HU191697B

HU191697B - Process for preparing a new polysaccharide decreasing triglyceride blood level and pharmaceutical compositions containing thereof

Info

Publication number: HU191697B
Application number: HU842873A
Authority: HU
Inventors: Yasuo Kawwai; Kazunaga Yazawa
Original assignee: Advance Kaihatsu Kenkyusho
Priority date: 1983-07-27
Filing date: 1984-07-26
Publication date: 1987-03-30
Also published as: JPH0365362B2; ES8505722A1; DD222895A5; SU1732815A3; PL248970A1; PL147734B1; DE3480217D1; AU3048884A; ES534629A0; US4687764A; EP0132981A3; HUT34773A; EP0132981A2; AU563995B2; EP0132981B1; CA1239364A; MX7693E; JPS6028401A

Description

A találmány tárgya eljárás új, a triglicerid-szintet csökkentő . poliszacharid (továbbiakban jelölése: „TRS ) és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

Ismeretes, hogy az atherosclerosis vagy hiperlipidémia, mely a középkorúak vagy idősek betegsége, terápiás kezelésére számos gyógyászati készítményt, mint például a klofibrátot és az ezt tartalmazó készítményeket használják. Mégis, a kívánt célok teljes mellékben nem elégíthetők ki ezeknek az ismert készítményeknek az alkalmazásával például a farmakológiái hatások és mellékhatások szempontjából, ezért jelentősen megnövekedett az igény hatékonyabb és biztonságosabb gyógyszerek kidolgozására.

A találmány tárgya eljárás új, emlősöknek biztonságosan adagolható, emlősállatok vérének trigliceridszintjét csökkentő poliszacharid TRS előállítására. A találmány másik tárgya eljárás a fenti poliszacharidot, a TRS-t hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

A találmány szerinti új, emlősállatokban a vér trigliceríd-szintjét csökkentő poliszacharid a következő tulajdonságokkal rendelkezik:

a) specifikus forgatóképesség:

= + 190,1 (1,8 tömeg/tf%-os oldatban)

b) móltömeg gélszűrés alapján:

000 ± 3000

c) cukorösszetétel (súly% gázkromatográfiás analízis alapján):

glükóz 70,3 ramnóz 13,7 uronsav 16,0

d) sav-bázis jellemzők: semleges poliszacharidok

e) fiziológiás tulajdonságok:

képes emlősök vérének triglicerid-szintjének csökkentésére,

A vér triglicerid szintjét csökkentő poliszacbaridot úgy állíthatjuk elő, hogy egy Streptococcus nemzetséghez tartozó mikroorganizmus sejtjeiből és/vagy a tápközeg felülúszó részéből a triglicerid-szint csökkentő poliszacharidot összegyűjtjük. A találmány szerinti, a vér triglicerid szintjét csökkentő poliszacharid hipotrigliceridémiás anyagaként alkalmazható. A gyógyászat) készítmények hatóanyagaként alkalmazható. A gyógyászati készítmények egy gyógyászatilag alkalmas hordozóanyagot is tartalmaznak, és emlősök orális kezelésére alkalmas készítmények formájában alkalmazhatók.

A találmány szerinti poliszacharid tulajdonságait a mellékelt ábrákkal illusztráljuk.

Az 1. ábra a találmány szerinti TRS poliszacharid IR abszorpciós spektrumát ábrázolja.

A 2-4. ábra az 1. példa szerinti gélszűrés eluciós ábráját mutatja.

Úgy találtuk, hogy a Streptococcus genusból és/ vagy a tápkö/.eg felüíúszó részéből nyert új poliszacharidok hatékonyan csökkentik a vér trigliceridszinljét. Ezt az alkotórészt az ún. gasztroinesztinális baktériumból ill. a tápközeg felülúszó részéből extrakció útján kaptuk. A vegyület orálisan adagolva nem toxikus.

Az eljárásban használatos mikroorganizmust, az előállítási módszert, a fiziko-kémiai tulajdonságokat és a találmány szerinti TRS poliszacharM farmakológiái tulajdonságait az alábbiakban részletezzük.

Mikroorganizmus

]) Fajok

A találmány szerinti eljárásban használható mikroorganizmusok a Streptococcus fajhoz tartoznak: Streptococcus faecium, Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus avium, Streptococcus durans, Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus equinus, stb. Ezeken kívül a bélrendszerben születéstől kezdve meglévő fajok is előnyösen alkalmazhatók.

Ezeknek a mikroorganizmusoknak a tipikus példányait helyeztük a japán Fermentációs Kísérleti Intézetnél (ERI) letétbe. A FRI a budapesti, Mikroorganizmusok Letétbe Helyezésére Vonatkozó Szerződés értelmében nemzetközi deponálási hatóságnak minősül. A letétbe helyezett mikroorganizmusok deponálási számait az I. táblázat tartalmazza.

1. Táblázat

Λ törzs neve Streptococcus faecium Streptococcus faecalis Streptococcus avium Streptococcus salivarius Streptoccocus durans Streptococcus mitis Streptococcus equinus

Deponálási száma FERM BP 296 FERM BP 297 FERM BP 298 FERM BP 299 FERMP BP 300 FERM BP 301 FERM BP 302

2) A mikroorganizmusok mikrobiológiai tulajdonságai Általános mikrobiológiai tulajdonságok

Λ találmány szerinti mikroorganizmusok mikrobiológiai tulajdonságai az azonos osztályhoz tartozó mikroorganizmusokéval megegyeznek. így az általános mikrobiológiai tulajdonságokat, a tenyésztési módszereket és egyéb tulajdonságaikat a következő irodalmi hivatkozások írják le:

1) Bergey s Manual of Determinative Bacteriology

8. kiadás, 490 509(1974)

2) Int. J. Syst. Bact. 16, 114(1966)

3) Microbiol. Immunoi. 25 (3), 257- 269(1981)

4) J. Clin. Pathol. 33, 53-57. (! 980)

5) J. General Microbiol. 128, 713-720 (1982)

6) Applied Microbiol. 23 (6), 1131-1139 (1972)

A fenti példaként felhozott törzsek tipikus mikrobiológiai tulajdonságait a következőkben lehet összefoglalni:

2. táblázat
	Törzsek
Tulajdon-	ADV	ADV	AD ADV	ADV	ADV	ADV
ságok	1009	9001	2003 10001	3001	7001	8001
A sejt formája			szferoid
Gram * vagy -	♦	♦	4 ♦	4	♦	♦
Hemolizis	a	a	a a	α	α	α
Tenyésztés 10°C-on	+	+	±
Tenyésztés 45°C-on	₊		* ±	♦	±	♦
Tenyésztés 50 c-on	*

Hó'állóság 60°C-on

30 percig ♦	♦
Növekedés pH ·
9,6 táptalajon *	♦	*	-	*	-	-

Metilénkék redukáló

képesség *	4	-	-	♦	-
Zselatin csepp-

folyósodása Növekedés 6,5% NaCl-t tartalmazó
táptalajon ♦	+	-	-	+	-	-

40% epét tartalmazó

táptalajon a
növekedés	*	♦	+	-	+	-	+
Ammónia fejlesztés			ND*2		+	±
Hippursav hidrolízis		4			♦
Növekedés telluritot tartalmazó közegben		+		ND		ND
Növekedés TTC-t* tartalmazó táptalajon				ND		ND
Savképzés szénforrásból Glükóz	+	+		♦			♦
Eszku lin	±	*	+	*	4	ND	*
Inulin	-	-	-	*	-	-	4
Laktóz	<-	*		+	·»·	±
Glicerin	-	*	4	-		-	-
Arabinóz	* ,	-	+	-	-
Melecitóz		*	4	ND	....	ND
Szorbit	--		+	-	-		-
Antigén csoport	D	D	O\|DJ	K	D	-	D

*1; 2.3,5-trifenil-tetrazólium-klorid &

*2: Nem végeztük el.

3) Tenyésztési eljárások

A találmány ’ szerinti mikroorganizmusok tenyésztése szokványos módszerrel történik. Például a baktérium sejtek Rogosa tápközegben való folyamatos aerob tenyésztéssel gyűtjlietők össze és a tápközeg centrifugáíásával nyerhetők ki. A Rogosa táptalaj összetétele a kővetkező:

Triptikáz (BBL Mierobiology system

USA) 10g

Élesztő extraktum 5 g

Trintóz (Oifco, USA) 3 g

Kálium-hidrogénfosz'fát 3 g

Kálium-diliidrogénfoszfát 3 g

Triammónium-citrát 2 g

Tween 80 1 g

Glükóz 20 g

Cisztein-hidroklorid 0,2 g

Sóoldat *1 5 ml

Desztillált viz 1 literre kiegészítve (pH 7, sterilizálás 121°C-on percig) *lMgSO₄.7H₂O ll,5g

FeSO₄:2H₂O 2,4 g

MnS0₄.2H₂0 2,4 g desztillált víz 100 ml

A TRS poliszacharid előállítása

A találmány szerinti TRS poliszacharid egyik tipikus előállítási lehetősége a következő:

1) A mikroorganizmusok összegyűjtése

A fenternlített mikroorganizmus törzsek mindegyikét Rogosa tápközegbe oltottuk, 37°C-on inkubáltuk 5 10 órán keresztül keverés nélkül aerob körülmények között, így egy olyan tápközeget kaptunk, amelynek adott életképes baktériumsejt koncentrációja volt. A fermentlevet folyamatosan kicentrifugáztuk 1 2 00 fordulat/perc sebességgel. Az összegyűjtött baktérlumscjteket sóoldattal (0,85% NaCl tartalom) mostuk 2 3 alkalommal.

2) Λ baktérium sejtek szétválasztása

a) A mosott sejteket fiziológiás sóoldatban mostuk, és szétválasztás céljából 115^aC-on 10 percen keresztül hőkezeltük.

b) A baktérium sejteket mostuk, fiziológiás sóoldatban szuszpendáltuk és szonikusan (15KC, 60 perc), francia préssel és más szokványos módszerekkel szétroncsoltuk.

3) A zsír eltávolítása a sejtekből

A szétválasztott sejtszuszpenziót kloroform-metanol 2 : 1 térfogatú elegyével kevertük össze. A szerves oldószerrel kiextrahálható komponenseket teljesen eltávolítottuk 3000 fordulat/perc sebességű 10 percen keresztül való centrifugálással, majd a kloroformos fázist eldobtuk.

4) Proteolitikus enzimekkel való kezelés

A zsírtalanított mintát olyan proteolitikus enzimekkel, mint a pronáz, tripszin és pepszin kezeltük szokványos eljárásokkal. Ezek közül a proteolitikus enzimek közül a pronáz a legalkalmasabb erre a célra. A kezelés körülményeinek leírását a Methods in Enzymology, VIII., kötet, 26 old, (1966) tartalmazza.

5) Tisztítás

Λ proteolitikus reakciókeverék felülúszó részéhez olyan kicsapószereket, mint a triklór-ecetsav vagy ammóniuin-szulfát adtunk, hogy kicsapjuk a proteinfrakciót. A fehérje-frakciót ezután a megfelelő nuklcázokkal kezeltük, hogy eltávolítsuk az olyan nukleinsav alkotórészeket, mint a DNS, RNS, vagy a fehérjéket a frakcióból. Az enzimes kezelések után az oldatot többször diali/.álluk.

Λ részlegesen tisztított fehérje-frakciót ezután további tisztítási eljárásoknak vetettük alá, mint például gélsztírcs és oszlopkromatografálás , így végül egy tiszta poliszacharid-frakciót, amelyet TRS-nek neveztünk el, kaptunk.

A TRS poliszacharid általánosságban a fiziko-kérniai tulajdonságainak megfelelően, igen sok izolációs és tisztítási eljárással állítható elő, például kiesapás-kioldas és extrakció, oldószer, extrakció, dialízis, oszlopkromatográfia, elektroforézis, gészűrés vagy ezek kombinációja segítségével. Ezért a találmányunkat nem korlátozzuk egyetlen specifikus módszerre sem.

A találmány szerinti eljárás rokonságban van más, poliszacharidokból felépülő, Streptococcus faihoz tartozó mikroorganizmusok segítségével előállítható hipotrigliceridémikusan aktív termékek előállításával, mivel a poliszacharid frakció hordozza a farmakológiai aktivitást. Ezt részletesen a példákban mutatjuk be.

A tápközeg felülúszó részének hipotrigliceridémiás aktivitása a baktérium sejtekben lévő anyagának egyötöde.

A TRS poliszacharid fizikémiai tulajdonságai

A találmány szerinti TRS poliszacharid fizikokémiai és fiziológiai tulajdonságai a következők:

1) Kémiai jellemzők és oldékonysági tulajdonságok

Az elporított minta, amelyet kisózás és fagyasztva szárítás után kaptunk, nem folyósodó fehér por volt, amely vízben igen jól, (~100 mg/ml) etanolban, metanolban és acetonban részletesen, míg éterben és kloroformban nem oldódott.

2) Mólsúly

A találmány szerinti TRS poliszacharid mólsúlyát 14 000 ± 3000-te becsültük több, különböző mólsúlyú dextránt használva, gélszűrés alapján Toyo-31 pearl HW 55 oszlopot (Toyosoda Co., Ltd.) használva, melyet 0,3 mól nátriumkloridot tartalmazó 25 millimólos Tris-HCl pufferral, (pH = 7,5), egyensúlyoztunk ki.

3) Specifikus forgatókép

A TRS poliszacharid specifikus forgatóképessége

1,8 súly/tf%-os oldatban [α]λ⁹ =+190,1 (dextrarotáció), melyet DIP-4 típusú (Japan Spectroscopic Co., Ltd) polariméterrel határoztuk meg.

4. Cukorösszetétel

a) A minta 4 g-ját 0,2 mólos trifluor-ecetsavval (TFA) kezeltük 100°C-on 7 órán keresztül, majd a következőképpen trimetil-szilileztük, a mintát 0,2 ml hexametil-diszilazánnal (20 tf%-os piridines oldat) és 0,02 ml trimetíl-klórszilánnal kevertünk össze, 15 percig kevertettük és 5 perc állás után gázkromatográfiásán meganalizáltuk a glükóz, ramnóz stb. tartalom meghatározása céljából. Az elválasztó kolonna hőmérséklete )79°C volt. Az uronsavat, stb. karbazol-kénsavas módszerrel [módosított Bitter-Muir módszer, Bittér, T., Muir, IL: Anal. Biochem. 4, 330 (1962)] határoztuk meg. A TRS poliszacharid cukorösszetétele a következő volt:

glükóz 70,3% ramnóz 13,7% uronsav 16,0%.

5) Sav-bázis sajátságok

A TRS poliszacharid 0,1 és 0,5%-os oldatának pH-ja 6,70 volt.

6) ÍR abszorpciós spektrum

A TRS poliszacharid ÍR abszorpciós spektrumát JASCO A-302 típusú (Japan Spectroscopic Co., Ltd.) IR spektrofotométerrel mértük meg. Az ÍR spektrumot az 1. ábra szemlélteti, melyen az abszcissza a hullámot, az ordináta a transzmissziót jelenti %-ban kifejezve.

7) Elemanalízis

Az elemanalízist Perkin-Elmer 240 B típusú elemanalizátorral végeztük. A C_Í1H₆₄O₃₈ képlet alapján végzett elemanalízis eredménye a következő volt:

C = 37,2%, H = 6,4%, 0 = 56,4%.

8) Olvadáspont

A TRS poliszacharid olvadáspontja 235-241°C volt, melyet Yanaco MP-3 (Yanagimoto Seisakusho, japán) olvadáspont mérő műszerrel mértünk meg.

9) Fiziológiai tulajdonságok

A TRS poliszacharid emlősállatok vérének trigliceridszintjére csökkentő hatással van orális adagolás esetén.

Ez az aktivitás 80—I15°C hőmérséklet — és 4,1 — 11 közötti pH-tartományban stabil a TRS poliszacharid tárolása esetén.

A TRS poliszaeharid farmakológiai tulajdonságai 1) Farmakológiai hatások

Mint azt az alábbi példák mutatják, a találmány szerinti TRS poliszacharidból felépülő atherosclerózis ellenes gyógyszer különlegesen hatékonyan csökkenti emlősök vértriglicerid-szintjét. Ennek megfelelően ez a gyógyszer az atherosclerosishoz, hiperlipidémiához, hiperlipoproteinémiához, xantomatoz.ishoz, kolecistolitiazishoz, magas vérnyomáshoz, cukorbetegséghez és egyéb betegségekhez, kapcsolódó betegségek terápiás vagy preventív gyógyszereként használható.

A találmány szerinti készítményt emlősökbe orálisan, intraperitoneálisan, intravénásán vagy egyéb módokon juttathatjuk. Alkalmanként 1 pg 0,5 g gyógyszert adhatunk testkilogramrnonként. Orális kezelés esetén 0,1 mg-100 mg/testsúly kg anyag adása előnyös. A találmány szerinti anyagot bármilyen formában használhatjuk, például fiziológiás sóoldatban vagy egyéb folyadékokban oldva, injekcióként, liofilizált porként, kúpként, külső bevonattal ellátott tablettaként, szublingualis tablettaként, granulátumként, tablettaként, kapszulaként stb. megfelelő vívőanyagokkal, hígító bázisokkal, oldószerekkel stb. együtt.

2) Akut toxicitás

Mint azt az alábbi példák mutatják, a találmány szerinti TRS poliszacharid LD₅₀ értéke nagyobb, mint 1200 rng/testúly kg intraperitoneálisan adagolva egerek esetén. Az anyag lényegében nem toxikus orális kezelés esetén.

A találmányt az alábbi példákkal illusztráljuk, anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk.

1. példa

A TRS poliszacharid előállítása és tisztítása

Streptococcus faecium (FERM BP-196) törzset 2 1 Rogosa tápközegre oldottuk úgy, hogy a mikroorganizmus végső koncentrációja 1 x 10’ baktérium sejt/ml volt. A beoltott közeget 37°C-on 10 órán keresztül keverés nélkül aerob körülmények között inkubáltuk, így 10⁹ baktérium sejt/ml koncentrációjú tápközeget kaptunk. A baktérium sejteket 12 000 fordulat/perc sebességű folyamatos centrifugálással gyűjtöttük össze, fiziológiás sóoldattal (0,85 s% nátrium-klorid) mostuk, és fiziológiás sóoldatban szuszpcndáltuk. így 100 ml, 2 x 10’⁰ baktérium sejt/ml koncentrációjú szuszpenziót nyertünk.

A fenti baktérium sejt szuszpenziót 115°C-on 10 percen keresztül hőkezeltük, és a zsírok eltávolítása céljából háromszor mostuk kloroform-metanol 2 : 1 térfogatarányú elegyével.

A zsírtalanított baktérium szuszpenziót 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percen keresztül centrifugáztuk, és az alsó, vagyis a kloroformos fázist félretettük. A vizes fázist használtuk a következő tisztítási lépések kiindulási anyagaként.

A kiindulási anyagot ezután 100 ml foszfát-pufferban (pH = 7,8) oldott 20 mg pronázzal (XIV. típusú szigma proteáz), [mely oldat 0,0015 mól kalcium-kJoridot is tartalmazott], kezeltük 47°C-on 24 órán keresztül, majd 10 mg további pronázzal kezeltük ugyanilyen körülmények között. A pronázcs kezelés kísérleti körülményeit a Methods in Enzymology (1966) Vili. kötetének 26. oldala írja le.

A pronázzal kezelt anyagot két fázisra választottuk szét 3000 fordulat/percen való 10 perces centrifugálással. A felülúszó frakcióhoz 1/9 térfogatrész 100 s/tf. %-os triklór-ecetsavat (TCA) adtunk, 3 órán keresztül 4 °C-on kevertettük és 3000 fordulat/ perc sebességgel 10 percen keresztül centrifugáztuk. így két fázist, egy felülúszó és egy csapadék frakciót kaptunk. A csapadék frakcióhoz vele megegyező térfogatú 10%-os TCA-t adtunk, és megismételtük az előző eljárást. A kapott csapadékot háromszor etil-éterrel mostuk, hogy eltávolítsuk a triklórecetsavat, 50 ml desztillált vízben mostuk, 1 n nát4

191.697 rium-hidroxid oldattal semlegesítettük, a triklórecetsav teljes eltávolítása érdekében dializáltuk, majd végül liofllizálással 345 mg szárazsúlyú felül- 5 úszó frakció végterméket nyertünk.

A kapott felülúszó frakciót a fenti pronázzal kezeltük és dializálás után 176 mg szárazsúlyú (mól súly > 35000) dializált frakciót nyertünk. A dializált frakciót I. sz. tisztított frakciónak nevezzük.

A fenti I. sz. tisztított frakciót Sephadex G-100 (Pharmacia) oszlopon kromatografáltuk, mely oszlopot 0,05 M trisz-sósav pufferrel egyensúlyoztunk ki.

Az 1. sz. tisztított frakció oszlopkromatogramját 1 ml/perc eluciós sebességnél a 2. ábra mutatja. Az abszcissza az eluciós térfogatot (ml), az ordináta az eluált anyag koncentrációját (jug/ml) mutatja. 124 ml anyag átáramlása után a frakciókat összegyűjtöttük és II. sz tisztított frakciónak neveztük el, melynek szárazsúlya 93,6 mg volt.

A 3. ábra a 11. sz. tisztított 0,3 M nátrium-kloridot tartalmazó frakció 25 millimólos trisz-sósav puf- 20 ferrel kiegyensúlyozott Toyopearl HW-55F oszlopon meghatározott kromatogramját mutatja. Az eluciós sebesség 1 ml/perc volt. A 3. ábrán az 1., 2. ill. 3. vonal a cukor, a protein és a nukleinsav eluciós profilját mutatja.

A 87,9 mg szárazsúlyú tisztított TRS poliszacharidot a 80-100 ml térfogatú frakciók összegyűjtésével nyertük.

A 4. ábra a 3. ábrával megegyező körülmények között felvett, a TRS poliszacharid oszlopkromatogramját mutatja.

S TRS poliszacharid fizikai-kémiai tulajdonságait a fentiekben ismertettük.

A 4. táblázat a Lowry módszerrel meghatározott protein, az orcinol módszerrel kapott RNS, a difenil-aminos módszerrel kapott DNS és a fenol-kénsavas módszerrel kapott cukor mennyiségét és kitermelését tartalmazza mindegyik eljárás esetén. A táblázatban az értékek száraz súlyokat (mg) ill. súly %-ot jelentenek.

3. táblázat

Frakciók	Kitermelés	Protein
Felülúszó		Γ4~Γ“~
I. sz. tisztított frakció	176	2,8
II. sz. tisztított frakció	93,6	2,1
TRS poliszacharid -	87,9	nyomokban

A 3. táblázatban jelzett specifikus aktivitás az egyes frakciók triglicerid-szint csökkentő relatív aktivitását mutatják közönséges patkányok egységsúlyára számítva, ha a hőkezelt baktériumsejtek triglicerid-szint csökkentő hatását 1-nek tekintjük. A hipotrigliceriális aktivitás meghatározására alkalmazott kísérleti módszereket a 2. példában ismertetjük.

2. példa

A TRS poliszacharid farmakoiógiai hatása 1) Hipotrigliceridémiás aktivitás (1) mg/testsúly kg-nyi mennyiségnek megfelelő liofilizált TRS poliszacharidot tartalmazó fiziológiás sóoldatos mintákat készítettünk. Ezekből a mintákból közönséges patkányoknak (18 hónapos hím, átlagos testsúly 246 g, mindegyik csoportban 10 patkány) és közönséges és sterilizált egereknek (18 hónapos hím, átlagos testsúly 30 g, 10 egér minden csoportban) naponta 1 ml-t adtunk orálisan. Az egereket és patkányokat 8—12 hétig tartottuk megfigyelés alatt. Ezután ezeknek az állatoknak az artériás vérét az abdominális aortából lecsapoltuk és a szérum mintákat centrifugálással választottuk el a teljes vérből. A triglicerid-szintet Trygliceride TG WAKO (Wako Junyake Co., Ltd.j-val, acetil-acetonos módszerrel határoztuk meg.

Az eredményeket a 4. táblázat összegezi. A táblázatban felsorolt értékek a kezelt csoportok vérének a triglicerid-szintjének a kontroll csoport, amely nem kapott TRS poliszacharidot, vérének triglicerid szintjéhez viszonyított csökkenését (%) jelzik. A tetszés szerinti mennyiségben adott élelem százalékos összetételét az 5. táblázat mutatja.

au

RNS DNS Cukor Specifikus aktivitás

1,8 nyomokban	' ”75^	~77T
1,6 nyomokban	95,6	10,2
0,9 nyomokban	97,0	12,3
nyomokban nyomokban	100	23,0
4.1	úblázat
Állat Közönséges patkány		Csökkenési arány (%)
(12 hetes kezelés) Közönséges egér		40,5
(8 hetes kezelés) Sterilizált egér		45,1
(8 hetes kezelés)		39,6
5.1	áblázat
összetétel		Súly %
Kazein		20
Szójaolaj		10
Búzakeményítő		61
Ásványi anyagok		4
Vitamin keverék		2
Porított szűrőpapír		3
2) Hipotrigliceridémiás aktivitás (2)

A fent említett mintákat naponta 1 ml-es dózisban adagoltuk közönséges patkányoknak (18 hetes, átlagos testsúly 238 g, minden csoportban 15 patkány) és közönséges és sterilizált egereknek (18 hetes, hím, átlagos testsúly 31 g, 10 egér minden csoportban) 12 héten keresztül. A vértrigliceridet a fentiekben említett módszer szerint határoztuk meg. Az eredményeket a ή, táblázat tartalmazza.

4, „koleszterinnel terhelt és a „fruktózzal terhelt kifejezés a táblázatban azt jelenti, hogy a fenti táplálékhoz 1% koleszterint adtunk, illetve a búzakeményítőt teljes egészében fruktózzal helyettesítettük. A táblázatban található értékek a nem kezelt csoporthoz viszonyított koleszterin-szint csökkenést jelentik %-ban kifejezve.

191.697

6. táblázat

Állatok	Csökkentett
	szint (%)
Sterilizált egerek *	45,4
Közönséges egerek *	41,6
Közönséges patkányok*	43,2
Közönséges patkányok**	42,0

•Koleszterinnel terhelt étrend **Fiuktózzal terhelt étrend

3) Hipotrigliceridémiás aktivitás (3) mg,'ml TRS poliszacharidot tartalmazó fiziológiás sóoldat minta 1 mi ét adtuk naponta 2 héten keresztül hiperlipidémiás patkányoknak (18 hetes hím, átlagos testsúly 250 g, 5 patkány minden csoportban), melyeket „koleszterinnel terhelt” eledellel etettünk. A vér trigliceridszintjét a fent említett módszer szerint határoztuk meg. Az eredményeket a 7. táblázat tartalmazza. A táblázatban található értékek a nem kezelt csoporthoz viszonyított triglicerid-szint csökkenést jelentik százalékban kifejezve.

Állat

7. táblázat

Csökkenési arány ('') 45,0 0

Kezelt Kontroll

4) Dózisválasz

Fiziológiás sóoldatban 0,1 mg 20 mg/ml TRS poliszacharidot oldottunk, és ennek 1 mi ével kezeltük naponta a kísérleti közönséges patkányokat, (6 hetes hím, átlagos testsúly 216 g, 5 patkány egy csoportban) 4 héten keresztül. A vér trigliceridszintjét a fentiekben ismertetett módszerrel határoztuk meg (a kontroll csoportoknak nem adtunk TRS poliszacharidot). Az eredményeket a 8. táblázat mutatja.

8. táblázat

Dózis (mg/patkány)

Kontroll

0,1

5) Akut toxicitás

1, 10 és 100 mg TRS poliszacharidot tartalmazó fiziológiás sóoldat mintákkal (0,5 nd/egér) intraperitoneálisan kezeltünk 1CR egereket (6 hetes hím, átlagos testsúly 31,4 + 0,6 g, 10 egér minden csoportban). Az egerek thanatobiológíás megfigyelését 14 napon keresztül folytattuk. A kontroll anyag fiziológiás sóoldat volt.

Az Ll)₅„ értéket a Behrens-Karber módszerrel [Arch. Exp. Path. Pharmakologie, 117. kötet, 379388 (1935)] határoztuk meg, és ez több volt, mint 1 200 nig/teslsúly kg.

Az anyag orális kezelés esetén lényegében nem volt toxikus.

6) Gyógy szer készít menyek

I) 25 mg tisztított TRS poliszacharidot 275 mg liszt ított keményítőporral homogenizáltunk, ezután orális kezelésre alkalmas tablettákat formáztunk belőlük. Ez a tabletta megtelel 1ϋ^1ΓΙ hökezelt sejt/test50 súly kg nagyságú dózissal való kezelésnek (50 kg-os felnőtt).

2) A TRS poliszaeharid egységesen összekeverhető hígító bázisokkal, mint például a kalcium-karbonát, laktóz, stb., sikosítóanyagokkal, mint sztearinsav, talkum, stb. és más adalékanyagokkal, és tabletták készíthetők orális kezelés céljára. A TRS poliszacharid napi dózisa általában 0,1 -100 mg/testsúly kg.

3) 900 mg TRS poliszacharidot 30 ml desztillált vízben szuszpendáltuuk és oldottunk, megédesítettük, és szirupot készítettünk belőle.

Claims

I. Eljárás új. az emlősök vérének trigliceridszintjél csökkentő poliszachatid, mely a következő tulajdonságokkal rendelkezik

a) specifikus forgatóképesség:

= * 190,1 g (1,8 tomeg/tf%-os oldatban),

b) mólsúly gélszűrés alapján:

14 000+ 3000, cl cukorössz.elétel (törneg% gázkromatográfiás analízis alapján), glükóz 70,3 ramnóz 13,7 uronsav 16,0, d l sav bázis jellemzők: semleges poliszaeharidok előállítására, azzal jellemezve, hogy a Streptococcus nemzetséghez tartozó S. faeeium, S. faecalis, S. aviunt, S. bovis.

S. salivarius, S. durans, S. notis, S. equinus mikroorganizmusok legalább egyike megfelelő tápközegben tenyésztjük, majd a vér triglicerid-s/intjét csökkentő aktív poliszacharidot kinyerjük a tenyésztett sejtekből és/vagy a tápközeg felúlúszó részéből.

35 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal j e 1 1 e- Csökkenési m c z. v e, hogy mikroorganizmusok mikroorganizmusként az alábbi közül legalább egyet alkal- arány (átlagos 7) 0 10,0 mázunk: S. faeeium FERM BP-296, 40 S. faecalis FERM BP-297, S. aviunt FERM BP-298, 17,4 S. salivarius FERM BP-299, 43,0 S. durans FERM BP 300, 48,2 S. mitis FERM BP-301, S. equinus FERM BP-302.

6C

3. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a vér trigliceridsziiitjét csökkentő poliszacharidot a közegből úgy nyerjük ki, hogy szétroncsoljuk az összegyűjtött baktériumsejteket és elválasztjuk belőle a poliszaeharid frakciót.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a tápközeg felülúszó részét összegyűjtjük, és a poliszacharid-fiakciót ebből kinyerjük.
5. Eljárás a vér trigliecrid-szintjét csökkentő vagy atheroselerosis ellenes gyógyszerkészítmény előállítására, azzal j e 1 1 e ni ez v e, hogy 1-4. igénypontok bármelyike szerint előállított poliszacharidot legalább egy gyógyászatilag alkalmas iner', szilárd vagy folyékony hordozóval és/vagy segédanyaggal összekeverjük és gyógyászati készítménnyé alakítjuk.