SK287787B6 - Použitie L-karnitínu ako stabilizačného činidla proteínov - Google Patents

Abstract

Je opísané použitie L-karnitínu a jeho solí na zachovanie aktivity zmeneného chaperónového proteínu alfa-kryštalínu.

Description

Vynález sa týka technickej oblasti stabilizácie proteínov, najmä terapeutických účinkov stabilizácie proteínov.

Doterajší stav techniky

Pri vytváraní proteínov a polypeptidov, či už extrakciou, alebo technikami biotechnológií rekombinantov, je problémom udržovanie správneho skladania proteínu tak, aby si udržal požadovanú aktivitu.

Neskladanie alebo nesprávne alebo inak modifikované skladania sa môžu vyskytovať z dôvodu technickej manipulácie alebo všeobecných procesných systémov pre vytváranie proteínov.

Ďalší problém pri spracovaní proteínových látok je daný zhlukovaním proteínov.

Stav techniky ponúka mnoho riešení. Niektoré z nich sú svojím charakterom chemické, čo znamená, že sú použité chemické činidlá, ako sú napríklad jednotlivé zmesi solí, hoci aj v pufrových roztokoch.

US 5 728 804, podľa výskumu Corporation Technologies, opisuje spôsob proteínovej renaturácie prostredníctvom bezdetergentných cyklodextrínov. US 5 563 057, podľa výskumu Wisconsin Alumni Research Foundation, iného než je cyklodextín, hovorí o použití určitých detergentov pre opätovné skladanie zle skladaných enzýmov.

US 5 874 075, podľa Amgen, opisuje komplexy proteínov : fosfolipidov užitočných na stabilizáciu proteínov proti tepelne vyvolanému zhlukovaniu, denaturácii a strate aktivity.

US 5 756 672, podľa Genetech, opisuje zlúčeninu zahŕňajúcu polypeptid v určitom pufri. Tento pufor je vhodný pre opätovné skladanie nevhodne skladaných polypeptidov. Osobitné uskutočnenie je dané pre opätovné skladanie zle skladaného rastového faktora I podobného inzulínu.

Uvedené spôsoby by mohli byť konvenčné, keďže sú tu použité ľahko dostupné chemické látky, napríklad soli medi alebo mangánu (US 5 756 672).

Opätovné preskladanie sa vyskytuje tiež prostredníctvom chromatografických techník, pozri Altamirano, M.M. et al. Nat. Biotechnol. 1999 feb; 17(2): 187-91.

Objavenie chaperonínov otvorilo novú oblasť pre technológiu spracovania proteínov.

Chaperoníny, tiež známe ako proteíny tepelného šoku alebo HSP, sú prírodné proteíny majúce biologickú úlohu pri skladaní proteínov. Pozri extenzívny prehľad htpp://www-ermm.chcu.cam.ac.uk/000021015h.htm od Júlia C. Ranford, Anthony R.M. Coates a Brian Handerson.

Technicky sú chaperoníny intenzívne skúmané ako prostriedky na členenie uvedeného problému stabilizácie proteínov a opätovného skladania.

Tento výskum vedie k novo objaveným chaperonínom a k ich použitiu pre stabilizáciu proteínov, pozri napríklad US 5 428 131, podľa Yale University. Pre obraz chaperonínov pri technickom probléme, ktorému čelí tento vynález, pozri napríklad US 5 688 651 podľa RAMONT University; US 5 646 249, podľa U.S: Health Department; US 5 561 221 podľa Nippon Oil Company Limited, WO 00/20606 podľa Remain and Schirmbeck, JP 11266865 podľa Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK, WO 99/40435, podľa Netzer; JP 10327869 podľa Kaiyo Biotechnology Kenkyusho KK; WO 00/71723 podľa Roche Diagnostics; WO 00/55183 a WO 99/05163 podľa Medical Research Council.

Chaperoníny sú užitočné prostriedky pre stabilizáciu proteínov a opätovné skladanie, ale niektoré technické nedostatky prichádzajú pri ich použití. Keďže sú to proteíny, hoci majú sklon k zmene, ako je tepelná, potrebujú tiež nejaký ochranný faktor.

V technickej oblasti stabilizácie proteínov je tento problém veľmi dôležitý pri príprave HSP vakcín rakoviny. Bolo pozorované, že imunogenicita daného antigénu je zachytená ďaleko účinnejšie, ak je prítomný v imúnnych bunkách v komplexe s HSP (Requena, J.M. et al., Ars-Pharm 1997, 38(2-3): 191-208; Castelino, F. et al., J. Exp Med. 2000, 191(11):1957-1964). Zvlášť, imunitná odpoveď na rakovinu je podporená s HSP (t. j. HSP70 alebo gp96), ktoré sú viazané s antigénnym peptidom („špecifické antigénne identifikačné odtlačky“), z ktorých oboje sú získané z rakovinových buniek pacientov (Yedavelli Spet al Int. J. Mol. Med. 1999, 4(3):243-248). Preto je dôležité mať stabilný a/alebo dobre chránený HSP pre vakcíny rakoviny.

Zaujímavo, niektoré chaperoníny, ako sú alfa-kryštalínové proteíny očnej šošovky, sú členmi malej rodiny proteínov tepelného šoku (sHSP). sHSP boli ukázané ako fungujúce v množstve rôznych procesov v rozmedzí od RNA stabilizácie po elastázovú inhibíciu a interakciu s cytoskeletom.

AlfaA-kryštalín sa nachádza primáme v očnej šošovke, vo veľmi malých hladinách bol zistený v iných tkanivách, pričom alfaB-kryštalín je teraz známy ako v podstate všade sa vyskytujúci v organizme (Haley, D.A. et al., J. Mol. Biol. 1998, 277:27-35). Biologický význam alfaB-kryštalínu je zvýraznený jeho zvýšenými hladinami pri ischémii srdca a v mozgu pacientov so sklerózou multiplex, Alzheimerovou chorobou a neurologickými ochoreniami. V zhode s klasifikáciou ako HSP bolo ukázané, že alfaB-kryštalín je vyvolaný škálou fyziologických stresov vrátane tepla, osmotického tlaku a toxicity kovov. Biologický význam alfaA2

-kryštalínu v očnej šošovke je zvýraznený jeho účinným potláčaním a nekontrolovaným zhlukovaním poškodených proteínov.

Ako sa zdá z uvedených príkladov, stabilizácia chaperonínov, buď pre ich použitie, alebo pre ich stabilizáciu pri týchto patologických stavoch, v ktorých sú tieto zmenené, je veľmi dôležitá v oblasti medicíny.

Podstata vynálezu

Teraz bolo zistené, že L-kamitín má prekvapujúci efekt pri stabilizácii proteínov a zvlášť priaznivý aspekt pre oblasť medicíny, L-kamitín má prekvapujúci efekt pri ochrannej aktivite chaperónov, táto ochranná aktivita je vykazovaná prostredníctvom stabilizačného efektu L-kamitínu smerom k chaperónovej aktivite.

Potom je cieľom predkladaného vynálezu použitie L-karintínu alebo jeho soli na stabilizáciu proteínov, zvlášť ako pomocného faktora pri ochrannej aktivite chaperónov.

V jednom prednostnom uskutočnení predkladaného vynálezu je L-kamitín použitý v terapeutickej oblasti na chránenie aktivity zmenených chaperónových proteínov.

V spojení s prvým prednostným uskutočnením je L-kamitín použitý na prípravu lieku na liečbu ochorení v dôsledku zmenených chaperónových proteínov.

V druhom prednostnom uskutočnení predkladaného vynálezu je L-kamitín použitý na prípravu lieku na liečbu ochorení na báze zmenenej aktivity alfa-kryštalínového proteínu, konkrétnejšie alfaA- a/alebo alfaB-kryštalínu. Ochorenia, ktoré môžu byť liečené, sú napríklad ischemické srdce a mozog pacientov so sklerózou multiplex, Alzheimerovou chorobou a inými neurologickými ochoreniami. V treťom uskutočnení ochorením je oftalmologické postihnutie, kde α-kryštalín je zmenený chaperónový protein. V špecifickom aspekte sa predkladaný vynález používa pri liečbe katarakty, s vylúčením katarakty diabetického pôvodu.

Cieľom predkladaného vynálezu sú tiež proteíny, najmä chaperoníny, ako je HSP, stabilizované prostredníctvom L-kamitínu.

V súlade s tým, ďalšími cieľmi predkladaného vynálezu sú použitia L-kamitínu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli na prípravu lieku na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.

Špecifickým cieľom predkladaného vynálezu je oftalmologický prípravok obsahujúci vhodné množstvo L-kamitínu alebo jeho farmaceutický prijateľnej soli. Tento oftalmologický prípravok môže prípadne obsahovať ďalšiu aktívnu zložku užitočnú na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.

Uvedené ciele predkladaného vynálezu budú zobrazené podrobne tiež prostredníctvom príkladov. Podrobný opis vynálezu

Za farmaceutický prijateľnú soľ L-kamitínu sa pokladá soľ, organická alebo anorganická, vhodná pre použitie v oblasti humánnej alebo veterinárnej medicíny. Vo všeobecnej oblasti stabilizácie proteínov môže byť použitá akákoľvek soľ s podmienkou, že je kompatibilná so špecifickou aplikáciou.

Príklady farmakologicky prijateľných solí L-kamitínu, ale bez obmedzenia sa len na nasledujúce, sú chlorid, bromid, jodid, aspartát, kyselina asparágová, citrát kyselina citrónová, vínnan, kyselina vínna, fosforečnan, kyselina fosforečná, fumarát, kyselina fumarová, glykofosforečnan, laktát, maleát, kyselina maleínová, mukát, orotát, šťaveľan, kyselina štaveľová, síran, kyselina sírová, trichlóracetát, trifluóracetát, metánsulfonát, pamoát a kyselina pamoová.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Očná šošovka je priehľadný orgán vytvorený vysoko koncentrovanou a vysoko usporiadanou matricou štruktúrnych proteínov nazvaných „kryštalíny“, ktoré sú pravdepodobne najdlhšie žijúcimi proteínmi organizmu (Wistow, G., a Piatigorsky, J. (1988), Ann. Rev. Bioechem, 57, 479-504; Blomendal, H. (1982), Biochem. 12, 1-38; Bettelheim, F.A. (1985), The Ocular Lens Structure, Function, and Pathology, (Maisel, H. ed.) strany 265-300, Marcel Dekker, Inc., New York; Tardieu, A., a Delay, M. (1988), Ann. Rev. Biophys. Chem. 17, 47-70).

Posttranslačné modifikácie šošovkového kryštalínu, v dôsledku veku alebo ochorenia ako je diabetes, môže vyústiť do konformačných zmien a zhlukovania týchto proteínov a viesť k nepriehľadnosti a k vytvoreniu katarakty (Harding, D. (1981), Molecular and Cellular Biology of the Eye Lens (Bloemendal, H., ed;) strany 327-365, John Willey and Sons, New York). Hoci mechanizmy vytvorenia katarakty nie sú dobre poznané, oxidácia šošovkových proteínov ie spojená s kataraktou u cicavcov (Francis, P.J. (1999), Trends in Genetics 15, 191-196).

Šošovka prechádza hlavným oxidačným tlakom, pretože je stále vystavená svetlu a oxidantom (Varma, S.D., et al. (1984), Curr. Eye Res. 3, 35-57, Spector, A. (1995), FASEB J. 9, 1173-1182; Taylor, A., and Davies, K.J. (1987), Free Radic. Biol. Med. 3, 371-377; Zigman, S. (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (Ducan, G., ed.) strany 117-149, Academic press, New York; I. Dillon, J. (1985), The Ocular Lens Structure, Function, and Pathology, Maisel, H. ed, Marcel Dekker, Inc., New York). Oxidačné modifikácie zahŕňajú selektívnu oxidáciu špecifických aminokyselín, ktorá má za následok zmeny náboja, degradácie proteínov, priečnej väzby proteínov a nerozpustnosti, a zvýšenie tryptofánovej fluorescencie (Spector, A., and Gamer, W.H. (1981), Exp. Eye Res. 33, 673-681 Andley, U.P. (1987), Photochem, Photobiol. 46, 1057-1066 Davies, K.J.A., et al., (1987), J. Biol. Chem. 262, 9914-9920 Augusteyn, R.C. (1981), Mechanisms of Cataract Formation in the Human Lens (Ducan, G., ed.) strany 72-115, Academic Press, London Zigler, J.S. Jr. et al., (1989), Free Radic. Biol. Med. 7, 499-505). Následne boli rozvinuté antioxidačné systémy a opravné mechanizmy, aby opačne pôsobili ako efekty oxidantov. Prvá línia obrany proti oxidačnému tlaku je vytvorená antioxidantmi zachytávajúcimi radikály, ktoré redukujú oxidačné napadnutie. Napríklad, glutatión (GSH) a taurín, ktoré sú oba vysoko zastúpené v tkanive očnej šošovky, majú ochranné efekty pri in vitro modeloch diabetickej katarakty (Richard, R.C. et al., (1998), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 397-407, Jones, R.A.V. and Hothersall, J.S. (1999), Exp. Eye. Res. 69, 291-300). Ďalej, a-kryštalín, ktorý vytvára až do 50 % celkovej proteínovej hmoty šošovky cicavcov, pôsobí ako molekulový chaperón, ktorý zabraňuje teplom vyvolanému zhlukovaniu mnohých proteínov a je potrebný na renaturáciu chemicky denaturovaných proteínov (Jones, R.A.V. and Hothersall, J.S. (1999), Exp. Eye Res. 69, 291-300). Kľúčový element α-kryštalínovej funkcie je jeho schopnosť zabrániť nenormálnym spojeniam proteínov pomocou viazania na prechodne vystavené hydrofóbne proteínové povrchy (van den Ussel, P.R. et al. (1996), Opthalmic Res. 28, 39-43). Pretože α-kryštalín zabraňuje ultrafialovému žiareniu aj voľnými radikálmi vyvolanému zhlukovaniu proteínov in vitro (Groenen, P.J. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 225, 1-19, Andley, U.P. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273, 31252-31261; Lee, J.S. et al. (1997) J. Proteín Chem. 16, 283-289; Kramps, J.A. et al. (1978), Biochem. Viophys. Acta 533, 487-495; van Kleef, F.S.M., et al. (1976), Eur. J. Biochem. 66,477-483 Smulders, R.H.P.H. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 29060-29066), môže ochraňovať aj šošovkové proteíny od fotooxidačných zmien in vivo.

US patent č. 5 037 851 vydaný 6.8.1991 s prioritou 15.11.1988 v mene tohto istého právneho zástupcu ako pri predkladanom vynáleze, nárokuje terapeutický spôsob liečby katarakty, ktorý obsahuje podávanie subjektu majúcemu kataraktu orálne alebo parentálne 1000 až 2000 mg/deň acetyl-D-kamitínu alebo ekvivalentného množstva jednej z jeho farmaceutický prijateľných solí. Poznanie tohto patentu je obmedzené na acetyl-D-kamitín.

Vynálezca predkladaného vynálezu a jeho kolegovia predtým ukázali, že pri experimentálnom diabete zvierat zníženie kamitínu v šošovke a všade sa vyskytujúcej molekule obsiahnutej v mnohých biologických cestách je v začiatku dôležité a selektívny prípad sa snáď vzťahuje na vytvorenie katarakty (Pesotto, P, et al., (1997) Exp. Eye Res. 64, 195-201). V tomto dokumente je objavené, ako je pri diabetických stavoch strata L-kamitínu v šošovke a hladiny kamitínu v iných tkanivách oka sa zdajú byť v podstate nezasiahnuté. Autori uzavierajú, že úloha L-kamitínu v šošovke je stále nejasná, ale jeho strata sa môže týkať vzniku katarakty. V tejto referencii je dobré odporučenie použiť acetyl-kamitín dávajúci dobrý dôvod pre očakávanie úspechu na zabránenie vzniku katarakty farmakologickým pôsobením, ako bolo ukázané pri aspiríne. Dôvod očakávania priaznivého pôsobenia pomocou acetyl-kamitínu z pohľadu dobre známeho pôsobenia aspirínu je v tom, že obe zlúčeniny majú acetylačné vlastnosti, ktoré pri svojej premene sú zodpovedné za ochranu šošovkových proteínov.

Popri svojej primárnej funkcii ako nosiča mastných kyselín s dlhým reťazcom z cytoplazmy na miesta β-oxidácie sa predpokladá, že L-kamitín by mohol slúžiť aj na udržovanie bunkovej homeostázy.

Swamy-Mruthinti, S., a carter, A.L: (1999), Exp Eye Res 69, 109-115 ukázali, že L-kamitín je in vitro neefektívny pri glykácii šošovkových kryštalínov, pričom acetyl-L-kamitín a acetyl-salicylová kyselina znižovali glykáciu kryštalínu. Tieto uvažovania vysvetľujú, prečo hladiny L-kamitínu v rôznych tkanivách zvierat vždy nekorelujú s energetickými požiadavkami tkanív alebo lipidovým metabolizmom. Napríklad, očné šošovky, cievami neprekrvované tkanivo, ktorého hlavným zdrojom energie je glukóza absorbovaná zo zrakových tekutín, má vyššie koncentrácie L-kamitínu než iné očné časti (Pessoto, P. et al (1994) J. Ocul. Pharmacol. 10, 643-651).

Tento vynález v súlade s tým uvažuje o použití L-kamitínu a jeho farmakologicky prijateľných solí na prípravu oftalmologického farmaceutického prípravku na terapeutickú liečbu katarakty, najmä katarakty nediabetického pôvodu. V praxi, terapeuticky účinné množstvo L-kamitínu alebo ekvivalentné množstvo jednej z jeho farmakologicky prijateľných solí je podávané do oka, prípadne s obsahom ďalšej aktívnej zložky užitočnej na liečbu katarakty nediabetického pôvodu.

Prednostne je prípravok vo forme očných kvapiek. Očné kvapky sú aplikované v rozsahu terapeutickej potreby, ako to určí odborník a závisí od podmienok pacienta, vážnosti ochorenia a iných faktorov, ktoré zváži odborník. Napríklad môžu byť vhodné 2 - 3 kvapky 3 - 4-krát denne.

Prípravky pre očné kvapky obsahujú obvyklý sterilný izotonický roztok. Výber vhodných excipientov je v rámci schopností bežného odborníka vo farmakologickej technológii. Napríklad, pre excipienty sa použije chlorid sodný, dibázický fosforečnan sodný monobázický fosforečnan sodný, benzalkóniumchlorid a etylalkohol. Prípravok je doplnený na správny objem destilovanou vodou.

Príklady

Materiály a spôsoby

Kultúra orgánu šošovky

Potkany Sprague-Dawley vo veku štyri mesiace boli anestetikované 5 mg/kg xylazínu a 65 mg/kg ketamínu a bola im odrezaná hlava. Okamžite potom boli oči vybrané, extrahované a umiestnené do 2 ml modifikovaného TC-199 média. Integrita očnej šošovky bola stanovená meraním proteínu vylúhovaného do média kultúry po 30 - 60 minútach; poškodené očné šošovky boli odhodené. Jedna očná šošovka z každého páru bola umiestnená do média kultúra bez H₂O₂ a použitá ako kontrolná. Po 24 hodinách sa kontrolované šošovky nelíšili od čerstvo vybratých šošoviek v žiadnom z parametrov hodnotených v tejto štúdii. Kontrolované šošovky z každého páru boli umiestnené v médiu a po uvedení do rovnováhy s 5 % CO₂ pri 37 °C boli vystavené 500 μΜ H₂O₂ v neprítomnosti alebo prítomnosti 300 μΜ L-kamitínu. Po 24 hodinách inkubácie boli zaznamenané morfologické charakteristiky a zmeny a očné šošovky boli fotografované. Inkubované šošovky boli prepláchnuté soľným roztokom, vysiate na filtračnom papieri, odvážené a potom ihneď spracované na biochemickú analýzu. Na determinovanie vytekania laktát dehydrogenázy (LDH) boli šošovky inkubované jednotlivo v každom rozdielnom médiu a médium bolo zozbierané denne a uchované na LDH analýzu. Extrakcia šošovkových proteínov

Odpuzdrené šošovky boli homogenizované roztieracou tyčinkou na jedno použitie a potom boli vibrované ultrazvukom (20 mM HEPES, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM ditiotreitol, 450 mM NaCi, 25 % glycerol, 0,5 μΜ/ml leupeptín, 0,5 μg/ml protinín, 0,5 mM fenylmetánsulfonylfluorid) na ľade. Podiely homogenátu z každej z inkubovaných šošoviek boli odobraté na analýzu GSH a L-kamitínu. Zvyšok bol centrifugovaný počas 25 minút pri 20 000 otáčkach na separovanie supematantu z peliet. Peleta bola premytá s 1,0 ml pufra a vysušená pod dusíkom. Táto frakcia bola označená ako „vo vode nerozpustná“ frakcia. Frakcia supematantu bola dialyzovaná dvakrát proti 3 ml 0,025 mol/1 fosforečného pufra, pH 7,4 počas 48 hodín a lyofilizovaná. Táto frakcia bola označená ako „vo vode rozpustná“ frakcia. Vo vode rozpustná a vo vode nerozpustná frakcia bola odlipidovaná s 3,0 ml chloroform : metanol (2 : 1) počas 16 hodín pri trasení, po ktorom nasledovalo centrifugovanie pri 2000 otáčkach počas 5 minút.

Po tom, ako bolo organické rozpúšťadlo odobraté, bol zvyšok upravený s 2,0 ml dietyléteru, ponechaný stáť počas 5 minút a potom bol centrifugovaný pri 2000 otáčkach počas 5 minút. Peleta bola vysušená na vzduchu a uložená pri 4 °C v sušičke.

Príprava kryštalínov

Vo vode rozpustné kryštalínové frakcie boli izolované preparatívnou chromatografiou s gélovým prestupom Sephacryl S-300-HR, ako už popísal (Smulders, R.H.P.H. et al. (1996), J. Biol. Chem. 271, 29060-29066, de Jong, et al. (1974), Eur. J. Biochem. 48, 271-276). Stručne, rozpustný protein bol aplikovaný na 100 x 1,5 cm stĺpec a rozvinutý rovnomerne s fosforečným pufrom. Celkové frakcie z kontrolných a H₂O₂ ± L-karnitínom liečených šošoviek boli koncentrované ultrafiltráciou v Diaflovom prístroji a ich čistota bola kontrolovaná pomocou SDS-PAGE, urobeného podľa Laemmli použitím Bio-Rad Mini-Protea II System. Proteínové koncentrácie boli merané s Bradfordfordou súpravou proteínových vzoriek.

Westtem analýza nasávania

Celkový homogenát šošovky bol aplikovaný použitím na 4 - 20 % gradient dodecylsíran sodných (SDS) gélov použitím tricínových pufrov a potom prenesený na polyvinylidéndifluridové membrány. Westtem nasávanie bolo vykonané, ako je popísané niekde inde (Kim, S.Y. et al. (1995), J. Invest. Dermatol. 104, 211-217). Koncentrácia protilátok bola 5 pg/ml pri primárnej protilátke (anti-y-glutamyl-e-lyzín-izopeptid) a 0,1 pg/ml pri sekundárnej protilátke. Nasávanie bolo potom rozvinuté zvýšenou chemiluminiscenciou (Pierce, Miláno, Taliansko). Následne sa rysovali pásy veľmi vysokej molekulovej hmotnosti, vylúhované do SDS pufra obsahujúceho Tricín, oslobodené od SDS extrakciou iónového páru (Konigsberg, W.H., a Henderson, L. (1983) Proc. Natl. Sci. USA 80, 2467-2471) a podrobené analýze aminokyselín.

Meranie priečnej väzby izopeptidov vo vode rozpustných proteínoch

Vo vode rozpustné proteíny boli suspendované v 0,2 M N-etylmorfolínacetáte (pH 8,1). Podiel (10 %) bol použitý na determinovanie množstva celkového proteínu. Vzorky boli vylúhované sekvenčnou adíciou proteolytických enzýmov (kolagenáza, pronáza, aminopeptidáza, karboxypeptidáza A, karboxypeptidáza B a kar5 boxypeptidáza y), priamo do reakčnej zmesi pri 37 °C v prítomnosti 0,02 % azidu sodného. Po vylúhovaní enzýmov bola voľná priečna väzba N-(y-glutamyl)lyzín izopeptidu opätovne rozpustená pomocou HPLC a bolo determinované množstvo analýzou aminokyselín (Hohl, D., et al (1991), J. Biol. Chem. 266, 6626-6636). V uvedenej súprave experimentov bol obsah izopeptidu šošoviek stanovený bez predchádzajúcej extrakcie.

Tryptofánová fluorescencia

Tryptofánová fluorescencia straty proteínu, indikátor tryptofánovej oxidácie, sa zdá byť markerom kryštalínovej integrity. Preto sme merali tryptofánovú fluorescenciu v šošovkovom kryštalíne (Perkin-Elmer 65040 spektrofotometer) podľa už popísaného spôsobu (Jones, R.H.V., a Hothersall, J.S. (1993), Exp. Eye Res. 57, 783-790). Excitácia vlnovej dĺžky bola situovaná do stanovená na 295 nm a fluorescenčná emisia bola zistená pri 330 nm.

Vyhodnotenie molekulovej chaperónovej aktivity a-kryštalínov zo šošoviek kontrolných a in vitro liečených potkanov

Boli vykonané nasledujúce experimenty v podstate ako už boli opísané niekde inde (Horwitz, J. (1992) Proc. Natl. Sci. USA 89, 10449-10453). Chaperónom podobná aktivita α-kryštalínu zo šošoviek kontrolných a H₂O₂ ± L-kamitín liečených potkanov bola stanovená štúdiami tepelnej denaturácie. Miera, do ktorej nemodifíkovaná alebo modifikovaná preparácia α-kryštalínu chránila p_L-kryštalín (použitý ako terčový proteín) z teplom vyvolanej denaturácie a zhlukovania, bola stanovená nasledovne: 100 pg alebo 200 pg a-kryštalínu bolo pridané k 200 pg p_L-kryštalínu v 1,5 ml kyvete a doplnené na konečný objem 1 ml s 50 mM fosforečného pufta, pH 7,0. Kyveta bola umiestnená v teplotu regulovanom bunkovom držiaku pripojenom k UV spektra fotometru. Rozptyl svetla v dôsledku denaturácie proteínov a zhlukovanie boli monitorované pri 360 nm absorbancii u 3000 otáčkami pri 55 °C a u 1800 otáčok pri 58 °C.

Zostava stredných vlákien a kvantitatívny rozbor obsahujúci a-kryštalíny

Kvantitatívny rozbor sedimentácie, ktorý navrhol Nicholl a Quinlan (Nicholl, I.D. a Quinlan, R.A. (1994), EMBO J. 13, 945-953) bol použitý na stanovenie α-kryštalínom vyvolanej inhibície zostavy stredného vlákna. Čistená vláknitá kyslá pôda z prasaťa: na tieto štúdie bol použitý proteín (GFAP); bol čistený od prasacej miechy pomocou nervovej flotácie, ako už bolo popísané (Pemg, M.D., et al. (1999), J. Celí Sci. 112, 2099-2112, MacLean-Fletcher, S., and Pollard, T.D. (1980), Biochem. Biophys. Res. Commun. 96, 18-27). Kvantitatívny rozbor vytvorenia gélu založený na spôsobe použitom na monitorovaní aktín viažucej proteínovej aktivite pomocou viskozimetrie padajúcej guľôčky (Pemg, M.D., et al (1999), J Celí Sci,. 112, 2099-2112). α-Kryštalíny boli zmiešané s GFAP v 8 M močovine, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA, 25 mM 2-merkaptoetanole a potom po krokoch dialyzované v 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 25 mM 2-merkaptoetanole. Zostava GFAP stredných vlákien v prítomnosti alebo neprítomnosti α-kryštalínu bola vyvolaná pridaním 20-násobne koncentrovaného pufra za vzniku výslednej koncentrácie 100 mM imidazol-HCl, pH 6,8, 0,5 mM DTT. 100 pl podiel vzorky bol zavedený do sklenej skúmavky a použitý na kvantitatívnu analýzu viskozity. Skúmavka bola potom ponorená do 37 °C vodného kúpeľa na 1 hodinu a potom sa urobil rozbor vzorky vytvorenia gélu. Balón bol potom umiestnený do skúmavky a bola monitorovaná schopnosť roztoku podopierať balón.

Mikroskopické preskúmanie očnej šošovky

Po 24 hodinách s alebo bez H₂O₂ v prítomnosti alebo neprítomnosti L-kamitínu boli očné šošovky podrobené štandardným postupom pre histologickú analýzu. Pre optickú mikroskopiu boli šošovky odobraté z média kultúry, ponorené vo fixačnom (neutrálnom pufrovom formalíne), dehydrované v etanole, čistené v xyléne a uložené v parafínovom vosku pre sekcionovanie. Pre rozborevú elektrónovú mikroskopiu boli šošovky fixované ponorením počas aspoň 24 hodín pri izbovej teplote v roztoku 2,5 % glutaraldehydu a 6 % sacharózy, pufrovanej na pH 7,2 s 50 mM kakodylátom sodným. Vzorky boli dehydratované pomocou postupného radu etanolu, kritický bod vysušený použitím CO₂, upevnený na hliníkové paličky, pokovovaním potiahnuté zlatom a preskúmané s Leica Stereoscan 440 mikroskopom pri 3 - 7 kV stupňujúcom sa napätí.

Pre prenosovú elektrónovú mikroskopiu boli šošovky fixované ako bolo opísané pre postup rozborovej elektrónovej mikroskopie, potom fixované v OsO₄, pufrované s 150 mM fosforečnanu sodno-draselného (pH 7,4), uložené, sekcionované a napustené farbou pre elektrónovú mikroskopiu. Boli preskúmané v JEOL 100B elektrónovom mikroskope.

Výsledky

Zmeny v morfológii šošovky

Po 24 hodinách inkubácie šošovky inkubované bez H2O2 (kontrolné šošovky) si zachovali svoju priehľadnosť, ale tie, ktoré boli vystavené 500 mM H₂O₂, sa stali jednotne zahmlenými cez vonkajšiu kortikálnu oblasť a boli nafúknuté. Ako ukazuje tabuľka 1, na konci inkubácie boli s H₂O₂ liečené šošovky výrazne ťažšie než kontrolné šošovky (47 ± 0,2 mg oproti 25 ± 0,1 mg). Neboli rozdiely v hmotnosti medzi kontrolnými šošovkami a šošovkami liečenými s L-kamitínom aj H₂O₂. Šošovky liečené s H₂O₂ samotným sa stali nepriehľadnými, pričom šošovky liečené s L-karnitínom a H₂O₂ ostali priehľadné. Optická a elektrónová mikroskopia ukázala, že bunkový tvar bol nezmenený a že bunky vlákien boli pri kontrolných šošovkách neporušené a pri šošovkách liečených s L-kamitínom a H₂O₂. Pri šošovkách vystavených H₂O₂ samotnému bola pozorovaná tvorba balónu, skvapalnenie a rôzne stupne nafúknutia.

Koncentrácie L-kamitínu a GSH pri kontrolných a H₂O₂ liečených šošovkách

Pri experimentálnych podmienkach nebol výrazný rozdiel v koncentráciách L-kamitínu a GSH pri kontrolných šošovkách, pričom liečba s 500 mM H₂O₂ spôsobila prudký pokles hladín GSH a L-kamitínu (tabuľka 1). Pridanie L-kamitínu (300 mM) do inkubačného média šošovky pred liečbou s H₂O₂ nezabránilo strate GSH, ale udržalo koncentráciu kamitínu takmer na hladine zodpovedajúcej kontrolným šošovkám. Na determinovanie či zníženie GSH a L-kamitínu súviselo s poškodením šošovky, sme merali únik LDH do média. Ako sa očakávalo, po liečbe s H₂O₂ bolo zníženie hladín GSH a L-kamitínu sprevádzané výrazným zvýšením LDH v supematantoch, určujúc, že vyčerpanie týchto faktorov bolo určite spojené s poškodením šošovky. Na determinovanie ochranného efektu L-karnitínu sme inkubovali šošovky v médiu kultúry obsahujúcom 300 mM molekuly. Ako sa očakávalo, koncentrácia GSH v šošovkách liečených s L-karnitínom a H₂O₂ sa znížila na asi rovnakú hladinu ako v šošovkách vystavených H₂O₂ samotnému, ale koncentrácia LDH v médiu z šošovky liečenej s L-kamitínom a H₂O₂ bola podobná tej, ktorá bola pozorovaná pri kontrolných šošovkách. Toto indikuje, že L-kamitín môže vydržať túto koncentráciu H₂O₂.

Znovuzískanie proteínov s vysokou molekulovou hmotnosťou v nerozpustných vo vode šošovkových frakciách obsahujúcich izopeptidovú priečnu väzbu

Vo vode nerozpustné proteíny tvorili iba 5 % celkových proteínov pri kontrolných šošovkách, ale boli zvýšené na 41 % celkových proteínov pri šošovkách liečených s H₂O₂ (tabuľka 1). Koncentrácie vo vode nerozpustných proteínov v šošovkách liečených s L-kamitínom a H₂O₂ boli rovnaké, ako tie, ktoré boli pozorované pri kontrolných šošovkách.

Chaperónom podobná funkcia a-kryštalínov

Vlastnosti chaperónov z čisteného vo vode rozpustného α-kryštalínu boli determinované rozborom zhlukovania kryštalínu (terčový proteín). Charakteristicky sa βι -kryštalíny zhlukujú pri stúpajúcej teplote. Adícia α-kryštalínu buď zabraňuje, alebo znižuje teplom vyvolanému zhlukovaniu β [ -kryštalínu, ktorý je meraný rozptylom svetla pri 360 nm. Keďže pomer a a β determinuje stupeň ochrany proti teplom vyvolanému zhlukovaniu, použili sme 100 pg alebo 200 pg α-kryštalínu a 200 pg βν-ΐα^ΐαΐήπι. Ako sa očakávalo, a-kryštalín z kontrolných šošoviek vykazoval chaperónovú aktivitu. Po inkubácii s H₂O₂ bolo výrazné zníženie v kapacite α-kryštalínu na zabránenie teplom vyvolanému zhlukovaniu p_L-kryštalínu, pričom prítomnosť L-kamitínu v šošovkovej inkubačnej zmesi zabránila tomuto nefatícnemu efektu.

Rozbor vzorky vytvorenia gélu

Keďže stredné vlákna, ako je GFAP, sú fyziologický terč α-kryštalínov, testovali sme chaperónovú aktivitu α-kryštalínu použitím viskozimetrie padajúceho balóna pri rozbore vzorky vytvorenia gélu (MacLeanFletcher, S., a Pollard, T.D., (1980), Biochem. Biophys. Res. Commun. 96, 18-27).

GFAP je príslušný terč v dôsledku vlastnosti α-kryštalínu nezhlukovať GFAP cytoplazmové inklúzie. V neprítomnosti α-kryštalínu GFAP vytvára proteínový gél, ktorý nesie balón použitý v teste viskozity. Na determinovanie, či liečba s H₂O₂, ktorá pôsobila na kapacitu šošovkového α-kryštalínu a premšila GFAP siete, bol pridaný k rozboru vzorky vytvorenia gélu α-kryštalín z kontrolných alebo z H₂O₂ ± L-kamitínom liečených šošoviek. a-Kryštalín z kontrolných šošoviek úplne inhiboval vytvorenie a udržovanie GFAP gélu pri rozbore viskozity vzorky, pričom α-kryštalín zo šošoviek liečených s H₂O₂ samotných nepôsobil na vytvorenie gélu. Popritom, α-kryštalín zo šošoviek liečených s L-kamitínom aj H₂O₂ blokoval GFAP vytvorenie gélu do tej istej miery ako α-kryštalín z kontrolných šošoviek.

Merania tryptofánovej fluorescencie

Tryptofánová fluorescencia bola meraná v α-kryštalínových frakciách z kontrolných a liečených šošoviek na identifikovanie konformačných zmien. Pri α-kryštalíne z H₂O₂ liečených šošoviek bola 2,7-násobná strata tryptofánovej fluorescencie; znovu, L-kamitín obnovil základnú hodnotu.

Šošovky vystavené L-karnitínu a oxidačnému stresu ostali priehľadné. Hoci vynálezcovia tohto vynálezu nechcú byť viazaní akoukoľvek teóriou, ochranný efekt L-kamitínu nie je ľahko vysvetlený, L-kamitín sám osebe nie je známy ako vykazujúci antioxidačnú aktivitu (Arduini, A., et al. (1992), J. Biol. Chem. 267, 12673-81). Ani L-kamitín nezachránil vyčerpanie GSH, ktoré znamená, že priaznivý efekt nebol sprostredkovaný zvýšením GSH prostredníctvom napríklad anaplerotického efektu na NADPH, kofaktora enzýmu glutatión reduktáza (Pemg, M.D., (1999), J. Biol. Chem. 47, 33235-33243, Wuensch, S.A., a ray, P.D. (1997), Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 118, 599-605). Skôr skutočnosť, že únik LDH do média nebol zvýšený pri šošovkách liečených s L-kamitínom a vystavených oxidačnému stresu, indikuje, že molekula môže udržať integritu šošovky. Tu ukazujeme, že chaperónová aktivita α-kryštalínu šošovky je znížená prostredníctvom in vitro oxidačného stresu, a poskytuje podpom pre návrh, že šošovkové proteíny podrobené oxidačnému poškodeniu si udržujú vysoký stupeň posttranslačných modifikácií (Cherian, M., a Abraham, E.C., (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 212, 184-189). L-Kamitín nielen redukoval zvýšené posttranslačné modifikácie šošovkových proteínov, ale tiež poskytol výraznú ochranu proti zníženej chaperónovej aktivite a-kryštalínu. α-Kryštalín ukázal, že potlačuje zhlukovanie denaturovaných proteínov v štúdiách, v ktorých zmesi tepelnému stresu vystavených β-kryštalínov slúžili ako substrát (Kramps, J.A., et al., (1978), Biochem. Biophys. Acta 533, 487-495). Bolo ukázané, že oxidačný stres porušuje chaperónovú aktivitu α-kryštalínov, ktorá je rozhodujúca pre udržovanie priehľadnosti šošoviek (Zigler, J.S. Jr. et al., (1989), free Radic. Biol. Med. 7, 499-505; Richard R.C. et al., (1998), Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217, 397-407). Potom, L-kamitín priaznivo ovplyvňuje priehľadnosť šošovky pôsobením priamo na a-kryštalín.

a- aj β-kryštalíny sú na N-zakončení acetylované. Použitím analýzy skríningu nasávania škvŕn spojenej s hmotnostnou spektrofotometriou Takemoto et al. uskutočnili dôkaz, že metatión a-kryštalínu, ktorý je N-acetylovaný na konci, môže byť oxidovaný na metatiónsulfoxid in vivo (Sims, N.R., et al., (2000), Brain Res. Mol. Brain Res. 77, 176-184). Táto oxidácia metatiónu s N-zakončením, ktoré je odkryté na vonkajšku polypeptidu, môže negatívne vplývať na funkciu proteínu. Popri acetylácii na NH-zakončení sú podrobené acetylácii aminoskupiny lyzínových (Lys) rezíduí. Všetkých sedem kravských Lys rezíduí (α-kryštalín) reagujú s aspirínom, miera acetylácie sa mení od 10 % pri lys 88, najmenej reaktívny, do 60 % pri Lys 166, najviac reaktívny (Takemoto, L. et al., (1992), Curr. Eye Res. 11, 651-655; Rao, G.N. et al., (1985), Biochem. Biophys. Res. Commun. 129, 1125-1127). Aspirín inhibuje glykáciu aj karbamoyláciu prostredníctvom acetylácie Rezíduí Lys (Hasan, A. et al., (1993), Exp. Eye Res. 57, 29-35; Cromptonm, Rixon, K.C., and Harding, J.J. (1985) Exp. Eye Res. 40, 297-311; Rao, G.N., and Cotlier, E. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 151, 991-996; Huby, R., and Harding, J.J. (1988) Exp. Eye Res. 47, 53-59; Ajiboye, R., and Harding D. (1989), Exp Eye Res. 49, 31-41; Blakytin, R., and Harding, J.J. (1992), Exp. Eye Res. 54, 509-518). Nedávno bolo ukázané, že acetyl-L-kamitín inhibuje glykáciu (α-kryštalínu vo väčšej miere než iné kryštalíny, prostredníctvom acetylácie potenciálnych miest glykácie (Groenen, P.J., et al., (1993), Biochem. J. 295, 399404). Glykácia sa zdá oveľa škodlivejšia než acetylácia v dôsledku toho, že pri sieťovaní proteínov a pri výraznom znížení chaperónovej aktivity α-kryštalínu sú obsiahnuté len produkty glykácie (Groenen, P.J. et al., (1993), Biochem. J. 295, 399-404, Blakytin, R., and Harding, J.J. (1992), Exp. Eye Res. 54, 509-518).

Tabuľka 1

Zmeny niektorých biochemických parametrov pri kontrolných šošovkách a pri H₂O₂ ± L-kamitínom liečených šošovkách

	Hmotnosť šošovky (mg)	Vo vode nerozpustný proteín ( %)	Glutatión (pmol/g hmotn.hmotn.)	Voľný karnitín (nmol/g hmotn.hmotn.)	Acetylkamitín (nmol/g hmotn. hmotn.)	LDH (jednotky/ml upraveného média)	Celkový kamitín (nmol/g hmotn.hmotn.)
Kontrolné	25 ±0,1	5± 1,1	4,87± 0,23	156 ±3	29 ± 1	NZ	187 ±5
h2o2	47 ± 0,2*	41 ± 1,9*	2,44 ± 0,69*	27 ±2*	6± 1*	53 ±6	36 ±3*
H2O2 + Lkamitín	27 ± 0,9	5 ±2,0	2,71 ±0,73*	151 ±2	37 ±2**	NZ	189 ±2

• P<0,001, **P<0,005, NZ: nezistiteľné

Claims (3)

1. Použitie L-kamitínu a jeho solí na zachovanie aktivity zmeneného chaperónového proteínu a-kryštalínu.

5

2. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že týmto α-kryštalínom je alfaA-kryštalín.

3. Použitie podľa nároku 1, vyznačujúce sa tým, že týmto α-kryštalínom je alfaB-kryštalín.