SU1636739A1

SU1636739A1 - Device for fluorescent medium investigation

Info

Publication number: SU1636739A1
Application number: SU894679615A
Authority: SU
Inventors: Сергей Викторович Нечаев; Андрей Анатольевич Левкович; Михаил Георгиевич Солоненко; Елена Владимировна Багнюк
Original assignee: Институт физики АН БССР
Priority date: 1989-04-18
Filing date: 1989-04-18
Publication date: 1991-03-23

Abstract

Изобретение относитс к измерени м излучений флуоресцирующих сред, возбужденных лазером, и может быть использовано дл ДНК-сиквёнса. Цель изобретени - увеличение чувствительности анализа. Устройство содержит лазер 1, поворотную призму 2, селективное зеркало с отверстием 3, двух- линзовый объектив 4 со срезом 7 на дво ковыпуклой линзе объектива, пространственный фильтр 5, оптически св занные между собой. 1 ил.This invention relates to the measurement of radiation of fluorescent media excited by a laser, and can be used for DNA sequencing. The purpose of the invention is to increase the sensitivity of the analysis. The device comprises a laser 1, a turning prism 2, a selective mirror with an aperture 3, a two-lens objective 4 with a slice 7 for a two-convex objective lens, a spatial filter 5, optically interconnected. 1 il.

Description

Изобретение относится к измерению слабых потоков флуоресценции, возбуждаемой лазерным излучением в флуоресцирующих средах, и может быть ис- $ пользовано для детектирования нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК в полиакриламидном геле.The invention relates to measuring weak fluorescence fluxes excited by laser radiation in fluorescent media, and can be used to detect the nucleotide sequence of DNA fragments in a polyacrylamide gel.

Цель изобретения - повышение чувствительности измерения флуоресценции j о за. счет эффективного снижения уровня фона и увеличения объема возбуждаемог го вещества.The purpose of the invention is to increase the sensitivity of the measurement of fluorescence j about. due to an effective decrease in the background level and an increase in the volume of the excited substance.

На чертеже представлена оптическая схема предлагаемого устройства. 1$ Устройство содержит лазер 1, поворотную призму 2, поворотное селективное зеркало 3 с отверстием, двухлинзовый объектив 4, пространственный фильтр 5, исследуемую среду б, плос- 20 кий срез 7 на одной из сторон двояковыпуклой линзы объектива.The drawing shows an optical diagram of the proposed device. $ 1 The device contains a laser 1, a rotary prism 2, a rotary selective mirror 3 with an aperture, a two-lens lens 4, a spatial filter 5, a test medium b, a flat slice 7 on one side of a biconvex lens.

Лазер 1 предназначен для генерации лазерного излучения. Призма предназначена для поворота луча лазера 1 25 под углом 90°. Поворотное селективное зеркало 3 с отверстием предназначено для пропускания луча лазера че- . рез отверстие, направления излучения флуоресценции на фотоприемник зд (не показан). Двухлинзовый объектив 4 предназначен для фокусировки лазерного луча, а также для сбора излучения флуоресценции и направления его параллельным пучком на селективное поворотное зеркало 3. Объектив 4 имеет две линзы. Одна из них является двояковыпуклой и имеет на одной из сторон плоский срез, расположенный на пути луча лазера, что приводит к ₄θ смещению его точки фокусировки.Laser 1 is designed to generate laser radiation. The prism is designed to turn the laser beam 1 25 at an angle of 90 °. Swivel selective mirror 3 with a hole is designed to transmit a laser beam through. cut hole, the direction of fluorescence radiation at the photodetector rear (not shown). A dual lens lens 4 is intended for focusing a laser beam, as well as for collecting fluorescence radiation and directing it in parallel beam to a selective rotary mirror 3. Lens 4 has two lenses. One of them is biconvex and has a flat cut on one side located on the path of the laser beam, which leads to a ₄ θ shift of its focus point.

В предлагаемом устройстве срез выполнен на стороне, обращенной к мениску. Вторая линза выполнена в виде мениска, вогнутая сторона которого обращена к исследуемой среде.In the proposed device, the slice is made on the side facing the meniscus. The second lens is made in the form of a meniscus, the concave side of which is facing the test medium.

Пространственный фильтр 5 предназначен для поглощения любых лучей, идущих непараллельно оптической оси устройства между объективом 4 и поворотным селективным зеркалом. Он представляет собой набор тонкостенных концентрических цилиндров, поверхность которых имеет коэффициент поглощения, близкий к единице. Он .может быть выполнен, например, из фольги. Внутренний цилиндр являет- · ся каналом для луча лазера и имеет протяженность от отверстия в селективном поворотном зеркале до объектива 4. Остальные цилиндры имеют протяженность от объектива 4 до ближайшего к нему поворотного селективного зеркала 3 и не препятствует излучению, отражаемому от поворотного селективного зеркала 3. Количество цилиндров подбирает; ся под конкретный объектив экспериментально и может быть от 5 до 10 в зависимости от конкретного объектива.The spatial filter 5 is designed to absorb any rays traveling non-parallel to the optical axis of the device between the lens 4 and a rotary selective mirror. It is a set of thin-walled concentric cylinders, the surface of which has an absorption coefficient close to unity. It can be made, for example, of foil. The inner cylinder is a channel for the laser beam and has a length from the hole in the selective rotary mirror to the lens 4. The remaining cylinders have a length from the lens 4 to the nearest rotary selective mirror 3 and does not interfere with the radiation reflected from the rotary selective mirror 3. The number of cylinders picks up; It is experimental for a specific lens and can be from 5 to 10 depending on the specific lens.

Устройство работает следующим образом.The device operates as follows.

Луч лазера поворачивается призмой 2, проходит через отверстие в поворотном селективном зеркале, каналируется внутренним цилиндром пространственного фильтра 5 и попадает на двухлинзовый объектив 4, проходит его в месте среза 7 на собирающей линзе объектива 4, фокусируется в точку. За счет наличия среза данный объек-. тив имеет два фокусных расстояния:The laser beam is rotated by a prism 2, passes through an opening in a rotary selective mirror, is channeled by the inner cylinder of the spatial filter 5, and enters a two-lens lens 4, passes through it at the cut-off point 7 on the collecting lens of lens 4, and is focused to a point. Due to the presence of a cut, this object is. A tiv has two focal lengths:

” для сбора флуоресценции, для фокусировки лазерного луча. Исследуемая среда 7 помещена в главной фокальной плоскости f <, лазерный луч фокусируется за исследуемой средой 6.”To collect fluorescence, to focus the laser beam. The studied medium 7 is placed in the main focal plane f <, the laser beam is focused behind the studied medium 6.

'Излучение флуоресценции собирается объективом 4 в пучок параллельных лучей, которые проходят сквозь пространственный фильтр 5, попадают на непрозрачное для длин волн флуоресценции поворотное зеркало 3 и далее направляются на фотоприемник.'The fluorescence radiation is collected by the lens 4 into a beam of parallel rays that pass through the spatial filter 5, are incident on the rotary mirror 3, which is opaque to the fluorescence wavelengths, and then sent to the photodetector.

Конструкция объектива позволяет получить оптимальные параметры лазерного пучка для детектирования нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК и других объектов в полиакриламидном геле. Размеры лазерного пучка выбираются исходя из следующих соображений: максимальный диаметр лазерного пучка не должен превышать 0,2 мм, чтобы достигалось необходимое пространственное разрешение, минимальный диаметр ограничен тем, что высокая плотность мощности приводит к фотодеструкции исследуемой среды и снижению величины регистрируемого сигнала, поэтому необходима большая площадь лазерного пучка для возбуждения наибольшего количества вещества. Оптимальным можно принять диаметр пучка равный 0,1-0,2 мм, при котором достигается высокая чувствительность изме5.. 1636739 6 рений, что и имеет место в объекти- зуют гелий-кадмиевый лазер мощве данной конструкции. ностыо 25 мВт с длиной волны 441 нм.The design of the lens allows you to obtain the optimal parameters of the laser beam for detecting the nucleotide sequence of DNA fragments and other objects in a polyacrylamide gel. The dimensions of the laser beam are selected on the basis of the following considerations: the maximum diameter of the laser beam must not exceed 0.2 mm in order to achieve the required spatial resolution, the minimum diameter is limited by the fact that a high power density leads to photodestruction of the medium under study and a decrease in the value of the recorded signal, therefore, a large laser beam area to excite the largest amount of substance. The beam diameter equal to 0.1–0.2 mm can be taken as optimal, at which a high sensitivity of measurements is achieved. .. 1636739 6 rhenium, which takes place in a helium-cadmium laser power of this design. nostyo 25 mW with a wavelength of 441 nm.

Двухлинзовый объектив позволяет повысить чувствительность и за счет больного (до 90°) угла сбора флуоресценции. Объектив может быть выполнен и многолинзовым.A two-lens lens makes it possible to increase the sensitivity of the fluorescence collection angle due to the patient (up to 90 °). The lens can be made and multi-lens.

Применение пространственного фильтра позволяет отрезать отраженный и рассеянный лазерный свет. Лазерные лучи, проходящие непараллельно оптической оси, поглощаются фильтром и не попадают в фотоприемник. Это значительно снижает уровень фона, что приводит к увеличению соотношения сигнал/шум и повышает чувствительность устройства.The use of a spatial filter allows you to cut off the reflected and scattered laser light. Laser beams traveling non-parallel to the optical axis are absorbed by the filter and do not enter the photodetector. This significantly reduces the background level, which leads to an increase in the signal-to-noise ratio and increases the sensitivity of the device.

Применение селективного поворотного зеркала позволяет выделить из со- 20 бираемого объективом света только излучение флуоресценции, что также снижает уровень фона, повышает чувствительность устройства.The use of a selective swivel mirror makes it possible to distinguish only fluorescence radiation from 20 light collected by the lens, which also reduces the background level and increases the sensitivity of the device.

Пример. Используют двухлинзо- 25 вый объектив, специально рассчитанный для работы с веществом, находящимся между стеклами толщиной 4 мм, • и исправленный на хроматические абберации. Фокусное расстояние для сбора флуоресценции £( =14 мм,для фокусировки лазера = 20 мм. Угол сбора флуоресценции 90 °. Наличие фокуса fg. обеспечивают срезом на внутренней стороне двояковыпуклой линзы объектива, диаметр среза равняется двум миллиметрам. В трчке сбора люминесценций диаметр лазерного луча равен 0,17 мм.Example. A two-lens 25 lens is used, specially designed for working with a substance located between glasses 4 mm thick, and corrected for chromatic aberration. The focal length for collecting fluorescence £ (= 14 mm, for laser focusing = 20 mm. The angle of collection of fluorescence is 90 °. Focus fg. Provide a cut on the inside of the biconvex objective lens, the cut diameter is two millimeters. In the luminescence collection beam, the diameter of the laser beam equal to 0.17 mm.

Пространственный фильтр обеспечивает каналирование лазерного луча в тонкослойный диаметр с внутренним диаметром 2 мм, который установлен одним торцом к отверстию в поворотном зеркале, другим - вплотную к линзе объектива. Остальные цилиндры имеют одинаковую высоту 30 мм и различаются диаметром на 4 мм.The spatial filter provides channeling of the laser beam into a thin-layer diameter with an inner diameter of 2 mm, which is installed at one end to the hole in the swivel mirror and the other close to the lens of the lens. The remaining cylinders have the same height of 30 mm and differ in diameter by 4 mm.

Селективное зеркало имеет отражение 99,7% для диапазона длин волн 520-560 нм под углом 45°. ИспольВ качестве флуоресцирующей метки при электрофорезе фрагментов ДНК используют флуоресциин - изотиоционат При этом была достигнута пороговая чувствительность 5 · 10^пмоль в пробе при соотношении сигнал/шум равном 2.The selective mirror has a reflection of 99.7% for the wavelength range of 520-560 nm at an angle of 45 °. Use As a fluorescent label for electrophoresis of DNA fragments, fluorescein - isothiocyanate is used. In this case, a threshold sensitivity of 5 · 10 ^p mol in the sample was achieved with a signal-to-noise ratio of 2.

Преимуществом изобретения является увеличение чувствительности в 10 раз за счет того, что конструктивные особенности устройства позвох ляют снизить фон, поднять соотношение сигнал/шум, а также увеличить объем возбуждаемого вещества.'An advantage of the invention is an increase in sensitivity by a factor of 10 due to the fact that the design features of the device make it possible to reduce the background, increase the signal-to-noise ratio, and also increase the volume of the excited substance. '

Claims

Claim

A device for analyzing fluorescent media containing optically <·. connected laser, rotary prism, * a rotary mirror with holes in the center and a lens located on the optical axis of the device, characterized in that, in order to increase sensitivity, the device is additionally equipped with a spatial filter made in the form of a set of thin-walled concentric cylinders coaxial with the optical axis , with the absorption coefficient of the surface close to unity, and located between the rotary mirror and the lens, and the rotary mirror is made selective for wavelengths of radiation Oscillations, and the lens is double-lensed, one of the lenses is biconvex and has a slice on one side located on the optical axis and perpendicular to it, the diameter of the slice corresponds to the width of the laser beam, and the second lens is made in the form of a meniscus and the concave side faces the test medium while the focus of the lens f <is the investigated medium, f ₂ is the focus of the lens for the laser beam and is located behind the investigated medium.