SU534236A1 - Способ получени дезоксирибомононуклеотидов - Google Patents

Description

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОМОНОНУКЛЕОТИДОВ

1

Изобретение относитс  к получению биологически активных веществ которые могут найти применение в медицине в качестве физиологически активных средств.

Известен способ получени  мононукпеотидов ферментативным путем, например, при обработке РНК культуральной жнцкостью штаммы StoiplrvLococcus aurcus в услови х пониженной активности, содержащейс  в среде фосфотазы.

Известен также способ получени  5-мононуклеотидов , заключающийс  в ток, что в качестве сырь  испат:ьзуют полимерные нуклеиновые кислоты, которые расщепл ют на мононуклеотиды 5-фосфодиэстераза ак- тивными экстрактами растительного происхождени  с последующим выделением целевого продукта известными приемами,

Однако известные способы не обеспечивают высокого выхода целевого продук- та,

С целью расширени  сырьевой базы и повышени  выхода целевого продукта в предлагаемом способе в качестве исходного сырь  используют отходы производ2

ства протаминсульфата из молок рыб, экстракцию осуществл ют кислотой, а фер ментативный гидролиз провод т нуклеазами из печени промысловых рыб.

Дл  получени  дезоксирибомононуклеотидов предлагаемым способом примен ют ферментные препараты, которые получают из печени морских промысловых рыб, таки как камбала, горбуша и . Получают их следующим образом.

Печень камбачы гомогенизируют в дистиллированной воде, подкисленной до рН 3,0 в гомогенизаторе Уоринга, затем гомогенат экстрагируют в течение 3 суток, освобождают от.верхнего сло  жира, после чего центрифугируют при 4°С и 250О об/мин в течение 40 мин, Затем надосадочную жидкость сливают и довод т добавлением сухого сернокислого аммони  до 25% насыщени . Осадок отдел ют центрифугированием , а надосадочную жидкость довод т до 9О% насыщени . Осадок собирают фильтрованием и раствор ют в минимальном объеме дистиллированной воды. Полученный раствор снова довод т до н сыщени  40%-ным сернокислым аммонием затем осадок отдел ют центрифугированием и отбрасывают, Надосадочную жидкость довод т до 90% насыщени  сернокислым аммонием, затем выпавший в осадок собирают фильтрованием под вакуумом. Полученный осадок раствор ют в минимальном количестве 0,01М фосфатного буфера, рН 8,0 и в таком .виде полученный препарат хран т в течение при без потери активности. Дальнейшую очистку ферментного препарата осуществл ют с помощью гельфильтрации на колонке с сефадексом 6-100, После очистки ферментного препарата про вод т фракционирование на колонке с ДЕА целлюлозой и собирают объединенные фракции фосфодиэстеразы, дезоксирибонуклеазы 1 и Ц. Дезоксирибомононуклеотиды из отходов производства протаминсульфата из молок рыб получают следующим образом. Пример Отходы производства про таминсульфата из молок рыб растирают до порошкообразного состо ни  в фарфоровых ступках. Затем полученную порошкообразную массу (250 г) перемешивают в 5 л 7%-ной трихлоруксусной кислоты (ТХ полученный раствор разливают по 1 л -в колбы и встр хивают на универсальном аппарате дл  встр хивани  жидкости до 4 О мин, затем центрифугируют 20 мин при 500О об/мин, удал ют осадок, а над осадочную жидкость сливайт в стекл нную емкость. Таким образом извлекают кислоторастворимые продукты - алигонуклеотиды , мононуклеотиды, азотистые основани . Полученный кислотный экстракт нейтрализуют 4н, аммиаком до рН 7,0 добавл5пот 4 г МсгбОд. , затем внос т препарат нуклеаз {4ОО мг), выделенный вышеописанным способом. Реакционный раствор инкубируют при 37 °С в течение 24 час, рН инкубационной смеси периодически контролируют. После окончани  процесса ферментатив ного гидролиза олигонуклеотидов и добавлени  1О л 96° гидролизного спирта, полученный раствор фильтруют, затем упаривают до сиропообразной жидкости, кото рую развод т дистиллированной водой и фильтруют через активированный угсиь дл  удалени  пигментов. Разделение смеси дезоксирибомононуклеотидов осуществл ют следующим образом . Берут 1ОО мл раствора смеси дезокси рибомононуклеотидов и нанос т на ионообменную колонку размером 50x12 см. содержащую смолу Дауэкс- в. хлоридной форме, рН наносимого раствора предварительно довод т аммиаком до 10, Сначала колонку промывают бидистиллированной водой дл  удалени  аммиака, раствором OjOlM хлорида аммони  1215 л, до тех. пор, пока рН эпюирующего раствора не понизитс  до 7,0, В результате такой промывки удал ют .азотистые основани  и нуклеозиды, после этого колонку промывают 0,01М сол ной кислотой (15-20 л), при этом удал ют все нуклеотрады . ПолинукЛеотиды и остатки негидролизовавшейс  ДНК остаютс  на колонке, Так осуществл ют первоначальное разделение продуктов гидролиза ДНК Затем фракцию дезоксирибомононуклеотидов , полученную при пропускании через колонку 0,О1М раствора сол ной кислоты и концентрированную повторной реабсорбцией на Дауэкс-1, подщелачивают BOftным раствором аммиака и нанос т на колонку меньших размеров (10x2 см), содержащую Дауэкс-1, дл  выделени  О-Рдельных дезоксирибонуклеотидов, осуществл   их фракционирование следующим образом . Пропускают О,01М раствор хлористого аммони  до тех пор, пока рН раствора, вытекающего из колонки,не снизитс  до 6,0, затем пропускают через колонку 0,О01 М раствор сол ной кислоты,при этом выдел ют фракцию, содержащую дезоксицитидиловую кислоту (включа  5-метилдитидиловую кислоту), затем гфомыванием 0,002М сол ной кислотой выдел ют фракцию, содержащую дезоксиадениловую кислоту, раствором 0,ООЗМ сол ной кислоты выдел ют фракцию, содержащую тимидиловую кислоту, раствором 0,005М сол ной кислоты выдел ют фракцию, содержащую дезоксигуаниловую кислоту, Идентификацию фракпкк нуклеотидов, собранных с колонки, осуществл ют при помощи спектр офотометрии. Полученные растворы дезоксирибомононуклеотидов каждый в отдельности концентрируют путем реадсорбции на ионообменных колонках, промывают водой и апюируют разбавленными растворами сол ной кислоты . При этом пуриновые Дезоксирибомононуклеотиды быстро нейтрализуют водным раствором аммиака с целью избежани  кислотного гидролиза, Дальнейи1ую концентрацию каждого полученного дезоксирибомононуклеотида в растворе осуществл ют упариванием в вакууме раствора с последующим осаждением смесью этанола с эфиром или раствором сопей бари  с аммиаком. Предлагаемый способ позвол ет использовать в качестве исходного сырь  отходы лроизводства протаминсульфата из молок рыб, которые до насто щего времени во всем мире не наход т никакого применени  и выбрасываютс  за ненадобностью. Получение дезоксирибомононуклеотидов из пред лагаемого сырь  обходитс  в два раза дещеьле по сравнению с их получением из полимерных нуклеиновых кислот. 36 Ф 3 о б р ормула изооретени  Способ получени  дезоксирибомононуклеотидоБ путем экстракции исходного сырь , ферментативного гидролиза полученного экстракта с последующим выделением целевого продукта известными приемами , отличающийс  тем, что, с целью расщирени  сырьевой базы и повыщени  выхода целевого продукта, в качестве исходного сырь  используют отходы производства протаминсульфата из молок рыб, экстракцию осуществл ют кислотой , а ферментативный гидролиз провод т нуклеазами из печени промысловых рыб.