Claims (2)
1 . Изобретение относитс к обпастн био технологии в чаетноста к способам получени иммс влизованнык ({ рмёнтов, а именно к способу получени иммобилизованной эндонуклеазы Serralia таг-сезсеп и может использоватьс в биохимии дл гидролвЕза нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) в прс ессах получени олиго-.и 5 -мононуклеотндов. Использование этото пр тарата перспективно в медицине дл лечени гнойных абсцессов и ран. Известен способ получени иммобил&зованньк нуклеаз, в котором нуклеазы к« валентно св зывают с гндроксилсодержашими носител ми активированными предварвтелЬно бромистым цианом, В качестве носител чаще всего примен етс агароза И. Низка механическа , термическа cTo kocTB и сильное набухание в воде агаро зы ограничивают область применени ферментного препарата в технологических пр цессах,а применение бромистого циана дл - активации агарозы делает недопустимым использомпне этих препаратов в . Наиболее близким по технической су«д ностн к изобретению 1шл етс скособ получени иммобилизованной нуклеазы Зе«та «л «агсе-ас«пь. Фермент ковалентво св зывают с органич.еским гид роке клсодержаидам полимером - j«. - минобензшюксиме- тилдекстраном при помощи реакции даазосочетаний . Активированный носитель П€шучают из коммерческого препарата декстраjua - попиглюк на с мол. весом 6ОООО. Способ иммобилизации фермента В8ШЮ чает обработку полиглюки на хлористым Jau -нитробензилоксиметилпиридинием; выделение из полученной смесв -нитробензилоксиметнлполиглюкина{ восстановление последнего до .Л -амйнобензилоксйметшшолиглюкина} диализ, переосажденне и высушивание последнего; диазотирование JU -амйнобензилоксиметипполнглюкина| св зывание фермента с диазотированным Л аминобеизилокснметилполиглюкином; отцеленме иммобилизованной нуклеазы от неГ1ро|звагнроваЕшего полйглюкина при помошй гепь-фильтрапии. Полученный ферментный препарат растворим в вопе, при хранении при 12- 5 С и рН 7,0 в течение двух мес нев сохран ет СБОЮ активность 2j. , - . ;, 0днако, получение препаративньк количеств иммобилизованной эндонуклеазы вэбестным способом требует специальных методов очистки, таких как гель-фильтраци и диал$5з. Способ трудоемок .многостадкйности. Применетге иммобкл ;аованной эндонуклеазы в медицинских не:л х предполагает использование высокоочишенного исходного фермента. Но даже в этом случае возможность ее использо , вани сомнительна, так как нет сведений об антигенных свойствахиммобилизованной нуклеазы. При созданий нйТрерывных технологических процессов получени олигоркбо-, олигодезокси-рибо 5 -нуклеотидов н нонуклеотидов с использованием рас творк мых ферментных препаратов возникает сложна задача отйвлени юс от продуктов реакнин. Кроме того, данный способ кммобйлиза ции эндонуклеазы t arcSstens не представл ет возможность регулировать и РНК азную активности ферментного препарата, т.е. вли ть на спе цифичность эндонуклеазы к одному из суб стратов. . Цель изобретени - упрощение процесса йммобйлйзацийГ расширение. 6(бласти применени иммобилизованной эндонукле азы и увеличение специфичности эндонуклеазы к одному из субстратов. Указанна цель достигаетс за счет тбго, что процесс получени иммобилизованной эндонуклеазы провод т в присутст- ВИИ субстрата (РНК или ДНК) в качестве полимера используют аминоэт лцедлюлозуф предварительно активированную глутаровым альдегидом, причем обычно количество используемого субстрат С{ ставл 9т ,4 вес.%. Процесс осушестёл етс следующим образом. Провод т активирование АЭ- еллюлозы раствором глутаровогр альдегида. Затем производ т св зывание |юрмента с активированной матрицей в присутствии субгстратов {ДНК или РНК) в концентра:нни не менее 2 мг/мл. Полученный пре™ парат обрабатывают раствором NoGH.CTa бплгзироваиный таким образом иммобилв-one . This invention relates to biopsy biology, in particular, to methods for producing immestomed antibodies (namely, methods for the preparation of immobilized Serralia tag-seccep endonuclease and can be used in biochemistry for hydrolyzing nucleic acids (DNA and RNA) in oligo-oligo hydrolysis in the production of oligo-oligo-oligo-oligo-hydrolysis of nucleic acids (DNA and RNA) in oligo-oligo production. 5 mononucleotides. The use of this drug is promising in medicine for the treatment of purulent abscesses and wounds. There is a known method of obtaining immobilization of amphibious nucleases, in which nucleases valencely bind to the x-containing media of the active prearranged cyanogen bromide. Agarose is most commonly used as a carrier. Low mechanical, thermal cTo kocTB and strong swelling of agarose in water limit the scope of use of the enzyme preparation in technological processes, and the use of cyanogen for the activation of agarose makes it impossible to use agarose. preparations in. The closest to the technical problem of the invention is to obtain a method for the preparation of an immobilized Zee nuclease. The covalent enzyme is bound to the organic containing polymer - j "with organic hydrate. - Minobenzshyuksimededekstranom using the reaction of daazo combinations. Activated carrier P € is joking from the commercial drug dextra jua - popiglyuk on the pier. weight 6oooo. The method of immobilization of the V8SHU enzyme is the processing of polyglumes on Jau-nitrobenzyloxymethylpyridinium chloride; isolation from the resulting mixture -nitrobenzyloxymethylpolyglucine {reduction of the latter to .L-aminobenzyloxymethenscholiglukin} dialysis, re-precipitated and drying the latter; diazotization of JU-amino-benzyloxymethyl-full-glucan | binding of the enzyme to the diazotized L-aminobeisyloxnmethyl polyglukine; the removal of immobilized nuclease from non-fatal | Zvagonnogo Eseh Polyglukin with the help of hepatitis-filtrapii. The resulting enzyme preparation is soluble in borax, when stored at 12–5 ° C and pH 7.0 for two months, retains a SBU activity of 2j. , -. ; However, obtaining preparative amounts of immobilized endonuclease by the online method requires special purification methods, such as gel filtration and dialysis. The method is time consuming. Applying an immobl; aovated endonuclease in medical non: l x involves the use of a highly purified starting enzyme. But even in this case, the possibility of using it is doubtful, since there is no information about the antigenic properties of immobilized nuclease. When creating new technological processes for producing oligorkbo-, oligodeoxy-ribo 5-nucleotides and non-nucleotides using dissolving enzyme preparations, the difficult task of eliminating us from the products of reactins arises. In addition, this method of kmmobilizing the endonuclease t arcSstens does not represent the ability to regulate the RNA activity of the enzyme preparation, i.e. affect the specificity of the endonuclease to one of the substrates. . The purpose of the invention is to simplify the process of expansion. 6 (application of an immobilized endonuclease and an increase in the specificity of the endonuclease to one of the substrates. This goal is achieved due to the fact that the preparation of the immobilized endonuclease is carried out in the presence of the substrate (RNA or DNA) as a polymer using aminoethylose cellulose previously activated by glutamic aql ale and amalgamide aa aql amalgate aql amalgate aeql or DNA or DNA) as the polymer used as amino acid ethereal endonuclease extruded endonuclease. , moreover, the amount of substrate C used is {9 tons, 4 wt.%. The process is dried as follows. The AE-cellulose is activated with a solution of glutarone Then, binding of the activated matrix with the presence of substrates (DNA or RNA) in a concentration of at least 2 mg / ml is carried out. The resulting pre ™ parat is treated with a solution of NoGH.CTa, thus immobilized
735594 зованный препарат промывают солевым раствором. Полученные препараты иммобилизова кой эндонуклеазы обладают высокой удельной активностью, около 140ОО ед./г матрвды . Препарат сохран ет60% активности в течение года при хранении 5-1 и рН 7,0. При гидролизе РНК в проточной колонке в течение 15 дней ферментный препарат полностью сохран ет свою перво- 5шчапьную активность, а при гидролизе Дик в реакторе с перемешиванием за это же врем активность препарата падает , незначите-.льно, на 1О%. Пример 1, К5Ог влажной АЭн 1еллюлозы добавл ют 150 мл 25%-ного глутарового альдегида и 2ВО мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2--Х ч Затем активированную АЭ- 1еллюлозу промывают 0,2 М раствором NaCft. К Би г влажной активированной АЭ-целлюлозы . добавл ют НО мл водного рас.твора эндонуклеазы, содержащего 1740ЬОО ед.акт. (за единицу эндонуклеазной активности принимают количество фермента, вызывающее увеличение поглощени кислоторастворимых продуктов при 260 нм на 1 о.е. за 2.0 мин при стандартное-опредеneiffie эндонуклеазной активности провод т по РНК) и 0,22 г ДНК. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 ч. Полученный пре- парат иммобилизованной эндонуклеазы отжимают , на стекл нном фильтре и суспендируют в 500 мл 0,1%-ного раствора боргидркда натри в О,1 М Na-фосфатном буфере (рН 8,0) в течение ЗО мин при 6°С, Стабилизированный таким образом иммобилизованньсй фермент промывают 1 М раствором HciCfi. Препарат иммобилизованной эндонуклеазы гидролизует как ДНК,так и РНК. Удельна активность препаратов, ед.акт/г сухой матрицы: РНКазы 7980; ДНК-азы 14l40. Активность ДНК-азы в 1,8 раз превышает активность РНК-азы. Выход по активности составл ет 20%. Пример 2. К5г влажной АЭцеллюлозы добавл ют 15 мл 25%-ного глутарового альдегида н 25 мл дистиллированной води; эту смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2-х ч. Затем активированную АЭ-иеллюлозу промывают 0,2 М раствором HaCft. К 5 г влажной активированной АЭнхеллюлог зы добавл ют 24 мл водного раствора эндонуклеазы, содержащего 5800ОО ед. акт. и 0,096 г т-РНК. Реакционную сме перемешивают при комнатной температур в течение 5 ч. Полученный препарат имм билизованной эндокукпеазы отжимают на стекл нном фильтре и суспендируют в 50 мл 0,1%-ного раствора боргидрида натри в 0,1 М Ыо-фосфатном буфере рН 8fO в течение ЗО мин при 6°С. Ста- нэированный таким образом иммобилизованный фермент промывают 1 М раст вором NoCU. Препарат иммобилизованной эндонуклеазы гидролизует как ДНК, так и РНК, Удельна активность препаратов, ед,акт/г сухой матрицы: РНК-азы 14063 ДНК-азы 7050. Активность РНК-азы в 2 раза превышает активность ДНК-азы. Выход по активности составл ет 10%. Как видно из примеров, св зывание эн донуклеазы в присутствий одного из субстратов приводит к избирательному повышению удельной активности по оДному из субстратов в 1,5-2 раза. Это позвол ет примен ть иммобилизованную эндонуклеазу дл преимущественного гидролиза ои ного из субстратов (ДНК и РНК), если они оба содержатс в реакционной смеси. К преимуществам во до нерастворимой . иммобилизованной эндонуклеазы относ тс высока стабильность, простота отделени нерастворимого ферментного препарата от продуктов реакции,возможность многократного использовани в периодических твехнологических процессах и длительного использовани в непрерывных процессах дл получени олигорибо-, олигодезокси-р о-5-нуклеотидов и 5 -мойонуклеотидов . Кроме того, способ не тре бует высокоочищенного исходного фермента , а нерастворнмьш производные нуклеаз перспективны как фармацевтические препараты дл местного лечени гнойных ран. Фор М у ла изобретени 1,Способ получени иммобилизованной эндонуклеазы S,erro1ia тагев&свпа путем ковалентного св зывани с органическим гйдроксилсодержащим полимером, о тлич ающийс тем, что, с целью упрощени пррцесса иммобилизации, расширени области применени иммобилизованной ёндонуклеазы и увеличени специфичности эндонуклеазы к одному из субстратов {РНК или ДНК) в качестве органического гидроксйлсодержащего полимера используют аминоэтшщеллюлозу, предварительно активированную глутаровым альдегидом , и процесс осуществл ют в присутствии соответствующего субстрата. 2. Способ по п.-1, о т л и ч а ю щ и и с тем, что субстрат примен ют в количестве 0,2-0,4 вес,%. Источники информации, прин тые во внимание при экспертизе l.Omenn G.S., tl.A., ЛпГтйеп; С-ft,, FracVioncaVion oi nllhoo tes ag-o n t Sicjphy ococcoi6 on Sephc«rc)9,e ImrnunoacisorHenis (Halur-e 225 189, 197O. 735594 The drug is washed with saline. The obtained preparations of immobilized endonucleases have a high specific activity, about 140OO units / g of material. The drug retains 60% activity during the year when stored 5-1 and pH 7.0. During hydrolysis of RNA in a flow column for 15 days, the enzyme preparation retains its primary activity completely, and during hydrolysis of Dick in the stirred reactor during the same time, the activity of the preparation decreases, insignificantly, by 10%. Example 1, K5Og of wet AE 1cellulose is added 150 ml of 25% glutaraldehyde and 2BO ml of distilled water. The mixture is stirred at room temperature for 2 - x h. Then the activated AE - 1 cellulose is washed with a 0.2 M solution of NaCft. To Bi g wet activated AE-cellulose. BUT ml of the aqueous solution of the endonuclease containing 1740 OOH unit. (per unit of endonuclease activity, the amount of enzyme that causes an increase in the absorption of acid-soluble products at 260 nm per 1 unit is taken for 2.0 minutes with standard-determined neiffie endonuclease activity carried out by RNA) and 0.22 g of DNA. The reaction mixture is stirred at room temperature for 5 hours. The resulting preparation of immobilized endonuclease is squeezed, on a glass filter and suspended in 500 ml of a 0.1% sodium borohydride solution in O, 1 M Na-phosphate buffer (pH 8, 0) for 30 minutes at 6 ° С, the immobilized enzyme thus stabilized is washed with 1 M HciCfi solution. The preparation of immobilized endonuclease hydrolyzes both DNA and RNA. The specific activity of drugs, units of act / g of dry matrix: RNase 7980; DNA basics 14l40. The activity of DNA-basics is 1.8 times higher than the activity of RNA-basics. The activity yield is 20%. Example 2. To 5 g of wet AEcellulose, add 15 ml of 25% glutaraldehyde and 25 ml of distilled water; this mixture is stirred at room temperature for 2 hours. Then the activated AE-cellulose is washed with a 0.2 M HaCft solution. To 5 g of wet activated AEnchellulose, 24 ml of an endonuclease aqueous solution containing 5800OO units is added. Act. and 0.096 g tRNA. The reaction mixture was stirred at room temperature for 5 hours. The resulting preparation, immobilized endocucpease, was squeezed on a glass filter and suspended in 50 ml of a 0.1% aqueous solution of sodium borohydride in 0.1 M Ny-phosphate buffer pH 8fO for 30 min. at 6 ° C. The immobilized enzyme thus immobilized is washed with a 1 M solution of NoCU. The preparation of the immobilized endonuclease hydrolyzes both DNA and RNA. The specific activity of the preparations, units, act / g of the dry matrix: RNA basics 14063 DNA basics 7050. The activity of RNA basics is 2 times higher than the activity of DNA basics. The activity yield is 10%. As can be seen from the examples, the binding of the endonuclease in the presence of one of the substrates leads to a selective increase in the specific activity in one of the substrates by 1.5-2 times. This allows the immobilized endonuclease to be used to preferentially hydrolyze one of the substrates (DNA and RNA) if they are both contained in the reaction mixture. To advantages in to insoluble. Immobilized endonucleases are characterized by high stability, ease of separation of the insoluble enzyme preparation from the reaction products, the possibility of multiple use in periodic technological processes, and long-term use in continuous processes to produce oligoribo, oligodeoxy-p o-5-nucleotides and 5 myonucleotides. In addition, the method does not require highly purified starting enzyme, and insoluble nuclease derivatives are promising as pharmaceutical preparations for the local treatment of purulent wounds. Fore M u la Invention 1, Method for the preparation of immobilized endonuclease S, erro1ia tagev & by covalent bonding with an organic hydroxyl-containing polymer, in order to simplify the immobilization process, expand the field of application of the immobilized polymer, expand the area of application of the immobilized polymer, expand the field of application of the immobilized polymer, expand the field of application of the immobilized polymer, expand the area of application of the immobilized polymer, expand the field of application of the immobilized polymer, expand the field of application of an immobilized polymer from substrates (RNA or DNA), aminoethylcellulose previously activated with glutaric aldehyde is used as an organic hydroxy-containing polymer, and the process is t in the presence of an appropriate substrate. 2. The method according to p. 1, about tl and h and y and so that the substrate is used in an amount of 0.2-0.4 weight,%. Sources of information taken into account in the examination of l.Omenn G.S., tl.A., LpGtyep; C-ft ,, FracVioncaVion oi nllhoo tes ag-o n t Sicjphy ococcoi6 on Sephc "rc) 9, e ImrnunoacisorHenis (Halur-e 225 189, 197O.
2.Кур ненко Б. М, Калачова И. В,, Габдуллина Г, К. Стабилизаци нуклеаз ковале тиым св зыванкем с растворимым декстраном. - Виоорганическа хими , 1(4), 483, 1975 (прототип).2.Kur Nenko B.M., Kalachova I.V., Gabdullina G, K. Stabilization of nucleases for binding with a dextran. - Vioorganic Chemistry, 1 (4), 483, 1975 (prototype).