульфат аммони  или т.п., По высушивании органического экст .ракта безводным сульфатом натри  тритиловый сложный эфир выдел ют из растворител  известными методами, например гель-фильтрацией с применением продуктов как Bio-Beads S-X3, Sephadex LH-20 или адсорбционной хроматограс ией с применением носителей, как силикагель, глинозем, фуллерова земл , Хритиловый сложный эфир далее очи щают кристаллизацией из растворител  или смеси растворителей, как бензол, толуол, ксилол, этилацетат, диэтиловый эфир, хлористый метилен, хлороформ, гексан, петролейный эфир (кип щий в диапазоне 30-60С). Среди сложных эфиров общей структурной формулы (III), которые можно, псшучить вышеприведенными способами, антибиотик тритиловый сложный эфир структурной формулы (П-а) S- cHi-cHj- iH-co-cHj Hj-CHj  вл етс  одним из наиболее полезHbik так как он более устойчив по сравне нию с антибиотиком структурной форм лы (I), его легче выделить, причем он сохран ет сильное антибиотическо действие и ингибирующее р)лактамаз действие, в то врем  как тритиловый сложный эфир известных пенициллинов не оказывает какого-либо ощутимого антибиотического дейстЗви . Далее, этот тритиловый сложный эфир структурной формулы (и-а) очень важен в качестве одного из активных сложных эфиров и полезного промежуточного продукта дл  синтезировани  других фармацевтических полезных продуктов поскольку тритиловуюгруппулегко отщепить . БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АНТИБИОТИКА ,ТРИТИЛОВОГО СЛОЖНОГО ЭФИРА Тритиловый сложный эфир антибиотика обладает широким спектром антибиотического действи , в частност против р да различных грам-положительных бактерий родов DipCococcus, Streptococcus, Staphy6ococcus, Sarcina , BaciCBus и тому подобных органиэмов , а также грам-отрицательных бактерий родов ABcaBigenes, Comamona к т. п. Тритиловый сложный эфир антибиоти ка также оказывает хорошее, действие против грам-отрицательнык бактерий родов Escherichia, KEebsietEa, Proteus . Существенной отличительной чертой тритилового сложного эфира антибиоти ка  вл етс  сильное действие против храм-отрицательных бактерий, устойчи вых против антибиотиков, обладающих 1 -лактамовой кольцевой структурой и относ щихс  к родам Citrobacter, Proteus, Enterobacter, K ebsiet6a, Serratia. Тритиловый сложный эфир антибиотика также обладает свойством повы .шать антибиотическое действие других антибиотиков, в частности (i-лактамо вых антибиотиков, как пенициллинов и цефалоспоринов, против образующих fr-лактамазу бектерий, как Citrobacte f eundii, Proteus vuEgaris, Enterobacter aerogenes., Serratia marcescen Тритиловый сложный .эфир антиб о и ка при введении мышам, зараженным па тогенными грам-положительными бактер (  ми, оказывает значительное терапевксйческое действие. Тритиловый сложный эфир при введении внутрибрюшинньм путем мышам в количестве 500 мг/кг не вызывает смерти подопытных животных. Антибиотик и его производные, в частности тритиловый сложный эф-ир, оказывают в пробирке и на живом организме действие на грам-отрицательные и грам-положительные микроорганизмы и вследствие этого полезны при борьбе с бактериальными инфекци ми и их предупреждении в организмах подопытных животных. Антибиотик или его тритиловый сложный эфир и соответствующие составы могут быть введены орально, местно или парентерально (внутривенно, внутримышечно , внутрибрюшинно и т. д.) и могут найти применение в целом р де различных фармацевтических препа- |ратов в зависимости .от способа введени . Так, например, антибиотик или его тритршовый сложный эфир можно . , сочетать с фармакологически совместиit/sbiM носителем, разбавителем в твердом виде (например в виде таблеток, , порошков, гранул, покрытых саха ,ром таблеток, лепешек, порошков дл  распьшени , суппозиториев и т. д.), в полутвердом виде (например в виде мазей, кремов, полутвердых капсул и, так далее), в жидком виде (например, в виде жидких растворов, эмульсий, , взвесей, лосьонов, сиропов, раствор.ов дл  инъецировани , жидких растворовдл  распылени  и т. д.). Единична  доза, содержаща  антиби- отик, или его тритиловый сложный эфир может содержать 0,1-99% по весу активного компонента в любом виде;- жидком , полужидком и твердом, i Таблетки и капсулы дл  орального. введени  могут быть получены в виде единичных доз и содержать св зывающие агенты, например сироп, аравийскую камедь, желатину, сорбитол, тригакант , поливинилпирролидон, или наполнители , например лактозу, сахарозу,, крахмал, фосфат кальци , сорбитол, глицин или смазывающие агенты, например стеарат магни , полиэтиленгликоль, тальк, кремнезем или другие; агенты распада, например картофельный крахмал; смачивающие агенты - лаурилсульфат натри  или др. -Таблетки могут быть покрыты в соответствии с общеизвестными методами. Жидкие препараты могут быть получены дл  орального введени  в виде мас ных или водшлх суспензий, раствоов , эмульсий, сиропов и так далее, или же их можно изготавливать в виде ухих прсйуктов, которые разбавл ют одой или другими соответствующими носител ми перед введением. Вышеприеденные жидкие препараты дл  орального введени .могут содержать следующие фармацевтически совместимые . ингредиенты; суспендирующие ингредиенты (например, метилцеллюлозу, сорбитоловый сироп, сахарный сироп, оксиэтилцеллюлозу , желатину, карбоксиметилцеллюлозу , гель стеарата алюмини , гидрогенированные съедобные жиры и масла), неводные носители (например , этиловый спирт, пропиленгликоль , масл нистые сложные эфиры, фракционированное масло кокосового ореха, миндальное масло); эмульгирующие агенты (например, лецитин на ос нове аравийской камеди, сорбитановый моноолеат); консервирующие средства (например, метил-п-оксибензоат, пропил-п-оксибензоат , сорбиновую кислоту ) . Суппозитории-могут содержать обыч ные основные продукты дл  этих средс как масло какао и различные глицерид Инъекционные составы могут быть получены в виде единичных доз в ампу лах или многодозовых емкост х с соде жанием консервирующего средства. Они могут иметь форму суспензий, растворов и эмульсий в масл нистых или вод ных носител х, а в соответствующем случае могут содержать суспендирующие или диспергирующие агенты и стабилизаторы . Антибиотик может быть по лучен в виде порошка, который можно комбинировать с непирогенной стериль ной водой перед применением. Составы, содержащие антибиотик или его тритиловый сложный эфир, могут быть получены в различных формах пригодных дл  адсорбции через слизис тую оболочку носа, горла, а также бронхов. Так, например, дл  этой цел предпочтительными  вл ютс  порощки или жидкие растворы дл  распылени , ингал ционные препараты, лепешки, полоскани  дл  горла и так далее, Дл  лечени  глаз и ушей антибиотик изготавливают в виде отдельных капсу дл  ввода по капл м в жидком или полужидком виде. Дл  местного применени  пригодны препараты на гидрофобвой или гидрофильной основах, как п рошки, лосьоны, кремы, мази. Составы могут содержать ингредиенты , например, консервирующие, про тизоокислительные, смазывающие, при дающие в зкость, ароматизирующие, суспендирующие, св зующие, стабилиз ющие продукты. В случае использовани  антибиот ка и/или его тритилового сложного эфира дл  лечени  инфекций в оргс1низ ме свиней, коров, овец, кур препсфатЦ могут быть получены в виде срегдст расположенных внутри молочной железы на основе веществ замедленного или скорого действи , например в виде концентратов дл  добавлени  в корм, Фармацевтические составы согласно изобретению могут содержать антибио -тик или его тритиловый сложный эфир виде единственного активного инредиента или же в сочетании с иными терапевтически действенными ингредиентами. Так как антибиотик и его тритиловый сложный эфир обладают синергистическим действием на различных образующих fb-лактамазу бактерий в сочетании с ib -лактамовыми соединени ми, их целесообразно комбинировать в . фармацевтических составах с Ь-лактамовыми соединени ми. В качестве подход щего р -лактамового соединени  используют бензилпенициллин, феноксипенициллин , карбенициллин, ампициллин и амоксициллин; а также производные цефалоспорина, как цефалоридин, цефалотин, цефазолин, цефалексин, цефокситин , цефацетрил, цефамондол, цефапирин , цефрадин и цефалоглицин. Примен ют антибиотик и известные fl-лактамовые соединени  в соотношени х от 20:1 до 1:150, предпочтительно, от 10:1 до 1:100. При лечении бактериальных инфекций у млекопитающих количество антибиотика его тритилового сложного эфира можно измен ть в зависимости от объекта лечени , веса тела, типа, серьезности и симптомов инфекции, способа и количества введений. При обыкновенном оральном ИЛИ парентеральном введении целесообразной  вл етс  суточна  доза 0,05-500 мг/кг, предпочтительно 0,5-200 мг/кг, более предпочтительно в виде частичных доз. Дозы вне приведенного диапазона также могут быть применены в зависимости от индивидуальных условий подвергаемого лечению организма. Антибиотик или его тритиловый сложный эфир может найти применение не только в фармацевтических.составах, а также может быть добавлен в виде концентрата или же непосредственно в корм. Дополнительно его можно использовать в качестве активного ингредиента дл  консервировани  кормов или их дезинфекции. Во всех примерах качественные и количественные опыты на противомикробное действие основаны на следующей методике. Биоиспытание на противомикробное дей зтвие. Полученную за ночь культуру Comainonas terrigena В-996 на косом питательном агаре взвешивают в питательном бульоне с целью достижени  оптической плотности клеток пор дка 0,040 при 610 нм. Пссевную взвесь добавл ют в количестве 1% в расплавленную агаровую среду, содержащую 0,8% питательного бульонного порошка (Kyokuto Nutrient Broth Powder) и 1% Bacto-Agar. 7 мл засе нной расплавленной агаровой среды распредел ют в чашке Петри диаметром 9 см и дают отвердеть. По лучают пастину типа Comamonas. Организм StaphyEococcus aureus FDA 209 Р культивируют за ночь в пи тательном бульоне со встр хиванием, разбавл   50 раз питательным бульоном дл  получени  посевной взвеси, 1% по объему этой взвеси тщательно смешивают с расплавленной агаровой средой, содержащей 1% Kyokuto Nutrie Broth Powder и 1% Bacto-Agar. 7 мл каждой из засе нной расплавленной агаровой среды вливают с гелеобразо ванием в. чашку Петри диаметром 9 см. Э.ту пластину обозначают биопластиной типа StaphyEococcus. Аналогично получают биопластину типа ACcaligenes. Полученную за ночь питательную культуру на косом агаре организма AEca igenes faecaCis В-326 взвешивают в питательном бульоне, получа  суспензию из сем н, концентрацию клеток которой довод т до оптической плотности 0,020 при 610 нм. Агаровую среду, состо щую из 0,5% Kyokuto Nutrient Broth Powder и 1% Bacto-Agar, расплавл ют при допустимой температуре и засевают 1,0% прививочного материала посевной суспензии . 7 мл засе нной расплавленной аг ровой среды распредел ют в чашке Пет ри диаметром 9 см и дают образоватьс  гелю. Эту пластину назьшают биопластиной типа AEcaEigenes. Пульповый кружок (8 мм) -обычным способом пропитывают раствором испытуемого образца, выдерживают на чистом листе фильтровальной бумаги в течение времени, достаточного дл  удалени  избыточного раствора и затем перенос т на биоиспытательную пластину. После инкубации при 35°С в течение 20 ч замер ют диаметр обра зовавшейс  зоны ингибировани  и срав нивают со стандартными растворами це :фалоридина. Антимикробное действие антибиотика и-родственных соединений выражают в виде единиц цефалоридинового эквивалента на мл. В частности, раствор антибиотика и родственных соединений согласно изобретению, показывающий тот же диа метр зоны ингибировани , как 100 мг/ дефалоридина, выражают, как 100 цефа . лоридиновых единиц/мл. Аналогично, е ли твердый образец антибиотика и род ственных соединений согласно изобретению дает при концентрации 1 мг/мл тот же диаметр, как 1 мг/мл цефалори дина, специфическа  активность тверд го образца будет выражена, как 1 Цефалоридинова  единица на мг. Стандарт на - крива  биологического опыта немн |го измен етс  в зависимости от рода испытуемого организма. Дл  обозначен подопытных микроорганизмов примен нгт следующие названи  - сокращени : Comamonas цефалоридинова  единица JCCV) , Staphygococcus - це.фалоридинова  единица (SCV); AEcaEigenes - цефалоридинова  единица (ACV). Биоавтографи . Изготавливают большую биоиспытательнуюпластину за исключением того, что 100 мл засе нной расплавленной агаровой среды вливают в пр моугольн то чашку 32 х 24 см, а не в чашку Петри (9 см). Подлежащую биоиспытанию бумажную хроматограмму помещают на 15 мин на эту большую испытательную пластину. По удалении бумаги испытательную пластину инкубируют 20 ч при З5с в цел х обнаружени  зон ингибировани . Эта техника позвол ет не только вычитывать значение ( ) Rf (качественное испытание), то также и определить ан .тимикробное действие, основыва сь на размерах зоны-ингибировани . В случае применени  пластины дл  тонкослойной хроматографии между ней ii поверхностью испытательной пластины помещают тонкую бумагу. Аналогичный способ примен ют дл  качественного и полуколичественного биологических испытаний. Пример 1. Колбу Эрленмайера емкостью 500 мл, содержащую посевную культуральную среду, стерилизуют при 120с в течение 15 мин. К богатой спорами косой культуре организма Streptoravces А 271 добавл ют 10 мл 0,02% iween-SO, после чего смесь слегка перемешивают , получа  суспензию спор. Колбу Эрленмайера емкостью 500 мл инокулируют 1 iJm споровой суспензии, встр хива  затем в цел х культивировани  48 ч при 28С на ротационном вибраторе . Затем 2 мл посевной культуры инокулируют в каждую из 6 колб Эрленмайера , из которых кажда  содержит 100 М.П описанной среды, после чего 48- 96 ч культивируют, встр хива  при на ротационном вибраторе. Среда посевной культуры, вес.% М сной экстракт 0,3 Bacto-tryptone0,5 Глюкоза0,1 Крахмал растворимый 2,4 Дрожжевой экстракт 0-, 5 Карбонат кальци  0,4 Обезжиренна  соева  мука0,5 рН перед стерилизацией 7,5; после стерилизации 7,1; через 2 дн  ферментации - 7,4. Производственна  среда, вес.% Среда AG-1 Глюкоза1 / 5 . Крахмал кукурузный 2,5 Жидкость от. замочки кукурузы 2,0 Сухие дрожжи1,0 Метионин 0,1 0,00013 сосе2- рН перед стерилизацией 7,2; после сте1рилйзации - 6,1; через 4 дн  фермента|ции - 7,8. Продолжение табл. Элюаты №№ 8-14 соедин ют, концен рируют до 100 мл при температуре ни же 30°С на ротационном выпарном аппа рате и затем сушат замораживанием с получением 2,6 г желтовато-коричнево го порошка. Этот порошок раствор ют в дистиллированной воде с концентра цией 500 ecu/мл. Растворы на основе фосфатного буфера заданных рн получают доведением 15 М дикалийфосфата до необходимого значени  с помощью 5 и. гидроокиси натри  или 5 н. фосфорной кислоты. В 1 мл раствора антибиотика добавл ют 1 .мл фосфатного буфера и значение рН довод т до первоначального. Растворы антибиотика с изменением рН выдерживают 30 мин при в вод ной бане, охлаждают под проточной водой и нейтрализуют до рН 7,0 небольшим, количеством 5 н. гидроокиси натри  или 5 н. фосфорной кислоты. Контроль , ную трубку, соде зжащую раствор антибиотика PS-5 с рН 7,0 помещсшт на лед ную баню на полчаса. Остаточную антимикробную активность замер ют описанным способом с применением в качестве подопытного микроорганизма Comamonas terrigena В-996. Остаточна  активность, % Эти результаты показывают, что по лученный в насто щем примере желтова токоричневый порошок заметно стабилен при рЫ диапазона 6,9-9,0 в течение 30 мин при 60°С.Устойчивость айтибиотика повышаетс  при болеенизких температурах даже при кислом рН. Так, например, после обработки антибиотика при рН 3,0 в течение 5 мин при -17С по меньшей мере 30% первоначального антибиотического действи  еще можно установить. Пример 3., Экстракци  при низкой температуре и -бутанолом. Большую исп : 1тательн ю трубку, содержащую 20 мл дистиллированной воды, 12 мл н-бутанола и 7 г хлористого натри , охлаждают до -17с без замораживани . Желтовато-коричневый порошок антибиотика полученный в примере 2, разбавл ют до концентрации 200 мг/мл в дистиллированной воде и предварительно замораживают, 1 мл холодного раствора антибиотика добавл ют в эту испытательную трубку, быстро довод т рН до 2,75, 3,0 или 3,25 с помощью серной кислоты и выдержива  температуру смеси ниже - Ю-С. После тщательного перемеш1шани  регенерируют н -бутаноловый слой и тщательно смешивают с 5 мл 0,5 М (рН 6,8), перенос  активный компонент в водный слой. ; Пример 4. Получение порошка , аналохично примеру 2 из 100 л бульонного фильтрата после сушки замораживанием получают 27,7 г желтовато-коричневого порошка антибиотика. Этот порошок (активность 13,2 CCU/мг) раствор ют в 30 мл 25 М фосфатного буфера (рН 6,8) и помещают на колонну из QAE-Sephadex А-25 основна  анионнообменна  смола, полностью переведен:на  в четвертичное соединение, полученна  вводом диэтил-2-оксипропиламмониевых групп в декстрановый гель (3,3 X 25,0 см). После промывки небольшим количеством того же фосфатного буфера активную фракцию элюируют тем ке буфером, содержащим хлористый натрий в концентрации 0,5 М в ходе элюировани . Активную фракцию (300 мл) охлаждают до 0°С и обрабатывают б г активного угл . Активный уголь собирают , промывают водой к элюируют 50% по объему ацетона. По удалении ,ацетона выпаркой при температуре ниже 30°С 727 мг коричневато-желтого пороапса натриевой соли антибиотика регенерируют лиофилизацией. Удельна  активность препарата - 264 ССи/мг. Пример 5. Получение порошковой дэаэ-целлюлозы. 727 г полученного в примере 4, коричневато-желтого порошка антибиотика раствор ют в 1 мл 25 М фосфатного буфера (рН 6,8) к загружают на колонну (1,5 X 27,0 см из BiO-Gee Р-2 (поперечно сшитый синтетический сополиерный состав в виде катализирующего сло  на основе метилен.-бис-акриламид него сополимера, уравновешенного тем же фосфатным буфером. Про вл   тем же самым фосфатным буфером, получают активную фракцию в количестве 15 мл. Полученную активную фракцию помещают на колонну (2,5 х 28,0 см) из диэтиленминоэтиловой (ДЭАЭ) целлюлозы DE 32, уравновешенной тем же самым фосфатным буфером. Элюирование осуществл ют линейным градиентом хлористого натри  в том же фосфатном буфере (0-0,5 М). Полученную активную фракцию (240 мл) адсорбируют на 4,5 г активного угл , при . Активный уголь с:обирают фильтрацией, промывают водо и элюируют 50% по объему ацетона. Аце тонный элюат выпаривают при температуре ниже до полного удалени ац тона, лиофилизиру  затем с получением 120 мг коричневато-белого порошка натриевой соли антибиотика PS-5. Удельна  активность этого препарата состав л ет 60.0 ССи/мг. Пример 6. Высокоочищенный препарат антибиотика. Аналогично примеру 1 организм Streptomyces А 271 культивируют в колбе Эрленмайера емкостью 500 мл, содержащей 100 мл среды SE-4 инокулиру  затем в 30-литровый ферментатор , содержащий 15 л среды SE-4. Куль тивирование продолжают 24 ч при28°с и 200 об/мин с принудительной аэрацией в объеме 7,5 л/мин, получа  культуру сем н. 2 емкости дл  ферментации емкостью в 200 л, выполненные из нержавеющей стали, наполн ют каждый 200 л среды ML-19, содержащей 2,5% обезжиренной соевой муки, затем обрабатывают в ав токлаве, инокулируют 1 л посевной культуры микроорганизма Streptomyces и 271, полученной описанным способом и ферментируют 12 ч с аэрацией и пере мешиванием. Содержимое обоих сосудов соедин  ОТ, смешивают с 5% по весу Торср Pertite, Торсо N 34 (Торсо Pereite Kogyo К.К.) и фильтруют через фильтр-пресс, получа  160 л буль онного фильтрата. Антибиотичный титр этого фильтрата оказываетс  равным 235 ССи/мл. Этот бульонный фильтрат пропускают через колонну из ионообме ной смолыDIAION РА-306 (сильно осно на  днионноабменна  -смола, с поперечн сшитой полистироловой матрицей и; три метиламмонийхлоридными звень ми) 10 X 52 см, 4,5 мл влажного объема без остатка. Затем активный продукт, про пущенный через эту колонну, адсорбир ют -на колонне из DIAION НР-20 (14 х X 97 см; 15 л) и элюируют 75% метано ла. Собранный активный элюат (2 л, 9,854 ССи/мл) трижды разбавл ют 4 л поды и загружают на 2-литровую колон ну (5,5 X 84 см) иэ DIAION PA-306S. После промывки 500 мл воды антибиоти ческий материал элюнруют 8 л линейного натрийхлоридного градиента 0-3% и собирают по фракци м в 200 мл. Активные фракции №№ 17-31 собирают, поуча  2,8 л активного элюата (4,120 си/мл). Этот элюат снова загружают на 1-литровую колонну из DIAION НР-20 (4,5 X 63 см) и элюируют 3-литровым линейным градиентом ацетона от О до 25%. Объем каждой фракции составл ет 30 мл. Активный элюат (390 мл 27,220 оси/мл) выдел ют, соедин   антимикробно активные фракции №№ 54-66. По удалении ацетона перегонкой под пониженным давлением элюат DIAIOl НР-20 пропускают через колонну емкостью 200 мл из QAE-Sephadex А-25 (2,5 X 41 см). Антимикробное активное вещество собирают по фракци м в 10 мл путем элюировани  2-литровым линейным натрийхлоридным градиентом (0-1,5%). Фракции №№ 68-81 соедин ют в качестве активного элюата (140 мл; 42, 120 ССи/мл). рН этого элюата QAE-Sephadex А-25 осторожно довод т до 8,3 с применением 1%-ной гидроокиси натри  и загружают на колонну из 200 мл DIAION HP-20AG (2,5 X 41 см). Элюирование линейным градиентом осуществл ют с применением 1 л водного ацетона от О до 10%-ного, Объем каждой фракции составл ет 10 мл. Фракции №№ 48-53 соедин ют, получа  60 мл активного элюата (45,000 CCU/мл). Сушкой замораживают , получа  249 мг желтого порошка (8,000 ССи/мг). : В цел х дальнейшей очистки 150 мг этого желтого порошка раствор ют в небольшом количестве 0,01 М натрийсульфатного буфера (рН 8,0),,пропуска  через колонну (130 мл; 1,5 х X 73 см) из Sephadex G-10 (декстрановый гель в виде катализирующего сло , получаемый сшиванием декстрановых фракций эпирхлоргидраном) . Антибиотик про вл ют 0,01 М натрийфосфатным буфером (рН 8,0-), фракциниру  элюат, 36 мл активного элюата получают из фракций №№ 38-55 (65,000 ССи/мл). Элюат Sephadex G-10 хроматографируют на колонне из QAE-Sephadex А-25 (100 мл; 2,0 X 32 см) с последующим элюированием с применением линейног .о градиента посредством 1 л раствора хлористого натри  от О до 1,5%-ного . Объем фракций - 10 мл. В качестве активного элюата собирают 5 активных фракций №№ 48-52 (50 мл; 22,000 ССи/мл). рН этого активного элюата осторожно довод т до 8,3 посредством 1%-ной гидроокиси натри  и загружагот на колонну из 50 мл DIAION НР-20. (1,2 х X 44 см) . Натриевую соль антибиотика выдел ют из фракций 5 мл элюированием лин ным градиентом посредством 400 мл водного ацетона от О до 10%-ного. Активные фракции №№ 39-41 собирают лиофилизируют, получа  51 мл белого порошка (21,000 CCU/мг). Такой препарат на основе натриево соли антибиотика представл ет вещест во белого цвета, растворимое в водр и нерастворимое в ацетоне. При замере в аппарате дл  измерени  микроточки плавлени  Кофлера ВУ- при повышении температуры со скоростью l C/MHH этот препарат не показывает  сной точки плавлени . Он ста новитс  желтым около 148С и постепе но разм гчаетс  вы1 е 1бО°С. Около 203С оттенок препарата медленно пер ходит из желтого в коричневый цвет. При 220°С - коричнева  смола. УФ-спектр поглощени . 60 мкг натриевой соли антибиотика раствор ют в 3,0 мл воды, замер   в спектрофотометре. Замеренные результаты/ полученные расчетным путем следующие са .246 nm ( 82,0 301 nm (11° 267,5). в водный раствор этого препарата (21,000 ССи/мг) в дистиллированной воде добавл ют гидроксиламйновый раствор (рН 7,5) дл  получени  реакционной смеси, содержащей 21,3 мкг/мл натриевой соли антибиотика и 10 мМ гидроксиламина. Через полчаса при 22°С реакционна  смесь тер ет около 94% первоначальной оптической плотности при 301 нм. ИК-спектр поглощени . Характерные максимумы поглощени  наблюдаютс  при указанных длинах волн; около 1750 см (-СО- в р-лакта мовом кольце) ; около 1650 см- (-СО- Б агишдной св зи) ; около 1640 - 1540 см- (-COCf) . ПМР-спектр. НижеприведенньЕ харак терные сигналы получены в виде измерени : триплет с центром около 1,06 .частей/миллион (J -около 7,5 Гц) (CH -CHg-); мультиплет в области 1,7 2,00 частей/миллион ); резкий сйнглет около 2,65 частей/мйлЛИОН (); мультиплеты в области 2,88-3,58 ч/м (-СН-, -СН-); мультиплет в области 3,9-А, 20 ч/м (-СН-) Цветова  реакци . Реактив Эрлиха положительна  реакци  Йодоплатинат То же Нингидрин Отрицательна  реакци . Удельное вращение. -Тц- + 1,23 (с 1,59, 0,01 М, рН 8) трийфосфатный буфер. Тонкослойна  хроматографиа (ТСХ). Натриевую соль антибиотика подверют тонкослойной хроматографии в уканных услови х. Значени  Rf опредеют биоавтографией. Целлюлозна  ТСХ-пластина. Система растворителей R(f) н-Бутанол(этанол)вода -7/7/6/по объему . 0,94 Изопропанол/вода -7/3 по объему0,96 Силикагельна  ТСХ-пластина предвательно покрыта  Силикагельна  пласна 60 F.-,. ) . Система растворителей Этанол/вода - 7/3 по объему н-Пропанол/вода - 7/3 по объему ажна  хроматографи . Натриева  соль антибиотика дает дующие значени  R(f) на фильтруюбумаге Тоуо Fitter Paper N 50 , казанных услови х Система растворителей н-Пропанол/вода -7/3 по объему0,68 н-Прогтанол/изопропанол/вода - 7/7/6 по объему 0,70 Ацетонитрил/вода - 8/2 по объему 0,36 Ацетонитрил/трис-буфер/ ЭДТА0,34 ( Смесь растворителей, состо ща  из 120 мл ацетонитрила , 30 мл буфера на основе М/10 трис(оксиметил)аминометанхлористоводородной кислоты рН 7,5 и 1 мл М/10 этилендиаминтетраацетата рН 7,5) Этанол-вода - 7/3 по объему . 0,63 Высоковольтный бумажный электро- ез. Натриевую соль антибиотика аналиуют высоковольтным бумажным электорезом в указанных услови х. Фильтровальна  бумага дл  анали- Тоуо Fitter Paper N 50. Полученные результаты следующие: проведении электрофореза в тече30 мин с охлаждением ниже f С потенциале 42 В/см в буфере (рН ), содержащем 3,3 г барбитал  и 5 г мединала в 3000 мл воды, антитик мигрирует к аноду (28 мм). - Магнитный резонансный спектр Примен   в качестве внутреннего ндарта диоксан С -магнитный резосный спектр натриевой соли антибика в т желой воде замер ют с помоспектрометра . Получают следующие актерные сигналы: ( 1)184,04 ррт ( 2) 174,96

169,29 141,11 130,40

(диоксан) 67,39 60,19 55,63 40,41 40,00 31,49 22,62 22,46 11,36

Антимикробный спектр действи . Значени  минимальной ингибирующей концентрации (МИК) натриевой соли антибиотика определ ют на различных патоген- 4нын -микроорганизмах, включа  устойчивые штаммы, методом разбавленного бульона,

Натриевую соль антибиотика раствор ют в бульоне Brain Heart infusion Broth .Eiken (pH 7,0) при концен- 20 трации пор дка 5-50 мкг/мл, из кото- рого изготавливают р д разбавленных продуктов в той же жидкой среде. Микроорганизмы культивируют 18 ч в буль-. Примечание:

оне Brain Heart jnfiision Broth EiKen при 28 С при окончательном размере прививочного материала 1x10 клеток/мл Культуре дают сто ть 20 ч при , после чего регистрируют рост микроорганизма каждого образца разбавленного антибиотика. МИК показывает минимальную концентрацию антибиотика (натриевой соли его), где визуально нельз  определить размножени  основного микроорганизма. В качестве контрол  2 известных Ъ -лактамовых антибиотика - цефалоридин и цефокситин раствор ют в бульоне brain heart infusion broth (рН 7,0) при концентраци х пор дка 1-100 мкг/мл и затем разбавл ют в цел х получени  р да разбавленных культур в приведенной жидкой среде. Эти образцы обрабатывают способом, описанным дл  определе ни  МИК.

В табл. 4 приведены полученные результаты (дополнительно к значени м МИК антибиотика дл  сравнени  включены данные дл  цефалоридина и цефокситина ).

Таблица 4 + образующийр-лактамазу организм; 2+ устойчив к анамицину/ гентамицину и тобрамицину; 3 устойчив к гентамицину и тобрамицину, 4+ - в среде добавлено 10% лошадиной крови.

Усилие антимикробного действи  известных (Ь -лактамовых соединений против микроорганизмов, устойчивых к /i-лактаму.

10 мл расплавленного питательного агара, содержащего 50 мкг/мл пенициллина G или цефалоридина, 0,8% бульонного порошка Kyoto Nutrient Broth Powder и 1,0% агара Difco Bacto-Agar (pH 7,0) засевают микроорганизмами, устойчивыми к {Ь-лактаму и образующими (5-лактамазу, вылива  затем в чаш;ку Петри (9 см) в цел х получени  биоиспытательной агаровой пластины.

Устойчивый кр -лактаму

На эту агаровую пластину помещают пульповые кружки (8 мм), содержащие ,каждый 25 мкл растворов антибиотика PS-5 в заданной концентрации, после чего инкубируют при в течение 18 ч перед регистрацией зон ингибировани . Контрольную испытательную пластину изготавл ют аналогично, но без пенициллина G или цефалоридина. ,В контроле на пластинах испытывают :В тех же услови х пенициллин G, ам:пициллин , оксациллин и цефазолин.

В табл. 5 и 6 приведены полученные результаты.

Таблиц-а 5

27

73851728

Наблюдаетс  сильное ингибирование пенициллиназы микроорганизма Proteus vuCgaris за счет действи  антибиотика . При наличии 1/42 эквивалента антибиотика в пенициллине G в качестэе субстрата более 50% активности

Таблица 6

Proteus Р-5-р1-лактамазы ингибируетс .

Пример 7. Способ получени  (препарата тритилового сложного эфира 65 Антибиотика. 30,0 г желтовато-коричневого лио филизированного порошка натриевой со ли антибиотика (удельной активности 27 ССи/мг) раствор ют в 100 мл диметилформамида с добавлением 3,0 г три тиламина, Охлажца  льдом, в реакцио ную смесь добавл ют 9,0 г тритилхлорида с вьщерживанием температуры раствора ниже . После перемешивани  в течение 12 ч при 5°С весь активный материал антибиотика превращаетс  в продукт тритилировани . .Реакционный раствор выливают в 1000 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 6,8), экстрагиру  затем трижды 1000 мл этилацета та в каждом случае. Этилацетатные экстракты соедин ют, дегидратируют безводным сульфатом натри  и выпарив ют досуха при по,ниженном давлении. Остаток от выпарки раствор ют в 20 м бензола и пропускают через колонну из Bio-Beads S - ХЗ (пористый слой стиролдивинилбензольного сополимера дл  гельпермеации; 4,5 х 60,0 см), /которую предварительно уравновешиваю бензолом. Колонну про вл ют бензолом Активна  фракци , показывающа  антибиотичное действие на испытательной пластине Comamonas, концентрируетс  досуха при пониженном давлении. Полученный остаток раствор ют в 1 мл бензола и загружают на силикагелевую колонну (25 г; 1,5 х 24,0 см). После промывки бензолэтилацетатной .. смесью (10:1) в цел х удалени  остаточных реактивов, активный материал элюируют бензолэтилацетатной смесью (1:2). Активный элюат выпаривают досуха под пониженным давлением и снова раствор ют в 0,5 мл бензола . Бензольный раствор помещают на нейтральную колонну из окиси алюмини  и про вл ют бенэолэтилацетатной смесью при различных соотношени х (10:1, 6:1, 4:1, 3:1, 2:1 и 1:1). Активные элюаты соедин ют и выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток от выпарки раствор ют в 0,3 мл бензола, загружают На силикагелевую колонну (10 г,, 0,9 х 22,0 с По удалении примесей с помоЩью бензо этилацетатной смеси (10:1) активный материал элюируют бензолэтилацетатно смесью (1:2) и концентрируют под пониженным давлением с получением твер дого порошка. Полученный порошок раствор ют в 0,5 мл бензола и очищают на колонне Bio-Beads S - ХЗ. (1,2 х 96 см) с применением бензола в качестве агента про влени . Активный элю ат выпаривают досуха в вакууме. Полу ченный сухой порошок раствор ют в 0,5 мл ацетона и подвергают гель-. .фильтрации с применением колонны Sephadex LH-20, декстрановый гель в виде сло , получаемый поперечным сши ванием декстрановых цепей оксипропилированием (1,2 х 96,0 см), которую предварительно наполн ют ацетоном до взбухаии . Активную фракцию выпаривают досуха, получа  23 мг белого порошка. Перекристаллизацией этого порошка из бензолгексановой смеси получают 12 мг бесцветного кристаллического порошка-продукта (10,800 ССи/мл). Бесцветный кристаллический продукт  вл етс  тритиловым сложным эфиром антибиотика. Растворимость продукта тритилировани  антибиотика определ ют растворением со встр хиванием 5 мг в каждом случае продукта тритилировани  антибиотика PS-5 в 0,1 мл каждого из испытуемых растворителей при 20с. Результаты следующие: в основном не раствор етс  в воде, И-гексане и петролейном эфире (т. кип. ЗО-бО С). Высокорастворим в бензоле, этилацетате, хлороформе, метаноле., этаноле, ацетоне , диметилформамнде (ДМФ) и диметилсульфоксиде (ДМСО). Устойчивость. Тритиловый сложный эфир антибиотика раствор ют в 1 единице по объему метанола, разбавл   затем 9 единицами по объему дистиллированной воды, как только оказываетс  возможным получить раствор 125 ССи/мл 10 М раствор дикалийфосфата обрабатывают 5 н. фосфорной кислотой или 5 н. гидроокисью натри  до достижени  рН 3-9. К 1 1ЧЛ каждого из фосфатных буферов добавл ют 1 мл каждого из упом  нутых растворов тритилового сложного эфира антибиотика; в соответствующем случае рН смеси подрегулировывают до требуемого значени  с применением фосфорной кислоты или гидроокисью натри . Раст-вор смеси вьдерживают в вод ной .бане 30 мин при , охлаждают проточной водой и нейтрализуют до рН 7,0 небольшим количеством фосфорной кислоты или гидроокиси натри . Контрольный раствор (рН 7,0) выдерживают на лед ной бане на прот жении всего опыта. Остаточный антибиотичный материал испытывают обьгчным биоиспытательным методом с применением в качестве подопытного микроорганизма Comaraonas terrigena В-996. Продукт тритилировани  антибиотика плавитс  при 83,5-85,, постепенно станов сь коричневым при температуре выше 140°С. УФ-спектр поглощени  продукта тритилнровани  антибиотика согласно изобетению регистрируют с помощью спектофотометра при концентрации 128 мкг/3 мл метанола. С° 315,5 (Е 156) Характерные максимумы поглощени  наблкщаютс  при следующих диапазонах волн: 3430, 3100-3000 (С-Н фенильной группы ) ; 2990,2950,1770 (С-О р-лактамового кольца) ; 1695 (-СО-амидной св зиГ 1665 (--СО-0, сложноэфирной св зи) ; 1445, 1340, 1275, ИЗО спГ. , ПМР-спектр. Самые характерные сиг налы следующие: триплет около 1,10 ч ( 3 - около 7,0 Гц); синглет при 1,86 ч/м; мультиплет в области 7,107 56 ч/м (протоны в бензольном кольце тритиловой группы). . Элементарный анализ. 3,5 Ml продукта тритилировани  ан тибиотика сушат .при комнатной температуре „. ч при пониженном давлении 1 X 10 мм рт.ст. и подвергают элемен тарному анализу. Найдено, С 61,89%; Н 5,78%; N 4,48%; S 4,62%. Цветова  реакци . Реактив Эрлиха Положительно ТрифенилтетразолийОтрицательно Xлорид Отрицательно Хлорид железа Хлористое железоОтрицательно йод Йэдплатинат Положительно Гид рокеиламинПоложительно хлористое железо Хлортолидин Положительно Отрицательно Нингидрин Тонкослойна  хроматографи  (ТСХ) Трити/ овый сложный эфир антибиоти ка дает следу1ощие- значени  R в зада ных услови х. Сторону миграции опред л ют биоавтографией на Comamonas ter rigena В-996. Силикагельна  ТСХ: пластина,предв рительно покрыта , силикагельна  60 Р 54Система растворителей: бензол/ацетон (2:1) R : 0,29. Цэллюлозна  ТСХ: пластина Eastman Chromagran Sheet 13254 Ce&EuE-ose с флуоресцентным реактивом., (NO 6065) . РастворительR(f) Верхн   фаза,и-бутанол/ /этанол воды (4:1:5)0,56 м-Бутанол,1,0

StaphyEOCOCCUS aureus FDA 209 р StaphyKococcus aureus Smith Dip ococcus pneumoniae Type III Streptococcus pyogenes NY-5 Sacrina Eutea S-19 Escherichia co2i К 12

Claims (1)

1. 0,04 0,04 0,01 0,01 0,05 2,5 Изопропанол/вода (8:7) 0,91 Изопропанол/вода (1:4) 1,0 Молекул рна  структура антибиотика и приведенные физико-химические свойства подтверждают структурную фо. мулу тритилового сложного эфира антибиотика . Биологические свойства тритиловогс.. сложного эфира. Антимикробный спектр действи . Значени  МИК соединени  определ ют на различных патогенных микроорганизмах , включа  определенные устойчивые штаммы, с применением метода разбавле. ни  бульона. В частности тритиловый сложный эфир антибиотика раствор ют в небольшом количестве метанола и разбавл ют, как только становитс  возможным в бульоне Brain Heart Dnfusion Broth Eiken до концентрации тритилового сложного эфира антибиотика пор дка 40-20 мкг/мл. Ко.нцентраци  метанола в целевом растворе не превышает 10%. Этот раствор разбавл ют согласно двукратному геометрическому р ду.. Микроорганизмы, приведенные в табл,.. 7, культивируют 18 ч при 28°С в бульоне и инокулируют с получением серий разбавленного продукта с окон 1ательным размером прививочного материала 1 X 10 клеток/мл. Результаты регистрируют после инкубации при в течение 20 ч. Значени  МИК показывают низшую единицу концентрации продукта тритилоровани  антибиотика, когда не наблюдаетс  роста соответствующих микроорганизмов в описанных условийх . В качестве контрольных антибиотиков изготавливают растворы ампициллина и .цефалоридина при концентрации 100 мкг/мл с обработкой, аналогичной обработке соединени  согласно изобретению . В табл. 7 сведены значени  МИК тритилового сложного эфира антибиотика вместе с таковыми ампициллина и цефалоридина в качестве контрол . Таблица 7 Как видно из таблицы, тритиловый сложный эфир антибиотика оказывает широкое антимикробное действие, в ча стности сильное антибиотичноё деиствие на различные штаммы микроорганиз мов, устойчивых к р-лактаму {образую щих fb-лактамазу) . УСИЛЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ТРИТИЛОВОГО СЛО НОГО ЭФИРА АНТИБИОТИКА НА АНТИБИОТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПЕНИЦИЛЛИНОВЫХ И ЦЕФАЛОСПОРИНОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ ПРОТИВ УСТОЙЧИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ Испытательные чашки Петри (диаметром 9 см), содержащие устойчивые микроорганизмы, получают нанесением 10 мл расплавленного питательного ргара с посевом микроорганизмов ус- гойчивых к р-лактаму (образующих |}-лактамазу) , на твердый основной слой питательного агара (рН 7,0 , 15 мл), .содержащего 50 мкг/мл пенициллина G или цефалоридина. ИспыjПродолжение табл. 7 туемые антибиотичные растворы помещают на пульповый кружок (8 мм) в крличестве 25 мкл и затем на испытательные пластины. После инкубации при . 35°С в течение 18 ч замер ют зс-ну ингибировани  и сравнивают с результатами на соответствьтощнх пластинах, не содержащих ни пенициллина G, ни цефалоридина. в табл. 8 приведены результаты, Из данных табл. 8 совершенно  сно, что комбинаци  продукта тритилировани  антибиотика в концентрации ниже нижнего предела биологического опыта с пластинами с пенициллином G или дефалоридином в концентрации ниже этого предела дает значительную зону ингибировани . Этот факт  сно подтверждает усиление антибиотического действи  пенициллина G или цефалори (Цина продуктом тритилиррвани  антибиотика . Подтверждение антимикробного синер гизма продукта тритилировани  антибиотика и цефалоридина путем метода разбавлени  бульона на штамме Proteus vufigaris, устойчивом против | -лактам Штамм Proteus vuEgaris Р-5, устойчивый к р -лактамовым соединени м за -счет образовани  р)-лактамазы, поэт му примен ют сочетание 7,5% МИК цефалоридина с 12,5% МИК тритилового слож ного эфира антибиотика, что ингибируе рост подопытного микроорганизма. Активность на живом организме продукта тритилировани  антибиотика замер ют на мьошах, инфицированных внутрибрюшинно организмом StaphyEococcu aureus Smith в количестве 5 х 10 кле ток на мышь. Тритиловый сложный эфир антибиотика ввод т подкожно непосредственно после заражени . 50%-на  лечебна  доза у мышей-самцов составл ет 2,55 мг/кг (27.540 CCU/кг). Ингибирующее р-лактамазу действие 50% гидролизата цефалоридина ингибируетс  посредством 0,60 и 0,80 мкг/мг продукта тритилировани  антибиотика PS-5 в ходе опыта (-лактамазой Proteus vuEgaris Р-5 и Citrobacter freundii Е-9, соответственно. Токсичность. Тритиловый сложный эфир антибиотика PS-5 не вызывает смертельного действи  у мышей-самцов при внутрибрюшном введении в количестве 500 мг/кг. Пример 8. Способ получени  продукта тритилировани  .антибиотика Коричневато-желтый порошок натриевой соли антибиотика PS-5 (715 мг, 235 ССи/мг), полученный аналогично примеру 4, раствор ют в 3,5 мл гексаметилфосфортриамида . По добавлешик 70 мг триэтиламина с охлаждением льдом, в смесь добавл ют 250 мг триi a б л и 1.1; a тилбромида при температуре ниже 10°С. Смесь перемешивают при в течение 7 ч в цел х завершени  реакции тритилировани . Реакционную смесь выливают в 50 мл лед ной воды и вьщерживанзт до расплавлени  твердого льда. Тритиловый сложный эфир антибиотика трижды экстрагируют с применением 15 мл бензола (каждый раз) и обрабатывают аналогично примеру 7, получа  9,4 мг бесцветного кристаллического порошка. Физико-химические свойства этого препарата аналогичны примеру 7. Пример 9. Получение продукта тритилировани  антибиотика в присутствии CROWN-эфира. Сырой коричневато-белый порошок (10,1 г) лиофилизации, полученный аналогично примеру 2, взвешивают в 20-0 мл хлористого метилена и раствор ют с перемешиванием и добавлением 1 мл 15 - Crown - 5. Вьвдержива  температуру раствора ниже 5С с помощью льда, добавл ют 8,5 г тритилхлорида. Реакционную смесь нагревают до комнатной температуры и перемешивают 3 ч. После фильтрации фильтрат выпаривают досуха при пониженном давлении. Остаток раствор ют в. 10 мл бензола за один прием, фильтруют и очищают аналогично примеру 7, получа  7,3 мг бесцветного кристаллического порошка. Пример 10. Способ получени  продукта тритилиров.ани  антибиотика в присутствии четвертичной аммониевой соли. Антибиотик экстрагируют из 48 л бульонного фильтрата (11,7 CCU/мл) два раза с применением 15 л в каждом случае дихлорметана, содержащего . ,0,05% цетилдиметилбензиламмонийхлорира (активность дихлорметановогр экстракта 24,0 CCU/м-п; активность исполь зуемого бульонного фильтрата.- 5,7 ССи/мл). Дихлорметановый экстра сушат 4UU г безводного сульфата натри  и выпаривают до 500 мл под по ниженным давлением на ротационном выпарном аппарате. Концентрат (450 ССи/мл) дегидратируют вначале 10 г безводного сульфата натри , а затем по фильтрации - 5 г молекул ,рного сита 4 А, В этот сухой раствор добавл ют 4,5 г тритилхлорида при температуре ниже 5с, перемешива  смесь 5 ч при 5с. По удалении дихлорметана выпаркой при комнатной температуре, остато раствор ют в 15 мл бензола и очищают аналогично примеру 7, получа  8 мг безводного кристаллического порошка тритилового сложного эфира антибиоти ка. Физ.ико-химические свойства этого препарата почти идентичны с таковыми примера 7. Пример 11. Метиловый сложны эфир антибиотика. 90 мг натриевой соли антибиотика, полученной аналогично примеру 6 (8,000 ССи/мг), взвешивают в 3 мл су хого диметилформамида, добавл   зате 50 мг триэтиламина и 0,3 мл йодистог метила. После перемешивани  в течени 2,5 ч при комнатной температуре добавл ют 100 мл бензола, тщательно пе ремешива  дл  экстрагировани . Бензо ный слой отдел ют, промывают 100 мл 0,1 М (рН 6,8) и затем сушат безводн сульфатом натри . Сухой бензольный р створ концентрируют до небольшого об ема под пониженным давлением и загру жают на колонну (1,2 х 90 см) из Bio-Beads S-ХЗ. Метиловый сложный эфир про вл ют бензолом. Элюатные фракции содержащие сложный эфир, соедин ют и выпаривают досуха под пониженным давлением, полу ча  бесцветное масло. Масл нистый продукт раствор ют в небольшом количестве ацетона и хроматографируют на колонне (1,2 X 90 см) Sephadex LH-20 ацетоном в качестве про вител . Элюатные фракции, содержащие метиловый сложный эфир антибиотика, собирают и выпаривают досуха, получа  11,2 мг метилового сложного эфира антибиотика . Метиловый сложный эфир отличаетс  следующими физическими и кимическими свойствами. . , . Тонкослойна  хроматографи . Rj 0,45 (силикагельна  пластина 60 Р бензол : ацетон 1:1). УФ-спектр поглощени : максимум в метаноле CHjOH Л 315,5 nm max ИК-спектр поглощени : максимум в шороформе 3430, 1766, 1660 смСигналы в ПМР в дейтерийхлороформе (&) 1,05 (3 Н, t, 3 7,5 Hz); 1,7-2,0 (2Н, m) ; 2,00 (3 Н, S); 2,83 ,65 (7 Н, т); 3,83 (3 Н, S); 3,844 ,06 (1 Н, т) . Молекул рный вес (масс-спектрометри  высокой степени разрешени ). Найде но: 312,1131. СН4Н S Вычислено; 312, 1143. На основе приведенных данных меTIiлoвый сложный эфир антибиотика действительно соответствует структурной формуле II, указанной выше, где R - метил. Прием, описанный в примере 2, повтор ют с применением этилйодида, изопропилйодида , изобутилйодида, н-пентилйодида или н-гексилйодида вместо метилйодида, получа  сложные эфиры антибиотика этиловый, изопропиловый, изобутиловый, Н-пентиловый, «-гексиловый сложный эфир,. Образование этих сложных эфиров, подтверждаетс  тонкослойной хроматографией , ИК-спектрометрией поглощени , ПМР-спектрометрией и масс-спектрометрией . Составы, содержащие антибиотик и/или тритиловый, сложный эфир антибиотика , можно вводить в разных единичных дозах, как твердых или жидких, оральных формах дл  проглатывани . Эти составы содержат на единичную дозу , жидкую или твердую, активный маггериал в количествах от -0,1 до 99%, предпочтительно, 10-60%. Количество активного ингредиента в составе может колебатьс  в зависимости от вводимой формы и общего веса состава, причем обычно колеблетс  в пределах диапазона 10-1000 мг, предпочтительно , 100-1000 мг. В парентеральных составах единична  доза  вл етс  обычно чистым или высокоочищенным антибиотиком, его фармацевтически совместимой.солью и/или продуктом его тритилировани  в растворе в стерильной воде или же в виде раст.воримого порошка, предназначенного дл  растворени . Активный продукт может вводитьс  также и в сочетании с соединени ми, чувствительными к З-лактамазе. Предлагаемый способ позвол ет полуить новый антибиотик. Формула изобретени  Способ пол чени  антибиотика обей формулы tej-CHjS - CHj - CKj-NH- СО - CHj 0 где Rj, - водород, металл, ашкил или трифенилметил, з аключаю397385174ь

   щ и и с   в том, .что штамм Strepto--неральные соли, при рН 4,0-9,0 и темmyces А 271 выращивают в аэробных ус-пературе 20-40 С с последующим выделелови х в питательной среде, содержа-нием целевого продукта в виде кислощей источники углерода и азота и ми-ты или в виде сложного эфира или соли.