DE1767390A1 - Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnring von L-Asparaginase

  L-Asparaginase ist bekannt. Sie kommt in Escherichia coli

  intrazellulär vor l11. A. Camphell, Z. T. Mashburn, E. A.

  Boyse, L. J: 01d, Biochemistry _6 (1967), Seiten 721 bis

  730, hier weitere Literatur% und wurde auf folgende Weise

  aus der 7e17.mpqse von "4;. col i Bl! = E. coli ATCn 11303 g^

  Wonnen:

  Freisetzen des Enzyms durch Zertrümmerung der Bakterien-

  zellen mit Ultrascliizill oder Zermahlen mit Aluminiumoxyd,

  Beseitigung von Zelltrümmern und Nucleinsäuren durch Fäl-

  lung mit Manganchlorid und anschließendes Zentrifugieren,

  Aussalzen des Rohenyms aus der überstehenden Lösung mit

  Ammoniumsulfat, Dialyse und weitere Reinigung durch Chroma-

  tographie an DEAE-Zellulosesäulen.

  Die Anzucht der E. coli-Zellen erfolgte in Nährbouillon,

  Pehtonlösung--n, auf "Trypticase Soy Agar" und in Einer Nähr-

  lösung der Zusammensetzung "Dehydrated Bacto-Nutrient Broth"

  0,8 %, Glucose 1,0 %, Dinatriumhydrogenphospiiat 0,6 % und

  Kaliumdihydrogenl-)lio.#3phat 0,3 r Z-H. A. Campbell, L. T.

  Mashburn, E. A. Boyse, L. J. 01d, Biochemistry 6 (1967)

  Seiten. 720 bis 730; d. Roberts, M. D. Prager, N. ßachyrtsky, Cancer Research ?_6 (1966), Seiten 2213 bis 2C1-17-7-Diese Arbeitsmethoden sind jedoch für eine technische Gewinnung des Enzyms nicht geeignet.
• Es wurde nun erfunden, daß man L-Asparaginase in technischem Maßstab und in guter Ausbeute herstellen kann, indem man Escherichia coli-Zellen anzüchtet, die gewachsenen Zellen mit organischen Basen vom Molekulargewicht über 1000 oder deren Salzen ausfällt, die isolierten Zellen mit Aceton aufschließt, die Zellen mit Wasser extrahiert, extrahierte Zellen, Nucleinsäuren und Ballastproteine durch Fällung mit organischen Basen vom Molekulargewicht über 10'J0 oder deren Salzen entfernt und aus der überstehenden Lösung L-Asparaginase mit Aceton ausfällt und isoliert.
• Als Organismus wurde Escherichia coli ATCC 9E37 verwendet. Es sind jedoch praktisch auch alle anderen Escherichia coli-Stämme geeignet, z. B. Escherichia coli ATCC 4157, 8677, 8739, 972-3, 10536, 10586, 11105, 11126, 12142, 12408, 12911, 13676, 13706, 13762, 14948.
• Versuche mit Schüttelkulturen zeigten, daß die Verwendung von sogenannten "synthetischen" Nährlösungen und der biher für-diesen Zweck bekainten Nährlösungen zu nur schwacher L-Asparaginase-Bildung führt. Dagegen erhält man Bakterienzellen hoher enzymatischer Aktivität mit Nährlösungen, die neben den erforderlichen anorganischen Ionen und Aminosäure- und Peptidgemischen in Form von Zellautolysaten oder Proteinhydrolysaten als N -Quelle geeignete oganische Säuren als C-Quelle enthalten. Maisquellwasscrlösuugen erfüllen diese Anforderungen in hervorragender Weise. Noch bessere Ergebnisse werden erzielt, wenn ntan die in Maisquellwasser vorhandene Konzentration an Milchsäure erhöht und zusätzlich NH4+-Ionen hinzufügt. Anstelle von Milchsäure kann man auch Bernsteinsäure, Fumarsäure oder Z-Äpfelsäure verwenden. Zusätze von durch E. coli vergärbaren Kohlehydraten, z. B. Glucose, Fructose, Mannose, Maltose, Galaktose usw., oder der Aminosäuren DL-Yalin, DL-Serin, L-Cystein, L-Tryptophan und DL-Norvalin bewirken eine Repressioa; Zusätze von L-Glutaminsäure, L-Asparaginsäure, DL-Alanin und Glykokoll dagegen eine Fördorung der Synthese von L-Asparaginase.
• Auch Hefeextrakt eignet sich als Basis für die erfindungsgemäßen Nährlösungen.
• Als gut geeignet erwiesen sich folgende Nährlösungen:

  1. Maisquellwasser

  (bezogen auf Trockensubstanz) 3,00 %

  Natriumlaktat 0,60 % PH 7,0

  (Nil 4 )2S04 0920 %

  2. Maisquellwasser

  (bezogen auf Trockensubstanz) 3,00 ö

  Natriumlaktat 0,30

  L-Glutaminsäure-Na 0,15 % pH 7,0

  Glykokoll 0,15

  (NH4)2504 0,20 %

  3. Hefeextrakt 2,00 %

  Natriumlaktat 1,00 9& pH 7,0

  (NH4) 2504 0920 96

  Diese Nährlösungen wurden mit Schrägagarkulturen von E. coli ATCC 9637 beimpft und auf der Schüttelmaschine etwa 20 Stunden bei 300C kultiviert. Der pH-Wert der Kulturen stieg in dieser Zeit auf 8,5 bis 8,9 an.
• Die gleichen Resultate wurden bei der Übertragung dieser Arbeitsbedingungen in den technischen Fermentermaßstab erzielt.
• Nach beendeter Züchtung wird eine organische Base mit einem Molekulargewicht über 1000 oder deren Salz zur Kulturbrühe gegeben, wodurch die Zellen ausgeflockt und.leicht zentrifugierbar werden. Nach Resuspension der Zellen in Wasser werden diese durch Zugabe von Aceton erneut ausgefällt. Dabei werden die Zellen aufgeschlossen und so verändert, daß sich die gebildete L-Asparaginase im nächsten Schritt mit Wasser herauslösen läßt. Dieser besteht in der nochmsliuE@n Abtrennung durch Zentrifugieren, nochmaliger Resuspensiori und Extraktion mit Wasser. Aus dieser Suspension werden durch Zugabe einer der obengenannten organischen Ba2er die extrahierten Zellen, Nucleinsäuren und Ballastproteine au@>-gefällt und durch Zentrifugieren entfernt. Aus der überstehenden wäßrigen Lösung kann L-Asparaginase durch. Zugabe von viel Aceton gefällt werden. Statt Aceton lassen sich zum AufschluB der Zellen und zur Ausfällung der L-lssparaginase auch andere mit Wasser mischbare oder beschränkt mischbare organische Lösungsmittel, wie Methanol, Äthanol, Isopropenol, Methyläthylketon, Dimethylsulfoxyd, verwenden.
• Gegenüber den bisher bekannten Verfahren hat das erfindungsgemäße Verfahren überraschenderweise den großen Vorteil, L-Asparaginase in praktisch pyrogenfreiem Zustand zu liefern.

  Bestimmung der relativen L-Asparaginase-Aktivität der

  aus Kulturlösungen isolierten Bakteni_enzellen

  15,0 ccm Kulturlösung werden zentrifugiert. Die überstehen-

  de Lösung wird verworfen. Die Bakterienzellen würden zu

  einem Volumon von 15,0 ccm in 1120 bidestillierv rE:siispen-

  diert. 3,0 ccm bzw. 5,0 ccm dieser Zellsuspen:,'Lon werden

  mit 12,0 ccm bzw. 10,0 ccm bidestillierten Wa:ser verdünnt

  und mit 15,0 ccm 2-; iger L-Asparaginlösun" in 1/10 mola.rer

  Phosphatpufferlösung von pH 7,0 versetzt. Es folgt dann

  ein Zusatz von 0,2 ccm Toluol.

  Das so hergeBtellte Reaktionsgemisch, welches nun 1,0 ,°l

  L-Asparagin und 1/10 bzw. 1/6 der ursprünglich in der

  Kulturlösung vorliegenden Bakterienzellkonzentration

  (= 1/10 (ILd)ormal bzw. 1/6 (N)ormal) eri@htilt, wird unter

  Gummistopfenverschluß 3 Stiinderi hei 30°c.

  e:@r@@@@ trgl t. _

  Nach Ablauf dieser Zeit wird das Gem> sch 5 Minnten auf

  100°C erhitzt, wieder abgekühlt und klarzentrifugiert.

  Die überstehende Lösung wird zur kolorinetrischen tIH3-

  Stickstoffbestimmung mit Nesslers Reagens gegen Aa:imonium-

  sulfat-Standardlösungen verwendet. Unter diesen Testbe-

  dingungen entstand durch in Nährlösung 1 gew2@ch:3erle Dak-

  terienzellen 0,025 bis 0,04 %, durch in :i@ihx@ösun; 2 ge-

  wachsene Zellen 0,035 bis 0,065 % und durch in 21@@.tirlö@i.@ng 3

  gewachsene Zellen 0,0,1 % N. (Maximal abspaltbarcr id hei

  1 , 0 % L-Asparagin i in Reaktionsgemisch = 0,106 ;'j 1;) .

  Um ein Maß für die relative h-A:3par agim;::e-AktivitC-it der

  E. coli-Zcllen zu erhalten, multipliziert man die kolori--

  metrisch beitirnri'te N-Konzentration mit dem Verdünnurigs-

  faktor der im Testreakt:iorisgeniisc)i vor-H--gen en I?,ikterier;.-

  zellkonzentration. So beträgt die relative

  Aktivität cIer in ldährlö:3u.ng 1 Zellen 0,G-5 bi;,

  0,04 x 10 = 0,25 bis 0,4, die der in Nährlösung @ gewachse-

  ner. Zellen 0,035 bis 0,06; x 10 = 0,35 bis 0.65 und die der

  in Nä!irlösung 3 gewachsenen Zellen 0,04 x 6 = 0924-

  Die Z-Aspa7-agina^e-Besti.mmurig der Roh-Z-A; paraginase er-

  folgte nach vier Methode aus Cancer Research 26 (1966),

  Seiten 2013 bis 2017.

  Die erfindungsgemäß gewoiifie@ie h--Asparagiriasc soll als Arz-

  neimittel. gegen solche Tumoren verwendet werden, die zu

  ihrem Wachstum L-Asparagin als Wuchsstoff benötigen. Vor

  einer solchen Verwendung ist es zweckmäßig, die erfindungs-

  gemäß gewonnen(,L-Aspar@igi_üase weiter anzui eichern bzw. zu

  reinigen.

  J3 c: :i s _i. e 1

  Bei der iw.. nachstehende. als "Rase" bezeichneten Verbindung

  har:delt es sich un eiri }lochmolekulares Produkt der allgemei-

  nen Formel:

  milk. einem Molek u7 argewich i. über 1000, die durch Umsetzung

  von i@i-( 3-ämitiu-ii-propy l )-me R;hyl _@rnin mit Epicülorhydrin

  entsteht.

  Arheitsgm@; 1

  (bezogen. auf `frockensiii):; tari2 )

  wird uii_t 2 n Kalilauge auf pli 7,0 eingeGtc:zlt, 20 Minuten

  auf 120°C erhi i,zt uud nach Abkühlung in der Uberlaufzentri -

  fuge oder durch Seit2-Filtration geklärt. 30 Liter dieser

  klaren Naisquellwasserlösung werden mit 170 Litern Leitungs-

  wasser verdünnt. Zur Herstellung der obenbeschriebenen Nähr-

  lösung 1 werden 1,2 kg Natriumlaktat und 0,4 kg Amzionium-

  sulfat, zur Herstellung der Nährlösung .' 016 kg riatrium-

  laktat, 0,3 kg 1.1-Glutaminsäure-Na, 0,3 kg Glykokoll und

  014 kg Antmoni_ü17@S Ulf at zugesetzt.

  Die erhaltene 1dährlösung wird in- einem Fermenter 40 Miauten

  bei 1100C sterilisiert, anschließend abgekühlt und dann mit

  500 ccin einer 18 Stunden bei 3000 gewachsenen Schüttelkul-

  tur von Escherichia coli ATCC 9637 in eitaer Pährlö sung, be-

  stehend aus 1,5 ;b Iiefc:extrakt und 095 % Natriumlaktat,

  pH 7,0, beimpft. Der f@@ri:c@t@tationsansatz wird bei 300C mit

  80 Litern Luft/fjjnutt150 Umdre:hungc:n des Rührwerkes

  pro Minute belüftet.

  ArbeitsL#ani; 2

  Nach einer Waclistum:zeit von 16 bis 18 Stunden - wenn der

  pIi der Kultur auf etwa 8,E3 angestiegen ist - wird die Kul-

  turbrühe auf et@-ra 200C abgekühlt. Die Bakterien, welche

  L-Asparaginase ecithalten, werden durch einen Zusatz von

  1,0 Liter 2,5-dgiger "Base"-Lösung ausgeflockt, in der

  Überlaufzentrifuge abgetrennt und zu einem Volumen von

  20 Litern mit Leitungswasser resuspendiert.

  Arbeitsgang 3

  In die in Arbeitsgang 2 erhaltene Zellsuspenoion läBt man

  unter Rühren 80 Liter Aceton einlaufen, setzt 20 ccm

  2,5-%ige "Basel'-Lösung hinzu, trennt die ausgefällten

  Bakterien in der Überlaufzentrifupe ab und resuspendiert die Zellmasse wiederum zu 20 Litern mit Leitungswasser. Arbeitsgang 4 Zur Extraktion der h-Asparaginase aus den Bakterienzellen wird die in Arbeitsgang 3 hergestellte Suspension 4,5 Stunden bei 300C gerührt. Während dieser Zeit wird der ph durch Zusätze von 1 n Natronlauge bzw. 10-%il;er Essigaäurc bei pli 7,5 bis 7,8 gehalten. Anschließend wird auf etwa 200C abgekühlt.
• Arbeitsgang 5 In die nach Arbeitsgang 4 extrahierte ZellauspenSion läßt man unter Rühren 2,5 Liter 2,5-%ige "Basel'-Lösung einlauft-r. ui,d tretiii-L derl entstandenen a harken ueraus extrahierten Baktcrien und unlöslicliern "Base"-Nucleinsäure-Proteinkomplex besteht, in der Überlaufzentrifuge ab. Der Niederschlag wird verworfen. Man erhält etwa 17 Liter einer klaren Lösung, in der sich neben anderen Zellinhaltsstoffen die h-Asparaginase befindet.
• Arbeitsgang 6 Aus der in Arbeitsgang 5 gewonnenen Lösung wird Roh-h-Asparaginase durch Zusatz von 68 Litern Aceton ausgefällt. Die entstandene Fällung wird isoliert, mit Aceton nachgewaschen und im Vakuum bei 25 bis 300C getrocknet. Man erhält etwa 100 g Roh-h-Asparaginase mit einer h-Asparaginase-Aktivität von etwa 3,3 (bei Verwendung von Nährlösung 1) bzw. 4,0 bis 4,5 internationalen Einheiten pro mg (bei Verwendung von Nährlösung 2). Bei Verwendung von Nährlösung 3 enthält die Roh-h-Asparaginane etwa 2,5 internationale Einheiten pro mg.

Claims (1)

1. Patentansprüche 1. Verfahren zur Gewinnung von L-Asparaginase, dadurch gekennzeichnet, daß man Escherichia coli-Zellen züchtet, die gewachsenen Zellen mit organischen Brisen vom Molekular- gewicht über 1000 oder deren Salzen ausfällt, die isolierten Zellen mit Aceton aufschließt, die Zellen mit Wasser extra- hiert, extrahierte Zellen, Nucleinsäuren und Ballastproteine durch Fällung mit organischen Basen vom Molekulargewicht über 1000 oder deren Salzen entfernt, und aus der überstehelzden Lösung L-Asparaginase mit Aceton ausfällt und isoliert. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekeanzeichne t, daß man die Züchtung in einer Nährlösung vornimmt, die Maisquellwasser und/oder Hefeextrakt und Salze von orE,ani- schen Säuren, wie P.Iilctisäure, Bernsteinsaure, fumar sö.llre oder Z-Äpfelsäure, und Ammoniumionen enthält und weitgehend frei von durch E. coli. vergärbaren Kohlehydraten ist. 3. Verfahren nach Ans priich 1 und 2, dadurch geitennzeich- riet, daß man die Züchtung in einer Nährlö: ung vornilr;r@.t, die außer den in Anspruch 2 genannten Bestandteilen h-Glutamin- säure, L-Aspar@agzn^äure oder DL-Alanin oder Glykokoll oder Salze dieser Alriizio:@äur(:n enthält und weitgehend frei von durch E. coli vergärbaren Kohlehydraten Verfahren nach Anai)ruch 1, dadurch ;el:cnnzc:ictinei,, daß man Zellen von Esche:richia coli A`1GC fj6?7 vert:eiidf:t. 5. Verf#-fahren nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Aufschluß der Zellen und zur Aup-fällung der Asparagi_nase statt Aceton aridere mit Wasser wischbare oder beschränkt mischbare organische Lösungsmittel verwendet.