SU404277A1 - Способ выделения l-аспарагиназы - Google Patents

Description

ИзОбретенле относитс  к микробиологической промышленности.

Известен способ выделени  -аспараг назы вз культуральной жи1дкости, нолученной при ,культивирован.и,и Escherichia соИ, предусматривающлй осажден е L-аспарагиНазы органическим растворителем, например ацетоном.

Предлагаемый способ позвол ет более полно выделить фермент из культуральной жидкости.

Дл  этого перед осаждением L-асп.араги«азы органическим растворителем производ т осаждение клеток Escherichia coli в Виде хлапьев из культуральной жидкости добавлением в нее органического основани  с молекул рным весам более 1000 или его соли с последующим отделением -клеток, напр.имер, центрифугированием и экстрагированием водой , а доб-авление органимеокого растворител  осуществл ют в полученный экстракт.

В качестве основани  можно примен ть акрамин общей фор.мулы

CONH,(CH2) 6-NHCO-NH (СНг) з-N-

СН 

(СН2)

с молекул рньгм весом выше 1000, который можно получать путем реакции обмена ди-(3амино-га-пропил )-метиламина с гександиизоцианато .м; протамин; гистон; катионоактивный крахмал, полученный путем обменного разложени  крахмала с гидрохлоридом Р-ДИалк .иламинаэтилхлорида.

Сущность слосо ба заключаетс  в следующем .

Выр:ащи ают клетки Escherichia coli на питательной среде, содержащей неорганические ионы и смесь из а.м.инокислоты .и пептида в форме клеточных автолизов или протеингидролизов в качестве источника азота, а в качестве источника углерода - соответствующие органические кислоты.

В качестве питательной среды можно использовать за,мочную кукурузную «оду. Хорощие результаты получают, если концентрацию молочной кислоты, содержащейс  в замочной кукурузной воде, повыщают и добавочно прибавл ют NH 4-ионы. Вместо молочной кислоты могут быть также прилгенены  нтарна  кислота, фумарова  кислота и.пи L- блочна  кислота. Добавление способных под действие-м Escherichia coli к сбраживанию углеводов , на1пример глюкозы, фружтозы, маннозы, мальтозы, галактозы или аминокислот DL-ъклин , DL-серин, /.-цистеин, L-триптофан и DLнорвадин подавл ет синтез, а добавление Lглютаминовой кислоты, /.-аспарагиновой кислоты , DL-аланина и гликоколла способствует синтезу L-ac.na.par,Ha3bi. Как основа дл  питательных растворов может быть использован дрожжевой экстракт. Хорошие результаты показали следующие и тательные растворы, содержащие, %: I. Воду от замочной кукурузы (в отношении к сухой субстанции) 3,0 Молочнокислый натрий6,0(рН 7,0) (NH4)2S040.20 II. Воду от за.мочки кукурузы (в отношении :К сухой субстанции)3,00 Молочнокислый натрий0,30 L-глюта.миновую кислоту-Na 0,15(рН 7,0) Гликоколл0,15 (MH4)2SO40,20 III. Дрожжевой экстракт2,00 МолочнО:Кислый натрий1,00 (NH4) 25:040,20 Эти питательные растворы засевают культурой с касого агара Escherlchia coli АТСС 9637 И культивируют «а вибрациониой маши«е «коло 20 час при 30° С. Значение рН возрастает за iSTO .врем  до 8,5-в,9. После окончани  выращивани  в питательный бульон добавл ют органическое основание с 1молекул рным весом свыше 1000 или его соль. ,В результате клетки осаждаютс  хлопь ми -и могут быть легче це трифугироваиы . После двойного суспендировани  клеток В воде их осаждают снова, добавл   ацетон. При это.м клетйад перевод тс  в удобную дл  ;перер:аботки фор.му и так измен ютс , что образовавша с  L-аспараглназа .может быть выделена с водой 1из раствора в следующей ступени. Эта ступень состоит из .повторного отделени  центр ифугированием, еще одного двойного суопендироваии  и зкстрации водой. Из этой суспензии добавлением одной из названных органических основ осаждают экстрагированные клетки, нуклеиновые кислоты и балластные протеины и удал ют центрифугироваБие .м. Из отсто вщегос  водного раствора Ь-аспара.гиваза может быть осаждена пр.и добавлении большого количества ацетона . Вэдесто ацетона дл  переведени  клеток в другую фор.му и дл  осаждени  L-асцарагнHiasbi могут быть применены также другие смещ.и1вае:мые или только ограничено смешиваемые с водой органические р.астворителИ (.метанол, этанол, изонропанол, метилэтилкетон   д.и.метилсульфокоид). Относительную активность /.-аспарагиназы апредел ют следующи м образо;м. 16,0 см питательного .раствора центрифуг .ируют, 1отсто вщийс  раствор удал ют. Клетки ба:ктернй повторно суспендируют в дважды дистиллированной воде до объема 15,0 слг. 3,0 см этой суспензии клеток разбавл ют 12,0 см дважды дистиллированной во.ды и добавл ют 15,0 см 2%-ного раствора L-асцарагина в 1/10 мол рном буферном раство.ре фосфата со значением рН 7. Затем добавл ют 0,2 см толуола. Изготовленную такиМ образом реа:кционную смесь, котора  содержит 1,0% аснарагина и 1/10 и 1/6 нервон.ачально находившегос  в пит тельно:М растворе концентр а1та клеток бактерий (1/10N или 1/6N), за.крыв |резиновой пробкой, встр хивают в течение 3 час при 30° С. |По истечении этого времен.и смесь в течение 5 мин нагрев-ают до 100° С, снова охлаждают и центрифугируют. Отсто Бш.иЙ1С  раствор иримен ЕОт дл  калориметрического определени  ЫНз-азота с реактивоМ Неслера iB отношении стандартного раствора а.ммонийсульфата . Пр.и этих услови х опыта от выросших в питательном растворе двух клеток 0,035 до 0,065% N; от выр.осш.их в питательном растворе трех клеток - 0,04%1N (.максимально отщепл емый N при содержании 1,0% L-аспарагина щ .реакционной смеси равен .0,0106% N 1). Чтобы получить значение относительной активности L-аспарагиназы Esoherichla coli умножают калориметрически определенную N-концентрацию на фактор разбавлени  концентрации наход щихс  с опытной реакционной смеси клеток бактерий. Относительна  активность аспарагиназы выращенных клеток в питательно.м растворе I составл ет 0,0,25 (0,04) X 10 0,25 (0,4); клеток, выращенных в .питательном растворе II - 0,035 (0,065) X Ш 0,35 (0,65); клеток, вы .ращенных в растворе III-0,04 X 6 0,24. Пример 1. 10%-ный раствор замочной К).курузной ВОДЬ из расчета на cyixoe .вещество посредствам 2N раствора КОН устанавливают на значение рН 7, нагревают в течение 20 мин до 120°С и .после охлаждени  осветл ют в центр.ифуге с верхним отводом жидкости или фильтрованием методом Зейтца. 30 л этого прозрачного раствора замочной кукурузной воды .разбавл ют водопроводной водой iB количестве 170 л. Дл  изготовлени  питательного раствора I добавл ют 1,2 кг лактата «атри  и 0,4 кг сульфата а.ммони , дл  изготовле.ни  питательного раствора II добавл ют 0,6 кг лактата натри , 0,3 кг /--глюта1м.ино1вой кислоты-Na, 0,3 кг гликоколла и 0,4 кг сульфата ам.мони . Полученный питательный раствор стерилизуют в ферментаторе 40 мин при 110° С, затем охлаждают и инокулируют 500 см выросшей в течение 18 час при 30° С, .и встр хивании культуры Escherichia coll АТСС 9637 в питательном растворе с рН 7,0, состо  щем ,из 1,5% экстракта дрожжей и 0,5%. лактата натри . Ферментационный затор при 30°С аэрируют воздухом со С|Коростью 80 л1мин при 150 об/мин 1мешалки. По истечении времени роста от 16 до 18 час, когда рН культуры повысилс  ирибдизительно до 8,8, .культуральны.й -бульон охлаждают примерно до 20° С. Бактерии, котОрые содержат /--аспарагалазу, коагул ируют, добавл   4 л 2,5%-ного раствора акр,ИМина R, имеющего формулу

CONH (СНз) 6-NiHCO-NH (СНг) 3-N -

СН,

- (СН2)б

с .молекул рНым весом выше 1000, который 01бразуетс  ,при. реа1КциИ обменного pa3vio Keлв  ди-(3-а,мино-/г-1пр.оП:ил)--мет ла.М|И1Н:а с ге ксанди .изоц,ианатом; затем отдел ют в центрН (фуге с верхним отводом жидкости и повторно суспендируют, добавл   водопрсводную воду до общего объема 20 л.

;В полученную суспензию клеток, размешива , вливают 80 л ацетона, добавл ют 20 слг 2,5%;-ного акра1МиНа R, отдел ют выпавшие бактерйл в центрифуге с верхаим отводом жидкости   клеточную массу повторно суспендируют в Водапроводной воде, добав.л   ее до общего объема 20 л.

Дл  экстракцИИ лз клеток бактерий L-acпарагин азы суспензию размешивают в течение 4,5 час ;пр,и 30° С. В течение этого времени посредством добавки IN натронного щелока iHviM 1-0%-ной уксусной кислоты поддерживают piH на значепид 7,5-7,8. Затем охлаждают до 20° С.

В экстрагированную клеточную суспензию, разчмещива , вливают 5 л 2,5%-ного акрамина R ,и отдел ют в центрифуге с верхни.м отводом жидкости образовавшийс  сильный осадок, состо щий из экстрагированных бактерий и нерастворимого «основани  -комплекса нуклеиновой кислоты и протеина. Осадок выбрасьивают. Получают приблизительно 17 л лрозр.ачного раствора, в котором с другими содерж.ащИМИс  в клетках материалами находитс  Ь-аспараг,и«аза.

Из -полученного раствора, добавл   68 л ацетона, осаждают сырую L-acn.aparHHa3y. Образовавшийс  осадок изолируют, промывают ацетоно,м и просушивают в вакууме при 25-30° С. Получают приблиз1И:тельно 100 г сырой L-ас арагиназы с активностью приблизительно . 3,3 (при применении питательного раствора I) .или 4,0-5,5 ин. ед. .на 1 мг (при применении питательно.го раствора II). При применении питательного раствора III сыра  L-аспарагиназа со.держит приблизительно 2,:5 ин. ед. на 1 мг.

Пр.ИМер 2. Катионоактивпый крах.мал  вл етс  1высокомолекул рны,м .продуктом с молекул рным весом свыше 1000, который образуетс  при реакции обменного разложени  крахмала с .гидрохлоридом р-диалкила .Мгиноэтил .

10%:-ной раствор замочной кукурузной воды (.из расчета на сухое вещество.) посредством 2N раствора едкого кали  устанавливают на .значение рП 7, нагревают 20 мин до

120° С и после охлаждени  осветл ют в центрИ (фуге с верхним отв-одам жидкости или .фильтрованием методом Зейтца. 30 л этого прозрачно.го раствора замочной ку.курузной 5 воды разбавл ют 170 л водопроводной воды. Дл  ИЗГОТОВЛ6Н.ИЯ питательного раствора I дабавл ют 1,2 кг лактата натри  и 0,4 кг сульфата аммови , дл  изготовлени  питательного раствора II добавл- ют 0,6 кг лакта0 та патри  0,3 кг 1-тлютамино вой кислОты-,Ка, 0,3 кг гликоколла и 0,4 кг сульфата аммони . Полученный питательный р аствор стерилизуют в ферментаторе 40 лшн при 110° С, затем .охлаждают и инокулируют 500 с выросшей

в течение 18 час при 30° С, и встр хивании культуры Escherichia соЦ ATCiC 9637 при значении рП 7,0, состо щем из 1,5% экстракта дрожжей и 0,5% ла.ктата натри .

Ферментационный затор при температуре

30° С, аэрируют воздухом со скоростью 80 л1мин лри 150 об1мин мешал;к,и.

По истечении времени роста от 16 до 18 час, когда рН культуры повысилс  прибл1Изительно до 8,8 культур а лъньш бульон охлаж дают пр.име|рно до 20°С. Бактерии, осоторые содержат 1-аспарагина.зу, коагулируют посредством добавки 2 л 2,5%-ного раствора кати оно активного .крахмала, отдел ют в центрифуге с верхним ОТВОД01М жидкости и повторно суспендируют, добавл   водопроводную воду до общего объема 20 л.

В полученную суспенаию клеток, ра.змеш,ива , вливают 80 л ацетона, добавл ют 20 см 2,5% -ного раствора катионоактивного крах |мала, отдел ют выпавшие бактер.ии в центрифуге с верхним отводом жидкости и клеточную массу повторно суспендируют щ водопроводной воде, добавл   ее до общего объема 20 л.

Дл  экстракции из клеток бактерий L-aonaрагиназы полученную суспензию размешивают в течение 4,5 час при 30° С. В течение этого Времени посредством добавки IN нат .ронного щелока или 10%-ной уксусной кислоты поддерживают рН 7,5-7,8. Затем охлаждают до 20° С.

В экстрагирова.нную клеточную суспензию, размешива , вливают 5 л 2,5%-ного катионоактивного крахмала и отдел ют в центрифуге

с ве,рхним отводом жидкости образовавщийс  сильный осадок, состо щий из экстрагированных бактерий и нерастворимого «основани  - комплекса нук:леиновой кислоты « протеина. Осадок выбрасывают. Получают приблизительно 17 л прозрачного раствора, в Котором нар ду с другими содерл аЩ.имис  в клетках матерналами находитс  L-acnap.arHHa3a.

Из по.тученноГО раствора, добавл   68 л ацетона, осаждают сырую L-аспарагиназу.

0 Образова.вщийс  осадок .изол нруют, промывают ацетоном ,и просушивают в вакууме при 26 до .30° С. |Получают приблизительно 100 г сырой L-acn.aparnHa3bi с активностью приблизительно 3,0 (при применении питательного

5 раствора I) или 4,0-4,5 ин. ед. на 1 мг (при

пр мен-ении литательного раствора II). При применении литательного раствора III сыра  Ь-асиаратинаЗа содержит приблизительно 2,5 ин. бд. на 1  г.

Пр.имер 3. 10%-:ный раствор замочной кукурузной воды (,иа расчета на сухоте вещество ) посредством 2N раствора едкото кали  ус т а На в Ли в а ют иа значение рН 7, нагрев,ают в течение 20 ми.н до 120° С и лосле охлаждени  осветл ют В центри фуге с BepiXBHM отводо-м жидкости .ил:И (фильтрованием .методом Зейтца . 3€ л этого лрозрач ого раствора замочной .кукурузной воды разбавл ют 170 л водолроВОДИОЙ 1ВОДЬГ.

Дл  .изготовлени  литательного раствора I добавл ют 1,2 кг лактата .натри  « 0,4 кг сулыфата аммони .

Дл  .изготовлени  литательного раствора И добавл ют 0,6 KiS лактата натри , 0,3 кг -глют1ам:иноеой кислоты-Na 0,3 кг глвкоколла и 0,4 КЗ сульфата аммони .

Полученный питательный pacTBiOp стерилизуют в ферментаторе 40 мин при 110° С, затем охлаждают и и-нокулируют 500 СМ вы1рО1Сшей в течение 18 час лр  30° С, ,и встр хвваиии культуры Esoherichia colt АТСС 9637 пр  зн.ачени1И. рН 7,,0, состо щем 1,5% экстракта дрожжей и 0,5% лактата «атри . Ферментационный затор при 30° С аэрируют воздухом со скоростью 80 л/мин при скорости вр.ащеаи  М1е,шал;ки 150 об/мин.

По истечении времени роста lOT 16 до 18 4aCj ко1гда .рН культуры повысилс  приблизительно до 8,8, 1культуральный бульон охлаждают лр1И.мерно до 20° С. Бактерии, которые содержат Ь-асиарагиназу, коагулируют посредством добавки 1 л 2,5%-ного раствора основани 

{-iNiH-(€«2)з-N-.{СН2)з-NH - (СН2)

I СНз

с .молекул рньш весом свыше 1000, который образуетс  лри реакции обм.енното р-азложени  ди- 3-а;мино-«-лр1ап. метила мина с эпихл .0 ргидр:ином; отдел ют в |Це1Нтрифуге с верх«ИМ отводом ж.идкО|СТ,и. и повторно суспендируют , добавл   водолроводную воду до ci6щего объема 20 л.

Дл  экстра1К ци1и из .клеток бактерий L-acпарагиназы лолученную суспензию размешивают в течение 4,5 час лр.и 30°-С. .В течение этого времени, посредством IN .натрониого щелока или 10%-ной.укоусной кислоты п.ад.де,рживают рН «а зйачеиии 7,5-7,.8. Затем охлаждают до 20°С.

В экстрагироваиную клеточную суапенз.ию, раЗ|Меш.ива , вливают 2,5 л 2,5%-но.г.о раствора основани  и отдел ют в .центрифуге с верхним ОТВОДО.М жидкости о бразовавщи.йс  сильный осадок, состо щий из экстра.пированных бактерий и .нераствори.мого .оснав1ани -ком.плекса нукле.И1Новой кислоты и лротеила. Осадок выб.расывают. П.олуЧ|ают .приблизительно 17 л л.розрачного раств., в котором нар ду с другими саде,ржащ1ИМис  в .клетках матер .иалами находитс  .-асларагиназа.

Из полученного раствора посредством добавки 69 л а.цетона, осаждают L-аспарагиназу. Образовавшийс  осадок изолируют, лро.мывают ацетоНом и .просушивают в .ва1сууме 1пр.и 25-30° С. Получают лриблизительно 100 г сырой L-аспарагиназы с а|Кт.и.вностью приблизительно 3,3 (пр.и лрименении питательного р.аствора I) или 4,0-4,6 .ин. ед. на 1 мг (.пр.и пр.именении питательного раствора II). При применении питательн.о.го раствора 1П сыра  L-аспарагиназа содержит лрибли.з.ительно 2,5 ин. ед. на 1 мг.

Предмет и з .о б р е т е н и  

Способ выделени  /.-асп.арагИ|Назы из культуральной 1Ж.идкости, лолученной лри культи.вирова .нии Escherichia coli, предус.матривающий Осаждение /.-аспаратиназы ор.Г1аиически.м .растворителем , на.при.мер 1ацет|0.н.ом, отличающийс  TeiM, что, с целью б.олее полного выделен .и  .фермента, перед осаждевием L-acnapaли .назы орган.ически.м растворителем, .производ т осаждение клеток Escherichia coli в виде хлопьев .из культу.ралыной жидкости добавлением в нее органического основани  с молекул рньим весо.м более 1000 ил.и его соли с лоследующи .м отделением клето.к, например, центр.ифугирован.ием и экстрагированием воДО .Й, а до бавление органического растворител  осуществл ют в полученный экстракт.