SU1600633A3 - Способ очистки белкового токсина бактерий ВоRDетеLLа реRтUSSIS - Google Patents
Способ очистки белкового токсина бактерий ВоRDетеLLа реRтUSSIS Download PDFInfo
- Publication number
- SU1600633A3 SU1600633A3 SU874202442A SU4202442A SU1600633A3 SU 1600633 A3 SU1600633 A3 SU 1600633A3 SU 874202442 A SU874202442 A SU 874202442A SU 4202442 A SU4202442 A SU 4202442A SU 1600633 A3 SU1600633 A3 SU 1600633A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- bacteria
- toxin
- pertussis
- buffer
- gel
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 231100000654 protein toxin Toxicity 0.000 title claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title abstract description 5
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 title description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims abstract description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 claims 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 abstract description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 abstract description 7
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 abstract description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 3
- 108050005077 Haptoglobin Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000014702 Haptoglobin Human genes 0.000 abstract description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract description 2
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract 1
- 229940052491 bordetella pertussis Drugs 0.000 abstract 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 abstract 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 abstract 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 21
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 9
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 description 9
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010044715 asialofetuin Proteins 0.000 description 6
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100034114 DnaJ homolog subfamily C member 14 Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101000870166 Homo sapiens DnaJ homolog subfamily C member 14 Proteins 0.000 description 1
- 206010025280 Lymphocytosis Diseases 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Polymers With Sulfur, Phosphorus Or Metals In The Main Chain (AREA)
Abstract
Изобретение относитс к технической биохимии, в частности к препаративному выделению белковых антигенов бактерий рода Bordetella pertus- sis, и может быть использовано в г-ккробиологии, медицине и иммунологии . Целью изобретени вл етс уве- лз-1чение емкости аффинных сорбентов с одновременным повьппением степени чистоты Еыдап емых антигенов. Сначала провод т м гкий гидролиз фату- нка или гаптоглобина с получением дес аттлрованньгх производных, которые фиксируют на водонерастворимом носителе (органическом или неорганическом ) . Культуральную жидкость бактерий Eordetella pertussis сорбируют на a.-jKbHHHOM сорбенте при рН 6-8, а десорбцию осуществл ют либо буфер- раствором, содержащим хлористый натрий, либо хаотропными агентами, либо карбонатным буфером с рН ,8,3- 1 5 6 .. i ч . п. ф-лы. (П
Description
Изобретение относитс к технической биохимии и биотехнологии, в частности к препаративному выделению белкового токсина бактерий Borrletella .pertussis, и может быть использовано в микробиологии, медицине и иммунологии .
Целью изобретени вл етс повышение эффективности процесса и степени чистоты выдел емого токсина.
Способ осуществл ют следующим образом .
Сначала провод т м гкий гидролиз фетуина или гаптоглобина с получением десиалированных производных. Эти производные затем фиксируют на водонерастворимом носителе (органическом или неорганическом) с получением аффинных сорбентов. Эти сорбенты используют дл очистки белковых антигенов бактерий Bordetella pertussis .
При осуществлении способа отдел ют токсин pertussis, который фиксируетс на аффинном носителе, тогда как F-HA остаетс в растворе, затем элю- ируют токсин pertussis с помотью соответству ошего элюирующего средства .
Также используют данный способ дл очистк.ч обогащенной F-HA-фрак- ции, чтобы удалить токсин pertussis, который она может содержать, причем этот последний удерживаетс афсЬин
05
оо со
см
to
мым носителем. Отделив полученный иоситепь после введени в контакт с ..материалом хроматографии раствора, получают очищенный F-HA-pacTBOp.
Исходным очищаемым раствором может быть надосадочна зсидкость культуры бактерий рода Bordetella или частично очищенный раствор токсина pertussis или F-HA.
Дл очистки токсина pertussis на аффинном носителе адсорбционной хро- Иатографией используют исходный раствор, рН которого доведено до значени 6-8, предпочтительно 7. Количество используемого носител адсорбционной хроматографии зависит от начального объема надосадочной жидкости и/или от концентрации токсина pertussis в культуральпой среде 20 или во фракции, используемой в качестве исходного продукта. Контакт осуществл етс в ванне или в колонке
1600633
ра, содержащего 1 мг/мл асиалофету- ина, 0,1 М NaHOO и 0,5 М NaCl.
Смесь оставл ют реагировать при в течение ночи при м гком перемешивании . К смеси добавл ют 125 мл 5М раствора этаноламина, рН 8,0. После , инкубации при комнатной температуре в течение 4 ч гель последовательно промывают 500 мл 0,1 М буфера на основе ацетата натри , рН 4,0, содержащего Ш NaCL, затем 500 мл 50 t трис-НС1-буфера, рН 7,5, содержащего Ш NaCl. Этот цикл промывки повтор ют три раза.
Гель затем промывают 3 раза по 500 мл 50 мМ трис-НС1-буфера, рН7,5, в присутствии консерванта, такого как мертиол т, с концентрацией 1/10000 (об.ч.).
Гель Сефарозы - АЕ, соединенный с асиалофетуином, хран т при в буфере, таком как 50 мМ трис-НС1-бу- фер, рН 7,5, в присутствии консерван15
при 2-30°С.
Дп элюировани токсина pertussis, 25 та, например мертиол та. фиксированного на аффинном носителе Используемый в качестве лиганда в можно использовать, например, буфер- ннй раствор, содержащий в достаточной концентрации соли и/или классические
30
хаотропные агенты, например хлорид кагни или карбонатный буфер, имеющий мол рность более 25 мМ и рН пор дка 8,3-11,6.
адсорбционной хроматографии асиало- фетуин получают следуюгшм образом. Водный раствор фетуина (фетуин типа III, Сигма) гидролизуют с помощью 0,05 н. «2504 в течение 1 ч - при . После гидролиза раствор диешизуют несколькими объемами дистиллированной воды в течение 24 ч при + , чтобы удалить свободные сиаловые кислоты. Раствор асиалофе- туина может быть концентрирован путем ультрафильтрации с помошью мембран , порог разделени которых равен 10000.
Способ иллюстируетс следующими примерами.
Пример 1. Очистка токсина pertussis путем адсорбционной хроматографии на сефарозе 4В-асиапофетуине . ,40
а). Адсорбци токсина pertussis
на геле.
Обогащенную токсином pertussis фракцию, полученную после центрифугировани и концентрировани бакте- 45 риальной суспензии Bordetella pertussis (I фаза), культивированной в ферментере на 30 л, пропускают через хроматографическую колонку диаметром 4 см, содержащую 12П мл носите- о
л Сефароза-4В, соединенного с асиалофетуином , с расходом 6 мп/см /ч. Сефарозу-4В соедин ют с асиалофетуином следующим образом. 30 г активированной ССТ.г сефарозы 4В (Phar- macia) подвергают набуханию в 6 л мМ НС1 в течение около 15 мин. Гель затем промывают .3 раза по 6 л 1 мК НС1. К гелю Добавл ют 400 мл раствота , например мертиол та. Используемый в качестве лиганда в
адсорбционной хроматографии асиало- фетуин получают следуюгшм образом. Водный раствор фетуина (фетуин типа III, Сигма) гидролизуют с помощью 0,05 н. «2504 в течение 1 ч - при . После гидролиза раствор диешизуют несколькими объемами дистиллированной воды в течение 24 ч при + , чтобы удалить свободные сиаловые кислоты. Раствор асиалофе- туина может быть концентрирован путем ультрафильтрации с помошью мембран , порог разделени которых равен 10000.
Удаление сиаловых кислот контролируетс специфическим колориметрическим определением сиаловых кислот белковой фракции до и после гидролиза .
б). Элюирование токсина.
Гель промывают двум объемами колонки 50 мМ трис-НС1-буфера, ,5 т.е. вплоть до полного исчезновени УФ-поглошени при 278 им, затем одним объемом колонки 50 мМ трис-НС1- буфера, рН 7,5, содержащего 1 М NaCl Токсин pertussis элюируют 400 мл 100 мМ карбонатного буфера, рН 9,6.
Измер ют оптическую плотность и гемагглютинатную активность фракций coбиpae ыx на выходе из колонны.
Содержапше действующее начало фракции, т.е. обладающие.сильной ге
магглютинатной, не ингибируемой холе- стеролом активностью, объедин ют,
Токсин pertussis затем осаждают на сульфате аммони с конечной концентрацией , соответствующей 70%-ному насыщению,
Таким образом, очищенный токсин pertussis вызывает сильный лимфоцитов и ел:ает восприимчивыми (сенсибилизирует ) мышей CFW к гиста- мину в дозе 0,04 мкг/мышь. Способность токсина pertussis к образованию кластеров на клетках СНО характеризуетс удельной активностью пор дка 65000-260000, CPU/мкг.
Результаты физико-химических анализов и биологических активностей (колориметрически определ ют возможное содержание загр знений, ДНК, ДНК сахараJ определ ют содержание эндотоксина , проведение электрофореза в среде SDS или в кислой среде и т.д.) подтверждают гомогенность готового препарата, включающего очищенное дей- ствующее начало.
Анализы на содержание токсина pertussis в начальной культуральной над- осадочной жидкости и в конечном осадке показывают выход после очистки выше 90%.
Пример 2. Очистка токсина pertussis путем адсорбированной хро- матогр афии на сферосил-ОЕАЕ-декстран- асиалофетуине.
а). Адсорбци токсина на геле адсорбционной хроматографии.
рН фракции, полученной после центрифугировани и концентрировани су с- пензии Bordetella pertussis (фаза 1)
довод т до 7 путем добавлени 5 н. раствора сол ной кислоты. Фракцию пропускают через колонку диаметром 2 см, содержащую 60 мл носител Сфе- росил-ВЕАЕ-декстран, соединенного с асиалофетуином, с расходом 60 мп/см /ч.
Сферосил-ВЕАЕ-декстран (носитель, образованный шариками диоксида кремни ХОС 005, покрытыми минимумом сшитого DEAE-декстрана) соедин ют с асиалофетуином следуюпим образом.
Сферосил-ВЕАЕ-декстран подвергают осторожному окислению, чтобы получить альдегидные функции, способные реагировать с а1иногруппами лиганда. Асиалофетуин в виде раствора с концентрацией 4 мг/мл в ЮмМ фосфатном буфере, рН 8,0,ввод т в
контакт с гелем в течение 15 ч при комнатной температуре. Гбль затем промывают следующими растворами: 10 Ш фосфатный буфер, рН 8,0, 20 г/л гликоколь, 0,17 мМ NaCl , 0,05 М цитрат натри , рН 2,8, i н. HCi;
О
б). Элюирование токсина pertus10
5
0
5
0
5
sis.
Гель промывают 120 мл 50 мМ трис- -НС1-буфера, рН 7,5, затем 70 мл 50 мМ трис НС1-буфера, содержащего 1М NaCl. Токсин pertussis злюи- 15 руют 50 мМ трис-НС1-буфером, рН 7,5, содержащим 4М MgCl. Измер ют оптическую плотность при 288 нм и гемаг- глютинантную активность собранных на выходе из колонки фракций. Содержаще 20 действующее начало фракции, т.е. обладающие повышенной гемагглютинант- ной активностью, не ингибируемой хо- лестеролом, объедин ют.
Полученную смесь обессоливают путем фильтрации через гель в колонне с Сефадексом С-25 { 7,5 i 45 см, Pharmacia ) , уравновешенным с буфером 50 мМ трис-НС1, рН 7,5. Элюирование осуществл ют с .помощью того же самого буфера.
Измер ют оптическую плотность при 278 нм и гемагглютинантную активность фракций, собранных на выходе из колонки . Содержащие токсин pertussis фракции, т.е. обладающие повышенной гемагглютинантной активностью, объ- .един ют.
Действуютее начало осаждают на сульфате аммони путем медленного добавлени при перемепивании Д7 r{NFg) ЗОд на 100 мл раствора. Анализ биологических и физико-химических свойств показывает, что полученный продукт представл ет собой высокоочитенное действующее начало.
Пример 3. Удаление следов токсина pertussis из обогащенной F-HA-фракции.
Способы очистки F-HA включают стадию десорбции F-HA из хроматографи- ческого носител , например оксиапати- та, с помощью 100 фосфатного буфера , рН 7,0, содержащего 0,5 М NaCl.
Измер ют оптическую плотность при 278 нм и гемагглютинантную активность фракций, собираемых на выходе из колонки с оксиапатитом. Фракции, содержащие F-HAj т.е. обладающие по- вьш1енной гемагглютинантной активно0
5
стью и ингибируекые {слестероломз объедин ют,
С целью удалени возможно кмек1- щихс следов токсина pertussis смесь фракций, содержащих F-fIA, пропускают через колонку с сефароза 4В-асиало- фетуином. F-HA элюируют непосредственно , тогда как возможные следа: токсина удерживаютс к колонке
F-HA затем осаждают сульфатом аммони путем добавлегл-ш медленно и при перемешивании 47 г (Шд)304 на 100 мл раствора.
Таким образом, очиа енный F-HA не вызывает ни лимфоцитоза, нн восприимивости к гистамину в дозе 100 мкг/Мз1шь. ри концентради 100. . F-HA е вызывает мо;сифик.ации в. клеточом слое, образованном клетками ичника хом ка, т.е. отсутствует образование клеточных скоплений (кластеров ) , характерных дл наличи токсина {pertussis. Его удельна гемаг- глютинантна активность, измеренна на эритроцитах гусей, пор дка 250000- 500000 ед, НА/мг щ)отеи:на. Эта активность полностью ингибируетс холе- стеролом.
Пример 4. Сравнительное изучение способности токсина pertussis на носител х адсорбционной хроматографии на основе фетуина и асиалофетуина.
Гель дл адсорбционной хроматогра- 4ми получают путем иммобилизации аси- алофетуина на активированной CNBt (Pharmacia) сефарозе-4В согласно способу , описанному в примере 1 ,
5
0
Параллельно аналогичным образом получают гель дл адсорбционной хроматографии с фетуином, .
Фиксацию фетуина и фиксацию асиалофетуина осуществл ют в идентичных экспериментальных услови х дл получени на гел х плотностей сравниваемых лигандов.
Каждый эксперимент реализуют параллельно на двух типах носителей, ввод т их в контакт с одним и тем же объемом культуральной надосадочной жидкости, содержащей токсин pertussis. Элюирйванное количество токсина pertussis определ ют по анализу протеина и иммуноферментативным методом (ELISA).
Провод т сравнительное изучение пригодности шэлуче11; ых гелей. Относительна емкость гел , содержащего фетуин, составл ет 79% ст емкоСти гел , содержащего асиалофетуин.
Claims (2)
1.Способ очистки белкового токсина бактерий Bordetella pertussis с помощью аффинной хроматографии, отлич ающкйс тем, что, с цепью повышени эффективности процесса и степени чистоты .выдел емого токсина, используют аффинный сорбент, содержащий стационарный лиганд - десиапированный гликопротеин.
2.Способ поп. ,oтличaю- щ и и с тем, что используют аффинный сорбент, содержащий в качестве десиалированного гликопротеина асиалофетуин или аспалогаптоглобин. .
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8605457A FR2597605B1 (fr) | 1986-04-16 | 1986-04-16 | Nouveau materiau pour chromatographie d'affinite et son application a la separation et a la purification des antigenes proteiques des bacteries du genre bordetella |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1600633A3 true SU1600633A3 (ru) | 1990-10-15 |
Family
ID=9334301
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU874202442A SU1600633A3 (ru) | 1986-04-16 | 1987-04-15 | Способ очистки белкового токсина бактерий ВоRDетеLLа реRтUSSIS |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4985144A (ru) |
| EP (1) | EP0242302B1 (ru) |
| JP (1) | JPH0826080B2 (ru) |
| AT (1) | ATE57936T1 (ru) |
| CA (1) | CA1295985C (ru) |
| DE (2) | DE242302T1 (ru) |
| ES (1) | ES2000434B3 (ru) |
| FR (1) | FR2597605B1 (ru) |
| GR (2) | GR880300042T1 (ru) |
| LU (1) | LU90380I2 (ru) |
| SU (1) | SU1600633A3 (ru) |
| ZA (1) | ZA872711B (ru) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0218859A3 (en) * | 1985-10-11 | 1989-09-06 | International Business Machines Corporation | Signal processor communication interface |
| AU613387B2 (en) * | 1987-08-13 | 1991-08-01 | Carl-Zeiss-Stiftung Trading As Schott Glaswerke | An inorganic carrier element comprising an amine-containing surface layer for the immobilization of microorganisms or cells, a process for the preparation thereof |
| US5445817A (en) * | 1992-08-21 | 1995-08-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Pertussis toxin used as a carrier protein with non-charged saccharides in conjugate vaccines |
| WO2004036216A1 (ja) * | 2002-10-18 | 2004-04-29 | Japan Science And Technology Agency | 糖鎖−糖鎖結合性タンパク質の相互作用の測定方法およびその利用 |
| US7402243B2 (en) | 2004-09-10 | 2008-07-22 | Dionex Corporation | Organosilanes and substrate bonded with same |
| US7468130B2 (en) * | 2005-02-15 | 2008-12-23 | Dionex Corporation | Organosilanes and substrates covalently bonded with same and methods for synthesis and use same |
| US7557232B2 (en) * | 2007-05-25 | 2009-07-07 | Dionex Corporation | Compositions useful as chromatography stationary phases |
| DK2691411T3 (da) * | 2011-03-29 | 2020-05-11 | Glaxosmithkline Llc | Buffersystem til proteinoprensning |
| WO2019189474A1 (ja) * | 2018-03-27 | 2019-10-03 | 日本精工株式会社 | ステアリング装置 |
| KR102362777B1 (ko) * | 2018-03-27 | 2022-02-15 | 주식회사 녹십자 | 친화성 크로마토그래피 공정을 포함하는 백일해균 유래 단백질 수득 방법 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU547104A1 (ru) * | 1973-12-21 | 1985-03-30 | Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени химико-технологический институт им.Д.И.Менделеева | Способ получени сорбента дл гемоадсорбции |
| US4125492A (en) * | 1974-05-31 | 1978-11-14 | Pedro Cuatrecasas | Affinity chromatography of vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers |
| US4225487A (en) * | 1974-05-31 | 1980-09-30 | Pedro Cuatrecasas | Affinity chromatography of Vibrio cholerae enterotoxin-ganglioside polysaccharide and the biological effects of ganglioside-containing soluble polymers |
| US4010251A (en) * | 1974-12-16 | 1977-03-01 | Green Allan M | Scanning agent composition and use in imaging liver and for biliary function |
| FR2403098A1 (fr) * | 1977-09-19 | 1979-04-13 | Merieux Inst | Nouveau materiau capable de fixer de facon reversible des macromolecules biologiques, sa preparation et son application |
| US4247452A (en) * | 1978-03-01 | 1981-01-27 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Purification of pertussis haemagglutinins |
| US4416872A (en) * | 1982-03-17 | 1983-11-22 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Treatment of malaria with liposomes containing 8-aminoquinoline derivatives and glycoconjugates |
| US4466951A (en) * | 1982-11-12 | 1984-08-21 | University Of California | Intracellular trapping of therapeutics or tracer agents |
| SE445649B (sv) * | 1983-06-08 | 1986-07-07 | Jorgen Hermansson | Anvendning av en fast berare med immobiliserad orosomucoid for separation, forfarande for framstellning av separationsmaterial, separationsanordning samt separationsmaterial |
| JPS6098988A (ja) * | 1983-11-01 | 1985-06-01 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | Ｌｐｆ−ｈａの精製法 |
| JPS6176422A (ja) * | 1984-09-22 | 1986-04-18 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 百日ぜきコンポ−ネントワクチンおよび百日ぜき・ジフテリア・破傷風混合ワクチンの製造方法 |
-
1986
- 1986-04-16 FR FR8605457A patent/FR2597605B1/fr not_active Expired
-
1987
- 1987-04-15 SU SU874202442A patent/SU1600633A3/ru active
- 1987-04-15 ZA ZA872711A patent/ZA872711B/xx unknown
- 1987-04-15 US US07/038,748 patent/US4985144A/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-04-15 CA CA000534842A patent/CA1295985C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-16 AT AT87400878T patent/ATE57936T1/de active
- 1987-04-16 DE DE198787400878T patent/DE242302T1/de active Pending
- 1987-04-16 JP JP62092148A patent/JPH0826080B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-16 EP EP87400878A patent/EP0242302B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-16 ES ES87400878T patent/ES2000434B3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-04-16 DE DE8787400878T patent/DE3765822D1/de not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-05-20 GR GR88300042T patent/GR880300042T1/el unknown
-
1990
- 1990-12-18 US US07/629,674 patent/US5045203A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-01-24 GR GR91400080T patent/GR3001376T3/el unknown
-
1999
- 1999-03-29 LU LU90380C patent/LU90380I2/xx unknown
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Robinson P.I. et al. Eiochim, Bicphys, Acta, 197, 242, 659-661. Патент Великобритагаи № 201553, кл. С Q7 G 7/00, 1979. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0242302A1 (fr) | 1987-10-21 |
| JPH0826080B2 (ja) | 1996-03-13 |
| DE242302T1 (de) | 1988-06-09 |
| ATE57936T1 (de) | 1990-11-15 |
| CA1295985C (fr) | 1992-02-18 |
| AU603794B2 (en) | 1990-11-29 |
| JPS62253396A (ja) | 1987-11-05 |
| ZA872711B (en) | 1987-10-05 |
| ES2000434A4 (es) | 1988-03-01 |
| LU90380I2 (fr) | 1999-05-31 |
| AU7158087A (en) | 1987-10-22 |
| GR880300042T1 (en) | 1988-10-18 |
| ES2000434B3 (es) | 1991-04-16 |
| GR3001376T3 (en) | 1992-09-11 |
| US5045203A (en) | 1991-09-03 |
| EP0242302B1 (fr) | 1990-10-31 |
| US4985144A (en) | 1991-01-15 |
| FR2597605B1 (fr) | 1989-06-23 |
| DE3765822D1 (de) | 1990-12-06 |
| FR2597605A1 (fr) | 1987-10-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Er-el et al. | Hydrocarbon-coated sepharoses. Use in the purification of glycogen phosphorylase | |
| US4673734A (en) | Porous mineral support coated with an aminated polysaccharide polymer | |
| US4138287A (en) | Purifying and isolating method for hepatitis virus to use in preparing vaccine | |
| CN1015512B (zh) | 切向流亲合超滤法 | |
| Nachman et al. | Membrane-based receptor affinity chromatography | |
| SU1600633A3 (ru) | Способ очистки белкового токсина бактерий ВоRDетеLLа реRтUSSIS | |
| US5280109A (en) | Isolated, large latent complexes of TGF-β2 and TGF-β3, and new binding protein for latent form TGF-β1, TGF-β2 and TGF-β3 LTBP-2 | |
| US4440675A (en) | Human immune interferon | |
| CA1237998A (en) | Method for purification of filamentous hemagglutinin | |
| SU1523046A3 (ru) | Способ очистки человеческого @ -интерферона | |
| US4168261A (en) | Method for the purification of interferon using porous glass beads | |
| US4382027A (en) | Purification of human immune interferon | |
| US4485038A (en) | Method for the production and purification of human leukocyte interferon | |
| US4743551A (en) | Purification of microbial rennet from Mucor miehei | |
| US3925152A (en) | Virus separation | |
| SU644796A1 (ru) | Способ очистки протеолитических ферментов | |
| JP3508149B2 (ja) | ヒト血清アルブミンおよびその製造方法 | |
| RU2145610C1 (ru) | Способ очистки рекомбинантного эритропоэтина человека | |
| JP4154743B2 (ja) | インターロイキン６レセプターの精製方法 | |
| CA1239104A (en) | Method for the purification of lpf-ha | |
| SU1175965A1 (ru) | Способ выделени урокиназы из биологических источников | |
| JPH05170799A (ja) | ヒトインターロイキン８の精製方法 | |
| JPS6251592B2 (ru) | ||
| AU601788B2 (en) | Purified appetite-regulating substances of biological origin their antibodies, immunocomplexes of the appetite-regulating substances formed with the antibodies and processes for preparing same | |
| CA1065305A (en) | PROCESS FOR THE ENRICHMENT OF THE PREGNANCY-SPECIFIC .beta.1-GLYCOPROTEIN |