SU1732815A3 - Способ получени гипотриглицеридально-активных полисахаридов - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к способу получени  физиологически активных полисахаридов , которые могут найти применение в медицине. Целью изобретени   вл етс  повышение активности целевого продукта. Способ заключаетс  в том, что на бульоне Рогозы в аэробных услови х культивируют штамм Streptococcus faecium PERM BP-296 или Streptococcus faecalls PERM BP-297, или Streptococcus savlum PERM BP-298, или Streptococcus salivalls PERM BP-299, или Streptococcus olurans PERM BP-300, или Streptococcus mitis PERM BP-301, или SheptoccoccuS equinus PERM BP-302, отдел ют биомассу от культуральной жидкости с последующим выделением целевого прс- дукт. Получаемые полисахариды обладают способностью снижать уровень триглицери- да в крови от 45 до 50%. 11 табл., 4ил. w Ё

Description

Изобретение относитс  к способам получени  гипоглицеридально-активных полисахаридов , т.е. полисахаридов, снижающих содержание триглицерида в крови млекопитающих .

Вещества подобного типа действи  могут быть применены в качестве терапевтических препаратов против атеросклероза или гиперлипидемии, которые  вл ютс  наибо-. лее типичными заболевани ми людей среднего и пожилого возраста.

Известен способ получени  физиологически активного полисахарида путем культивировани  штаммов-продуцентов из рода Pseudomonas на соответствующей питательной среде и выделени  из ферментационного бульона посредством фракционировани  биополимеров 1.

Недостатком способа  вл етс  недостаточно высока  физиологическа  активность полисахарида.

Целью изобретени   вл етс  повышение активности целевого продукта.

На фиг. 1-4 приведены хроматограммы. по сн ющие предлагаемый способ.

Сущность способа получени  гипотриг- лицеридально-активных полисахаридов состоит в том, что на питательной среде - бульоне Рогозы - а аэробных услови х выращивают штаммы-продуценты Streptococcus faecium PERM BP-296 или Streptococcus faecalis PERM BP-297, или Streptococcus savlum BP-298, или Streptococcus salivalls

XI

CJ ГО 00

д

ел

OJ

PERM BP-299, или Streptococcus durans PERM BP-300, или Streptococcus mltls PERM BP-301, или Streptococcus equlnus PERM BP-302 до максимального наполнени  целевого продукта, отдел ют биомассу от культуральной жидкости и осуществл ют выделение целевого продукта из культуральной жидкости или из биомассы после ее депротеинизации и дезынтеграции.

Наиболее общие примеры таких микроорганизмов сданы на хранение в Исследовательский институт ферментации (ИИФ, т.е. Международный центр хранени  в соответствии с Будапештским соглашением) в Японии, а шифры хранени  перечислены в табл.1.

Микробиологические характеристики микроорганизмов, используемых в предлагаемом способе,  вл ютс  такими же, что и микробиологические характеристики известных микроорганизмов, принадлежащих тому же классу, т.е. общие микробиологические характеристики, методы культивирование и другие свойства соответствуют характеристикам, описанным в Руководстве Берге  по определительной бактериологии, 8-е изд.

Наиболее общие микробиологические свойства указанных штаммов приведены в табл.2 и 11.

Указанные микроорганизмы можно - культивировать известным методом. Например , бактериальные клетки могут быть получены при помощи стационарного культивировани  в среде бульона Рогоза при аэробных услови х, затем бактериальные клетки отдел ютс  при помощи центрифугировани  культуры.

Состав среды бульона Рогоза следующий , г: триптиказа 10; экстракт дрожжей 5; триптоза 3; К2НР043; КН2Р043; триаммоний цитрат 2; твин-80 1; глюкоза 20; хлоргидрат цистеина 0,2, кроме того, раствор соли (1 MgS,04 7H20 11,5; FeSCV7H20 0,68; MnS04 2H20 2,4; дистиллированна  вода 100 мл) 1-5 мл и дистиллированна  вода - до объема 1 л, (рН 7, стерилизаци  нагреванием до температуры 121 °С, котора  поддерживаетс  в течение 15 мин).

Получение полисахарида ПССТ.

Выращивание микроорганизмов. Каждый из указанных микробных штаммов , засевают на среду бульона Рогоза и инкубируют без перемешивани  при 37°С в течение 5-10 ч при аэробных услови х, в результате чего получают культуральный бульон с некоторой концентрацией живых бактериальных клеток.

Культуральный бульон непрерывно подвергают центрифугированию со скоростью 12000 об/мин, а собранные бактериальные клетки затем промывают в сол ном растворе (0,85% NaCI) 2 или 3 раза.

Разрушение бактериальных клеток. Промытые клетки суспендируют в физиологический сол ной раствор и обрабатывают термическим способом при 115°С в течение

0 10 мин с целью их разрушени .

Бактериальные клетки, промытые и суспендированные в физиологический сол ной раствор, разрушают при помощи обработки ультразвуком (15 кГц, 60 мин) французским

5 прессом или другими известными способами .

Удаление жира из клеток. Суспензию разрушенных клеток смешивают со смесью хлороформ-метанол (2:1 об/об). Компонен0 ты, экстрагируемые органическим растворителем , затем полностью удал ютс .при помощи центрифугировани  со скоростью 300 об/мин в течение 10 мин, а слой хлороформа сливают.

5 Обработка протеолйтическими ферментами . Обезжиренные пробы обрабатывают протеолйтическими ферментами, такими как проназа, трипсин и пепсин при помощи известных процедур. Из этих протеолитиче0 ских ферментов проназа  вл етс  наиболее предпочтительной дл  этой цели. Услови  обработки этим ферментом  вл ютс  известными .

Очистка. В верхний слой после центри5 фугировани  протеолитической реакционной смеси добавл ют такие осаждающие агенты, как трихлоруксусна  кислота или сульфат аммони  с тем, чтобы протеинова  фракци  выпала в осадок и ее можно было

0 удалить. Фракцию верхнего сло  затем обрабатывают соответствующей нуклеазой или протеолйтическими ферментами с тем, чтобы удалить составл ющие нуклеиновых кислот, таких как ДНК и РНК или протеины

5 фракции. После такой ферментной обработки несколько раз осуществл ют диализ.

Частично очищенную фракцию затем снова подвергают другим процедурам очистки , таким как гелева  фильтраци  и очист0 ка с использованием хроматографической колонны. Чиста  препараци  полисахарида, обозначаемого как полисахарид ПССТ, получаетс  в конце последней стадии.

В общем случае этот полисахарид ПССТ

5 может быть получен в соответствии с его физико-химическими характеристиками при помощи многочисленных процедур изол ции и очистки, которые уже давно широко используютс  в это области техники, таких как осаждение-растворение и экстракци , экстрагирование растворителем, диализ , применение хроматографической колонны , электрофорез, гелева  фильтраци  или люба  комбинаци  этих процедур. Таким образом, изобретение никоим образом не ограничиваетс  какой-либо конкретной из упом нутых процедур.

Т.е. препараци  изобретени  относитс  к способам получени  активных продуктов, снижающих содержащие триглицеридов в крови, которые состо т из полисахарида, и их получают из микроорганизмов, принадлежащих семейству Streptococcus, так как фармакологическа  активность была обнаружена во фракции полисахарида,

Отметим, что активность по снижению содержани  триглицерида в верхнем слое культурального бульона составл ет примерно 1/5 от активности в бактериальной клетке .

Физико-химические и физиологические характеристики полисахарида ПССТ состо т в следующем.

Химическа  природа и свойства растворимости . Тонко измельченна  проба, полученна  после обессоливани  и сушки вымораживанием,  вл етс  негигроскопичным белым порошком, обладающим высокой растворимостью (100 мг/мл) в воде, но она только частично раствор етс  в этаноле, метаноле и ацетоне и совсем не раствор етс  в простом эфире и хлороформе.

Молекул рный вес. Молекул рный вес полисахарида ПССТ оцениваетс  в примерно 14000±3000 и устанавливаетс  при помощи гелевой фильтрации с использованием нескольких правовращающих материалов различного молекул рного веса в качестве индексов, и колонны Тойопеарл HW/55 (фирма Тойосоде Ко., Лтд), уравно- вешенной при помощи 25 мМ трис-НС буфера , содержащего 0,ЗМ NaC (pH 7,5).

Удельный показатель вращени . Удельный показатель вращени  упом нутого полисахарида ПССТ в 1,8%-ном растворе, , равен + 190,1 (правое вращение). Этот показатель определ етс  при помощи пол риметра (модель ДИП-4, фирма Джапан Спектроскопик, Ко. Лтд.).

Сахарный состав. 4мг пробы обрабаты- вают 0,2 М раствором ТФК (трифторуксус- ной кислоты) при 100°С в течение 7 ч, а триметилсилилирование осуществл ют следующим образом: пробу смешивают с 0,2 мл гексаметилдисилазана (20% в пиридине) и 0,02 мл триметилхлорсилана, смесь перемешивают в течение 15 мин и после отстаивани  в течение 5 мин подвергают газовой хроматографии q целью определени  содержани  глюкозы, рамнозы и т.д. Температура колонны разделени  составл ет 179 С. Содержание уроновой кислоты определ ют с использованием метода карбазол-НаЗСм (модифицированный метод Биттера-Муира).

Состав Сахаров полисахарида ПССТ следующий, %: глюкоза 70,3; рамноза 13,7; уронова  кислота 16,0.

Кислотно-основные характеристики. рН 0,1 и 0,5%-ного раствора полисахарида ПССТ составил 6,71.

Спектр инфракрасного поглощени . Инфракрасный спектр поглощени  полисахарида ПССТ, полученный с использованием инфракрасного спектрометра (модуль IASLO А 302, Джапан Спектроскопик Ко, Лтд), приведен на фиг. 1,где по ос м абсцисс и ординат отложены длина волны и пропускание соответственно.

Элементарный анализ. Элементарный анализ при помощи элементарного анализатора (модель 240 В, Перкин-Элмер) дал следующий результат: С 37,2%, Н 6,4% и О 56,4%, дл  полисахарида ПССТ. Упрощенна  формула имеет следующий вид

С31Н64Н35.

Температура точки плавлени . Точка плавлени  полисахарида ПССТ составила 235-241 °С, ее измер ют при помощи установки дл  измерени  температуры точки плавлени  (модель Яанако МР-3, фирма Яанагимото Сейсакушо, Япони ).

Физиологические характеристики. Полисахарид ПССТ  вл етс  активным при применении с целью снижени  содержани  триглицерида в крови млекопитающего при стоматическом применении.

Эта активность  вл етс  стабильной в области температур от -80°С до 115°С и при рН в области от 4,1 до 11, если даже полисахарид перед применением хранилс .

Фармакологическое действие полисахарида ПССТ.

Фармакологические эффекты. Предлагаемый антиатеросклеротический препарат, содержащий предлагаемый полисахарид ПССТ,  вл етс  в высшей степени эффективным при снижении содержани  триглицерида в крови млекопитающих. В соответствии с этим предлагаемый препарат используетс  в качестве терапевтического или профилактического препарата при заболевани х, св занных с атеросклерозом, гиперлипи- демией, гиперлипопротеиномией, ксанто- матозом, холецистолитизом, гипертонией, диабетом и другими заболевани ми.

Предлагаема  композици  может быть применена к млекопитающим стоматическим , внутрибрюшинным внутривенным или любым другим способам. Количество

препарата в одной дозе должно составл ть от примерно 1 мг до 0,5 г/кг веса тела. При стоматическом применении в предпочтительном варианте это количество в одной дозе составл ет от примерно 0,01 мг до 100 мг/кг веса тела. Дл  применени  лекарственного препарата может быть выбрана люба  его форма: его можно примен ть в виде раствора в физиологическом сол ном растворе или в других носител х, в виде инъекций, изготовленных при помощи лио- филизации и т.д., в виде суппозиториев, таблеток с покрытием, гранул, таблеток, капсул и т.д. с соответствующими носител ми и разбавител ми.

Остра  токсичность. Указанна  величина дл  предлагаемого полисахарида ПССТ составл ет более 1200 мг/кг веса тела при внутрибрюшинном применении мышам. Предлагаемый материал  вл етс  по существу нетоксичным при стоматическом применении .

Пример Получение и очистка полисахарида ПССТ. Streptococcus faectum ФЕРМ БП-296 прививают в 2 л среды бульона Рогоза с конечной концентрацией клеток 1x106 бактерий/мл. Среду после прививки культивируют в течение 10 ч при 37°С без перемешивани  в аэробных услови х с тем, чтобы в результате получить культуральный бульон с концентрацией клеток 10 бактерий/мл. Бактериальные клетки собирают при помощи непрерывного центрифугировани  со скоростью 12000 об/мин, промывают физиологическим сол ным раствором (0,85% NaCI) и суспендируют в такой раствор с тем, чтобы получить 100 мл суспензии клеток с концентрацией 2х1010 бактерий/мл .

Упом нутую суспензию бактериальных клеток обрабатывают при 115°С в течение 10 мин и обрабатывают 3 раза смесью хлороформ-метанол (2:1 в/в) с целью удалени  жиров.

Обезжиренную суспензию бактерий подвергают центрифугированию со скоростью 3000 об/мин в течение 10 мин, а нижний слой, т.е. слой хлороформа, удал ют. Водный слой используют в качестве исходного материала на следующих стади х очистки .

Исходный материал затем обрабатывают 20 мг проназы (сигма протеаза типа X1Y) в 100 мл фосфатного буфера (рН 7,8), содержащего 0,0015 мг СаС12, при 47°С в течение 24 ч, а затем обрабатывают при помощи 10 мг проназы при тех же услови х.

Материал, обработанный проназой, раздел ют на осажденную фракцию и фракцию верхнего сло  после отстаивани  при

помощи центрифугировани -со скоростью 3000 об/мин в течение 10 мин.

Во фракцию верхнего сло  добавл ют 1/9 объема 100%-ного (в/о) раствора трихлоруксусной кислоты (ТХК), выдерживают при 4°С в течение 3 ч при перемешивании, а затем полученный материал подвергают центрифугированию при скорости 3000 об/мин в течение 10 мин, в результате чего

0 получают осадок и верхний слой. В осажденную фракцию добавл ют такой же объем 10%-ного раствора ТХК и повтор ют описанную процедуру. Полученный верхний слой промывают 3 раза этиловым простым

5 эфиром с целью удалени  ТХК, раствор ют в 50 мл дистиллированной воды, нейтрализуют 1 н. раствором NaOH, диализируют с целью полного удалени  ТХК и, наконец, подвергают его лиофилизации с тем, чтобы

0 получить 258 мг (сухой вес) фракции верхнего сло .

Полученную фракцию верхнего сло  обрабатывают проназой, подвергают диализу , в результате чего получаю т 176 мг

5 (сухой вес) диализированной фракции (MB 3500). Диализированную фракцию в дальнейшем будем называть очищенной фракцией I.

Очищенную фракцию I подвергают

0 фракционированию при помощи хроматог- рафической колонны СефадексТ-100 (фирма Фармациа), урвновешенной буфером 0,05 М трис-HCI. Полученна  в результате хроматограмма очищенной фракции I при

5 скорости элюировани  1 мл/мин, приведена на фиг.2, где по абсциссе откладывают объем элюировани , а по оси ординат - концентрацию элюированного материала. Фракцию после 124 мл собирают и в даль0 нейшем будем ее называть очищенной фракцией II (сухой вес 93,6 мг).

На фиг.З - приведена хроматограмма очищенной фракции II, котора  была получена при помощи колонны Тойопеарал HW 5 55F, уравновешенной 25 мМ буфера трис- HCI, содержащего 0,3 М NaCI.

Скорость элюировани  составила 1 мл/мин. На фиг.З кривые 1-3 представл ют собой профили элюировани  сахара, проте0 ина и нуклеиновой кислоты соответственно.

Очищенный полисахарид ПССТ (87,9 мг

сухой вес) выдел ют при помощи отбора

порции, элюированной в области фракций

80 100мл.

5 На фиг.4 приведена хроматограмма полисахарида ПССТ при тех же эсперимен- тальных услови х, которые были использованы дл  фиг.З.

В табл.З приведен количественный выход протеина, который определ лс  мегодом Лоури, РНК, который определ лс  методом орсинола, ДНК, который определ лс  методом дифениламина, и сахара, который определ лс  методом фенола-НаЗСМ в каждом способе получени .

Удельна  активность, приведенна  в табл.3, указывает на относительную активность по снижению содержаний триглице- рида каждой фракции при испытании на крысах на единицу веса, причем активность термически обработанных бактериальных клеток равна 1. Методы анализа по определению активности снижени  содержани  триглицерида у животных описаны в примере 2.

Установлено, что полисахарид ПССТ может быть выделен и очищен из других бактериальных штаммов, перечисленных в табл.1, по аналогии с насто щим примером, но с меньшим выходом.

П р и м е р 2. Фармакологический эффект полисахарида ПССТ.

Активность по снижению содержани  триглицерида.

1.Пробы физиологического раствора, содержащие эквивалент 16 мг/кг веса тела лиофилизованного полисахарида ПССТ, получают аналогичным образом. Эти пробы примен ют стоматическим способом в ежедневной дозе 1 мл в крысам (возраст 18 недель, самцы, средний вес 246 г, 10 крыс в группе) и стерильным мышам (возраст 18 недель, самцы, средний вес тела 30 г, 10 мышей в группе). Крысы и мыши вскармливаютс  в течение 8-12 недель. Затем собирают артериальную кровь из абдоминальной аорты этих животных, а пробы сыворотки отдел ют при помощи центрифугировани  всей крови. Определ ют содержание триглицерид ТГ ВАКО (фирма Вако Юниаке Ко, Лтд. Ацетил-ацетоновый метод).

Полученные рузультаты собраны в табл,4 (степень снижени -no сравнению со значени ми в контрольных группах, к которым описанна  обработка не примен лась),

Состав диеты, котора  примен лась на период вскармливани , приведен в табл.5.

2.Упом нутые пробы примен ют орально стоматическим способом в ежедневной дозе 1 мл к обычным крысам (возраст 18 недель, самцы, средний вес животного 238 г, 15 крыс в группе) и к обычным стерилизованным мышам (возраст 18 недель, самцы, средний вес животного 31 г, 10 мышей в группе) в течение 4 недель. Содержание триглицерида в крови определ ют в точности так же, как это было описано. Полученные результаты собраны в табл.6 (степень снижени  по сравнению со значени ми.

полученными дл  необработанной контрольной группы).

3. Физиологические сол ные пробы, содержащие 4 мг/мл полисахарида ПССТ, 5 примен ют стоматическим способом в ежедневной дозе 1 мл на крысу в течение 2 недель к крысам, больным гиперлипиде- мией (возраст 18 недель, самцы, средний вес животного 250 г, 5 крыс в группе), кото0 рых вскармливают кормом, богатым холестерином . Содержание триглицерида в крови определ етс  в соответствии с приведенным описанием. Результаты собраны в табл.7.

5 Реакци  на различные дозы. Физиологические сол ные пробы, содержащие от 0,1 до 20 мг/мл полисахарида ПССТ, примен ют стоматическим способом в ежедневной дозе 1 мл на обычную крысу (возраст 6 не0 дель, самцы, средний вес животного 216 г, 5 крыс в группе) в течение 4 недель. Содержание триглицерида в крови определ ют указанными методами (в качестве контрольной группы использовалась группа необра5 ботанных крыс). Полученные результаты собраны в табл.8.

Остра  токсичность. Физиологические сол ные пробы (0,5 мл/мышь), содержащие 1,10 и 100 мг полисахарида ПССТ, примен 0 ют внутрибрюшинным способом к мышам 1C (возраст 6 недель, средний вес 31,6±0,6 г, 10 животных в группе). Тана- тобиологические наблюдени  за мышами осуществл ют в течение 14 дней. Контроль5 ным материалом был физиологический сол ной раствор.

Величина LDso, рассчитанна  в соответствии с методом Беренса-Кербера, составила более 1200 мг/кг веса животного. При

0 стоматическом применении предлагаемый материал  вл етс  по существу нетоксичным .

Фармацевтические композиции.

1.25 мг очищенного полисахарида 5 ПССТ тщательно перемешивают с 275 мг

порошка очищенного крахмала, а затем из полученной смеси изготавливают таблетки дл  стоматического применени . Кажда  полученна  таким образом таблетка соот- 0 ветствует дозе в 101 термически обработанных клеток/кг веса тела дл  взрослого пациента, имеющего вес в 50 кг.

2.Полисахарид ПССТ тщательно перемешивают с разбавител ми, такими как

5 карбонат кальци , лактоза и т.д., смазывающими материалами, такими как стеаринова  кислота, тальк и т.д, и другими добавками, а затем из полученной смеси получают таблетки дл  стоматического применени . Ежедневна  доза полисахарида

ПССТ в общем случае составл ет от 01, до 100 мг/кг веса тела.

3. Полисахарид ПССТ (900 мг) суспендируют и раствор ют в дистиллированной воде (30 мл), добавл ют ароматизирующий сироп, а затем приготавливают композиции в виде сиропа.

ПримерЗ. Получение и очистка ТР5- полисахарида.

S.faecalis PERM BP-297, S avlum PERM ВР-298, S. sallvarlus PERM BP-299, S.durans PERM BP-300, S.mltis PERM BP- 301, S.equlnus PERM BP-302 инокулируют в бубьон Рогоза {2 л) при конечной концентрации 1x10 бактерий/мл. Засе нную среду инкубируют в течение 10 ч при 37°С без перемешивани  при аэробных услови х до получени  109 бактерий/мл культурального . бульона. Затем бактериальные клетки собирают при помощи непрерывного центрифугировани  при 12000 об/мин, промывают физиологическим раствором (0,85% NaCI) и суспендируют в том же растворе до получени  100 мл суспензии клеток при концентрации 2х1010 мл.

Указанную бактериальную клеточную суспензию подвергают тепловой обработке при 115°С в течение 10 мин и трехкратной обработке смесью хлороформа и метанола (2:1 об/об) в цел х удалени  жиров.

Обезжиренную бактериальную суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин и нижний слой, т.е. слой хлороформа, отбрасывают. Водный слой используют в качестве исходного материала в последующей стадии очистки. Затем исходный материал обрабатывают 20 мг проназы (сигма проназа типа XIV) в 100 мл фосфатного буфера (рН 7,8), содержащего 0,0015 мг CaCl2, в течение 24 ч при 47°С, а затем при тех же услови х обрабатывают 10 мг проназы .

Обработанный проназой материал раздел ют на фракции преципитации и супернатанта путем центрифугировани  при 3000 об/мин в течение 10 мин. Во фракцию супернатанта добавл ют 1/9 объема 100 мас.%-ной трихлоруксусной кислоты (ТСА), оставл ют с перемешиванием на 3 ч при 4°С, а затем центрифугируют при 300 об/мин в течение 10 мин дл  получени  фракции преципитации и супернатанта. Фракцию преципитации дополн ют тем же объемом 10% ТСА и повтор ют указанную процедуру. Полученный супернатант 3 раза промывают этиловым эфиром дл  удалени 

ТСА, раствор ют в 50 мл дистиллированной воды, нейтрализуют 1н. NaOH, диализуютс целью полного удалени  ТСА и, наконец, лиофилизуют дл  получени  фракции супернатанта .

Полученную фракцию супернатанта обрабатывают проназой описанным способом и диализуют дл  получени  диализирован- ной фракции (MW 3500).

Указанную очищенную фракцию фракционируют при помощи хроматографии на колонках с Сефадексом С-100, уравновешенным 0,05 М трис-HCI буфером.

Очищенный TPS полисахарид выдел ют

путем сбора элюированной части в 80- 100 мл фракций.

Выход полисахаридов приведен в табл.9.

Физико-химические свойства TPS полисахарида  вл ютс  такими же, как описанные .

П р и м е р 4. Фармакологический эффект TPS полисахарида.

Указанные образцы были введены пероральнопри дневной дозе 10 мг/день/крыса стандартным крысам (самцам в возрасте 18 недель со средним весом 238 г, кажда  группа содержала 15 крыс). Кровь животных анализировали на уровень триглицерида.

Степень снижени  триглицерида приведена в табл.10.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  гипотриглицеридаль- но-активных полисахаридов предусматривающий выращивание штамма-продуцента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора, минеральные соли, биостимул торы роста и воду, в аэробных услови х до максимального накоплени  целевого продукта, отделение биомассы продуцента с образованием потока культуральной жидкости и последующее выделение и очистку целевого продукта с его депротеинизацией, отличающийс 

   тем, что, с целью повышени  активности целевого продукта, в качестве штамма-продуцента используют штамм S.faecium PERM ВР-296 или S.faecails PERM BP-297, или S.savium PERM ВР-298, или S.sallvalls

   PERM BP-299, или S.durans PERM BP-300, или S.mltis PERM BP-301, или S.equinus PERM BP-302, в качестве питательной среды - бульон Рогозы, а выделение целевого продукта провод т из культуральной жидкости или из биомассы после ее депротеини- зации и дезинтеграции.

   13

   1732815

   14 Таблица 1

   .Т. а блица 2

   Таблица 3

   Таблица 4

   Таблица 5

   15

   1732815

   Диета, обогащенна  холестерином (добавление 1 % холестерина в указанную диету)

   Диета, обогащенна  фруктозой (замена фруктозой всего количества пшеничного крахмала в указанной диете)

   Таблица 7

   Таблица 6

   Таблица 8

   Таблица 9

   Табл и ца 10

   +

   +

   +

   2

   37

   +

   +

   +

   +

   +

   +

   +

   +

   Сфероид

   0,5-1,0 мк в диаметре Пары или цепи в жидкой среде

   ± + 2

   37

   + 2

   37

   + +

   37

   + .

   1 +

   ±

   2,3,5-Трифенилтетра золхлорид. производилось.

   + 2

   37

   + +

   37

   3-7

   37

   + .

   1 +

   ±

   Концентраци  ,нг/м - .

   %

   Пропускание, % fe

   I

   N,

   0,4

   |1 Г

   s

   со го

   00

   ел

   1

   i

   И

   200

   50100

   05ын элншрованц , мл (Риг.5

   О

   100- 0&ъем эшироёани , мл

   Фиг.4

   f5ff